JPH10130269A - カルボリン誘導体 - Google Patents
カルボリン誘導体Info
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Landscapes
- Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 新規なグルタミン酸毒性抑制作用を有する化
合物と、それを生産できる菌株およびそれを用いた医薬
品を提供する。 【解決手段】 下記式で表わされるカルボリン誘導体、
受託番号FERM BP−5637にて工業技術院生命
工学工業技術研究所にて寄託された放線菌の菌株および
このカルボリン誘導体からなるグルタミン酸毒性の抑制
剤。 【化1】
合物と、それを生産できる菌株およびそれを用いた医薬
品を提供する。 【解決手段】 下記式で表わされるカルボリン誘導体、
受託番号FERM BP−5637にて工業技術院生命
工学工業技術研究所にて寄託された放線菌の菌株および
このカルボリン誘導体からなるグルタミン酸毒性の抑制
剤。 【化1】
Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、新規なカルボリン誘導
体、それを生産できる菌株、およびそれを用いた医薬品
に関するものである。
体、それを生産できる菌株、およびそれを用いた医薬品
に関するものである。
【0002】
【発明の背景】L−グルタミン酸は、タンパク質を構成
する天然のアミノ酸の一種であるが、神経細胞に対する
毒性を持つことが知られている。このグルタミン酸毒性
を抑制する作用を有する物質が得られれば、その物質は
脳代謝を賦活したり、改善するための医薬あるいは脳虚
血症患治療薬等として利用できることが予想される。
する天然のアミノ酸の一種であるが、神経細胞に対する
毒性を持つことが知られている。このグルタミン酸毒性
を抑制する作用を有する物質が得られれば、その物質は
脳代謝を賦活したり、改善するための医薬あるいは脳虚
血症患治療薬等として利用できることが予想される。
【0003】これまでに、放線菌生産物からグルタミン
酸毒性を抑制する作用を持つ、いくつかの物質が分離抽
出され、その化学構造も確認されている。また、ビタミ
ンEのような抗酸化物質がグルタミン酸毒性を抑制する
作用を有することも知られている。
酸毒性を抑制する作用を持つ、いくつかの物質が分離抽
出され、その化学構造も確認されている。また、ビタミ
ンEのような抗酸化物質がグルタミン酸毒性を抑制する
作用を有することも知られている。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、優れたグル
タミン酸毒性を抑制する作用を持つ新規な物質、そして
その物質を生産する微生物を提供することを目的とす
る。
タミン酸毒性を抑制する作用を持つ新規な物質、そして
その物質を生産する微生物を提供することを目的とす
る。
【0005】
【課題を解決するための手段】本発明者は、土壌中から
ストレプトマイセス属に属する新しい放線菌の菌株を発
見した。この菌株は、1996年8月27日に工業技術
院生命工学工業技術研究所へ寄託した。受託番号は、F
ERM BP−5637である。本発明者が、この菌株
について研究を進めたところ、この菌株は、下記式で表
わされる新規なカルボリン誘導体を生産することを見出
した。
ストレプトマイセス属に属する新しい放線菌の菌株を発
見した。この菌株は、1996年8月27日に工業技術
院生命工学工業技術研究所へ寄託した。受託番号は、F
ERM BP−5637である。本発明者が、この菌株
について研究を進めたところ、この菌株は、下記式で表
わされる新規なカルボリン誘導体を生産することを見出
した。
【0006】
【化4】
【0007】本発明者は、上記カルボリン誘導体につい
てさらに研究を進めたところ、この物質は優れたグルタ
ミン酸毒性の抑制作用を有していることが判明した。
てさらに研究を進めたところ、この物質は優れたグルタ
ミン酸毒性の抑制作用を有していることが判明した。
【0008】本発明のカルボリン誘導体の物理化学的な
