JPH10155479A - １，５−アンヒドログルシトール脱水素酵素、その製造法及びこれを用いる１，５−アンヒドログルシトールの定量法 - Google Patents
１，５−アンヒドログルシトール脱水素酵素、その製造法及びこれを用いる１，５−アンヒドログルシトールの定量法Info
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- JPH10155479A JPH10155479A JP8323969A JP32396996A JPH10155479A JP H10155479 A JPH10155479 A JP H10155479A JP 8323969 A JP8323969 A JP 8323969A JP 32396996 A JP32396996 A JP 32396996A JP H10155479 A JPH10155479 A JP H10155479A
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 次の理化学的性質を有する1,5-アンヒド
ログルシトール（1,5-AG）脱水素酵素、その製造法及び
当該酵素を用いる1,5-AGの定量法。 (1)作用：電子キャリアー非存在下において、1,5-AGに
特異的に作用して２位の水酸基を酸化すると共に直接還
元性発色剤を還元する反応を触媒する。 (2)基質特異性：1,5-AGに強く、L-ソルボースに弱く、D
-グルコースに若干作用する。 (3)至適pH：8.0〜9.0付近。 (4)pH安定性：pH7.0〜9.0にて安定。 (5)至適温度：35〜40℃付近。 (6)温度安定性：40℃付近まで90％以上安定。 (7)電子受容体：2,6-ジクロロフェノールインドフェノ
ール、フェリシアン化合物等のほか、還元性発色剤も利
用できるが、NAD、NADP等の補酵素や溶存酵素は利用で
きない。 (8)分子量：約55,000（SDS-PAGE法）。 【効果】 試料中の1,5-AGを簡便にかつ高い精度で測定
でき、特に糖尿病等の診断に極めて有用である。
ログルシトール（1,5-AG）脱水素酵素、その製造法及び
当該酵素を用いる1,5-AGの定量法。 (1)作用：電子キャリアー非存在下において、1,5-AGに
特異的に作用して２位の水酸基を酸化すると共に直接還
元性発色剤を還元する反応を触媒する。 (2)基質特異性：1,5-AGに強く、L-ソルボースに弱く、D
-グルコースに若干作用する。 (3)至適pH：8.0〜9.0付近。 (4)pH安定性：pH7.0〜9.0にて安定。 (5)至適温度：35〜40℃付近。 (6)温度安定性：40℃付近まで90％以上安定。 (7)電子受容体：2,6-ジクロロフェノールインドフェノ
ール、フェリシアン化合物等のほか、還元性発色剤も利
用できるが、NAD、NADP等の補酵素や溶存酵素は利用で
きない。 (8)分子量：約55,000（SDS-PAGE法）。 【効果】 試料中の1,5-AGを簡便にかつ高い精度で測定
でき、特に糖尿病等の診断に極めて有用である。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、新規な1,5-アンヒ
ドログルシトール脱水素酵素及びその製造法、並びに当
該酵素を用いた、簡便かつ高精度で糖尿病等の診断に有
用な、1,5-アンヒドログルシトールの定量法に関する。
ドログルシトール脱水素酵素及びその製造法、並びに当
該酵素を用いた、簡便かつ高精度で糖尿病等の診断に有
用な、1,5-アンヒドログルシトールの定量法に関する。
【０００２】
【従来の技術】1,5-アンヒドログルシトール（以下、
「1,5-AG」という）は、ある種の疾患、特に糖尿病にお
いて、血清、血漿、尿等の体液中の量が大きく変動する
ことから、有用な診断指標として近年臨床において重要
な検査項目となりつつある。この1,5-AGの定量法として
は、ピラノースオキシダーゼを作用させて、生成する過
酸化水素をパーオキシダーゼ発色系にて比色定量する方
法（特公平5-41238号公報）が主流となり、近年、汎用
の自動分析装置に応用されている。他の方法としては、
1,5-AG酸化能を有する酸化酵素を作用させ、酸素の消費
量や電子受容体の還元体もしくは酸化された1,5-AG反応
生成物を測定する方法などが挙げられる。
「1,5-AG」という）は、ある種の疾患、特に糖尿病にお
いて、血清、血漿、尿等の体液中の量が大きく変動する
ことから、有用な診断指標として近年臨床において重要
な検査項目となりつつある。この1,5-AGの定量法として
は、ピラノースオキシダーゼを作用させて、生成する過
酸化水素をパーオキシダーゼ発色系にて比色定量する方
法（特公平5-41238号公報）が主流となり、近年、汎用
の自動分析装置に応用されている。他の方法としては、
1,5-AG酸化能を有する酸化酵素を作用させ、酸素の消費
量や電子受容体の還元体もしくは酸化された1,5-AG反応
生成物を測定する方法などが挙げられる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、ヒト由
来の被検体、例えば血清中の1,5-AGの濃度レベルは低
く、糖尿病患者においては更に低値化することから、ピ
ラノースオキシダーゼを用いたパーオキシダーゼ発色系
