JP2003505082A - 新規なポリヌクレオチドとその使用法 - Google Patents

新規なポリヌクレオチドとその使用法

Info

Publication number
JP2003505082A
JP2003505082A JP2001512880A JP2001512880A JP2003505082A JP 2003505082 A JP2003505082 A JP 2003505082A JP 2001512880 A JP2001512880 A JP 2001512880A JP 2001512880 A JP2001512880 A JP 2001512880A JP 2003505082 A JP2003505082 A JP 2003505082A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
nucleotide sequence
seq
shows
sequence designated
srt
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2001512880A
Other languages
English (en)
Inventor
ベーカー，ケヴィン，ピー．
ゴッダード，オードリー
ウッド，ウィリアム，アイ．
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Genentech Inc
Original Assignee
Genentech Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genentech Inc filed Critical Genentech Inc
Publication of JP2003505082A publication Critical patent/JP2003505082A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

(57)【要約】 本発明は新規なポリヌクレオチドとそれによりコードされるるポリペプチドを対象とする。ここにまた提供されるものは、その核酸配列を含むベクターと宿主細胞、異種性ポリペプチド配列に融合した本発明のポリペプチドを含んでなるキメラポリペプチド分子、本発明のポリペプチドに結合する抗体及び本発明のポリペプチドを製造する方法である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 (発明の分野) 本発明は一般にヒトポリペプチドをコードする全長ｃＤＮＡ分子の少なくとも
一部を構成する新規な核酸分子の同定と単離に関する。
【０００２】 (発明の背景) 細胞外タンパク質は、特に、多細胞生物の形成、分化及び維持において重要な
役割を担っている。多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、移動、分化又は他の
細胞との相互作用は、典型的には、他の細胞及び／又は直近の環境から受け取る
情報に支配される。この情報は、しばしば分泌ポリペプチド(例えば、***促進
因子、生存因子、細胞障害性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン)に
より伝達され、これが、今度は多様な細胞レセプター又は膜結合タンパク質によ
り受け取られ解釈される。これらの分泌ポリペプチド又はシグナル分子は、通常
は細胞分泌経路を通過し、細胞外環境におけるその作用部位に到達する。 分泌タンパク質は、製薬、診断、バイオセンサー及びバイオリアクターを含む
、様々な産業的用途を有している。血栓溶解剤、インターフェロン、インターロ
イキン、エリスロポエチン、コロニー刺激因子、及び種々の他のサイトカインの
ような、現在入手可能な大抵のタンパク質薬物は分泌タンパク質である。膜タン
パク質であるそのレセプターもまた治療又は診断用薬剤としての可能性を有して
いる。新規な未変性の分泌タンパク質を同定する努力が産業界と学術界の両方に
よってなされている。多くの努力が新規な分泌タンパク質のコード配列を同定す
るために哺乳動物組換えＤＮＡライブラリーのスクリーニングに注がれている。
スクリーニング方法及び技術の例は文献に記載されている[例えば、Klein等, Ｓ
ＲＴc. Natl. Acad. Sci. 93;7108-7113(1996);米国特許第5,536,637号を参照さ
れたい]。
【０００３】 膜結合タンパク質とレセプターは、とりわけ、多細胞生物の形成、分化及び維
持において重要な役割を担っている。多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、移
動、分化又は他の細胞との相互作用は、典型的には他の細胞及び／又は直近の環
境から受け取る情報に支配される。この情報は、しばしば分泌ポリペプチド(例
えば、***促進因子、生存因子、細胞障害性因子、分化因子、神経ペプチド、及
びホルモン)により伝達され、これが次に多様な細胞レセプター又は膜結合タン
パク質により受け取られ解釈される。このような膜結合タンパク質と細胞レセプ
ターは、これらに限定されるものではないが、サイトカインレセプター、レセプ
ターキナーゼ、レセプターホスファターゼ、細胞-細胞間相互作用に関与するレ
セプター、及びセレクチン及びインテグリンのような細胞接着分子を含む。例え
ば、細胞の増殖及び分化を調節するシグナルの伝達は、様々な細胞タンパク質の
リン酸化により部分的に調節される。そのプロセスを触媒する酵素であるプロテ
インチロシンキナーゼはまた成長因子レセプターとしても作用しうる。具体例に
は、線維芽細胞成長因子レセプター及び神経成長因子レセプターが含まれる。 膜結合タンパク質とレセプター分子は、製薬及び診断薬を含む、様々な産業的
用途用を有している。例えば、レセプターイムノアドヘシンはレセプター-リガ
ンド間相互作用を阻止する治療薬として使用することができる。膜結合タンパク
質はまた、関連するレセプター／リガンド間相互作用の可能性のあるペプチド又
は小分子インヒビターをスクリーニングするために使用することもできる。新規
な未変性のレセプター又は膜結合タンパク質を同定するための努力が産業界と学
術界の双方によってなされている。多くの努力が、新規なレセプター又は膜結合
タンパク質のコード配列を同定するために、哺乳動物組換えＤＮＡライブラリー
のスクリーニングに注がれている。 最近、多くの哺乳動物タンパク質の全て又は一部をコードする独特な核酸分子
の同定と単離に顕著な進歩がみられる。ここで我々は、種々のヒトポリペプチド
をコードする少なくとも一部のｃＤＮＡ分子を構成する新規なポリヌクレオチド
の同定と特徴付けを記載する。
【０００４】 (発明の概要) ヒトポリペプチドをコードする少なくとも一部のｃＤＮＡ分子を構成する新規
なポリペプチドを同定し単離した。 一実施態様では、本発明は、添付した図に示す核酸配列の何れか一つ、又はそ
の相補配列、又は以下に定義するその核酸配列のポリヌクレオチド変異体を含ん
でなる単離された核酸分子を提供する。 他の実施態様では、本発明は、添付した図に示す核酸配列の何れか一つ、又は
その相補配列、又は以下に定義するその核酸配列のポリヌクレオチド変異体から
本質的になる単離された核酸分子を提供する。 他の実施態様では、本発明は、添付した図に示す核酸配列の何れか一つ、又は
その相補配列、又は以下に定義するその核酸配列のポリヌクレオチド変異体から
なる単離された核酸分子を提供する。 さらなる他の実施態様では、本発明は、(ａ)図１〜５６２の何れか一つのＤＮ
Ａ分子、又は(ｂ)(ａ)のＤＮＡ分子の相補鎖に対して、少なくとも約８０％の配
列同一性、好ましくは少なくとも約８１％の配列同一性、より好ましくは少なく
とも約８２％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８３％の配列同一
性、更により好ましくは少なくとも約８４％の配列同一性、更により好ましくは
少なくとも約８５％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８６％の配
列同一性、更により好ましくは少なくとも約８７％の配列同一性、更により好ま
しくは少なくとも約８８％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８９
％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９０％の酸配列同一性、更に
より好ましくは少なくとも約９１％の配列同一性、更により好ましくは少なくと
も約９２％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９３％の配列同一性
、更により好ましくは少なくとも約９４％の配列同一性、更により好ましくは少
なくとも約９５％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９６％の配列
同一性、更により好ましくは少なくとも約９７％の配列同一性、更により好まし
くは少なくとも約９８％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９９％
の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子を提供
する。
【０００５】 他の態様では、単離された核酸分子は、(ａ)図１〜５６２の何れか一つのＤＮ
Ａ分子、又は(ｂ)(ａ)のＤＮＡ分子の相補鎖に対して、少なくとも約８０％の配
列同一性、好ましくは少なくとも約８１％の配列同一性、より好ましくは少なく
とも約８２％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８３％の配列同一
性、更により好ましくは少なくとも約８４％の配列同一性、更により好ましくは
少なくとも約８５％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８６％の配
列同一性、更により好ましくは少なくとも約８７％の配列同一性、更により好ま
しくは少なくとも約８８％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８９
％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９０％の酸配列同一性、更に
より好ましくは少なくとも約９１％の配列同一性、更により好ましくは少なくと
も約９２％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９３％の配列同一性
、更により好ましくは少なくとも約９４％の配列同一性、更により好ましくは少
なくとも約９５％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９６％の配列
同一性、更により好ましくは少なくとも約９７％の配列同一性、更により好まし
くは少なくとも約９８％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９９％
の配列同一性を有するヌクレオチド配列から本質的になる。 さらなる他の態様では、単離された核酸分子は、(ａ)図１〜５６２の何れか一
つのＤＮＡ分子、又は(ｂ)(ａ)のＤＮＡ分子の相補鎖に対して、少なくとも約８
０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８１％の配列同一性、より好ましく
は少なくとも約８２％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８３％の
配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８４％の配列同一性、更により好
ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８
６％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８７％の配列同一性、更に
より好ましくは少なくとも約８８％の配列同一性、更により好ましくは少なくと
も約８９％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９０％の酸配列同一
性、更により好ましくは少なくとも約９１％の配列同一性、更により好ましくは
少なくとも約９２％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９３％の配
列同一性、更により好ましくは少なくとも約９４％の配列同一性、更により好ま
しくは少なくとも約９５％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９６
％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９７％の配列同一性、更によ
り好ましくは少なくとも約９８％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも
約９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列からなる。
【０００６】 他の実施態様では、本発明は、(ａ)図１〜５６２の何れか一つのＤＮＡ分子、
又は(ｂ)(ａ)のＤＮＡ分子の相補鎖に対してハイブリダイズするヌクレオチド配
列を含む単離された核酸分子に関する。好ましくは、ハイブリダイゼーションは
ストリンジェントなハイブリダイゼーション及び洗浄条件下で起こる。また、単
離された核酸分子が(ａ)図１〜５６２の何れか一つのＤＮＡ分子子、又は(ｂ)(
ａ)のＤＮＡ分子の相補鎖に完全に相補的であるのが好ましい。 さらなる他の実施態様では、本発明は、例えばハイブリダイゼーションオリゴ
ヌクレオチドプローブとして、又は抗体の結合部位を含んでいてもよいポリペプ
チド断片をコードするための用途が見出されうる、(ａ)図１〜５６２の何れか一
つのＤＮＡ分子、又は(ｂ)(ａ)のＤＮＡ分子の相補鎖内に含まれる少なくとも約
１０の連続ヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する。特定の態様にお
いて、単離された核酸分子は約１０〜約１０００、約１０〜約９００、約１０〜
約８００、約１０〜約７００、約１０〜約６００、約１０〜約５００、約１０〜
約４００、約１０〜約３００、約１０〜約２００、約１０〜約１００、約１０〜
約９０、約１０〜約８０、約１０〜約７０、約１０〜約６０、約１０〜約５０、
約１０〜約４０、約１０〜約３０又は約１０〜約２０のヌクレオチド長であり、
ここで「約」という用語は、示されたヌクレオチド配列長にその示された長さの
１０％をプラス又はマイナスすることを意味する。さらなる他の態様では、単離
された酸分子は、(ａ)図１〜５６２の何れか一つのＤＮＡ分子、又は(ｂ)(ａ)の
ＤＮＡ分子の相補鎖内に含まれる少なくとも約１５、２０、２５、３０、３５、
４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５又
は１００の連続ヌクレオチドを含む。
【０００７】 また、本発明は、哺乳動物ポリペプチドをコードする哺乳動物ｃＤＮＡライブ
ラリーから全長哺乳動物ｃＤＮＡ分子の存在を検出する及び／又は得るためため
に、ここに記載した核酸分子から誘導されたヌクレオチド配列を有するオリゴヌ
クレオチドプローブを使用する方法に関する。好ましくは、哺乳動物はヒトであ
る。本方法は、ここに記載したオリゴヌクレオチドの一又は複数で哺乳動物ｃＤ
ＮＡライブラリーをスクリーニングし、全長ｃＤＮＡの存在を検出し、場合によ
っては該ライブラリーから全長ｃＤＮＡを取得することを含む。 他の実施態様では、本発明はここに記載した単離された核酸分子又はその変異
体の任意のものを含んでなるベクターを提供する。 そのようなベクターを含んでなる宿主細胞もまた提供される。例を挙げると、
宿主細胞はＣＨＯ細胞、大腸菌、又は酵母でありうる。ポリペプチドを生産する
ための方法が更に提供され、これは、ポリペプチドの発現に適した条件下で宿主
細胞を培養し、細胞培養物から所望のポリペプチドを回収することを含んでなる
。 他の実施態様では、本発明はここに記載した単離された核酸分子の何れかによ
りコードされる単離されたポリペプチドを提供し、ここで、これらのポリペプチ
ドをＳＲＴポリペプチドと命名する。 さらなる他の実施態様では、本発明は、ここに記載した核酸分子によりコード
されるポリペプチドに特異的に結合する抗体を提供する。好ましくは、抗体はモ
ノクローナル抗体である。
【０００８】 (好適な実施態様の詳細な説明) Ｉ．定義 ここで使用される際の「ＳＲＴポリペプチド」という用語は、「天然配列ＳＲ
Ｔポリペプチド」及び「ＳＲＴポリペプチド変異体」(これはここでさらに定義
する)を包含する。「ＳＲＴ」とは、添付した図に示す核酸分子によりコードさ
れるポリペプチド及びその変異体、添付した図に示す配列を含む核酸分子及びそ
の変異体、並びに上記のものの断片に対して与えられる記号表示である。本発明
のＳＲＴポリペプチドはヒト組織型又は他の供給源といった種々の供給源から単
離してもよく、組換え又は合成方法によって調製してもよい。 「天然配列」ＳＲＴポリペプチドは、天然由来の対応するＳＲＴポリペプチド
と同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでいる。このような天然配列
ＳＲＴポリペプチドは、自然から単離することもできるし、組換え及び／又は合
成手段により生産することもできる。「天然配列ＳＲＴポリペプチド」という用
語には、特に、自然に生じる切断又は分泌形態(例えば、細胞外ドメイン配列)、
自然に生じる変異形態(例えば、選択的にスプライシングされた形態)及びそのポ
リペプチドの自然に生じる対立遺伝子変異体が含まれる。 ＳＲＴポリペプチド「細胞外ドメイン」又は「ＥＣＤ」は、膜貫通及び細胞質
ドメインを本質的に有しないＳＲＴポリペプチドの形態を称する。通常、ＳＲＴ
ポリペプチドＥＣＤは、このような膜貫通及び／又は細胞質ドメインを約１％未
満、好ましくはそのようなドメインを約０．５％未満しか持たない。本発明のＳ
ＲＴポリペプチドについて同定された任意の膜貫通ドメインは、疎水性ドメイン
のその型を同定するために当該分野において日常的に使用される基準に従い同定
されることが理解されるであろう。膜貫通ドメインの厳密な境界は変わり得るが
、最初に同定されたドメインのいずれかの末端から約５アミノ酸を越えない可能
性が高い。
【０００９】 「ＳＲＴポリペプチド変異体」とは、特に記載される任意の他のポリペプチド
の特に誘導された断片のアミノ酸配列と少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一
性を有する下記に定義の活性ＳＲＴポリペプチドを意味する。このようなＳＲＴ
ポリペプチド変異体には、例えば、全長アミノ酸配列のＮ-又はＣ-末端並びに一
又は複数の内部ドメインに、一又は複数のアミノ酸残基が付加、もしくは欠失さ
れたＳＲＴポリペプチドが含まれる。通常、ＳＲＴポリペプチド変異体は、添付
した図に示す核酸分子によりコードされるＳＲＴポリペプチド又はその特定の断
片と、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約
８１％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８２％のアミノ酸配
列同一性、より好ましくは少なくとも約８３％のアミノ酸配列同一性、より好ま
しくは少なくとも約８４％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約
８５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８６％のアミノ酸配
列同一性、より好ましくは少なくとも約８７％のアミノ酸配列同一性、より好ま
しくは少なくとも約８８％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約
８９％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％のアミノ酸配
列同一性、より好ましくは少なくとも約９１％のアミノ酸配列同一性、より好ま
しくは少なくとも約９２％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約
９３％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９４％のアミノ酸配
列同一性、より好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、より好ま
しくは少なくとも約９６％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約
９７％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９８％のアミノ酸配
列同一性、そしてより好ましくは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有
している。ＳＲＴポリペプチド変異体には、天然ＳＲＴポリペプチド配列を含ま
ない。通常は、ＳＲＴポリペプチド変異体は、少なくとも約１０アミノ酸長、多
くの場合少なくとも約２０アミノ酸長、より多くの場合は少なくとも約３０アミ
ノ酸長、より多くの場合は少なくとも約４０アミノ酸長、より多くの場合は少な
くとも約５０アミノ酸長、より多くの場合は少なくとも約６０アミノ酸長、より
多くの場合は少なくとも約７０アミノ酸長、より多くの場合は少なくとも約８０
アミノ酸長、より多くの場合は少なくとも約９０アミノ酸長、より多くの場合は
少なくとも約１００アミノ酸長、より多くの場合は少なくとも約１５０アミノ酸
長、より多くの場合は少なくとも約２００アミノ酸長、より多くの場合は少なく
とも約２５０アミノ酸長、より多くの場合は少なくとも約３００アミノ酸長、又
はそれ以上である。
【００１０】 ここに同定されるＳＲＴポリペプチド配列に対する「パーセント(％)アミノ酸
配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必
要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとし
た、ＳＲＴ配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセ
ントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のための
アラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばBLAST、BLAST
-2、ALIGN、ALIGN-2又はMegalign(DNASTAR)ソフトウエアのような公に入手可能
なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であ
れば、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必
要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメ
ータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配
列同一性値は、以下に記載するように、ALIGN-2プログラム用の完全なソースコ
ードが表１に与えられている配列比較コンピュータプログラムALIGN-2を用いて
得られる。ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムはジェネンテク社によって
作成され、表１に示したソースコードは米国著作権事務所, Washington D.C., 2
0559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号TXU510087の下で登
録されている。ALIGN-2プログラムはジェネンテク社、South San Francisco, Ca
liforniaを通して公的に入手可能であり、また表１に与えたソースコードからコ
ンパイルしてもよい。ALIGN-2プログラムは、UNIX（登録商標）オペレーティン グシステム、好ましくはデジタルUNIX V4.0Dでの使用のためにコンパイルされる 。全ての配列比較パラメータは、ALIGN-2プログラムによって設定され変動しな い。
【００１１】 ここでの目的のためには、アミノ酸配列比較にALIGN-2が用いれれる状況では
、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対
する％アミノ酸配列同一性(あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれ
に対して或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配
列Ａと言うこともできる)は次のように計算される： 分率Ｘ／Ｙの１００倍 ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムALIGN-2のＡ及びＢのプログラムア
ラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、
ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長
さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％ア
ミノ酸配列同一性とは異なると認識されるであろう。％アミノ酸配列同一性の計
算の例として、表２及び３は、「比較タンパク質」と称されるアミノ酸配列の「
ＰＲＯ」と称されるアミノ酸配列に対する％アミノ酸配列同一性の計算方法を示
す。 特に断らない限りは、ここで使用されるの全ての％アミノ酸配列同一性値は上
記のようにALIGN-2配列比較コンピュータプログラムを用いて得られる。しかし
ながら、％アミノ酸配列同一性は、NCBI-BLAST2(Altschul等, Nucleic Acids Re
s. 25: 3389-3402 (1997))を用いて決定してもよい。NCBI-BLAST2配列比較プロ
グラムは、http://ww.ncbi.nlm.nih.govからダウンロードすることができる。NC
BI-BLAST2は幾つかの検索パラメータを使用し、それら検索パラメータの全ては
デフォルト値に設定され、例えば、unmask＝可、鎖＝全て、予測される発生＝１
０、最小低複合長＝１５／５、マルチパスｅ-値＝０．０１、マルチパスの定数
＝２５、最終ギャップアラインメントのドロップオフ＝２５、及びスコアリング
マトリクス＝BLOSUM62を含む。 アミノ酸配列比較にNCBI-BLAST2が用いられる状況では、与えられたアミノ酸
配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同
一性(あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％
アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともでき
る)は次のように計算される： 分率Ｘ／Ｙの１００倍 ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムNCBI-BLAST2のＡ及びＢのプログラ
ムアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であ
り、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂ
の長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する
％アミノ酸配列同一性とは異なると評価されるであろう。
【００１２】 「ＳＲＴ変異体ポリヌクレオチド」又は「ＳＲＴ変異体核酸配列」は、添付し
た図に示す核酸配列の何れか又はその特定の断片に対して少なくとも約８０％の
核酸配列同一性を有する核酸分子を意味する。通常は、ＳＲＴ変異体ポリヌクレ
オチドは、添付した図に示す核酸配列の何れか又はその特定の断片に対して少な
くとも約８０％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８１％の核酸配
列同一性、より好ましくは少なくとも約８２％の核酸配列同一性、より好ましく
は少なくとも約８３％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８４％の
核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８５％の核酸配列同一性、より好
ましくは少なくとも約８６％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８
７％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８８％の核酸配列同一性、
より好ましくは少なくとも約８９％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくと
も約９０％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９１％の核酸配列同
一性、より好ましくは少なくとも約９２％の核酸配列同一性、より好ましくは少
なくとも約９３％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９４％の核酸
配列同一性、より好ましくは少なくとも約９５％の核酸配列同一性、より好まし
くは少なくとも約９６％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９７％
の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９８％の核酸配列同一性、そし
てより好ましくは少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有している。ＳＲＴポ
リヌクレオチド変異体は、天然のＳＲＴヌクレオチド配列を含まない。 通常は、ＳＲＴ変異体ポリヌクレオチドは、少なくとも約１０ヌクレオチド長
、多くの場合約１５ヌクレオチド長、多くの場合少なくとも約２０ヌクレオチド
長、多くの場合約２５ヌクレオチド長、多くの場合少なくとも約３０ヌクレオチ
ド長、多くの場合少なくとも約３５ヌクレオチド長、多くの場合少なくとも約４
０ヌクレオチド長、多くの場合少なくとも約４５ヌクレオチド長、多くの場合少
なくとも約５０ヌクレオチド長、多くの場合少なくとも約５５ヌクレオチド長、
多くの場合少なくとも約６０ヌクレオチド長、多くの場合少なくとも約６５ヌク
レオチド長、多くの場合少なくとも約７０ヌクレオチド長、多くの場合少なくと
も約７５ヌクレオチド長、多くの場合少なくとも約８０ヌクレオチド長、多くの
場合少なくとも約８５ヌクレオチド長、多くの場合少なくとも約９０ヌクレオチ
ド長、多くの場合少なくとも約９５ヌクレオチド長、多くの場合少なくとも約１
００ヌクレオチド長、又はそれ以上である。
【００１３】 ここに同定されるＳＲＴポリペプチドコード化核酸配列に対する「パーセント
(％)核酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得る
ために必要ならば間隙を導入し、ＳＲＴポリペプチドコード化核酸配列のヌクレ
オチドと同一である候補配列中のヌクレオチドのパーセントとして定義される。
パーセント核酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の
技量の範囲にある種々の方法、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2又はMega
lign(DNASTAR)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエア
を使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の全長
に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含
む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる
。しかし、ここでの目的のためには、％核酸配列同一性値は、以下に記載するよ
うに、ALIGN-2プログラム用の完全なソースコードが表１に与えられている配列
比較コンピュータプログラムALIGN-2を用いて得られる。ALIGN-2配列比較コンピ
ュータプログラムはジェネンテク社によって作成され、表１に示したソースコー
ドは米国著作権事務所, Washington D.C., 20559に使用者用書類とともに提出さ
れ、米国著作権登録番号TXU510087の下で登録されている。ALIGN-2はジェネンテ
ク社、South San Francisco, Californiaを通して公的に入手可能であり、また
表１に与えたソースコードからコンパイルしてもよい。ALIGN-2プログラムは、U
NIXオペレーティングシステム、好ましくはデジタルUNIX V4.0Dでの使用のため
にコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ALIGN-2プログラムによっ
て設定され変動しない。
【００１４】 ここでの目的のために、与えられた核酸配列Ｃの、与えられた核酸配列Ｄとの
、又はそれに対する％核酸配列同一性(あるいは、与えられた核酸配列Ｄと、又
はそれに対して或る程度の％核酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸
配列Ｃと言うこともできる)は次のように計算される： 分率Ｗ／Ｚの１００倍 ここで、Ｗは配列アラインメントプログラムALIGN-2のＣ及びＤのプログラムア
ラインメントによって同一であると一致したスコアのヌクレオチドの数であり、
ＺはＤの全ヌクレオチド数である。核酸配列Ｃの長さが核酸配列Ｄの長さと異な
る場合、ＣのＤに対する％核酸配列同一性は、ＤのＣに対する％核酸配列同一性
とは異なると評価されるであろう。％核酸配列同一性の計算の例として、表４及
び５は、「比較ＤＮＡ」と称される核酸配列の「ＰＲＯ-ＤＮＡ」と称される核
酸配列に対する％核酸配列同一性の計算方法を示している。 特に断らない限りは、ここで使用される全ての％核酸配列同一性値は上記のよ
うにALIGN-2配列比較コンピュータプログラムを用いて得られる。しかしながら
、％核酸配列同一性は、配列比較プログラムNCBI-BLAST2(Altschul等, Nucleic
Acids Res. 25: 3389-3402 (1997))を用いて決定してもよい。NCBI-BLAST2配列
比較プログラムは、http://ww.ncbi.nlm.nih.govからダウンロードすることがで
きる。NCBI-BLAST2は幾つかの検索パラメータを使用し、それら検索パラメータ
の全てはデフォルト値に設定され、例えば、unmask＝可、鎖＝全て、予測される
発生＝１０、最小低複合長＝１５／５、マルチパスｅ-値＝０．０１、マルチパ
スの定数＝２５、最終ギャップアラインメントのドロップオフ＝２５、及びスコ
アリングマトリクス＝BLOSUM62を含む。 配列比較にNCBI-BLAST2が用いれれる状況では、与えられた核酸配列Ｃの、与
えられた核酸配列Ｄとの、又はそれに対する％核酸配列同一性(与えられた核酸
配列Ｄと、又はそれに対して或る程度の％核酸配列同一性を持つ又は含む与えら
れた核酸配列Ｃと言うこともできる)は次のように計算される： 分率Ｗ／Ｚの１００倍 ここで、Ｗは配列アラインメントプログラムNCBI-BLAST2のＣ及びＤのプログラ
ムアラインメントによって同一であると一致したスコアのヌクレオチドの数であ
り、ＺはＤの全ヌクレオチド数である。核酸配列Ｃの長さが核酸配列Ｄの長さと
異なる場合、ＣのＤに対する％核酸配列同一性は、ＤのＣに対する％核酸配列同
一性とは異なると評価されるであろう。
【００１５】 他の実施態様では、ＳＲＴ変異体ポリヌクレオチドは、活性ＳＲＴポリペプチ
ドをコードし、好ましくは緊縮性ハイブリダイゼーション条件下で、添付した図
に示すヌクレオチド配列の任意のもの、又はそれらの相補鎖にハイブリダイゼー
ション可能な核酸分子である。ＳＲＴ変異体ポリペプチドは、ＳＲＴ変異体ポリ
ヌクレオチドにコードされるものであってもよい。
【００１６】 「陽性(ポジティブ)」という用語は、上記のように実施されたアミノ酸配列同
一性比較の中で、比較された配列において同一ではないが類似の特性を有してい
るアミノ酸残基を含む。関心あるアミノ酸残基に対して陽性とされたアミノ酸残
基は、関心あるアミノ酸残基と同一であるか、又は関心あるアミノ酸残基の好ま
しい置換(下記の表６に定義)であるものである。 ここでの目的のために、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配
列Ｂとの、又はそれに対する陽性の％値(あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂ
と、又はそれに対して或る程度の％陽性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列
Ａと言うこともできる)は次のように計算される： 分率Ｘ／Ｙの１００倍 ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムALIGN-2のＡ及びＢのプログラムア
ラインメントによって、上述にように陽性であるとされたスコアのアミノ酸残基
の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ
酸配列Ｂの長さと等しくない場合、ＡのＢに対する％陽性は、ＢのＡに対する％
陽性とは異なると評価されるであろう。
【００１７】 「単離された」とは、ここで開示された種々のポリペプチドを記述するために
使用するときは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収され
たポリペプチドを意味する。好ましくは、単離されたポリペプチドは天然にはそ
れに付随している全ての成分が付随していない。その自然環境の汚染成分とは、
そのポリペプチドの診断又は治療への使用を典型的には妨害する物質であり、酵
素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ま
しい実施態様では、ポリペプチドは、(１)スピニングカップシークエネーターを
使用することにより、少なくとも１５残基のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列を
得るのに充分なほど、あるいは、(２)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染
色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性まで精
製される。単離されたポリペプチドには、ＳＲＴの自然環境の少なくとも１つの
成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツのポリペプチドが含まれる。
しかしながら、通常は、単離されたポリペプチドは少なくとも１つの精製工程に
より調製される。 「単離された」ＳＲＴポリペプチドコード化核酸分子は、同定され、ＳＲＴコ
ード化核酸の天然源に通常付随している少なくとも１つの汚染核酸分子から分離
された核酸分子である。好ましくは、単離された核酸は、自然にはそれに付随し
ている全ての汚染物質が付随していない。単離されたＳＲＴコード化核酸分子は
天然に見出される形態あるいは設定以外のものである。ゆえに、単離された核酸
分子は、天然の細胞中に存在するＳＲＴコード化核酸分子とは区別される。しか
し、単離されたＳＲＴポリペプチドコード化核酸分子は、例えば、核酸分子が天
然細胞のものとは異なった染色***置にあるＳＲＴを通常発現する細胞に含まれ
るＳＲＴコード核酸分子を含む。
【００１８】 「コントロール配列」なる用語は、特定の宿主生物において作用可能に結合し
たコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を称する。例えば原核生物に好
適なコントロール配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列、及び
リボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化
シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。 核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合」してい
る。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に
参画するプレタンパク質として発現されているなら、そのポリペプチドのＤＮＡ
に作用可能に結合している；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影
響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に結合している；又はリボソーム結合
部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード配列と作用
可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合している」とは、結合したＤ
ＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズに
あることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも近接している必要はない
。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位
が存在しない場合は、従来の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプター
あるいはリンカーが使用される。
【００１９】 「抗体」という用語は最も広い意味において使用され、例えば、単一の抗-Ｓ
ＲＴモノクローナル抗体(アゴニスト、アンタゴニスト、及び中和抗体を含む)、
多エピトープ特異性を持つ抗-ＳＲＴ抗体組成物、一本鎖抗-ＳＲＴ抗体、及び抗
-ＳＲＴ抗体の断片(下記参照)を包含している。ここで使用される「モノクロー
ナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団、すなわち、集団に含まれ
る個々の抗体が、少量存在しうる自然に生じる可能性のある突然変異を除いて同
一である集団から得られる抗体を称する。 ハイブリダイゼーション反応の「緊縮性」は、当業者によって容易に決定され
、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な計算である。
一般に、プローブが長くなると適切なアニーリングのための温度が高くなり、プ
ローブが短くなると温度は低くなる。ハイブリダイゼーションは、一般的に、相
補的鎖がその融点に近いがそれより低い環境に存在する場合における変性ＤＮＡ
の再アニールする能力に依存する。プローブとハイブリダイゼーション可能な配
列との間の所望の相同性の程度が高くなると、使用できる相対温度が高くなる。
その結果、より高い相対温度は、反応条件をより緊縮性にするが、低い温度は緊
縮性を低下させる。ハイブリダイゼーション反応の緊縮性の更なる詳細及び説明
は、Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscienc
e Publishers, (1995)を参照のこと。 ここで定義される「緊縮性条件」又は「高度の緊縮性条件」は、(１)洗浄のた
めに低イオン強度及び高温度、例えば、５０℃において０．０１５Ｍの塩化ナト
リウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリ
ウムを用いるもの；(２)ハイブリダイゼーション中にホルムアミド等の変性剤、
例えば、４２℃において５０％(v/v)ホルムアミドと０．１％ウシ血清アルブミ
ン／０．１％フィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのｐＨ６
．５のリン酸ナトリウムバッファー、及び７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍ
Ｍクエン酸ナトリウムを用いるもの；又は(３)４２℃における５０％ホルムアミ
ド、５ｘＳＳＣ(０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム)、
５０ｍＭのリン酸ナトリウム(ｐＨ６．８)、０．１％のピロリン酸ナトリウム、
５ｘデンハート液、超音波処理サケ***ＤＮＡ(５０μｇ／ｍｌ)、０．１％ＳＤ
Ｓ、及び１０％のデキストラン硫酸と、４２℃における０．２ｘＳＳＣ(塩化ナ
トリウム／クエン酸ナトリウム)中の洗浄及び５５℃での５０％ホルムアミド、
ついで５５℃におけるＥＤＴＡを含む０．１ｘＳＳＣからなる高緊縮性洗浄を用
いるものによって同定される。 「中程度の緊縮性条件」は、Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989に記載されて
いるように同定され、上記の緊縮性より低い洗浄溶液及びハイブリダイゼーショ
ン条件(例えば、温度、イオン強度及び％ＳＤＳ)の使用を含む。中程度の緊縮性
条件の例は、２０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ(１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍ
Ｍのクエン酸三ナトリウム)、５０ｍＭリン酸ナトリウム(ｐＨ７．６)、５ｘデ
ンハート液、１０％デキストラン硫酸、及び２０ｍｇ／ｍＬの変性剪断サケ***
ＤＮＡを含む溶液中の３７℃での終夜インキュベーション、ついで１ｘＳＳＣ中
３７−５０℃でのフィルターの洗浄といった条件である。当業者であれば、プロ
ーブ長などの因子に適合させる必要に応じて、どのようにして温度、イオン強度
等を調節するかを認識するであろう。
【００２０】 「エピトープタグ」なる用語は、ここで用いられるときは、「タグポリペプチ
ド」に融合したＳＲＴポリペプチドを含んでなるキメラポリペプチドを称する。
タグポリペプチドは、その抗体が産生され得るエピトープを提供するに十分な残
基を有しているが、その長さはそれが融合するポリペプチドの活性を阻害しない
よう充分に短い。また、タグポリペプチドは、好ましくは、抗体が他のエピトー
プと実質的に交差反応をしないようにかなり独特である。適切なタグポリペプチ
ドは、一般に、少なくとも６のアミノ酸残基、通常は約８〜約５０のアミノ酸残
基(好ましくは約１０〜約２０のアミノ酸残基)を有する。 ここで用いられる「イムノアドヘシン」なる用語は、異種タンパク質(「アド
ヘシン」)の結合特異性と免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能とを
結合した抗体様分子を指す。構造的には、イムノアドヘシンは、所望の結合特異
性を持ち、抗体の抗原認識及び結合部位以外である(即ち「異種の」)アミノ酸配
列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物を含む。イムノアドヘシン分
子のアドへシン部分は、典型的には少なくともレセプター又はリガンドの結合部
位を含む隣接アミノ酸配列である。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメ
イン配列は、ＩｇＧ-１、ＩｇＧ-２、ＩｇＧ-３又はＩｇＧ-４サブタイプ、Ｉｇ
Ａ(ＩｇＡ-１及びＩｇＡ-２を含む)、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭなどの任意の免
疫グロブリンから得ることができる。 ここで目的としている「活性な」及び「活性」とは、天然又は天然発生ＳＲＴ
の生物学的及び／又は免疫学的活性を保持するＳＲＴの形態を称し、「生物学的
」活性とは、天然又は天然発生ＳＲＴによって生ずる(阻害性又は刺激性の)生物
学的機能であって、天然又は天然発生ＳＲＴが有する抗原性エピトープに対して
抗体を生成する能力を除くものを意味し、「免疫学的」活性とは、天然又は天然
発生ＳＲＴが有する抗原性エピトープに対して抗体を生成する能力を称する。 「アンタゴニスト」なる用語は最も広い意味で用いられ、ここに開示した天然
ＳＲＴポリペプチドの生物学的活性を部分的もしくは完全に阻止、阻害、又は中
和する任意の分子を含む。同様に「アゴニスト」なる用語も最も広い意味で用い
られ、ここに開示した天然ＳＲＴポリペプチドの生物学的活性を模倣する任意の
分子を含む。好適なアゴニスト又はアンタゴニスト分子は特に、アゴニスト又は
アンタゴニスト抗体又は抗体断片、天然ＳＲＴポリペプチドの断片又はアミノ酸
配列変異体、ペプチド、有機小分子等を含む。ＳＲＴポリペプチドのアゴニスト
又はアンタゴニストの同定方法は、ＳＲＴポリペプチドを候補アンタゴニスト又
はアゴニスト分子と接触させ、ＳＲＴポリペプチドに通常付随する一又は複数の
生物学的活性の検出可能な変化を測定することを含みうる。
【００２１】 「治療」とは、治癒的処置、予防的及び防止的療法の両方を意味し、目的は標
的とする病理学的状態又は疾患を防止又は低下(減少)させることにある。治療が
必要なものとは、既に疾患に罹っているもの、並びに疾患に罹りやすいもの又は
疾患が防止されるべきものを含む。 「慢性」投与とは、急性様式とは異なり連続的な様式での薬剤を投与し、初期
の治療効果(活性)を長時間に渡って維持することを意味する。「間欠」投与とは
、中断無く連続的になされるのではなく、むしろ周期的になされる性質の治療で
ある。 治療の目的のための「哺乳動物」は、ヒト、家庭及び農業用動物、動物園、ス
ポーツ、又はペット動物、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ
、ウサギなどを含む哺乳類に分類される任意の動物を称する。好ましくは、哺乳
動物はヒトである。 一又は複数の治療薬と「組み合わせた」投与とは、同時(同時期)及び任意の順
序での連続した投与を含む。 ここで用いられる「担体」は、製薬的に許容されうる担体、賦形剤、又は安定
化剤を含み、用いられる用量及び濃度でそれらに暴露される細胞又は哺乳動物に
対して非毒性である。生理学的に許容されうる担体は、水性ｐＨ緩衝溶液である
ことが多い。生理学的に許容されうる担体の例は、リン酸塩、クエン酸塩、及び
他の有機酸塩のバッファー；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量(約１
０残基未満)ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又
は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、
例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシン；グルコー
ス、マンノース又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；Ｅ
ＤＴＡ等のキレート剤；マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール；ナト
リウム等の塩形成対イオン；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えばTWEENＴ
Ｍ、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、及びPLURONICSＴＭを含む。
【００２２】 「抗体断片」は、無傷の抗体の一部、好ましくは無傷の抗体の抗原結合又は可
変領域を含む。抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ')２、及びＦｖ断
片；ダイアボディ(diabodies)；直鎖状抗体(Zapata等, Protein Eng. 8(10): 10
57-1062 [1995])；一本鎖抗体分子；及び抗体断片から形成された多重特異性抗
体を含む。 抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗体結合断片
を生成し、その各々は単一の抗原結合部位を持ち、残りは容易に結晶化する能力
を反映して「Ｆｃ」断片と命名される。ペプシン処理はＦ(ａｂ')２断片を生じ
、それは２つの抗原結合部位を持ち、抗原を交差結合することができる。 「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び結合部位を含む最小の抗体断片である。この
領域は、密接に非共有結合した１本の重鎖と１本の軽鎖の可変ドメインの二量体
からなる。この配置において各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用してＶＨ
−ＶＬ二量体の表面に抗原結合部位を決定する。集合的には、６つのＣＤＲｓは
抗体に対して抗原結合特異性をもたらす。しかしながら、単一の可変ドメイン(
又は抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含んでなるＦｖの半分)でさえ、結合部
位全体よりは低い親和性であるが、抗原を認識し結合する能力を持つ。 またＦａｂ断片は、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン(ＣＨ
１)も含む。Ｆａｂ断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含
む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に幾つかの残基が付加されていることに
よりＦａｂ断片と相違する。ここで、Ｆａｂ'-ＳＨは、定常ドメインのシステイ
ン残基が遊離のチオール基を持つＦａｂ’を表す。Ｆ(ａｂ')２抗体断片は、最
初はＦａｂ’断片の対として生成され、それらの間にヒンジシステインを有する
。抗体断片の他の化学的結合も知られている。 任意の脊椎動物種からの抗体(免疫グロブリン)の「軽鎖」は、それらの定常ド
メインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ及びラムダと呼ばれる二つの明らかに
異なる型の一方に割り当てられる。 それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンは異
なるクラスに分類できる。免疫グロブリンには五つの主要なクラス：ＩｇＡ、Ｉ
ｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、これらの幾つかは更にサブクラス(ア
イソタイプ)、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３，ＩｇＧ４、ＩｇＡ及びＩ
ｇＡ２に分割される。