性質は以下の通りである。 外観: 赤褐色粉末 融点: 247〜249℃(分解) 比旋光度:[α]D 20 =−33°(c=0.04,メタノール) 分子式: C21H20N2 O8 分子量: 429.1324(実測値、HRFAB−MS) 429.1298(計算値) UV λmax nm(ε)(メタノール中): 210(10500)、256(5200)、284(6400)、 400(4500) UV λmax nm(ε)(NaOH/メタノール中): 238(10000)、410(4800) IR νmax cm-1(KBr): 3400、1730、1630、1295。
性質は以下の通りである。 外観: 赤褐色粉末 融点: 247〜249℃(分解) 比旋光度:[α]D 20 =−33°(c=0.04,メタノール) 分子式: C21H20N2 O8 分子量: 429.1324(実測値、HRFAB−MS) 429.1298(計算値) UV λmax nm(ε)(メタノール中): 210(10500)、256(5200)、284(6400)、 400(4500) UV λmax nm(ε)(NaOH/メタノール中): 238(10000)、410(4800) IR νmax cm-1(KBr): 3400、1730、1630、1295。
【0009】本発明のカルボリン誘導体のプロトンNM
Rスペクトル(ジメチルホルムアミド(DMF)−d
7 、−40℃)および13C−NMRスペクトル(ジメチ
ルスルホキシド(DMSO)−d6 )を図1と図2にそ
れぞれ示す。尚、構造式中にグリセロール部分を有する
ことは、ピリジニウム・p−トルエンスルホネートの存
在下、2,2−ジメトキシプロパンを作用させた後、ア
ルカリ加水分解することで、グリセロール・ジメチルケ
タール([α]D 21 =+9.8°(C=0.06,ベン
ゼン))が得られたことからも確認された。上記カルボ
リン誘導体は、今のところ、本発明者が発見した菌株の
培養によってのみしか得られていない。次に、この菌株
について説明する。
Rスペクトル(ジメチルホルムアミド(DMF)−d
7 、−40℃)および13C−NMRスペクトル(ジメチ
ルスルホキシド(DMSO)−d6 )を図1と図2にそ
れぞれ示す。尚、構造式中にグリセロール部分を有する
ことは、ピリジニウム・p−トルエンスルホネートの存
在下、2,2−ジメトキシプロパンを作用させた後、ア
ルカリ加水分解することで、グリセロール・ジメチルケ
タール([α]D 21 =+9.8°(C=0.06,ベン
ゼン))が得られたことからも確認された。上記カルボ
リン誘導体は、今のところ、本発明者が発見した菌株の
培養によってのみしか得られていない。次に、この菌株
について説明する。
【0010】上記カルボリン誘導体を生産する菌株(1
996年8月27日に工業技術院生命工学工業技術研究
所へ寄託した、受託番号FERM BP−5637)
は、長野県のりんご畑で採取された土壌見本から単離さ
れたものであり、ストレプトマイセス属に属する放線菌
である。本菌株は、「放線菌の同定実験法」(日本放線
菌研究会)及び「インターナショナル・ストレプトマイ
セス・プロジェクト(International Streptomyces Proj
ect (ISP))」に規定の方法によると、次のように特徴づ
けられる。基生菌糸が分断しない。気菌糸は長い主軸を
形成し、それより不規則に分枝した先端に、10〜50
個またはそれ以上からなる3〜5回転のらせん状の胞子
鎖を形成する。胞子は非運動性で、楕円形を呈し、幅が
0.4〜0.5μm、長さが1.0〜1.2μmであ
り、胞子表面はとげ状である。菌核、胞子のう、その他
の特殊形態は観察されない。細胞壁化学型はI型であ
る。
996年8月27日に工業技術院生命工学工業技術研究
所へ寄託した、受託番号FERM BP−5637)
は、長野県のりんご畑で採取された土壌見本から単離さ
れたものであり、ストレプトマイセス属に属する放線菌
である。本菌株は、「放線菌の同定実験法」(日本放線
菌研究会)及び「インターナショナル・ストレプトマイ
セス・プロジェクト(International Streptomyces Proj
ect (ISP))」に規定の方法によると、次のように特徴づ
けられる。基生菌糸が分断しない。気菌糸は長い主軸を
形成し、それより不規則に分枝した先端に、10〜50