では、感度の面で十分なものとはいい難い。また、電子
受容体を利用する酸化還元酵素を用いて、その還元体を
測定する方法においても、電子受容体である2,6-ジクロ
ロフェノールインドフェノール、フェリシアン化合物等
の還元体自身が不安定であることや、感度の面で十分な
ものとはいえず、多数検体処理のための汎用の自動分析
装置への応用が困難であることなどの問題点がある。
来の被検体、例えば血清中の1,5-AGの濃度レベルは低
く、糖尿病患者においては更に低値化することから、ピ
ラノースオキシダーゼを用いたパーオキシダーゼ発色系
では、感度の面で十分なものとはいい難い。また、電子
受容体を利用する酸化還元酵素を用いて、その還元体を
測定する方法においても、電子受容体である2,6-ジクロ
ロフェノールインドフェノール、フェリシアン化合物等
の還元体自身が不安定であることや、感度の面で十分な
ものとはいえず、多数検体処理のための汎用の自動分析
装置への応用が困難であることなどの問題点がある。
【０００４】従って、1,5-AGを簡便に精度よく測定で
き、かつ汎用の自動分析装置への応用も容易な1,5-AGの
定量方法の開発が望まれていた。
き、かつ汎用の自動分析装置への応用も容易な1,5-AGの
定量方法の開発が望まれていた。
【０００５】
【課題を解決するための手段】かかる実情において、本
発明者らは、1,5-AGの分析に利用できる反応系について
検討すると共に、それらに利用できる酵素について探索
を行った。その結果、アグロバクテリウム（Agrobacter
ium）属に属する微生物の膜画分中に、1,5-AGを特異的
に酸化する新規な酵素（以下「1,5-AG脱水素酵素」とい
う）が存在することを見出した。そして、この1,5-AG脱
水素酵素を1,5-AGに作用させると、1,5-AGの２位の水酸
基を酸化すると共に2,6-ジクロロフェノールインドフェ
ノールなどの電子受容体を還元させる反応を触媒するこ
と、及び当該反応を還元性発色剤を用いて行うと電子キ
ャリアーの非存在下においても1,5-AGの２位水酸基を酸
化すると共に直接還元性発色剤を還元し発色物質を生成
させることを見出し、本発明を完成した。
発明者らは、1,5-AGの分析に利用できる反応系について
検討すると共に、それらに利用できる酵素について探索
を行った。その結果、アグロバクテリウム（Agrobacter
ium）属に属する微生物の膜画分中に、1,5-AGを特異的
に酸化する新規な酵素（以下「1,5-AG脱水素酵素」とい
う）が存在することを見出した。そして、この1,5-AG脱
水素酵素を1,5-AGに作用させると、1,5-AGの２位の水酸
基を酸化すると共に2,6-ジクロロフェノールインドフェ
ノールなどの電子受容体を還元させる反応を触媒するこ
と、及び当該反応を還元性発色剤を用いて行うと電子キ
ャリアーの非存在下においても1,5-AGの２位水酸基を酸
化すると共に直接還元性発色剤を還元し発色物質を生成
させることを見出し、本発明を完成した。
【０００６】すなわち本発明は、次の理化学的性質を有
する1,5-AG脱水素酵素を提供するものである。
する1,5-AG脱水素酵素を提供するものである。
【０００７】(1) 作用：電子キャリアー非存在下におい
て、1,5-アンヒドログルシトールに特異的に作用して２
位の水酸基を酸化するとともに直接還元性発色剤を還元
する反応を触媒する作用を有する。
て、1,5-アンヒドログルシトールに特異的に作用して２
位の水酸基を酸化するとともに直接還元性発色剤を還元
する反応を触媒する作用を有する。
【０００８】(2) 基質特異性：1,5-アンヒドログルシト
ールに強く作用し、L-ソルボースに弱く作用する。ま
た、D-グルコースに若干作用する。
ールに強く作用し、L-ソルボースに弱く作用する。ま
た、D-グルコースに若干作用する。
【０００９】(3) 至適pH：至適pHは8.0〜9.0付近にあ
る。
る。
【００１０】(4) pH安定性：pH7.0〜9.0にて安定であ
る。
る。
【００１１】(5) 至適温度：至適温度は35〜40℃付近に
ある。
ある。
【００１２】(6) 温度安定性：40℃付近まで90％以上安
定である。
定である。
【００１３】(7) 電子受容体：2,6-ジクロロフェノール
インドフェノール、フェリシアン化合物等のほか、還元
性発色剤も利用できる。またNAD、NADP等の補酵素や溶
存酵素は利用できない。
インドフェノール、フェリシアン化合物等のほか、還元
性発色剤も利用できる。またNAD、NADP等の補酵素や溶
存酵素は利用できない。
【００１４】(8) 分子量：ドデシル硫酸−ポリアクリル
アミド電気泳動法による分子量は、約55,000である。
アミド電気泳動法による分子量は、約55,000である。
【００１５】また、本発明は、アグロバクテリウム属に
属し、1,5-AG脱水素酵素生産能を有する微生物を栄養培
地に培養し、膜画分中に1,5-AG脱水素酵素を生成蓄積せ
しめ、これを採取することを特徴とする1,5-AG脱水素酵
素の製造法を提供するものである。
属し、1,5-AG脱水素酵素生産能を有する微生物を栄養培
地に培養し、膜画分中に1,5-AG脱水素酵素を生成蓄積せ
しめ、これを採取することを特徴とする1,5-AG脱水素酵
素の製造法を提供するものである。
