JPH10179143A - リン酸化１，５−アンヒドログルシトールに作用する酵素を産生する微生物、当該微生物が産生する酵素及びそれを使用したリン酸化１，５−アンヒドログルシトールの定量方法 - Google Patents
リン酸化１，５−アンヒドログルシトールに作用する酵素を産生する微生物、当該微生物が産生する酵素及びそれを使用したリン酸化１，５−アンヒドログルシトールの定量方法Info
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- JPH10179143A JPH10179143A JP9303642A JP30364297A JPH10179143A JP H10179143 A JPH10179143 A JP H10179143A JP 9303642 A JP9303642 A JP 9303642A JP 30364297 A JP30364297 A JP 30364297A JP H10179143 A JPH10179143 A JP H10179143A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 リン酸化１，５−アンヒドロ−Ｄ−グルシト
ールに作用する酸化還元酵素を産生する微生物、当該酵
素及びそれを使用したリン酸化１，５−アンヒドロ−Ｄ
−グルシトールの定量方法を提供する。 【解決手段】 本発明の微生物は、リン酸化１，５−ア
ンヒドロ−Ｄ−グルシトールに作用する酸化還元酵素を
産生する微生物である。本発明の微生物の産生する酸化
還元酵素は１，５−アンヒドロ−Ｄ−グルシトールの酵
素定量法に有用である。
ールに作用する酸化還元酵素を産生する微生物、当該酵
素及びそれを使用したリン酸化１，５−アンヒドロ−Ｄ
−グルシトールの定量方法を提供する。 【解決手段】 本発明の微生物は、リン酸化１，５−ア
ンヒドロ−Ｄ−グルシトールに作用する酸化還元酵素を
産生する微生物である。本発明の微生物の産生する酸化
還元酵素は１，５−アンヒドロ−Ｄ−グルシトールの酵
素定量法に有用である。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は新規な微生物、それ
が産生する酵素及び当該酵素を使用した１，５−アンヒ
ドログルシトールの定量方法に関する。より詳細には、
リン酸化１，５−アンヒドロ−Ｄ−グルシトール類に作
用する酵素を産生する微生物及び当該微生物が産生し、
リン酸化１，５−アンヒドロ−Ｄ−グルシトール類を酸
化し得る酵素、並びに当該酵素を使用したリン酸化１，
５−アンヒドロ−Ｄ−グルシトールの定量方法に関し、
かかる酵素及び定量方法は、臨床検査などにおける１，
５−アンヒドロ−Ｄ−グルシトール（以下、１，５−Ａ
Ｇという）の定量に有用である。
が産生する酵素及び当該酵素を使用した１，５−アンヒ
ドログルシトールの定量方法に関する。より詳細には、
リン酸化１，５−アンヒドロ−Ｄ−グルシトール類に作
用する酵素を産生する微生物及び当該微生物が産生し、
リン酸化１，５−アンヒドロ−Ｄ−グルシトール類を酸
化し得る酵素、並びに当該酵素を使用したリン酸化１，
５−アンヒドロ−Ｄ−グルシトールの定量方法に関し、
かかる酵素及び定量方法は、臨床検査などにおける１，
５−アンヒドロ−Ｄ−グルシトール（以下、１，５−Ａ
Ｇという）の定量に有用である。
【０００２】
【従来の技術】１，５−ＡＧはグルコース類似の構造を
有するポリオールであり、ヒトでは血液、髄液、尿など
に存在し、糖尿病患者では１，５−ＡＧ濃度が低下する
ことが知られており、糖尿病の重要なマーカーとして注
目されている。従来、１，５−ＡＧはガスクロマトグラ
フィーにより定量されていた（検査と技術、21巻、No.
6、407〜412、1982年）。しかし、この方法で定量する
には特別な装置が必要であり、また操作が繁雑で熟練を
要するため、臨床検査の分野で多数の検体を測定するに
は支障があった。
有するポリオールであり、ヒトでは血液、髄液、尿など
に存在し、糖尿病患者では１，５−ＡＧ濃度が低下する
ことが知られており、糖尿病の重要なマーカーとして注
目されている。従来、１，５−ＡＧはガスクロマトグラ
フィーにより定量されていた（検査と技術、21巻、No.
6、407〜412、1982年）。しかし、この方法で定量する
には特別な装置が必要であり、また操作が繁雑で熟練を
要するため、臨床検査の分野で多数の検体を測定するに
は支障があった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】近年、操作性の改善を
目的として１，５−ＡＧの定量に酵素を用いた方法が報
告されている。例えば特開昭６３−１８５３９７号には
１，５−ＡＧを酸化する酵素を用いて過酸化水素を産生
させて１，５−ＡＧを定量する方法が開示されている。
しかし、このような酸化酵素を用いる方法は、生体試料
中のビリルビンやアスコルビン酸などの還元性物質の影
響を受けるという問題がある。更に、使用する酵素の
１，５−ＡＧに対する基質特異性が低いため、臨床検査
のような各種／多量の糖類を含む試料から微量の１，５
−ＡＧのみを測定することは困難で、各種糖類の測定値
に与える影響が大きい。特に、グルコースの正の影響が
大きいため、これらの対策として、たとえば前記特開昭
６３−１８５３９７号や特開平７−２３１７９６号で
は、強塩基性陰イオン交換樹脂やホウ酸処理法が開示さ
れている。また特開平５−３０４９９６号では同様にｐ
Ｈを７．２〜８．５に調整する方法が開示されている。
しかし、これらの方法はいずれも操作が繁雑であるとい
う欠点があり、自動分析装置を用いて多数の検体を迅速
に測定するには難点を持っていた。
目的として１，５−ＡＧの定量に酵素を用いた方法が報
告されている。例えば特開昭６３−１８５３９７号には
１，５−ＡＧを酸化する酵素を用いて過酸化水素を産生
させて１，５−ＡＧを定量する方法が開示されている。
しかし、このような酸化酵素を用いる方法は、生体試料
中のビリルビンやアスコルビン酸などの還元性物質の影
響を受けるという問題がある。更に、使用する酵素の
１，５−ＡＧに対する基質特異性が低いため、臨床検査
のような各種／多量の糖類を含む試料から微量の１，５
−ＡＧのみを測定することは困難で、各種糖類の測定値
に与える影響が大きい。特に、グルコースの正の影響が
大きいため、これらの対策として、たとえば前記特開昭
６３−１８５３９７号や特開平７−２３１７９６号で
は、強塩基性陰イオン交換樹脂やホウ酸処理法が開示さ
れている。また特開平５−３０４９９６号では同様にｐ
Ｈを７．２〜８．５に調整する方法が開示されている。