個またはそれ以上からなる3〜5回転のらせん状の胞子
鎖を形成する。胞子は非運動性で、楕円形を呈し、幅が
0.4〜0.5μm、長さが1.0〜1.2μmであ
り、胞子表面はとげ状である。菌核、胞子のう、その他
の特殊形態は観察されない。細胞壁化学型はI型であ
る。
【0011】菌株を、(1)シュクロース・硝酸塩寒天
培地、(2)グルコース・アスパラギン寒天培地、
(3)グリセリン・アスパラギン寒天培地、(4)無機
塩・スターチ寒天培地、(5)チロシン寒天培地、
(6)栄養寒天培地、(7)イースト・麦芽寒天培地お
よび(8)オートミール寒天培地で培養した結果観察さ
れた各種培地上での培養性状を第1表に示す。
培地、(2)グルコース・アスパラギン寒天培地、
(3)グリセリン・アスパラギン寒天培地、(4)無機
塩・スターチ寒天培地、(5)チロシン寒天培地、
(6)栄養寒天培地、(7)イースト・麦芽寒天培地お
よび(8)オートミール寒天培地で培養した結果観察さ
れた各種培地上での培養性状を第1表に示す。
【0012】
【表1】 第1表 ──────────────────────────────────── 培地 集落表面の菌叢色 集落の裏面色 拡散性色素 ──────────────────────────────────── (1) 気菌糸なし 明茶味灰色(3ec) なし (2) 緑色系列 (21ec〜22ba) 淡黄色(2cb) なし (3) 青色系列 (15ba) 淡黄色(2ca) なし (4) 緑色系列 (22dc) 明茶味灰色(3ec〜4ge) なし (5) 気菌糸なし 淡黄色(2ba) なし (6) 気菌糸なし 淡黄色(2db) なし (7) 緑色系列 (22dc) 淡茶色(4ie〜4gc) なし (8) 緑色系列 (22cb) 淡黄色(2ca) なし ──────────────────────────────────── 註:かっこ内は、カラー・ハーモニー・マニュアル(コ
ンテナー・コーポレーション・オブ・アメリカ、195
0)の色標コードを示す。
ンテナー・コーポレーション・オブ・アメリカ、195
0)の色標コードを示す。
【0013】第1表に示されているように、集落表面の
菌叢色は緑色系列である。また、裏面色は淡黄色から明
茶味灰色の不鮮明色を呈し、pHで変化しない。拡散性
色素の産生は認められなかった。生理的性状および炭素
源の同化性を下記第2表に示す。
菌叢色は緑色系列である。また、裏面色は淡黄色から明
茶味灰色の不鮮明色を呈し、pHで変化しない。拡散性
色素の産生は認められなかった。生理的性状および炭素
源の同化性を下記第2表に示す。
【0014】
【表2】 第2表 ──────────────────────────────────── 生理的性状および炭素源の同化性 ──────────────────────────────────── 生育温度範囲 20〜45℃ 最適温度 20〜30℃ メラニン様色素の生産:チロシン寒天培地 − ペプトン・イースト鉄寒天培地 ± トリプトン・イースト・ブロス培地 − スターチの加水分解 + ゼラチンの液化 − 脱脂牛乳のペプトン化 − 脱脂牛乳の凝固 − 硝酸塩の還元 + 炭素源の同化:D−グルコース + L−アラビノース + D−キシロース + D−フラクトース + シュクロース + L−ラムノース + ラフィノース + i−イノシトール + D−マンニット + ────────────────────────────────────
【0015】以上のように、本菌株は中温性であり、炭
素源は全て利用する。本菌株の形態的性状と細胞壁化学
型から、本菌株はストレプトマイセス属に位置すると判
断される。上述の諸性状(胞子鎖形態、胞子表面、菌叢
色、裏面色、拡散性色素、炭素源の同化能等)をもと
に、「細菌名承認リスト、1980」およびそれ以降の
有効名リストに記載されたストレプトマイセス属(以下
単に「S.」と略す)の種について検索し、近縁種を選
出する作業を行なった。その結果、S.ヒルスタス(S.h
irsutus)の診断的性状と本菌株の性状とがよく一致して
いることが判明した(第3表)。従って、本菌株は、
S.ヒルスタスと最も近似であるということができる。
ただし、バージェイズ・マニュアル・オブ・システマテ