【００１６】更に本発明は、還元性発色剤の存在下、1,
5-アンヒドログルシトールを含む試料に上記1,5-AG脱水
素酵素を作用せしめ、生成する還元された発色物質を測
定することを特徴とする1,5-AGの定量法を提供するもの
である。
5-アンヒドログルシトールを含む試料に上記1,5-AG脱水
素酵素を作用せしめ、生成する還元された発色物質を測
定することを特徴とする1,5-AGの定量法を提供するもの
である。
【００１７】
【発明の実施の形態】従来、アグロバクテリウム属に属
する微生物中からは、Hayanoら（ジャーナル・オブ・バ
イオロジカル・ケミストリー，242巻，3665-3672，1967
年）によって細胞質画分中にグルコシド-3-デヒドロゲ
ナーゼの存在が確認され、別に、Takeuchiら（ジャーナ
ル・オブ・バイオケミストリー，100巻，1049-1055，19
86年）によって1,5-AGがグルコシド-3-デヒドロゲナー
ゼの基質となり得ることが報告されている。また、シュ
ードモナス属に属する菌株からは、NAKAMURAら（ジャー
ナル・オブ・バイオケミストリー，99巻，607-613，198
6年）によって膜画分に電子受容体の存在下の場合の
み、1,5-AGを1,5-アンヒドロ-D-フルクトースに変換す
るとともに酸素を消費する酸化活性をもつ酵素が報告さ
れている。
する微生物中からは、Hayanoら（ジャーナル・オブ・バ
イオロジカル・ケミストリー，242巻，3665-3672，1967
年）によって細胞質画分中にグルコシド-3-デヒドロゲ
ナーゼの存在が確認され、別に、Takeuchiら（ジャーナ
ル・オブ・バイオケミストリー，100巻，1049-1055，19
86年）によって1,5-AGがグルコシド-3-デヒドロゲナー
ゼの基質となり得ることが報告されている。また、シュ
ードモナス属に属する菌株からは、NAKAMURAら（ジャー
ナル・オブ・バイオケミストリー，99巻，607-613，198
6年）によって膜画分に電子受容体の存在下の場合の
み、1,5-AGを1,5-アンヒドロ-D-フルクトースに変換す
るとともに酸素を消費する酸化活性をもつ酵素が報告さ
れている。
【００１８】しかしながら、1,5-AGに特異的で、電子キ
ャリアー非存在下で1,5-AGを酸化し直接還元性発色剤を
還元する代謝酵素の存在は未だ報告されていない。すな
わち、本発明酵素の作用を式に示すと次のとおりである
が、このような作用を示す酵素は未だ知られておらず新
規なものである。
ャリアー非存在下で1,5-AGを酸化し直接還元性発色剤を
還元する代謝酵素の存在は未だ報告されていない。すな
わち、本発明酵素の作用を式に示すと次のとおりである
が、このような作用を示す酵素は未だ知られておらず新
規なものである。
【００１９】
【数１】
【００２０】本発明の酵素の生産に用いられる微生物と
しては、アグロバクテリウム属に属し、1,5-AG脱水素酵
素を生産するものであればいずれの菌株でもよいが、好
適な例としては、財団法人発酵研究所に寄託され、分譲
可能な公知菌株であるアグロバクテリウム・ツメファシ
エンスIFO13532、アグロバクテリウム・ツメファシエン
スIFO13533等が挙げられる。
しては、アグロバクテリウム属に属し、1,5-AG脱水素酵
素を生産するものであればいずれの菌株でもよいが、好
適な例としては、財団法人発酵研究所に寄託され、分譲
可能な公知菌株であるアグロバクテリウム・ツメファシ
エンスIFO13532、アグロバクテリウム・ツメファシエン
スIFO13533等が挙げられる。
【００２１】上記菌体を培養する培地としては、炭素
源、無機窒素源及び無機塩を含む培地が用いられる。炭
素源としては基本的に糖類を利用し、L-ソルボース、グ
ルコース等を酵素誘導するものであればいずれも使用で
きる。無機窒素源としては硫酸アンモニウム、塩化アン
モニウム、リン酸アンモニウム等が、無機塩としてはナ
トリウム、カリウム、マグネシウム、鉄、マンガン等の
塩類が使用できる。
源、無機窒素源及び無機塩を含む培地が用いられる。炭
素源としては基本的に糖類を利用し、L-ソルボース、グ
ルコース等を酵素誘導するものであればいずれも使用で
きる。無機窒素源としては硫酸アンモニウム、塩化アン
モニウム、リン酸アンモニウム等が、無機塩としてはナ
トリウム、カリウム、マグネシウム、鉄、マンガン等の
塩類が使用できる。
【００２２】培養は、振とう、通気撹拌等の方法による
好気的条件下で行うのががよく、pH６〜８、25〜35℃で
行うのが好ましい。培養期間は１〜７日間、通常は２〜
４日間で完了する。上記方法で培養することにより、主
に菌体の膜画分中に1,5-AG脱水素酵素が生成蓄積され
る。
好気的条件下で行うのががよく、pH６〜８、25〜35℃で
行うのが好ましい。培養期間は１〜７日間、通常は２〜
４日間で完了する。上記方法で培養することにより、主
に菌体の膜画分中に1,5-AG脱水素酵素が生成蓄積され
る。
【００２３】培養後、微生物中から本発明酵素を取得す
るには、適当な緩衝液中で菌体をダイノミル、超音波処
理等により破壊し、その処理液から膜画分を超遠心等に
より分離する。次いでトリトンX-100等の非イオン界面
活性剤により膜画分から酵素を遊離させ、不溶分を遠心
分離により除去すると、1,5-AG脱水素酵素含有抽出液を