【００２３】 「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含
み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。好ましくは、Ｆｖポ
リペプチドはＶＨ及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーを更に含み、それ
はｓＦＶが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にする。ｓＦｖの概説に
ついては、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg
及びMoore編, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)のPluckthunを
参照のこと。 用語「ダイアボディ(diabodies)」は、二つの抗原結合部位を持つ小型の抗体
断片を称し、その断片は同じポリペプチド鎖(ＶＨ−ＶＬ)内で軽鎖可変ドメイン
(ＶＬ)に結合した重鎖可変ドメイン(ＶＨ)を含む。同じ鎖の二つのドメイン間に
対形成するには短すぎるリンカーを用いることにより、ドメインは強制的に他の
鎖の相補的ドメインと対形成して二つの抗原結合部位を生成する。ダイアボディ
は、例えば、EP 404,097; WO 93/11161; 及びHollinger等, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)に十分に記載されている。 「単離された」抗体は、その自然環境の成分から同定され分離及び／又は回収
されたものである。その自然環境の汚染成分とは、その抗体の診断又は治療への
使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タン
パク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様では、抗体は、(１)ローリ法(Lowry
method)で測定した場合９５重量％を越える抗体、最も好ましくは９９重量％を
越えるまで、(２)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少
なくとも１５残基のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、あ
るいは、(３)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるい
は還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一になるまで精製される。単離され
た抗体には、抗体の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、組換え
細胞内のインサイツの抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離された抗体
は少なくとも１つの精製工程により調製される。
【００２４】 特定のポリペプチド又は特定のポリペプチドのエピトープに「特異的に結合す
る」又は「対して特異的である」抗体とは、任意の他のポリペプチド又はポリペ
プチドエピトープに実質的に結合することなく、特定のポリペプチド又は特定の
ポリペプチドのエピトープに結合するものである。 「標識」なる語は、ここで用いられる場合、抗体に直接又は間接的に結合して
「標識」抗体を生成する検出可能な化合物又は組成物を称する。標識は、それ自
身検出可能でもよく(例えば、放射性標識又は蛍光標識)、又は酵素標識の場合、
検出可能な基質化合物又は組成物の化学変化を触媒してもよい。 「固相」とは、本発明の抗体がそれに付着することのできる非水性マトリクス
を意味する。ここに包含する固相の例は、部分的又は全体的に、ガラス(例えば
、孔調整ガラス)、多糖類(例えばアガロース)、ポリアクリルアミド、ポリスチ
レン、ポリビニルアルコール及びシリコーンから形成されたものを含む。或る種
の実施態様では、内容に応じて、固相はアッセイプレートのウェルを構成するこ
とができ；その他では精製カラム(例えばアフィニティクロマトグラフィーカラ
ム)とすることもできる。また、この用語は、米国特許第4,275,149号に記載され
たような、別個の粒子の不連続な固相も包含する。 「リポソーム」は、種々の型の脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤からなる
小型の小胞であり、哺乳動物への薬物(ＳＲＴポリペプチド又はその抗体など)の
送達に有用である。リポソームの成分は、通常は生体膜の脂質配置に類似する二
層構造に配置される。 「小分子」とは、ここでは約５００ダルトン以下の分子量を持つと定義される
。
【００２５】 「オリゴヌクレオチド」又は「オリゴマー」は、ポリメラーセ連鎖反応(ＰＣ
Ｒ)に使用できる程の十分な数の塩基を有するヌクレオチド残基の一配列である
。これらの配列はゲノム又はｃＤＮＡ配列に基づいており(又はこれらからデザ
インされ)、特定の細胞又は組織において同一、類似又は相補的なＤＮＡ又はＲ
ＮＡの存在を増幅、確認又は明らかにするために使用されうる。オリゴヌクレオ
チド又はオリゴマーは、上述したような少なくとも約１０ヌクレオチドを有する
ＤＮＡ配列の一部を含んでなる。オリゴヌクレオチドは化学的に合成してもよく
、プローブとして使用してもよい。 「プローブ」は、用途に応じて、好ましくは約１０から多くなるとほぼ約６０
００ヌクレオチドの間で、可変長さの核酸配列である。それらは、同一、類似又
は相補的な核酸配列の検出に使用される。より長いプローブは、通常、天然又は
組換え供給源から得られたものであり、高度に特異的であり、オリゴマーよりも
標的核酸にハイブリダイズするのが遅いことがよくある。プローブは一本鎖又は
二本鎖であってよく、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーション膜ベース、又はエライザ
のような技術において特異性を持つように注意深くデザインされうる。 本発明の核酸分子に対して「検出可能に標識された」とは、分子に、例えば放
射性核種、酵素、蛍光、化学発光又は発色剤のような検出可能な化合物が、共有
結合か非共有結合のいずれかにより、結合されていることを意味する。検出可能
な標識は特定の核酸又はアミノ酸配列と結合し、その存在を明らかにし、その定
量を可能にする。 ポリヌクレオチド又は核酸分子の「一部」又は「断片」は、プローブとして使
用可能な約６ｋｂ、好ましくは約１ｋｂより少ないヌクレオチドを有するヌクレ
オチド配列の全て又は任意の一部を含んでなる。このようなプローブは、ニック
トランスレーション、クレノーフィルイン反応(Klenow fill-in reaction)、Ｐ
ＣＲ、又は当該分野でよく知られている他の方法を使用して、検出可能な標識で
標識してもよい。反応条件の最適化と擬陽性の除去のために予備試験した後、核
酸プローブをサザン、ノーザン又はインサイツハイブリダイゼーションに使用し
て、タンパク質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡが生物学的試料、細胞型、組織、
器官又は生物体に存在するかどうかを決定することができる。
【００２６】
【００２７】 ＩＩ. 本発明の組成物と方法 Ａ．全長ＳＲＴポリペプチド 本発明は、本出願でＳＲＴポリペプチドと称される全長ヒトポリペプチドの少
なくとも一部をコードする新規に同定され単離されたポリヌクレオチド配列を提
供する。特に下記の実施例でさらに詳細に開示されるように、ＳＲＴポリペプチ
ドの少なくとも一部をコードするｃＤＮＡが同定され単離された。単純化の目的
のために、本明細書において、ここに開示した核酸分子にコードされるポリペプ
チド並びに上記のＳＲＴの定義に含まれるさらなる天然相同体及び変異体は、そ
れらの起源又は調製形式に関わらず、「ＳＲＴ」で呼称する。
【００２８】 Ｂ．ＳＲＴポリペプチド変異体 ここに記載した天然配列ＳＲＴポリペプチドに加えて、ＳＲＴ変異体も調製で
きると考えられる。ＳＲＴ変異体は、ＳＲＴ ＤＮＡに適当なヌクレオチド変化
を導入することにより、及び／又は所望のＳＲＴポリペプチドを合成することに
より調製できる。当業者は、グリコシル化部位の数又は位置の変化あるいは膜固
着特性の変化などのアミノ酸変化がＳＲＴの翻訳後プロセスを変えうることを認
識するであろう。 天然配列ＳＲＴ又はここに記載したＳＲＴの種々のドメインにおける変異は、
例えば、米国特許第5,364,934号に記載されている保存的及び非保存的変異につ
いての任意の技術及び指針を用いてなすことができる。変異は、結果として天然
配列ＳＲＴと比較してＳＲＴのアミノ酸配列が変化するＳＲＴをコードする一又
は複数のコドンの置換、欠失又は挿入であってよい。場合によっては、変異は少
なくとも１つのアミノ酸のＳＲＴの一又は複数のドメインの任意の他のアミノ酸
による置換である。アミノ酸残基が所望の活性に悪影響を与えることなく挿入、
置換又は欠失されるかの指針は、ＳＲＴの配列を相同性の知られたタンパク質分
子の配列と比較し、相同性の高い領域内でなされるアミノ酸配列変化の数を最小
にすることによって見出される。アミノ酸置換は、一のアミノ酸の類似した構造
及び／又は化学特性を持つ他のアミノ酸での置換、例えばロイシンのセリンでの
置換、即ち保存的アミノ酸置換の結果とすることができる。挿入又は欠失は、場
合によっては約１から５のアミノ酸の範囲内とすることができる。許容される変
異は、配列においてアミノ酸の挿入、欠失又は置換を系統的に作成し、得られた
変異体について全長又は成熟天然配列が示す活性を試験することにより決定され
る。
【００２９】 ＳＲＴポリペプチド断片がここに提供される。このような断片は、例えば、全
長天然タンパク質と比較した際に、Ｎ-末端又はＣ-末端で切断されてもよく、又
は内部残基を欠いていてもよい。或る種の断片は、ＳＲＴポリペプチドの所望の
生物学的活性に必須ではないアミノ酸残基を欠いている。 ＳＲＴ断片は、多くの従来技術の任意のものによって調製してよい。所望のペ
プチド断片は化学合成してもよい。代替的方法は、酵素的消化、例えば特定のア
ミノ酸残基によって定められる部位のタンパク質を切断することが知られた酵素
でタンパク質を処理することにより、あるいは適当な制限酵素でＤＮＡを消化し
て所望の断片を単離することによるＳＲＴ断片の生成を含む。さらに他の好適な
技術は、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)により、所望のポリペプチド断片をコー
ドするＤＮＡ断片を単離し増幅することを含む。ＤＮＡ断片の所望の末端を定め
るオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲの５’及び３’プライマーで用いられる。好ま
しくは、ＳＲＴポリペプチド断片は対応天然ＳＲＴポリペプチドと少なくとも１
つの生物学的及び／又は免疫学的活性を共有する。 特別の実施態様では、関心ある保存的置換を、好ましい置換との表題で表６に
示す。このような置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、表６に例示的置換
と名前を付けた又は以下にアミノ酸分類でさらに記載するように、より実質的な
変化が導入され生成物がスクリーニングされる。
【００３０】 ＳＲＴポリペプチドの機能又は免疫学的同一性の実質的修飾は、(ａ)置換領域
のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋配置、(ｂ)標的部位の分子の
電荷又は疎水性、又は(ｃ)側鎖の嵩を維持しながら、それらの効果において実質
的に異なる置換基を選択することにより達成される。天然発生残基は共通の側鎖
特性に基づいてグループに分けることができる： (１)疎水性：ノルロイシン, met, ala, val, leu, ile; (２)中性の親水性：cys, ser, thr; (３)酸性：asp, glu; (４)塩基性：asn, gln, his, lys, arg; (５)鎖配向に影響する残基：gly, pro; 及び (６)芳香族：trp, tyr, phe。 非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを
必要とするであろう。また、そのように置換された残基は、保存的置換部位、好
ましくは残された(非保存)部位に導入されうる。 変異は、オリゴヌクレオチド媒介(部位指向性)突然変異誘発、アラニンスキャ
ンニング、及びＰＣＲ突然変異誘発等の当該技術において公知の技術を使用して
作成することができる。部位指向性突然変異誘発［Carter等, Nucl. Acids Res.
, 13: 4331 (1986); Zoller等, Nucl. Acids Res., 10: 6487 (1987)］、カセッ
ト突然変異誘発［Wells等, Gene, 34: 315 (1985)］、制限選択突然変異誘発［W
ells等, Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 (1986)］又は他の周
知の技術が、ＳＲＴ変異体ＤＮＡを製造するために、クローン化されたＤＮＡに
実施できる。 また、隣接配列に沿って一又は複数のアミノ酸を同定するのにスキャンニング
アミノ酸分析を用いることができる。好ましいスキャンニングアミノ酸は比較的
小さく、中性のアミノ酸である。そのようなアミノ酸は、アラニン、グリシン、
セリン、及びシステインを含む。アラニンは、ベータ炭素を越える側鎖を排除し
変異体の主鎖構造を変化させにくいので、この群の中で典型的に好ましいスキャ
ンニングアミノ酸である［Cuningham及びWells, Science, 244: 1081-1085 (198
9)］。また、アラニンは最もありふれたアミノ酸であるため典型的には好ましい
。さらに、それは埋もれた及び露出した位置の両方に見られることが多い［Crei
ghton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol.,
150: 1 (1976)］。アラニン置換が十分な量の変異体を生じない場合は、アイソ
テリック(isoteric)アミノ酸を用いることができる。
【００３１】 Ｃ．ＳＲＴポリペプチドの修飾 ＳＲＴポリペプチドの共有結合的修飾は本発明の範囲内に含まれる。共有結合
的修飾の一型は、ＳＲＴポリペプチドの標的とするアミノ酸残基を、ＳＲＴの選
択された側鎖又はＮ又はＣ末端残基と反応できる有機誘導体化試薬と反応させる
ことを含む。二官能性試薬での誘導体化が、例えばＳＲＴを水不溶性支持体マト
リクスあるいは抗-ＳＲＴ抗体の精製方法又はその逆で用いるための表面に架橋
させるのに有用である。通常用いられる架橋剤は、例えば、１，１-ビス(ジアゾ
アセチル)-２-フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ-ヒドロキシスクシンイ
ミドエステル、例えば４-アジドサリチル酸、３，３’-ジチオビス(スクシンイ
ミジルプロピオネート)等のジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イ
ミドエステル、ビス-Ｎ-マレイミド-１，８-オクタン等の二官能性マレイミド、
及びメチル-３-[(ｐ-アジドフェニル)-ジチオ］プロピオイミダート等の試薬を
含む。 他の修飾は、グルタミニル及びアスパラギニル残基の各々対応するグルタミル
及びアスパルチル残基への脱アミノ化、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、
セリル又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、
及びヒスチジン側鎖のα-アミノ基のメチル化[T.E. Creighton, Proteins: Stru
cture and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp.79
-86 (1983)]、Ｎ末端アミンのアセチル化、及び任意のＣ末端カルボキシル基の
アミド化を含む。
【００３２】 本発明の範囲内に含まれるＳＲＴポリペプチドの共有結合的修飾の他の型は、
ポリペプチドの天然グリコシル化パターンの変更を含む。「天然グリコシル化パ
ターンの変更」とは、この目的で意図されるのは、天然配列ＳＲＴに見られる一
又は複数の炭水化物部分の欠失(存在するグリコシル化部位の除去又は化学的及
び／又は酵素的手段によるグリコシル化の削除のいずれかによる)、及び／又は
天然配列ＳＲＴに存在しない一又は複数のグリコシル化部位の付加を意味する。
さらに、この文節は、存在する種々の炭水化物部分の性質及び特性の変化を含む
、天然タンパク質のグリコシル化における定性的変化を含む。 ＳＲＴポリペプチドへのグリコシル化部位の付加はアミノ酸配列の変更を伴っ
てもよい。この変更は、例えば、一又は複数のセリン又はトレオニン残基の天然
配列ＳＲＴ(Ｏ-結合グリコシル化部位)への付加、又は置換によってなされても
よい。ＳＲＴアミノ酸配列は、場合によっては、ＤＮＡレベルでの変化、特に、
ＳＲＴポリペプチドをコードするＤＮＡを予め選択された塩基において変異させ
、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンを生成させることを通して変更されてもよ
い。
【００３３】 ＳＲＴポリペプチド上に炭水化物部分の数を増加させる他の手段は、グリコシ
ドのポリペプチドへの化学的又は酵素的結合による。このような方法は、この技
術分野において、例えば、1987年9月11日に公開されたWO 87/05330、及びAplin
及びWriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)に記載されている
。 ＳＲＴポリペプチド上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的又は酵素的に
、あるいはグルコシル化の標的として提示されたアミノ酸残基をコードするコド
ンの変異的置換によってなすことができる。化学的脱グリコシル化技術は、この
分野で知られており、例えば、Hakimuddin等, Arch. Biochem. Biophys., 259:5
2 (1987)により、及びEdge等, Anal. Biochem., 118: 131 (1981)により記載さ
れている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Thotakura等, Meth.
Enzymol. 138:350 (1987)に記載されているように、種々のエンド及びエキソグ
リコシダーゼを用いることにより達成される。 ＳＲＴの共有結合的修飾の他の型は、ＳＲＴポリぺプチドの、種々の非タンパ
ク質様ポリマー、例えばポリエチレングリコール(PEG)、ポリプロピレングリコ
ール、又はポリオキシアルキレンの一つへの、米国特許第4,640,835号；第4,496
,689号；第4,301,144号；第4,670,417号；第4,791,192号又は第4,179,337号に記
載された方法での結合を含む。
【００３４】 また、本発明のＳＲＴポリペプチドは、他の異種ポリペプチド又はアミノ酸配
列に融合したＳＲＴを含むキメラ分子を形成する方法で修飾してもよい。 一実施態様では、このようなキメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合できる
エピトープを提供するタグポリペプチドとＳＲＴとの融合を含む。エピトープタ
グは、一般的にはＳＲＴのアミノ又はカルボキシル末端に位置する。このような
ＳＲＴのエピトープタグ形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて
検出することができる。また、エピトープタグの提供は、抗-タグ抗体又はエピ
トープタグに結合する他の型の親和性マトリクスを用いたアフィニティ精製によ
ってＳＲＴを容易に精製できるようにする。種々のタグポリペプチド及びそれら
各々の抗体はこの分野で良く知られている。例としては、ポリ-ヒスチジン(poly
-his)又はポリ-ヒスチジン-グリシン(poly-his-gly)タグ；flu HAタグポリペプ
チド及びその抗体１２ＣＡ５［Field等, Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988
)］；c-mycタグ及びそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７及び９
Ｅ１０抗体［Evan等, Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)］
；及び単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ(gD)タグ及びその抗体［Paborsky等
, Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)］を含む。他のタグポリペプチド
は、フラッグペプチド［Hopp等, BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)］；ＫＴ
３エピトープペプチド［Martin等, Science, 255:192-194 (1992)］；α-チュー
ブリンエピトープペプチド［Skinner等, J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (19
91)］；及びＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ［Lutz-Freyermuth等, Proc
. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)］を含む。 それに換わる実施態様では、キメラ分子はＳＲＴの免疫グロブリン又は免疫グ
ロブリンの特定領域との融合体を含んでもよい。キメラ分子の二価形態(「イム
ノアドヘシン」とも呼ばれる)については、そのような融合体はＩｇＧ分子のＦ
ｃ領域であり得る。Ｉｇ融合体は、好ましくはＩｇ分子内の少なくとも１つの可
変領域に換えてＳＲＴポリペプチドの可溶化(膜貫通ドメイン欠失又は不活性化)
形態を含む。特に好ましい実施態様では、免疫グロブリン融合体は、ＩｇＧ１分
子のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３、又はヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３領域を
含む。免疫グロブリン融合体の製造については、1995年6月27日発行の米国特許
第5,428,130号を参照のこと。
【００３５】 Ｄ．ＳＲＴポリペプチドの調製 以下の記載は、主として、ＳＲＴ核酸を含むベクターで形質転換又は形質移入
された細胞を培養することによりＳＲＴを生産する方法に関する。もちろん、当
該分野においてよく知られている他の方法を用いてＳＲＴを調製することができ
ると考えられる。例えば、ＳＲＴ配列、又はその一部は、固相技術を用いた直接
ペプチド合成によって生産してもよい［例えば、Stewart等, Solid-Phase Pepti
de Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969)；Merrifield, J.
Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)参照］。手動技術又は自動によるインビ
トロタンパク質合成を行ってもよい。自動合成は、例えば、アプライド・バイオ
システムズ・ペプチド合成機(Foster City, CA)を用いて、製造者の指示により
実施してもよい。ＳＲＴの種々の部分は別々に化学的に合成され、化学的又は酵
素的方法を用いて結合させて全長ＳＲＴを生産してもよい。
【００３６】 １．ＳＲＴをコードするＤＮＡの単離 ＳＲＴをコードするＤＮＡは、ＳＲＴｍＲＮＡを保有していてそれを検出可能
なレベルで発現すると考えられる組織から調製されたｃＤＮＡライブラリーから
得ることができる。従って、ヒトＳＲＴ ＤＮＡは、実施例に記載されるように
、ヒトの組織から調製されたｃＤＮＡライブラリーから簡便に得ることができる
。またＳＲＴ-コード化遺伝子は、ゲノムライブラリーから又は公知の合成方法(
例えば、自動化核酸合成)により得ることもできる。 ライブラリーは、関心ある遺伝子あるいはその遺伝子によりコードされるタン
パク質を同定するために設計されたプローブ(ＳＲＴに対する抗体又は少なくと
も約２０−８０塩基のオリゴヌクレオチド等)によってスクリーニングでき、こ
こで、そのプローブは添付した図に示すポリヌクレオチド配列に基づいている。
選択されたプローブによるｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーのスクリーニングは
、例えばSambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual(New York: Col
d Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に記載されている標準的な手順を使
用して実施することができる。ＳＲＴをコードする遺伝子を単離する他の方法は
ＰＣＲ法を使用するものである［Sambrook等,上掲；Dieffenbach等, PCR Primer
：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)］。
【００３７】 下記の実施例には、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング技術を記載してい
る。プローブとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は、充分な長さで、疑陽
性が最小化されるよう充分に明瞭でなければならない。オリゴヌクレオチドは、
スクリーニングされるライブラリー内のＤＮＡとのハイブリダイゼーション時に
検出可能であるように標識されていることが好ましい。標識化の方法は当該分野
において良く知られており、３２Ｐ標識されたＡＴＰのような放射線標識、ビオ
チン化あるいは酵素標識の使用が含まれる。中程度の厳密性及び高度の厳密性を
含むハイブリダイゼーション条件は、上掲のSambrook等に与えられている。 このようなライブラリースクリーニング法において同定された配列は、Genban
k等の公共データベース又は他の個人の配列データベースに寄託され公衆に利用
可能とされている他の周知の配列と比較及びアラインメントすることができる。
分子の決定された領域内又は全長配列に渡っての(アミノ酸又はヌクレオチドレ
ベルのいずれかでの)配列同一性は、この分野で知られた、そしてここに記載し
た方法を用いて決定することができる。 タンパク質コード配列を有する核酸は、初めてここで開示された推定アミノ酸
配列を使用し、また必要ならば、ｃＤＮＡに逆転写されなかったｍＲＮＡの生成
中間体及び先駆物質を検出する上掲のSambrook等に記述されているような従来の
プライマー伸展法を使用し、選択されたｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーをスク
リーニングすることにより得られる。
【００３８】 ２．宿主細胞の選択及び形質転換 宿主細胞を、ここに記載したＳＲＴ生産のための発現又はクローニングベクタ
ーで形質移入又は形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又
は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適当に変性された常套的栄養
培地で培養する。培養条件、例えば培地、温度、ｐＨ等々は、過度の実験をする
ことなく当業者が選ぶことができる。一般に、細胞培養の生産性を最大にするた
めの原理、プロトコール、及び実用技術は、Mammalian Cell Biotechnology: a
Practical Approach, M.Butler編 (IRL Press, 1991)及びSambrook等, 上掲に見
出すことができる。 原核生物細胞形質移入及び真核生物細胞形質転換の方法、例えば、ＣａＣｌ２ 、ＣａＰＯ４、リポソーム媒介及びエレクトロポレーションは当業者に知られて
いる。用いられる宿主細胞に応じて、このような細胞に対して適した標準的な方
法を用いて形質転換はなされる。前掲のSambrook等に記載された塩化カルシウム
を用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションが、一般的に原核生物に対
して用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファシエンスによる感染が、Shaw
等, Gene, 23:315 (1983)及び1989年6月29日公開のWO 89/05859に記載されてい
るように、或る種の植物細胞の形質転換に用いられる。このような細胞壁のない
哺乳動物の細胞に対しては、Graham及びvan der Eb, Virology, 52:456-457 (19
78)のリン酸カルシウム沈降法を使用することができる。哺乳動物細胞の宿主系
形質転換の一般的な態様は米国特許第4,399,216号に記載されている。酵母菌中
への形質転換は、典型的には、Van Solingen等, J. Bact., 130:946 (1977)及び
Hsiao等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3829 (1979)の方法に従って実施さ
れる。しかしながら、ＤＮＡを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロ
インジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞、又はポリカチオン、
例えばポリブレン、ポリオルニチン等を用いる細菌プロトプラスト融合もまた用
いることもできる。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術については、
Keown等, Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)及び Mansour等, Nature
, 336:348-352 (1988)を参照のこと。
【００３９】 ここでのベクターにＤＮＡをクローニングあるいは発現するために適切な宿主
細胞には、原核生物、酵母菌、又は高等真核生物細胞が含まれる。適切な原核生
物は、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生
物体、例えば大腸菌のような腸内細菌科を含む。種々の大腸菌株が公衆に利用可
能であり、例えば、大腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９４(ATCC31,446)；大腸菌Ｘ１７７６
(ATCC31,537)；大腸菌株Ｗ３１１０(ATCC27,325)及びＫ５７７２(ATCC53,635)で
ある。他の適切な原核動物宿主細胞は、大腸菌、例えば、E. coli、エンテロバ
クター、エルビニア(Erwinia)、クレブシエラ(Klebsiella)、プロテウス(Proteu
s)、サルモネラ、例えば、ネズミチフス菌、セラチア、例えば、セラチアマルセ
サンス(Serratia marcescans) 、及び赤痢菌、並びに桿菌、例えばバシリスブチ
リス(B. subtilis)及びバシリリチェニフォルミス(B. licheniformis)(例えば、
1989年4月12日発行のDD 266,710に記載されたバシリリチェニフォルミス４１Ｐ)
、シュードモナス、例えば緑膿筋及びストレプトマイセスなどの腸内細菌科を含
む。これらの例は限定ではなく例示である。株Ｗ３１１０は、組換えＤＮＡ生産
発酵のための共通の宿主株であるので一つの特に好ましい宿主又は親宿主である
。好ましくは、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌する。例えば、株
Ｗ３１１０は、宿主に外来のタンパク質をコードする遺伝子における遺伝子変異
をするように修飾してもよく、そのような宿主の例としては、完全な遺伝子型ｔ
ｏｎＡを有する大腸菌Ｗ３１１０株１Ａ２；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ ｐｔｒ３
を有する大腸菌Ｗ３１１０株９Ｅ４；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ ｐｒｔ３ ｐｈ
ｏＡ Ｅ１５ (ａｒｇＦ-ｌａｃ)１６９ ｄｅｇＰ ｏｍｐＴ ｋａｎｒを有す
る大腸菌Ｗ３１１０株２７Ｃ７(ATCC 55,244)；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ ｐｔ
ｒ３ ｐｈｏＡ Ｅ１５ (ａｌｇＦ-ｌａｃ)１６９ ｄｅｇＰ ｏｍｐＴ ｒ
ｂｓ７ ｉｌｖＧ ｋａｎｒを有する大腸菌Ｗ３１１０株３７Ｄ６；非カナマイシ
ン耐性ｄｅｇＰ欠失変異を持つ３７Ｄ６株である大腸菌Ｗ３１１０株４０Ｂ４；
及び1990年8月7日発行の米国特許第4,946,783号に開示された変異周辺質プロテ
アーゼを有する大腸菌株を含む。あるいは、クローニングのインビトロ法、例え
ばＰＣＲ又は他の核酸ポリメラーゼ反応が好適である。
【００４０】 原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、ＳＲＴ-コード
化ベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・
セレヴィシアは、通常用いられる下等真核生物宿主微生物である。他に、シゾサ
ッカロミセスプロンブ(Schizosaccharomyces pombe)(Beach及びNurse, Nature,
290: 140 [1981]; 1985年5月2日発行のEP 139,383)；クルベロミセスホスツ(Klu
yveromyces hosts)(米国特許第4,943,529号; Fleer等, Bio/Technology, 9: 968
-975 (1991))、例えばケーラクチス(K. lactis)(MW98-8C, CBS683, CBS4574; Lo
uvencourt等, J. Bacteriol. 737 [1983])、ケーフラギリス(K. fragilis)(ATCC
12,424)、ケーブルガリクス(K. bulgaricus)(ATCC 16,045)、ケーウィケラミイ
(K. wickeramii)(ATCC 24,178)、ケーワルチイ(K. waltii)(ATCC 56,500)、ケー
ドロソフィラルム(K. drosophilarum)(ATCC 36,906; Van den Berg等, Bio/Tech
nology, 8: 135 (1990))、ケーテルモトレランス(K. thermotolerans)及びケー
マルキシアナス(K. marxianus)；ヤロウィア(yarrowia)(EP 402,226)；ピッチャ
パストリス(Pichia pastoris)(EP 183,070; Sreekrishna等, J. Basic Microbio
l, 28: 265-278 [1988])；カンジダ；トリコデルマレーシア(reesia)(EP 244,23
4)；アカパンカビ(Case等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5259-5263 [1979
])；シュワニオマイセス(schwanniomyces)、例えばシュワニオマイセスオクシデ
ンタリス(occidentalis)(1990年10月31日発行のEP 394,538)；及び糸状真菌、例
えば、ニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラジウム(Tolypocladium)(1991
年1月10日発行のWO 91/00357)；及びコウジ菌、例えば偽巣性コウジ菌(Ballance
等, Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284-289 [1983]; Tilburn等, Gene
, 26: 205-221 [1983]; Yelton等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-147
4 [1984])及びクロカビ(Kelly及びHynes, EMBO J., 4: 475-479 [1985])が含ま
れる。ここで好ましいメチロトロピック(methylotropic)酵母は、これらに限ら
れないが、ハンセヌラ(Hansenula)、カンジダ、クロエケラ(Kloeckera)、ピチア
(Pichia)、サッカロミセス、トルロプシス(Torulopsis)、及びロドトルラ(Rhodo
torula)からなる属から選択されるメタノールで成長可能な酵母を含む。この酵
母の分類の例示である特定の種のリストは、C. Anthony, The Biochemistry of
Methylotrophs, 269 (1982)に見出される。
【００４１】 グリコシル化ＳＲＴの発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。
無脊椎動物細胞の例としては、ショウジョウバエＳ２及びスポドステラＳｆ９等
の昆虫細胞並びに植物細胞が含まれる。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、チ
ャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)及びＣＯＳ細胞を含む。多くの特異的な例は
、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株 (COS-7, ATCC CRL 1651);
ヒト胚腎臓株(293又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された293細胞
、Graham等, J. Gen Virol., 36:59 (1977));チャイニーズハムスター卵巣細胞
／-ＤＨＦＲ(CHO, Urlaub及びChasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (
1980));マウスのセルトリ細胞(TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980
))；ヒト肺細胞 (W138, ATCC CCL 75); ヒト肝細胞 (Hep G2, HB 8065); 及びマ
ウス***腫瘍細胞 (MMT 060562, ATTC CCL51)を含む。適切な宿主細胞の選択は
、この分野の技術常識内にある。
【００４２】 ３．複製可能なベクターの選択及び使用 ＳＲＴをコードする核酸(例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ)は、クローニン
グ(ＤＮＡの増幅)又は発現のために複製可能なベクター内に挿入される。様々な
ベクターが公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド
、ウイルス粒子、又はファージの形態とすることができる。適切な核酸配列が、
種々の手法によってベクターに挿入される。一般に、ＤＮＡはこの分野で周知の
技術を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクター成分と
しては、一般に、これらに制限されるものではないが、一又は複数のシグナル配
列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロ
モーター、及び転写終結配列を含む。これらの成分の一又は複数を含む適当なベ
クターの作成には、当業者に知られた標準的なライゲーション技術を用いる。 ＳＲＴは直接的に組換え手法によって生産されるだけではなく、シグナル配列
あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのＮ-末端に特異的切断部位を有
する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ペプチドとしても生産
される。一般に、シグナル配列はベクターの成分であるか、ベクターに挿入され
るＳＲＴ-コード化ＤＮＡの一部である。シグナル配列は、例えばアルカリホス
ファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐあるいは熱安定性エンテロトキシンIIリー
ダーの群から選択される原核生物シグナル配列であってよい。酵母の分泌に関し
ては、シグナル配列は、酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー(酵母菌
属(Saccharomyces)及びクルイベロマイシス(Kluyveromyces)α因子リーダーを含
み、後者は米国特許第5,010,182号に記載されている)、又は酸ホスフォターゼリ
ーダー、白体(C.albicans)グルコアミラーゼリーダー(1990年4月4日発行のEP362
179)、又は1990年11月15日に公開されたWO 90/13646に記載されているシグナル
であり得る。哺乳動物細胞の発現においては、哺乳動物シグナル配列は、同一あ
るいは関連ある種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列並びにウイルス分泌リ
ーダーのようなタンパク質の直接分泌に使用してもよい。
【００４３】 発現及びクローニングベクターは共に一又は複数の選択された宿主細胞におい
てベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。そのような配列は種々の細菌、
酵母及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２に由来す
る複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド開始点は
酵母に適しており、様々なウイルス開始点(ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイ
ルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用
である。 発現及びクローニングベクターは、典型的には、選択性マーカーとも称される
選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(a)アンピシリン、ネオマイシン、
メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素
に耐性を与え、(b)栄養要求性欠陥を補い、又は(c)例えばバシリに対する遺伝子
コード化-Ｄ-アラニンラセマーゼのような、複合培地から得られない重要な栄養
素を供給するタンパク質をコードする。 哺乳動物細胞に適切な選べるマーカーの例は、ＤＨＦＲあるいはチミジンキナ
ーゼのように、ＳＲＴ-コード化核酸を取り込むことのできる細胞成分を同定す
ることのできるものである。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、
Urlaub 等により, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)に記載されて
いるようにして調製され増殖されたＤＨＦＲ活性に欠陥のあるＣＨＯ株化細胞で
ある。酵母菌中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐ７に存在す
るｔｒｐ１遺伝子である［Stinchcomb等, Nature, 282：39(1979)；Kingsman等,
Gene, 7：141(1979)；Tschemper等, Gene, 10：157(1980)］。ｔｒｐ１遺伝子
は、例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６あるいはＰＥＰ４-１のようなトリプトフ
ァン内で成長する能力を欠く酵母菌の突然変異株に対する選択マーカーを提供す
る［Jones, Genetics, 85:12 (1977)］。
【００４４】 発現及びクローニングベクターは、通常、ＳＲＴ-コード化核酸配列に作用可
能に結合し、ｍＲＮＡ合成を指示するプロモーターを含む。種々の可能な宿主細
胞により認識されるプロモーターがよく知られている。原核生物宿主での使用に
好適なプロモーターはβ-ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系［Chang等
, Nature, 275:615 (1978)；Goeddel等, Nature, 281:544 (1979)］、アルカリ
ホスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系［Goeddel, Nucleic Acid
s Res., 8:4057 (1980); EP 36,776］、及びハイブリッドプロモーター、例えば
ｔａｃプロモーター［deBoer 等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (198
3)］を含む。細菌系で使用するプロモータもまたＳＲＴをコードするＤＮＡと作
用可能に結合したシャイン・ダルガーノ(S.D.)配列を有する。 酵母宿主と共に用いて好適なプロモーター配列の例としては、３-ホスホグリ
セラートキナーゼ［Hitzeman 等, J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)］又は他の
糖分解酵素［Hess 等, J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968)；Holland, Biochem
istry, 17：4900(1978)］、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-３-リン酸
デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフ
ルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラーゼ、３-ホスホグリセレート
ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコー
スイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。 他の酵母プロモーターとしては、成長条件によって転写が制御される付加的効
果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチ
トクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネ
イン、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガ
ラクトースの利用を受ける酵素のプロモーター領域がある。酵母菌での発現に好
適に用いられるベクターとプロモータはEP 73,657に更に記載されている。 哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからのＳＲＴ転写は、例えば、ポリオー
マウィルス、伝染性上皮腫ウィルス(1989年7月5日公開のUK 2,211,504)、アデノ
ウィルス(例えばアデノウィルス２)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、
サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス及びサルウィルス４
０(SV40)のようなウィルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物
プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、
及び熱衝撃プロモーターから得られるプロモーターによって、このようなプロモ
ーターが宿主細胞系に適合し得る限り制御される。
【００４５】 より高等の真核生物によるＳＲＴをコードするＤＮＡの転写は、ベクター中に
エンハンサー配列を挿入することによって増強され得る。エンハンサーは、通常
は約１０から３００塩基対で、プロモーターに作用してその転写を増強するＤＮ
Ａのシス作動要素である。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在
知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及び
インスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサ
ーが用いられるであろう。例としては、複製開始点の後期側のＳＶ４０エンハン
サー(１００-２７０塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハン
サー、複製開始点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハ
ンサーが含まれる。エンハンサーは、ＳＲＴコード配列の５’又は３’位でベク
ター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから５’位に位置
している。 また真核生物宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細
胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、転写の終結及びｍＲＮＡ
の安定化に必要な配列も含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのＤＮ
Ａ又はｃＤＮＡの通常は５’、時には３’の非翻訳領域から取得できる。これら
の領域は、ＳＲＴをコードするｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片とし
て転写されるヌクレオチドセグメントを含む。 組換え脊椎動物細胞培養でのＳＲＴの合成に適応化するのに適切な他の方法、
ベクター及び宿主細胞は、Gething等, Nature, 293:620-625 (1981); Mantei等,
Nature, 281:40-46 (1979); EP 117,060; 及びEP 117,058に記載されている。
【００４６】 ４．遺伝子増幅／発現の検出 遺伝子の増幅及び／又は発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識
されたプローブを用い、例えば、従来よりのサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写
を定量化するノーザンブロット法［Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77:52
01-5205 (1980)］、ドットブロット法(ＤＮＡ分析)、又はインサイツハイブリダ
イゼーション法によって、直接的に試料中で測定することができる。あるいは、
ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖及びＤＮＡ-ＲＮＡハイブリッド二本鎖又はＤＮＡ-
タンパク二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いること
もできる。ついで、抗体を標識し、アッセイを実施することができ、ここで二本
鎖は表面に結合しており、その結果二本鎖の表面での形成の時点でその二本鎖に
結合した抗体の存在を検出することができる。 あるいは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量する免疫学的な
方法、例えば細胞又は組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液のア
ッセイによって、測定することもできる。試料液の免疫組織化学的染色及び／又
はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意
の哺乳動物で調製することができる。簡便には、抗体は、天然配列ＳＲＴポリペ
プチドに対して、又はここで提供されるＤＮＡ配列をベースとした合成ペプチド
に対して、又はＳＲＴ ＤＮＡに融合し特異的抗体エピトープをコードする外因
性配列に対して調製され得る。
【００４７】 ５．ポリペプチドの精製 ＳＲＴの形態は、培地又は宿主細胞の溶菌液から回収することができる。膜結
合性であるならば、適切な洗浄液(例えばトリトン-Ｘ１００)又は酵素的切断を
用いて膜から引き離すことができる。ＳＲＴの発現に用いられる細胞は、凍結融
解サイクル、超音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤などの種々の化学的又は
物理的手段によって破壊することができる。 ＳＲＴを、組換え細胞タンパク質又はポリペプチドから精製することが望まし
い。適切な精製手順の例である次の手順により精製される：すなわち、イオン交
換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ又はカチオン交換樹
脂、例えばＤＥＡＥによるクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤ
Ｓ-ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えばセファデックスＧ-７５を用いるゲ
ル濾過；ＩｇＧのような汚染物を除くプロテインＡセファロースカラム；及びＳ
ＲＴのエピトープタグ形態を結合させる金属キレート化カラムである。種々のタ
ンパク質精製方法を用いることができ、このような方法はこの分野で知られ、例
えば、Deutcher, Methodes in Enzymology, 182 (1990)；Scopes, Protein Puri
fication: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982)に記
載されている。選ばれる精製過程は、例えば、用いられる生産方法及び特に生産
される特定のＳＲＴの性質に依存する。
【００４８】 Ｅ．ＳＲＴポリヌクレオチド及びポリペプチドの用途 ここで開示するＳＲＴヌクレオチド配列(及び／又はそれらの相補鎖)は、例え
ばハイブリダイゼーションプローブとしての使用を含む分子生物学の分野におい
て、染色体及び遺伝子マッピングにおいて、組織タイピング、疾病組織検出、Ｐ
ＣＲ技術において、新規な治療用分子のスクリーニングにおいて、そしてアンチ
センスＲＮＡ及びＤＮＡの作製においての種々の用途を有している。また、ＳＲ
Ｔ核酸も、ここに記載される組換え技術によるＳＲＴポリペプチドの調製に有用
であろう。 ここで開示するＳＲＴポリヌクレオチド又はその一部は、全長ＳＲＴｃＤＮＡ
の単離又は関心あるＳＲＴ配列に対して所望の配列同一性を持つ更に他のｃＤＮ