ィック・バクテリオロジー(Bergey's Manual of Syste
matic Bacteriology)第4巻において、ウイリアムス(W
illiams)等は、S.ヒルスタスを、S.グリゼオフラブ
ス(S.griseoflavus)の異名(シノニム)としている。従
って、本菌株は、S.グリゼオフラブス(S.griseoflavu
s)に含まれる一菌株と同定することができる。
素源は全て利用する。本菌株の形態的性状と細胞壁化学
型から、本菌株はストレプトマイセス属に位置すると判
断される。上述の諸性状(胞子鎖形態、胞子表面、菌叢
色、裏面色、拡散性色素、炭素源の同化能等)をもと
に、「細菌名承認リスト、1980」およびそれ以降の
有効名リストに記載されたストレプトマイセス属(以下
単に「S.」と略す)の種について検索し、近縁種を選
出する作業を行なった。その結果、S.ヒルスタス(S.h
irsutus)の診断的性状と本菌株の性状とがよく一致して
いることが判明した(第3表)。従って、本菌株は、
S.ヒルスタスと最も近似であるということができる。
ただし、バージェイズ・マニュアル・オブ・システマテ
ィック・バクテリオロジー(Bergey's Manual of Syste
matic Bacteriology)第4巻において、ウイリアムス(W
illiams)等は、S.ヒルスタスを、S.グリゼオフラブ
ス(S.griseoflavus)の異名(シノニム)としている。従
って、本菌株は、S.グリゼオフラブス(S.griseoflavu
s)に含まれる一菌株と同定することができる。
【0016】
【表3】 第3表 ──────────────────────────────────── 比較項目 本菌株 ストレプトマイセス ストレプトマイセス・ ・ヒルスタス グリゼオフラブス ──────────────────────────────────── 胞子鎖形態:らせん状 + + + 胞子表面:とげ状 + + + 菌叢色: 緑色 + + + 灰色 − − + 裏面色: 不鮮明色 + + + 赤/橙色 − − + pH感受性 − − − 拡散性色素産生 − − − メラニン色素産生 − − − スターチの加水分解 + + + 硝酸塩の還元 + + + 生育温度:10℃ − − − 37℃ + + + 45℃ + + + 炭素源の同化 アラビノース + + + キシロース + + + イノシトール + + + マンニット + + + ラムノース + + + ラフィノース + + − シュクロース + + − ────────────────────────────────────
【0017】本発明のカルボリン誘導体は、本菌株のよ
うな生産菌を適当な培地で好気的に培養して、培養物か
ら目的物を採取することにより製造できる。培地は、カ
ルボリン誘導体生産菌が利用できる栄養源から構成す
る。炭素源としては、グリセロール(グリセリン)が好
ましい。窒素源としては、モラセス、カゼインおよびポ
リペプトンが好ましく利用できる。また、必要に応じて
無機塩類を添加することができる。醗酵中の発泡を抑制
するために、適当な消泡剤(例、シリコーン)を添加し
てもよい。
うな生産菌を適当な培地で好気的に培養して、培養物か
ら目的物を採取することにより製造できる。培地は、カ
ルボリン誘導体生産菌が利用できる栄養源から構成す
る。炭素源としては、グリセロール(グリセリン)が好
ましい。窒素源としては、モラセス、カゼインおよびポ
リペプトンが好ましく利用できる。また、必要に応じて
無機塩類を添加することができる。醗酵中の発泡を抑制
するために、適当な消泡剤(例、シリコーン)を添加し
てもよい。
【0018】上記菌株を用いての本発明のカルボリン誘
導体の大量生産には、好気的深部培養条件を採用するこ
とが好ましい。この条件は、他の一般的な生物活性物質
の大量生産のための培養条件と同様である。少量生産の
場合は、フラスコ内での振盪培養を採用することができ
る。また、ジャー・ファーメンターを用いて培養しても
よい。その場合、生産過程における生育遅延を避けるた
めに、醗酵槽への接種には微生物の栄養細胞を用いるこ
とが好ましい。このためには、比較的少量の培地に微生
物の細胞を接種し、該接種培地を培養して微生物の栄養