得ることができる。精製酵素は、この抽出液を、疎水ク
ロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ヒ
ドロキシアパタイト、ゲル濾過等の酵素の精製に一般的
に使われている技術を適宜組み合せて精製することによ
り得られる。
るには、適当な緩衝液中で菌体をダイノミル、超音波処
理等により破壊し、その処理液から膜画分を超遠心等に
より分離する。次いでトリトンX-100等の非イオン界面
活性剤により膜画分から酵素を遊離させ、不溶分を遠心
分離により除去すると、1,5-AG脱水素酵素含有抽出液を
得ることができる。精製酵素は、この抽出液を、疎水ク
ロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ヒ
ドロキシアパタイト、ゲル濾過等の酵素の精製に一般的
に使われている技術を適宜組み合せて精製することによ
り得られる。
【００２４】次に、微生物としてアグロバクテリウム・
ツメファシエンスIFO13533を用いて得られた本発明の1,
5-AG脱水素酵素の性質を示す。なお、以下における1,5-
AG脱水素酵素の活性は、次の方法で測定した。
ツメファシエンスIFO13533を用いて得られた本発明の1,
5-AG脱水素酵素の性質を示す。なお、以下における1,5-
AG脱水素酵素の活性は、次の方法で測定した。
【００２５】〈酵素活性測定法〉0.2Mリン酸カリウム緩
衝液（pH8.0）1.5ml、0.25重量％ニトロテトラゾリウム
ブルー 0.3ml、２重量％トリトンX-100 0.3ml、50mM 1,
5-AG水溶液0.3ml、水0.45ml、及び酵素溶液0.15mlより
成る全量3.0mlの酵素含有液を37℃で反応させ、540nmに
おける吸光度変化（ΔmOD/min）を測定する。この条件
下で生成するホルマザン色素の分子吸光係数を16.7×10
3とし、１分間に１μmolのホルマザンを生成する酵素量
を１単位（unit）として、1,5-AG脱水素酵素の活性を次
式に従って求めた。
衝液（pH8.0）1.5ml、0.25重量％ニトロテトラゾリウム
ブルー 0.3ml、２重量％トリトンX-100 0.3ml、50mM 1,
5-AG水溶液0.3ml、水0.45ml、及び酵素溶液0.15mlより
成る全量3.0mlの酵素含有液を37℃で反応させ、540nmに
おける吸光度変化（ΔmOD/min）を測定する。この条件
下で生成するホルマザン色素の分子吸光係数を16.7×10
3とし、１分間に１μmolのホルマザンを生成する酵素量
を１単位（unit）として、1,5-AG脱水素酵素の活性を次
式に従って求めた。
【００２６】
【数２】
【００２７】〈理化学的性質〉 (1) 作用：１mM 2,6-ジクロロフェノールインドフェノ
ール及び2.5mM 1,5-AGを含有する100mMトリス・塩酸緩
衝液（pH9.0）に本発明酵素を添加し、37℃で反応させ
経時的に反応液中の生成物と反応のモルバランスを表１
に示す条件でHPLCにて分析した。
ール及び2.5mM 1,5-AGを含有する100mMトリス・塩酸緩
衝液（pH9.0）に本発明酵素を添加し、37℃で反応させ
経時的に反応液中の生成物と反応のモルバランスを表１
に示す条件でHPLCにて分析した。
【００２８】
【表１】
【００２９】その結果、反応の進行とともにリテンショ
ンタイム10.0分の1,5-AGのピークが減少し、新たにリテ
ンションタイム9.6分の位置に反応物のピークが現れ
た。この反応のモルバランスは一致していた。また、1,
5-AGの３位の水酸基を酸化する作用を持つグルコシド-3
-デヒドロゲナーゼ（EC 1.1.99.13）を同様の条件で反
応させ、HPLCで分析した結果、1,5-AGのピーク減少とと
もに、新たにリテンションタイム10.8分の位置に反応物
のピークが現れた。一方、1,5-AGの２位の水酸基を酸化
する作用を持つピラノースオキシダーゼ（EC 1.1.3.1
0）を、2.5mM 1,5-AGを含有する40mMホウ酸緩衝液（pH
7.5）に添加し、37℃で反応させた結果、1,5-AGのピー
ク減少とともに、新たにリテンションタイム9.6分の位
置に反応物のピークが現れた。これらの結果において、
1,5-AGに本発明酵素を作用させた場合の反応生成物とピ
ラノースオキシダーゼを作用させた場合の反応生成物の
リテンションタイムが一致していることから、本発明酵
素による1,5-AGの酸化部位は２位の水酸基であることが
分かる。
ンタイム10.0分の1,5-AGのピークが減少し、新たにリテ
ンションタイム9.6分の位置に反応物のピークが現れ
た。この反応のモルバランスは一致していた。また、1,
5-AGの３位の水酸基を酸化する作用を持つグルコシド-3
-デヒドロゲナーゼ（EC 1.1.99.13）を同様の条件で反
応させ、HPLCで分析した結果、1,5-AGのピーク減少とと
もに、新たにリテンションタイム10.8分の位置に反応物
のピークが現れた。一方、1,5-AGの２位の水酸基を酸化
する作用を持つピラノースオキシダーゼ（EC 1.1.3.1
0）を、2.5mM 1,5-AGを含有する40mMホウ酸緩衝液（pH
7.5）に添加し、37℃で反応させた結果、1,5-AGのピー
ク減少とともに、新たにリテンションタイム9.6分の位
