JPH09507749A - Ｅ型肝炎ウイルスに対するモノクローナル抗体及びそれらを使用する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）、特にはＨＥＶ ＯＲＦ−３抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体が記述される。また、これらのモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞系、これらのモノクローナル抗体を使用する方法、及びこれらのモノクローナル抗体を含む検定キットが提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｅ型肝炎ウイルスに対するモノクローナル抗体及び それらを使用する方法 発明の背景 本発明は、一般に、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）に特異的に結合する抗体に関 し、特には、ＨＥＶ ＯＲＦ−３抗原に対するモノクローナル抗体を分泌するハ イブリドーマ細胞系、及びこれらのモノクローナル抗体を用いる方法に関する。 飲料水伝染性、流行性又は腸伝染性非Ａ非Ｂ肝炎（ＥＴ−ＮＡＮＢＨ）と様々 に呼ばれるＨＥＶは、世界的に分布し、発展途上国におけるウイルス性肝炎の主 要な地域的流行の原因として注目されている。Ｄ．Ｗ．Ｂｒａｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌ．４６：４４２−４６１（１９９０）。発展途 上国においては、入国した被曝旅行者の他に、ＥＴ−ＮＡＮＢＨの散発的な事例 が報告されている。Ｓ．Ｊ．Ｓｋｉｄｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ ３３７：１５４１（１９９１）。糞便−口経路の感染が主体ではあるが、幾つか の疫学的研究においては、限られたヒト−ヒト経路の被曝が示唆されている。Ｏ ．Ｖｅｌａｓｑｕｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ａｍｅｒ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ ．３６３：３２８１−３２８５（１９９０）。こ れらの疾患は、妊娠の第３の３ヶ月期間の間に感染した妊娠女性の約２０％とい う高い致死率を示すものとして文献に記載されている。前述のＤ．Ｗ．Ｂｒａｄ ｌｅｙらを参照のこと。 ＨＥＶの推定薬剤の分子クローニングは、ウイルス増殖の組織培養システムが 欠けていることにより妨げられている。しかしながら、利用可能な動物モデルと 新規に開発された非特異的増幅手順を用いることにより、ＨＥＶのバーメス（Ｂ ｕｒｍｅｓｅ）株に感染したカニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍａａｑｕ ｅｓ）の胆汁から得られた独特のｃＤＮＡクローン（“ＥＴ１．１”と同定され た）の同定が可能となっている。Ａ．Ｇ．Ａｎｄｊａｐａｒｉｄｚｅ ｅｔ ａ ｌ．，Ｖｏｐｒ．Ｖｉｒｕｓｏｌ．１：７３−８０（１９８６）、Ｄ．Ｗ．Ｂｒ ａｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：６２７７−６２８１（１９８７）及びＧ．Ｗ．Ｒｅｙｅｓ ｅｔ ａｌ． ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３３５−１３３９（１９９０）。このクローンの ウイルス起源の確認に成功したことが、ソマリア、タシュケント、ボルネ オ、パキスタン及びメキシコのＥＴ−ＮＡＮＢＨ感染者から採集した糞便試料中 の類似配列の同定に繋がった。前出のＧ．Ｒ．Ｒｅｙｅｓらを参照のこと。また 、ｃＤＮＡライブラリーも、メキシコでのＥＴ−ＮＡＮＢＨ流行の間に得られた ヒト便試料から作製されている。Ｇ．Ｒ．Ｒｅｙｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇａｓｔ ｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｊａｐｏｎ ．２６：１４２−１４７（１９９１）。これら のｃＤＮＡの免疫スクリーニングが、ＨＥＶに特異的なエピトープをコードする ２つのｃＤＮＡクローンの同定に結び付いた。Ｐ．Ｏ．Ｙａｒｂｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：５７９０−５７９７（１９９１）。一組の重 複するｃＤＮＡの単離及び配列決定は、この型の肝炎が、他の分子的に特徴付け られたウイルス性肝炎の他のいかなる作用因子とも似ていない、新規のウイルス によって引き起こされるという認識に結び付いた。Ａ．Ｗ．Ｔａｍ ｅｔ ａｌ ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８５：１２−１３１（１９９１）。 ＨＥＶゲノムの様々な領域がクローン化されており、グルタチオン−Ｓ−トラ ンスフェラーゼ（ＧＳＴ）を用いて融合タンパク質として大腸菌内で発現されて いる。例えば、前出のＳ． Ｊ．Ｓｋｉｄｍｏｒｅらを参照のこと。これらの組換え抗体のうちの４つ、ＨＥ Ｖのバーメス（Ｂ）株から誘導された２つとＨＥＶのメキシコ（Ｍ）株から誘導 された２つは、明らかにＨＥＶに被爆している個体に由来する抗体によって認識 される抗原性部位を有していることが示されている。前出のＰ．Ｏ．Ｙａｒｂｏ ｕｇｈらを参照のこと。Ｍ３−２及びＭ４−２と命名されたメキシコ株由来の２ つの抗原は、それぞれ、第２オープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ−２） 及び第３オープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ−３）のカルボキシ末端の アミノ酸配列に対応する。Ｂ３−２及びＢ４−２と命名されたバーメス株由来の ２つの抗原は、それぞれ、ＯＲＦ−２及びＯＲＦ−３のカルボキシ末端のアミノ 酸配列に対応する。Ｍ３−２及びＢ３−２組換え抗原は、両者とも、ＯＲＦ−２ のカルボキシ末端由来の４２アミノ酸を有している。これらの４２アミノ酸の配 列のアミノ酸相同性の程度は９０．５％Ｉｄ．である。Ｍ４−２及びＢ４−２組 換え抗原は、各々、ＯＲＦ−３のカルボキシ末端に由来する３３アミノ酸を有し ており、これら３３アミノ酸の２つの配列の相同性の程度は７３．５％Ｉｄ．で ある。 ＨＥＶの検出のために開発される試験は、被験試料におけるウイルスの特異的 な存在の検出に有用な試薬を含まなければならない。