しかし、これらの方法はいずれも操作が繁雑であるとい
う欠点があり、自動分析装置を用いて多数の検体を迅速
に測定するには難点を持っていた。
【０００４】このような臨床検査における実状を考慮し
て、自動化に適した検査方法の開発が行われ、特開平６
−３０３９９５号、特開平６−１８９７５５号あるは特
開平６−２３９７０４号に示すように、酸化還元酵素を
用いた１，５−ＡＧの測定方法が検討されてきた。しか
し、各種／多量の糖類を含む臨床検体試料中から微量の
１，５−ＡＧを分別測定することは困難であった。特
に、酸化酵素、例えば、ピラノースオキシダーゼを用い
た方法では混在する糖類の測定値に与える影響が指摘さ
れている（臨床化学、第２３巻、第２号、188〜194、19
94年）。このような実状は精密かつ高精度を要求される
臨床検査の分野では改善されなければならない問題であ
る。
て、自動化に適した検査方法の開発が行われ、特開平６
−３０３９９５号、特開平６−１８９７５５号あるは特
開平６−２３９７０４号に示すように、酸化還元酵素を
用いた１，５−ＡＧの測定方法が検討されてきた。しか
し、各種／多量の糖類を含む臨床検体試料中から微量の
１，５−ＡＧを分別測定することは困難であった。特
に、酸化酵素、例えば、ピラノースオキシダーゼを用い
た方法では混在する糖類の測定値に与える影響が指摘さ
れている（臨床化学、第２３巻、第２号、188〜194、19
94年）。このような実状は精密かつ高精度を要求される
臨床検査の分野では改善されなければならない問題であ
る。
【０００５】本発明者等はこのような従来の方法を改良
して、臨床検査における検体試料の測定に適応できる方
法、特に自動分析装置に利用できる方法について鋭意研
究を行った。その結果、リン酸化１，５−ＡＧに作用す
る微生物を見出し、またこの微生物からリン酸化１，５
−ＡＧに作用し得る酸化還元酵素の分離に成功した。そ
して、この酵素を、電子受容体の存在下にリン酸化１，
５−ＡＧに作用させて、その酸化還元物を測定すること
により、リン酸化１，５−ＡＧの測定が可能になること
が確認され、更にその反応を利用することによって、
１，５−ＡＧを高精度で測定できることを見出した。詳
しくは、リン酸基供与体の存在下で、１，５−ＡＧにリ
ン酸化酵素を作用させてリン酸化１，５−ＡＧを生成
し、次いで本発明の酵素を作用させることにより１，５
−ＡＧの測定が可能になる。これらの方法は操作が繁雑
でなく、反応条件が穏和なため自動分析装置での測定が
可能となり、日常の臨床検査で多数の試料測定に有用で
あることが分かり、本発明を完成するに至った。本発明
はかかる知見に基づいてなされたもので、リン酸化１，
５−ＡＧに作用する酸化還元酵素を産生する微生物及び
当該微生物が産生する酸化還元酵素並びに当該酵素を使
用したリン酸化１，５−ＡＧの定量方法を提供すること
を目的とする。
して、臨床検査における検体試料の測定に適応できる方
法、特に自動分析装置に利用できる方法について鋭意研
究を行った。その結果、リン酸化１，５−ＡＧに作用す
る微生物を見出し、またこの微生物からリン酸化１，５
−ＡＧに作用し得る酸化還元酵素の分離に成功した。そ
して、この酵素を、電子受容体の存在下にリン酸化１，
５−ＡＧに作用させて、その酸化還元物を測定すること
により、リン酸化１，５−ＡＧの測定が可能になること
が確認され、更にその反応を利用することによって、
１，５−ＡＧを高精度で測定できることを見出した。詳
しくは、リン酸基供与体の存在下で、１，５−ＡＧにリ
ン酸化酵素を作用させてリン酸化１，５−ＡＧを生成
し、次いで本発明の酵素を作用させることにより１，５
−ＡＧの測定が可能になる。これらの方法は操作が繁雑
でなく、反応条件が穏和なため自動分析装置での測定が
可能となり、日常の臨床検査で多数の試料測定に有用で
あることが分かり、本発明を完成するに至った。本発明
はかかる知見に基づいてなされたもので、リン酸化１，
５−ＡＧに作用する酸化還元酵素を産生する微生物及び
当該微生物が産生する酸化還元酵素並びに当該酵素を使
用したリン酸化１，５−ＡＧの定量方法を提供すること
を目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】上記の課題を解決するた
めになされた本発明の要旨は、 リン酸化１，５−ＡＧに作用する酸化還元酵素を産生
するデレヤ属に属する微生物； 微生物が、デレヤ エスピー α-１５（ＦＥＲＭ ＢＰ
−６１４０）である上記記載の微生物； 下記の理化学的性質及び生化学的性質を有する酵素； ａ）リン酸化１，５−ＡＧに作用する； ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる推定分子量が約６７ｋＤａ
である； ｃ）ゲル濾過法による推定分子量が約５５ｋＤａであ
る； ｄ）１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で
平衡化したＤＥＡＥ型樹脂ゲルに吸着し、０．３Ｍ Ｎ
ａＣｌを含有する同緩衝液で溶出する； リン酸化１，５−アンヒドログルシトールに、電子受
容体の存在下、上記記載の酵素を作用させることを特
徴とするリン酸化１，５−アンヒドログルシトールの定
量方法； １，５−アンヒドログルシトールをリン酸化し、生成
したリン酸化１，５−アンヒドログルシトールに、電子
受容体の存在下、上記記載の酵素を作用させることを
特徴とする１，５−アンヒドログルシトールの定量方
法；にある。
めになされた本発明の要旨は、 リン酸化１，５−ＡＧに作用する酸化還元酵素を産生
するデレヤ属に属する微生物； 微生物が、デレヤ エスピー α-１５（ＦＥＲＭ ＢＰ
−６１４０）である上記記載の微生物； 下記の理化学的性質及び生化学的性質を有する酵素； ａ）リン酸化１，５−ＡＧに作用する； ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる推定分子量が約６７ｋＤａ
である； ｃ）ゲル濾過法による推定分子量が約５５ｋＤａであ
る； ｄ）１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で
平衡化したＤＥＡＥ型樹脂ゲルに吸着し、０．３Ｍ Ｎ
ａＣｌを含有する同緩衝液で溶出する； リン酸化１，５−アンヒドログルシトールに、電子受
容体の存在下、上記記載の酵素を作用させることを特
徴とするリン酸化１，５−アンヒドログルシトールの定
量方法； １，５−アンヒドログルシトールをリン酸化し、生成
したリン酸化１，５−アンヒドログルシトールに、電子
受容体の存在下、上記記載の酵素を作用させることを