置に反応物のピークが現れた。これらの結果において、
1,5-AGに本発明酵素を作用させた場合の反応生成物とピ
ラノースオキシダーゼを作用させた場合の反応生成物の
リテンションタイムが一致していることから、本発明酵
素による1,5-AGの酸化部位は２位の水酸基であることが
分かる。
【００３０】(2) 基質特異性：前述の酵素活性測定法に
おいて、1,5-AGの代わりに各種糖溶液（いずれも終濃度
５mM）を用いた場合の相対反応性（基質特異性）を表２
に示す。本発明酵素は1,5-AGに対して強く、L-ソルボー
スに対しては弱く作用し、D-グルコースに若干作用し
た。
おいて、1,5-AGの代わりに各種糖溶液（いずれも終濃度
５mM）を用いた場合の相対反応性（基質特異性）を表２
に示す。本発明酵素は1,5-AGに対して強く、L-ソルボー
スに対しては弱く作用し、D-グルコースに若干作用し
た。
【００３１】
【表２】
【００３２】(3) 至適pH：本発明酵素を用いて、前述の
酵素活性測定法中における緩衝液の代わりに、種々のpH
を有するクエン酸緩衝液、リン酸カリウム緩衝液、トリ
ス−塩酸緩衝液及びグリシン緩衝液を用いた場合の酵素
活性を測定した。この結果を図１に示す。図１より、本
発明酵素の至適pHは8.0〜9.0付近にあることが分かる。
酵素活性測定法中における緩衝液の代わりに、種々のpH
を有するクエン酸緩衝液、リン酸カリウム緩衝液、トリ
ス−塩酸緩衝液及びグリシン緩衝液を用いた場合の酵素
活性を測定した。この結果を図１に示す。図１より、本
発明酵素の至適pHは8.0〜9.0付近にあることが分かる。
【００３３】(4) pH安定性：種々のpHを有するクエン酸
緩衝液、リン酸カリウム緩衝液、トリス−塩酸緩衝液及
びグリシン緩衝液（各緩衝液とも200mM）に本発明酵素
を添加し、37℃で60分間処理後、残存酵素活性を測定し
た。この結果を図２に示す。図２より、本発明酵素の安
定pH範囲は7.0〜9.0であることが分かる。
緩衝液、リン酸カリウム緩衝液、トリス−塩酸緩衝液及
びグリシン緩衝液（各緩衝液とも200mM）に本発明酵素
を添加し、37℃で60分間処理後、残存酵素活性を測定し
た。この結果を図２に示す。図２より、本発明酵素の安
定pH範囲は7.0〜9.0であることが分かる。
【００３４】(5) 至適温度：本発明酵素を用いて、前述
の酵素活性測定法における組成で、種々の温度で10分間
反応させた。この結果を図３に示す。図３より、本発明
酵素の至適温度は35〜40℃付近であることが分かる。
の酵素活性測定法における組成で、種々の温度で10分間
反応させた。この結果を図３に示す。図３より、本発明
酵素の至適温度は35〜40℃付近であることが分かる。
【００３５】(6) 温度安定性：本発明酵素を20mMリン酸
カリウム緩衝液に添加し、種々の温度で10分間処理後、
残存酵素活性を測定した。この結果を図４に示す。図４
より、本発明酵素は40℃付近まで90％以上安定であるこ
とが分かる。
カリウム緩衝液に添加し、種々の温度で10分間処理後、
残存酵素活性を測定した。この結果を図４に示す。図４
より、本発明酵素は40℃付近まで90％以上安定であるこ
とが分かる。
【００３６】(7) 電子受容体：100mMリン酸カリウム緩
衝液（pH8.0）中に、本発明酵素とともに種々の電子受
容体を共存させた場合の、各電子受容体での活性を相対
活性で表した。表３より、2,6-ジクロロフェノールイン
ドフェノール及びフェリシアン化合物が電子受容体とし
ての活性が高いが、ニトロテトラゾリウムブルーについ
ては電子キャリアー非存在下においても電子受容体とな
り得ることが分かる。
衝液（pH8.0）中に、本発明酵素とともに種々の電子受
容体を共存させた場合の、各電子受容体での活性を相対
活性で表した。表３より、2,6-ジクロロフェノールイン
ドフェノール及びフェリシアン化合物が電子受容体とし
ての活性が高いが、ニトロテトラゾリウムブルーについ
ては電子キャリアー非存在下においても電子受容体とな
り得ることが分かる。
【００３７】
【表３】
【００３８】(8) 分子量：ドデシル硫酸−ポリアクリル
アミド電気泳動法により求めた本発明酵素の分子量は、
約55,000であった。
アミド電気泳動法により求めた本発明酵素の分子量は、
約55,000であった。
【００３９】(9) 等電点：クロマトフォーカシングカラ
ム（ファルマシア社製）を用いた本発明酵素の等電点
は、約4.0であった。
ム（ファルマシア社製）を用いた本発明酵素の等電点
は、約4.0であった。
【００４０】(10) Km値：ラインウイバーバーク（Linew
eaver-Burk）プロットにより、本発明酵素の1,5-AGに対
するKm値を求めた結果、約1.0mMであった。
eaver-Burk）プロットにより、本発明酵素の1,5-AGに対
するKm値を求めた結果、約1.0mMであった。
【００４１】本発明の1,5-AGの定量法は、上記本発明の
1,5-AG脱水素酵素を用い、次の如くして行われる。すな
わち、被検体を還元性発色剤の存在下、1,5-AG脱水素酵
素又はこれを含有する酵素製剤とともにインキュベート
し、2-ケト-1,5-AG及び還元された発色物質を生成せし
め、生成した発色物質量を測定することにより、被検体
中の1,5-AG量を定量することができる。