Ａ(例えば、ＳＲＴの天然発生変異体又は他の種からのＳＲＴをコードするもの)
の単離のためのｃＤＮＡライブラリー用のハイブリダイゼーションプローブとし
て使用できる。場合によっては、プローブの長さは約２０〜約５０塩基である。
ハイブリダイゼーションプローブは、少なくとも部分的にここで開示するヌクレ
オチド配列の新規な領域から誘導してもよく、それらの領域は、過度の実験をす
ることなく、天然配列ＳＲＴのプロモーター、エンハンサー成分及びイントロン
を含むゲノム配列から決定され得る。例えば、スクリーニング法は、ＳＲＴ遺伝
子のコード化領域を周知のＤＮＡ配列を用いて単離して約４０塩基の選択された
プローブを合成することを含む。ハイブリダイゼーションプローブは、３２Ｐ又
は３５Ｓ等の放射性ヌクレオチド、又はアビジン／ビオチン結合系を介してプロ
ーブに結合したアルカリホスファターゼ等の酵素標識を含む種々の標識で標識さ
れうる。本発明のＳＲＴ遺伝子に相補的な配列を有する標識されたプローブは、
ヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングし、
そのライブラリーの何れのメンバーがプローブにハイブッド形成するかを決定す
るのに使用できる。ハイブリダイゼーション技術は、以下の実施例において更に
詳細に記載する。
【００４９】 米国特許第4,683,195号；同4,800,195号：及び同4,965,188号に記載されてい
るＰＣＲは、添付した図に開示されているポリヌクレオチド配列に基づいたオリ
ゴヌクレオチドのさらなる用途を提供する。このようなオリゴマーは一般的には
化学合成されるが、組換え由来又はその双方の混合物であってもよい。オリゴマ
ーは一般的に２つのヌクレオチド配列を含み、その一方はセンス方向(５'から３
')であり、もう一方はアンチセンス方向(３'から５')であって、特定の遺伝子の
同定又は診断用途のために至適化された条件下で使用される。同じ２つのオリゴ
マー、オリゴマーの入れ子状態のセット、又はオリゴマーの縮重プールでさえ、
密接に関連したＤＮＡ又はＲＮＡ配列の同定及び／又は定量のために緊縮性の低
い条件下で使用され得る。
【００５０】 全長遺伝子は、部分的なヌクレオチド配列及び種々の当該分野で既知の方法を
使用してクローニングすることができる。Gobindaら, PCR Methods Applic. 2：
318-322(1993)には、汎用的なプライマーを使用して既知の遺伝子座に隣接する
未知の配列を取り出す直接的方法として「制限部位ＰＣＲ」を開示している。第
１に、ゲノムＤＮＡをリンカーに対するプライマーと既知の領域に特異的なプラ
イマーの存在下で増幅する。増幅された配列を、同一のリンカープライマーと最
初のものに内在する他の特異的なプライマーを用いて、二回目のＰＣＲ工程にか
ける。各回のＰＣＲの産物を適切なＲＮＡポリメラーゼを用いて転写し、逆転写
酵素を使用して配列決定する。Gobindaらは、遺伝子の３'非コード化領域の２０
ヌクレオチドの保存的配列を同定したＩＸ因子に関するデータを提供している。 インバースＰＣＲ法は既知の領域に基づくプライマーを用いて開始して、未知
の配列を成功裏に獲得することが報告されている最初の方法である(Trigliaら,
Nucleic Acids Res. 16：8186(1988))。本方法は、遺伝子の既知の領域に適切な
断片を生成するために、いくつかの制限酵素を使用する。次に、断片を分子内ラ
イゲーションにより環化し、ＰＣＲテンプレートとして使用する。多岐にわたる
プライマーが既知の領域からデザインされる。ＰＣＲの前に必要な複数回にわた
る制限酵素での消化とライゲーションのために、この手順は時間がかかり高価な
ものとなっている(Gobindaら, 上掲)。
【００５１】 キャプチャーＰＣＲ(Lagerstromら, PCR Methods Applic. 1：111-119(1991))
は、ヒト及びＹＡＣ ＤＮＡにおける既知の配列に隣接したＤＮＡ断片をＰＣＲ
増幅させる方法である。Gobindaら(上掲)により記載されたように、キャプチャ
ーＰＣＲでも、ＰＣＲの前にＤＮＡ分子の未知部分に加工された二重鎖配列を配
するために複数回の制限酵素での消化とライゲーション工程が必要となる。制限
及びライゲーション反応は同時に行うことができるが、配列決定の前に伸長、固
定化及びＰＣＲと精製の２回の実施が必要であり、煩雑で時間のかかる方法であ
る。 Parkerら, Nucleic Acids Res. 19：3055-3060(1991)はウオーキングＰＣＲに
ついて教示しており、未知の配列の取り出しを可能にする標的遺伝子ウオーキン
グ法である。PromoterFinderＴＭはClontech(Palo Alto, Calif)から入手できる
新しいキットであり、ゲノムＤＮＡ中をウオーキングするためにｐ５３由来のプ
ライマーとＰＣＲを使用する。入れ子状態のプライマーと特殊なPromoterFinder
ライブラリーを使用して、上流の配列、例えばプロモータ及び調節成分を検出す
る。この方法はライブラリーをスクリーニングする必要性を回避し、イントロン
／エクソンの接合部の発見に有用である。
【００５２】 他の新規なＰＣＲ法である「Improved Methods for Obtaining Full Length c
DNA Sequences」(1998年10月6日に発行された米国特許第5,817,479号を参照)は
ＸＬ-ＰＣＲ(Perkin-Elmer, Foster City, Calf.)を使用し、ＤＮＡのより長い
断片に部分的なヌクレオチド配列を増幅させ伸長させるものである。この方法は
、一人の研究者が一度に複数の遺伝子(２０又はそれ以上まで)を加工し、６−１
０日以内に伸長した(おそらくは全長の)配列を得ることを可能にするために開発
された。この新規な方法は、標識されたプローブを使用してプラスミドライブラ
リーをスクリーニングし、一人の研究者が１４−４０日以内に約３−５の遺伝子
だけを加工できるようにする方法に取って換わるものである。 約２日間で実施できる第１工程において、複数のプライマーのうちの任意の２
つを設計し、既知の部分的配列に基づいて合成する。約６〜８時間かかる第２工
程では、配列を選択されたライブラリーのＰＣＲ増幅により伸長させる。約１日
かかる第３及び第４工程は、増幅したｃＤＮＡの精製と適切なベクターへのその
ライゲーションである。約１日かかる第５工程は形質転換し、宿主細菌を成長さ
せることを含む。約５時間かかる第６工程では、ＰＣＲを使用して伸長した配列
について細菌クローンをスクリーニングする。約１日かかる最終工程は、選択さ
れたクローンの調製と配列決定を含む。
【００５３】 全長ｃＤＮＡが得られていない場合、最初のライブラリー又はいくつかの他の
好ましいライブラリーの何れかを使用して全手順を繰り返す。好ましいライブラ
リーは、サイズ選択してより大きなｃＤＮＡのみを含むものであってもよいし、
又は肺、肝臓、心臓及び脳などの、Gibco/BRL(Gaithersburg, Md.)から市販され
ているライブラリーを単独で又は組合せてなるものであってもよい。ｃＤＮＡラ
イブラリーはオリゴ(ｄＴ)又はランダムプライミングを用いて調製されていても
よい。ランダムプライムライブラリーは、それらが遺伝子の５'末端の含むより
多くの配列を含む点で好ましい。ランダムプライムライブラリーは、オリゴ(ｄ
Ｔ)ライブラリーが完全な遺伝子を生じない場合に特に有用である。
【００５４】 添付した図に示す任意の特定のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列をまた用
いて、天然ゲノム配列をマッピングするためのプローブを産生することができる
。配列は、よく知られた技術を使用し、特定の染色体又は染色体の特定領域にマ
ッピングされうる。これらには、染色体の広がりに対するインサイツハイブリダ
イゼーション(Vermaら, 「Human Chromosomes：A Manual of Basic Techniques
」, Pergamon Press, New York City, 1988)、フローソート染色体調製物、又は
人工的な染色体構成物、例えば酵母人造構造物(ＹＡＣｓ)、細菌人造染色体(Ｂ
ＡＳｓ)、細菌Ｐ１構造物又は単一の染色体ｃＤＮＡライブラリーが含まれる。
【００５５】 染色体調製物のインサイツハイブリダイゼーションと物理的マッピング技術、
例えば確立された染色体マーカーを使用する連鎖解析は、遺伝子地図の拡張に非
常に貴重である。遺伝子地図の例は、Science(265：1981f)の1994 Genome Issue
に見出すことができる。多くの場合、他の哺乳動物種の染色体上の遺伝子の配置
は、特定のヒト染色体の数又はアームが未知であったとしても、関係するマーカ
ーを明らかにする。新規な部分的ヌクレオチド配列を染色体アーム、又はその一
部に物理的マッピングによりあてがうことができる。これは、位置クローニング
又は他の遺伝子発見技術を使用して原因遺伝子を探している研究者に貴重な情報
を提供する。疾患又は症候群、例えば毛細血管拡張性運動失調症(ＡＴ)が、特定
のゲノム領域への遺伝子連鎖、例えば１１ｑ２２-２３へのＡＴによりおおざっ
ぱに局在化されたならば(Gattiら, Nature 336：577-580(1988))、その領域にマ
ッピングされた任意の配列がさらなる研究のための遺伝子を表す。本発明のヌク
レオチド配列は、さらに、正常な個人と保菌者又は疾患のある個人の間の、転移
、転置等のためのヌクレオチド配列の染色***置の差を検出するために使用され
うる。 特定のＳＲＴポリペプチドをコードする部分的なヌクレオチド配列は、組換え
ＤＮＡ技術のよく知られた方法を使用してアミノ酸配列を生産するために使用す
ることができる。アミノ酸又はペプチドは原核生物であれ真核生物であれ、種々
の宿主細胞に発現されうる。宿主細胞はヌクレオチド配列が取り出された同じ種
からでも異なった種からでもよい。組換えＤＮＡ技術によりアミノ酸配列又はペ
プチドを生産する利点は、精製のために十分な量が得られ、単純化された精製手
順を利用できることである。
【００５６】 ＳＲＴヌクレオチド配列で形質転換した細胞は上述のように発現と細胞培養か
らのペプチドの回収に適した条件下で培養されうる。組換え細胞により生産され
るペプチドは配列それ自体及び／又は使用するベクターに応じて、分泌されるか
又は細胞内に含有されうる。一般的に、分泌形態で組換えタンパク質を調製する
のがより簡便であり、これは、特定の原核生物又は真核生物細胞膜を通っての移
動を行わせる組換えヌクレオチド配列へのＳＲＴのライゲーションにより達成さ
れる。他の組換え構築物は、タンパク質精製を容易にするポリペプチドドメイン
をコードするヌクレオチド配列にＳＲＴを結合させる(Krollら, DNA Cell Biol
. 12：441-53(1993))。
【００５７】 ＳＲＴ核酸の他の有用な断片は、標的ＳＲＴｍＲＮＡ(センス)又はＳＲＴ Ｄ
ＮＡ(アンチセンス)配列に結合できる一本鎖核酸配列(ＲＮＡ又はＤＮＡのいず
れか)を含むアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを含む。アンチセンス
又はセンスオリゴヌクレオチドは、本発明によると、ＳＲＴ ＤＮＡのコード化
領域の断片を含む。このような断片は、一般的には少なくとも約１４ヌクレオチ
ド、好ましくは約１４から３０ヌクレオチドを含む。与えられたタンパク質をコ
ードするｃＤＮＡ配列に基づく、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを
誘導する能力は、例えば、Stein及びCohen(Cancer Res. 48: 2659: 1988)及び v
an der Krol等(BioTechniques 6: 958, 1988)に記載されている。 アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの標的核酸配列への結合は二重鎖
の形成をもたらし、それは、二重鎖の分解の促進、転写又は翻訳の期外停止を含
む幾つかの方法の一つ、又は他の方法により、標的配列の転写又は翻訳を阻止す
る。よって、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＳＲＴタンパク質の発現を阻
止するのに用いられる。アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、修飾糖
-ホスホジエステル骨格(又は他の糖結合、WO 91/06629に記載のもの等)を有する
オリゴヌクレオチドをさらに含み、そのような糖結合は内因性ヌクレアーゼ耐性
である。そのような耐性糖結合を持つオリゴヌクレオチドは、インビボで安定で
あるが(即ち、酵素分解に耐えうるが)、標的ヌクレオチド配列に結合できる配列
特異性は保持している。
【００５８】 センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の例は、WO 90/10048に記載
されているもののような、有機部分、及びオリゴヌクレオチドの標的核酸配列へ
の親和性を向上させる他の部分、例えばポリ-(Ｌ-リジン)に共有結合したオリゴ
ヌクレオチドを含む。さらにまた、エリプチシン等の挿入剤、アルキル化剤又は
金属錯体をセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合させ、アンチセン
ス又はセンスオリゴヌクレオチドの標的ヌクレオチド配列への結合特異性を改変
してもよい。 アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、ＣａＰＯ４-媒介Ｄ
ＮＡ形質移入、エレクトロポレーションを含む任意の遺伝子転換方法により、又
はエプスタイン-バーウイルスなどの遺伝子転換ベクターを用いることにより、
標的核酸配列を含む細胞に導入される。好ましい方法では、アンチセンス又はセ
ンスオリゴヌクレオチドは、適切なレトロウイルスベクターに挿入される。標的
核酸配列を含む細胞は、インビボ又はエキソビボで組換えレトロウイルスベクタ
ーに接触させる。好適なレトロウイルスベクターは、これらに限られないが、マ
ウスレトロウイルスＭ-ＭｕＬＶから誘導されるもの、Ｎ２(Ｍ-ＭｕＬＶから誘
導されたレトロウイルス)、又はＤＣＴ５Ａ、ＤＣＴ５Ｂ及びＤＣＴ５Ｃと命名
されたダブルコピーベクター(WO 90/13641参照)を含む。 また、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは、WO 91/04753に記載さ
れているように、リガンド結合分子との複合体の形成により標的ヌクレオチド配
列を含む細胞に導入してもよい。適切なリガンド結合分子は、これらに限られな
いが、細胞表面レセプター、成長因子、他のサイトカイン、又は細胞表面レセプ
ターに結合する他のリガンドを含む。好ましくは、リガンド結合分子の複合体形
成は、リガンド結合分子がその対応する分子又はレセプターに結合する、あるい
はセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその複合体の細胞への侵入を
阻止する能力を実質的に阻害しない。 あるいは、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは、WO 90/10448に記
載されたように、オリゴヌクレオチド-脂質複合体の形成により標的核酸配列を
含む細胞に導入してもよい。センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド-脂質
複合体は、好ましくは内因性リパーゼにより細胞内で分解される。
【００５９】 また、プローブは、ＰＣＲ技術に用いて、密接に関連したＳＲＴコード化配列
の同定のための配列のプールを作成することができる。 また、ＳＲＴをコードするヌクレオチド配列は、そのＳＲＴをコードする遺伝
子のマッピングのため、及び遺伝子疾患を持つ個体の遺伝子分析のためのハイブ
リダイゼーションプローブの作成にも用いることができる。ここに提供されるヌ
クレオチド配列は、インサイツハイブリダイゼーション、既知の染色体マーカー
に対する結合分析、及びライブラリーでのハイブリダイゼーションスクリーニン
グ等の周知の技術を用いて、染色体及び染色体の特定領域にマッピングすること
ができる。 ＳＲＴのコード化配列が他のタンパク質に結合するタンパク質をコードする場
合(例えば、ＳＲＴがレセプターである場合)、ＳＲＴは、結合性相互作用に係る
他のタンパク質又は分子を同定するアッセイに用いることができる。このような
方法により、レセプター／リガンド結合性相互作用のインヒビターを同定するこ
とができる。このような結合性相互作用に含まれるタンパク質も、ペプチド又は
小分子阻害剤又は結合性相互作用のアゴニストのスクリーニングに用いることが
できる。また、レセプターＳＲＴは関連するリガンドの単離にも使用できる。ス
クリーニングアッセイは、天然ＳＲＴ又はＳＲＴのレセプターの生物学的活性に
似たリード化合物の発見のために設計される。このようなスクリーニングアッセ
イは、化学的ライブラリーの高スループットスクリーニングに基づくアンモニア
ッセイを含み、小分子候補薬剤の同定に特に適したものである。考慮される小分
子は、合成有機又は無機化合物を含む。アッセイは、この分野で良く特徴付けら
れているタンパク質-タンパク質結合アッセイ、生化学的スクリーニングアッセ
イ、免疫検定及び細胞ベースのアッセイを含む種々の型式で実施される。
【００６０】 また、ＳＲＴ又はその修飾型をコードする核酸は、トランスジェニック動物又
は「ノックアウト」動物を産生するのにも使用でき、これらは治療的に有用な試
薬の開発やスクリーニングに有用である。トランスジェニック動物(例えばマウ
ス又はラット)とは、出生前、例えば胚段階で、その動物又はその動物の祖先に
導入された導入遺伝子を含む細胞を有する動物である。導入遺伝子とは、トラン
スジェニック動物が発生する細胞のゲノムに組み込まれたＤＮＡである。一実施
形態では、ＳＲＴをコードするｃＤＮＡは、確立された技術によりＳＲＴをコー
ドするゲノムＤＮＡをクローン化するために使用することができ、ゲノム配列を
、ＳＲＴをコードするＤＮＡを発現する細胞を有するトランスジェニック動物を
産生するために使用することができる。トランスジェニック動物、特にマウス又
はラット等の特定の動物を産生する方法は当該分野において常套的になっており
、例えば米国特許第4,736,866号や第4,870,009号に記述されている。典型的には
、特定の細胞を組織特異的エンハンサーでのＳＲＴ導入遺伝子の導入の標的にす
る。胚段階で動物の生殖系列に導入されたＳＲＴコード化導入遺伝子のコピーを
含むトランスジェニック動物はＳＲＴをコードするＤＮＡの増大した発現の影響
を調べるために使用できる。このような動物は、例えばその過剰発現を伴う病理
学的状態に対して保護をもたらすと思われる試薬のテスター動物として使用でき
る。本発明のこの態様においては、動物を試薬で治療し、導入遺伝子を有する未
治療の動物に比べ病理学的状態の発症率が低ければ、病理学的状態に対する治療
的処置の可能性が示される。 あるいは、ＳＲＴの非ヒト相同体は、動物の胚性幹細胞に導入されたＳＲＴを
コードする変更ゲノムＤＮＡと、ＳＲＴをコードする内在性遺伝子との間の相同
的組換えによって、ＳＲＴをコードする欠陥又は変更遺伝子を有するＳＲＴ「ノ
ックアウト」動物を作成するために使用できる。例えば、ＳＲＴをコードするｃ
ＤＮＡは、確立された技術に従い、ＳＲＴをコードするゲノムＤＮＡのクローニ
ングに使用できる。ＳＲＴをコードするゲノムＤＮＡの一部を欠失したり、組み
込みを監視するために使用する選択可能なマーカーをコードする遺伝子等の他の
遺伝子で置換することができる。典型的には、ベクターは無変化のフランキング
ＤＮＡ(５’と３’末端の両方)を数キロベース含む［例えば、相同的組換えベク
ターについてはThomas及びCapecchi, Cell, 51:503(1987)を参照のこと］。ベク
ターは胚性幹細胞に(例えばエレクトロポレーションによって)導入し、導入され
たＤＮＡが内在性ＤＮＡと相同的に組換えられた細胞が選択される［例えば、Li
等, Cell, 69:915(1992)参照］。選択された細胞は次に動物(例えばマウス又は
ラット)の胚盤胞内に注入されて集合キメラを形成する［例えば、Bradley, Tera
tocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Rober
tson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152参照］。その後、キメラ性胚を適
切な偽妊娠の雌性乳母に移植し、期間をおいて「ノックアウト」動物をつくり出
す。胚細胞に相同的に組換えられたＤＮＡを有する子孫は標準的な技術により同
定され、それらを利用して動物の全細胞が相同的に組換えられたＤＮＡを含む動
物を繁殖させることができる。ノックアウト動物は、例えば、ＳＲＴポリペプチ
ドが不在であることによるある種の病理的状態及びその病理的状態の進行に対す
る防御能力によって特徴付けられる。
【００６１】 また、ＳＲＴポリペプチドをコードする核酸は遺伝子治療にも使用できる。遺
伝子治療用途においては、例えば欠陥遺伝子を置換するため、治療的有効量の遺
伝子産物のインビボ合成を達成するために、細胞に遺伝子が導入される。「遺伝
子治療」とは、１回の処理により継続的効果が達成される従来の遺伝子治療と、
治療的に有効なＤＮＡ又はｍＲＮＡの１回又は繰り返し投与を含む遺伝子治療薬
の投与の両方を含む。アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡは、ある種の遺伝子のイン
ビボ発現を阻止する治療薬として用いることができる。短いアンチセンスオリゴ
ヌクレオチドを、細胞膜による制限された取り込みに起因する低い細胞内濃度に
もかかわらず、それが阻害剤として作用する細胞中に移入できることは既に示さ
れている(Zamecnik等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 4143-4146 [1986])。
オリゴヌクレオチドは、例えばそれらの負に荷電したリン酸ジエステル基を非荷
電基で置換することによって取り込みを促進するように修飾してもよい。 生存可能な細胞に核酸を導入するための種々の技術が存在する。これらの技術
は、核酸が培養細胞にインビトロで、あるいは意図する宿主の細胞においてイン
ビボで移入されるかに応じて変わる。核酸を哺乳動物細胞にインビトロで移入す
るのに適した方法は、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェ
クション、細胞融合、ＤＥＡＥ-デキストラン、リン酸カルシウム沈殿法などを
含む。現在好ましいインビボ遺伝子移入技術は、ウイルス(典型的にはレトロウ
イルス)ベクターでの形質移入及びウイルス被覆タンパク質-リポソーム媒介形質
移入である(Dzau等, Trends in Biotechnology 11, 205-210[1993])。幾つかの
状況では、核酸供給源を、細胞表面膜タンパク質又は標的細胞に特異的な抗体、
標的細胞上のレセプターに対するリガンド等の標的細胞を標的化する薬剤ととも
に提供するのが望ましい。リポソームを用いる場合、エンドサイトーシスを伴っ
て細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質、例えば、特定の細胞型向性のカ
プシドタンパク質又はその断片、サイクルにおいて内部移行を受けるタンパク質
に対する抗体、細胞内局在化を標的とし細胞内半減期を向上させるタンパク質が
、標的化及び／又は取り込みの促進のために用いられる。レセプター媒介エンド
サイトーシスの技術は、例えば、Wu等, J. Biol. Chem. 262, 4429-4432 (1987)
; 及びWagner等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990)によって
記述されている。遺伝子マーキング及び遺伝子治療のプロトコールの概説につい
ては、Anderson等, Science 256, 808-813 (1992)を参照のこと。
【００６２】 ここに記載したＳＲＴポリペプチドは、タンパク質電気泳動目的の分子量マー
カーとして用いてもよい。 ここに記載したＳＲＴポリペプチド又はその断片をコードする核酸分子は染色
体同定に有用である。この点において、実際の配列に基づく染色体マーキング試
薬は殆ど利用可能ではないため、新規な染色体マーカーの同定の必要性が存在し
ている。本発明の各ＳＲＴ核酸分子は染色体マーカーとして使用できる。 また本発明のＳＲＴポリペプチド及び核酸分子は組織タイピングに使用でき、
ここで、本発明のＳＲＴポリペプチドは、ある組織では他のものと比較して、例
えば正常な組織に対して疾患のある組織では、異なった様式で発現をする。ＳＲ
Ｔ核酸分子は、ＰＣＲ、ノーザン分析、サザン分析及びウェスタン分析のための
プローブの生成に使用される。 また、ここに記載したＳＲＴポリペプチド及び抗体は治療薬として用いてもよ
い。本発明のＳＲＴポリペプチドは、製薬的に有用な組成物を調製するのに知ら
れた方法に従って製剤され、それにより、このＳＲＴ生成物は製薬的に許容され
る担体媒体と混合される。治療用製剤は、凍結乾燥された製剤又は水性溶液の形
態で、任意的な生理学上許容可能な担体、賦形剤又は安定剤と、所望の精製度を
有する活性成分とを混合することにより(Remington's Pharmaceutical Sciences
, 16th edition, A. Osol, Ed., (1980))、調製され保管される。許容される担
体、賦形剤又は安定剤は、用いる投与量及び濃度ではレシピエントに対して無毒
性であり、リン酸、クエン酸及び他の有機酸等の緩衝液；アスコルビン酸を含む
抗酸化剤；低分子量(残基数１０個未満)ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチ
ン又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性重合体
；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシン等のアミノ酸；
グルコース、マンノース又はデキストリン等の単糖類、二糖類又は他の炭水化物
；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール類
；ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又はTWEENＴＭ、PLURONICSＴＭ又はＰ
ＥＧ等の非イオン性界面活性剤を含む。
【００６３】 インビボ投与に使用される製剤は滅菌されていなくてはならない。これは、凍
結乾燥及び再構成の前又は後に、滅菌フィルター膜を通す濾過により容易に達成
される。 ここで、治療用組成物は一般に、無菌のアクセスポートを具備する容器、例え
ば、皮下注射針で貫通可能なストッパーを持つ静脈内溶液バッグ又はバイアル内
に配される。 投与経路は周知の方法、例えば、静脈内、腹膜内、脳内、筋肉内、眼内、動脈
内又は病巣内経路での注射又は注入、局所投与、又は徐放系による。 本発明の製薬組成物の用量及び望ましい薬物濃度は、意図する特定の用途に応
じて変化する。適切な用量又は投与経路の決定は、通常の内科医の技量の範囲内
である。動物実験は、ヒト治療のための有効量の決定についての信頼できるガイ
ダンスを提供する。有効量の種間スケーリングは、Toxicokinetics and New Dru
g Development, Yacobi等, 編, Pergamon Press, New York 1989, pp. 42-96のM
ordenti, J. 及びChappell, W. 「The use of interspecies scaling in toxico
kinetics」に記載された原理に従って実施できる。 ＳＲＴポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストのインビボ投与が
用いられる場合、正常な投与量は、投与経路に応じて、哺乳動物の体重当たり１
日に約１０ｎｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇまで、好ましくは約１μｇ／ｋｇ／
日から１０ｍｇ／ｋｇ／日である。特定の用量及び輸送方法の指針は文献に与え
られている；例えば、米国特許第4,657,760号、第5,206,344号、又は第5,225,21
2号参照。異なる製剤が異なる治療用化合物及び異なる疾患に有効であること、
例えば一つの器官又な組織を標的とする投与には他の器官又は組織とは異なる方
式で輸送することは必要であることが予想される。 ＳＲＴポリペプチドの投与を必要とする任意の疾患又は疾病の治療に適した放
出特性を持つ製剤でＳＲＴポリペプチドの持続放出が望まれる場合、ＳＲＴポリ
ペプチドのマイクロカプセル化が考えられる。持続放出のための組換えタンパク
質のマイクロカプセル化は、ヒト成長ホルモン(ｒｈＧＨ)、インターフェロン(
ｒｈＩＦＮ-)、インターロイキン-２、及びＭＮｒｇｐ１２０で成功裏に実施さ
れている。Johnson等, Nat. Med., 2: 795-799 (1996); Yasuda, Biomed. Ther.
, 27: 1221-1223 (1993); Hora等, Bio/Technology, 8: 755-758 (1990); Clela
nd, 「Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polyla
ctide Polyglycolide Microsphere Systems」in Vaccine Design: The Subunit
and Adjuvant Approach, Powell 及び Newman編, (Plenum Press: New York, 19
95), pp. 439-462; WO 97/03692, WO 96/40072, WO 96/07399; 及び米国特許第5
,654,010号。
【００６４】 これらのタンパク質の持続放出製剤は、ポリ-乳酸-コグリコール酸(ＰＬＧＡ)
ポリマーを用い、その生体適合性及び広範囲の生分解特性に基づいて開発された
。ＰＬＧＡの分解生成物である乳酸及びグリコール酸は、ヒト身体内で即座にク
リアされる。さらに、このポリマーの分解性は、分子量及び組成に依存して数ヶ
月から数年まで調節できる。Lewis, 「Controlled release of bioactive agent
s from lactide/glycolide polymer」in: M. Chasin及び R. Langer (編), Biod
egradable Polymers as Drug Delivery Systems (Marcel Dekker: New York, 19
90), pp. 1-41。 本発明は、ＳＲＴポリペプチドに類似する(アゴニスト)又はＳＲＴポリペプチ
ドの効果を阻害する(アンタゴニスト)ものを同定するための化合物のスクリーニ
ング方法も包含する。アンタゴニスト候補薬のスクリーニングアッセイは、ここ
に同定した遺伝子にコードされるＳＲＴポリペプチドと結合又は複合体形成する
化合物、又はコード化ポリペプチドと他の細胞性タンパク質との相互作用を阻害
する化合物を同定するために設計される。このようなスクリーニングアッセイは
、それを特に小分子候補薬の同定に適したものにする、化学的ライブラリーの高
スループットスクリーニングに適用可能なアッセイを含む。 このアッセイは、タンパク質-タンパク質結合アッセイ、生化学的スクリーニ
ングアッセイ、イムノアッセイ、及び細胞ベースのアッセイで、この分野で知ら
れたものを含む種々の方式で実施される。 アンタゴニストについての全てのアッセイは、それらが候補薬をここで同定さ
れた核酸にコードされるＳＲＴポリペプチドと、これら２つの成分が相互作用す
るのに十分な条件下及び時間で接触させることを必要とすることにおいて共通す
る。
【００６５】 結合アッセイにおいて、相互作用は結合であり、形成された複合体は単離され
るか、又は反応混合物中で検出することができる。特別な実施態様では、ここに
同定された遺伝子にコードされるＳＲＴポリペプチド又は候補薬が、共有又は非
共有結合により固相、例えばマイクロタイタープレートに固定化される。非共有
結合は、一般的に固体表面をポリペプチドの溶液で被覆し乾燥させることにより
達成される。あるいは、固定化されるＳＲＴポリペプチドに特異的な固定化抗体
、例えばモノクローナル抗体を、それを固体表面に固着させるために用いること
ができる。アッセイは、固定化成分、例えば固着成分を含む被覆表面に、検出可
能な標識で標識されていてもよい非固定化成分を添加することにより実施される
。反応が完了したとき、未反応成分を例えば洗浄により除去し、固体表面に固着
した複合体を検出する。最初の非固定化成分が検出可能な標識を有している場合
、表面に固定化された標識の検出は複合体形成が起こったことを示す。最初の非
固定化成分が標識を持たない場合は、複合体形成は、例えば、固定化された複合
体に特異的に結合する標識抗体によって検出できる。 候補化合物が相互作用するがここに同定した遺伝子にコードされる特定のＳＲ
Ｔポリペプチに結合しない場合、そのポリペプチドとの相互作用は、タンパク質
-タンパク質相互作用を検出するために良く知られた方法によってアッセイする
ことができる。そのようなアッセイは、架橋、同時免疫沈降、及び勾配又はクロ
マトグラフィカラムを通す同時精製などの伝統的な手法を含む。さらに、タンパ
ク質-タンパク質相互作用は、Fields及び共同研究者等(Fiels及びSong, Nature(
London) 340, 245-246 (1989); Chien等, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 88, 9578
-9582 (1991))に記載された酵母菌ベースの遺伝子系を用いることにより、Chevr
ay及びNathans, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 89, 5789-5793 (1991)に開示され
ているようにして監視することができる。酵母菌ＧＡＬ４などの多くの転写活性
化剤は、２つの物理的に別個のモジュラードメインからなり、一方はＤＮＡ結合
ドメインとして作用し、他方は転写活性化ドメインとして機能する。以前の文献
に記載された酵母菌発現系(一般に「２-ハイブリッド系」と呼ばれる)は、この
特性の長所を利用して、２つのハイブリッドタンパク質を用い、一方では標的タ
ンパク質がＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインに融合し、他方では、候補となる活性
化タンパク質が活性化ドメインに融合している。ＧＡＬ１-ｌａｃＺリポーター
遺伝子のＧＡＬ４活性化プロモーターの制御下での発現は、タンパク質-タンパ
ク質相互作用を介したＧＡＬ４活性の再構成に依存する。相互作用するポリペプ
チドを含むコロニーは、β-ガラクトシダーゼに対する色素生産性物質で検出さ
れる。２-ハイブリッド技術を用いた２つの特定なタンパク質間のタンパク質-タ
ンパク質相互作用を同定するための完全なキット(MATCHMAKERＴＭ)は、Clontech
から商業的に入手可能である。この系は、特定のタンパク質相互作用に含まれる
タンパク質ドメインのマッピング、並びにこの相互作用に係るアミノ酸残基の特
定にも拡張することができる。
【００６６】 ここで同定されたＳＲＴポリペプチドをコードする遺伝子と細胞内又は細胞外
成分との相互作用を阻害する化合物は、次のように試験できる：通常は反応混合
物は、遺伝子産物と細胞外又は細胞内成分を、それら２つの生成物が相互作用及
び結合する条件下及び時間で、含むように調製される。候補化合物が結合を阻害
する能力を試験するために、反応は試験化合物の不存在及び存在下で実施される
。さらに、プラシーボを第３の反応混合物に添加してポジティブ対照を提供して
もよい。混合物中に存在する試験化合物と細胞内又は細胞外成分との結合(複合
体形成)は上記のように監視される。試験化合物を含有する反応混合物ではなく
対照反応における複合体の形成は、試験化合物が試験化合物とその結合パートナ
ーとの相互作用を阻害することを示す。 アンタゴニストをアッセイするために、ＳＲＴポリペプチドを特定の活性につ
いてスクリーニングする化合物とともに細胞に添加してよく、ＳＲＴポリペプチ
ド存在下での関心ある活性を阻害する化合物の能力は、化合物がＳＲＴポリペプ
チドのアンタゴニストであることを示す。あるいは、アンタゴニストは、ＳＲＴ
ポリペプチド及び膜結合ＳＲＴポリペプチドレセプター又は組換えレセプターを
持つ潜在的アンタゴニストを、競合的阻害アッセイに適した条件下で結合させる
ことにより検出してもよい。ＳＲＴポリペプチドは、放射性等で標識でき、レセ
プターに結合したＳＲＴポリペプチド分子の数を潜在的アンタゴニストの有効性
を決定するのに使用できる。レセプターをコードする遺伝子は、当業者に知られ
た多くの方法、例えばリガンドパンニング及びＦＡＣＳソートにより同定できる
。Coligan等, Current Protocols in Immun., 1(2): Chapter 5 (1991)。好まし
くは、発現クローニングが用いられ、ポリアデニル化ＲＮＡがＳＲＴポリペプチ
ドに反応性の細胞から調製され、このＲＮＡから生成されたｃＤＮＡライブラリ
ーがプールに分配され、ＣＯＳ細胞又はＳＲＴポリペプチド反応性でない他の細
胞の形質移入に使用される。スライドガラスで成長させた形質移入細胞を標識し
たＳＲＴポリペプチドに暴露する。ＳＲＴポリペプチドは、ヨウ素化又は部位特
異的タンパク質キナーゼの認識部位の包含を含む種々の手段で標識できる。固定
及びインキュベーションの後、スライドにオートラジオグラフィ分析を施す。ポ
ジティブプールを同定し、相互作用サブプール化及び再スクリーニング工程を用
いてサブプールを調製して再形質移入し、結果的に推定レセプターをコードする
単一のクローンを生成する。
【００６７】 レセプター同定の代替的方法として、標識ＳＲＴポリペプチドをレセプター分
子を発現する細胞膜又は抽出調製物に光親和性結合させることができる。架橋材
料はＰＡＧＥに溶解させ、Ｘ線フィルムに暴露される。レセプターを含む標識複
合体を励起し、ペプチド断片に分離し、タンパク質マイクロ配列決定を施すこと
ができる。マイクロ配列決定から得たアミノ酸配列は、推定レセプターをコード
する遺伝子を同定するｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする分解性オリゴ
ヌクレオチドプローブの組の設計に用いられる。 アンタゴニストの他の検定では、レセプターを発現する哺乳動物細胞又は膜調
製物を、候補化合物の存在下で標識ＳＲＴポリペプチドとともにインキュベート
する。ついで、この相互作用を促進又は阻止する化合物の能力を測定する。 潜在的なアンタゴニストのより特別な例は、免疫グロブリンとＳＲＴポリペプ
チドとの融合体に結合するオリゴヌクレオチド、特に、限られないが、ポリ-及
びモノクローナル抗体及び抗体断片、一本鎖抗体、抗-イディオタイプ抗体、及
びこれらの抗体又は断片のキメラ又はヒト化形態、並びにヒト抗体及び抗体断片
を含む抗体を含んでいる。あるいは、潜在的アンタゴニストは、密接に関連した
タンパク質、例えば、レセプターを認識するが効果を与えず、従ってＳＲＴポリ
ペプチドの作用を競合的に阻害するＳＲＴポリペプチドの変異形態であってもよ
い。 他の潜在的なＳＲＴポリペプチドアンタゴニストは、アンチセンス技術を用い
て調製されたアンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ作成物であり、例えば、アンチセン
スＲＮＡ又はＤＮＡ分子は、標的ｍＲＮＡにハイブリダイズしてタンパク質翻訳
を妨害することによりｍＲＮＡの翻訳を直接阻止するように作用する。アンチセ
ンス技術は、トリプルへリックス形成又はアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡを通し
て遺伝子発現を制御するのに使用でき、それらの方法はともに、ポリヌクレオチ
ドのＤＮＡ又はＲＮＡへの結合に基づく。例えば、ここでの成熟ＳＲＴポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチド配列の５’コード化部分は、約１０から４０
塩基対長のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドの設計に使用される。ＤＮＡ
オリゴヌクレオチドは、転写に含まれる遺伝子の領域に相補的であるように設計
され(トリプルへリックス−Lee等, Nucl, Acids Res., 6: 3073 (1979); Cooney
等, Science, 241: 456 (1988); Dervan等, Science, 251: 1360 (1991)参照)、
それによりＳＲＴポリペプチドの転写及び生成を防止する。アンチセンスＲＮＡ
オリゴヌクレオチドはインビボでｍＲＮＡにハイブリダイズしてｍＲＮＡ分子の
ＳＲＴポリペプチドへの翻訳を阻止する(アンチセンス−Okano, Neurochem., 56
: 560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expr
ession (CRC Press: Boca Raton, FL, 1988))。上記のオリゴヌクレオチドは、
細胞に送達され、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡをインビボで発現させて、ＳＲ
Ｔポリペプチドの生産を阻害することもできる。アンチセンスＤＮＡが用いられ
る場合、翻訳開始部位、例えば標的遺伝子ヌクレオチド配列の−１０から＋１０
位置の間から誘導されるオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。
【００６８】 潜在的アンタゴニストは、ＳＲＴポリペプチドの活性部位、レセプター結合部
位、又は成長因子又は他の関連結合部位に結合し、それによりＳＲＴポリペプチ
ドの正常な生物学的活性を阻止する小分子を含む。小分子の例は、これらに限ら
れないが、小型ペプチド又はペプチド様分子、好ましくは可溶性ペプチド、及び
合成非ペプチド有機又は無機化合物を含む。 リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒できる酵素的ＲＮＡ分子である。リ
ボザイムは、相補的標的ＲＮＡへの配列特異的ハイブリダイゼーション、ついで
ヌクレオチド鎖切断的切断により作用する。潜在的ＲＮＡ標的内の特異的リボザ
イム切断部位は、既知の技術で同定できる。更なる詳細は、例えば、Rossi, Cur
rent Biology 4: 469-471 (1994)及びＰＣＴ公報、番号WO 97/33551(1997年9月1
8日発行)を参照。 転写阻害に用いられるトリプルヘリックス形成における核酸分子は一本鎖でデ
オキシヌクレオチドからなる。これらのオリゴヌクレオチドの基本組成は、フー
グスチン塩基対則を介するトリプルヘリックス形成を促進するように設計され、
それは一般に二重鎖の一方の鎖上のプリン又はピリミジンのサイズ変更可能な伸
展を必要とする。さらなる詳細は、例えば、ＰＣＴ公報、番号WO 97/33551, 上
掲を参照。 これらの小分子は、上記で議論したスクリーニングアッセイの一又は複数の任
意のものにより及び／又は当業者に良く知られた他の任意のスクリーニング技術
により同定できる。
【００６９】 Ｆ．抗-ＳＲＴポリペプチド抗体 本発明は抗-ＳＲＴ抗体を更に提供する。抗体の例としては、ポリクローナル
、モノクローナル、ヒト化、二重特異性及びヘテロ結合体抗体が含まれる。
【００７０】 １．ポリクローナル抗体 抗-ＳＲＴ抗体はポリクローナル抗体を含む。ポリクローナル抗体の調製方法
は当業者に知られている。哺乳動物においてポリクローナル抗体は、例えば免疫
化剤、及び所望するのであればアジュバントを、一又は複数回注射することで発
生させることができる。典型的には、免疫化剤及び／又はアジュバントを複数回
皮下又は腹腔内注射により、哺乳動物に注射する。免疫化剤は、ＳＲＴポリペプ
チド又はその融合タンパク質を含みうる。免疫化剤を免疫化された哺乳動物にお
いて免疫原性が知られているタンパク質に結合させるのが有用である。このよう
な免疫原タンパク質の例は、これらに限られないが、キーホールリンペットヘモ
シアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン及び大豆トリプシンインヒビ
ターが含まれる。使用され得るアジュバントの例には、フロイント完全アジュバ
ント及びＭＰＬ-ＴＤＭアジュバント(モノホスホリル脂質Ａ、合成トレハロース
ジコリノミコラート)が含まれる。免疫化プロトコールは、過度の実験なく当業
者により選択されるであろう。
【００７１】 ２．モノクローナル抗体 あるいは、抗-ＳＲＴ抗体はモノクローナル抗体であってもよい。モノクロー
ナル抗体は、Kohler及びMilstein, Nature, 256:495 (1975)に記載されているよ
うなハイブリドーマ法を使用することで調製することができる。ハイブリドーマ
法では、マウス、ハムスター又は他の適切な宿主動物を典型的には免疫化剤によ
り免疫化することで、免疫化剤に特異的に結合する抗体を生成するかあるいは生
成可能なリンパ球を誘発する。また、リンパ球をインビトロで免疫化することも
できる。 免疫化剤は、典型的にはＳＲＴポリペプチド又はその融合タンパク質を含む。
一般にヒト由来の細胞が望まれる場合には末梢血リンパ球(「ＰＢＬ」)が使用さ
れ、あるいは非ヒト哺乳動物源が望まれている場合は、脾臓細胞又はリンパ節細
胞が使用される。ついで、ポリエチレングリコール等の適当な融合剤を用いてリ
ンパ球を不死化株化細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する［Goding,
Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) p
p. 59-103］。不死化株化細胞は、通常は、形質転換した哺乳動物細胞、特に齧
歯動物、ウシ、及びヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラット又はマウスの骨
髄腫株化細胞が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の不死
化細胞の生存又は成長を阻害する一又は複数の物質を含有する適切な培地で培養
される。例えば、親細胞が、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトラ
ンスフェラーゼ(HGPRT又はHPRT)を欠いていると、ハイブリドーマの培地は、典
型的には、ヒポキサチン、アミノプチリン及びチミジンを含み(「ＨＡＴ培地」)
、この物質がＨＧＰＲＴ欠乏性細胞の増殖を阻止する。 好ましい不死化株化細胞は、効率的に融合し、選択された抗体生成細胞による
安定した高レベルの抗体発現を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性
である。より好ましい不死化株化細胞はマウス骨髄腫株であり、これは例えばカ
リフォルニア州サンディエゴのSalk Institute Cell Distribution Centerやバ
ージニア州マナッサスのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入
手可能である。ヒトモノクローナル抗体を生成するためのヒト骨髄腫及びマウス
-ヒト異種骨髄腫株化細胞も記載されている［Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (
1984)；Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applicat
ions, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63］。
【００７２】 ついでハイブリドーマ細胞が培養される培養培地を、ＳＲＴに対するモノクロ
ーナル抗体の存在についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によ
って生成されたモノクローナル抗体の結合特異性は免疫沈降又はラジオイムノア
ッセイ(ＲＩＡ)や酵素結合免疫測定法(エライザ)等のインビトロ結合検定法によ
って測定する。このような技術及びアッセイは、当該分野において公知である。
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunson及びPollard, Anal. Biochem
., 107:220 (1980)によるスキャッチャード分析法によって測定することができ
る。 所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを制限希釈工程によりサ
ブクローニングし、標準的な方法で成長させることができる［Goding, 上掲］。
この目的のための適当な培地には、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地及び
ＲＰＭＩ-１６４０倍地が含まれる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物
においてインビボで腹水として成長させることもできる。 サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ
−セファロース法、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー法、ゲル電気泳
動法、透析法又はアフィニティークロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン
精製方法によって培養培地又は腹水液から単離又は精製される。 また、モノクローナル抗体は、組換えＤＮＡ法、例えば米国特許第4,816,567
号に記載された方法により作成することができる。本発明のモノクローナル抗体
をコードするＤＮＡは、常套的な方法を用いて(例えば、マウス抗体の重鎖及び
軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使
用して)、容易に単離し配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細
胞はそのようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたら、ＤＮＡ
は発現ベクター内に配することができ、これが宿主細胞、例えばサルＣＯＳ細胞
、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、あるいは免疫グロブリンタンパク
質を生成等しない骨髄腫細胞内に形質移入され、組換え宿主細胞内でモノクロー
ナル抗体の合成をすることができる。また、ＤＮＡは、例えば相同マウス配列に
換えてヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することにより［米国
特許第4,816,567号；上掲のMorrison等］、又は免疫グロブリンコード化配列に
非免疫グロブリンポリペプチドのコード化配列の一部又は全部を共有結合するこ
とにより修飾することができる。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、
本発明の抗体の定常ドメインに置換でき、あるいは本発明の抗体の１つの抗原結
合部位の可変ドメインに置換でき、キメラ性二価抗体を生成する。 抗体は一価抗体であってもよい。一価抗体の調製方法は当該分野においてよく
知られてる。例えば、一つの方法は免疫グロブリン軽鎖と修飾重鎖の組換え発現
を含む。重鎖は一般的に、重鎖の架橋を防止するようにＦｃ領域の任意の点で切
断される。あるいは、関連するシステイン残基を他のアミノ酸残基で置換するか
欠失させて架橋を防止する。 一価抗体の調製にはインビトロ法がまた適している。抗体の消化による、その
断片、特にＦａｂ断片の生成は、当該分野において知られている慣用的技術を使
用して達成できる。
【００７３】 ３．ヒト及びヒト化抗体 本発明の抗-ＳＲＴ抗体は、さらにヒト化抗体又はヒト抗体を含む。非ヒト(例
えばマウス)抗体のヒト化形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖あ
るいはその断片(例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２あるいは抗体の他
の抗原結合サブ配列)であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含
むものである。ヒト化抗体はレシピエントの相補性決定領域(ＣＤＲ)の残基が、
マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒ
ト種(ドナー抗体)のＣＤＲの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシ
ピエント抗体)を含む。幾つかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワ
ーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。また、ヒト化抗体は
、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見
出されない残基を含んでいてもよい。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほと
んど全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほ
とんど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少
なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗
体は、最適には免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリ
ンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる［Jones等, Nature, 321:522-525 (
1986); Riechmann等, Nature, 332:323-329 (1988); 及びPresta, Curr. Op Str
uct. Biol., 2:593-596 (1992)］。 非ヒト抗体をヒト化する方法はこの分野でよく知られている。一般的に、ヒト
化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒト
アミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移
入」残基と称される。ヒト化は基本的に、Winter及び共同研究者［Jones等, Nat
ure, 321:522-525 (1986)；Riechmann等, Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoe
yen等, Science, 239:1534-1536 (1988)］の方法に従って、齧歯類ＣＤＲ又はＣ
ＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより実施される。よって、
このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が
非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第4,816,567号)
である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのＣＤＲ残基及び場合によっ
ては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換され
たヒト抗体である。
【００７４】 また、ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリー［Hoogenboom及びWint
er, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)；Marks等, J. Mol. Biol., 222:581 (1991
)］を含むこの分野で知られた種々の方法を用いて作成することもできる。また
、Cole等及びBoerner等の技術も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用するこ
とができる(Cole等, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Lis
s. p.77(1985)及びBoerner等, J. Immunol., 147(1)：86-95(1991) ］。同様に
、ヒト抗体はヒト免疫グロブリン座位をトランスジェニック動物、例えば内在性
免疫グロブリン遺伝子が部分的又は完全に不活性化されたマウスに導入すること
により産生することができる。投与の際に、遺伝子再配列、組立、及び抗体レパ
ートリーを含むあらゆる観点においてヒトに見られるものに非常に類似している
ヒト抗体の生産が観察される。このアプローチは、例えば米国特許第5,545,807
号；同第5,545,806号；同第5,569,825号；同第5,625,126号；同第5,633,425号；
同第5,661,016号、及び次の科学文献：Marks等, Bio/Technology 10, 779-783 (
1992); Lonberg等, Nature 368 856-859 (1994); Morrison, Nature 368, 812-1
3 (1994); Fishwild等, Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger,
Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg及びHuszar, Intern. Rev. Im
munol. 13 65-93 (1995)に記載されている。
【００７５】 ４．二重特異性抗体 二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有する
モノクローナル抗体、好ましくはヒトもしくはヒト化抗体である。本ケースにお
いて、結合特異性の一方はＳＲＴに対してであり、他方は任意の他の抗原、好ま
しくは細胞表面タンパク質又はレセプター又はレセプターサブユニットに対して
である。 二重特異性抗体を作成する方法は当該技術分野において周知である。伝統的に
は、二重特異性抗体の組換え生産は、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免
疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現に基づく［Milstein及びCuello, Nature,
305:537-539 (1983)］。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を無作為に取り揃えるため
、これらハイブリドーマ(クアドローマ)は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合
物を生成し、その内一種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精
製は、アフィニティークロマトグラフィー工程によって通常達成される。同様の
手順が1993年5月13日公開のWO93/08829、及びTraunecker等, EMBO J.,10:3655-3
656 (1991)に開示されている。 所望の結合特異性(抗体-抗原結合部位)を有する抗体可変ドメインを免疫グロ
ブリン定常ドメイン配列に融合できる。融合は、好ましくは少なくともヒンジ部
、ＣＨ２及びＣＨ３領域の一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのもの
である。少なくとも一つの融合には軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常
領域(ＣＨ１)が存在することが望ましい。免疫グロブリン重鎖融合をコードする
ＤＮＡ、及び望むのであれば免疫グロブリン軽鎖を、別々の発現ベクターに挿入
し、適当な宿主生物に同時形質移入する。二重特異性抗体を作成するための更な
る詳細については、例えばSuresh等, Methods in Enzymology, 121:210(1986)を
参照されたい。
【００７６】 WO96/27011に記載された他の方法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作し
て組換え細胞培養から回収される異種二量体の割合を最大にすることができる。
好適な界面は抗体定常ドメインのＣＨ３領域の少なくとも一部を含む。この方法
では、第１抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな
側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置き換えられる。大きな側鎖と同じ
又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの
(例えばアラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第２の抗体分子の界面
に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘ
テロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。 二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体断片(例えば、Ｆ(ａｂ')２二重特異性抗
体)として調製できる。抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献
に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製すること
ができる。Brennan等, Science, 229:81(1985) は無傷の抗体をタンパク分解的
に切断してＦ(ａｂ')２断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、
ジチオール錯体形成剤亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安
定化させ、分子間ジスルフィド形成を防止する。産生されたＦａｂ'断片はつい
でチオニトロベンゾアート(ＴＮＢ)誘導体に転換される。Ｆａｂ'-ＴＮＢ誘導体
の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ'-チオールに再転
換し、他のＦａｂ'-ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成す
る。作られた二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用すること
ができる。 大腸菌からＦａｂ'断片を直接回収でき、これは化学的に結合して二重特異性
抗体を形成することができる。Shalaby等, J. Exp. Med., 175:217-225 (1992)
は完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ(ａｂ')２分子の製造を記述している。
各Ｆａｂ'断片は大腸菌から別個に分泌され、インビトロで定方向化学結合を受
けて二重特異性抗体を形成する。このようにして形成された二重特異性抗体は、
正常なヒトＴ細胞及びＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する細胞に結合可能で、
ヒト***腫瘍標的に対するヒト細胞障害性リンパ球の細胞溶解活性の誘因となる
。
【００７７】 組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する様々な方法
もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して
生産されている。Kostelnyら, J.Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓ及
びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの
異なった抗体のＦａｂ'部分に結合させる。抗体ホモダイマーをヒンジ領域で還
元してモノマーを形成し、ついで再酸化して抗体ヘテロダイマーを形成する。こ
の方法はまた抗体ホモダイマーの生産に対して使用することができる。Hollinge
rら, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイ
アボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供した。断
片は、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするには十分に短いリンカ
ーにより軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)を結合してなる。従
って、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは他の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメ
インと強制的に対形成させられ、２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ(ｓ
Ｆｖ)ダイマーの使用により二重特異性抗体断片を製造する他の方策もまた報告
されている。Gruberら, J.Immunol. 152:5368 (1994)を参照されたい。 二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することがで
きる。Tuttら J.Immunol. 147:60(1991)。 例示的な二重特異性抗体は、ここに与えられたＳＲＴポリペプチドの２つの異
なるエピトープに結合しうる。あるいは、抗-ＳＲＴポリペプチドのアームは、
特定のＳＲＴポリペプチド発現細胞に細胞防御メカニズムを集中させるように、
Ｔ細胞レセプター分子(例えばＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８、又はＢ７)等の白血球
上のトリガー分子、又はＦｃγＲＩ(ＣＤ６４)、ＦｃγＲＩＩ(ＣＤ３２)及びＦ
ｃγＲＩＩＩ(ＣＤ１６)等のＩｇＧ(ＦｃγＲ)に対するＦｃレセプターに結合す
るアームと結合しうる。また、二重特異性抗体は特定のＳＲＴポリペプチドを発
現する細胞に細胞障害薬を局在化させるためにも使用されうる。これらの抗体は
ＳＲＴ結合アーム及び細胞障害薬又は放射性キレート化剤、例えばEOTUBE、DPTA
、DOTA、又はTETAと結合するアームを有する。関心ある他の二重特異性抗体はＳ
ＲＴポリペプチドに結合し、そしてさらに組織因子(ＴＦ)に結合する。
【００７８】 ５．ヘテロ結合抗体 ヘテロ結合抗体もまた本発明の範囲に入る。ヘテロ結合抗体は、２つの共有結
合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対
してターゲティングさせるため［米国特許第4,676,980号］及びＨＩＶ感染の治
療のために［WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089］提案されている。この抗
体は、架橋剤に関連したものを含む合成タンパク化学における既知の方法を使用
して、インビトロで調製することができると考えられる。例えば、ジスルフィド
交換反応を使用するか又はチオエーテル結合を形成することにより、免疫毒素を
作成することができる。この目的に対して好適な試薬の例には、イミノチオレー
ト及びメチル-４-メルカプトブチリミデート、及び例えば米国特許第4,676,980
号に開示されているものが含まれる。
【００７９】 ６．エフェクター機能の加工 本発明の抗体をエフェクター機能について改変し、例えば癌治療における抗体
の有効性を向上させるのが望ましい。例えば、システイン残基をＦｃ領域に導入
し、それにより、この領域に鎖間ジスルフィド結合を形成させるようにしてもよ
い。そのようにして生成された同種二量体抗体は、向上した内部移行能力及び／
又は増加した相補鎖媒介細胞殺傷及び抗体-依存性細胞性細胞毒性(ＡＤＣＣ)を
有しうる。Caron等, J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992)及びShopes, J. Immu
nol. 148: 2918-2922 (1992)参照。向上した抗腫瘍活性を持つ同種二量体抗体は
また、Wolff等, Cancer research 53: 2560-2565 (1993)に記載されたような異
種二官能性架橋を用いても調製しうる。あるいは、抗体は、２つのＦｃ領域を有
するように加工して、それにより相補鎖溶解及びＡＤＣＣ能力を向上させること
もできる。Stevenson等, Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989)参照。
【００８０】 ７．免疫結合体 本発明はまた、化学治療薬、毒素(例えば、細菌、真菌、植物又は動物由来の
酵素活性毒素、又はその断片)などの細胞障害薬、あるいは放射性同位体(即ち、
放射性結合)に結合された抗体を含む免疫結合体にも関する。 このような免疫結合体の生成に有用な化学治療薬は上記した。用いることので
きる酵素活性毒素及びその断片は、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活
性断片、(緑膿菌からの)外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン(m
odeccin)Ａ鎖、α-サルシン、アレウリテス・フォーディ(Aleurites fordii)タ
ンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ(Phyto
laca americana)タンパク質(ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ-Ｓ)、モモルデ
ィカ・チャランチア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、
クロチン(crotin)、サパオナリア・オフィシナリス(sapaonaria oficinalis)イ
ンヒビター、ゲロニン(gelonin)、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(
restrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)及びト
リコテセン(tricothecene)を含む。様々な放射性ヌクレオチドが放射性結合抗体
の生成に利用可能である。例として、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０ Ｙ及び１８６Ｒｅを含む。抗体及び細胞障害薬の結合体は、種々の二官能性タン
パク質カップリング剤、例えば、Ｎ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ
ール)プロピオネート(ＳＰＤＰ)、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステルの二
官能性誘導体(ジメチルアジピミデートＨＣＬ等)、活性エステル(ジスクシンイ
ミジルスベレート等)、アルデヒド(グルタルアルデヒド等)、ビス-アジド化合物
(ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン等)、ビス-ジアゾニウム誘導体(
ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン等)、ジイソシアネート(
トリエン２，６-ジイソシアネート等)、及びビス-活性フッ素化合物(１，５-ジ
フルオロ-２，４-ジニトロベンゼン等)を用いて作成できる。例えば、リシン免
疫毒素は、Vitetta等, Science 238: 1098 (1987)に記載されたように調製する
ことができる。カーボン-１４-標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジ
エチレントリアミン五酢酸(ＭＸ-ＤＴＰＡ)は、放射性ヌクレオチドの抗体への
結合のためのキレート剤の例である。WO 94/11026参照。 他の実施態様では、腫瘍の予備標的化で使用するために、抗体は「レセプター
」(ストレプトアビジン等)に結合されてもよく、抗体-レセプター結合体は患者
に投与され、ついで清澄化剤を用いて未結合結合体を循環から除去し、次に細胞
障害薬(例えば、放射性ヌクレオチド等)に結合したた「リガンド」(アビジン等)
を投与する。
【００８１】 ８．免疫リポソーム また、ここに開示する抗体は、免疫リポソームとして調製してもよい。抗体を
含むリポソームは、Epstein等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985)
; Hwang等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); 及び米国特許第4,
485,045号及び第4,544,545号に記載されたような、この分野で知られた方法で調
製される。向上した循環時間を持つリポソームは、米国特許第5,013,556号に開
示されている。 特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ
-誘導ホスファチジルエタノールアミン(ＰＥＧ-ＰＥ)を含む脂質組成物での逆相
蒸発法によって生成される。リポソームは、所定の孔サイズのフィルターを通し
て押し出され、所望の径を有するリポソームが生成される。本発明の抗体のＦａ
ｂ’断片は、Martin等, J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982)に記載されている
ように、ジスルフィド交換反応を介してリポソームに結合され得る。化学治療薬
(ドキソルビシン等)は、場合によってはリポソーム内に包含される。Gabizon等,
J. National Cancer Inst. 81(19) 1484 (1989)参照。
【００８２】 ９．抗体の製薬組成物 ここで同定されるＳＲＴポリペプチドに特異的に結合する抗体、並びに上記に
開示したスクリーニングアッセイで同定された他の分子は、種々の疾患の治療の
ために、製薬組成物の形態で投与することができる。 ＳＲＴポリペプチドが細胞内であり、全抗体がインヒビターとして用いられる
場合、内在化抗体が好ましい。しかし、リポフェクション又はリポソームも抗体
、又は抗体断片を細胞に送達するのに使用できる。抗体断片が用いられる場合、
標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最小阻害断片が好ましい。例
えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的タンパク質配列に結合する能力を保
持したペプチド分子が設計できる。このようなペプチドは、化学的に合成でき、
及び／又は組換えＤＮＡ技術によって生成できる。例えば、Marasco等, Proc. N
atl. Acad. Sci. USA 90, 7889-7893 (1993)参照。ここでの製剤は、治療すべき
特定の徴候に必要な場合に１以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼ
さない相補的活性を持つものも含んでよい。あるいは、又はそれに加えて、組成
物は、その機能を増強させる薬剤、例えば細胞障害薬、サイトカイン、化学治療
薬又は成長阻害剤を含んでもよい。これらの分子は、適切には、意図する目的に
有効な量の組み合わせで存在する。 また、活性成分は、例えばコアセルベーション技術により又は界面重合により
調製されたマイクロカプセル、例えば、各々ヒドロキシメチルセルロース又はゼ
ラチン-マイクロカプセル及びポリ(メタクリル酸メチル)マイクロカプセル中、
コロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミン小球、マイクロエマル
ション、ナノ粒子及びナノカプセル)中、又はマイクロエマルション中に包括さ
れていてもよい。これらの技術は上掲のRemington's Pharmaceutical Scienceに
開示されている。
【００８３】 インビボ投与に使用される製剤は無菌でなけらばならない。これは、滅菌濾過
膜を通した濾過により容易に達成される。 徐放性製剤を調製してもよい。徐放性製剤の好適な例は、抗体を含有する固体
疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、このマトリクスは成形された物品、
例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形状である。除放性マトリクスの例は
、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリラー
ト)、又はポリ(ビニルアルコール))、ポリアクチド(米国特許第3,773,919号)、
Ｌ-グルタミン酸及びγ-エチル-Ｌ-グルタマートのコポリマー、非分解性エチレ
ン-酢酸ビニル、LUPRON DEPOTＴＭ(乳酸-グリコール酸コポリマーと酢酸リュー
プロリドの注射可能な小球)などの分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、及びポ
リ-Ｄ-(-)-３-ヒドロキシブチル酸を含む。エチレン-酢酸ビニル及び乳酸-グリ
コール酸などのポリマーは分子を１００日に渡って放出することができるが、あ
る種のヒドロゲルはより短時間でタンパク質を放出してしまう。カプセル化され
た抗体が身体内に長時間残ると、それらは３７℃の水分に露出されることにより
変性又は凝集し、その結果、生物学的活性の喪失及び起こりうる免疫原性の変化
をもたらす。合理的な方法は、含まれる機構に依存する安定化について工夫する
ことができる。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド交換を通した分子間Ｓ−
Ｓ結合形成であると発見された場合、安定化はスルフヒドリル残基の修飾、酸性
溶液からの凍結乾燥、水分含有量の制御、適切な添加剤の使用、及び特異的ポリ
マーマトリクス組成物の開発によって達成されうる。
【００８４】 Ｇ．抗-ＳＲＴ抗体の用途 本発明の抗-ＳＲＴ抗体は様々な有用性を有している。例えば、抗-ＳＲＴ抗体
は、ＳＲＴの診断アッセイ、例えばその特定細胞、組織、又は血清での発現の検
出に用いられる。競合的結合アッセイ、直接又は間接サンドウィッチアッセイ及
び不均一又は均一相で行われる免疫沈降アッセイ［Zola, Monoclonal Antibodie
s: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987) pp. 147-158］等のこの
分野で知られた種々の診断アッセイ技術が使用される。診断アッセイで用いられ
る抗体は、検出可能な部位で標識される。検出可能な部位は、直接又は間接に、
検出可能なシグナルを発生しなければならない。例えば、検出可能な部位は、３ Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ又は１２５Ｉ等の放射性同位体、フルオレセインイ
ソチオシアネート、ローダミン又はルシフェリン等の蛍光又は化学発光化合物、
あるいはアルカリホスファターゼ、ベータ-ガラクトシダーゼ又はセイヨウワサ
ビペルオキシダーゼ等の酵素であってよい。抗体に検出可能な部位を結合させる
ためにこの分野で知られた任意の方法が用いられ、それにはHunter等 Nature, 1
44:945 (1962)；David等, Biochemistry, 13: 1014 (1974)；Pain等, J. Immuno
l. Meth., 40:219 (1981) ;及びNygren, J. Histochem. and Cytochem., 30:407
(1982)に記載された方法が含まれる。 また、抗-ＳＲＴ抗体は組換え細胞培養又は天然供給源からのＳＲＴのアフィ
ニティー精製にも有用である。この方法においては、ＳＲＴに対する抗体を、当
該分野でよく知られている方法を使用して、セファデックス樹脂や濾紙のような
適当な支持体に固定化する。次に、固定化された抗体を、精製するＳＲＴを含む
試料と接触させた後、固定化された抗体に結合したＳＲＴ以外の試料中の物質を
実質的に全て除去する適当な溶媒で支持体を洗浄する。最後に、ＳＲＴを抗体か
ら脱離させる他の適当な溶媒で支持体を洗浄する。 以下の実施例は例示目的でのみ提供されるものであって、本発明の範囲を決し
て限定することを意図するものではない。 本明細書で引用した全ての特許及び参考文献の全体を、出典明示によりここに
取り込む。
【００８５】 (実施例) 実施例で言及されている市販試薬は、特に示さない限りは製造者の使用説明に
従い使用した。ＡＴＣＣ登録番号により以下の実施例及び明細書全体を通して同
定されている細胞の供給源はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、
マナッサス、ＶＡである。
【００８６】 実施例１ ＳＲＴ ｃＤＮＡの単離 １．オリゴｄＴプライムｃＤＮＡライブラリーの調製 ｍＲＮＡをInvitrogen, San Diego, CAからの試薬及びプロトコールを用いて
ヒト組織から単離した(Fast Track 2)。このＲＮＡを、Life Technologies, Gai
thersburg, MD (Super Script Plasmid System)からの試薬及びプロトコールを
用いるベクターｐＲＫ５ＤにおけるオリゴｄＴプライムしたｃＤＮＡの生成に使
用した。この方法において、二本鎖ｃＤＮＡは１０００ｂｐを越えるサイズ分類
し、ＳａｌＩ／ＮｏｔＩ結合ｃＤＮＡをＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ切断ベクターにクロ
ーニングした。ｐＲＫ５Ｄは、ＸｈｏＩ／ＮｏｔＩｃＤＮＡクローニング部位の
前にあるＳｆｉＩ制限酵素部位が続くｓｐ６転写開始部位を持つクローニングベ
クターである。
【００８７】 ２．ランダムプライムｃＤＮＡライブラリーの調製 一次ｃＤＮＡクローンの５’末端を好ましく表現するために二次ｃＤＮＡライ
ブラリーを作成した。Ｓｐ６ＲＮＡを(上記の)一次ライブラリーから生成し、こ
のＲＮＡを、ベクターｐＳＳＴ-ＡＭＹ．０におけるLife Technologies (上で参
照したSuper Script Plasmid System)からの試薬及びプロトコールを用いたラン
ダムプライムしたｃＤＮＡライブラリーの生成に使用した。この方法において、
二本鎖ｃＤＮＡを５００-１０００ｂｐにサイズ分類し、平滑末端でＮｏｔＩア
ダプターに結合させ、ＳｆｉＩ部位で切断し、そしてＳｆｉＩ／ＮｏｔＩ切断ベ
クターにクローニングした。ｐＳＳＴ-ＡＭＹ．０は、ｃＤＮＡクローニング部
位の前に酵母アルコールデヒドロゲナーゼプロモータ、及びクローニング部位の
後にマウスアミラーゼ配列(分泌シグナルを持たない成熟配列)についで酵母アル
コールデヒドロゲナーゼ転写終結区を有するクローニングベクターである。よっ
て、アミラーゼ配列でフレームに融合するこのベクターにクローニングされたｃ
ＤＮＡは、適当に形質移入された酵母コロニーからのアミラーゼの分泌を導く。
【００８８】 ３．形質転換及び検出 上記の段落２に記載したライブラリーからのＤＮＡを氷上で冷却し、それにエ
レクトロコンピテントＤＨ１０Ｂ細菌(Life Technoligies、２０ｍｌ)を添加し
た。細菌及びベクターの混合物は、ついで製造者に推奨されているように電気穿
孔した。ついで、ＳＯＣ培地(Life Technplogies、１ｍｌ)を添加し、この混合
物を３７℃で３０分間インキュベートした。形質転換体は、ついでアンピシリン
を含む２０標準１５０ｍｍＬＢプレートに蒔き、１６時間インキュベートした(
３７℃)。ポジティブコロニーをプレートから廃棄し、細菌ペレットから標準的
なプロトコール、例えばＣｓＣｌ-勾配を用いてＤＮＡを単離した。精製ＤＮＡ
は、ついで以下の酵母プロトコールにのせた。 酵母方法は３つの範疇に分けられる：(１)酵母のプラスミド／ｃＤＮＡ結合ベ
クターでの形質転換；(２)アミラーゼを分泌する酵母クローンの検出及び単離；
及び(３)酵母コロニーから直接的な挿入物のＰＣＲ増幅及び配列決定及びさらな
る分析のためのＤＮＡの精製。 用いた酵母菌株はＨＤ５６-５Ａ(ATCC-90785)であった。この株は以下の遺伝
子型：ＭＡＴα、ｕｒａ３-５２、ｌｅｕ２-３、ｌｅｕ２-１１２、ｈｉｓ３-１
１、ｈｉｓ３-１５、ＭＡＬ＋、ＳＵＣ＋、ＧＡＬ＋を有する。好ましくは、不
完全な翻訳後経路を持つ酵母変異体を用いることができる。このような変異体は
、ｓｅｃ７１、ｓｅｃ７２、ｓｅｃ６２に転位不全対立遺伝子を持つが、切断さ
れたｓｅｃ７１が最も好ましい。あるいは、これらの遺伝子の正常な操作を阻害
するアンタゴニスト(アンチセンスヌクレオチド及び／又はリガンドを含む)、こ
の翻訳後経路に含まれる他のタンパク質(例えば、ＳＥＣ６１ｐ、ＳＥＣ７２ｐ
、ＳＥＣ６２ｐ、ＳＥＣ６３ｐ、ＴＤＪ１ｐ又はＳＳＡ１ｐ-４ｐ)又はこれらの
タンパク質の複合体形成も、アミラーゼ発現酵母と組み合わせて好ましく用いら
れる。 形質転換は、Gietz等, Nucl. Acid. Res., 20: 1425 (1992)に概略が記された
プロトコールに基づいて実施された。形質転換細胞は、ついで寒天からＹＥＰＤ
複合培地ブロス(１００ｍｌ)に播種し、３０℃で終夜成長させた。ＹＥＰＤブロ
スは、Kaiser等, Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Press, Col
d Spring Harbor, NY, p. 207 (1994)に記載されているように調製した。終夜培
地は、ついで新鮮なＹＥＰＤブロス(５００ｍｌ)中におよそ２ｘ１０６細胞／ｍ
ｌ(約ＯＤ６００＝０．１)に希釈し、１ｘ１０７細胞／ｍｌ(約ＯＤ６００＝０
．４-０．５)まで再成長させた。
【００８９】 ついで細胞を収穫し、5,000rpmで５分間のSorval GS3 ローターのＧＳ３ロー
ターボトルに移し、上清をデカントし、ついで無菌水に再懸濁することにより形
質転換のために調製し、そして５０ｍｌのファルコン管内で、Beckman GS-6KR遠
心機において3,500rpmで再度遠心分離した。上清をデカント、細胞をＬｉＡｃ／
ＴＥ(10ml, 10mMのトリス-HCl, 1mMのEDTA pH7.5, 100mMのＬｉ２ＯＯＣＣＨ３ )で続けて洗浄し、ＬｉＡｃ／ＴＥ(2.5ml)中に再懸濁させた。 形質転換は、マイクロチューブ内で、調製した細胞(100μl)を新鮮な変性一本
鎖サケ***ＤＮＡ(Lofstrand Labs, Gaitherburg, MD)及び形質転換ＤＮＡ(1μg
vol.＜10μl)と混合することにより起こした。混合物はボルテックスにより簡
単に混合し、ついで40%ＰＥＧ／ＴＥ(600μl, 40%のポリエチレングリコール-４
０００, 10mMのトリス-HCl, 1mMのEDTA, 100mMのLi２OOCCH３, pH 7.5)を添加した 。この混合物を緩く撹拌し、３０分間撹拌しながら３０℃でインキュベートした
。ついで細胞に４２℃で１５分間熱衝撃を与え、反応容器をミクロチューブ内で
12,000rpmで5-10秒間遠心分離し、デカント及びＴＥ(500μl, 10mMのトリス-HCl, 1 mMのEDTA pH 7.5)への再懸濁についで遠心分離した。ついで、細胞をＴＥ(1ml)
中に希釈し、アリコート(200μl)を150mm成長プレート(ＶＷＲ)に予め調製した
選択培地に拡げた。 あるいは、複数の少量反応の代わりに、形質転換を１回の大規模反応で実施し
たが、試薬の量はしかるべくスケールアップした。 用いた選択培地は、Kaiser等, Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Har
bor Press, Cold Spring Harbor, NY, p. 208-210 (1994)に記載されているよう
に調製したウラシルを欠く合成完全デキストロース寒天(ＳＣＤ-Ｕｒａ)であっ
た。形質転換体は３０℃で２-３日成長させた。 アミラーゼを分泌するコロニーの検出は、選択成長培地における赤色デンプン
の包含により実施した。Biely等, Anal. Biochem., 172: 176-179 (1988)に記載
された方法に従って、デンプンを赤色染料(反応性 Red-120, Sigma)に結合させ
た。結合したデンプンをＳＣＤ-Ｕｒａ寒天プレートに最終濃度0.15%(w/v)で導
入し、リン酸カリウムでｐＨ７．０に緩衝した(最終濃度50-100mM)。 ポジティブコロニーを拾って新鮮な選択培地(150mmプレート)に画線し、良好
に単離され同定可能な単一コロニーを得た。アミラーゼ分泌についてポジティブ
な良好に単離された単一コロニーは、緩衝ＳＣＤ-Ｕｒａ寒天への赤色デンプン
の直接導入により検出した。ポジティブコロニーは、デンプンを分解して、ポジ
ティブコロニーの周囲に直接目視できる暈を形成する能力により決定した。
【００９０】 ４．ＰＣＲ増幅によるＤＮＡの単離 ポジティブコロニーが単離された場合、その一部を楊枝で拾い、９６ウェルプ
レートにおいて無菌水(30μl)に希釈した。この時点で、ポジティブコロニーは
凍結して次の分析のために保存するか、即座に増幅するかのいずれかである。細
胞のアリコート(5μl)を、0.5μlのKlentaq(Clontech, Palo Alto, CA); 4.0μl
の10mM dNTP(Perkin Elmer-Cetus); 2.5μlのKentaqバッファー(Clontech); 0.2
5μlの正方向オリゴ１；0.25μlの逆方向オリゴ２；12.5μlの蒸留水を含有する
25μl容量におけるＰＣＲ反応のテンプレートとして使用した。正方向オリゴヌ
クレオチド１の配列は： 5'-TGTAAAACGACGGCCAGTTAAATAGACCTGCAATTATTAATCT-3'(配列番号：５６３)
であった。 逆方向オリゴヌクレオチド２の配列は： 5'-CAGGAAACAGCTATGACCACCTGCACACCTGCAAATCCATT-3'(配列番号：５６４) であった。 ついで、ＰＣＲは以下の通り実施した： ａ． 変性 92℃、5分間 ｂ．３サイクル： 変性 92℃、30秒間 アニール 59℃、30秒間 伸長 72℃、60秒間 ｃ．３サイクル： 変性 92℃、30秒間 アニール 57℃、30秒間 伸長 72℃、60秒間 ｄ．２５サイクル： 変性 92℃、30秒間 アニール 55℃、30秒間 伸長 72℃、60秒間 ｅ． 保持 4℃ 上述したオリゴヌクレオチドの下線を施した領域は、各々ＡＤＨプロモーター
領域及びアミラーゼ領域にアニーリングされ、挿入物が存在しない場合はベクタ
ーｐＳＳＴ-ＡＭＹ．０からの３０７ｂｐ領域を増幅する。典型的には、これら
のオリゴヌクレオチドの５’末端の最初の１８ヌクレオチドは、配列プライマー
のアニーリング部位を含んでいた。即ち、空のベクターからのＰＣＲ反応の全生
成物は３４３ｂｐであった。しかしながら、シグナル配列融合ｃＤＮＡは、かな
り長いヌクレオチド配列をもたらした。 ＰＣＲに続いて、反応のアリコート(5μl)を、上掲のSambrook等に記載された
ように1%アガロースゲル中でトリス-ボラート-ＥＤＴＡ(ＴＢＥ)緩衝系を用いた
アガロースゲル電気泳動により試験した。４００ｂｐより大きな単一で強いＰＣ
Ｒ産物をもたらすクローンを、96 Qiaquick PCR 清浄化カラム(Qiagen Inc., Ch
atsworth, CA)での精製の後にＤＮＡ配列によりさらに分析した。
【００９１】 このアミラーゼスクリーニングから単離されたｃＤＮＡ分子を図１-５６２(そ
れぞれ配列番号：１-５６２)に示す。ここで、ヌクレオチド「Ｎ」及び「Ｘ」は
任意のヌクレオチドを示す。これらのｃＤＮＡ分子が得られたｃＤＮＡライブラ
リーは次の通りである： (１) ヒト肝臓組織 図１-１９、１２４及び１３０ (２) ヒト胎盤組織 図２０-７３ (３) ヒト網膜組織 図７４-７５、８１、１０７-１０８、１３９-１４０及び３４０-３４１ (４) ヒト唾液腺組織 図７６-７８ (５) ヒト臍帯静脈内皮細胞 図７９-８０、９７、１１０、２４５-２５２、２５４-２６０、２６３-２
６５、４１３-４２１、４３３-４３７、４４４-４４９、４５４-４５６、４６２
-４６７、４７７-４７８、４８０-４８５、４９２-４９３、５１５及び５４８ (６) ヒト甲状腺組織 図８２-８４、９０-９１、９６、１０９、１４１-１４３及び２６８ (７) ヒト小腸組織 図８５-８６、１４４-１６１及び２６７ (８) ヒト大腸癌腫組織 図８７ (９) ヒト肺内皮細胞 図８８及び９３-９５ (１０)ヒト視床下部組織 図８９ (１１)ヒト乳癌組織 図９２、１１１-１１５、２０６-２１３、２２８-２３２、２６９-２７０
、４５０-４５３、５３４-５４７、５５６及び５５９ (１２)ヒト大動脈内皮細胞 図９８-１０２、１２５-１２９、１３６-１３８、２１６-２１７、２５３
、２６１-２６２、３００-３０１、３２７-３３０、３６５-３６７及び３８５-
３８７ (１３)ヒト子宮組織 図１０３-１０６、１７０-１７３、１７６-１８３、２３３-２３５、２３
８、２４２-２４４、２６６、３１１-３１２及び５５７ (１４)ヒト肺癌組織 図１０６-１０８、２０１-２０５、２２１-２２７、２７１-２７４、３３
４-３３９、３４２-３４８、３５０-３５１、３６０-３６４、３７２、３８８-
４０８、４１１、４３１-４３２、４７９、５５８及び５６０-５６１ (１５)ヒト***上皮細胞 図１１９-１２１、２１４及び３１６-３２０ (１６)ヒト慢性骨髄性白血病組織 図１２２-１２３及び１３１-１３５ (１７)ヒト脊髄組織 図１６２、１６７-１６９、１９８-２００、２３６及び３１５ (１８)ヒト胎児脳組織 図１６３-１６６、１７４-１７５、３３２-３３３、４２２-４３０及び４
９４-５０２ (１９)ヒト胎児肝臓組織 図１８４-１９７、４０９-４１０及び４１２ (２０)ヒト前立腺組織 図２１５、２３７、２３９-２４１及び３４９ (２１)ヒト乳腺組織 図２１８-２２０、２７５-２７６及び３３１ (２２)ヒト腺癌組織 図２７７-２９９及び３０２-３１０ (２３)ヒト胎児小腸組織 図３１３-３１４ (１０)ヒト胎児肺組織 図３２１-３２６ (２５)ヒト精巣組織 図３５２-３５９、３６８-３７１、３７７-３８４、４３８-４４３、４５
７-４６１、４８６-４９１、５１３-５１４、５１６-５２７及び５６２ (２６)ヒトＭＣＦ-７細胞 図３７３-３７６、４６８-４７６、５０３-５１２、５２８-５３３及び５
４９-５５５
【００９２】 実施例２ 全長ｃＤＮＡ分子の同定 オリゴヌクレオチドプローブは、図１ないし５６２に示すものを含む、ここに
開示したＳＲＴポリヌクレオチド配列の何れかから生成することができ、上述の
実施例１のパラグラフ１に記載されたようにして調製されたヒトｃＤＮＡライブ
ラリーのスクリーニングに使用される。クローニングベクターはｐＲＫ５Ｂ(ｐ
ＲＫ５Ｂは、ＳｆｉＩ部位を持たないｐＲＫ５Ｄの前駆体である；Holmes等, Sc
ience, 253:1278-1280 (1991)を参照されたい）であってよく、ｃＤＮＡサイズ
カットは２８００ｂｐ未満であった。１）ＰＣＲにより関心ある配列を含むｃＤ
ＮＡライブラリーを同定するため、及び２）ＳＲＴの全長コード化配列のクロー
ンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドプローブを合
成してよい。正方向及び逆方向ＰＣＲプライマーは一般的に２０から３０ヌクレ
オチドの範囲であり、しばしば約１００−１０００ｂｐ長のＰＣＲ産物を与える
ように設計される。プローブ配列は典型的には４０−５５ｂｐ長である。全長ク
ローンについて幾つかのライブラリーをスクリーニングするために、ライブラリ
ーからのＤＮＡを上掲のAusubel等, Current Protocols in Molecular Biology
に従って、ＰＣＲプライマー対でのＰＣＲ増幅によりスクリーニングしてよい。
ついでポジティブライブラリーを、プローブオリゴヌクレオチド及びプライマー
対の一方を用いた関心ある遺伝子をコードするクローンの単離に使用する。
【００９３】 実施例３ ハイブリダイゼーションプローブとしてのＳＲＴポリペプチドの使用 以下の方法は、ＳＲＴをコードするヌクレオチド配列のハイブリダイゼーショ
ンプローブとしての使用を記載する。 全長又は成熟ＳＲＴのコード配列を含むＤＮＡは、ヒト組織ｃＤＮＡライブラ
リー又はヒト組織ゲノムライブラリーにおける相同性ＤＮＡ類(ＳＲＴの天然に
生じる変異体をコードするものなど)のスクリーニングのためのプローブとして
用いられる。 いずれかのライブラリーＤＮＡを含むフィルターのハイブリダイゼーション及
び洗浄は、以下の高緊縮条件で実施する。放射標識ＳＲＴ誘導プローブのフィル
ターへのハイブリダイゼーションは、50%ホルムアミド、5xＳＳＣ、0.1%ＳＤＳ
、0.1%ピロリン酸ナトリウム、50mMリン酸ナトリウム、pH6.8、2xデンハート液
、及び10%デキストラン硫酸の溶液中で、42℃において20時間行う。フィルター
の洗浄は、0.1xＳＳＣ及び0.1%ＳＤＳの水溶液中、42℃で行う。 ついで、全長天然配列ＳＲＴをコードするＤＮＡと所望の配列同一性を有する
ＤＮＡは、この分野で知られた標準的な方法を用いて同定できる。
【００９４】 実施例４ 大腸菌におけるＳＲＴの発現 この実施例は、大腸菌における組み換え発現によるＳＲＴの非グリコシル化形
態の調製を例示する。 ＳＲＴをコードするＤＮＡ配列は、選択されたＰＣＲプライマーを用いて最初
に増幅する。プライマーは、選択された発現ベクターの制限酵素部位に対応する
制限酵素部位を持たなければならない。種々の発現ベクターを用いることができ
る。好適なベクターの例は、ｐＢＲ３２２(大腸菌から誘導されたもの；Bolivar
等, Gene, 2:95 (1977)を参照)であり、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性
についての遺伝子を含む。ベクターは、制限酵素で消化され、脱リン酸化される
。ＰＣＲ増幅した配列は、ついで、ベクターに結合させる。ベクターは、好まし
くは抗生物質耐性遺伝子、ｔｒｐプロモーター、ｐｏｌｙｈｉｓリーダー(最初
の６つのＳＴＩＩコドン、ｐｏｌｙｈｉｓ配列、及びエンテロキナーゼ切断部位
を含む)、ＳＲＴコード化領域、ラムダ転写終結区、及びａｒｇＵ遺伝子を含む
。 ライゲーション混合物は、ついで、上掲のSambrook等に記載された方法を用い
た選択した大腸菌株の形質転換に使用される。形質転換体は、それらのＬＢプレ
ートで成長する能力により同定され、ついで抗生物質耐性クローンが選択される
。プラスミドＤＮＡが単離され、制限分析及びＤＮＡ配列分析で確認される。 選択されたクローンは、抗生物質を添加したＬＢブロスなどの液体培地で終夜
成長させることができる。終夜培養は、続いて大規模培養の播種に用いられる。
次に細胞を最適光学密度まで成長させ、その間に発現プロモーターが作動する。 更に数時間の細胞培養の後、細胞は遠心分離により採集することができる。遠
心分離で得られた細胞ペレットは、この分野で知られた種々の薬剤を用いて可溶
化され、ついで可溶化ＳＲＴタンパク質を金属キレート化カラムを用いてタンパ
ク質を緊密に結合させる条件下で精製することができる。 以下の手法を用いて、大腸菌においてポリＨｉｓタグ形態でＳＲＴを発現させ
てもよい。ＳＲＴをコードするＤＮＡを選択したＰＣＲプライマーを用いて最初
に増幅する。プライマーは、選択された発現ベクターの制限酵素部位に対応する
制限酵素部位、及び効率的で信頼性のある翻訳開始、金属キレートカラムでの迅
速な精製、及びエンテロキナーゼでのタンパク質分解的除去を与える他の有用な
配列を含む。ついでＰＣＲ増幅された、ポリ-Ｈｉｓタグ配列を発現ベクターに
結合させ、それを株５２(W3110 fuhA(tonA) lon galE rpoHts(htpRts) clpP(lac
Iq))に基づく大腸菌宿主の形質転換に使用した。形質転換体は、最初に50mg/ml
のカルベニシリンを含有するＬＢ中、30℃で振盪しながら3-5のＯ．Ｄ．６００
に達するまで成長させる。ついで培養をＣＲＡＰ培地(3.57gの(ＮＨ４)２ＳＯ４ 、0.71gのクエン酸ナトリウム・2H2O、1.07gのＫＣｌ、5.36gのDifco酵母抽出物
、500mL水中の5.36gのShefield hycase SF、並びに110mMのＭＰＯＳ、pH7.3、0.
55%(w/v)のグルコース及び７ｍMのＭｇＳＯ４の混合で調製)中に50-100倍希釈し
、30℃で振盪させながら約20-30時間成長させる。試料を取り出してＳＤＳ-ＰＡ
ＧＥ分析により発現を確認し、バルク培養を遠心分離して細胞をペレット化する
。細胞ペレットを精製及び再折りたたみまで凍結させる。
【００９５】 0.5から1Lの発酵(6-10gペレット)からの大腸菌ペーストを、7Mのグアニジン、
20mMのトリス、pH8バッファー中で10容量(w/v)で再懸濁させる。固体硫酸ナトリ
ウム及びテトラチオン酸ナトリウムを添加して最終濃度を各々0.1M及び0.02Mと
し、溶液を4℃で終夜撹拌する。この工程により、亜硫酸化によりブロックされ
た全てのシステイン残基を持つ変性タンパク質がもたらされる。溶液をBeckman
Ultracentrifuge中で40,000rpmで30分間遠心分離する。上清を金属キレートカラ
ムバッファー(6Mのグアニジン、20mMのトリス、pH7.4)の3-5容量で希釈し、0.22
ミクロンフィルターを通して濾過して透明化する。透明化抽出物を、金属キレー
トカラムバッファーで平衡化させた5mlのQiagen Ni-NTA金属キレートカラムに充
填した。カラムを50mMのイミダゾール(Calbiochem, Utrol grade)を含む添加バ
ッファー、pH7.4で洗浄する。タンパク質を250mMのイミダゾールを含有するバッ
ファーで溶離する。所望のタンパク質を含有する画分をプールし、4℃で保存す
る。タンパク質濃度は、そのアミノ酸配列に基づいて計算した吸光係数を用いて
280nmにおけるその吸収により見積もる。 試料を、20mMのトリス、pH8.6、0.3MのＮａＣｌ、2.5Mの尿素、5ｍＭのシステ
イン、20mMのグリシン及び1mMのＥＤＴＡからなる新たに調製した再折りたたみ
バッファー中に徐々に希釈することによりタンパク質を再折りたたみさせる。リ
フォールディング容量は、最終的なタンパク質濃度が50〜100マイクログラム/ml
となるように選択する。リフォールディング溶液を4℃で12-36時間ゆっくり撹拌
する。リフォールディング反応はＴＦＡを最終濃度0.4%(約３のｐＨ)で添加する
ことにより停止させる。タンパク質をさらに精製する前に、溶液を0.22ミクロン
フィルターを通して濾過し、アセトニトリルを最終濃度2-10%になるまで添加す
る。再折りたたみされたタンパク質を、Poros R1/H逆相カラムで、0.1%ＴＦＡの
移動バッファーと10〜80%のアセトニトリル勾配での溶離を用いてクロマトグラ
フにかける。A280吸収を持つ画分のアリコートをＳＤＳポリアクリルアミドゲル
で分析し、相同な再折りたたみされたタンパク質を含有する画分をプールする。
一般的に、殆どのタンパク質の正しく再折りたたみされた種は、これらの種が最
もコンパクトであり、その疎水性内面が逆相樹脂との相互作用から遮蔽されてい
るので、アセトニトリルの最低濃度で溶離される。凝集した種は通常、より高い
アセトニトリル濃度で溶離される。タンパク質の誤って折りたたまれた形態を所
望の形態から除くのに加えて、逆相工程は試料からエンドトキシンも除去する。 所望の折りたたまれたＳＲＴポリペプチドを含有する画分をプールし、溶液に
向けた窒素の弱い気流を用いてアセトニトリルを除去した。タンパク質を、透析
又は調製バッファーで平衡化したG25 Superfine(Pharmacia)樹脂でのゲル濾過及
び滅菌濾過により、0.14Mの塩化ナトリウム及び4%のマンニトールを含む20mMの
Ｈｅｐｅｓ、pH6.8に処方する。
【００９６】 実施例５ 哺乳動物細胞でのＳＲＴの発現 この実施例は、哺乳動物細胞における組み換え発現による潜在的にグリコシル
化した形態のＳＲＴの調製を例示する。 発現ベクターとしてベクターｐＲＫ５(1989年3月15日公開のEP 307,247参照)
を用いる。場合によっては、ＳＲＴ ＤＮＡを選択した制限酵素を持つｐＲＫ５
に結合させ、上掲のSambrook等に記載されたようなライゲーション方法を用いて
ＳＲＴ ＤＮＡを挿入させることができる。得られたベクターは、ｐＲＫ５-ＳＲ
Ｔと呼ばれる。 一実施態様では、選択された宿主細胞は２９３細胞とすることができる。ヒト
２９３細胞(ATCC CCL 1573)は、ウシ胎児血清及び場合によっては滋養成分及び
／又は抗生物質を添加したＤＭＥＭなどの培地中で組織培養プレートにおいて成
長させて集密化する。約10μｇのｐＲＫ５-ＳＲＴ ＤＮＡを約1μgのＶＡ ＲＮ
Ａ遺伝子コード化ＤＮＡ［Thimmappaya等, Cell, 31:543 (1982))］と混合し、5
00μlの1mMトリス-ＨＣｌ、0.1mMＥＤＴＡ、0.227MＣａＣｌ２に溶解させる。こ
の混合物に、滴状の、500μlの50mMＨＥＰＥＳ(pH7.35)、280mMのＮａＣｌ、1.5
mMのＮａＰＯ４を添加し、25℃で10分間析出物を形成させる。析出物を懸濁し、
２９３細胞に加えて37℃で約4時間定着させる。培地を吸引し、ＰＢＳ中2mlの20
%グリセロールを30秒間添加する。２９３細胞をついで無血清培地で洗浄し、新
鮮な培地を添加し、細胞を約5日間インキュベートする。 形質移入の約24時間後、培地を除去し、培地(のみ)又は200μCi/ml３５Ｓ-シ
ステイン及び200μCi/ml３５Ｓ-メチオニンを含む培地で置換する。12時間のイ
ンキュベーションの後、条件培地を回収し、スピンフィルターで濃縮し、15%Ｓ
ＤＳゲルに添加する。処理したゲルを乾燥させ、ＳＲＴポリペプチドの存在を現
す選択された時間にわたってフィルムにさらす。形質転換した細胞を含む培地に
、更なるインキュベーションを施し(無血清培地で)、培地を選択されたバイオア
ッセイで試験する。 これに換わる技術において、ＳＲＴは、Somparyac等, Proc. Natl. Acad. Sci
., 12:7575 (1981)に記載されたデキストラン硫酸法を用いて２９３細胞に一過
的に導入される。２９３細胞をスピナーフラスコ内で最大密度まで成長させ、70
0μｇのｐＲＫ５-ＳＲＴ ＤＮＡを添加する。細胞を、まずスピナーフラスコか
ら遠心分離によって濃縮し、ＰＢＳで洗浄する。ＤＮＡ-デキストラン沈殿物を
細胞ペレット上で4時間インキュベートする。細胞を20%グリセロールで90秒間処
理し、組織培地で洗浄し、組織培地、5μg/mlウシインシュリン及び0.1μg/mlウ
シトランスフェリンを含むスピナーフラスコに再度導入する。約4日後に、条件
培地を遠心分離して濾過し、細胞及び細胞片を除去する。ついで発現されたＳＲ
Ｔを含む試料を濃縮し、透析及び／又はカラムクロマトグラフィー等の任意の選
択した方法によって精製する。
【００９７】 他の実施態様では、ＳＲＴをＣＨＯ細胞で発現させることができる。ｐＲＫ５
-ＳＲＴは、ＣａＰＯ４又はＤＥＡＥ-デキストランなどの公知の試薬を用いてＣ
ＨＯ細胞に形質移入することができる。上記したように、細胞培地をインキュベ
ートし、培地を培養培地(のみ)又は３５Ｓ-メチオニン等の放射性標識を含む培
地に置換することができる。ＳＲＴポリペプチドの存在を同定した後、培地を無
血清培地に置換してもよい。好ましくは、培地を約６日間インキュベートし、つ
いで条件培地を収集する。ついで、発現されたＳＲＴを含む培地を濃縮して、任
意の選択した方法によって精製することができる。 また、エピトープタグＳＲＴは、宿主ＣＨＯ細胞において発現させてもよい。
ＳＲＴはｐＲＫ５ベクターからサブクローニングしてもよい。サブクローン挿入
物は、ＰＣＲを施してバキュロウイルス発現ベクター中のポリ-ｈｉｓタグ等の
選択されたエピトープタグを持つ枠に融合できる。ポリ-ｈｉｓタグＳＲＴ挿入
物は、ついで、安定なクローンの選択のためのＤＨＦＲ等の選択マーカーを含む
ＳＶ４０誘導ベクターにサブクローニングできる。最後に、ＣＨＯ細胞をＳＶ４
０誘導ベクターで(上記のように)形質移入することができる。発現を確認するた
めに、上記のように標識化を行ってもよい。発現されたポリ-ＨｉｓタグＳＲＴ
を含む培地は、ついで濃縮し、Ｎｉ２＋-キレートアフィニティクロマトグラフ
ィー等の選択された方法により精製できる。 またＳＲＴは、一過性発現法によりＣＨＯ及び／又はＣＯＳ細胞で、他の安定
な発現方法によりＣＨＯ細胞で発現させてもよい。
【００９８】 ＣＨＯ細胞における安定な発現は以下の方法を用いて実施される。タンパク質
は、それぞれのタンパク質の可溶化形態のコード配列(例えば、細胞外ドメイン)
がヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ２ドメインを含むＩｇＧ１定常領域配列に融合したＩ
ｇＧ作成物(イムノアドヘシン)、及び／又はポリ-Ｈｉｓタグ形態として発現さ
れる。 ＰＣＲ増幅に続いて、それぞれのＤＮＡを、Ausubel等, Current Protocols o
f Molecular Biology, Unit 3.16, John Wiley and Sons (1997)に記載されたよ
うな標準的技術を用いてＣＨＯ発現ベクターにサブクローニングする。ＣＨＯ発
現ベクターは、関心あるＤＮＡの５’及び３’に適合する制限部位を有し、ｃＤ
ＮＡの便利なシャトル化ができるように作成される。ベクターは、Lucas等, Nuc
l. Acids res. 24: 9, 1774-1779 (1996)に記載されたようにＣＨＯ細胞での発