特徴とする１，５−アンヒドログルシトールの定量方
法；にある。
【０００７】
【発明の実施の形態】本発明による上記の微生物は、リ
ン酸化１，５−ＡＧに作用する酸化還元酵素を産生す
る。当該酵素はリン酸化１，５−ＡＧ及び１，５−ＡＧ
の定量に有用である。本発明の微生物の具体例であるデ
レヤ エスピー α-１５株の菌学的性質は以下のとおり
である。 (a)形態学的性状 1. 細胞の形及び大きさ： カン菌 2. 細胞の多形性の有無： なし 3. 運動性の有無： あり 4. 胞子の有無： なし 5. グラム染色性： 陰性
ン酸化１，５−ＡＧに作用する酸化還元酵素を産生す
る。当該酵素はリン酸化１，５−ＡＧ及び１，５−ＡＧ
の定量に有用である。本発明の微生物の具体例であるデ
レヤ エスピー α-１５株の菌学的性質は以下のとおり
である。 (a)形態学的性状 1. 細胞の形及び大きさ： カン菌 2. 細胞の多形性の有無： なし 3. 運動性の有無： あり 4. 胞子の有無： なし 5. グラム染色性： 陰性
【０００８】(b)各培地における生育状態 1. 肉汁寒天平板培養： 乳白色／良好 2. 肉汁寒天斜面培養： 乳白色／良好 3. 肉汁液体培養： 乳白色／良好
【０００９】(c)生理学的性質 1. 硝酸塩の還元： 陽性 2. 脱窒反応： 陰性 3. ＶＰ反応： 陰性 4. インドールの生成： 陰性 5. 硫化水素の生成： 陰性 6. クエン酸の利用： 陰性 7. 色素の生成： 陰性 8. ウレアーゼ： 陰性 9. オキシダーゼ： 陰性 10. カタラーゼ： 陽性 11. 生育の範囲： ｐＨ６．０〜８．０／３０℃付近 12. 酸素に対する態度： 好気性 13. Ｏ-Ｆテスト: 無変化型 14. 下記の糖類からの酸の生成 Ｌ−アラビノース： 陽性 Ｄ−キシロース ： 陽性 Ｄ−グルコース ： 陽性 Ｄ−マンノース ： 陰性 Ｄ−フルクトース： 陽性 Ｄ−ガラクトース： 陽性 麦芽糖 ： 陽性 ショ糖 ： 陽性 乳糖 ： 陽性 トレハロース ： 陽性 Ｄ−ソルビット ： 陽性 Ｄ−マンニット ： 陽性 イノシット ： 陽性 グリセリン ： 陽性
【００１０】(d)その他の諸性質 1. β-ガラクトシダーゼ： 陽性 2. アルギニンジヒドラーゼ： 陰性 3. リジンデカルボキシラーセ： 陰性 4. オルニチンデカルボキシラーゼ： 陰性 5. トリプトファンデアミナーゼ： 陰性 6. ゼラチナーゼ： 陰性 7. α−メチル−Ｄ−グルコシドでの増殖： 陽性 8. ＮａＣｌの要求性： 陽性
【００１１】以上の菌学的性質から、Bergey's Manual
of Determinative Bacteriology (Ninth Edition)に基
づいて検索したところ、本菌株はデレヤ(Deleya)属の細
菌に比較的類似しているが、上記の諸性質と一致するも
のは見出されなかった。そこで、本発明菌はデレヤ属に
属する新種の菌株と判断し、デレヤ エスピー α-１５
(Deleya sp. α-15)と命名した。また、この菌株は工業
技術院生命工学工業技術研究所に「受託番号ＦＥＲＭ
ＢＰ−６１４０」として寄託されている。
of Determinative Bacteriology (Ninth Edition)に基
づいて検索したところ、本菌株はデレヤ(Deleya)属の細
菌に比較的類似しているが、上記の諸性質と一致するも
のは見出されなかった。そこで、本発明菌はデレヤ属に
属する新種の菌株と判断し、デレヤ エスピー α-１５
(Deleya sp. α-15)と命名した。また、この菌株は工業
技術院生命工学工業技術研究所に「受託番号ＦＥＲＭ
ＢＰ−６１４０」として寄託されている。
【００１２】本発明菌の培養は、当該菌株が良好に生育
できるものであれば、いかなる培地及び培養条件であっ
てもよく、かかる培養により増殖させて必要量の菌体を
得ることができる。上記の培地は、適当な炭素源、窒素
源、無機イオン及びその他必要な成分を含有させること
ができる。培地の炭素源としては、グルコース、α−メ
チル−Ｄ−グルコシドなどが利用できる。また、窒素源
としては、ペプトン、酵母エキス、肉エキスなどの有機
窒素源、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどの無
機窒素源が利用できる。更に、無機イオンとしては、リ
ン酸イオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、マグ
ネシウムイオン、鉄イオン、銅イオン、マンガンイオン
などが利用できる。また、必要に応じて、培地には、ビ
タミン類、細胞増殖因子などの成分を添加することもで
きる。
できるものであれば、いかなる培地及び培養条件であっ
てもよく、かかる培養により増殖させて必要量の菌体を
得ることができる。上記の培地は、適当な炭素源、窒素
源、無機イオン及びその他必要な成分を含有させること
ができる。培地の炭素源としては、グルコース、α−メ
チル−Ｄ−グルコシドなどが利用できる。また、窒素源
としては、ペプトン、酵母エキス、肉エキスなどの有機
窒素源、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどの無
機窒素源が利用できる。更に、無機イオンとしては、リ
ン酸イオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、マグ
ネシウムイオン、鉄イオン、銅イオン、マンガンイオン
などが利用できる。また、必要に応じて、培地には、ビ
タミン類、細胞増殖因子などの成分を添加することもで
きる。
【００１３】本発明菌の培養方法としては、常法に準
じ、振盪培養法などの液体培地を用いる培養方法、寒天
培地などの固体培地を用いる培養方法が利用でき、好気
的条件下に行われる。培養温度は２５〜４０℃、好まし
くは３０℃付近、培養途中のｐＨは６〜８、好ましくは
７付近にて行われる。培養日数としては、菌体量、培地
組成などに応じて適宜設定できるが、通常１〜２日、好
ましくは１日である。
じ、振盪培養法などの液体培地を用いる培養方法、寒天
培地などの固体培地を用いる培養方法が利用でき、好気
的条件下に行われる。培養温度は２５〜４０℃、好まし
くは３０℃付近、培養途中のｐＨは６〜８、好ましくは
７付近にて行われる。培養日数としては、菌体量、培地
組成などに応じて適宜設定できるが、通常１〜２日、好
ましくは１日である。
【００１４】本発明の酵素は、本発明の微生物の粉砕物
の水溶性画分から得ることができる。即ち、本発明の酵
素は、培養した本発明の微生物を適当な緩衝液（例え
ば、リン酸緩衝液等、ｐＨ６程度）中で慣用の方法（例