細胞を生産し、次に培養した栄養細胞を醗酵槽に移すこ
とが好ましい。栄養細胞を生産するための培地は、カル
ボリン誘導体を生産するための培地と異なるものであっ
てもよい。
導体の大量生産には、好気的深部培養条件を採用するこ
とが好ましい。この条件は、他の一般的な生物活性物質
の大量生産のための培養条件と同様である。少量生産の
場合は、フラスコ内での振盪培養を採用することができ
る。また、ジャー・ファーメンターを用いて培養しても
よい。その場合、生産過程における生育遅延を避けるた
めに、醗酵槽への接種には微生物の栄養細胞を用いるこ
とが好ましい。このためには、比較的少量の培地に微生
物の細胞を接種し、該接種培地を培養して微生物の栄養
細胞を生産し、次に培養した栄養細胞を醗酵槽に移すこ
とが好ましい。栄養細胞を生産するための培地は、カル
ボリン誘導体を生産するための培地と異なるものであっ
てもよい。
【0019】培養混合物の攪拌および通気は、通常の方
法で実施できる。攪拌には、プロペラまたは類似の機械
的攪拌装置を用いることができる。醗酵槽の回転または
振盪により攪拌してもよい。通気には、種々のポンプ装
置を用いることができる。また、培地に滅菌空気を通す
ことにより通気してもよい。醗酵温度は、一般に10乃
至40℃、好ましくは20乃至30℃である。醗酵時間
は、一般に50乃至200時間である。醗酵時間は、醗
酵条件および規模に応じて変化する。醗酵が完了後、種
々の慣用的な回収および精製方法により、培養液からカ
ルボリン誘導体を回収できる。回収方法としては、溶媒
抽出、クロマトグラフィーあるいは再結晶化が採用でき
る。溶媒抽出および再結晶化では、カルボリン誘導体に
適当な溶媒を用いる。二種類以上の溶媒を併用してもよ
い。
法で実施できる。攪拌には、プロペラまたは類似の機械
的攪拌装置を用いることができる。醗酵槽の回転または
振盪により攪拌してもよい。通気には、種々のポンプ装
置を用いることができる。また、培地に滅菌空気を通す
ことにより通気してもよい。醗酵温度は、一般に10乃
至40℃、好ましくは20乃至30℃である。醗酵時間
は、一般に50乃至200時間である。醗酵時間は、醗
酵条件および規模に応じて変化する。醗酵が完了後、種
々の慣用的な回収および精製方法により、培養液からカ
ルボリン誘導体を回収できる。回収方法としては、溶媒
抽出、クロマトグラフィーあるいは再結晶化が採用でき
る。溶媒抽出および再結晶化では、カルボリン誘導体に
適当な溶媒を用いる。二種類以上の溶媒を併用してもよ
い。
【0020】カルボリン誘導体は、一般に培養菌体成分
中に見出される。従って、培養液を遠心あるいは濾過し
て得られた菌体を適当な溶媒で抽出してから、カルボリ
ン誘導体の精製処理を実施することが好ましい。溶媒と
しては、アセトンやメタノールを用いることができる。
カルボリン誘導体の精製は、抽出液を慣用的な方法に従
って処理することにより実施できる。例えば、抽出液か
ら蒸発あるいは蒸留によって溶媒を除去した後、適当な
溶媒(例、酢酸エチル)で再抽出、乾固を繰り返し、カ
ルボリン誘導体を含む残留物を得ることができる。これ
を粗標品として、慣用的な精製方法、例えば、シリカゲ
ルクロマトグラフィーやHPLC分取を行ない、カルボ
リン誘導体を精製することができる。
中に見出される。従って、培養液を遠心あるいは濾過し
て得られた菌体を適当な溶媒で抽出してから、カルボリ
ン誘導体の精製処理を実施することが好ましい。溶媒と
しては、アセトンやメタノールを用いることができる。
カルボリン誘導体の精製は、抽出液を慣用的な方法に従
って処理することにより実施できる。例えば、抽出液か
ら蒸発あるいは蒸留によって溶媒を除去した後、適当な
溶媒(例、酢酸エチル)で再抽出、乾固を繰り返し、カ
ルボリン誘導体を含む残留物を得ることができる。これ
を粗標品として、慣用的な精製方法、例えば、シリカゲ
ルクロマトグラフィーやHPLC分取を行ない、カルボ
リン誘導体を精製することができる。
【0021】本菌株以外の微生物についても、通常の方
法によってカルボリン誘導体生産株を、自然界から分離
することが可能である。具体的には、抗生物質生産菌の
単離方法と同様に実施できる。また、本菌株に、放射線