したがって、モノクローナ ル抗体のような、ＨＥＶとのみ反応することが可能な試薬に対する必要性が存在 する。加えて、純粋な、特定の単一特異的抗原を生成する能力は、明らかに、Ｈ ＥＶ抗原の正確な同定、特徴付け、及び精製に大変重要なものである。 ＨＩＶのような作用因子に対するスクリーニング検定結果の確認に様々な方法 を利用することが可能であるが、これらの技法はいまだＨＥＶの存在の確認に利 用することはできない。生体外（in vitro）でのＨＥＶの培養及びウイルスベー スのウェスタン・ブロット試験のような方法を利用することはできない。ＨＥＶ 核酸の検出はＰＣＲを実施することにより行うことはできるが、この技法は冗長 で高価なものであり、サーモサイクラー （thermocycler）のような特別な装置 を必要とし、所要時間が２４時間までかかる。免疫電子顕微鏡（ＩＥＭ）が抗− ＨＥＶ抗体の存在の確認に用いられているが、ＩＥＭの使用は日常的な確認手段 としては高価である。 したがって、被験試料中のＨＥＶ抗原又はＨＥＶ抗体をスク リーニングするための、正確、迅速で、かつコスト的に有効な方法に用いること が可能なモノクローナル抗体を提供することには利点がある。発明の要約 本発明は、ＨＥＶ ｏｒｆ−３抗原の検出に用いることが可能な、非常に特異 的な新規モノクローナル抗体及びそれらの断片を提供する。このモノクローナル 抗体は、カルボキシ末端でＨＥＶ ｏｒｆ−３タンパク質に特異的に結合する。 このモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマは：モノクローナル抗体（Ｈ ６７Ｃ４６）を分泌する、ハイブリドーマ細胞系Ｈ６７Ｃ４６（Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ ．受託番号ＨＢ１１５２１、１９９４年１月２７日にＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．に寄託） として同定されている。このモノクローナル抗体の特異性は、ＨＥＶ−ｏｒｆ− ３抗原を有利に同定することを可能とし、この同定は、ＨＥＶ感染の診断及び評 価の他に、ウイルス分化の研究に有用であり得る。 本発明のモノクローナル抗体は、ＨＥＶ抗原または抗体を検出するための免疫 検定において用いることができる。そのような免疫検定の多くのフォーマットは 当該技術分野において周知 であり、ＨＥＶ ｏｒｆ−３抗原に特異的に結合する既知量のモノクローナル抗 体を加えることにより変形することができる。 特に好ましい検定フォーマットは、被験試料中に存在し得るＨＥＶ抗体の存在 及び量を決定する競合検定である。この検定は、ＨＥＶ抗体を含むことが疑われ る被験試料を、ＨＥＶ抗原でコーティングした固相及び信号発生化合物を含む指 示試薬及びＨＥＶ ｏｒｆ−３抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体と、 被験試料及び固相及び／又は指示試薬及び固相の抗原／抗体複合体を形成するに 十分な時間及び条件下で接触させ：かつ、被験試料中のＨＥＶ抗体の存在を示す 、ネガティブ被験試料から発生する信号との比較による指示試薬の固相への結合 の減少を検出することにより、被験試料中に存在するＨＥＶ抗体の存在を決定す ることを包含する。 本発明のモノクローナル抗体を含む検定キットも記述される。図面の簡単な説明 図１は、プラスミドｐＪＯ２０１及びｐＧＥＸ−ＨＥＶ−ＯＲＦ３−８−５由 来の、ｏｒｆ−３ ＣＫＳ／ＨＥＶ ８−５抗原の生成に用いられるプラスミド の模式図である。発明の詳細な説明 本発明のモノクローナル抗体は、被験試料中にＨＥＶ抗原又は抗体が存在する 場合には、その存在を決定する様々な検定システムにおいて用いることができる 。提供されるモノクローナル抗体の断片もまた使用することができる。 本発明のモノクローナル抗体は、以下のようにしてスクリーニングすることが できる。組換えもしくは合成ＨＥＶ ｏｒｆ−３抗原を固相（好ましくは、ポリ スチレンビーズ）上に用いる。例えば、下記実施例１に記載されるようにして得 られるＣＭＰ−ＫＤＯシンセターゼ（ＣＫＳ）ＨＥＶ組換えｏｒｆ−３（８−５ ）を固相上に非精製（抽出及び可溶化）形態でコーティングする。あるいは、固 相上に（同時係属出願である、１９９３年７月９日出願の米国出願番号０８／０ ８９，８７７号に記載される通りに得られる）合成ペプチドｓｐＢ４−２を用い る免疫検定（ＥＩＡ）を利用する。非特異的結合の検出は、固相にＣＫＳのみを 、又は非ＨＥＶ−ＣＫＳ組換えタンパク質をコーティングすることにより達成さ れる。被験試料（マウス血清、組織培養上清、またはマウス腹水）を試料希釈液 中に連続的に希釈し、一部を各固相と共に４０℃で１〜２時間インキ ュベートする。その後、ビーズをバッファーで洗浄し、セイヨウワサビ・ペルオ キシダーゼ（horseradish peroxidase）（ＨＲＰＯ）−標識二次抗体を用いて結 合抗体を検出する。ビーズを結合体（conjugate）と共に４０℃で十分な時間イ ンキュベートし、前と同様に洗浄する。暗所にて、室温で３０分間、適切な基質 溶液を添加する。硫酸を加えて反応を停止させ、硫酸添加の２時間以内に、４９ ２ｎｍでの基質の吸光度を測定することにより発生した色の量を決定する。この 方法の詳細は、下記実施例部分に記載されている。 例えば、好ましい検定フォーマットにおいて、本発明のモノクローナル抗体を ＨＥＶ抗原に対する抗体を検出するための競合プローブとして用いることができ る。例えば、固相上にコーティングされたＨＥＶ抗原をＨＥＶに対する抗体を含 むと思われる被験試料と接触させ、本発明のモノクローナル抗体に結合されてい る、測定可能な信号を発生する信号発生化合物を含む指示試薬と共に、被験試料 と固相との、又は指示試薬と固相との抗原／抗体複合体を形成するに十分な時間 及び条件下でインキュベートする。発生する信号の減少によって立証される、本 発明のモノクローナル抗体の固相への結合の減少は、定量的に 測定することができる。確定したネガティブＨＥＶ被験試料から発生する信号と 比較して信号が測定可能な程度減少することは、被験試料における抗−ＨＥＶ抗 体の存在を示している。 ＨＥＶ抗原を検出する代替検定法においては、固相上にコーティングされてい るポリクローナルもしくはモノクローナル抗−ＨＥＶ抗体又はそれらの断片を、 ＨＥＶ抗原を含む可能性のある被験試料と接触させて混合物を形成する。この混 合物を、抗原／抗体複合体を形成するに十分な時間及び条件下でインキュベート する。その後、測定可能な信号を発生する信号発生化合物が結合している、ＨＥ Ｖ抗原に特異的に結合するモノクローナルもしくはポリクローナル抗体又はそれ らの断片を含む指示試薬を、抗原／抗体複合体と接触させて二次混合物を形成す る。