現を用い、関心あるｃＤＮＡ及びジヒドロフォレートレダクターゼ(ＤＨＦＲ)の
発現の制御にＳＶ４０初期プロモーター／エンハンサーを用いる。ＤＨＦＲ発現
は、形質移入に続くプラスミドの安定な維持のための選択を可能にする。 所望のプラスミドＤＮＡの12マイクログラムを、市販の形質移入試薬Superfec
t(登録商標)(Quiagen), Dosper(登録商標)及びFugene(登録商標)(Boehringer Ma
nnheim)を使用し約一千万のＣＨＯ細胞に導入する。細胞は、上掲のLucas等に記
載されているように成長させる。約3x10−７細胞を、下記のような更なる成長及
び生産のためにアンプル中で凍結させる。 プラスミドＤＮＡを含むアンプルを水槽に配して解凍し、ボルテックスにより
混合する。内容物を10mLの媒質を含む遠心管にピペットして、1000rpmで５分間
遠心分離する。上清を吸引して細胞を10mLの選択培地(0.2μm濾過ＰＳ２０、5%
の0.2μm透析濾過ウシ胎児血清)中に再懸濁させる。ついで細胞を90mLの選択培
地を含む100mLスピナーに分ける。1-2日後、細胞を150mLの選択培地を満たした2
50mLスピナーに移し、37℃でインキュベートする。さらに2-3日後、250mL、500m
L及び2000mLのスピナーを3x10５細胞/mLで播種する。細胞培地を遠心分離により
新鮮培地に交換し、生産培地に再懸濁させる。任意の適切なＣＨＯ培地を用いて
もよいが、実際には1992年6月16日に発行された米国特許第5,122,469号に記載さ
れた生産培地を使用した。3Lの生産スピナーを1.2ｘ106細胞/mLで播種する。0日
目に、細胞数とｐＨを測定する。1日目に、スピナーをサンプルし、濾過空気で
の散布を実施した。2日目に、スピナーをサンプルし、温度を33℃に変え、30mL
の500g/Lのグルコース及び0.6mLの10%消泡剤(例えば35%ポリジメチルシロキサン
エマルション、Dow Corning 365 Medical Grade Emulsion)を取る。生産を通し
て、ｐＨを7.2近傍に調節し維持する。10日後、又は生存率が70%を下回るまで、
細胞培地を遠心分離で回収して0.22μmフィルターを通して濾過する。濾過物を4
℃で貯蔵するか、即座に精製用カラムに充填した。
【００９９】 ポリ-Ｈｉｓタグ作成物について、タンパク質をNi-NTAカラム(Qiagen)を用い
て精製する。精製の前に、イミダゾールを条件培地に5mMの濃度まで添加する。
条件培地を、0.3MのＮａＣｌ及び5mMイミダゾールを含む20mMのＨｅｐｅｓ, pH7
.4バッファーで平衡化した6mlのNi-NTAカラムに4-5ml/分の流速で4℃においてポ
ンプ供給する。充填後、カラムをさらに平衡バッファーで洗浄し、タンパク質を
0.25Mイミダゾールを含む平衡バッファーで溶離する。高度に精製されたタンパ
ク質を、続いて10mMのＨｅｐｅｓ、0.14MのＮａＣｌ及び4%のマンニトール、pH6
.8を含む貯蔵バッファー中で25mlのG25 Superfine(Pharmacia)を用いて脱塩し、
-80℃で貯蔵する。 イムノアドヘシン(Ｆｃ含有)作成物を以下のようにして条件培地から精製する
。条件培地を、20mMのリン酸ナトリウムバッファー, pH6.8で平衡化した5mlのプ
ロテインＡカラム(Pharmacia)に汲み上げる。充填後、100mMのクエン酸, pH3.5
で溶離する前に、カラムを平衡バッファーで強く洗浄する。溶離したタンパク質
を、1mlの画分を275μlの1Mトリスバッファー, pH9を含む管に回収することによ
り即座に中性化する。高度に精製されたタンパク質を、続いてポリ-Ｈｉｓタグ
タンパク質について上記した貯蔵バッファー中で脱塩する。均一性はＳＤＳポリ
アクリルアミドゲルとエドマン(Edman)分解によるＮ-末端アミノ酸配列決定によ
り評価する。
【０１００】 実施例６ 酵母菌でのＳＲＴの発現 以下の方法は、酵母菌中でのＳＲＴの組換え発現を記載する。 第１に、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターからのＳＲＴの細胞内生産又は分
泌のための酵母菌発現ベクターを作成する。ＳＲＴをコードするＤＮＡ及びプロ
モーターを選択したプラスミドの適当な制限酵素部位に挿入してＳＲＴの細胞内
発現を指示する。分泌のために、ＳＲＴをコードするＤＮＡを選択したプラスミ
ドに、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターをコードするＤＮＡ、天然ＳＲＴシグ
ナルペプチド又は他の哺乳動物シグナルペプチド、又は、例えば酵母菌α因子又
はインベルターゼ分泌シグナル／リーダー配列、及び(必要ならば)ＳＲＴの発現
のためのリンカー配列とともにクローニングすることができる。 酵母菌株ＡＢ１１０等の酵母菌は、ついで上記の発現プラスミドで形質転換し
、選択された発酵培地中で培養できる。形質転換した酵母菌上清は、10%トリク
ロロ酢酸での沈降及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離で分析し、ついでクマシーブ
ルー染色でゲルの染色をすることができる。 続いて組換えＳＲＴは、発酵培地から遠心分離により酵母菌細胞を除去し、つ
いで選択されたカートリッジフィルターを用いて培地を濃縮することによって単
離及び精製できる。ＳＲＴを含む濃縮物は、選択されたカラムクロマトグラフィ
ー樹脂を用いてさらに精製してもよい。
【０１０１】 実施例７ バキュロウイルス感染昆虫細胞でのＳＲＴの発現 以下の方法は、バキュロウイルス感染昆虫細胞中におけるＳＲＴの組換え発現
を記載する。 ＳＲＴコードする配列を、バキュロウイルス発現ベクターに含まれるエピトー
プタグの上流に融合させる。このようなエピトープタグは、ポリ-ｈｉｓタグ及
び免疫グロブリンタグ(ＩｇＧのＦｃ領域など)を含む。ｐＶＬ１３９３(Navogen
)などの市販されているプラスミドから誘導されるプラスミドを含む種々のプラ
スミドを用いることができる。簡単には、ＳＲＴコード化配列又はＳＲＴコード
配列の所望の部分、例えば膜貫通タンパク質の細胞外ドメインをコードする配列
又はタンパク質が細胞外である場合の成熟タンパク質をコードする配列などが、
５’及び３’領域に相補的なプライマーでのＰＣＲにより増幅される。５’プラ
イマーは、隣接する(選択された)制限酵素部位を包含していてもよい。生産物は
、ついで、選択された制限酵素で消化され、発現ベクターにサブクローニングさ
れる。 組換えバキュロウイルスは、上記のプラスミド及びBaculoGoldＴＭウイルスＤ
ＮＡ(Pharmingen)を、Spodoptera frugiperda(「Ｓｆ９」)細胞(ATCC CRL 1711)
中にリポフェクチン(GIBCO-BRLから市販)を用いて同時形質移入することにより
作成される。28℃で4-5日インキュベートした後、放出されたウイルスを回収し
、更なる増幅に用いた。ウイルス感染及びタンパク質発現は、O'Reilley等, Bac
ulovirus expression vectors: A laboratory Manual, Oxford: Oxford Univers
ity Press (1994)に記載されているように実施する。 次に、発現されたポリ-ｈｉｓタグＳＲＴを、例えばＮｉ２＋−キレートアフ
ィニティクロマトグラフィーにより次のように精製する。抽出は、Rupert等, Na
ture, 362:175-179 (1993)に記載されているように、ウイルス感染した組み換え
Ｓｆ９細胞から調製する。簡単には、Ｓｆ９細胞を洗浄し、超音波処理用バッフ
ァー(25mMのＨｅｐｅｓ、pH7.9；12.5mMのＭｇＣｌ２；0.1mM ＥＤＴＡ；10%グ
リセロール；0.1%のＮＰ-４０；0.4MのＫＣｌ)中に再懸濁し、氷上で2回20秒間
超音波処理する。超音波処理物を遠心分離で透明化し、上清を負荷バッファー(5
0mMリン酸塩、300mMのＮａＣｌ、10%グリセロール、pH7.8)で50倍希釈し、0.45
μmフィルターで濾過する。Ｎｉ２＋-ＮＴＡアガロースカラム(Qiagenから市販)
を5mLの総容積で調製し、25mLの水で洗浄し、25mLの負荷バッファーで平衡させ
る。濾過した細胞抽出物は、毎分0.5mLでカラムに負荷する。カラムを、分画回
収が始まる点であるＡ２８０のベースラインまで負荷バッファーで洗浄する。次
に、カラムを、結合タンパク質を非特異的に溶離する二次洗浄バッファー(50mM
リン酸塩；300mMのＮａＣｌ、10%グリセロール、pH6.0)で洗浄する。Ａ２８０の
ベースラインに再度到達した後、カラムを二次洗浄バッファー中で0から500mMイ
ミダゾール勾配で展開する。1mLの分画を回収し、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ及び銀染色又
はアルカリホスファターゼ(Qiagen)に結合したＮｉ２＋-ＮＴＡでのウェスタン
ブロットで分析する。溶離したＨｉｓ１０−タグＳＲＴを含む画分をプールして
負荷バッファーで透析する。 あるいは、ＩｇＧタグ(又はＦｃタグ)ＳＲＴの精製は、例えば、プロテインＡ
又はプロテインＧカラムクロマトグラフィーを含む公知のクロマトグラフィー技
術を用いて実施できる。
【０１０２】 実施例８ ＳＲＴに結合する抗体の調製 この実施例は、ＳＲＴに特異的に結合できるモノクローナル抗体の調製を例示
する。 モノクローナル抗体の生産のための技術はこの分野で知られており、例えば、
上掲のGodingに記載されている。用いられ得る免疫原は、精製ＳＲＴ、ＳＲＴを
含む融合タンパク質、及び細胞表面に組換えＳＲＴを発現する細胞を含む。免疫
原の選択は当業者が過度の実験をすることなくなすことができる。 Ｂａｌｂ／ｃ等のマウスを、完全フロイントアジュバントに乳化して皮下又は
腹腔内に1-100マイクログラムで注入したＳＲＴ免疫原で免疫化する。あるいは
、免疫原をＭＰＬ-ＴＤＭアジュバント(Ribi Immunochemical Researh, Hamilto
n, MT)に乳化し、動物の後足蹠に注入してもよい。免疫化したマウスは、ついで
10から12日後に、選択したアジュバント中に乳化した付加的免疫源で追加免疫す
る。その後、数週間、マウスをさらなる免疫化注射で追加免疫する。抗-ＳＲＴ
抗体の検出のためのエライザアッセイで試験するために、レトロオービタル出血
からの血清試料をマウスから周期的に採取してもよい。 適当な抗体力価が検出された後、抗体に「ポジティブ(陽性)」な動物に、ＳＲ
Ｔ静脈内注射の最後の注入をすることができる。3から4日後、マウスを屠殺し、
脾臓細胞を取り出す。ついで脾臓細胞を(35%ポリエチレングリコールを用いて)
、ＡＴＣＣから番号ＣＲＬ１５９７で入手可能なＰ３Ｘ６３ＡｇＵ．１等の選択
されたマウス骨髄腫株化細胞に融合させる。融合によりハイブリドーマ細胞が生
成され、ついで、ＨＡＴ(ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン)培地
を含む96ウェル組織培養プレートに蒔き、非融合細胞、骨髄腫ハイブリッド、及
び脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害する。 ハイブリドーマ細胞は、ＳＲＴに対する反応性についてのエライザでスクリー
ニングされる。ＳＲＴに対する所望のモノクローナル抗体を分泌する「ポジティ
ブ(陽性)」ハイブリドーマ細胞の決定は、技術常識の範囲内である。 陽性ハイブリドーマ細胞を同系のＢａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注入し、抗-Ｓ
ＲＴモノクローナル抗体を含む腹水を生成させる。あるいは、ハイブリドーマ細
胞を、組織培養フラスコ又はローラーボトルで成長させることもできる。腹水中
に生成されたモノクローナル抗体の精製は、硫酸アンモニウム沈降、それに続く
ゲル排除クロマトグラフィーを用いて行うことができる。あるいは、抗体のプロ
テインＡ又はプロテインＧへの結合に基づくアフィニティクロマトグラフィーを
用いることもできる。
【０１０３】 実施例９ 特異的抗体を用いたＳＲＴポリペプチドの精製 天然又は組換えＳＲＴポリペプチドは、この分野の種々のタンパク質精製方法
の標準的な技術によって精製できる。例えば、プロ-ＳＲＴポリペプチド、成熟
ポリペプチド、又はプレ-ＳＲＴポリペプチドは、関心あるＳＲＴポリペプチド
に特異的な抗体を用いた免疫親和性クロマトグラフィーによって精製される。一
般に、免疫親和性カラムは抗-ＳＲＴポリペプチド抗体を活性化クロマトグラフ
ィー樹脂に共有結合させて作成される。 ポリクローナル免疫グロブリンは、硫酸アンモニウムでの沈殿又は固定化プロ
テインＡ(Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, N.J.)での精製のいずれ
かにより免疫血清から調製される。同様に、モノクローナル抗体は、硫酸アンモ
ニウム沈殿又は固定化プロテインＡでのクロマトグラフィーによりマウス腹水液
から調製される。部分的に精製された免疫グロブリンは、ＣｎＢｒ-活性化セフ
ァロースTM(Pharmacia LKB Biotechnology)等のクロマトグラフィー樹脂に共有
結合される。抗体が樹脂に結合され、樹脂がブロックされ、誘導体樹脂は製造者
の指示に従って洗浄される。 このような免疫親和性カラムは、可溶化形態のＳＲＴポリペプチドを含有する
細胞からの画分を調製することによるＳＲＴポリペプチドの精製において利用さ
れる。この調製物は、洗浄剤の添加又はこの分野で公知の方法により微分遠心分
離を介して得られる全細胞又は細胞成分画分の可溶化により誘導される。あるい
は、シグナル配列を含む可溶化ＳＲＴポリペプチドは、細胞が成長する培地中に
有用な量で分泌される。 可溶化ＳＲＴポリペプチド含有調製物は、免疫親和性カラムを通され、カラム
はＳＲＴポリペプチドの好ましい吸着をさせる条件下(例えば、洗浄剤存在下の
高イオン強度バッファー)で洗浄される。ついで、カラムは、抗体／ＳＲＴポリ
ペプチド結合を分解する条件下(例えば、約2-3といった低ｐＨバッファー、又は
高濃度の尿素又はチオシアン酸イオン等のカオトロープ)で溶離され、ＳＲＴポ
リペプチドが回収される。
【０１０４】 実施例１０ 薬物スクリーニング 本発明は、ＳＲＴポリペプチド又はその結合断片を種々の薬物スクリーニング
技術において使用することによる化合物のスクリーニングに特に有用である。そ
のような試験に用いられるＳＲＴポリペプチド又は断片は、溶液中の遊離状態で
も、固体支持体に固定されても、細胞表面に担持されていても、又は細胞内に位
置していてもよい。薬剤スクリーニングの１つの方法は、ＳＲＴポリペプチド又
は断片を発現する組換え核酸で安定に形質移入される真核生物又は原核生物宿主
細胞を利用する。薬剤は、そのような形質移入細胞に対して、競合的結合アッセ
イにおいてスクリーニングされる。そのような細胞は、生存可能又は固定化形態
のいずれかにおいて、標準的な結合アッセイに使用できる。例えば、ＳＲＴポリ
ペプチド又は断片と試験される試薬の間での複合体の形成を測定してよい。ある
いは、試験する試薬によって生ずるＳＲＴポリペプチドとその標的細胞又は標的
レセプターとの間の複合体形成における減少を試験することもできる。 しかして、本発明は、ＳＲＴポリペプチド関連疾患又は疾病に影響を与えうる
薬剤又は任意の他の試薬のスクリーニング方法を提供する。これらの方法は、そ
の試薬をＳＲＴポリペプチド又は断片に接触させ、(ｉ)試薬とＳＲＴポリペプチ
ド又は断片との間の複合体の存在について、又は(ｉｉ)ＳＲＴポリペプチド又は
断片と細胞との間の複合体の存在について、当該技術でよく知られた方法でアッ
セイすることを含む。これらの競合結合アッセイでは、ＳＲＴポリペプチド又は
断片が典型的には標識される。適切なインキュベーションの後、自由なＳＲＴポ
リペプチド又は断片を結合形態のものから分離し、自由又は未複合の標識の量が
、特定の試薬がＳＲＴポリペプチドに結合する又はＳＲＴポリペプチド／細胞複
合体を阻害する能力の尺度となる。 薬剤スクリーニングのための他の技術は、ポリペプチドに対して適当な結合親
和性を持つ化合物についての高スループットスクリーニングを提供し、1984年9
月13日に公開されたWO 84/03564に詳細に記載されている。簡単に述べれば、多
数の異なる小型ペプチド試験化合物が、プラスチックピン等の固体支持体又は幾
つかの他の表面上で合成される。ＳＲＴポリペプチドに適用すると、ペプチド試
験化合物はＳＲＴポリペプチドと反応して洗浄される。結合したＳＲＴポリペプ
チドはこの分野で良く知られた方法により検出される。精製したＳＲＴポリペプ
チドは、上記の薬剤スクリーニング技術に使用するためにプレート上に直接被覆
することもできる。さらに、非中和抗体は、ペプチドを捕捉し、それを固体支持
体上に固定化するのに使用できる。 また、本発明は、ＳＲＴポリペプチドに結合可能な中和抗体がＳＲＴポリペプ
チド又はその断片について試験化合物と特異的に競合する競合薬剤スクリーニン
グアッセイの使用も考慮する。この方法において、抗体は、ＳＲＴポリペプチド
で、一又は複数の抗原決定基を持つ任意のペプチドの存在を検出するのに使用で
きる。
【０１０５】 実施例１１ 合理的薬物設計 合理的薬物設計の目的は、関心ある生物学的活性ポリペプチド(例えば、ＳＲ
Ｔポリペプチド)又はそれらが相互作用する小分子、例えばアゴニスト、アンタ
ゴニスト、又はインヒビターの構造的類似物を製造することである。これらの例
の任意のものが、ＳＲＴポリペプチドのより活性で安定な形態又はインビボでＳ
ＲＴポリペプチドの機能を向上又は阻害する薬物の創作に使用できる(参考、Hod
gson, Bio/Technology, 9: 19-21 (1991))。 １つの方法において、ＳＲＴポリペプチド、又はＳＲＴポリペプチド-インヒ
ビター複合体の三次元構造が、ｘ線結晶学により、コンピュータモデル化により
、最も典型的には２つの方法の組み合わせにより決定される。分子の構造を解明
し活性部位を決定するためには、ＳＲＴポリペプチドの形状及び電荷の両方が確
認されなければならない。数は少ないが、ＳＲＴポリペプチドの構造に関する有
用な情報が相同タンパク質の構造に基づいたモデル化によって得られることもあ
る。両方の場合において、関連する構造情報は、類似ＳＲＴポリペプチド様分子
の設計又は効果的なインヒビターの同定に使用される。合理的な薬剤設計の有用
な例は、Braxton及びWells, Biochemistry, 31: 7796-7801 (1992)に示されてい
るような向上した活性又は安定性を持つ分子、又はAthauda等, J. Biochem., 11
3: 742-746 (1993)に示されているような天然ペプチドのインヒビター、アゴニ
スト、又はアンタゴニストとして作用する分子を含む。 また、上記のような機能アッセイによって選択された標的特異的な抗体を単離
しその結晶構造を解明することもできる。この方法は、原理的には、それに続く
薬剤設計が基礎をおくことのできるファーマコア(pharmacore)を生成する。機能
的な薬理学的に活性な抗体に対する抗-イディオタイプ抗体(抗-ids)を生成する
ことにより、タンパク質結晶学をバイパスすることができる。鏡像の鏡像として
、抗-idsの結合部位は最初のレセプターの類似物であると予測できる。抗-idは
、ついで、化学的又は生物学的に製造したペプチドのバンクからペプチドを同定
及び単離するのに使用できる。単離されたペプチドは、ファーマコアとして機能
するであろう。 本発明により、十分な量のＳＲＴポリペプチドがＸ線結晶学などの分析実験を
実施するために入手可能である。さらに、ここに提供したＳＲＴポリペプチドア
ミノ酸配列の知識は、ｘ線結晶学に換える、又はそれに加えるコンピュータモデ
ル化技術で用いられる指針を提供する。
【０１０６】 上記の文書による明細書は、当業者に本発明を実施できるようにするために十
分であると考えられる。寄託した態様は、本発明のある側面の一つの説明として
意図されており、機能的に等価なあらゆる作成物がこの発明の範囲内にあるため
、寄託された作成物により、本発明の範囲が限定されるものではない。ここでの
物質の寄託は、ここに記載の文書による説明が、そのベストモードを含む、本発
明の任意の側面の実施を可能にするために不十分であることを認めるものではな
いし、それが表す特定の例証に対して請求の範囲を制限するものと解釈されるも
のでもない。実際、ここに示し記載したものに加えて、本発明を様々に改変する
ことは、前記の記載から当業者にとっては明らかなものであり、添付の請求の範
囲内に入るものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ここでＤＮＡ８２８４と称するヌクレオチド配列(配列番号：１)
を示す。
【図２】 ここでＤＮＡ８３２８と称するヌクレオチド配列(配列番号：２)
を示す。
【図３】 ここでＤＮＡ８３５０と称するヌクレオチド配列(配列番号：３)
を示す。
【図４】 ここでＤＮＡ８３６９と称するヌクレオチド配列(配列番号：４)
を示す。
【図５】 ここでＤＮＡ８３７７と称するヌクレオチド配列(配列番号：５)
を示す。
【図６】 ここでＤＮＡ８４５６と称するヌクレオチド配列(配列番号：６)
を示す。
【図７】 ここでＤＮＡ８５５５と称するヌクレオチド配列(配列番号：７)
を示す。
【図８】 ここでＤＮＡ８５７６と称するヌクレオチド配列(配列番号：８)
を示す。
【図９】 ここでＤＮＡ９３８３と称するヌクレオチド配列(配列番号：９)
を示す。
【図１０】 ここでＤＮＡ９８４０と称するヌクレオチド配列(配列番号：
１０)を示す。
【図１１】 ここでＤＮＡ１００２８と称するヌクレオチド配列(配列番号
：１１)を示す。
【図１２】 ここでＤＮＡ１００７２と称するヌクレオチド配列(配列番号
：１２)を示す。
【図１３】 ここでＤＮＡ１０２４２と称するヌクレオチド配列(配列番号
：１３)を示す。
【図１４】 ここでＤＮＡ１０２８１と称するヌクレオチド配列(配列番号
：１４)を示す。
【図１５】 ここでＤＮＡ１２６２８と称するヌクレオチド配列(配列番号
：１５)を示す。
【図１６】 ここでＤＮＡ１２６４６と称するヌクレオチド配列(配列番号
：１６)を示す。
【図１７】 ここでＤＮＡ１２６５５と称するヌクレオチド配列(配列番号
：１７)を示す。
【図１８】 ここでＤＮＡ１２６６０と称するヌクレオチド配列(配列番号
：１８)を示す。
【図１９】 ここでＤＮＡ１２６６８と称するヌクレオチド配列(配列番号
：１９)を示す。
【図２０】 ここでＤＮＡ１２７２６と称するヌクレオチド配列(配列番号
：２０)を示す。
【図２１】 ここでＤＮＡ１２７２８と称するヌクレオチド配列(配列番号
：２１)を示す。
【図２２】 ここでＤＮＡ１２７２９と称するヌクレオチド配列(配列番号
：２２)を示す。
【図２３】 ここでＤＮＡ１２７３２と称するヌクレオチド配列(配列番号
：２３)を示す。
【図２４】 ここでＤＮＡ１２７３３と称するヌクレオチド配列(配列番号
：２４)を示す。
【図２５】 ここでＤＮＡ１２７４１と称するヌクレオチド配列(配列番号
：２５)を示す。
【図２６】 ここでＤＮＡ１２７４２と称するヌクレオチド配列(配列番号
：２６)を示す。
【図２７】 ここでＤＮＡ１２７４７と称するヌクレオチド配列(配列番号
：２７)を示す。
【図２８】 ここでＤＮＡ１２７５２と称するヌクレオチド配列(配列番号
：２８)を示す。
【図２９】 ここでＤＮＡ１２７９７と称するヌクレオチド配列(配列番号
：２９)を示す。
【図３０】 ここでＤＮＡ１２８０１と称するヌクレオチド配列(配列番号
：３０)を示す。
【図３１】 ここでＤＮＡ１２８０２と称するヌクレオチド配列(配列番号
：３１)を示す。
【図３２】 ここでＤＮＡ１２８１７と称するヌクレオチド配列(配列番号
：３２)を示す。
【図３３】 ここでＤＮＡ１２８１９と称するヌクレオチド配列(配列番号
：３３)を示す。
【図３４】 ここでＤＮＡ１２８２９と称するヌクレオチド配列(配列番号
：３４)を示す。
【図３５】 ここでＤＮＡ１２８３０と称するヌクレオチド配列(配列番号
：３５)を示す。
【図３６】 ここでＤＮＡ１２８３４と称するヌクレオチド配列(配列番号
：３６)を示す。
【図３７】 ここでＤＮＡ１２８３７と称するヌクレオチド配列(配列番号
：３７)を示す。
【図３８】 ここでＤＮＡ１２８４０と称するヌクレオチド配列(配列番号
：３８)を示す。
【図３９】 ここでＤＮＡ１２８４１と称するヌクレオチド配列(配列番号
：３９)を示す。
【図４０】 ここでＤＮＡ１２８４４と称するヌクレオチド配列(配列番号
：４０)を示す。
【図４１】 ここでＤＮＡ１２８４６と称するヌクレオチド配列(配列番号
：４１)を示す。
【図４２】 ここでＤＮＡ１２８５０と称するヌクレオチド配列(配列番号
：４２)を示す。
【図４３】 ここでＤＮＡ１２８６５と称するヌクレオチド配列(配列番号
：４３)を示す。
【図４４】 ここでＤＮＡ１２８６７と称するヌクレオチド配列(配列番号
：４４)を示す。
【図４５】 ここでＤＮＡ１２８８４と称するヌクレオチド配列(配列番号
：４５)を示す。
【図４６】 ここでＤＮＡ１２８８９と称するヌクレオチド配列(配列番号
：４６)を示す。
【図４７】 ここでＤＮＡ１２８９１と称するヌクレオチド配列(配列番号
：４７)を示す。
【図４８】 ここでＤＮＡ１２９００と称するヌクレオチド配列(配列番号
：４８)を示す。
【図４９】 ここでＤＮＡ１２９２２と称するヌクレオチド配列(配列番号
：４９)を示す。
【図５０】 ここでＤＮＡ１２９４６と称するヌクレオチド配列(配列番号
：５０)を示す。
【図５１】 ここでＤＮＡ１２９６７と称するヌクレオチド配列(配列番号
：５１)を示す。
【図５２】 ここでＤＮＡ１２９７４と称するヌクレオチド配列(配列番号
：５２)を示す。
【図５３】 ここでＤＮＡ１２９８２と称するヌクレオチド配列(配列番号
：５３)を示す。
【図５４】 ここでＤＮＡ１２９８３と称するヌクレオチド配列(配列番号
：５４)を示す。
【図５５】 ここでＤＮＡ１２９９１と称するヌクレオチド配列(配列番号
：５５)を示す。
【図５６】 ここでＤＮＡ１２９９８と称するヌクレオチド配列(配列番号
：５６)を示す。
【図５７】 ここでＤＮＡ１２９９９と称するヌクレオチド配列(配列番号
：５７)を示す。
【図５８】 ここでＤＮＡ１３１０１と称するヌクレオチド配列(配列番号
：５８)を示す。
【図５９】 ここでＤＮＡ１３１０４と称するヌクレオチド配列(配列番号
：５９)を示す。
【図６０】 ここでＤＮＡ１３１１０と称するヌクレオチド配列(配列番号
：６０)を示す。
【図６１】 ここでＤＮＡ１３１１４と称するヌクレオチド配列(配列番号
：６１)を示す。
【図６２】 ここでＤＮＡ１３１１５と称するヌクレオチド配列(配列番号
：６２)を示す。
【図６３】 ここでＤＮＡ１３１１６と称するヌクレオチド配列(配列番号
：６３)を示す。
【図６４】 ここでＤＮＡ１３１１８と称するヌクレオチド配列(配列番号
：６４)を示す。
【図６５】 ここでＤＮＡ１３１２４と称するヌクレオチド配列(配列番号
：６５)を示す。
【図６６】 ここでＤＮＡ１３１３２と称するヌクレオチド配列(配列番号
：６６)を示す。
【図６７】 ここでＤＮＡ１３１３３と称するヌクレオチド配列(配列番号
：６７)を示す。
【図６８】 ここでＤＮＡ１３１４６と称するヌクレオチド配列(配列番号
：６８)を示す。
【図６９】 ここでＤＮＡ１３１５２と称するヌクレオチド配列(配列番号
：６９)を示す。
【図７０】 ここでＤＮＡ１３１５６と称するヌクレオチド配列(配列番号
：７０)を示す。
【図７１】 ここでＤＮＡ１３１６３と称するヌクレオチド配列(配列番号
：７１)を示す。
【図７２】 ここでＤＮＡ１３１８５と称するヌクレオチド配列(配列番号
：７２)を示す。
【図７３】 ここでＤＮＡ１３９９２と称するヌクレオチド配列(配列番号
：７３)を示す。
【図７４】 ここでＤＮＡ１４５２３と称するヌクレオチド配列(配列番号
：７４)を示す。
【図７５】 ここでＤＮＡ１４６５６と称するヌクレオチド配列(配列番号
：７５)を示す。
【図７６】 ここでＤＮＡ１４９３８と称するヌクレオチド配列(配列番号
：７６)を示す。
【図７７】 ここでＤＮＡ１５１７２と称するヌクレオチド配列(配列番号
：７７)を示す。
【図７８】 ここでＤＮＡ１５６１８と称するヌクレオチド配列(配列番号
：７８)を示す。
【図７９】 ここでＤＮＡ１６５４６と称するヌクレオチド配列(配列番号
：７９)を示す。
【図８０】 ここでＤＮＡ１６６６９と称するヌクレオチド配列(配列番号
：８０)を示す。
【図８１】 ここでＤＮＡ１７２４４と称するヌクレオチド配列(配列番号
：８１)を示す。
【図８２】 ここでＤＮＡ１８３８２と称するヌクレオチド配列(配列番号
：８２)を示す。
【図８３】 ここでＤＮＡ１８４４４と称するヌクレオチド配列(配列番号
：８３)を示す。
【図８４】 ここでＤＮＡ１８６４９と称するヌクレオチド配列(配列番号
：８４)を示す。
【図８５】 ここでＤＮＡ１９５９７と称するヌクレオチド配列(配列番号
：８５)を示す。
【図８６】 ここでＤＮＡ１９６０１と称するヌクレオチド配列(配列番号
：８６)を示す。
【図８７】 ここでＤＮＡ２１３８６と称するヌクレオチド配列(配列番号
：８７)を示す。
【図８８】 ここでＤＮＡ２２８６８と称するヌクレオチド配列(配列番号
：８８)を示す。
【図８９】 ここでＤＮＡ２３６９４と称するヌクレオチド配列(配列番号
：８９)を示す。
【図９０】 ここでＤＮＡ２４０５０と称するヌクレオチド配列(配列番号
：９０)を示す。
【図９１】 ここでＤＮＡ２４０７４と称するヌクレオチド配列(配列番号
：９１)を示す。
【図９２】 ここでＤＮＡ２４７８７と称するヌクレオチド配列(配列番号
：９２)を示す。
【図９３】 ここでＤＮＡ２８２４２と称するヌクレオチド配列(配列番号
：９３)を示す。
【図９４】 ここでＤＮＡ２８２５４と称するヌクレオチド配列(配列番号
：９４)を示す。
【図９５】 ここでＤＮＡ３１７５１と称するヌクレオチド配列(配列番号
：９５)を示す。
【図９６】 ここでＤＮＡ３２９２２と称するヌクレオチド配列(配列番号
：９６)を示す。
【図９７】 ここでＤＮＡ３３４３９と称するヌクレオチド配列(配列番号
：９７)を示す。
【図９８】 ここでＤＮＡ３４５０８と称するヌクレオチド配列(配列番号
：９８)を示す。
【図９９】 ここでＤＮＡ３４８０７と称するヌクレオチド配列(配列番号
：９９)を示す。
【図１００】 ここでＤＮＡ３４８３２と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１００)を示す。
【図１０１】 ここでＤＮＡ３６２２３と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１０１)を示す。
【図１０２】 ここでＤＮＡ３６２４０と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１０２)を示す。
【図１０３】 ここでＤＮＡ３６４９０と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１０３)を示す。
【図１０４】 ここでＤＮＡ３６５１６と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１０４)を示す。
【図１０５】 ここでＤＮＡ３６５３３と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１０５)を示す。
【図１０６】 ここでＤＮＡ３６５３８と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１０６)を示す。
【図１０７】 ここでＤＮＡ３６７８８と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１０７)を示す。
【図１０８】 ここでＤＮＡ３６８１８と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１０８)を示す。
【図１０９】 ここでＤＮＡ３６８６８と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１０９)を示す。
【図１１０】 ここでＤＮＡ３７３９３と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１１０)を示す。
【図１１１】 ここでＤＮＡ２７５８８と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１１１)を示す。
【図１１２】 ここでＤＮＡ３７６０２と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１１２)を示す。
【図１１３】 ここでＤＮＡ３７６４２と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１１３)を示す。
【図１１４】 ここでＤＮＡ３７６７６と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１１４)を示す。
【図１１５】 ここでＤＮＡ３７７２１と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１１５)を示す。
【図１１６】 ここでＤＮＡ３７７５９と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１１６)を示す。
【図１１７】 ここでＤＮＡ３７８５７と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１１７)を示す。
【図１１８】 ここでＤＮＡ３７９３７と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１１８)を示す。
【図１１９】 ここでＤＮＡ３８０３７と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１１９)を示す。
【図１２０】 ここでＤＮＡ３８０５０と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１２０)を示す。
【図１２１】 ここでＤＮＡ３８０５３と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１２１)を示す。
【図１２２】 ここでＤＮＡ３８３１２と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１２２)を示す。
【図１２３】 ここでＤＮＡ３８３６０と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１２３)を示す。
【図１２４】 ここでＤＮＡ３８６００と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１２４)を示す。
【図１２５】 ここでＤＮＡ３８７２０と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１２５)を示す。
【図１２６】 ここでＤＮＡ３８７２７と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１２６)を示す。
【図１２７】 ここでＤＮＡ３８７３１と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１２７)を示す。
【図１２８】 ここでＤＮＡ３８８１０と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１２８)を示す。
【図１２９】 ここでＤＮＡ３８８１４と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１２９)を示す。
【図１３０】 ここでＤＮＡ３９３７８と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１３０)を示す。
【図１３１】 ここでＤＮＡ４００５０と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１３１)を示す。
【図１３２】 ここでＤＮＡ４０３７５と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１３２)を示す。
【図１３３】 ここでＤＮＡ４０３８２と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１３３)を示す。
【図１３４】 ここでＤＮＡ４０３９４と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１３４)を示す。
【図１３５】 ここでＤＮＡ４０４６１と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１３５)を示す。
【図１３６】 ここでＤＮＡ４０７３５と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１３６)を示す。
【図１３７】 ここでＤＮＡ４０７３６と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１３７)を示す。
【図１３８】 ここでＤＮＡ４０７３８と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１３８)を示す。
【図１３９】 ここでＤＮＡ４０７３９と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１３９)を示す。
【図１４０】 ここでＤＮＡ４１１４４と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１４０)を示す。
【図１４１】 ここでＤＮＡ４１１６１と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１４１)を示す。
【図１４２】 ここでＤＮＡ４１１８６と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１４２)を示す。
【図１４３】 ここでＤＮＡ４１２５０と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１４３)を示す。
【図１４４】 ここでＤＮＡ４１２８４と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１４４)を示す。
【図１４５】 ここでＤＮＡ４１３０３と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１４５)を示す。
【図１４６】 ここでＤＮＡ４１３２６と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１４６)を示す。
【図１４７】 ここでＤＮＡ４１４４４と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１４７)を示す。
【図１４８】 ここでＤＮＡ４１４４５と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１４８)を示す。
【図１４９】 ここでＤＮＡ４１４５２と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１４９)を示す。
【図１５０】 ここでＤＮＡ４１４５６と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１５０)を示す。
【図１５１】 ここでＤＮＡ４１４５８と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１５１)を示す。
【図１５２】 ここでＤＮＡ４１４６２と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１５２)を示す。
【図１５３】 ここでＤＮＡ４１４６５と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１５３)を示す。
【図１５４】 ここでＤＮＡ４１４７５と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１５４)を示す。
【図１５５】 ここでＤＮＡ４１５１４と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１５５)を示す。
【図１５６】 ここでＤＮＡ４１５６５と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１５６)を示す。
【図１５７】 ここでＤＮＡ４１５６６と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１５７)を示す。
【図１５８】 ここでＤＮＡ４１６２６と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１５８)を示す。
【図１５９】 ここでＤＮＡ４１７０９と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１５９)を示す。
【図１６０】 ここでＤＮＡ４１７７５と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１６０)を示す。
【図１６１】 ここでＤＮＡ４１７８４と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１６１)を示す。
【図１６２】 ここでＤＮＡ４２１９４と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１６２)を示す。
【図１６３】 ここでＤＮＡ４２２７９と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１６３)を示す。
【図１６４】 ここでＤＮＡ４２３１４と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１６４)を示す。
【図１６５】 ここでＤＮＡ４２３３１と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１６５)を示す。
【図１６６】 ここでＤＮＡ４２３５８と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１６６)を示す。
【図１６７】 ここでＤＮＡ４２８５８と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１６７)を示す。
【図１６８】 ここでＤＮＡ４２８７０と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１６８)を示す。
【図１６９】 ここでＤＮＡ４２８７５と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１６９)を示す。
【図１７０】 ここでＤＮＡ４３１９７と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１７０)を示す。
【図１７１】 ここでＤＮＡ４３２０３と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１７１)を示す。
【図１７２】 ここでＤＮＡ４３２９５と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１７２)を示す。
【図１７３】 ここでＤＮＡ４３３０１と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１７３)を示す。
【図１７４】 ここでＤＮＡ４３３６３と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１７４)を示す。
【図１７５】 ここでＤＮＡ４３４２０と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１７５)を示す。
【図１７６】 ここでＤＮＡ４４３４７９と称するヌクレオチド配列(配列
番号：１７６)を示す。
【図１７７】 ここでＤＮＡ４３４８９と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１７７)を示す。
【図１７８】 ここでＤＮＡ４３４９８と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１７８)を示す。
【図１７９】 ここでＤＮＡ４３５０９と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１７９)を示す。
【図１８０】 ここでＤＮＡ４３５１２と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１８０)を示す。
【図１８１】 ここでＤＮＡ４３５３１と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１８１)を示す。
【図１８２】 ここでＤＮＡ４３５４６と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１８２)を示す。
【図１８３】 ここでＤＮＡ４３５８６と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１８３)を示す。
【図１８４】 ここでＤＮＡ４３８６２と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１８４)を示す。
【図１８５】 ここでＤＮＡ４３８８７と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１８５)を示す。
【図１８６】 ここでＤＮＡ４３９３６と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１８６)を示す。
【図１８７】 ここでＤＮＡ４３９６１と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１８７)を示す。
【図１８８】 ここでＤＮＡ４３９７１と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１８８)を示す。
【図１８９】 ここでＤＮＡ４４０４８と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１８９)を示す。
【図１９０】 ここでＤＮＡ４４９２０と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１９０)を示す。
【図１９１】 ここでＤＮＡ４４９２２と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１９１)を示す。
【図１９２】 ここでＤＮＡ４４９３４と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１９２)を示す。
【図１９３】 ここでＤＮＡ４４９８７と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１９３)を示す。
【図１９４】 ここでＤＮＡ４５０１４と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１９４)を示す。
【図１９５】 ここでＤＮＡ４５０３０と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１９５)を示す。
【図１９６】 ここでＤＮＡ４５０５１と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１９６)を示す。
【図１９７】 ここでＤＮＡ４５０６４と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１９７)を示す。
【図１９８】 ここでＤＮＡ４５２８２と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１９８)を示す。
【図１９９】 ここでＤＮＡ４５２８８と称するヌクレオチド配列(配列番
号：１９９)を示す。
【図２００】 ここでＤＮＡ４５３００と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２００)を示す。
【図２０１】 ここでＤＮＡ４５７４０と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２０１)を示す。
【図２０２】 ここでＤＮＡ４５７５９と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２０２)を示す。
【図２０３】 ここでＤＮＡ４５７８４と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２０３)を示す。
【図２０４】 ここでＤＮＡ４５７８９と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２０４)を示す。
【図２０５】 ここでＤＮＡ４５８１６と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２０５)を示す。
【図２０６】 ここでＤＮＡ４５９４４と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２０６)を示す。
【図２０７】 ここでＤＮＡ４５９５４と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２０７)を示す。
【図２０８】 ここでＤＮＡ４５９６４と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２０８)を示す。
【図２０９】 ここでＤＮＡ４５９９３と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２０９)を示す。
【図２１０】 ここでＤＮＡ４６０９２と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２１０)を示す。
【図２１１】 ここでＤＮＡ４６２１３と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２１１)を示す。
【図２１２】 ここでＤＮＡ４６２１５と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２１２)を示す。
【図２１３】 ここでＤＮＡ４６２２６と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２１３)を示す。
【図２１４】 ここでＤＮＡ４６３２８と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２１４)を示す。
【図２１５】 ここでＤＮＡ４７５８０と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２１５)を示す。
【図２１６】 ここでＤＮＡ４７６９１と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２１６)を示す。
【図２１７】 ここでＤＮＡ４７７５１と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２１７)を示す。
【図２１８】 ここでＤＮＡ４７８３５と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２１８)を示す。
【図２１９】 ここでＤＮＡ４７８５８と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２１９)を示す。
【図２２０】 ここでＤＮＡ４７８９０と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２２０)を示す。
【図２２１】 ここでＤＮＡ４７９３０と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２２１)を示す。
【図２２２】 ここでＤＮＡ４７９９０と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２２２)を示す。
【図２２３】 ここでＤＮＡ４８０５４と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２２３)を示す。
【図２２４】 ここでＤＮＡ４８１２４と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２２４)を示す。
【図２２５】 ここでＤＮＡ４８１３１と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２２５)を示す。
【図２２６】 ここでＤＮＡ４８１６２と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２２６)を示す。
【図２２７】 ここでＤＮＡ４８２０９と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２２７)を示す。
【図２２８】 ここでＤＮＡ４８３８９と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２２８)を示す。
【図２２９】 ここでＤＮＡ４８４４６と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２２９)を示す。
【図２３０】 ここでＤＮＡ４８４６６と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２３０)を示す。
【図２３１】 ここでＤＮＡ４８５７６と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２３１)を示す。
【図２３２】 ここでＤＮＡ４８５９８と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２３２)を示す。
【図２３３】 ここでＤＮＡ４８６６６と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２３３)を示す。
【図２３４】 ここでＤＮＡ４８７４８と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２３４)を示す。
【図２３５】 ここでＤＮＡ４８７７７と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２３５)を示す。
【図２３６】 ここでＤＮＡ４８８３０と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２３６)を示す。
【図２３７】 ここでＤＮＡ４９３５２と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２３７)を示す。
【図２３８】 ここでＤＮＡ４９４０７と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２３８)を示す。
【図２３９】 ここでＤＮＡ４９４４８と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２３９)を示す。