照射や他の突然変異を誘発する処理を実施して、カルボ
リン誘導体の生産性を向上させてもよい。カルボリン誘
導体の生合成は、放線菌が生産する抗生物質と同様に、
多くの遺伝子が関与すると推定される。遺伝子組替え技
術の発達に伴い、このような物質の生合成についても、
遺伝子操作が可能になっている。このため、この菌株の
カルボリン誘導体の生合成に関与する遺伝子を、他の菌
株に導入して、得られた形質転換株にカルボリン誘導体
を生産させることもできる。
法によってカルボリン誘導体生産株を、自然界から分離
することが可能である。具体的には、抗生物質生産菌の
単離方法と同様に実施できる。また、本菌株に、放射線
照射や他の突然変異を誘発する処理を実施して、カルボ
リン誘導体の生産性を向上させてもよい。カルボリン誘
導体の生合成は、放線菌が生産する抗生物質と同様に、
多くの遺伝子が関与すると推定される。遺伝子組替え技
術の発達に伴い、このような物質の生合成についても、
遺伝子操作が可能になっている。このため、この菌株の
カルボリン誘導体の生合成に関与する遺伝子を、他の菌
株に導入して、得られた形質転換株にカルボリン誘導体
を生産させることもできる。
【0022】以上のように得られたカルボリン誘導体
は、優れたグルタミン酸毒性の抑制作用を示す。従っ
て、本発明のカルボリン誘導体は、グルタミン酸毒性の
抑制剤として有用である。本発明のカルボリン誘導体の
グルタミン酸毒性の抑制作用は、従来知られている化合
物よりも強く、数nMでグルタミン酸毒性を50%程度
抑制することができることが分った。公知のグルタミン
酸毒性の抑制作用を示す化合物は、軽度の脳虚血による
神経細胞死を抑制し、脳代謝を賦活する。従って、本発
明のカルボリン誘導体も、脳梗塞や脳血管性痴呆症のよ
うな脳虚血障害に対する治療薬として有効である。
は、優れたグルタミン酸毒性の抑制作用を示す。従っ
て、本発明のカルボリン誘導体は、グルタミン酸毒性の
抑制剤として有用である。本発明のカルボリン誘導体の
グルタミン酸毒性の抑制作用は、従来知られている化合
物よりも強く、数nMでグルタミン酸毒性を50%程度
抑制することができることが分った。公知のグルタミン
酸毒性の抑制作用を示す化合物は、軽度の脳虚血による
神経細胞死を抑制し、脳代謝を賦活する。従って、本発
明のカルボリン誘導体も、脳梗塞や脳血管性痴呆症のよ
うな脳虚血障害に対する治療薬として有効である。
【0023】
[実施例1] 「醗酵」スターチ(1%)、ポリペプトン(1%)、モ
ラセス(1%)、および肉エキス(1%)を含有するP
CI培地(滅菌前pH7.0)15mLを分注した試験
管に、本発明のストレプトマイセス・グリゼオフラブス
株の斜面培養1白金耳を接種し、27℃で2日間振盪培
養を行なった。次いで、この前培養物2mLを、グリセ
リン(2%)、モラセス(0.5%)、カゼイン(0.
5%)、ポリペプトン(0.1%)および炭酸カルシウ
ム(0.4%)を含有する培地(滅菌前pH7.2)1
00mLを分注した、こぶ付き500mL三角フラスコ
6本に接種し、27℃で2日間振盪培養を行なった。以
上のように調製した種600mLを、グリセリン(2
%)、モラセス(0.5%)、カゼイン(0.5%)、
ポリペプトン(0.1%)および炭酸カルシウム(0.
4%)を含有する生産培地(滅菌前pH7.2)30リ
ットルに接種した。培養は、ジャー・ファーメンタに
て、毎分30リットルの通気と400rpmの攪拌を行
ないながら、27℃で5日間醗酵を行なった。
ラセス(1%)、および肉エキス(1%)を含有するP
CI培地(滅菌前pH7.0)15mLを分注した試験
管に、本発明のストレプトマイセス・グリゼオフラブス
株の斜面培養1白金耳を接種し、27℃で2日間振盪培
養を行なった。次いで、この前培養物2mLを、グリセ
リン(2%)、モラセス(0.5%)、カゼイン(0.
5%)、ポリペプトン(0.1%)および炭酸カルシウ
ム(0.4%)を含有する培地(滅菌前pH7.2)1
00mLを分注した、こぶ付き500mL三角フラスコ
6本に接種し、27℃で2日間振盪培養を行なった。以
上のように調製した種600mLを、グリセリン(2
%)、モラセス(0.5%)、カゼイン(0.5%)、
ポリペプトン(0.1%)および炭酸カルシウム(0.