次いで、この二次混合物を、抗体／抗原／指示試薬複合体を形成するに十分 な時間及び条件下でインキュベートする。被験試料中に存在し、かつ固相上に補 足されたＨＥＶ抗原の存在を、存在する場合には信号発生化合物によって発生さ れる測定可能な信号を検出することにより決定する。被験試料中に存在するＨＥ Ｖ抗原の量は、発生する信号に比例する。 あるいは、固体支持体に結合しているポリクローナルもしく はモノクローナル抗−ＨＥＶ抗体又はそれらの断片、被験試料及び、信号発生化 合物が付着しているＨＥＶ抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体もしくは ポリクローナル抗体又はそれらの断片を含む指示試薬を同時に接触させて混合物 を形成する。この混合物を、抗体／抗原／抗体複合体を形成するに十分な時間及 び条件下でインキュベートする。被験試料中に存在し、かつ固相に補足されたＨ ＥＶ抗原の存在を、存在する場合には信号発生化合物によって発生される測定可 能な信号を検出することにより決定する。被験試料中に存在するＨＥＶ抗原の量 は、発生する信号に比例する。この検定フォーマット、または上述の検定フォー マットにおいては、本発明のモノクローナル抗体を、捕捉相として、又は指示試 薬の一部としてのいずれかとして用いることができる。 さらに別の検出方法においては、本発明のモノクローナル抗体を、免疫組織化 学分析による固定化細胞及び固定化組織切片におけるＨＥＶ抗原の検出に、当該 技術分野における熟練者に周知の標準法により用いることができる。 加えて、このモノクローナル抗体をＣＮＢｒ−活性化セファロースに類似のマ トリックスに結合させ、細胞培養物、又は血 液及び肝臓のような生物学的組織からの特定のＨＥＶ抗原のアフィニティ精製に 用いることができる。 また、本発明のモノクローナル抗体は、治療もしくは他の類似の用途に用いら れるキメラ抗体の生成に用いることもできる。 このモノクローナル抗体又はそれらの断片は、個別に、ＨＥＶ抗原の検出に供 することができる。また、本明細書において提供される本発明のモノクローナル 抗体（及びそれらの断片）の組合せは、ＨＥＶに対して異なる特異性を有する他 のモノクローナル抗体と組み合わせて、各々異なる結合特異性を有するＨＥＶ抗 体の混合物または“カクテル”の成分として用いることもできる。したがって、 このカクテルは、ＨＥＶゲノムのｏｒｆ−３を指向する本発明のモノクローナル 抗体を、他のＨＥＶ領域を指向する異なるモノクローナル抗体と共に含むことが できる。このモノクローナル抗体のカクテルは、本明細書の検定フォーマットに 記述されている単一のモノクローナル抗体の代わりに用いられ得る。 検定フォーマットにおいて用いることができるポリクローナル抗体又はそれら の断片は、ＨＥＶ抗原に特異的に結合するべきである。好ましく用いられるポリ クローナル抗体は哺乳 動物起源のものであり、ヒト、ヤギ、ウサギまたはヒツジ抗−ＨＥＶポリクロー ナル抗体が含まれるが、これらに限定されるものではない。検定に用いられるポ リクローナル抗体は、単独で、またはポリクローナル抗体のカクテルとしてのい ずれかで用いることが可能である。検定フォーマットにおいて用いられるカクテ ルは、異なるＨＥＶ特異性を有するモノクローナル抗体もしくはポリクローナル 抗体のいずれかを含んでなるため、ＨＥＶタンパク質分化及び特異性の研究の他 に、ＨＥＶ感染の診断、評価及び予後に有用である。 本明細書に記載される本発明の方法によって試験することができる試料には、 全血、血清、血漿、脳脊髄液、尿のようなヒト及び動物体液、細胞培養上清のよ うな生物学的液体、固定化組織試料及び固定化細胞試料が含まれる。 “固相”は臨界的なものではなく、当該技術分野における熟練者により選択さ れ得るものである。したがって、ラテックス粒子、微粒子、磁性体もしくは非磁 性体ビーズ、膜、プラスチックチューブ、マイクロタイターウェルの壁面、ガラ スもしくはシリコン片及びタンニン処理（tanned）ヒツジ赤血球は、全て適切な 例である。固相にペプチドを固定化する適切な方法に は、イオン、疎水性、共有相互作用等が含まれる。本明細書で用いられる“固相 ”は、不溶性、または一連の反応によって不溶性にし得るあらゆる物質を指す。 この固相は、捕捉試薬を引き付けて固定化するそれ固有の能力について選択する ことができる。あるいは、固相は、捕捉試薬を引き付けて固定化する能力を有す るさらなる受容体を保持していてもよい。このさらなる受容体には、捕獲試薬自 体、または捕獲試薬に結合する荷電物質に関して反対に荷電している荷電物質が 含まれ得る。さらに別の代替物として、受容体分子が、固相に固定化され（結合 し）、特異的な結合反応によって捕捉試薬を固定化する能力を有するあらゆる特 異的結合部材であってもよい。この受容体分子は、検定の実施前、もしくは検定 の実施中における、捕捉試薬の固相部材への間接結合を可能にする。このように 、固相は、プラスチック、誘導プラスチック（ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ ｐｌａ ｓｔｉｃ）、磁性もしくは非磁性金属、試験管のガラスもしくはシリコン表面、 マイクロタイターウェル、シート、ビーズ、微粒子、チップ、及び当該技術分野 における通常の技術を有する者に周知の他の形態であり得る。 固相が、検出抗体の接近を十分可能にする孔隙率、及び抗原 の結合に適した表面親和性を有する適切な多孔性材料をも含み得ることが意図さ れており、本発明の範囲内にある。一般には、微細孔構造が好ましいが、水和状 態にあるゲル構造を有する材料も同様に用いることができる。このような有用な 固体支持体には： 天然ポリマー性炭水化物及びそれらの人工的修飾物、架橋もしくは置換誘導体 、例えば、寒天、アガロース、架橋アルギン酸、置換及び架橋グアールガム、セ ルロースエステル、特に硝酸及びカルボン酸とのセルロースエステル、混合セル ロースエステル、及びセルロースエーテル；窒素含有天然ポリマー、例えば、架 橋もしくは修飾ゼラチンを含むタンパク質及び誘導体；天然炭化水素ポリマー、 例えば、ラテックス及びゴム；適切な多孔性構造を備えて調製することができる 合成ポリマー、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリビ ニルクロライド、ポリビニルアセテート及びその部分的加水分解誘導体、ポリア クリルアミド、ポリメタクリレート、を含むビニルポリマー、ポリエステル、ポ リアミドのような上記重縮合体のコポリマー及びターポリマー、及びポリウレタ ンもしくはポリエポキシドのような他のポリマー；多孔性無機材料、例え ば、硫酸バリウム、硫酸カルシウム、炭酸カルシウムを含むアルカリ土類金属及 びマグネシウムの硫酸塩もしくは炭酸塩、アルカリ及びアルカリ土類金属、アル ミニウム及びマグネシウムのケイ酸塩；並びに、アルミニウムもしくはケイ素の 酸化物もしくは水和物、例えば、クレイ、アルミナ、タルク、カオリン、ゼオラ イト、シリカゲル、又はガラス（これらの材料は、上記ポリマー材料を用いてフ ィルターとして用いることができる）；並びに上記種類の混合物もしくはコポリ マー、例えば、予め存在する天然ポリマーに対して合成ポリマーの重合を開始す ることにより得られるグラフトコポリマーが含まれる。