JPH09500915A - ハプテンで標識されたペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、（ａ）選択的に切り離すことができるように選択した第１アミノ側基上の保護基により反応性側基を保護したアミノ酸誘導体から所望のアミノ酸配列を有するペプチドを固相上で合成し、（ｂ）保護基を切り離し、少なくとも１個の遊離の第一級アミノ基を形成し、（ｃ）ペプチドの遊離の第一級アミノ基の少なくとも１個にハプテン活性エステル誘導体を結合し、（ｄ）所望により残存する保護基を切り離すことを特徴とするハプテンで標識されたペプチドの製造方法に関し、前記ハプテンは、ステロール、胆汁酸、性ホルモン、コルチコイド、カルデノリド、カルデノリド配糖体、ブファジエノリド、ステロイド−サポゲニン及びステロイドアルカロイドを含む群から選択される。

Description

【発明の詳細な説明】 ハプテンで標識されたペプチド 明細書 本発明はハプテンで標識されたペプチドの製造方法、該方法により取得可能な ハプテンで標識されたペプチド、及び免疫学的測定方法におけるこれらのペプチ ドの使用に関する。 体液中、特にヒト血清中の免疫グロブリンの検出は、微生物、特にHIV、肝炎 ウイルス等のウイルスによる感染を診断するために用いられる。被験試料中の特 異的免疫グロブリンの存在は通常、該特異的免疫グロブリンと反応する１種以上 の抗原との反応により検出される。試料液体中の特異的免疫グロブリンの検定方 法は、高感度で信頼性が高く、簡単且つ迅速でなければならない。 近年、放射性同位体を含まないマーカー基を利用した検出系がさかんに開発さ れており、このような系では光学（例えば発光又は蛍光）検出系、ＮＭＲ活性検 出系又は金属沈殿検出系によって被験試料中の分析対象物、例えば特異抗体の存 在を測定することができる。 ＥＰ−Ａ−０３０７１４９は、２種の組換えポリペプチドを抗原として使用す る抗体の免疫学的試験を開示しており、この試験では一方の組換え抗原を固相に 固定し、他方にマーカー基を担持させ、両者を異なる生物で発現させて試験の特 異性を高めている。 ＥＰ−Ａ−０３６６６７３は、精製標識抗原との反応および固相に結合された 同一精製抗原との反応によって抗体を検出する試料中の抗体の検出方法を開示し ている。 ＥＰ−Ａ−０３８６７１３は、２種の固体支持体を用いるHIV抗体の検出方法 を記載しており、この方法は種々のHIV抗原を２種の固体担体に固定し、各担体 を試料のアリコートと標識HIV抗原とに接触させ、少なくとも１回の試験で陽性 反応が生じるか否かにより抗体の存在を検出する。HIV抗原としては、組換えに より製造されたポリペプチドが開示されている。 ＥＰ−Ａ−０５０７５８６は、特異的免疫グロブリンの免疫学的試験の実施方 法を記載している。該方法は免疫グロブリンと結合することが可能な２種の抗原 と試料とを接触させる方法であり、第１の抗原は固体担体と結合するのに適した 基を有し、第２の抗原はマーカー基を有している。マーカー基は酵素、色原体、 金属粒子などの直接マーカー基でもよいし、間接マーカー基であってもよい。す なわち、抗原に結合されたこのマーカー基はさらにシグナル生成基を有するマー カー基のレセプターと反応することができる。このような間接マーカー基の１例 としてフルオレセイン誘導体が挙げられており、そのレセプターである抗体は酵 素に結合されている。抗原としてはＢ型肝炎表面抗原などのポリペプチドが開示 されている。この抗原に誘導体化によってＳＨ基が導入され、フルオレセインと 結合するために用いられる。 ＥＰ−Ａ−０５０７５８７は、ＩｇＭ抗体の特異的検出方法を開示している。 この方法は、被験抗体に対する標識抗体及び固相に結合することが可能な被験抗 体に対する第２の抗体と共に試料をインキュベートするものである。 従来技術から公知の免疫抗体検出方法は、通常、組換えＤＮＡ法により普通に 製造したポリペプチド抗原を使用している。しかし、このようなポリペプチド抗 原を用いると問題が生じる恐れがある。即ち、組換えポリペプチドはしばしば融 合ポリペプチドの形態のみで製造され、その場合、融合部分は試験で偽陽性の結 果を生じる恐れがある。また、組換えの発現により製造されるポリペプチドは、 試料溶液中での非常に安定性が低いことが多く、凝集する傾向がある。このよう なポリペプチドには、マーカー基を選択的且つ再現可能に導入できないことが多 いという欠点もある。 更に、組換えポリペプチド抗原の製造はコストが高く、組換えポリペプチド抗 原のロットにより免疫学的反応性に大きなばらつきが生じる恐れがある。 従って、本発明の目的は、簡単且つ効率的に免疫学的試験用抗原を製造するこ とができ、従来技術から公知である抗原の欠点を少なくとも部分的に解消する方 法を提供することである。また、このような方法ではマーカー基を抗原に選択的 且つ再現可能に導入できるはずである。 この目的は、（ａ）所望により選択的に切り離せるように選択した側鎖の第１ 級アミノ酸上の保護基により反応性側基を保護したアミノ酸誘導体から所望のア ミノ酸配列をもつペプチドを固相上で合成し、（ｂ）保護基を切り離して少なく とも１個の遊離の第１級アミノ基を形成し、（ｃ）ペプチドの少なくとも１個の 遊離の第１級アミノ基にハプテン活性エステル誘導体を結合し、（ｄ）所望によ り残存している保護基を切り離すことを特徴とするハプテンで標識されたペプチ ドの製造方法により達せられる。