4%)を含有する生産培地(滅菌前pH7.2)30リ
ットルに接種した。培養は、ジャー・ファーメンタに
て、毎分30リットルの通気と400rpmの攪拌を行
ないながら、27℃で5日間醗酵を行なった。
【0024】「単離と精製」培養液90リットルを遠心
分離し、得られた菌体を等量のアセトンにて抽出した。
アセトンを濃縮除去後、酢酸エチルにて抽出した。有機
層を減圧濃縮したのち、ヘキサンで洗浄後、不溶性画分
をシリカゲルクロマトグラフィー(WAKOGELC-100 、径
40mm、長さ450mm)に付した(展開溶媒:クロ
ロホルム/メタノール=7/1)。活性画分を集め、減
圧濃縮したのち、展開溶媒にメタノールを用いてゲル濾
過(Toyopearl HW-40 、径40mm、長さ400mm)
を行なった。さらに、得られた活性画分を減圧濃縮した
のち、逆相シリカゲルカラム(Senshu Pak. PEGASIL OD
S 、径20mm、長さ250mm)を用いて、90%メ
タノールの溶媒系にてHPLC分取を行なった。活性ピ
ークを減圧濃縮して、本発明のカルボリン誘導体を赤褐
色粉末として10mgを得た。
分離し、得られた菌体を等量のアセトンにて抽出した。
アセトンを濃縮除去後、酢酸エチルにて抽出した。有機
層を減圧濃縮したのち、ヘキサンで洗浄後、不溶性画分
をシリカゲルクロマトグラフィー(WAKOGELC-100 、径
40mm、長さ450mm)に付した(展開溶媒:クロ
ロホルム/メタノール=7/1)。活性画分を集め、減
圧濃縮したのち、展開溶媒にメタノールを用いてゲル濾
過(Toyopearl HW-40 、径40mm、長さ400mm)
を行なった。さらに、得られた活性画分を減圧濃縮した
のち、逆相シリカゲルカラム(Senshu Pak. PEGASIL OD
S 、径20mm、長さ250mm)を用いて、90%メ
タノールの溶媒系にてHPLC分取を行なった。活性ピ
ークを減圧濃縮して、本発明のカルボリン誘導体を赤褐
色粉末として10mgを得た。
【0025】[実施例2] 「ニワトリ胚中脳神経細胞に対するグルタミン酸毒性抑
制効果」グルタミン酸毒性抑制試験ではニワトリ胚中脳
神経細胞を用いた。この細胞に、濃度100μMのグル
タミン酸を添加すると細胞死が認められる。このグルタ
ミン酸誘発細胞死に対する本発明のカルボリン誘導体の
作用を調べた。ニワトリ胚(受精7日目)より中脳を切
り出し、0.0125%トリプシンで30分間処理し
た。培養液(2倍希釈MEM培地)で4回洗浄すること
によりトリプシンを除いた。細胞を分散させた後、24
穴マイクロプレートに5×104cells/cm2 の濃度にな
るように播種した。培養3日経過後に100μMのグル
タミン酸と本発明のカルボリン誘導体とを添加した。グ
ルタミン酸添加後、さらに48時間培養したのち、細胞
の生存率をトリパンブルー染色法により求めた。なお、
同様な測定をカルボリン誘導体の代りにビタミンE(対
照)を用いて行なった。上記の各測定により求められた
細胞生存率を第3図にグラフで示す。
制効果」グルタミン酸毒性抑制試験ではニワトリ胚中脳
神経細胞を用いた。この細胞に、濃度100μMのグル
タミン酸を添加すると細胞死が認められる。このグルタ
ミン酸誘発細胞死に対する本発明のカルボリン誘導体の
作用を調べた。ニワトリ胚(受精7日目)より中脳を切
り出し、0.0125%トリプシンで30分間処理し
た。培養液(2倍希釈MEM培地)で4回洗浄すること
によりトリプシンを除いた。細胞を分散させた後、24
穴マイクロプレートに5×104cells/cm2 の濃度にな
るように播種した。培養3日経過後に100μMのグル
タミン酸と本発明のカルボリン誘導体とを添加した。グ
ルタミン酸添加後、さらに48時間培養したのち、細胞
の生存率をトリパンブルー染色法により求めた。なお、
同様な測定をカルボリン誘導体の代りにビタミンE(対
照)を用いて行なった。上記の各測定により求められた
細胞生存率を第3図にグラフで示す。
【0026】
【発明の効果】本発明のカルボリン誘導体は優れたグル
タミン酸毒性の抑制作用を示す。従って本発明のカルボ
リン誘導体はグルタミン酸毒性の抑制剤として有用であ
る。
タミン酸毒性の抑制作用を示す。従って本発明のカルボ
リン誘導体はグルタミン酸毒性の抑制剤として有用であ
る。
【図1】本発明のカルボリン誘導体の 1H−NMRスペ
クトルを示すグラフである。
クトルを示すグラフである。
【図2】本発明のカルボリン誘導体の13C−NMRスペ
クトルを示すグラフである。
クトルを示すグラフである。
【図3】本発明のカルボリン誘導体とビタミンEのグル
タミン酸毒性の抑制作用を示すグラフである。
タミン酸毒性の抑制作用を示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 FI C12P 17/18 C12P 17/18 C //(C12N 1/20 C12R 1:465) (C12P 17/18 C12R 1:465)
Claims (5)
- 【請求項1】 下記式で表わされるカルボリン誘導体。 【化1】
- 【請求項2】 ストレプトマイセス属に属し、下記式で
表わされるカルボリン誘導体を生産する能力を有する放
線菌の菌株。 【化2】 - 【請求項3】 ストレプトマイセス属に属し、受託番号
FERM BP−5637にて工業技術院生命工学工業
技術研究所に寄託された放線菌の菌株。 - 【請求項4】 ストレプトマイセス属に属し、受託番号
FERM BP−5637にて工業技術院生命工学工業
技術研究所に寄託された放線菌の菌株から生産され、の
神経細胞に対するL−グルタミン酸の毒性を抑制する作
用を有する物質。 - 【請求項5】 下記式で表わされるカルボリン誘導体か
らなるグルタミン酸毒性の抑制剤。 【化3】
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP9257539A JPH10130269A (ja) | 1996-09-04 | 1997-09-04 | カルボリン誘導体 |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP25544496 | 1996-09-04 | ||
JP8-255444 | 1996-09-04 | ||
JP9257539A JPH10130269A (ja) | 1996-09-04 | 1997-09-04 | カルボリン誘導体 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH10130269A true JPH10130269A (ja) | 1998-05-19 |
Family
ID=26542213
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP9257539A Withdrawn JPH10130269A (ja) | 1996-09-04 | 1997-09-04 | カルボリン誘導体 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH10130269A (ja) |