これらの材料の全ては、 フィルム、シートもしくは板のような適切な形で用いることができ、あるいは紙 、ガラス、プラスチックフィルム、もしくはファブリックのような適切な不活性 担体に被覆し、又は接着し、又は積層することができる。多孔性構造のニトロセ ルロースは、モノクローナル抗体を含む多彩な試薬に対する優れた吸収及び吸着 性を有している。また、ナイロンも類似の特性を有しており、適切なものである 。 上述の多孔性固体支持体は、好ましくは、約０．０１ないし０．５ｍｍ、好ま しくは約０．１ｍｍの厚さのシートの形態に あることが意図されている。細孔のサイズは広い範囲内で変化し得、好ましくは 約０．０２５ないし１５ミクロン、特には０．１５ないし１５ミクロンである。 固相の固有電荷を変化させ、もしくは増強するために、材料又は、固相支持材 によって保持される微粒子に、荷電物質を直接コーティングすることができる。 あるいは、カラム内に保持されることで、または可溶性試薬及び被験試料の混合 物中に懸濁させることにより微粒子を固相として作用させることが可能であり、 あるいは粒子自身を固相支持材に保持され、かつ固相化することができる。“保 持され、かつ固定化する”は、支持材上もしくは支持材中の粒子が支持材内の他 の位置に実質的に移動することが不可能であることを意味する。この粒子は、当 該技術分野における熟練者が適切な型の粒状物質から選択することができ、ポリ スチレン、ポリメチルアクリレート、ポリプロピレン、ラテックス、ポリテトラ フルオロエチレン、ポリアクリロニトリル、ポリカーボネート、または類似の物 質からなるものが含まれる。粒子の平均径は用いられる支持材の平均細孔サイズ よりも小さいことが好ましいが、粒子のサイズは臨界的ではない。したがって、 様々な他の固相を用いる態様も意図 されるものであり、本発明の範囲内にある。例えば、ＥＰ公開０３２６１００号 に対応する同時係属出願、米国特許出願１５０，２７８号及び米国特許出願３７ ５，０２９号（ＥＰ公開０４０６４７３号）に記載される、マイナス荷電ポリマ ーを用いる固定可能な反応複合体を固定化するためのイオン捕捉法を本発明に従 って使用し得、迅速な液相免疫化学反応を行うことが可能である。固定可能な免 疫複合体は、マイナス荷電ポリアニオン／免疫複合体と予め処理されたプラス荷 電多孔性マトリックスとの間のイオン相互作用により反応混合物の残りから分離 され、ＥＰＯ公開０２７３，１１５号に対応する同時係属出願、米国特許出願９ ２１，９７９号に記載の化学発光信号測定に記載されるものを含む、上述の様々 な信号発生システムを用いて検出される。 また、本発明の方法を、固相が微粒子を含有する自動及び半自動システムを含 む微粒子技術を利用するシステムにおいて使用するために適応させることもでき る。このようなシステムには、それぞれＥＰＯ出願公開ＥＰ ０ ４２５ ６３ ３号及びＥＰ ０ ４２４ ６３４号に対応する同時係属出願、米国特許出願４ ２５，６５１号及び米国特許５，０８９，４２４号、 並びに米国特許５，００６，３０９号に記載されるものが含まれる。 指示試薬は、外部手段によって検出可能な測定可能信号を発生することが可能 であり、且つＨＥＶに対する特異的結合要素に結合（付着）する信号発生化合物 （標識）を含む。本明細書で用いられる“特異的結合要素”は、特異的結合対の 構成要素を意味する。すなわち、分子の一方が化学的もしくは物理的手段により 第２の分子に結合する２つの異なる分子である。ＨＥＶに対する特異的結合対の 抗体要素であることに加えて、指示試薬はまた、ビオチンもしくは抗−ビオチン 、アビジンもしくはビオチン、炭水化物もしくはレクチン、相補的ヌクレオチド 配列、作動体もしくは受容体分子、酵素補因子及び酵素、酵素阻害剤もしくは酵 素等のハプテン−抗−ハプテンシステムのいずれかを含む、あらゆる特異的結合 対の構成要素でもあり得る。免疫活性特異的結合要素は、抗体、抗原、又はサン ドイッチ検定においてはＨＥＶ、競合検定においては捕捉試薬、もしくは間接検 定においては補助特定的結合要素のいずれかに結合することが可能な抗体／抗原 複合体であり得る。 意図される様々な信号発生化合物（標識）には、色素原、酵 素のような触媒、フルオレセイン及びローダミンのような発光化合物、化学発光 化合物、放射性元素、及び直接視認標識（derect visual labels）が含まれる。 酵素の例には、アルカリンホスファターゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、 β−ガラクトシダーゼ等が含まれる。特定の標識の選択は臨界的なものではない が、それ自体もしくは１以上のさらなる物質との結合によるいずれかで信号を生 成することが可能なものである。 様々な他の固相を用いる別の態様もまた意図されたものであり、本発明の範囲 内にある。例えば、ＥＰ公開０３２６１００号に対応する同時係属出願、米国特 許出願１５０，２７８号、及び米国特許出願３７５，０２９号（ＥＰ公開０４０ ６４７３号）（これらの両者は、共通の所有権を享受し、参照することによりこ こに組込まれる）に記載される、マイナス荷電ポリマーを用いて固定可能な反応 複合体を固定化するイオン捕獲法を本発明に従って用いて、迅速な液相免疫化学 反応を行うことが可能である。固定可能な免疫複合体は、マイナス荷電ポリアニ オン／免疫複合体と予め処理されたプラス荷電多孔性マトリックスとの間のイオ ン相互作用により反応混合物の残りから分離され、ＥＰＯ公開０２７３，１１５ 号に対応する同時係属出願、 米国特許出願９２１，９７９号（これは、共通の所有権を享受し、参照すること によりここに組込まれる）に記載される化学発光信号測定に記載されるものを含 む、上述の様々な信号発生システムを用いて検出される。 また、本発明の方法を、固相が微粒子を含有する自動及び半自動システムを含 む微粒子技術を利用するシステムにおいて使用するために適応させることもでき る。