【図２４０】 ここでＤＮＡ４９５２８と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２４０)を示す。
【図２４１】 ここでＤＮＡ４９５２９と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２４１)を示す。
【図２４２】 ここでＤＮＡ４９９４８と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２４２)を示す。
【図２４３】 ここでＤＮＡ４９９５６と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２４３)を示す。
【図２４４】 ここでＤＮＡ４９９９２と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２４４)を示す。
【図２４５】 ここでＤＮＡ５０３０７と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２４５)を示す。
【図２４６】 ここでＤＮＡ５０３１９と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２４６)を示す。
【図２４７】 ここでＤＮＡ５０３４６と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２４７)を示す。
【図２４８】 ここでＤＮＡ５０３５４と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２４８)を示す。
【図２４９】 ここでＤＮＡ５０３５６と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２４９)を示す。
【図２５０】 ここでＤＮＡ５０４０５と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２５０)を示す。
【図２５１】 ここでＤＮＡ５０４２１と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２５１)を示す。
【図２５２】 ここでＤＮＡ５０４２３と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２５２)を示す。
【図２５３】 ここでＤＮＡ５０５２７と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２５３)を示す。
【図２５４】 ここでＤＮＡ５０５８４と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２５４)を示す。
【図２５５】 ここでＤＮＡ５０６２６と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２５５)を示す。
【図２５６】 ここでＤＮＡ５０６３７と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２５６)を示す。
【図２５７】 ここでＤＮＡ５０６５０と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２５７)を示す。
【図２５８】 ここでＤＮＡ５０６７４と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２５８)を示す。
【図２５９】 ここでＤＮＡ５０６７５と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２５９)を示す。
【図２６０】 ここでＤＮＡ５０６９８と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２６０)を示す。
【図２６１】 ここでＤＮＡ５０７３０と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２６１)を示す。
【図２６２】 ここでＤＮＡ５０７３７と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２６２)を示す。
【図２６３】 ここでＤＮＡ５１００３と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２６３)を示す。
【図２６４】 ここでＤＮＡ５１０１０と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２６４)を示す。
【図２６５】 ここでＤＮＡ５１０５９と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２６５)を示す。
【図２６６】 ここでＤＮＡ５１４１３と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２６６)を示す。
【図２６７】 ここでＤＮＡ５１７１２と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２６７)を示す。
【図２６８】 ここでＤＮＡ５１７９５と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２６８)を示す。
【図２６９】 ここでＤＮＡ５２１９９と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２６９)を示す。
【図２７０】 ここでＤＮＡ５２２１８と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２７０)を示す。
【図２７１】 ここでＤＮＡ５２３５２と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２７１)を示す。
【図２７２】 ここでＤＮＡ５４４４６と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２７２)を示す。
【図２７３】 ここでＤＮＡ５４５５２と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２７３)を示す。
【図２７４】 ここでＤＮＡ５４５８０と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２７４)を示す。
【図２７５】 ここでＤＮＡ５４６２３と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２７５)を示す。
【図２７６】 ここでＤＮＡ５４６７２と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２７６)を示す。
【図２７７】 ここでＤＮＡ５４８４０と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２７７)を示す。
【図２７８】 ここでＤＮＡ５４８５６と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２７８)を示す。
【図２７９】 ここでＤＮＡ５４８８２と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２７９)を示す。
【図２８０】 ここでＤＮＡ５４９４３と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２８０)を示す。
【図２８１】 ここでＤＮＡ５４９７０と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２８１)を示す。
【図２８２】 ここでＤＮＡ５５１３４と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２８２)を示す。
【図２８３】 ここでＤＮＡ５５１９８と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２８３)を示す。
【図２８４】 ここでＤＮＡ５５１９９と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２８４)を示す。
【図２８５】 ここでＤＮＡ５５２９２と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２８５)を示す。
【図２８６】 ここでＤＮＡ５５６４６と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２８６)を示す。
【図２８７】 ここでＤＮＡ５６５５３と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２８７)を示す。
【図２８８】 ここでＤＮＡ５６５５４と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２８８)を示す。
【図２８９】 ここでＤＮＡ５６５５６と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２８９)を示す。
【図２９０】 ここでＤＮＡ５６５８７と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２９０)を示す。
【図２９１】 ここでＤＮＡ５６５９０と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２９１)を示す。
【図２９２】 ここでＤＮＡ５６６００と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２９２)を示す。
【図２９３】 ここでＤＮＡ５６６４８と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２９３)を示す。
【図２９４】 ここでＤＮＡ５６６５０と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２９４)を示す。
【図２９５】 ここでＤＮＡ５６７０７と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２９５)を示す。
【図２９６】 ここでＤＮＡ５６７１７と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２９６)を示す。
【図２９７】 ここでＤＮＡ５８３８７と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２９７)を示す。
【図２９８】 ここでＤＮＡ５８４１４と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２９８)を示す。
【図２９９】 ここでＤＮＡ５８５２９と称するヌクレオチド配列(配列番
号：２９９)を示す。
【図３００】 ここでＤＮＡ５９３８５と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３００)を示す。
【図３０１】 ここでＤＮＡ５９７８９と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３０１)を示す。
【図３０２】 ここでＤＮＡ６０３２１と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３０２)を示す。
【図３０３】 ここでＤＮＡ６０３７０と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３０３)を示す。
【図３０４】 ここでＤＮＡ６０４０６と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３０４)を示す。
【図３０５】 ここでＤＮＡ６０４３８と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３０５)を示す。
【図３０６】 ここでＤＮＡ６０４６０と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３０６)を示す。
【図３０７】 ここでＤＮＡ６０４６６と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３０７)を示す。
【図３０８】 ここでＤＮＡ６０５０８と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３０８)を示す。
【図３０９】 ここでＤＮＡ６０５４２と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３０９)を示す。
【図３１０】 ここでＤＮＡ６０５９０と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３１０)を示す。
【図３１１】 ここでＤＮＡ６１３５０と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３１１)を示す。
【図３１２】 ここでＤＮＡ６１３５６と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３１２)を示す。
【図３１３】 ここでＤＮＡ６１４７８と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３１３)を示す。
【図３１４】 ここでＤＮＡ６１５１３と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３１４)を示す。
【図３１５】 ここでＤＮＡ６１５６１と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３１５)を示す。
【図３１６】 ここでＤＮＡ６１８９５と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３１６)を示す。
【図３１７】 ここでＤＮＡ６１９３０と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３１７)を示す。
【図３１８】 ここでＤＮＡ６１９５３と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３１８)を示す。
【図３１９】 ここでＤＮＡ６２０１１と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３１９)を示す。
【図３２０】 ここでＤＮＡ６２０８０と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３２０)を示す。
【図３２１】 ここでＤＮＡ６２１２６と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３２１)を示す。
【図３２２】 ここでＤＮＡ６２１５４と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３２２)を示す。
【図３２３】 ここでＤＮＡ６２１７０と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３２３)を示す。
【図３２４】 ここでＤＮＡ６２１９３と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３２４)を示す。
【図３２５】 ここでＤＮＡ６２２６１と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３２５)を示す。
【図３２６】 ここでＤＮＡ６２２９１と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３２６)を示す。
【図３２７】 ここでＤＮＡ６２４２２と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３２７)を示す。
【図３２８】 ここでＤＮＡ６２４３６と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３２８)を示す。
【図３２９】 ここでＤＮＡ６２５２４と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３２９)を示す。
【図３３０】 ここでＤＮＡ６２５８９と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３３０)を示す。
【図３３１】 ここでＤＮＡ６３８７８と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３３１)を示す。
【図３３２】 ここでＤＮＡ６４０１７と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３３２)を示す。
【図３３３】 ここでＤＮＡ６４０４５と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３３３)を示す。
【図３３４】 ここでＤＮＡ６４１０１と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３３４)を示す。
【図３３５】 ここでＤＮＡ６４１８３と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３３５)を示す。
【図３３６】 ここでＤＮＡ６４１９３と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３３６)を示す。
【図３３７】 ここでＤＮＡ６４１９９と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３３７)を示す。
【図３３８】 ここでＤＮＡ６４２６８と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３３８)を示す。
【図３３９】 ここでＤＮＡ６４３０４と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３３９)を示す。
【図３４０】 ここでＤＮＡ６４４５３と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３４０)を示す。
【図３４１】 ここでＤＮＡ６４４５８と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３４１)を示す。
【図３４２】 ここでＤＮＡ６４５１２と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３４２)を示す。
【図３４３】 ここでＤＮＡ６４５４０と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３４３)を示す。
【図３４４】 ここでＤＮＡ６４５５２と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３４４)を示す。
【図３４５】 ここでＤＮＡ６４５５７と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３４５)を示す。
【図３４６】 ここでＤＮＡ６４５６９と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３４６)を示す。
【図３４７】 ここでＤＮＡ６４６２７と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３４７)を示す。
【図３４８】 ここでＤＮＡ６４７４５と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３４８)を示す。
【図３４９】 ここでＤＮＡ６４７８４と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３４９)を示す。
【図３５０】 ここでＤＮＡ６５６０９と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３５０)を示す。
【図３５１】 ここでＤＮＡ６５６４４と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３５１)を示す。
【図３５２】 ここでＤＮＡ６５７２０と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３５２)を示す。
【図３５３】 ここでＤＮＡ６５７５２と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３５３)を示す。
【図３５４】 ここでＤＮＡ６５７７１と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３５４)を示す。
【図３５５】 ここでＤＮＡ６５８３３と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３５５)を示す。
【図３５６】 ここでＤＮＡ６５８３６と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３５６)を示す。
【図３５７】 ここでＤＮＡ６５８６４と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３５７)を示す。
【図３５８】 ここでＤＮＡ６５８６９と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３５８)を示す。
【図３５９】 ここでＤＮＡ６５９２８と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３５９)を示す。
【図３６０】 ここでＤＮＡ６６０６５と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３６０)を示す。
【図３６１】 ここでＤＮＡ６６０９５と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３６１)を示す。
【図３６２】 ここでＤＮＡ６６１９７と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３６２)を示す。
【図３６３】 ここでＤＮＡ６６２１７と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３６３)を示す。
【図３６４】 ここでＤＮＡ６６２３１と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３６４)を示す。
【図３６５】 ここでＤＮＡ６６４０４と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３６５)を示す。
【図３６６】 ここでＤＮＡ６６４３２と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３６６)を示す。
【図３６７】 ここでＤＮＡ６７０７６と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３６７)を示す。
【図３６８】 ここでＤＮＡ６８０１３と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３６８)を示す。
【図３６９】 ここでＤＮＡ６８０１８と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３６９)を示す。
【図３７０】 ここでＤＮＡ６８０３４と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３７０)を示す。
【図３７１】 ここでＤＮＡ６８１１９と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３７１)を示す。
【図３７２】 ここでＤＮＡ６８２４８と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３７２)を示す。
【図３７３】 ここでＤＮＡ６８３８３と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３７３)を示す。
【図３７４】 ここでＤＮＡ６８４２３と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３７４)を示す。
【図３７５】 ここでＤＮＡ６８４４１と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３７５)を示す。
【図３７６】 ここでＤＮＡ６８４５９と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３７６)を示す。
【図３７７】 ここでＤＮＡ６８５０９と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３７７)を示す。
【図３７８】 ここでＤＮＡ６８５１４と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３７８)を示す。
【図３７９】 ここでＤＮＡ６８５２１と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３７９)を示す。
【図３８０】 ここでＤＮＡ６８５３２と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３８０)を示す。
【図３８１】 ここでＤＮＡ６８５４０と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３８１)を示す。
【図３８２】 ここでＤＮＡ６８５６１と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３８２)を示す。
【図３８３】 ここでＤＮＡ６８５８５と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３８３)を示す。
【図３８４】 ここでＤＮＡ６９４９１と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３８４)を示す。
【図３８５】 ここでＤＮＡ７０２２２と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３８５)を示す。
【図３８６】 ここでＤＮＡ７０２３９と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３８６)を示す。
【図３８７】 ここでＤＮＡ７０２４４と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３５７)を示す。
【図３８８】 ここでＤＮＡ７０３４９と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３８８)を示す。
【図３８９】 ここでＤＮＡ７０４００と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３８９)を示す。
【図３９０】 ここでＤＮＡ７０４１３と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３９０)を示す。
【図３９１】 ここでＤＮＡ７０５２６と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３９１)を示す。
【図３９２】 ここでＤＮＡ７０６８５と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３９２)を示す。
【図３９３】 ここでＤＮＡ７０７３２と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３９３)を示す。
【図３９４】 ここでＤＮＡ７２６３４と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３９４)を示す。
【図３９５】 ここでＤＮＡ７２６８３と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３９５)を示す。
【図３９６】 ここでＤＮＡ７２６９５と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３９６)を示す。
【図３９７】 ここでＤＮＡ７２８６４と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３９７)を示す。
【図３９８】 ここでＤＮＡ７３１５６と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３９８)を示す。
【図３９９】 ここでＤＮＡ７３２７５と称するヌクレオチド配列(配列番
号：３９９)を示す。
【図４００】 ここでＤＮＡ７４０５２と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４００)を示す。
【図４０１】 ここでＤＮＡ７４０６３と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４０１)を示す。
【図４０２】 ここでＤＮＡ７４０７２と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４０２)を示す。
【図４０３】 ここでＤＮＡ７４１４０と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４０３)を示す。
【図４０４】 ここでＤＮＡ７４２１６と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４０４)を示す。
【図４０５】 ここでＤＮＡ７４２１８と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４０５)を示す。
【図４０６】 ここでＤＮＡ７４２２８と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４０６)を示す。
【図４０７】 ここでＤＮＡ７４２５６と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４０７)を示す。
【図４０８】 ここでＤＮＡ７５０６２と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４０８)を示す。
【図４０９】 ここでＤＮＡ７６１３７と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４０９)を示す。
【図４１０】 ここでＤＮＡ７６１５８と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４１０)を示す。
【図４１１】 ここでＤＮＡ７７０９８と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４１１)を示す。
【図４１２】 ここでＤＮＡ７７７９１と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４１２)を示す。
【図４１３】 ここでＤＮＡ７７９６８と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４１３)を示す。
【図４１４】 ここでＤＮＡ７７９７６と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４１４)を示す。
【図４１５】 ここでＤＮＡ７８０１７と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４１５)を示す。
【図４１６】 ここでＤＮＡ７８０９５と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４１６)を示す。
【図４１７】 ここでＤＮＡ７８１０３と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４１７)を示す。
【図４１８】 ここでＤＮＡ７８１１３と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４１８)を示す。
【図４１９】 ここでＤＮＡ７８７４６と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４１９)を示す。
【図４２０】 ここでＤＮＡ７８７５９と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４２０)を示す。
【図４２１】 ここでＤＮＡ７８７９６と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４２１)を示す。
【図４２２】 ここでＤＮＡ７９５６１と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４２２)を示す。
【図４２３】 ここでＤＮＡ７９６０２と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４２３)を示す。
【図４２４】 ここでＤＮＡ７９６１７と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４２４)を示す。
【図４２５】 ここでＤＮＡ７９６２８と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４２５)を示す。
【図４２６】 ここでＤＮＡ７９６４０と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４２６)を示す。
【図４２７】 ここでＤＮＡ７９６６１と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４２７)を示す。
【図４２８】 ここでＤＮＡ７９６８４と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４２８)を示す。
【図４２９】 ここでＤＮＡ７９７１７と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４２９)を示す。
【図４３０】 ここでＤＮＡ７９７３３と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４３０)を示す。
【図４３１】 ここでＤＮＡ７９９７０と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４３１)を示す。
【図４３２】 ここでＤＮＡ８００５０と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４３２)を示す。
【図４３３】 ここでＤＮＡ８０２４７と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４３３)を示す。
【図４３４】 ここでＤＮＡ８０２６５と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４３４)を示す。
【図４３５】 ここでＤＮＡ８０６１５と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４３５)を示す。
【図４３６】 ここでＤＮＡ８０６２３と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４３６)を示す。
【図４３７】 ここでＤＮＡ８０６２７と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４３７)を示す。
【図４３８】 ここでＤＮＡ８１８９６と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４３８)を示す。
【図４３９】 ここでＤＮＡ８１９１８と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４３９)を示す。
【図４４０】 ここでＤＮＡ８１９７６と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４４０)を示す。
【図４４１】 ここでＤＮＡ８２０１７と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４４１)を示す。
【図４４２】 ここでＤＮＡ８２０２４と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４４２)を示す。
【図４４３】 ここでＤＮＡ８２０２７と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４４３)を示す。
【図４４４】 ここでＤＮＡ８２１１５と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４４４)を示す。
【図４４５】 ここでＤＮＡ８２１５４と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４４５)を示す。
【図４４６】 ここでＤＮＡ８２１５７と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４４６)を示す。
【図４４７】 ここでＤＮＡ８２１６６と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４４７)を示す。
【図４４８】 ここでＤＮＡ８２１８２と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４４８)を示す。
【図４４９】 ここでＤＮＡ８２２１２と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４４９)を示す。
【図４５０】 ここでＤＮＡ８２４９８と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４５０)を示す。
【図４５１】 ここでＤＮＡ８２４９９と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４５１)を示す。
【図４５２】 ここでＤＮＡ８２５４０と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４５２)を示す。
【図４５３】 ここでＤＮＡ８２５３１と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４５３)を示す。
【図４５４】 ここでＤＮＡ８２６９３と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４５４)を示す。
【図４５５】 ここでＤＮＡ８２７０２と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４５５)を示す。
【図４５６】 ここでＤＮＡ８２７８６と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４５６)を示す。
【図４５７】 ここでＤＮＡ８２８５１と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４５７)を示す。
【図４５８】 ここでＤＮＡ８２８９８と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４５８)を示す。
【図４５９】 ここでＤＮＡ８２９３５と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４５９)を示す。
【図４６０】 ここでＤＮＡ８２９７７と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４６０)を示す。
【図４６１】 ここでＤＮＡ８２９８９と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４６１)を示す。
【図４６２】 ここでＤＮＡ８３６２８と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４６２)を示す。
【図４６３】 ここでＤＮＡ８３６３０と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４６３)を示す。
【図４６４】 ここでＤＮＡ８３７４９と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４６４)を示す。
【図４６５】 ここでＤＮＡ８３７７２と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４６５)を示す。
【図４６６】 ここでＤＮＡ８３８００と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４６６)を示す。
【図４６７】 ここでＤＮＡ８３９５０と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４６７)を示す。
【図４６８】 ここでＤＮＡ８４０２７と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４６８)を示す。
【図４６９】 ここでＤＮＡ８４０７６と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４６９)を示す。
【図４７０】 ここでＤＮＡ８４１０９と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４７０)を示す。
【図４７１】 ここでＤＮＡ８５０７２と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４７１)を示す。
【図４７２】 ここでＤＮＡ８５１５４と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４７２)を示す。
【図４７３】 ここでＤＮＡ８５１９３と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４７３)を示す。
【図４７４】 ここでＤＮＡ８５２２４と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４７４)を示す。
【図４７５】 ここでＤＮＡ８５２３７と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４７５)を示す。
【図４７６】 ここでＤＮＡ８５２８９と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４７６)を示す。
【図４７７】 ここでＤＮＡ８５３５７と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４７７)を示す。
【図４７８】 ここでＤＮＡ８５３６１と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４７８)を示す。
【図４７９】 ここでＤＮＡ８５３７１と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４７９)を示す。
【図４８０】 ここでＤＮＡ８６８７５と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４８０)を示す。
【図４８１】 ここでＤＮＡ８６８７６と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４８１)を示す。
【図４８２】 ここでＤＮＡ８６９０５と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４８２)を示す。
【図４８３】 ここでＤＮＡ８６９４５と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４８３)を示す。
【図４８４】 ここでＤＮＡ８６９６９と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４８４)を示す。
【図４８５】 ここでＤＮＡ８７０５０と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４８５)を示す。
【図４８６】 ここでＤＮＡ８７０９４と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４８６)を示す。
【図４８７】 ここでＤＮＡ８７１２６と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４８７)を示す。
【図４８８】 ここでＤＮＡ８７４９３と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４８８)を示す。
【図４８９】 ここでＤＮＡ８７４９４と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４８９)を示す。
【図４９０】 ここでＤＮＡ８７５０５と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４９０)を示す。
【図４９１】 ここでＤＮＡ８７５６６と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４９１)を示す。
【図４９２】 ここでＤＮＡ８７５８６と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４９２)を示す。
【図４９３】 ここでＤＮＡ８７６４９と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４９３)を示す。
【図４９４】 ここでＤＮＡ８９３４０と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４９４)を示す。
【図４９５】 ここでＤＮＡ８９３５５と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４９５)を示す。
【図４９６】 ここでＤＮＡ８９３６５と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４９６)を示す。
【図４９７】 ここでＤＮＡ８９４１９と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４９７)を示す。
【図４９８】 ここでＤＮＡ８９４７０と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４９８)を示す。
【図４９９】 ここでＤＮＡ８９４８０と称するヌクレオチド配列(配列番
号：４９９)を示す。
【図５００】 ここでＤＮＡ８９５４９と称するヌクレオチド配列(配列番
号：５００)を示す。
【図５０１】 ここでＤＮＡ８９６０６と称するヌクレオチド配列(配列番
号：５０１)を示す。
【図５０２】 ここでＤＮＡ８９６１５と称するヌクレオチド配列(配列番
号：５０２)を示す。
【図５０３】 ここでＤＮＡ８９６６９と称するヌクレオチド配列(配列番
号：５０３)を示す。
【図５０４】 ここでＤＮＡ８９７６０と称するヌクレオチド配列(配列番
号：５０４)を示す。
【図５０５】 ここでＤＮＡ８９７６６と称するヌクレオチド配列(配列番
号：５０５)を示す。
【図５０６】 ここでＤＮＡ８９７７２と称するヌクレオチド配列(配列番
号：５０６)を示す。
【図５０７】 ここでＤＮＡ８９７７３と称するヌクレオチド配列(配列番
号：５０７)を示す。
【図５０８】 ここでＤＮＡ８９７７４と称するヌクレオチド配列(配列番
号：５０８)を示す。
【図５０９】 ここでＤＮＡ８９８７２と称するヌクレオチド配列(配列番
号：５０９)を示す。
【図５１０】 ここでＤＮＡ８９９１８と称するヌクレオチド配列(配列番
号：５１０)を示す。
【図５１１】 ここでＤＮＡ８９９２８と称するヌクレオチド配列(配列番
号：５１１)を示す。
【図５１２】 ここでＤＮＡ８９９３０と称するヌクレオチド配列(配列番
号：５１２)を示す。
【図５１３】 ここでＤＮＡ９１４６３と称するヌクレオチド配列(配列番
号：５１３)を示す。
【図５１４】 ここでＤＮＡ９１５０７と称するヌクレオチド配列(配列番
号：５１４)を示す。
【図５１５】 ここでＤＮＡ９３６１５と称するヌクレオチド配列(配列番
号：５１５)を示す。
【図５１６】 ここでＤＮＡ９４０１１と称するヌクレオチド配列(配列番
号：５１６)を示す。
【図５１７】 ここでＤＮＡ９４０４３と称するヌクレオチド配列(配列番
号：５１７)を示す。
【図５１８】 ここでＤＮＡ９４０５０と称するヌクレオチド配列(配列番
号：５１８)を示す。
【図５１９】 ここでＤＮＡ９４０９７と称するヌクレオチド配列(配列番
号：５０９)を示す。
【図５２０】 ここでＤＮＡ９４０９８と称するヌクレオチド配列(配列番
号：５２０)を示す。
【図５２１】 ここでＤＮＡ９４１００と称するヌクレオチド配列(配列番
号：５２１)を示す。
【図５２２】 ここでＤＮＡ９４１２６と称するヌクレオチド配列(配列番
号：５２２)を示す。
【図５２３】 ここでＤＮＡ９４１３６と称するヌクレオチド配列(配列番
号：５２３)を示す。
【図５２４】 ここでＤＮＡ９４１５６と称するヌクレオチド配列(配列番
号：５２４)を示す。
【図５２５】 ここでＤＮＡ９４２１９と称するヌクレオチド配列(配列番
号：５２５)を示す。
【図５２６】 ここでＤＮＡ９４２５４と称するヌクレオチド配列(配列番
号：５２６)を示す。
【図５２７】 ここでＤＮＡ９４２７４と称するヌクレオチド配列(配列番
号：５２７)を示す。
【図５２８】 ここでＤＮＡ９４２９２と称するヌクレオチド配列(配列番
号：５２８)を示す。
【図５２９】 ここでＤＮＡ９４３６０と称するヌクレオチド配列(配列番
号：５２９)を示す。
【図５３０】 ここでＤＮＡ９４３７７と称するヌクレオチド配列(配列番
号：５３０)を示す。
【図５３１】 ここでＤＮＡ９４４７７と称するヌクレオチド配列(配列番
号：５３１)を示す。
【図５３２】 ここでＤＮＡ９４５１８と称するヌクレオチド配列(配列番
号：５３２)を示す。
【図５３３】 ここでＤＮＡ９４５３３と称するヌクレオチド配列(配列番
号：５３３)を示す。
【図５３４】 ここでＤＮＡ９５３７０と称するヌクレオチド配列(配列番
号：５３４)を示す。
【図５３５】 ここでＤＮＡ９７３５８と称するヌクレオチド配列(配列番
号：５３５)を示す。
【図５３６】 ここでＤＮＡ９７３７４と称するヌクレオチド配列(配列番
号：５３６)を示す。
【図５３７】 ここでＤＮＡ９７４７０と称するヌクレオチド配列(配列番
号：５３７)を示す。
【図５３８】 ここでＤＮＡ９７５８１と称するヌクレオチド配列(配列番
号：５３８)を示す。
【図５３９】 ここでＤＮＡ９７７６７と称するヌクレオチド配列(配列番
号：５３９)を示す。
【図５４０】 ここでＤＮＡ９７８４２と称するヌクレオチド配列(配列番
号：５４０)を示す。
【図５４１】 ここでＤＮＡ９７９４９と称するヌクレオチド配列(配列番
号：５４１)を示す。
【図５４２】 ここでＤＮＡ９７９８７と称するヌクレオチド配列(配列番
号：５４２)を示す。
【図５４３】 ここでＤＮＡ９７９９５と称するヌクレオチド配列(配列番
号：５４３)を示す。
【図５４４】 ここでＤＮＡ９８２９３と称するヌクレオチド配列(配列番
号：５４４)を示す。
【図５４５】 ここでＤＮＡ９８２９４と称するヌクレオチド配列(配列番
号：５４５)を示す。
【図５４６】 ここでＤＮＡ９８３４６と称するヌクレオチド配列(配列番
号：５４６)を示す。
【図５４７】 ここでＤＮＡ９８３６０と称するヌクレオチド配列(配列番
号：５４７)を示す。
【図５４８】 ここでＤＮＡ９８８２９と称するヌクレオチド配列(配列番
号：５４８)を示す。
【図５４９】 ここでＤＮＡ１０１５１４と称するヌクレオチド配列(配列
番号：５４９)を示す。
【図５５０】 ここでＤＮＡ１０１５７２と称するヌクレオチド配列(配列
番号：５５０)を示す。
【図５５１】 ここでＤＮＡ１０１５８０と称するヌクレオチド配列(配列
番号：５５１)を示す。
【図５５２】 ここでＤＮＡ１０１５９５と称するヌクレオチド配列(配列
番号：５５２)を示す。
【図５５３】 ここでＤＮＡ１０１６３３と称するヌクレオチド配列(配列
番号：５５３)を示す。
【図５５４】 ここでＤＮＡ１０１７１７と称するヌクレオチド配列(配列
番号：５５４)を示す。
【図５５５】 ここでＤＮＡ１０１７６８と称するヌクレオチド配列(配列
番号：５５５)を示す。
【図５５６】 ここでＤＮＡ１０７３３２と称するヌクレオチド配列(配列
番号：５５６)を示す。
【図５５７】 ここでＤＮＡ４３４９９と称するヌクレオチド配列(配列番
号：５５７)を示す。
【図５５８】 ここでＤＮＡ４５７１３と称するヌクレオチド配列(配列番
号：５５８)を示す。
【図５５９】 ここでＤＮＡ４６０８９と称するヌクレオチド配列(配列番
号：５５９)を示す。
【図５６０】 ここでＤＮＡ６８２５６と称するヌクレオチド配列(配列番
号：５６０)を示す。
【図５６１】 ここでＤＮＡ７０３０５と称するヌクレオチド配列(配列番
号：５６１)を示す。
【図５６２】 ここでＤＮＡ８２９５３と称するヌクレオチド配列(配列番
号：５６２)を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 45/00 Ａ６１Ｐ 43/00 １０５ ４Ｃ０８５ 48/00 Ｃ０７Ｋ 14/47 ４Ｃ０８６ Ａ６１Ｐ 43/00 １０５ 16/18 ４Ｈ０４５ Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 1/19 16/18 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/08 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｑ 1/68 5/00 Ｂ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ベーカー，ケヴィン，ピー． アメリカ合衆国 メリーランド 20878， ダーンズタウン，インディアン ラン ド ライブ 14006 (72)発明者 ゴッダード，オードリー アメリカ合衆国 カリフォルニア 94131， サンフランシスコ，コンゴ ストリート 110 (72)発明者 ウッド，ウィリアム，アイ． アメリカ合衆国 カリフォルニア 94010， ヒルズバラ，サウスダウン コート 35 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 CA01 DA02 DA06 DA12 GA11 HA12 4B063 QA18 QQ42 QR32 QR55 QS34 QX01 4B064 AG01 CA02 CA06 CA10 CA19 CC24 DA01 DA13 4B065 AA26X AA72X AA91X AA93Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA25 CA44 CA46 4C084 AA02 AA06 AA07 AA13 AA17 BA01 BA08 BA22 BA23 MA01 NA14 ZB212 4C085 AA13 AA14 CC32 DD62 EE01 GG01 4C086 AA01 AA02 AA03 AA04 EA16 MA01 MA04 NA14 ZB21 4H045 AA10 AA11 AA20 BA10 CA40 EA20 EA50 FA74