えば、フレンチプレス等）で粉砕し、次いで遠心分離し
て夾雑物を除去した水溶性画分に含まれている。上記の
水溶性画分からの本発明の酵素の分離・精製は、慣用の
蛋白質精製法（例えば、塩析、透析、遠心分離、電気泳
動、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー等）に準
じて行うことができる。より具体的には、上記の水溶性
画分に硫酸アンモニウム等の塩を加え、夾雑蛋白を塩析
して除去し、次いで透析により塩を除去し；得られた水
溶液をＤＥＡＥ型イオン交換クロマトグラフィーで精製
し；溶出液をゲル濾過法で精製することにより、精製さ
れた本発明の酵素を得ることができる。
の水溶性画分から得ることができる。即ち、本発明の酵
素は、培養した本発明の微生物を適当な緩衝液（例え
ば、リン酸緩衝液等、ｐＨ６程度）中で慣用の方法（例
えば、フレンチプレス等）で粉砕し、次いで遠心分離し
て夾雑物を除去した水溶性画分に含まれている。上記の
水溶性画分からの本発明の酵素の分離・精製は、慣用の
蛋白質精製法（例えば、塩析、透析、遠心分離、電気泳
動、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー等）に準
じて行うことができる。より具体的には、上記の水溶性
画分に硫酸アンモニウム等の塩を加え、夾雑蛋白を塩析
して除去し、次いで透析により塩を除去し；得られた水
溶液をＤＥＡＥ型イオン交換クロマトグラフィーで精製
し；溶出液をゲル濾過法で精製することにより、精製さ
れた本発明の酵素を得ることができる。
【００１５】かくして得られた本発明の酵素（以下、α
−１５ ＧＤＨという）は、下記の理化学的性質及び生
化学的性質を有していた。 ａ）リン酸化１，５−ＡＧに作用する； ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる推定分子量が約６７ｋＤａ
である； ｃ）ゲル濾過法による推定分子量が約５５ｋＤａであ
る； ｄ）１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で
平衡化したＤＥＡＥ型樹脂ゲルに吸着し、０．３Ｍ Ｎ
ａＣｌを含有する同緩衝液（ｐＨ６．０）で溶出する。
−１５ ＧＤＨという）は、下記の理化学的性質及び生
化学的性質を有していた。 ａ）リン酸化１，５−ＡＧに作用する； ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる推定分子量が約６７ｋＤａ
である； ｃ）ゲル濾過法による推定分子量が約５５ｋＤａであ
る； ｄ）１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で
平衡化したＤＥＡＥ型樹脂ゲルに吸着し、０．３Ｍ Ｎ
ａＣｌを含有する同緩衝液（ｐＨ６．０）で溶出する。
【００１６】本発明におけるリン酸化１，５−ＡＧの定
量方法は、リン酸化１，５−アンヒドログルシトール
に、電子受容体の存在下、前記のα−１５ ＧＤＨを作
用させることからなり、その酵素反応を反応式（１）に
示す。
量方法は、リン酸化１，５−アンヒドログルシトール
に、電子受容体の存在下、前記のα−１５ ＧＤＨを作
用させることからなり、その酵素反応を反応式（１）に
示す。
【００１７】
【化１】
【００１８】本発明に使用される電子受容体としては特
に制限はなく、例えば、酸素、フェナジンメトサルフェ
ート（ＰＭＳ）、メトキシ−ＰＭＳ（ｍ-ＰＭＳ）、ジ
クロロフェノールインドフェノール(ＤＣＩＰ）、フェ
ロセン、フェロセン誘導体、ニトロテトラブルーテトラ
ゾリウム塩（ＮＴＢ）、チトクロームＣ、ニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチド（リン酸）酸化型（ＮＡＤ
（Ｐ））、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）などが
例示される。
に制限はなく、例えば、酸素、フェナジンメトサルフェ
ート（ＰＭＳ）、メトキシ−ＰＭＳ（ｍ-ＰＭＳ）、ジ
クロロフェノールインドフェノール(ＤＣＩＰ）、フェ
ロセン、フェロセン誘導体、ニトロテトラブルーテトラ
ゾリウム塩（ＮＴＢ）、チトクロームＣ、ニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチド（リン酸）酸化型（ＮＡＤ
（Ｐ））、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）などが
例示される。
【００１９】本発明の方法を、下記の反応式（２）に示
す例をもってより具体的に説明する。この反応におい
て、リン酸化１，５−ＡＧはα−１５ ＧＤＨの作用に
より酸化されると共に共存するｍ-ＰＭＳは還元され、
生成した還元型ｍ-ＰＭＳでＮＴＢを還元してフォルマ
ザンを生成させて、これを波長５７０ｎｍの吸光度で測
定することにより、リン酸化１，５−ＡＧの定量を行う
ことができる。なお、リン酸化１，５−ＡＧは、例え
ば、下記の反応式（３）、（４）又は（５）に示す方法
を用いて、１，５−ＡＧをリン酸基供与体の存在下でリ
ン酸化することにより生成することができる。反応式
（３）又は（４）に示す酵素反応は公知の反応であり、
従来法に準じて実施することができ、使用される試薬組
成物、反応条件などは従来法に準じて設定することがで
きる。また、反応式（５）に示す反応は、文献(例え
ば、The Journal of Biological Chemistry Vol.269, N
o.26, 17537-17541, 1994; 同誌 Vol.270, No.51, 3045
3-30457, 1995)に記載されているADP-dependent Hexoki
nase(以下、ADP-dependent ＨＫという)を用いる方法
で、本反応では特に効率よく１，５−ＡＧをリン酸化す
ることができることを本発明者らは見出した。
す例をもってより具体的に説明する。この反応におい
て、リン酸化１，５−ＡＧはα−１５ ＧＤＨの作用に
より酸化されると共に共存するｍ-ＰＭＳは還元され、
生成した還元型ｍ-ＰＭＳでＮＴＢを還元してフォルマ
ザンを生成させて、これを波長５７０ｎｍの吸光度で測
定することにより、リン酸化１，５−ＡＧの定量を行う
ことができる。なお、リン酸化１，５−ＡＧは、例え
ば、下記の反応式（３）、（４）又は（５）に示す方法
を用いて、１，５−ＡＧをリン酸基供与体の存在下でリ
ン酸化することにより生成することができる。反応式
（３）又は（４）に示す酵素反応は公知の反応であり、
従来法に準じて実施することができ、使用される試薬組