このようなシステムには、それぞれＥＰＯ出願公開ＥＰ ０ ４２５ ６３ ３号及びＥＰ ０ ４２４ ６３４号に対応する係属中の米国特許出願４２５， ６５１号及び米国特許４２５，６４３号（これらは、参照することによりここに 組込まれる）に記載されるものが含まれる。 免疫検定への走査型探針顕微鏡法（ＳＰＭ）の使用もまた、本発明のモノクロ ーナル抗体を容易に適合させ得る技術である。走査型探針顕微鏡法、特に原子間 力顕微鏡法においては、捕捉相、例えば、少なくとも１つの本発明のモノクロー ナル抗体を固相に付着させ、走査型探針顕微鏡を用いて固相の表面上に存在し得 る抗原／抗体複合体を検出する。走査型トンネル顕微鏡を用いることにより、抗 原／抗体複合体を検出するために多く の免疫検定システムにおいて通常必ず用いられる標識の必要性がなくなる。この ようなシステムは、係属中の米国特許出願６６２，１４７号に記載されている。 この特許出願は共通の所有権を享受し、参照することによりここに組込まれる。 特異的結合反応の監視には、多くの方式でＳＰＭを用いることができる。一態 様においては、特異的結合パートナーの１要素（本発明のモノクローナル抗体で あるアナライト（analyte）特異的物質）を走査に適切な表面に付着させる。こ のアナライト特異的物質の付着は、当該技術分野における通常の技術を有する者 に周知の方法に従ってプラスチックもしくは金属表面の固相を含む試験片に吸着 させることによるものであってもよい。または、誘導プラスチック、金属、シリ コン、もしくはガラスの固相を含む試験片への特異的結合パートナー（アナライ ト特異的物質）の共有結合性付着（covalent attachment）を用いることもでき る。共有結合性付着法は当該分野における熟練者に周知であり、試験片に特異的 結合パートナーを不可逆的に結合させる様々な手段が含まれる。試験片がシリコ ンもしくはガラスである場合には、特異的結合パートナーを付着させる前に、そ の表面を活性化しなければならない。トリエトキシアミノプ ロピルシラン（シグマ・ケミカル社（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， ）、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから入手可能）、トリエトキシビニルシラン（アル ドリッチ・ケミカル社（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，）、Ｍｉ ｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）、及び（３−メルカプト−プロピル）トリメトキシシラ ン（シグマ・ケミカル社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）のような活性化シラン化合 物を、それぞれ、アミノ−、ビニル及びチオールのような反応基の導入に用いる ことができる。このような活性化表面を結合パートナーの結合に直接用いること ができ（アミノもしくはチオールの場合）、あるいはグルタルアルデヒド、ビス （スクシンイミジル）スベレート、ＳＰＰＤ９（スクシンイミジル３−［２−ピ リジルジチオ］プロピオネート）、ＳＭＣＣ（スクシンイミジル−４−［Ｎ−マ レイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート）、ＳＩＡＢ（スクシ ンイミジル［４−ヨードアセチル］アミノベンゾエート）、及びＳＭＰＢ（スク シンイミジル４−［１−マレイミドフェニル］ブチレート）のようなリンカー（ linkers）とさらに反応させて結合パートナーを表面から分離することができる 。ビニル基を酸化して共有結合性付着の手段を供することが可能 である。また、これは、特異的結合パートナーの複数の付着点を提供し得る、ポ リアクリル酸のような様々なポリマーを重合するためのアンカー（anchor）とし て用いることもできる。アミノ表面を様々な分子量の酸化デキストランと反応さ せて、異なるサイズ及び受容能力を有する親水性リンカーを提供することができ る。酸化可能なデキストランの例には、デキストランＴ−４０（分子量４０，０ ００ダルトン）、デキストランＴ−１１０（分子量１１０，０００ダルトン）、 デキストランＴ−５００（分子量５００，０００ダルトン）、デキストランＴ− ２Ｍ（分子量２，０００，０００ダルトン）（これらは全てファルマシア（Ｐｈ ａｒｍａｃｉａ）、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪから入手可能である）またはフ ィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）（分子量７０，０００ダルトン）（シグマ・ケミカル 、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから入手可能）が含まれる。また、１９８８年１月２ ９日出願の係属中の米国特許出願１５０，２７８号、及び１９８９年７月７日出 願の係属中の米国特許出願３７５，０２９号（これらの各々は共通の所有権を享 受しており、参照することによりここに組込まれる）に記載される技術及び化学 を用いることにより、試験片表面上への特異的結合パ ートナーの固定化に高分子電解質相互作用を用いることができる。付着の好まし い方法は共有結合的手段によるものである。特異的結合要素の付着に続いて、非 特異的結合を最小限に止めるために、血清、タンパク質、または他のブロッキン グ剤等の材料で表面をさらに処理することができる。また、検定目的に対する適 正を確かめるために、表面の作製部位もしくは使用点のいずれかを走査すること もできる。この走査の過程が試験片の特異的結合特性を変化させることは予期さ れない。 本発明では固相の使用に対する優位が開示されているが、本発明のモノクロー ナル抗体が非固相検定システムにおいても利用可能であることも意図されている 。これらの検定システムは当該技術分野における熟練者には周知であり、本発明 の範囲内にあるものと考えられる。 本発明のモノクローナル抗体は、ＨＥＶ抗体の存在を検出するように設計され た検定において、陽性対照として使用することが可能である。被験試料中にＨＥ Ｖ抗体の存在を検出した検定において、ＨＥＶ抗原を捕捉相として用いることが できる。これらのＨＥＶ抗原は、ウイルス溶解物、ＨＥＶゲノムの様々な免疫原 性領域の合成ペプチド、及び／又は合成もしくは天然 抗原又は抗原のエピトープのいずれかを用いて作製された組換えタンパク質から 様々な手段により調製することができる。これらの型のＨＥＶ抗原が、本明細書 に記述されているものを含む様々な検定フォーマットにおいて捕捉相又は検出相 として使用可能であることも意図されたことである。