ハプテンは、ステロール、胆汁酸、性ホルモン 、コルチコイド、カルデノリド、カルデノリド配糖体、ブファジエノリド（bufa dienolides）、ステロイド−サポゲニン及びステロイドアルカロイドからなる群 から選択される。 本発明の方法により製造されるペプチドは、最長５０アミノ酸、特に好ましく は３０アミノ酸を有し、免疫学的検出法、特に特異的免疫グロブリンの定量に非 常に好適である。驚くべきことに、本発明の方法により製造されるペプチドは、 嵩高いハプテンマーカー基の存在にも拘わらず、測定しようとする免疫グロブリ ンに対して高い親和性と特異性とをもつことが判明した。 本発明の方法は、ハプテンマーカー基をその位置と個数に関して選択的に導入 することを可能にする。即ち、本発明によるペプチド合成では、使用するアミノ 酸誘導体の第１級アミノ基上で特定の保護基を用いることにより、保護基を選択 的切り離した後にハプテンとの反応に使用できるペプチド上のこれらの位置を個 々に選択することが可能である。こうして試験の再現性と感度を改善することが できる。 本発明の方法の別の利点は、ペプチド抗原を使用するのでＩｇＧ、ＩｇＭ、Ｉ ｇＥ及びＩｇＡなどのあらゆる抗体のクラスを認識できることにある。また、凝 集しにくい小型で安定な定義された抗原を使用するので、試験は干渉の影響を受 けにくい。 本発明の方法によりペプチドに結合するハプテンは、ステロール、胆汁酸、性 ホルモン、コルチコイド、カルデノリド、カルデノリド配糖体、ブファジエノリ ド、ステロイド−サポゲニン及びステロイドアルカロイドを含む群から選択され るステロイド骨格をもつ分子である。これらのハプテンは特異的レセプター、例 えばハプテンに対する抗体又は抗体のフラグメントと結合することができる。ハ プテンは、特に好ましくは、カルデノリド及びカルデノリド配糖体からなる群か ら選択される。これらの物質クラスの代表的な例はジゴキシゲニン、ジギトキシ ゲニン、ギトキシゲニン、ストロファンチジン、ジゴキシン、ジギトキシン、ジ トキシン及びストロファンチンであり、ジゴキシゲニンおよびジゴキシンが特に 好適である。 本発明の方法では、ハプテン活性エステル誘導体をペプチドのアミノ末端又は ／及び遊離第１級アミノ側基と結合する。本発明では「活性エステル」の用語は 、ペプチドの他の反応基と干渉性の副反応が生じないような条件の下で、ペプチ ドの遊離アミノ基と反応し得る活性化エステル基を包含することを意味する。Ｎ −ヒドロキシスクシンイミドエステルが活性エステル誘導体として好適に用いら れる。適切なハプテン活性エステル誘導体の例は、ジゴキシン−４"'−ヘミグル タレート−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ジゴキシゲニン−３−カル ボキシメチルエーテル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ジゴキシゲニ ン−３−Ｏ−メチルカルボニル−ε−アミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシ ンイミドエステル、ジゴキシゲニン−３−ヘミスクシネート−Ｎ−ヒドロキシス クシンイミドエステル、ジギトキシン−４"'−ヘミグルタレート−Ｎ−ヒドロキ シスクシンイミドエステル及びジギトキシゲニン−３−ヘミスクシネート−Ｎ− ヒドロキシスクシンイミドエステルである。これらのハプテン誘導体はBo ehri nger Mannheim Company GmbH（ドイツ国、マンハイム）から市販されている。Ｎ −ヒドロキシスクシンイミドエステル類に加え、ｐ−ニトロフェニル、ペンタフ ルオロフェニル、イミダゾール又はＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾールエステル 類などの類似体も使用することができる。 本発明の方法では、所望のアミノ酸配列をもつペぺプチドを、好ましくは市販 のペプチド合成機（例えば、Applied Biosystems製のＡ４３１又はＡ４３３型装 置）を用いて固相上で合成する。合成は、アミノ酸誘導体を用いてペプチドのカ ルボキシル末端から開始する公知の方法により行うことが好ましい。好ましくは アミノ酸誘導体を使用し、結合に必要なアミノ末端基をフルオレニルメチルオキ シカルボニル（Ｆｍｏｃ）残基で誘導体化する。使用するアミノ酸の反応性側基 は、ペプチド合成の完了後に容易に切り離せる保護基を含む。このような保護基 の好適な例は、トリフェニルメチル（Ｔｒｔ）、ｔ−ブチルエーテル（ｔＢｕ） 、 ｔ−ブチルエステル（０ ｔＢｕ）、ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）又は２ ，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル（Ｐｍｃ）などであ る。ハプテンで後から誘導体化しようとするペプチドの位置に第１級アミノ側基 を有するリジン残基又は他のアミノ酸誘導体のアミノ側鎖は、特定の反応条件下 、例えば酸の存在下で定量的に切り離せるように選択された第１のアミノ保護基 で保護する。このような酸に不安定な保護基の１例はＢｏｃである。ハプテンが 結合しないことを望まれる第１級アミノ側基をもつリジン残基又は他のアミノ酸 残基の側基は、第１の保護基を切り離せるような条件下ではそれ自体切り離せな いように選択された第２のアミノ保護基で保護する。第２の保護基はまた、ペプ チドを固相から切り離し、他の全ての保護基を切り離す条件の下で安定であるこ とが好ましい。