Cited By (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7504509B2 (en) | 2003-12-19 | 2009-03-17 | Plexxikon, Inc. | Compounds and methods for development of Ret modulators |
US8865735B2 (en) | 2011-02-21 | 2014-10-21 | Hoffman-La Roche Inc. | Solid forms of a pharmaceutically active substance |
US9096593B2 (en) | 2009-11-06 | 2015-08-04 | Plexxikon Inc. | Compounds and methods for kinase modulation, and indications therefor |
US9150570B2 (en) | 2012-05-31 | 2015-10-06 | Plexxikon Inc. | Synthesis of heterocyclic compounds |
US9169250B2 (en) | 2006-11-22 | 2015-10-27 | Plexxikon Inc. | Compounds modulating c-fms and/or c-kit activity and uses therefor |
US9447089B2 (en) | 2009-04-03 | 2016-09-20 | Plexxikon Inc. | Compositions and uses thereof |
US9469640B2 (en) | 2007-07-17 | 2016-10-18 | Plexxikon Inc. | Compounds and methods for kinase modulation, and indications therefor |
US9624213B2 (en) | 2011-02-07 | 2017-04-18 | Plexxikon Inc. | Compounds and methods for kinase modulation, and indications therefor |
-
1997
- 1997-09-04 JP JP9257539A patent/JPH10130269A/ja not_active Withdrawn
Cited By (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7504509B2 (en) | 2003-12-19 | 2009-03-17 | Plexxikon, Inc. | Compounds and methods for development of Ret modulators |
US9169250B2 (en) | 2006-11-22 | 2015-10-27 | Plexxikon Inc. | Compounds modulating c-fms and/or c-kit activity and uses therefor |
US9487515B2 (en) | 2006-11-22 | 2016-11-08 | Plexxikon Inc. | Compounds modulating c-fms and/or c-kit activity and uses therefor |
US9469640B2 (en) | 2007-07-17 | 2016-10-18 | Plexxikon Inc. | Compounds and methods for kinase modulation, and indications therefor |
US10426760B2 (en) | 2007-07-17 | 2019-10-01 | Plexxikon Inc. | Compounds and methods for kinase modulation, and indications therefor |
US9844539B2 (en) | 2007-07-17 | 2017-12-19 | Plexxikon Inc. | Compounds and methods for kinase modulation, and indications therefor |
US9663517B2 (en) | 2009-04-03 | 2017-05-30 | Plexxikon Inc. | Compositions and uses thereof |
US9447089B2 (en) | 2009-04-03 | 2016-09-20 | Plexxikon Inc. | Compositions and uses thereof |
US9096593B2 (en) | 2009-11-06 | 2015-08-04 | Plexxikon Inc. | Compounds and methods for kinase modulation, and indications therefor |
US9624213B2 (en) | 2011-02-07 | 2017-04-18 | Plexxikon Inc. | Compounds and methods for kinase modulation, and indications therefor |
US11337976B2 (en) | 2011-02-07 | 2022-05-24 | Plexxikon Inc. | Compounds and methods for kinase modulation, and indications therefor |
US8865735B2 (en) | 2011-02-21 | 2014-10-21 | Hoffman-La Roche Inc. | Solid forms of a pharmaceutically active substance |
US9150570B2 (en) | 2012-05-31 | 2015-10-06 | Plexxikon Inc. | Synthesis of heterocyclic compounds |
US9695169B2 (en) | 2012-05-31 | 2017-07-04 | Plexxikon Inc. | Synthesis of heterocyclic compounds |
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A300 | Application deemed to be withdrawn because no request for examination was validly filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20041207 |