1,5-AG脱水素酵素を用い、次の如くして行われる。すな
わち、被検体を還元性発色剤の存在下、1,5-AG脱水素酵
素又はこれを含有する酵素製剤とともにインキュベート
し、2-ケト-1,5-AG及び還元された発色物質を生成せし
め、生成した発色物質量を測定することにより、被検体
中の1,5-AG量を定量することができる。
【００４２】本発明の定量法に使用できる緩衝液として
はpH６〜10のリン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、グッド
緩衝液、ホウ酸緩衝液等、通常使用されるものであれば
いずれも使用可能である。
はpH６〜10のリン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、グッド
緩衝液、ホウ酸緩衝液等、通常使用されるものであれば
いずれも使用可能である。
【００４３】還元性発色剤としては、テトラゾリウム又
はその塩が挙げられるが、具体的には、ニトロテトラゾ
リウムブルー（以下NTBと略す）、2-(4-ヨードフェニ
ル)-3-(4-ニトロフェニル)-5-フェニル-2Hテトラゾリウ
ムクロライド、3-(4,5-ジメチル-2-チアゾリル)-2,5-ジ
フェニル-2Hテトラゾリウムブロマイド、2-(4-ヨードフ
ェニル)-3-(4-ニトロフェニル)-5-(2,4-ジスルホフェニ
ル)-2Hテトラゾリウム塩（以下WST-1と略す）等が利用
でき、その使用濃度は、50〜2000μmol/l、特に100〜10
00μmol/lの範囲が好ましい。
はその塩が挙げられるが、具体的には、ニトロテトラゾ
リウムブルー（以下NTBと略す）、2-(4-ヨードフェニ
ル)-3-(4-ニトロフェニル)-5-フェニル-2Hテトラゾリウ
ムクロライド、3-(4,5-ジメチル-2-チアゾリル)-2,5-ジ
フェニル-2Hテトラゾリウムブロマイド、2-(4-ヨードフ
ェニル)-3-(4-ニトロフェニル)-5-(2,4-ジスルホフェニ
ル)-2Hテトラゾリウム塩（以下WST-1と略す）等が利用
でき、その使用濃度は、50〜2000μmol/l、特に100〜10
00μmol/lの範囲が好ましい。
【００４４】本発明の定量法においては、1,5-AG脱水素
酵素は20〜10,000単位／リットル、特に200〜2,000単位
／リットルの範囲で使用するのが好ましい。
酵素は20〜10,000単位／リットル、特に200〜2,000単位
／リットルの範囲で使用するのが好ましい。
【００４５】本発明の定量法が適用できる試料として
は、1,5-アンヒドログルシトールを含む血清、血漿、尿
等の生体由来の試料が挙げられる。
は、1,5-アンヒドログルシトールを含む血清、血漿、尿
等の生体由来の試料が挙げられる。
【００４６】反応液中の還元された発色性物質の測定
は、上記の如くして反応せしめた後、発色物質特有の吸
収波長において、一定時間後の吸光度あるいは一定時間
内の吸光度変化を測定することにより行うことができ
る。
は、上記の如くして反応せしめた後、発色物質特有の吸
収波長において、一定時間後の吸光度あるいは一定時間
内の吸光度変化を測定することにより行うことができ
る。
【００４７】
【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４８】実施例１ 〔アグロバクテリウム・ツメフ
ァシエンスIFO13533由来1,5-AG脱水素酵素の取得〕 リン酸二カリウム２％、リン酸一カリウム0.5％、塩化
カリウム0.75％、塩化ナトリウム2.5％、塩化アンモニ
ウム1.25％、硫酸ナトリウム0.025％、硫酸マグネシウ
ム0.005％及びL-ソルボース0.1％より成る培地（pH7.
0）50mlを200ml容の培養フラスコに添加し、120℃で15
分間殺菌後冷却し、アグロバクテリウム・ツメファシエ
ンスIFO13533を１白金耳接種し、30℃で３日間振とう培
養して種培養液とした。得られた種培養液10mlを、２リ
ットル培養フラスコ中、上記と同じ組成の液体培地1000
mlに接種し、30℃で３日間振とう培養した。培養終了
後、遠心分離して菌体を回収した。得られた菌体量は培
養液１リットル当たり約２ｇであった。得られた菌体を
１ｇ当たり2.5mlの20mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.2）
に懸濁させ、超音波ホモジナイザーにより、菌体を細断
した。得られた破砕液を10,000ｇで遠心分離し、その上
清を更に100,000ｇで遠心分離して膜画分を得た。膜画
分１ｇ当たり10mlの１％トリトンX-100含有20mMリン酸
カリウム緩衝液（pH7.2）で懸濁させ、撹拌しながら一
晩膜画分から酵素の可溶化を行った。得られた可溶化液
を再度100,000ｇで遠心分離して膜残渣を除き、粗酵素
液を得た。この粗酵素液の酵素活性を前述の測定法に基
づいて測定したところ、菌体１ｇ当たり0.5単位の活性
が得られた。
ァシエンスIFO13533由来1,5-AG脱水素酵素の取得〕 リン酸二カリウム２％、リン酸一カリウム0.5％、塩化
カリウム0.75％、塩化ナトリウム2.5％、塩化アンモニ
ウム1.25％、硫酸ナトリウム0.025％、硫酸マグネシウ
ム0.005％及びL-ソルボース0.1％より成る培地（pH7.