成物、反応条件などは従来法に準じて設定することがで
きる。また、反応式（５）に示す反応は、文献(例え
ば、The Journal of Biological Chemistry Vol.269, N
o.26, 17537-17541, 1994; 同誌 Vol.270, No.51, 3045
3-30457, 1995)に記載されているADP-dependent Hexoki
nase(以下、ADP-dependent ＨＫという)を用いる方法
で、本反応では特に効率よく１，５−ＡＧをリン酸化す
ることができることを本発明者らは見出した。
【００２０】
【化２】
【００２１】
【化３】
【００２２】
【化４】
【００２３】
【化５】
【００２４】また、下記の反応式（６）に示される反応
は本発明の他の例を示すもので、この例ではα−１５
ＧＤＨの作用によりリン酸化１，５−ＡＧは酸化される
と共に共存するＤＣＩＰは還元されるので、波長６００
ｎｍの吸光度で測定することにより、リン酸化１，５−
ＡＧの定量を行うことができる。
は本発明の他の例を示すもので、この例ではα−１５
ＧＤＨの作用によりリン酸化１，５−ＡＧは酸化される
と共に共存するＤＣＩＰは還元されるので、波長６００
ｎｍの吸光度で測定することにより、リン酸化１，５−
ＡＧの定量を行うことができる。
【００２５】
【化６】
【００２６】本発明のリン酸化１，５−ＡＧの定量方法
は、適当な緩衝液中で行われ、用いられる酵素の使用量
は、試料中のリン酸化１，５−ＡＧ濃度などに応じて適
宜調整することができる。この酵素反応に使用される試
薬組成物の好ましい例としては、ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝
液（５０ｍＭ， ｐＨ５．５）、０．１ｍＭ ｍ-ＰＭ
Ｓ、０．０１〜２．００ｍＭ ＤＣＩＰ、０．０１〜１
０％ ＢＳＡ、１〜１０ Ｕ／ｍｌ α−１５ＧＤＨなど
が挙げられる。また、１，５−ＡＧをリン酸化する酵素
反応で使用される試薬組成物の好ましい例としては、５
０〜１００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．３）、０．１
〜１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０〜３０ｍＭ ＫＣｌ、２〜
５ｍＭ ＡＴＰ、０．１〜５０ｍＭ ＰＥＰ（フォスホエ
ノールピルビン酸）、１〜２０ Ｕ／ｍｌ ＰＫ（ピルビ
ン酸キナーゼ）、１０〜１０００ Ｕ／ｍｌ ＨＫ（又は
ＧＫ）；又は５０〜１００ｍＭ トリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ８．０）、０．１〜１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０〜
３０ｍＭ ＫＣｌ、２〜１０ｍＭ ＡＤＰ若しくはＣＤ
Ｐ、１〜１０００ Ｕ／ｍｌ ADP-dependent ＨＫなどが
挙げられる。
は、適当な緩衝液中で行われ、用いられる酵素の使用量
は、試料中のリン酸化１，５−ＡＧ濃度などに応じて適
宜調整することができる。この酵素反応に使用される試
薬組成物の好ましい例としては、ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝
液（５０ｍＭ， ｐＨ５．５）、０．１ｍＭ ｍ-ＰＭ
Ｓ、０．０１〜２．００ｍＭ ＤＣＩＰ、０．０１〜１
０％ ＢＳＡ、１〜１０ Ｕ／ｍｌ α−１５ＧＤＨなど
が挙げられる。また、１，５−ＡＧをリン酸化する酵素
反応で使用される試薬組成物の好ましい例としては、５
０〜１００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．３）、０．１
〜１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０〜３０ｍＭ ＫＣｌ、２〜
５ｍＭ ＡＴＰ、０．１〜５０ｍＭ ＰＥＰ（フォスホエ
ノールピルビン酸）、１〜２０ Ｕ／ｍｌ ＰＫ（ピルビ
ン酸キナーゼ）、１０〜１０００ Ｕ／ｍｌ ＨＫ（又は
ＧＫ）；又は５０〜１００ｍＭ トリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ８．０）、０．１〜１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０〜
３０ｍＭ ＫＣｌ、２〜１０ｍＭ ＡＤＰ若しくはＣＤ
Ｐ、１〜１０００ Ｕ／ｍｌ ADP-dependent ＨＫなどが
挙げられる。
【００２７】反応式（１）、（２）及び（６）の基質で
あるリン酸化１，５−ＡＧは、反応式（３）、（４）又
は（５）に示されるように、常法に準じ１，５−ＡＧに
グルコキナーゼ（ＧＫ）、ヘキソキナーゼ（ＨＫ）又は
ADP-dependent ＨＫを作用させることにより生成させる
ことができる。従って、反応式（３）、（４）又は
（５）により、１，５−ＡＧからリン酸化１，５−ＡＧ
を生成させ、ついで反応式（１）、（２）又は（６）に
よりリン酸化１，５−ＡＧを測定することにより１，５
−ＡＧを測定することが可能になる。
あるリン酸化１，５−ＡＧは、反応式（３）、（４）又
は（５）に示されるように、常法に準じ１，５−ＡＧに
グルコキナーゼ（ＧＫ）、ヘキソキナーゼ（ＨＫ）又は
ADP-dependent ＨＫを作用させることにより生成させる
ことができる。従って、反応式（３）、（４）又は
（５）により、１，５−ＡＧからリン酸化１，５−ＡＧ
を生成させ、ついで反応式（１）、（２）又は（６）に
よりリン酸化１，５−ＡＧを測定することにより１，５
−ＡＧを測定することが可能になる。
【００２８】上記の方法に用いるリン酸化酵素ＨＫ(Hex
okinase, EC 2.7.1.1)、ADP-dependent ＨＫ(EC登録な
し)及びＧＫ(Glucokinase, EC 2.7.1.2)は特に限定され
ないが、Alternaria sp., Bacillus sp., Aerobacter a
erogenes, Aspergillus oryzae, Bacillus stearotherm
opilus, Collectotrichum trifolii, Collectotrichum
trunctum, Escherichia coli, Fusarium roseum, Gibbe
rella fujikuroi, Leuconostoc mesenteroides, Saccha
romyces cerevisiae, Pyrococcus furiosusなど微生物