当該技術分野における通常 の技術を有する者に周知の手順に従い、検定の実施において試験血清の代わりに 本発明のモノクローナル抗体を用いることにより、ＨＥＶ抗体を検出するために 提供される試薬が適切に機能したことが確実なものとなる。 検定に用いられる試薬を、１以上のバイアル（vials）もしくはボトルのよう な容器を備え、各容器にモノクローナル抗体、又はモノクローナル抗体のカクテ ルのような検定に用いられる個別の試薬を収容したキットの形態で提供し得るこ とは意図されたことである。また、これらのキットには、洗浄剤、処理試薬（pr ocessing reagents）及び指示試薬のような検定の実施に必要な他の試薬のバイ アルもしくは容器を含めることも可能である。 以下の実施例は、本発明のＨ６７Ｃ４６モノクローナル抗体の利点及び有用性 を、このモノクローナル抗体の開発、特徴付 け、エピトープ・マッピング及び臨床的有用性を記述することにより示す。モノ クローナル抗体の開発に用いられる方法は、当該技術分野において周知であり、 Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９４（１ ９７５）に詳述され、かつＪ．Ｇ．Ｒ．Ｈｕｒｒｅｌ，ｅｄ．，Ｍｏｎｏｃｌｏ ｎａｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｃｏ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８２）に再録されている手順に従う。 本発明を実施するために、ＨＥＶの完全長のｏｒｆ−３をＣＫＳとの融合タン パク質としてコードする遺伝子を含むように組換えＤＮＡクローンを構築した。 抗原（８−５タンパク質と命名された）をマウスの免疫に用い、このマウスから の免疫脾臓細胞をＳＰ２／０−Ａｇ１４ミエローマ細胞と融合させて、ＨＥＶ ｏｒｆ−３と反応する免疫グロブリン（Ｉｇ）クラスＧ₁（ＩｇＧ₁）のモノクロ ーナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞系を作製した。この免疫グロブリンは マウス腹水中に産生され、これをアフィニティクロマトグラフィーによって精製 した。 以下に示される実施例は、本発明の真意及び範囲を説明すること意味するもの であり、これらを限定することを意味するものではない。実施例１ ハイブリドーマの生成及び特徴付け Ａ．組換えＨＥＶタンパク質の生成 プラスミドｐＧＥＸ−ＨＥＶ−ＯＲＦ３−８−５（図１）をジーンラブス社（ Ｇｅｎｅｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）、Ｒｅｄｗｏｏｄ Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆｏｒｎ ｉａから入手した。これは、ｐＧＥＸ発現系において、ＨＥＶのｏｒｆ−３抗原 の完全な１２３アミノ酸をグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合 としてコードする。当該技術分野において周知の方法に従い、大腸菌内のプラス ミドｐＪ０２０１に、８−５タンパク質と命名された完全長のｏｒｆ−３をコー ドする遺伝子をクローン化し、ＣＭＰ−ＫＤＯシンセターゼ（ＣＫＳ）とのキメ ラ融合タンパク質として発現させた。このＣＫＳ／ＨＥＶ−８−５タンパク質は 、イソプロピルｂ−Ｄチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）による誘導後に、大腸菌Ｘ Ｌ１−Ｂｌｕｅ株において、全細胞タンパク質の２０％を超えて発現した。こ のクローンを１０リットル発酵器内で増殖させることにより、１発酵当り１７０ −２６０ｇの湿った細胞ペーストが生じた。 Ｂ．ＣＫＳ−ＨＥＶタンパク質可溶化 ８−５タンパク質を発現する大腸菌細胞を、ｐＨ１０で、様々なプロテアーゼ 阻害剤の存在下において溶解した。ＣＫＳ融合タンパク質は不溶性であり、遠心 後にペレット中に残存した。ペレットを様々な洗浄剤で洗浄して非特異的タンパ ク質を除去した。０．５％ＳＤＳを含有するトリス、ｐＨ８．５への可溶化の後 に、ＣＫＳ融合タンパク質がＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びゲル濃度測定による評価で全 タンパク質の５０ないし６０％を示すことが見出された。この可溶化タンパク質 をセファクリルＳ−３００ＨＲ（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００ＨＲ）カラム クロマトグラフィーによりさらに精製した。画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、 プールし、ゲル濃度測定により純度について評価した。最終精製タンパク質は、 ９０％を超える純度であった。 Ｃ．マウスの免疫 免疫計画（マウス４匹）は、最初の免疫と６及び９週目の追加免疫とで構成さ れた。最初の免疫に対しては、上述の通りに 調製された、１０μｇのＣＫＳ−ＨＥＶ ｏｒｆ−３ ８−５抽出、可溶化（未 精製）組換えタンパク質を完全フロイントアジュバント中に乳化した。このエマ ルジョンを４匹のマウスの腹腔内に接種した。免疫後３週間目に、マウスの血清 を以下のように酵素免疫検定（ＥＩＡ）免疫反応性についてスクリーニングした 。ＨＥＶ８−５をコーティングしたビーズに対する被験血清抗−ＨＥＶ力価は、 大腸菌及びＣＫＳ溶解物を含有しない試料希釈液中で１０⁶であり、大腸菌及び ＣＫＳ溶解物を含有する試料希釈液中では１０⁵であって、したがって、非特異 的タンパク質に対して僅か１０倍の反応性を示すのみであった。１９９３年７月 ９日出願の同時係属出願、米国特許出願０７／０８９，８７７号に記載される通 りに調製されたＨＥＶ ｏｒｆ−３合成ペプチドｓｐＢ４−２をコーティングし たビーズに対するこのマウス血清抗体の力価は５×１０³であり、ＨＥＶ ｏｒ ｆ−３タンパク質のカルボキシ末端に対する反応性を示していた。 第１の免疫の６週間後に、不完全フロイントアジュバント中１０μｇの免疫タ ンパク質で２匹のマウスの腹腔内に追加抗原投与を行った。９週目に、上記タン パク質ＨＥＶ８−５をコー ティングしたビーズに対する免疫後抗−ＨＥＶ力価は、不所望の反応性を妨げる 添加物を含有しない試料希釈液中で６．２５×１０⁶、添加物を含有する試料希 釈液中で２×１０⁶、並びにｓｐＢ４−２に対して６．２５×１０⁶であった。次 いで、このマウスに、免疫タンパク質３０μｇを静脈内（尾静脈を介して）に追 加抗原投与し、３日後に融合に用いた。 Ｄ．