このような第２の保護基の例は、フェニルアセチルなどの酸に耐 性の保護基である。２０種の天然アミノ酸に加えて、このペプチドはβ−アラニ ン、γ−アミノ酪酸、ε−アミノカプロン酸、ノルロイシン又はオルニチンなど の合成アミノ酸も含み得る。これらの合成アミノ酸は、天然アミノ酸と同様に保 護された形態で合成に用いられる。 合成の完了後、ハプテンを結合しようとする位置に配置された保護基（第１の アミノ保護基を含む）は、固相からペプチドを遊離した後に任意に切り離される 。その後、こうして得られた生成物を好ましくはＨＰＬＣにより精製する。次い で各場合に所望され且つ遊離の第１級アミノ基、即ちペプチドのアミノ末端基又 は／及びアミノ側基と反応するハプテン活性エステル誘導体とペプチドとを反応 させることにより、ハプテン標識を導入する。好ましくは、遊離の第１級アミノ 基当たり１．５〜２．５当量の活性エステルを用いる。次いで反応生成物を、好 ましくはＨＰＬＣにより精製する。 ペプチドがフェニルアセチルなどの第２の保護基で誘導体化されたアミノ基を 未だ含んでいる場合には、最終段階でこれらの保護基を除去する。フェニルアセ チル保護基は、例えば、有機溶媒を含む水溶液に可溶なペニシリンＧアミダーゼ 又は固定されたペニシリンＧアミダーゼを用いて、室温で酵素的に除去すること ができる。 本発明の方法により製造されるペプチドが分子内ジスルフィド結合を含む場合 には、合成の完了後で且つ最後のアミノ酸のＮ末端のＦｍｏｃ保護基を切り離す 前に、例えばヘキサフルオロイソプロパノール／ジクロロメタン中のヨウ素を用 いて固相上でこのペプチド配列を酸化することができ（Kamber and Hiskey in G ross E.and Meinhofer J.，The Peptides,Academic Press,New York，１９８１ 年，１４５〜１４７頁）、その後、Ｎ末端のＦｍｏｃ保護基を切り離す。 好ましくは、免疫学的に反応するエピトープ領域、即ち抗体が結合しているペ プチド配列、とスペーサー領域を含むペプチドとを合成する。この場合、少なく とも１個のハプテン標識をスペーサー領域に結合するのが好ましい。ペプチドの スペーサー領域にある標識は、多くの場合、免疫学的試験で良好な感度を示す。 好ましくは１〜１０アミノ酸長のスペーサー領域は、電荷を有するか又は／及 び水素結合を好適に形成するので、安定化及び可溶化効果を発揮する。また、こ のようなスペーサー領域は、数個の高分子量レセプターがハプテンで標識された ペプチドに結合するのを立体的に促進することができる。スペーサー領域のアミ ノ酸は、好ましくは、グリシン、β−アラニン、γ−アミノ酪酸、ε−アミノカ プロン酸、リジン及びＮＨ₂−［（ＣＨ₂）_nＯ］_x−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＯＯＨ（式 中、ｎは２又は３であり、ｘは１〜１０である）で表される構造式を有する化合 物からなる群から選択される。更に、スペーサー領域は、好ましくは少なくとも 数個の合成アミノ酸誘導体を含む。スペーサー領域は、好ましくは、ペプチドの アミノ末端又は／及びカルボキシ末端に配置される。 例えば、細菌、ウイルス及び原生動物などの病原生物や、自己免疫抗原からの エピトープ領域を含むペプチドは、本発明の方法により、好適に合成される。免 疫反応性エピトープ領域は、好ましくは、HIV I、HIV II、HIVサブタイプ０又は Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）などのウイルス性抗原から誘導される。 好ましくは、HIV I、HIV II又はHIVサブタイプ０のエピトープはgp32、gp41及 びgp120の領域から選択される。HCVエピトープは、好ましくは、非構造タンパク 質領域であるＮＳ３、ＮＳ４又はＮＳ５のコア／エンベロープ領域から選択され る。 HIV I、HIV II又はHIVサブタイプ０のアミノ酸配列のエピトープ領域は、特に 好ましくは、アミノ酸配列群： NNTRKSISIG PGRAFYT (I) NTTRSISIGP GRAFYT (II) IDIQEERRMR IGPGMAWYS (III) QARILAVERY LKDQQLLGIW GASG (IV) LGIWGCSGKL ICTTAVPWNA SWS (V) KDQQLLGIWG SSGKL (VI) ALETLLQNQQ LLSLW (VII) LSLWGCKGKL VCYTS (VIII) WGIRQLRARL LALETLLQN (IX)及び QAQLNSWGCA FRQVCHTTVP WPNDSLT (X) 又は、少なくとも６、好ましくは少なくとも８アミノ酸長を有するそれらの部分 配列から選択される。 アミノ酸配列Ｉ〜ＩＩＩは、HIV Iのgp120領域に由来し、アミノ酸配列ＩＶ〜Ｉ ＸはHIV Iのgp41領域に由来し、アミノ酸配列ＸはHIV IIのgp32領域に由来する 。アミノ酸配列Ｉ−Ｘは、配列表にも配列番号１〜１０として示す。配列Ｖ、Ｖ ＩＩＩ及びＸは各々、好ましくはジスルフィド結合の形で存在する２個のシステ インを含む。これらの配列はハプテン標識、好ましくはジゴキシゲニン又はジゴ キシン標識、上記Ｎ末端又は／及びＣ末端スペーサーを含み、ここには、特に好 ましくはジゴキシゲニン−３−カルボキシメチルエーテル標識を有する。エピト ープ領域内に位置するリジン残基はまた、標識された形で任意に存在し得る。 