由来の酵素が適する。また、血清などの試料中の１，５
−ＡＧを測定する場合は、特開平５−７６３９７号に示
す試料中のグルコースの消去法を用いることにより、多
量のグルコースを含む血清試料中の１，５−ＡＧを正確
に測定することもできる。なお、血清試料中のグルコー
スの消去に関する方法はこれらに限定されるものではな
い。
okinase, EC 2.7.1.1)、ADP-dependent ＨＫ(EC登録な
し)及びＧＫ(Glucokinase, EC 2.7.1.2)は特に限定され
ないが、Alternaria sp., Bacillus sp., Aerobacter a
erogenes, Aspergillus oryzae, Bacillus stearotherm
opilus, Collectotrichum trifolii, Collectotrichum
trunctum, Escherichia coli, Fusarium roseum, Gibbe
rella fujikuroi, Leuconostoc mesenteroides, Saccha
romyces cerevisiae, Pyrococcus furiosusなど微生物
由来の酵素が適する。また、血清などの試料中の１，５
−ＡＧを測定する場合は、特開平５−７６３９７号に示
す試料中のグルコースの消去法を用いることにより、多
量のグルコースを含む血清試料中の１，５−ＡＧを正確
に測定することもできる。なお、血清試料中のグルコー
スの消去に関する方法はこれらに限定されるものではな
い。
【００２９】
【発明の効果】本発明菌はリン酸化１，５−ＡＧを炭素
源として利用できるので、本発明菌の産生する酵素はリ
ン酸化１，５−ＡＧに作用しリン酸化１，５−ＡＧの酵
素定量、ひいては１，５−ＡＧの酵素定量法に有用であ
る。また、本発明の方法によれば、リン酸化１，５−Ａ
Ｇ及び１，５−ＡＧを簡便にして且つ高精度で定量する
ことができ、更に自動分析装置による測定が可能である
ので、多数の試料を迅速に処理することができるという
効果を奏する。
源として利用できるので、本発明菌の産生する酵素はリ
ン酸化１，５−ＡＧに作用しリン酸化１，５−ＡＧの酵
素定量、ひいては１，５−ＡＧの酵素定量法に有用であ
る。また、本発明の方法によれば、リン酸化１，５−Ａ
Ｇ及び１，５−ＡＧを簡便にして且つ高精度で定量する
ことができ、更に自動分析装置による測定が可能である
ので、多数の試料を迅速に処理することができるという
効果を奏する。
【００３０】
【実施例】以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に
説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもの
ではない。 実施例１菌株の取得 唯一の炭素源としてα−メチル−Ｄ−グルコシドを添加
したＭ９培地寒天プレート（培地１リットル当り、Ｎａ
2ＨＰＯ4 ６ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ３ｇ、ＮａＣｌ３０ｇ、Ｎ
Ｈ4Ｃｌ １ｇ、α−メチル−Ｄ−グルコシド ４ｇ、Ｍ
ｇＳＯ4 １ｍＭ、ＣａＣｌ2 ０．１ｍｌ、寒天１５ｇを
含有）に、日本各地で採取した海水試料を加え、３０℃
で好気的に培養した。コロニーを単離し、下記のグルコ
ースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）活性試験に付し、ＧＤ
Ｈ活性を有するコロニーを選択・分離した。ＧＤＨ活性
試験は、各コロニーの細胞を１０ｍＭ リン酸緩衝液
（３％ＮａＣｌ含有、ｐＨ６．０）で３回洗浄した後、
０．７５ｍＭ ２，６−ジクロロフェノールインドフェ
ノール（ＤＣＩＰ）、０．７５ｍＭ フェナジンメトサ
ルフェート（ＰＭＳ）及び１００ｍＭ α−メチル−Ｄ
−グルコシドを含有する２５ｍＭ トリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ８．０）に加え、ＤＣＩＰの消色を観察し、消色
が認められたコロニーはＧＤＨ活性を有すると判断し
た。その結果、幾つかのＧＤＨ活性を有するコロニーが
見出され、そのうちＧＤＨ活性が特に強い株を単離した
（デレヤ エスピー α-１５株）。
説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもの
ではない。 実施例１菌株の取得 唯一の炭素源としてα−メチル−Ｄ−グルコシドを添加
したＭ９培地寒天プレート（培地１リットル当り、Ｎａ
2ＨＰＯ4 ６ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ３ｇ、ＮａＣｌ３０ｇ、Ｎ
Ｈ4Ｃｌ １ｇ、α−メチル−Ｄ−グルコシド ４ｇ、Ｍ
ｇＳＯ4 １ｍＭ、ＣａＣｌ2 ０．１ｍｌ、寒天１５ｇを
含有）に、日本各地で採取した海水試料を加え、３０℃
で好気的に培養した。コロニーを単離し、下記のグルコ
ースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）活性試験に付し、ＧＤ
Ｈ活性を有するコロニーを選択・分離した。ＧＤＨ活性
試験は、各コロニーの細胞を１０ｍＭ リン酸緩衝液
（３％ＮａＣｌ含有、ｐＨ６．０）で３回洗浄した後、
０．７５ｍＭ ２，６−ジクロロフェノールインドフェ
ノール（ＤＣＩＰ）、０．７５ｍＭ フェナジンメトサ
ルフェート（ＰＭＳ）及び１００ｍＭ α−メチル−Ｄ
−グルコシドを含有する２５ｍＭ トリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ８．０）に加え、ＤＣＩＰの消色を観察し、消色
が認められたコロニーはＧＤＨ活性を有すると判断し
た。その結果、幾つかのＧＤＨ活性を有するコロニーが
見出され、そのうちＧＤＨ活性が特に強い株を単離した
（デレヤ エスピー α-１５株）。
【００３１】実施例２デレヤ エスピー α-１５株の培養 上記の菌株を、１リットル当り１０ｇポリペプトン、１
ｇ酵母抽出物、３０ｇＮａＣｌ、２ｇ Ｋ2ＨＰＯ4、１
０ｇ α−メチル−Ｄ−グルコシドを含有する培地(ｐＨ
７．０)中で、３０℃にて１２〜４８時間好気的に培養
した。培養細胞を分離し、３％ ＮａＣｌを含有する１
０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液(ｐＨ６．０)で洗浄し
た。１リットルの培養液から約１０ｇ(湿潤重量)の細胞
を得た。
ｇ酵母抽出物、３０ｇＮａＣｌ、２ｇ Ｋ2ＨＰＯ4、１
０ｇ α−メチル−Ｄ−グルコシドを含有する培地(ｐＨ