ハイブリドーマの確立 非免疫マウスから脾臓を無菌的に取り出し、シリンジのプランジャーを用いて それを破砕して少量のダルベッコ最小必須（ＤＭＥ）培地（Dulbecco's Minimum Essential medium）を収容する６０×１５ｍｍペトリ皿内に設けられた篩を通 すことにより正常マウス脾臓細胞を調製した。この脾臓細胞溶液をＤＭＥ培地で 洗浄し、細胞ペレットに１０ｍＭトリス中０．８３％ＮＨ₄Ｃｌの溶液１ｍｌを １分間添加することにより赤血球細胞を溶解した。この細胞を再び洗浄し、２０ ％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するＤＭＥ培地４０ｍｌ中に再懸濁した。 融合の当日に免疫マウスを殺して脾臓を取り出し、脾臓細胞を１０ｍｌのＤＭ Ｅ培地に再懸濁して計数することを除いて正 常脾臓細胞の調製についてここに記載される通りに処理した。記載された通常の 方法の変形（前出のＫｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）を用いて、脾臓 細胞を１：１の比でＳＰ²／０ミエローマ細胞系と融合させた。２０％ＦＢＳ、 ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン（ＨＡＴ）を含有する１．５ｍ ｌのＤＭＥ培地の存在下、２４−マルチ・ウェル組織培養トレイのウェル当り１ ×１０⁶個の脾臓細胞を塗布（plate）した。２４時間後、２４マルチ・ウェル（ ０．５ｍｌ）当り２００，０００個の正常脾臓細胞を添加した。第５日にＨＡＴ 培地を添加し、第７日に置き換えた。 融合から得られた９０の最初のハイブリッドのうちの４つがＨＥＶに対する抗 体について陽性であった。ハイブリッド＃６７（Ｈ６７）は、１：１００希釈で 試験した場合に、８−５抗原をコーティングしたビーズに対して０．９８８の光 学密度（Ｏ．Ｄ．）を有し、ＣＫＳのみをコーティングしたビーズに対しては陰 性であり、かつＨＥＶ合成抗原ｓｐＢ４−２ビーズに対しては１：１００希釈で １．４９８のＯ．Ｄ．を有していた。次いで、Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎ ａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃ ｔｉｃｅｓ ，２ｎｄ ｅｄ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８６）に記載される限界希釈技術により、Ｈ６７をウェル当り１細胞でク ローン化した。 Ｅ．限界希釈によるクローンの確立 抗体陽性ウェルにおける生育可能細胞の数を数え、９６マルチウェル組織培養 トレイの各々について、１００細胞を含有するアリコートを、２０％ウシ胎児血 清（ＦＢＳ）及び５×１０⁶個正常マウス脾臓細胞を含有する２０ｍｌのＤＭＥ 培地に添加した。０．２ｍｌに調整された８チャネル・ピペットマン（ｐｉｐｅ ｔｍａｎ）を細胞懸濁液の植付けに用いた。このトレイを加湿された５％ＣＯ₂ インキュベーターにおいて３７℃でインキュベートし、蒸発するため、第５日及 び第７日もしくは必要に応じて調整した（refed）。成長体を有するウェルが３ ０−５０％集密となったとき（通常１０−２１日）、１コロニーのみを有するウ ェルを試料とし、抗体活性について試験した。各ハイブリッドに由来する幾つか の陽性ウェルを選択し、細胞を拡大させた。ＨＥＶ ｏｒｆ−３（８−５）、特 にはｓｐＢ４−２カルボキシ末端領域に対する反応性を有する単一のクローン（ Ｈ６７Ｃ４６と命名された）が得られた。実施例２ Ｈ６７Ｃ４６モノクローナル抗体の生成及び精製 さらなる評価のために選択されたクローンを組織培養Ｔ−フラスコにおいてス ケールアップし、１０⁶個の細胞を予めプリスタン処理した（pre-pristaned）Ｂ ＡＬＢ／ｃマウス（チャールズ・リバー・バイオテクニカル・サービス社（Ｃｈ ａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｉｎ ｃ．）、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）（前出のＨｕｒｒｅｌｌを参照）の腹腔 内に注射した。注射の７−１０日後に腹水を採取し、遠心して凍結した。プロテ インＡセファロースＣＬ−４Ｂ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｃ Ｌ−４Ｂ）（ファルマシア−ＬＫＢバイオテクノロジース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ −ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ） で、抗体をアフィニティ精製した。結合したモノクローナル抗体をｐＨ５．５で カラムから溶出した。これは、そのサブタイプがＩｇＧ₁であることを示してい る。実施例３ Ｈ６７Ｃ４６モノクローナル抗体のスクリーニング及び特徴付け 抗体をスクリーニングし、特徴付けるため、異なる抗原を固相（ポリスチレン ビーズ）上に有する酵素免疫検定（ＥＩＡ）を用いた：ＣＫＳ−ＨＥＶ組換えｏ ｒｆ−３（８−５）（実施例１に記述される通りに調製）を非精製（抽出及び可 溶化）形態（純度約５０−６０％のＨＥＶタンパク質）又は精製タンパク質（純 度＞９０％）のいずれかの形態で固相にコーティングし、別のＥＩＡでは固相上 に合成ペプチドｓｐＢ４−２を用い、さらに非特異的結合を検出するために、固 相にＣＫＳ単独又は非ＨＥＶ ＣＫＳ組換えタンパク質をコーティングした。 全ての検定に対して、マウス血清、組織培養上清、マウス腹水試料又は上記で 得られたモノクローナル抗体（ＭＡｂ）Ｈ６７Ｃ４６を、リン酸緩衝生理食塩水 ／トリス／ＥＤＴＡ、ｐＨ７．８を２０％ヤギ血清、１０％ウシ胎児血清、１％ ウシ血清アルブミン、０．２％トリトン−Ｘ １００、０．１％ナトリウムアジ ドと共に含有し、さらに１％大腸菌溶解物及び０．０１％ＣＫＳを添加し、もし くは添加しない試料希釈液で５ない し１０倍に連続的に希釈し、次いで２００μｌを各固相と共に４０℃で１−２時 間インキュベートした。その後、ビーズを５ｍｌ蒸留水で３回洗浄した。２００ μｌのＨＲＰＯ−標識二次抗体（ヤギ抗−マウスＩｇＧ Ｈ＋Ｌ）（カークガー ド・アンド・ペリー・ラブス（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ Ｌ ａｂｓ）より入手）を、トリス緩衝生理食塩水を１０％ヤギ血清、１０％ウシ胎 児血清及び０．１５％トリトン−Ｘ１００と共に含有する結合希釈液（conjugat e diluent）中０．３μｇ／ｍｌで用いて、結合抗体を検出した。