HCVのアミノ酸配列のエピトープ領域は、好ましくは、アミノ酸配列群： SRRFAQALPV WARPD (XI) PQDVKFPGGG QIVGGV (XII) EEASQHLPYI EQ (XIII) QKALGLLQT (XIV) SRGNHVSPTH YVPESDAA (XV) PQRKNKRNTN RRPQDVKFPG GGQIVGVV (XVI)及び AWYELTPAET TVRLRAYMNT PGLPV (XVII) 又は、少なくとも６、好ましくは少なくとも８アミノ酸長を有するそれらの部分 配列から選択される。配列ＸＩはHCVのＮＳ５領域に由来し、配列ＸＩＩ及びＸ ＶＩはHCVのコア領域に由来し、配列ＸＩＩＩ、ＸＩＶ及びＸＶはHCVのＮＳ４領 域に由来し、配列ＸＶＩＩはHCVのＮＳ３領域に由来する。アミノ酸配列ＸＩ〜 ＸＶＩＩは配列表に配列番号１１〜１７として示す。上記エピトープを有するペ プチドは、好ましくは、ハプテン標識された付加的なスペーサー領域を含む。 本発明の別の主題は、ハプテンで標識されたペプチドであり、このペプチドは 、最長５０アミノ酸、好ましくは３０アミノ酸長を有し、そのアミノ末端又は／ 及びアミノ側基が少なくとも１個のハプテン活性エステル誘導体と結合されてい る。このハプテンは、好ましくはジゴキシゲニン又はジゴキシンであり、活性エ ステルは、好ましくはＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである。 本発明のペプチドは、好ましくは、例えばヒト血清からの抗体と反応すること が可能な免疫学的に反応するエピトープ領域と、少なくとも１個のハプテン標識 を有する免疫学的に反応しないスペーサー領域とを含む。スペーサー領域は、好 ましくはペプチドのアミノ末端に位置し、１〜１０アミノ酸長をもつ。エピトー プ領域は、HIV I、HIV II又はHCV、HIVサブタイプＯなどのサブタイプを含む変 種も含めたアミノ酸配列に由来することが好ましく、アミノ酸配列Ｉ〜ＸＶＩＩ の１種又はそれらの部分配列である。 本発明は、また、試料液体中の特異抗体の免疫測定法における抗原としてハプ テンで標識されたペプチドの使用に関する。これらの抗体は、好適に定量され、 細菌、ウイルス又は原生動物などの微生物による感染を示す。ウイルスに対する 抗体、例えばHIV又は肝炎ウイルスに対する抗体は特に好適に定量される。試料 液体は、好ましくは血清、特に好ましくはヒト血清である。更に、本発明のハプ テンで標識されたペプチドを架橋試験方式の免疫学的方法で使用することが好ま しい。 本発明はまた、試料液体中の特異抗体の免疫測定法に関する。該方法は、（ａ ）被検定抗体に対する抗原であって、すでに定義したハプテンで標識されたペプ チドを含む第１の標識抗原と、（ｂ）シグナル生成基を有するハプテンのレセプ ターと共に試料液体をインキュベートし、ペプチドへの結合によって抗体を測定 することを特徴とする。ジゴキシン又はジゴキシゲニンで標識したペプチドを第 １の抗原として使用することが好ましく、ジゴキシゲニン又は／及びジゴキシン に対する抗体をレセプターとして使用することが好ましい。この点について、「 抗体」という用語は、抗体のフラグメント、例えばFab、Fab'、F(ab)₂、F(ab')₂ フラグメントなど又は他の抗体フラグメント例えば遺伝子工学により修飾された 他の抗体フラグメントをも包含する。レセプターをシグナル生成基、好ましくは ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ウレアー ゼ又はＱ−β−レプリカーゼなどの酵素に結合する。しかしながら、シグナル生 成基は色原基、放射活性のある基、ＮＭＲ活性基又は金属粒子（例えば金）でも よい。シグナル生成基は、酵素であることが好ましい。 本発明の免疫測定法は実際に、公知の試験方式、例えば単一の反応相からなる 均一系イムノアッセイ又は２反応相以上からなる不均一系イムノアッセイに従っ て行うことができる。不均一系試験方式が好適に使用され、固相の存在下で抗体 の存在が検出される。この試験方式の１例は、所謂二重抗原架橋試験法である。 この場合には、試料液体を固相の存在下で第１の抗原及び、第２の抗原と共にイ ンキュベートする。第２の抗原は被検定抗体に対するものであり、（ａ）固相に 結合しているか又は（ｂ）固相に結合できる形で存在する。固相又は／及び液相 中の標識を測定することにより、試料液体中の被検定抗体を定量する。第２の抗 原はビオチンで標識され、ストレプトアビジン又はアビジンで被覆した固相と結 合できることが好ましい。ビオチンで標識したペプチドを第２の抗原として使用 することが好ましい。 試験手順は、好ましくは、試料液体を固相上で第１の抗原及び第２の抗原と混 合し、第１の抗原、抗体及び固相に結合した第２の抗原の標識された固定化複合 体を得る段階を含む。他の抗体測定用試験フォーマットに比較して、架橋試験方 式は感度と特異性を改善をもたらし、即ち、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ及びＩｇＥ などの全ての免疫グロブリンのクラスが認識され、非特異的な反応性を低下させ る。二重抗原架橋試験の特異性と感度とは、２段階の試験手順が用いられ、この 手順が、試料液体を第１及び第２の抗原と第１段階で混合し、ついでシグナル生 成基を有する第１の抗原のハプテン標識のためのレセプターを添加するものであ る場合、さらに改善される。 固相に結合されたペプチドとハプテンで標識されたペプチドを抗原として用い る二重抗原架橋試験方式は、高力価の被検定抗体を含む試料を偽陰性と判定する 危険を減らすことができるという利点もある。