0）50mlを200ml容の培養フラスコに添加し、120℃で15
分間殺菌後冷却し、アグロバクテリウム・ツメファシエ
ンスIFO13533を１白金耳接種し、30℃で３日間振とう培
養して種培養液とした。得られた種培養液10mlを、２リ
ットル培養フラスコ中、上記と同じ組成の液体培地1000
mlに接種し、30℃で３日間振とう培養した。培養終了
後、遠心分離して菌体を回収した。得られた菌体量は培
養液１リットル当たり約２ｇであった。得られた菌体を
１ｇ当たり2.5mlの20mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.2）
に懸濁させ、超音波ホモジナイザーにより、菌体を細断
した。得られた破砕液を10,000ｇで遠心分離し、その上
清を更に100,000ｇで遠心分離して膜画分を得た。膜画
分１ｇ当たり10mlの１％トリトンX-100含有20mMリン酸
カリウム緩衝液（pH7.2）で懸濁させ、撹拌しながら一
晩膜画分から酵素の可溶化を行った。得られた可溶化液
を再度100,000ｇで遠心分離して膜残渣を除き、粗酵素
液を得た。この粗酵素液の酵素活性を前述の測定法に基
づいて測定したところ、菌体１ｇ当たり0.5単位の活性
が得られた。
【００４９】実施例２ 〔1,5-AG脱水素酵素の精製〕 実施例１で得られた可溶化液を、予め１％トリトンX-10
0含有20mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.2）で平衡化した
ハイドロキシアパタイトカラムに通して酵素を吸着さ
せ、同組成の緩衝液で洗浄後、１％トリトンX-100含有2
0mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.2）の直線グラジエント
で溶出し、酵素の活性画分を集めた。更に比活性を上げ
るため、再度ハイドロキシアパタイトカラムに通して上
記同様の操作を行い、活性画分を集め限外濾過により濃
縮し、比活性が12単位/mg蛋白質である精製酵素を得
た。該精製標品は、ポリアクリルアミド電気泳動におい
て単一バンドを示した。
0含有20mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.2）で平衡化した
ハイドロキシアパタイトカラムに通して酵素を吸着さ
せ、同組成の緩衝液で洗浄後、１％トリトンX-100含有2
0mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.2）の直線グラジエント
で溶出し、酵素の活性画分を集めた。更に比活性を上げ
るため、再度ハイドロキシアパタイトカラムに通して上
記同様の操作を行い、活性画分を集め限外濾過により濃
縮し、比活性が12単位/mg蛋白質である精製酵素を得
た。該精製標品は、ポリアクリルアミド電気泳動におい
て単一バンドを示した。
【００５０】実施例３ 〔NTBを利用した1,5-AGの定
量〕 0.35mM NTB及び１％トリトンX-100を含む350mMリン酸カ
リウム緩衝液（pH8.0）2.55mlに、各種濃度の1,5-AG溶
液0.15ml及び実施例２により得られた1,5-AG脱水素酵素
溶液0.3ml（0.54単位）を加えた全量3.0mlの反応液を、
37℃で10分間反応させ、540nmの吸光度を測定して検量
線を作成した。図５にこの結果を示した。検量線は、０
〜50μg/mlまで直線となり、還元性発色剤としてNTBを
用いた1,5-AGの定量が可能であることが分かる。
量〕 0.35mM NTB及び１％トリトンX-100を含む350mMリン酸カ
リウム緩衝液（pH8.0）2.55mlに、各種濃度の1,5-AG溶
液0.15ml及び実施例２により得られた1,5-AG脱水素酵素
溶液0.3ml（0.54単位）を加えた全量3.0mlの反応液を、
37℃で10分間反応させ、540nmの吸光度を測定して検量
線を作成した。図５にこの結果を示した。検量線は、０
〜50μg/mlまで直線となり、還元性発色剤としてNTBを
用いた1,5-AGの定量が可能であることが分かる。
【００５１】実施例４ 〔WST-1を利用した1,5-AGの定
量〕 実施例３の還元性発色剤に代えてWST-1を用い、吸光度
の測定波長を450nmとした以外は、上記と同様の操作に
て測定を行い検量線を作成した。図６にこの結果を示し
た。検量線は、０〜50μｇ／mlまで直線となり、還元性
発色剤としてWST-1を用いた1,5-AGの定量が可能である
ことが分かる。
量〕 実施例３の還元性発色剤に代えてWST-1を用い、吸光度
の測定波長を450nmとした以外は、上記と同様の操作に
て測定を行い検量線を作成した。図６にこの結果を示し
た。検量線は、０〜50μｇ／mlまで直線となり、還元性
発色剤としてWST-1を用いた1,5-AGの定量が可能である
ことが分かる。
【００５２】
【発明の効果】以上のように、本発明の1,5-AG脱水素酵
素は、電子キャリアー非存在下において1,5-AGに特異的
に作用し直接還元性発色剤を還元する作用を有する。従
って、これを用いた本発明の1,5-AGの定量法は、特異酵
素の作用により直接生成される還元された発色物質を測
定するものであるため、試料中の1,5-AGを簡便かつ精度
良く測定することができ、特に糖尿病等の診断に極めて
有用である。
素は、電子キャリアー非存在下において1,5-AGに特異的
に作用し直接還元性発色剤を還元する作用を有する。従
って、これを用いた本発明の1,5-AGの定量法は、特異酵
素の作用により直接生成される還元された発色物質を測
定するものであるため、試料中の1,5-AGを簡便かつ精度
良く測定することができ、特に糖尿病等の診断に極めて
有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】アグロバクテリウム・ツメファシエンスIFO135
33を培養して得られた本発明の1,5-AG脱水素酵素の最適
pHを示すグラフである。
33を培養して得られた本発明の1,5-AG脱水素酵素の最適
pHを示すグラフである。
【図２】アグロバクテリウム・ツメファシエンスIFO135
33を培養して得られた本発明の1,5-AG脱水素酵素のpH安
定性を示すグラフである。
33を培養して得られた本発明の1,5-AG脱水素酵素のpH安
定性を示すグラフである。
【図３】アグロバクテリウム・ツメファシエンスIFO135
33を培養して得られた本発明の1,5-AG脱水素酵素の最適
温度を示すグラフである。
33を培養して得られた本発明の1,5-AG脱水素酵素の最適
温度を示すグラフである。
【図４】アグロバクテリウム・ツメファシエンスIFO135
33を培養して得られた本発明の1,5-AG脱水素酵素の温度
安定性を示すグラフである。
33を培養して得られた本発明の1,5-AG脱水素酵素の温度
安定性を示すグラフである。
【図５】アグロバクテリウム・ツメファシエンスIFO135
33を培養して得られた本発明の1,5-AG脱水素酵素及び還
元性発色剤としてNTBを用いた1,5-AG測定の検量線であ
る。