７．０)中で、３０℃にて１２〜４８時間好気的に培養
した。培養細胞を分離し、３％ ＮａＣｌを含有する１
０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液(ｐＨ６．０)で洗浄し
た。１リットルの培養液から約１０ｇ(湿潤重量)の細胞
を得た。
【００３２】実施例３酵素（α−１５ ＧＤＨ）の分離・精製 後期対数期にある上記の培養細胞をフレンチプレス（１
５００ｋｇｆ）で粉砕した後、超遠心（４℃、６９８０
０×ｇ、９０分間）して上清の水溶性画分（１０ｍＭ
リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．０）を分離した。この
画分に硫酸アンモニウムを３０％となるように添加して
析出物を廃棄し、水溶液は１０ｍＭ リン酸カリウム緩
衝液（ｐＨ６．０）を用いて透析した。透析後の水溶液
は、ＤＥＡＥ−トヨパールカラム（内径２２ｍｍ×２０
ｃｍ）に付し、更に１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液
（ｐＨ６．０）で平衡化したＤＥＡＥ−５ＰＷカラム
（内径５ｍｍ×５ｃｍ）に付した。０〜０．４５Ｍ Ｎ
ａＣｌを含有する１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐ
Ｈ６．０）を用いた直線勾配法で溶出したところ、目的
物質は０．３Ｍ ＮａＣｌにて溶出した。溶出液を、
０．３Ｍ ＮａＣｌを含有する１０ｍＭ リン酸カリウム
緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したＴＳＫｇｅｌ Ｇ３
０００カラム（内径８ｍｍ×３０ｃｍ）に付し、ＧＤＨ
活性画分を分離して本発明の酵素を含む溶液を得た。得
られた酵素液を、８−２５％ポリアクリルアミド勾配ゲ
ル（ファルマシア社製、PhastGel gradient 8-25）を用
いたＳＤＳ−電気泳動法（硝酸銀染色）で分子量を測定
したところ、約６７ｋＤａであった。また、前述のＴＳ
Ｋｇｅｌ Ｇ３０００を用いたゲル濾過法で分子量を測
定したところ、約５５ｋＤａであった。なお、分子量標
準として、低分子量スタンダードキット（ファルマシア
社製）を使用した。
５００ｋｇｆ）で粉砕した後、超遠心（４℃、６９８０
０×ｇ、９０分間）して上清の水溶性画分（１０ｍＭ
リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．０）を分離した。この
画分に硫酸アンモニウムを３０％となるように添加して
析出物を廃棄し、水溶液は１０ｍＭ リン酸カリウム緩
衝液（ｐＨ６．０）を用いて透析した。透析後の水溶液
は、ＤＥＡＥ−トヨパールカラム（内径２２ｍｍ×２０
ｃｍ）に付し、更に１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液
（ｐＨ６．０）で平衡化したＤＥＡＥ−５ＰＷカラム
（内径５ｍｍ×５ｃｍ）に付した。０〜０．４５Ｍ Ｎ
ａＣｌを含有する１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐ
Ｈ６．０）を用いた直線勾配法で溶出したところ、目的
物質は０．３Ｍ ＮａＣｌにて溶出した。溶出液を、
０．３Ｍ ＮａＣｌを含有する１０ｍＭ リン酸カリウム
緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したＴＳＫｇｅｌ Ｇ３
０００カラム（内径８ｍｍ×３０ｃｍ）に付し、ＧＤＨ
活性画分を分離して本発明の酵素を含む溶液を得た。得
られた酵素液を、８−２５％ポリアクリルアミド勾配ゲ
ル（ファルマシア社製、PhastGel gradient 8-25）を用
いたＳＤＳ−電気泳動法（硝酸銀染色）で分子量を測定
したところ、約６７ｋＤａであった。また、前述のＴＳ
Ｋｇｅｌ Ｇ３０００を用いたゲル濾過法で分子量を測
定したところ、約５５ｋＤａであった。なお、分子量標
準として、低分子量スタンダードキット（ファルマシア
社製）を使用した。
【００３３】実施例４本発明の酵素（α−１５ ＧＤＨ）を用いたリン酸化
１，５−ＡＧの定量 本発明の酵素の存在下、リン酸化１，５−ＡＧを酸化す
ると共にＤＣＩＰを還元する酵素反応（反応式６）を利
用し、種々の濃度のリン酸化１，５−ＡＧを試料として
検量線を作成した。即ち、本発明の酵素溶液２０μｌと
５０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５）に０．１ｍＭ Ｄ
ＣＩＰ、０．１％ ＢＳＡを含む試薬３００μｌを混和
して３７℃で５分間予備加温した後、生理的食塩水に種
々の濃度のリン酸化１，５−ＡＧを溶解した試料８０μ
ｌを添加して消費されるＤＣＩＰを６００ｎｍの吸光度
で測定した。リン酸化１，５−ＡＧ濃度と吸光度の関係
を図１に示す。図１に示されるように、本発明の酵素を
用いた測定法は良好な直線性を示した。
１，５−ＡＧの定量 本発明の酵素の存在下、リン酸化１，５−ＡＧを酸化す
ると共にＤＣＩＰを還元する酵素反応（反応式６）を利
用し、種々の濃度のリン酸化１，５−ＡＧを試料として
検量線を作成した。即ち、本発明の酵素溶液２０μｌと
５０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５）に０．１ｍＭ Ｄ
ＣＩＰ、０．１％ ＢＳＡを含む試薬３００μｌを混和
して３７℃で５分間予備加温した後、生理的食塩水に種
々の濃度のリン酸化１，５−ＡＧを溶解した試料８０μ
ｌを添加して消費されるＤＣＩＰを６００ｎｍの吸光度
で測定した。リン酸化１，５−ＡＧ濃度と吸光度の関係
を図１に示す。図１に示されるように、本発明の酵素を
用いた測定法は良好な直線性を示した。
【００３４】実施例５本発明の酵素（α−１５ ＧＤＨ）を用いた１，５−Ａ
Ｇの定量 ヘキソキナーゼ（ＨＫ）又はグルコキナーゼ（ＧＫ）を
用いて１，５−ＡＧをリン酸化する酵素反応（反応式
４）と、本発明の酵素を用いてリン酸化１，５−ＡＧを
酸化する酵素反応（反応式２）を組み合わせ、種々の濃
度の１，５−ＡＧを用いて検量線を作成した。即ち、
０．１％トリトンＸ−１００、０．１％ ＢＳＡ、１０
ｍＭ ＭｇＣｌ2、２０ｍＭ ＰＥＰ（フォスホエノール
ピルビン酸）、２０ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＡＴＰ、５０
０ Ｕ／ｍｌ ＨＫ、１０ Ｕ／ｍｌ ＰＫ（ピルビン酸キ
ナーゼ）、１．３ｍＭ ＮＴＢ（ニトロテロラブルーテ
トラゾリウム塩）及び０．１３ｍＭ ｍ-ＰＭＳ（メトキ