Claims (31)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 (ａ)図１〜５６２の何れか一つのＤＮＡ分子、又は(ｂ)(ａ)
    のＤＮＡ分子の相補鎖に対して、少なくとも約８０％の核酸配列同一性を有する
    ヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子。
  2. 【請求項２】 図１〜５６２の何れか一つに示されるヌクレオチド配列又は
    その相補鎖を含んでなる請求項１に記載の単離された核酸分子。
  3. 【請求項３】 (ａ)図１〜５６２の何れか一つのＤＮＡ分子、又は(ｂ)(ａ)
    のＤＮＡ分子の相補鎖に対して、少なくとも約８０％の核酸配列同一性を有する
    ヌクレオチド配列から本質的になる請求項１に記載の単離された核酸分子。
  4. 【請求項４】 図１〜５６２の何れか一つに示されるヌクレオチド配列又は
    その相補鎖から本質的になる請求項１に記載の単離された核酸分子。
  5. 【請求項５】 (ａ)図１〜５６２の何れか一つのＤＮＡ分子、又は(ｂ)(ａ)
    のＤＮＡ分子の相補鎖に対して、少なくとも約８０％の核酸配列同一性を有する
    ヌクレオチド配列からなる請求項１に記載の単離された核酸分子。
  6. 【請求項６】 図１〜５６２の何れか一つに示されるヌクレオチド配列又は
    その相補鎖からなる請求項１に記載の単離された核酸分子。
  7. 【請求項７】 (ａ)図１〜５６２の何れか一つのＤＮＡ分子、又は(ｂ)(ａ)
    のＤＮＡ分子の相補鎖に対してハイブリダイズする単離された核酸分子。
  8. 【請求項８】 図１〜５６２の何れか一つの相補鎖にハイブリダイズする請
    求項７に記載の単離された核酸分子。
  9. 【請求項９】 前記ハイブリダイゼーションがストリンジェントなハイブリ
    ダイゼーション条件下で生じる請求項７に記載の単離された核酸分子。
  10. 【請求項１０】 (ａ)図１〜５６２の何れか一つのＤＮＡ分子、又は(ｂ)(
    ａ)のＤＮＡ分子の相補鎖内に含まれる少なくとも約１０の連続ヌクレオチドを
    含む単離された核酸分子。
  11. 【請求項１１】 図１〜５６２の何れか一つのＤＮＡ分子の相補鎖内に含ま
    れる少なくとも約１０の連続ヌクレオチドを含む請求項１０に記載の単離された
    核酸分子。
  12. 【請求項１２】 約１０〜約１０００ヌクレオチド長である請求項１０に記
    載の単離された核酸分子。
  13. 【請求項１３】 約１０〜約５００ヌクレオチド長である請求項１０に記載
    の単離された核酸分子。
  14. 【請求項１４】 約１０〜約１００ヌクレオチド長である請求項１０に記載
    の単離された核酸分子。
  15. 【請求項１５】 約１０〜約５０ヌクレオチド長である請求項１０に記載の
    単離された核酸分子。
  16. 【請求項１６】 図１〜５６２の何れか一つのＤＮＡ分子に対して完全に相
    補的である請求項１１に記載の単離された核酸分子。
  17. 【請求項１７】 検出可能に標識されている請求項１０に記載の単離された
    核酸分子。
  18. 【請求項１８】 哺乳動物ｃＤＮＡライブラリーの哺乳動物ポリペプチドを
    コードするｃＤＮＡ分子の存在を検出する方法において、 図１〜５６２の何れか一つのＤＮＡ分子にハイブリダイズするオリゴヌクレオ
    チドプローブと前記ｃＤＮＡライブラリーを接触させることを含み、ここで、該
    接触が、該ライブラリーのｃＤＮＡ分子への該プローブのハイブリダイゼーショ
    ンに適した条件下で実施され、該ライブラリーのｃＤＮＡ分子への該プローブの
    ハイブリダイゼーションが、該ｃＤＮＡライブラリーにおける哺乳動物ポリペプ
    チドをコードするｃＤＮＡ分子の存在を示すものである方法。
  19. 【請求項１９】 前記ハイブリダイゼーションがストリンジェントなハイブ
    リダイゼーション条件下でなされる請求項１８に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 前記オリゴヌクレオチドプローブが、図１〜５６２の何れ
    か一つのＤＮＡ分子の相補鎖内に含有された少なくとも約１０の連続ヌクレオチ
    ドを含んでなる請求項１８に記載の方法。
  21. 【請求項２１】 前記哺乳動物ポリペプチドがヒトポリペプチドである請求
    項１８に記載の方法。
  22. 【請求項２２】 請求項１に記載の核酸分子を含んでなるベクター。
  23. 【請求項２３】 前記核酸分子がベクターで形質転換した宿主細胞により認
    識されるコントロール配列に作用可能に結合させられた請求項２２に記載のベク
    ター。
  24. 【請求項２４】 請求項２２に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。
  25. 【請求項２５】 前記細胞がＣＨＯ細胞である請求項２４に記載の宿主細胞
    。
  26. 【請求項２６】 前記細胞が大腸菌である請求項２４に記載の宿主細胞。
  27. 【請求項２７】 前記細胞が酵母細胞である請求項２４に記載の宿主細胞。
  28. 【請求項２８】 請求項１に記載の核酸分子によりコードされる単離したＳ
    ＲＴポリペプチド。
  29. 【請求項２９】 請求項２８に記載の単離したＳＲＴポリペプチドに結合す
    る抗体。
  30. 【請求項３０】 モノクローナル抗体である請求項２９に記載の抗体。
  31. 【請求項３１】 ヒト化抗体である請求項２９に記載の抗体。
JP2001512880A 1999-07-26 2000-07-21 新規なポリヌクレオチドとその使用法 Pending JP2003505082A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US14570199P 1999-07-26 1999-07-26
US60/145,701 1999-07-26
PCT/US2000/020006 WO2001007611A2 (en) 1999-07-26 2000-07-21 Novel polynucleotides and method for the use thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2003505082A true JP2003505082A (ja) 2003-02-12