33を培養して得られた本発明の1,5-AG脱水素酵素及び還
元性発色剤としてNTBを用いた1,5-AG測定の検量線であ
る。
【図６】アグロバクテリウム・ツメファシエンスIFO135
33を培養して得られた本発明の1,5-AG脱水素酵素及び還
元性発色剤としてWST-1を用いた1,5-AG測定の検量線で
ある。
33を培養して得られた本発明の1,5-AG脱水素酵素及び還
元性発色剤としてWST-1を用いた1,5-AG測定の検量線で
ある。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:01）
Claims (6)
- 【請求項１】 次の理化学的性質を有する1,5-アンヒド
ログルシトール脱水素酵素。 (1) 作用：電子キャリアー非存在下において、1,5-アン
ヒドログルシトールに特異的に作用して２位の水酸基を
酸化するとともに直接還元性発色剤を還元する反応を触
媒する作用を有する。 (2) 基質特異性：1,5-アンヒドログルシトールに強く作
用し、L-ソルボースに弱く作用する。また、D-グルコー
スに若干作用する。 (3) 至適pH：至適pHは8.0〜9.0付近にある。 (4) pH安定性：pH7.0〜9.0にて安定である。 (5) 至適温度：至適温度は35〜40℃付近にある。 (6) 温度安定性：40℃付近まで90％以上安定である。 (7) 電子受容体：2,6-ジクロロフェノールインドフェノ
ール、フェリシアン化合物等のほか、還元性発色剤も利
用できる。またNAD、NADP等の補酵素や溶存酵素は利用
できない。 (8) 分子量：ドデシル硫酸−ポリアクリルアミド電気泳
動法による分子量は、約55,000である。 - 【請求項２】 アグロバクテリウム属に属し、1,5-アン
ヒドログルシトール脱水素酵素生産能を有する微生物に
より生産されるものである請求項１記載の1,5-アンヒド
ログルシトール脱水素酵素。 - 【請求項３】 アグロバクテリウム属に属し、1,5-アン
ヒドログルシトール脱水素酵素生産能を有する微生物を
栄養培地に培養し、膜画分中に1,5-アンヒドログルシト
ール脱水素酵素を生成蓄積せしめ、これを採取すること
を特徴とする1,5-アンヒドログルシトール脱水素酵素の
製造法。 - 【請求項４】 アグロバクテリウム属に属し、1,5-アン
ヒドログルシトール脱水素酵素生産能を有する微生物
が、アグロバクテリウム・ツメファシエンスである請求
項３記載の製造法。 - 【請求項５】 還元性発色剤の存在下、1,5-アンヒドロ
グルシトールを含む試料に請求項１又は２記載の1,5-ア
ンヒドログルシトール脱水素酵素を作用せしめ、生成す
る還元された発色物質を測定することを特徴とする1,5-
アンヒドログルシトールの定量法。 - 【請求項６】 還元性発色剤が、テトラゾリウム又はそ
の塩類である請求項５記載の定量法。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32396996A JP3819094B2 (ja) | 1996-12-04 | 1996-12-04 | １，５−アンヒドログルシトール脱水素酵素、その製造法及びこれを用いる１，５−アンヒドログルシトールの定量法 |
| US08/980,792 US5871949A (en) | 1996-12-04 | 1997-12-01 | Method of quantitative assay for 1,5-anhydroglucitol and reagent for quantitative assay |
| DE69704328T DE69704328T2 (de) | 1996-12-04 | 1997-12-03 | Verfahren zur quantitativen Bestimmung von 1,5-Anhydroglucitol, sowie Reagenz zur quantitativen Bestimmung |
| EP97309747A EP0846773B1 (en) | 1996-12-04 | 1997-12-03 | Method of quantitative assay for 1,5-anhydroglucitol and reagent for quantitative assay |
| KR1019970065879A KR100478514B1 (ko) | 1996-12-04 | 1997-12-04 | 1,5-언히드로글루시톨의정량법및정량용시약 |
| CNB971260427A CN1138001C (zh) | 1996-12-04 | 1997-12-04 | 1,5-脱水山梨醇的定量方法以及定量用试剂 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32396996A JP3819094B2 (ja) | 1996-12-04 | 1996-12-04 | １，５−アンヒドログルシトール脱水素酵素、その製造法及びこれを用いる１，５−アンヒドログルシトールの定量法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10155479A true JPH10155479A (ja) | 1998-06-16 |
| JP3819094B2 JP3819094B2 (ja) | 2006-09-06 |
Family
ID=18160662
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP32396996A Expired - Fee Related JP3819094B2 (ja) | 1996-12-04 | 1996-12-04 | １，５−アンヒドログルシトール脱水素酵素、その製造法及びこれを用いる１，５−アンヒドログルシトールの定量法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3819094B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP5622321B2 (ja) | 2008-06-19 | 2014-11-12 | 日本化薬株式会社 | 耐熱性１，５−アンヒドログルシトール脱水素酵素及びそれを用いた１，５−アンヒドログルシトールの測定法 |
| EP2365326A4 (en) | 2008-12-08 | 2013-06-12 | Nippon Kayaku Kk | BIOSENSOR FOR ELECTROCHEMICAL MEASUREMENT OF 1,5-ANHYDROGLUCITOL, AND MEASUREMENT METHOD AND MEASURING KIT USING THE SAME |
-
1996
- 1996-12-04 JP JP32396996A patent/JP3819094B2/ja not_active Expired - Fee Related
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