ビーズを結合 体（conjugate）と共に４０℃で１時間インキュベートし、前と同様に洗浄した 。Ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）基質を、ＯＰＤ希釈液（アボット（Ａｂｂ ｏｔｔ））５ｍｌ当り１つのＯＰＤタブレット（アボット）を添加することによ り新たに調製し、ＯＰＤ基質溶液３００μｌを洗浄したビーズの各々に加え、暗 所にて、室温で３０分間インキュベートした。硫酸１ｍｌを加えて反応を停止さ せ、硫酸添加後２時間以内に４９２ｎｍの基質の吸光度を測定することにより、 生じた色の量を決定した。下記表Ｉに示す結果は、抗体がＨＥＶのｏｒｆ−３領 域に対して特異的であったことを示している。 実施例４ ＨＥＶに対する抗体の競合検定 固相にＨＥＶ ｏｒｆ−３（８−５）又は、ｏｒｆ−３及びｏｒｆ−２領域を コードするタンパク質の組み合せをコーティングした。これらの固相を、ＨＥＶ 陰性ヒト血漿（陰性対照）又はＨＥＶ Ａｂを含むことが既知のヒト血漿（試料 ）の試料希釈液中１：２希釈液と共に、室温で一晩予備インキュベートした。次 に、ビーズを洗浄し、阻害剤が存在しない状態で １．０００−１．５００のＯ．Ｄ．を示すように希釈したＨＥＶ ｏｒｆ−３に 対する本発明のモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を適切なビーズに加えて４０℃で １時間インキュベートした。その後、ビーズを洗浄し、ＨＲＰＯ−ヤギ抗−マウ スＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を加えて４０℃で２時間インキュベートした。このビーズを 洗浄し、上述の通りにＯＰＤ基質を用いて標識の検出を行った。 理論的には、陽性ＨＥＶ Ａｂ含有試料は信号が５０％減少するはずである。 提示された実施例においては、ＨＥＶ Ａｂ陽性試料は、８−５ビーズが用いら れた場合にはＭＡｂＨ６７Ｃ４６の５７．６％の阻害を、ＨＥＶ ｏｒｆ−２／ ｏｒｆ−３組合せビーズを用いた場合には３５．３％の阻害を示した。これらの 結果を下記表IIに示す。 実施例５ ＨＥＶに対するｏｒｆ−３抗原の競合検定 固相に、ＨＥＶ ｏｒｆ−３（８−５）タンパク質又はｓｐＢ４−２合成ペプ チドをコーティングする。この検定フォーマットにおいて１．０００−２．００ ０のＯ．Ｄ．を示すことが予め決定されている濃度のモノクローナル抗体（ＭＡ ｂ）Ｈ６７Ｃ４６を、試料と共に、試料中のＨＥＶ抗原がＭＡｂに結合すること を可能とするに十分な長さの時間及び温度（３０−１２０分間、室温ないし４０ ℃）で、予備インキュベートす る。次いで固相を加え、混合物及びビーズを、残余の全ての未結合ＭＡｂが固相 に結合することを可能とするに十分な長さの時間及び温度（温度範囲：室温ない し４０℃、時間範囲：１−１６時間）でインキュベートする。その後、標識二次 抗体（例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）−標識ヤギ抗−マ ウスＩｇＧ）を用いた４０℃での１−２時間のインキュベーション、又はＭＡｂ 自身標識可能であってそれ故に検定を潜在的に一工程で実施可能とするＭＡｂを 用いて、ＭＡｂの固相への結合を検出する。次に、標識の検出を行う（すなわち 、ＨＲＰＯ標識Ａｂを用いる場合には、ＯＰＤ基質を添加し、３０分間インキュ ベートし、硫酸を添加して反応を停止させ、４９２ｎｍで読み取る）。陽性ＨＥ Ｖ抗原含有試料は、ＭＡｂの固相への結合を妨げ、信号を少なくとも５０％減少 させる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ // Ａ６１Ｋ 39/395 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/02 9282−4Ｂ 15/00 Ｃ (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． ＨＥＶ ｏｒｆ−３コード化タンパク質に特異的に結合し、ハイブリドー マ細胞系Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号ＨＢ１１５２２によって分泌されるモノクロ ーナル抗体の結合特異性を有する、モノクローナル抗体又はそれらの断片。 ２． Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号ＨＢ１１５２２によって分泌されるモノクロー ナル抗体又はそれらの断片。 ３． ＨＥＶ ｏｒｆ−３コード化タンパク質に特異的に結合するモノクローナ ル抗体又はそれらの断片を分泌するハイブリドーマ細胞系。 ４． ハイブリドーマ細胞系Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号ＨＢ１１５２２。 ５． ＨＥＶ抗原又は抗体の免疫検定における、ＨＥＶ ＯＲＦ−３抗原に特異 的に結合する既知量のモノクローナル抗体又はそれらの断片を添加する工程を包 含する改良。 ６． 被験試料中に存在し得るＨＥＶ抗体の量及び存在を決定するための競合検 定法であって、 ａ． ＨＥＶ抗体を含むと思われる被験試料を、少なくとも １つのＨＥＶ抗原がコーティングされている固相、及び測定可能な信号を発生す る信号発生化合物を含む指示試薬、及びＨＥＶ ｏｒｆ−３抗原に特異的に結合 するモノクローナル抗体と、被験試料及び固相及び／又は指示試薬及び固相の抗 原／抗体複合体を形成するに十分な時間及び条件下で接触させ、かつ ｂ． 被験試料中のＨＥＶ抗体の存在を示す、陰性被験試料から発生する信号 との比較での固相への指示試薬の結合の減少を検出することにより、被験試料中 に存在するＨＥＶ抗体の存在を決定する、 ことを包含する競合検定法。 ７． 前記モノクローナル抗体が、ハイブリドーマ細胞系Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託 番号ＨＢ１１５２２によって分泌されるモノクローナル抗体の結合特異性を有す る請求項８記載の方法。 ８． 前記信号発生化合物が、発光化合物、化学発光化合物、酵素及び放射性元 素からなる群より選択される請求項７記載の方法。 ９． 被験試料中のＨＥＶの存在を決定するための検定キットであって、ＨＥＶ ｏｒｆ−３領域に特異的に結合する少なく とも１つのモノクローナル抗体又はそれらの断片を収容する容器を含む検定キッ ト。 １０． 前記モノクローナル抗体が、細胞系Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号ＨＢ１１ ５２２によって分泌されるモノクローナル抗体の結合特異性を有している請求の 範囲第１２項記載の検定キット。