これは、フック効果の結果、即ち ペプチド当たりのマーカー基の数を好ましくは２〜１０マーカー基まで増加する ことによる。ペプチド当たりのハプテンマーカー基の数が増加すると、レセプタ ーによるシグナル増幅の結果、直接検出可能なマーカー基を用いる試験手順と比 較してフック感度が向上する。 本発明の更に別の主題は、特異抗体の免疫学的測定用試薬であり、この試薬は 被検定抗体と反応する本発明の少なくとも１種のハプテンで標識されたペプチド を含む。二重抗原架橋試験でこのような試薬を使用する場合には、試薬が（ａ） ハプテンで標識されたペプチドと、（ｂ）シグナル生成基を有するハプテンのレ セプターと、（ｃ）被検定抗体と反応し、固相と結合しているか又は固相と結合 できる形で存在する別の抗原を含むことが好ましい。ハプテンは、カルデノリド 又はカルデノリド−配糖体であるとが好ましく、特に、ジゴキシン又はジゴキシ ゲニンであることが好ましい。ハプテンのレセプターはハプテンに対する抗体で あることが好ましく、シグナル生成基は酵素であることが好ましく、他の抗原は ビオチン化され、ストレプトアビジン又はアビジンで被覆された固相に結合でき ることが好ましい。 以下、実施例と配列表とにより本発明を更に説明する。 配列番号１：HIV Iのgp120領域からのエピトープのアミノ酸配列を示す； 配列番号２：HIV Iのgp120領域からの別のエピトープのアミノ酸配列を示す； 配列番号３：HIV I、サブタイプＯのgp1210領域からの別のエピトープのアミノ 酸配列を示す； 配列番号４：HIV Iのgp41領域からのエピトープのアミノ酸配列を示す； 配列番号５：HIV Iのgp41領域からの別のエピトープのアミノ酸配列を示す； 配列番号６：HIV Iのgp41領域からの更に別のエピトープのアミノ酸配列を示す ； 配列番号７：HIV I、サブタイプＯのgp41領域からのエピトープのアミノ酸配列 を示す； 配列番号８：HIV I、サブタイプＯのgp41領域からの別のエピトープのアミノ酸 配列を示す； 配列番号９：HIV I、サブタイプＯのgp41領域からの更に別のエピトープのアミ ノ酸配列を示す； 配列番号10：HIV IIのgp32領域からのエピトープのアミノ酸配列を示す； 配列番号11：HCVのNS５領域からのエピトープのアミノ酸配列を示す； 配列番号12：HCVのコア領域からのエピトープのアミノ酸配列を示す； 配列番号13：HCVのNS４領域からのエピトープのアミノ酸配列を示す； 配列番号14：HCVのNS４領域からの別のエピトープのアミノ酸配列を示す； 配列番号15：HCVのNS４領域からの更に別のエピトープのアミノ酸配列を示す； 配列番号16：HCVのコア領域からの別のエピトープのアミノ酸配列を示す； 配列番号17：HCVのNS３領域からのエピトープのアミノ酸配列を示す。実施例１ ハプテンで標識されたペプチドの製造 ハプテンで標識したペプチドを、バッチ式のペプチド合成機（例えば、Applie d Biosystems製Ａ４３１又はＡ４３３）を用いて、フルオレニルメチルオキシカ ルボニル（Ｆｍｏｃ）固相ペプチド合成により合成した。このために、表１に示 すアミノ酸誘導体を各４．０当量使用した。 リジン誘導体Ｋ１を、ハプテン標識を導入しない位置に用いた。リジン誘導体 Ｋ２を、ハプテン標識を導入しようとする位置に用いた。リジン誘導体Ｋ３を、 ε−アミノ基をペプチドのスペーサー領域にカップリングさせるために用いた。 アミノ酸又はアミノ酸誘導体をＮ−メチルピロリドンに溶解した。４−（２’ ，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃ−アミノメチル）フェノキシ樹脂（Tetr ahedron Letters、２８巻（１９８７年），２１０７頁）４００〜５００ｍｇ上 に０．４〜０．７ｍｍｏｌ／ｇをロードしてペプチドを合成した（ＪＡＣＳ ９ ５巻（１９７３年），１３２８頁）。カップリング反応は、反応媒体としてのジ メチルホルムアミド中で、Ｆｍｏｃ−アミノ酸誘導体に対して４当量のジシクロ ヘキシルカルボジイミド及び４当量のＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾールを用い て２０分間行った。各合成段階終了後に２０％ピペリジンを含むジメチルホルム アミド溶液を用いて、Ｆｍｏｃ基を２０分以内に切り離した。 システイン残基がペプチド配列中に存在する場合には、合成の完了直後にヨウ 素のヘキサフルオロイソプロパノール／ジクロロメタン溶液を用いて、固相上で 酸化を行う。 合成用樹脂からのペプチドの遊離と、酸に不安定な保護基（フェニルアセチル 保護基を除く）の切り離しは、４０分以内に、室温で、トリフルオロ酢酸２０ｍ ｌ、エタンジチオール０．５ｍｌ、チオアニソール１ｍｌ、フェノール１．５ｇ 及び水１ｍｌを用いて行われた。次に、反応溶液に冷ジイソプロピルエーテル３ ００ｍｌを加え、４０分０℃に保ち、ペプチドを完全に沈殿させた。沈殿を濾過 し、ジイソプロピルエーテルで再び洗浄し、少量の５０％酢酸に溶解し、凍結乾 燥した。得られた粗生成物を、デルタ−ＰＡＫ ＲＰ Ｃ１８樹脂（カラム５０ ×３００ｍｍ、１００Å、１５μ）上で、適当な濃度勾配溶離液（溶離液Ａ：水 、０．１％トリフルオロ酢酸、溶離液Ｂ：アセトニトリル、０．１％トリフルオ ロ酢酸）を用いる分取ＨＰＬＣにより、約１２０分間精製した。イオンスプレー 質量分析法により溶出された物質を同定した。 