Family

ID=22514171

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2001512880A Pending JP2003505082A (ja) 1999-07-26 2000-07-21 新規なポリヌクレオチドとその使用法

Country Status (5)

Country Link
EP (1) EP1196570A2 (ja)
JP (1) JP2003505082A (ja)
AU (1) AU6117000A (ja)
CA (1) CA2378403A1 (ja)
WO (1) WO2001007611A2 (ja)

Families Citing this family (91)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001021836A2 (en) * 1999-09-23 2001-03-29 Incyte Genomics, Inc. Molecules for diagnostics and therapeutics
AU7720600A (en) * 1999-09-27 2001-04-30 Eli Lilly And Company Osteoprotegerin regulatory region
CA2392090A1 (en) 1999-11-16 2001-05-25 Merck & Co., Inc. G-protein coupled receptor
AU1919401A (en) * 1999-11-17 2001-05-30 Lexicon Genetics Incorporated Novel human notch ligand proteins and polynucleotides encoding the same
US6803192B1 (en) 1999-11-30 2004-10-12 Mayo Foundation For Medical Education And Research B7-H1, a novel immunoregulatory molecule
CA2392477A1 (en) 1999-11-30 2001-06-07 Mayo Foundation For Medical Education And Research B7-h1, a novel immunoregulatory molecule
US20050074754A1 (en) * 2000-04-27 2005-04-07 Shoichi Okubo Novel protein and use thereof
US7700359B2 (en) 2000-06-02 2010-04-20 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Gene products differentially expressed in cancerous cells
WO2002020598A1 (en) * 2000-07-28 2002-03-14 Michael Andrew Mcguckin Mucin
WO2002018556A2 (en) * 2000-08-31 2002-03-07 Millennium Pharmaceuticals, Inc. 8797, a human galactosyltransferase and uses thereof
EP1369478A4 (en) * 2001-02-15 2004-11-17 Mochida Pharm Co Ltd NEW CLASS A RECEPTOR RECEPTOR TYPE PROTEIN
US6518055B2 (en) * 2001-03-26 2003-02-11 Applera Corporation Isolated human protease proteins, nucleic acid molecules encoding human protease proteins, and uses thereof
WO2002086083A2 (en) 2001-04-20 2002-10-31 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods of enhancing cell responsiveness
MXPA03010069A (es) 2001-05-03 2004-04-02 Childrens Medical Center Canal de cation especeifico de espermatozoide, y aplicaciones relacionadas con los usos para el mismo.
US6809104B2 (en) 2001-05-04 2004-10-26 Tularik Inc. Fused heterocyclic compounds
US20020173459A1 (en) * 2001-05-18 2002-11-21 Pe Corporation (Ny) Isolated human secreted proteins, nucleic acid molecules encoding human secreted proteins, and uses thereof
US7208282B2 (en) 2001-05-31 2007-04-24 Merck & Co., Inc. Rhesus monkey, dog and ferret melanin-concentrating hormone type 2 receptor
US7563450B2 (en) 2001-10-04 2009-07-21 Immunex Corporation UL16 binding protein 4
EP1448589A4 (en) 2001-10-22 2005-03-30 Childrens Medical Center THE SPERM SPECIFIC CATION CHANNEL CATSPER2 AND USES THEREOF
US8729248B2 (en) 2001-10-22 2014-05-20 Children's Medical Center Corporation Sperm-specific cation channel, CATSPER2, and uses therefor
JP4376629B2 (ja) 2002-01-08 2009-12-02 ノバルティス バクシンズ アンド ダイアグノスティックス，インコーポレーテッド 癌性胸部細胞において差次的に発現された遺伝子産物およびその使用方法
US8110668B2 (en) 2002-08-07 2012-02-07 Children's Medical Center Corporation Sperm-specific cation channel, catsper-3 and uses therefor
WO2004015066A2 (en) 2002-08-07 2004-02-19 Children's Medical Center Corporation Sperm-specific cation channel, catsper-4, and uses therefor
BR0316070A (pt) 2002-11-06 2005-09-27 Tularik Inc Composto, composição farmacêutica, uso de um composto e, método para modular mchr
PT2157192E (pt) 2003-10-10 2013-11-28 Deutsches Krebsforsch Composições para diagnóstico e terapia de doenças associadas com a expressão aberrante de futrinas (r-espondinas)
GB0417887D0 (en) 2004-08-11 2004-09-15 Ares Trading Sa Protein
AU2005295038B2 (en) 2004-10-06 2012-05-17 Mayo Foundation For Medical Education And Research B7-H1 and methods of diagnosis, prognosis, and treatment of cancer
MX2009003229A (es) 2006-09-29 2009-06-18 Oncomed Pharm Inc Composiciones y metodos para diagnosticar y tratar cancer.
JP5777281B2 (ja) 2006-10-20 2015-09-09 デウトスクフエス クレブスフオルスチュングスゼントルム ストイフトウング デス オフフエントリクヘンレクフトス 血管新生及び脈管形成のモジュレーターとしてのｒスポンジン
HUE027154T2 (en) 2007-07-02 2016-08-29 Oncomed Pharm Inc Preparations and procedures for the treatment and diagnosis of cancer
WO2010121923A1 (en) 2009-04-15 2010-10-28 Deutsches Krebsforschungszentrum Rspondin-3 inhibition in bone disorders
US8551479B2 (en) 2010-09-10 2013-10-08 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating melanoma
EP2731625B1 (en) 2011-07-15 2018-04-18 OncoMed Pharmaceuticals, Inc. Rspo binding agents and uses thereof
WO2014012007A2 (en) 2012-07-13 2014-01-16 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Rspo3 binding agents and uses thereof
CN106687137A (zh) 2014-09-16 2017-05-17 昂考梅德药品有限公司 纤维化疾病的治疗
TW202035447A (zh) 2018-07-04 2020-10-01 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 新穎雙特異性促效性4-1bb抗原結合分子
SG10202105790QA (en) 2018-12-21 2021-07-29 Hoffmann La Roche Antibodies binding to cd3
EP3902830A1 (en) 2018-12-30 2021-11-03 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-rabbit cd19 antibodies and methods of use
JP2022522985A (ja) 2019-01-22 2022-04-21 ジェネンテック， インコーポレイテッド 免疫グロブリンａ抗体、並びに産生及び使用の方法
US20220135622A1 (en) 2019-02-28 2022-05-05 Genentech, Inc. Antibacterial peptides and methods of use
WO2020208049A1 (en) 2019-04-12 2020-10-15 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antigen binding molecules comprising lipocalin muteins
AR119382A1 (es) 2019-07-12 2021-12-15 Hoffmann La Roche Anticuerpos de pre-direccionamiento y métodos de uso
AR119393A1 (es) 2019-07-15 2021-12-15 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se unen a nkg2d
CN114423791A (zh) 2019-09-18 2022-04-29 豪夫迈·罗氏有限公司 抗klk7抗体、抗klk5抗体、多特异性抗klk5/klk7抗体及使用方法
PE20221282A1 (es) 2019-12-18 2022-09-05 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se unen a hla-a2/mage-a4
JP2023506956A (ja) 2019-12-20 2023-02-20 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト Ｉｌ－３７融合タンパク質及びその使用
CN115515678A (zh) 2019-12-23 2022-12-23 基因泰克公司 载脂蛋白l1特异性抗体及其使用方法
AU2021288916A1 (en) 2020-06-08 2022-11-24 F.Hoffmann-La Roche Ag Anti-HBV antibodies and methods of use
IL296225A (en) 2020-06-19 2022-11-01 Hoffmann La Roche Binding molecules in the fc domain that activate the immune system
JP2023531625A (ja) 2020-06-19 2023-07-25 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト ＣＤ３及びＦｏｌＲ１に結合する抗体
IL296089A (en) 2020-06-19 2022-11-01 Hoffmann La Roche Antibodies bind to cd3
IL298402A (en) 2020-06-19 2023-01-01 Hoffmann La Roche Antibodies that bind to CD3 and CD19
WO2021255146A1 (en) 2020-06-19 2021-12-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to cd3 and cea
US20230272116A1 (en) 2020-07-10 2023-08-31 Hoffmann-La Roche Inc. Antibodies which bind to cancer cells and target radionuclides to said cells
CA3185122A1 (en) 2020-07-17 2022-01-20 Cecilia Pui Chi Chiu Anti-notch2 antibodies and methods of use
BR112023001740A2 (pt) 2020-08-03 2023-02-28 Hoffmann La Roche Receptores de ligação ao antígeno, célula t transduzida, polinucleotídeo isolado, vetor, kit, método para tratar uma doença em um indivíduo e induzir a lise de uma célula-alvo e uso do receptor de ligação ao antígeno
CN116685325A (zh) 2020-10-20 2023-09-01 豪夫迈·罗氏有限公司 Pd-1轴结合拮抗剂和lrrk2抑制剂的组合疗法
WO2022086957A1 (en) 2020-10-20 2022-04-28 Genentech, Inc. Peg-conjugated anti-mertk antibodies and methods of use
JP2023547447A (ja) 2020-10-28 2023-11-10 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 改良型抗原結合受容体
WO2022148853A1 (en) 2021-01-11 2022-07-14 F. Hoffmann-La Roche Ag Immunoconjugates
WO2022152656A1 (en) 2021-01-12 2022-07-21 F. Hoffmann-La Roche Ag Split antibodies which bind to cancer cells and target radionuclides to said cells
US20240173442A1 (en) 2021-01-13 2024-05-30 Hoffmann-La Roche Inc. Combination therapy
JP2024509695A (ja) 2021-02-03 2024-03-05 ジェネンテック， インコーポレイテッド 多重特異性結合タンパク質分解プラットフォームおよび使用方法
EP4304732A1 (en) 2021-03-12 2024-01-17 Genentech, Inc. Anti-klk7 antibodies, anti-klk5 antibodies, multispecific anti-klk5/klk7 antibodies, and methods of use
WO2022241082A1 (en) 2021-05-14 2022-11-17 Genentech, Inc. Agonists of trem2
TW202313045A (zh) 2021-06-09 2023-04-01 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 用於癌症治療之組合療法
US20230048743A1 (en) 2021-07-12 2023-02-16 Genentech Inc. Structures for Reducing Antibody-Lipase Binding
AU2022310847A1 (en) 2021-07-14 2024-01-25 Genentech, Inc. Anti-c-c motif chemokine receptor 8 (ccr8) antibodies and methods of use
WO2023001884A1 (en) 2021-07-22 2023-01-26 F. Hoffmann-La Roche Ag Heterodimeric fc domain antibodies
WO2023012147A1 (en) 2021-08-03 2023-02-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antibodies and methods of use
WO2023086807A1 (en) 2021-11-10 2023-05-19 Genentech, Inc. Anti-interleukin-33 antibodies and uses thereof
CA3237616A1 (en) 2021-11-25 2023-06-01 F. Hoffmann-La Roche Ag Improved antigen binding receptors
AR127887A1 (es) 2021-12-10 2024-03-06 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se unen a cd3 y plap
TW202330582A (zh) 2021-12-15 2023-08-01 美商建南德克公司 穩定的ｉｌ－１８多肽及其用途
TW202340248A (zh) 2021-12-20 2023-10-16 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 促效性ｌｔｂｒ抗體及包含其之雙特異性抗體
TW202340251A (zh) 2022-01-19 2023-10-16 美商建南德克公司 抗ｎｏｔｃｈ２抗體及結合物及其使用方法
WO2023174838A1 (en) 2022-03-14 2023-09-21 F. Hoffmann-La Roche Ag Modulators of the g3bp2-tau interaction for the treatment of tau associated diseases
WO2023180511A1 (en) 2022-03-25 2023-09-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Improved chimeric receptors
WO2023186756A1 (en) 2022-03-28 2023-10-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Interferon gamma variants and antigen binding molecules comprising these
TW202402794A (zh) 2022-03-28 2024-01-16 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 經改良的ｆｏｌｒ１蛋白酶可活化之ｔ細胞雙特異性抗體
WO2023191816A1 (en) 2022-04-01 2023-10-05 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-fcrh5/anti-cd3 bispecific antibodies
WO2023198661A1 (en) 2022-04-12 2023-10-19 F. Hoffmann-La Roche Ag Fusion proteins targeted to the central nervous system
WO2023219613A1 (en) 2022-05-11 2023-11-16 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-fcrh5/anti-cd3 bispecific antibodies
WO2024015897A1 (en) 2022-07-13 2024-01-18 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-fcrh5/anti-cd3 bispecific antibodies
WO2024020432A1 (en) 2022-07-19 2024-01-25 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-fcrh5/anti-cd3 bispecific antibodies
WO2024020564A1 (en) 2022-07-22 2024-01-25 Genentech, Inc. Anti-steap1 antigen-binding molecules and uses thereof
WO2024068572A1 (en) 2022-09-28 2024-04-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Improved protease-activatable t cell bispecific antibodies
WO2024077239A1 (en) 2022-10-07 2024-04-11 Genentech, Inc. Methods of treating cancer with anti-c-c motif chemokine receptor 8 (ccr8) antibodies
WO2024091991A1 (en) 2022-10-25 2024-05-02 Genentech, Inc. Therapeutic and diagnostic methods for multiple myeloma
WO2024100170A1 (en) 2022-11-11 2024-05-16 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to hla-a*02/foxp3
WO2024104933A1 (en) 2022-11-15 2024-05-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Antigen binding molecules

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5536637A (en) * 1993-04-07 1996-07-16 Genetics Institute, Inc. Method of screening for cDNA encoding novel secreted mammalian proteins in yeast
US5707829A (en) * 1995-08-11 1998-01-13 Genetics Institute, Inc. DNA sequences and secreted proteins encoded thereby
US5824504A (en) * 1996-09-26 1998-10-20 Elshourbagy; Nabil A. Human 7-transmembrane receptor and DNA

Also Published As

Publication number Publication date
WO2001007611A3 (en) 2001-08-23
AU6117000A (en) 2001-02-13
WO2001007611A2 (en) 2001-02-01
CA2378403A1 (en) 2001-02-01
EP1196570A2 (en) 2002-04-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2003505082A (ja) 新規なポリヌクレオチドとその使用法
EP1210418B1 (en) Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
JP4451059B2 (ja) 分泌及び膜貫通ポリペプチドとそれをコードする核酸
US7304126B2 (en) Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US20050187379A1 (en) Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US20060003370A1 (en) Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
JP2007075118A (ja) 分泌及び膜貫通ポリペプチドとそれをコードする核酸
EP1169442B1 (en) Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US20070174922A1 (en) Nucleic acid encoding novel type-1 cytokine receptor glm-r
JP2003505350A5 (ja)
US7235633B2 (en) Cytokine receptors and nucleic acids encoding the same
US20050202497A1 (en) Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
JP2003530082A (ja) 免疫関連疾患を治療するための組成物及び方法
JP2003530082A6 (ja) 免疫関連疾患を治療するための組成物及び方法
US7576185B2 (en) PRO34128 antibodies
EP1506215B1 (en) Novel polypeptides having sequence similarity to gdnfr and nucleic acids encoding the same
US7235642B1 (en) Anti-PRO 1313 antibodies
EP1300417B1 (en) Secreted and transmembrane polypeptide and nucleic acid encoding the same
EP1247863B1 (en) Snake venom protein A homologue and nucleic acid encoding the same.
US7507557B2 (en) Nucleic acids encoding PRO1375 polypeptides
US7425613B2 (en) PRO1375 polypeptides
EP1621619B1 (en) Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
EP1953173B1 (en) Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids endoding the same
US20040086970A1 (en) Novel cytokine receptors and nucleic acids encoding the same
US20060051792A1 (en) Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same

Legal Events

Date Code Title Description
A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20051025

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20060509