シ-フェナジンメトサルフェート）を含む５０ｍＭ トリ
ス-塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）の第一試薬３２０μに
１，５−ＡＧ試料２０μｌを加え、３７℃下で５分間予
備加温した後、０．１％トリトンＸ−１００、０．１％
ＢＳＡ、６０ Ｕ／ｍｌの本発明の酵素を含む５０ｍＭ
トリス-塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）の第二試薬８０μｌ
を加え５分間加温した。その後、５７０ｎｍにおける吸
光度を測定した。図２にその検量線を示す。図２に示さ
れるように、本発明の酵素を用いた測定法は良好な直線
性を示した。
Ｇの定量 ヘキソキナーゼ（ＨＫ）又はグルコキナーゼ（ＧＫ）を
用いて１，５−ＡＧをリン酸化する酵素反応（反応式
４）と、本発明の酵素を用いてリン酸化１，５−ＡＧを
酸化する酵素反応（反応式２）を組み合わせ、種々の濃
度の１，５−ＡＧを用いて検量線を作成した。即ち、
０．１％トリトンＸ−１００、０．１％ ＢＳＡ、１０
ｍＭ ＭｇＣｌ2、２０ｍＭ ＰＥＰ（フォスホエノール
ピルビン酸）、２０ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＡＴＰ、５０
０ Ｕ／ｍｌ ＨＫ、１０ Ｕ／ｍｌ ＰＫ（ピルビン酸キ
ナーゼ）、１．３ｍＭ ＮＴＢ（ニトロテロラブルーテ
トラゾリウム塩）及び０．１３ｍＭ ｍ-ＰＭＳ（メトキ
シ-フェナジンメトサルフェート）を含む５０ｍＭ トリ
ス-塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）の第一試薬３２０μに
１，５−ＡＧ試料２０μｌを加え、３７℃下で５分間予
備加温した後、０．１％トリトンＸ−１００、０．１％
ＢＳＡ、６０ Ｕ／ｍｌの本発明の酵素を含む５０ｍＭ
トリス-塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）の第二試薬８０μｌ
を加え５分間加温した。その後、５７０ｎｍにおける吸
光度を測定した。図２にその検量線を示す。図２に示さ
れるように、本発明の酵素を用いた測定法は良好な直線
性を示した。
【図１】本発明の酵素を用いたリン酸化１，５−ＡＧの
定量における検量線を示す図である。
定量における検量線を示す図である。
【図２】本発明の酵素を用いた１，５−ＡＧの定量にお
ける検量線を示す図である。
ける検量線を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 渡津 吉史 神戸市西区室谷１丁目１−２ 国際試薬株 式会社研究開発センター内
Claims (5)
- 【請求項１】 リン酸化１，５−アンヒドロ−Ｄ−グ
ルシトールに作用する酸化還元酵素を産生するデレヤ属
に属する微生物。 - 【請求項２】 微生物が、デレヤ エスピー α-１５
（ＦＥＲＭ ＢＰ−６１４０）である請求項１記載の微
生物。 - 【請求項３】 下記の理化学的性質及び生化学的性質
を有する酵素。 ａ）リン酸化１，５−アンヒドロ−Ｄ−グルシトールに
作用する； ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる推定分子量が約６７ｋＤａ
である； ｃ）ゲル濾過法による推定分子量が約５５ｋＤａであ
る； ｄ）１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で
平衡化したＤＥＡＥ型樹脂ゲルに吸着し、０．３Ｍ Ｎ
ａＣｌを含有する同緩衝液で溶出する。 - 【請求項４】 リン酸化１，５−アンヒドログルシト
ールに、電子受容体の存在下、請求項３記載の酵素を作
用させることを特徴とするリン酸化１，５−アンヒドロ
グルシトールの定量方法。 - 【請求項５】 １，５−アンヒドログルシトールをリ
ン酸化し、生成したリン酸化１，５−アンヒドログルシ
トールに、電子受容体の存在下、請求項３記載の酵素を
作用させることを特徴とする１，５−アンヒドログルシ
トールの定量方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30364297A JP3929576B2 (ja) | 1996-10-16 | 1997-10-16 | リン酸化１，５−アンヒドログルシトールに作用する酵素を産生する微生物、当該微生物が産生する酵素及びそれを使用したリン酸化１，５−アンヒドログルシトールの定量方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP29568796 | 1996-10-16 | ||
| JP8-295687 | 1996-10-16 | ||
| JP30364297A JP3929576B2 (ja) | 1996-10-16 | 1997-10-16 | リン酸化１，５−アンヒドログルシトールに作用する酵素を産生する微生物、当該微生物が産生する酵素及びそれを使用したリン酸化１，５−アンヒドログルシトールの定量方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10179143A true JPH10179143A (ja) | 1998-07-07 |
| JP3929576B2 JP3929576B2 (ja) | 2007-06-13 |
Family
ID=26560375
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP30364297A Expired - Fee Related JP3929576B2 (ja) | 1996-10-16 | 1997-10-16 | リン酸化１，５−アンヒドログルシトールに作用する酵素を産生する微生物、当該微生物が産生する酵素及びそれを使用したリン酸化１，５−アンヒドログルシトールの定量方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3929576B2 (ja) |
-
1997
- 1997-10-16 JP JP30364297A patent/JP3929576B2/ja not_active Expired - Fee Related
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|---|---|
| JP3929576B2 (ja) | 2007-06-13 |
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