ハプテン標識、例えば、ジゴキシゲニン又はジゴキシン標識を、適当な活性エ ステル誘導体及びペプチドの遊離アミノ酸を用いて溶液中で導入した。誘導体化 するペプチドをＤＭＳＯと０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液ｐＨ８．５の混合液に 溶解した。次いで、遊離の第１級アミノ基当たり２当量の活性エステルを少量の ＤＭＳＯに溶解して滴下し、室温で撹拌した。分析用ＨＰＬＣにより反応をモニ ターした。生成物を分取ＨＰＬＣにより精製する。 ペプチドがフェニルアセチルで保護されたリジンをまだ含んでいる場合には、 最終段階で、有機溶媒を含むペニシリンＣアミダーゼ水溶液を用いて、この保護 基を室温で酵素的に切り離した。酵素は、例えば濾過によって分離し、ペプチド を分取ＨＰＬＣにより精製した。溶出された物質をイオンスプレー質量分析法に より同定した。 表２に示すペプチド化合物はHIV Ｉ及びHIV ＩＩの領域gp120、gp41及びgp32 に由来するものであり、ジゴキシゲニン−３−カルボキシメチルエーテル−Ｎ− ヒドロキシスクシンイミドエステル（ドイツ国、マンハイム、Boehringer Mannh eim GmbH）を用いて調製した。 下記表３に示すペプチドは、HCVのＮＳ５領域、ＮＳ４領域及びコア領域から 合成した。 ビオチンで標識されたペプチドは、ビオチン−ε誘導体化リジン残基（Ｆｍｏ ｃ−Ｌｙｓ（ビオチン）−ＯＨ）を用いて、Ｎ末端側を樹脂（ビオチン活性エス テル）上で誘導体化するか又は配列中で誘導体化することにより、合成した。実施例２ 好ましい試験手順による特異性と感度の改善 本発明のペプチドを用いる二重抗原橋試験の特異性と感度はまた、試料、ハプ テンで標識された抗原及び固相抗原を第１段階で混合し、ついで好ましくは１〜 ４時間後、特に好ましくは１．５〜２．５時間後に、抗ハプテン抗体を加える試 験手順により、改善することができる。 HIVエピトープgp41／１及びgp41／２（表２）を抗原として用いた。 好ましい２段階試験の試験条件は以下の通りであった： −５０ｍｍｏｌ／ｌの中性のリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）、０．２％ウ シ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．２％ラウリル硫酸ナトリウム（SDS）界面活 性剤 −インキュベーション時間 −ハプテンで標識された抗原と固相抗原と血清とのインキュベーション：１２ ０分 −抗ジゴキシゲニン抗体とペルオキシダーゼの複合体（＜Ｄｉｇ＞−ＰＯＤ） とのインキュベーション：６０分 −２，２’−アジノ−ジ−［３−エチルベンジルチアゾリン−スルホネート（ ６）］（ＡＢＴＳ）とのインキュベーション：６０分 −インキュベーション温度：２５℃ −全てのインキュベーション段階の間で結合体／遊離体を分離 選択できる別の２段階試験の試験条件は以下の通りであった： −５０ｍｍｏｌ／ｌの中性のリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）、0.2％ＢＳ Ａ、0.2％ＳＬＳ界面活性剤。 −インキュベーション時間 −固相抗原と血清とのインキュベーション：９０分 −ハプテンで標識された抗原と＜Ｄｉｇ＞−ＰＯＤとのインキュベーション： ９０分 −ＡＢＴＳとのインキュベーション：６０分 −インキュベーション温度：２５℃ −全てのインキュベーション段階の間で結合体／遊離体を分離 １段階試験の試験条件は以下の通りであった： −５０ｍｍｏｌ／ｌの中性のリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）、０．２％Ｂ ＳＡ、０．２％ＳＬＳ界面活性剤。 −インキュベーション時間 −両抗原と血清及び＜Ｄｉｇ＞−ＰＯＤとのインキュベーション：１２０分 −ＡＢＴＳとのインキュベーション：６０分 −インキュベーション温度：２５℃ −全てのインキュベーション段階の間で結合体／遊離体を分離 試験の結果を表４に示す。この結果から明らかなように、好ましい試験手順に おいて、著しく高いシグナルの相違、即ち陽性試料と陰性試料の測定シグナルの 比が得られる。 実施例３ 本発明のペプチド抗原を、二重抗原架橋試験で、組換えポリペプチド抗原と比 較した。本発明の実施例では、ジゴキシゲン化ペプチド抗原gp41／２（表２）を 同一配列のビオチン化ペプチド抗原と組み合わせて試験した。比較例では、ジゴ キシゲン化ポリペプチド抗原組替え gp41(Changら，Science ２２８巻(１９８ ５年)，９３〜９６頁)を、同一配列のビオチン化ポリペプチドと組み合わせて試 験した。 試験の結果を表５に示す。「ＮＣ」は陰性対照を表し、「ＰＣ」は陽性対照を 表す。「カットオフ」指数は実験の陽性判定と陰性判定の境界である。この指数 は２×ＮＣとして定義される。表５から明らかなように、組換えポリペプチド抗 原では陰性試料と陽性試料の差がほとんどないが、ペプチド抗原は非常に明瞭な 差が認められる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/532 0276−2Ｊ Ｇ０１Ｎ 33/532 Ｚ // Ｇ０１Ｎ 33/53 0276−2Ｊ 33/53 Ｊ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＣＮ，ＦＩ，Ｊ Ｐ，ＫＲ，ＮＯ，ＮＺ，ＵＳ (72)発明者 ザイデル，クリストフ ドイツ連邦共和国 ディー―82362 ヴァ イルハイム，アーメルシュトラーセ 39番 地 (72)発明者 ヴィーンフース，ウルスラ−ヘンリケ ドイツ連邦共和国 ディー―82152 クレ イリング，ブルグフリーデンシュトラーセ ８番地 (72)発明者 ファーツ，エルケ ドイツ連邦共和国 ディー―82396 ペー ル，クラメルシュトラーセ ３番地 (72)発明者 シュミット，ウルバン ドイツ連邦共和国 ディー―82386 オー バーハウゼン，ヴァルトシュトラーセ 36 番地

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ハプテンで標識されたペプチドを製造する方法であって、 （ａ）所望のアミノ酸配列を有するペプチドを、所望により選択的に切り離せる ように選択した第一のアミノ基上にある保護基により反応性側基を保護したアミ ノ酸誘導体から固相上で合成する段階と、 （ｂ）保護基を切り離し、少なくとも１個の遊離の第一級アミノ基を形成する段 階と、 （ｃ）ペプチドの遊離の第一級アミノ基の少なくとも１個にハプテン活性エステ ル誘導体を結合する段階と、 （ｄ）所望により残存する保護基を切り離す段階とを含み、ハプテンが、ステロ ール、胆汁酸、性ホルモン、コルチコイド、カルデノリド、カルデノリド配糖体 、ブファジエノリド、ステロイド−サポゲニン及びステロイドアルカロイドを含 む群から選択されるハプテンで標識されたペプチドの製造方法。 ２．請求項１に記載の方法であって、 前記ハプテンが、カルデノリド及びカルデノリド配糖体を含む群から選択され るハプテンで標識されたペプチドの製造方法。 ３．請求項２に記載の方法であって、 前記ハプテンがジゴキシゲニン、ジギトキシゲニン、ジトキシゲニン、ストロ ファンチジン、ジゴキシン、ジギトキシン、ジトキシン及びストロファンチンを 含む群から選択されるハプテンで標識されたペプチドの製造方法。 ４．請求項３に記載の方法であって、 ジゴキシゲニン又はジゴキシンを前記ハプテンとして使用するハプテンで標識 されたペプチドの製造方法。 ５．請求項１〜４のいずれかに記載の方法であって、 前記ハプテンが結合されるペプチドの位置に所定の反応条件下で定量的に切り 離すことができるアミノ側鎖の第１の保護基をもつアミノ酸誘導体を使用し、前 記ハプテンが結合されない位置に第１の保護基が切り離される反応条件の下では それ自身が切り離されないアミノ側鎖の第２の保護基を有するアミノ酸誘導体を 使用するハプテンで標識されたペプチドの製造方法。 ６．請求項５に記載の方法であって、 酸に不安定な第１の保護基と酸に安定な第２の保護基とを使用するハプテンで 標識されたペプチドの製造方法。 ７．請求項１〜６のいずれかに記載の方法であって、 Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを前記活性エステル誘導体として使用 するハプテンで標識されたペプチドの製造方法。 ８．請求項１〜７のいずれかに記載の方法であって、 免疫学的に反応するエピトープ領域とスペーサー領域とを含むペプチドを合成 し、少なくとも１個のハプテン標識を前記スペーサー領域に結合するハプテンで 標識されたペプチドの製造方法。 ９．請求項８に記載の方法であって、 前記スペーサー領域が１〜１０アミノ酸長を有するハプテンで標識されたペプ チドの製造方法。 １０．請求項８または９に記載の方法であって、 前記スペーサー領域がペプチドのアミノ又は／及びカルボキシ末端に位置する ハプテンで標識されたペプチドの製造方法。 １１．請求項８〜１０のいずれかに記載の方法であって、 前記スペーサー領域が電荷を有するアミノ酸又は／及び水素結合を形成するこ とが できるアミノ酸を含むハプテンで標識されたペプチドの製造方法。 １２．請求項８〜１１のいずれかに記載の方法であって、 前記スペーサー領域のアミノ酸が、グリシン、β−アラニン、γ−アミノ酪酸 、ε−アミノカプロン酸、リジン及びＮＨ₂−［（ＣＨ₂）_nＯ］_x−ＣＨ₂−ＣＨ₂ −ＣＯＯＨ（式中、ｎは２又は３であり、ｘは１〜１０である）で表される構造 式を有する化合物を含む群から選択されるハプテンで標識されたペプチドの製造 方法。 １３．請求項１〜１２のいずれかに記載の方法であって、 HIV I、HIV II又はHCVのアミノ酸配列からのエピトープ領域を含む前記ペプチ ドを合成するハプテンで標識されたペプチドの製造方法。 １４．請求項１３に記載の方法であって、 前記エピトープ領域がHIV I又はHIV IIのアミノ酸配列群： NNTRKSISIG PGRAFYT (I) NTTRSISIGP GRAFYT (II) IDIQEERRMR IGPGMAWYS (III) QARILAVERY LKDQQLLGIW GASG (IV) LGIWGCSGKL ICTTAVPWNA SWS (V) KDQQLLGIWG SSGKL (VI) ALETLLQNQQ LLSLW (VII) LSLWGCKGKL VCYTS (VIII) WGIRQLRARL LALETLLQN (IX)及び QAQLNSWGCA FRQVCHTTVP WPNDSLT (X) 又は少なくとも６アミノ酸長をもつそれらの部分配列から選択されるハプテンで 標識されたペプチドの製造方法。 １５．請求項１３に記載の方法であって、 前記エピトープ領域がHCVのアミノ酸配列群： SRRFAQALPV WARPD (XI) PQDVKFPGGG QIVGGV (XII) EEASQHLPYI EQ (XIII) QKALGLLQT (XIV) SRGNHVSPTH YVPESDAA (XV) PQRKNKRNTN RRPQDVKFPG GGQIVGVV (XVI)及び AWYELTPAET TVRLRAYMNT PGLPV (XVII) 又は少なくとも６アミノ酸長をもつそれらの部分配列から選択されるハプテンで 標識されたペプチドの製造方法。 １６．最大50アミノ酸長を有し、アミノ末端又は／及びアミノ側基を介して少な くとも１個のハプテン活性エステル誘導体と結合し、ステロール、胆汁酸、性ホ ルモン、コルチコイド、カルデノリド、カルデノリド−グリコシド、ブファジエ ノリド、ステロイド−サポゲニン及びステロイドアルカロイドを含む群から選択 されるハプテンで標識されたペプチド。 １７．請求項16に記載のペプチドであって、 前記ハプテンがジゴキシゲニン又はジゴキシンであるハプテンで標識されたペ プチド。 １８．請求項16または17に記載のペプチドであって、 前記ペプチドが免疫学的に反応するエピトープ領域とスペーサー領域とを含み 、前記スペーサー領域が少なくとも１種のハプテン標識を有するハプテンで標識 されたペプチド。 １９．請求項18に記載のペプチドであって、 前記スペーサー領域がペプチドのアミノ末端又は／及びカルボキシ末端に位置 するハプテンで標識されたペプチド。 ２０．請求項16〜19のいずれかに記載のペプチドであって、 前記エピトープ領域がHIV I、HIV II又はHCVのアミノ酸配列に由来するハプテ ンで標識されたペプチド。 ２１．請求項20に記載のペプチドであって、 前記エピトープ領域がHIV I又はHIV IIのアミノ酸配列群： NNTRKSISIG PGRAFYT (I) NTTRSISIGP GRAFYT (II) IDIQEERRMR IGPGMAWYS (III) QARILAVERY LKDQQLLGIW GASG (IV) LGIWGCSGKL ICTTAVPWNA SWS (V) KDQQLLGIWG SSGKL (VI) ALETLLQNQQ LLSLW (VII) LSLWGCKGKL VCYTS (VIII) WGIRQLRARL LALETLLQN (IX)及び QAQLNSWGCA FRQVCHTTVP WPNDSLT (X) 又は少なくとも６アミノ酸長をもつそれらの部分配列から選択されるハプテンで 標識されたペプチド。 ２２．請求項20に記載のペプチドであって、 前記エピトープ領域がHCVのアミノ酸配列群： SRRFAQALPV WARPD (XI) PQDVKFPGGG QIVGGV (XII) EEASQHLPYI EQ (XIII) QKALGLLQT (XIV) SRGNHVSPTH YVPESDAA (XV) PQRKNKRNTN RRPQDVKFPG GGQIVGVV (XVI)及び AWYELTPAET TVRLRAYMNT PGLPV (XVII) 又は少なくとも６アミノ酸長をもつそれらの部分配列から選択されるハプテンで 標識されたペプチド。 ２３．試料液体中の特異抗体の免疫検定法における抗原としての請求項１〜15の いずれかに記載の方法により製造したハプテンで標識されたペプチド、または請 求項16〜22のいずれかに記載のペプチドの使用。 ２４．架橋試験方式の免疫学的方法における請求項23に記載のペプチドの使用。 ２５．試料液体中の特異抗体の免疫検定法であって、 （ａ）被検定抗体に対する抗原であり、請求項１〜15のいずれかに記載の方法に より製造したハプテンで標識されたペプチド又は請求項16〜22のいずれかに記載 のペプチドを含む第一の標識抗原と、 （ｂ）シグナル生成基を有するハプテンのレセプター と共に試料液体をインキュベートし、 前記ペプチドに結合させて前記抗体を検出する試料液体中の特異抗体の免疫検定 法。 ２６．請求項25に記載の方法であって、 ジゴキシン又はジゴキシゲニンで標識したペプチドが前記第一の抗原として使 用され、ジゴキシゲニン又は／及びジゴキシンに対する抗体が前記レセプターと して使用される試料液体中の特異抗体の免疫検定法。 ２７．請求項25または26に記載の方法であって、 固相の存在下で第１の抗原及び（ａ）固相に結合しているか又は（ｂ）固相に 結合できる形で存在する、被検定抗体に対する第二の抗原と共に試料液体をイン キュベートし、固相又は／及び液相中の標識を検定することにより被検定抗体を 検出する試料液体中の特異抗体の免疫検定法。 ２８．請求項27に記載の方法であって、 ビオチンで標識された抗原を前記第二の抗原として使用し、ストレプトアビジ ン又はアビジンで被覆された固相を使用する試料液体中の特異抗体の免疫検定法 。 ２９．請求項28に記載の方法であって、 ビオチンで標識したペプチドを前記第二の抗原として使用する試料液体中の特 異抗体の免疫検定法。 ３０．請求項27〜29のいずれかに記載の方法であって、 試料液体を前記第一及び第二の抗原と混合し、次いで前記第一の抗原のハプテ ンのレセプターを添加する試料液体中の特異抗体の免疫検定法。 ３１．被検定抗体と反応し且つ請求項１〜15のいずれかに記載の方法により製造 された少なくとも１種のハプテンで標識されたペプチド、又は被検定抗体と反応 し且つ請求項16〜22のいずれかに記載のハプテンで標識されたペプチドを含む特 異抗体の免疫検定用試薬。 ３２．請求項31に記載の試薬であって、 （ａ）被検定抗体と反応する前記ハプテンで標識されたペプチドと、 （ｂ）シグナル生成基を有するハプテンのレセプターと、 （ｃ）被検定抗体と反応し、固相に結合されている別の抗原又は固相と結合でき る形で存在する別の抗原を含む特異抗体の免疫検定用試薬。