DE69324751T3 - Verfahren zur bestimmung von peptiden, die immunologisch wichtigen epitopen von hcv zugehörig sind - Google Patents

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Description

  • Das technische Problem, das der vorliegenden Erfindung zugrunde liegt, ist die Bereitstellung von Peptiden, welche immunologisch bedeutsamen Epitopen entsprechen, sowie die Verwendung dieser Peptide in diagnostischen oder immunogenen Zusammensetzungen.
  • Jüngste Entwicklungen in der Gentechnik sowie der Chemie der Festphasen-Peptidsynthese führten zu einer zunehmend breiteren Verwendung von synthetischen Peptiden in der Biochemie und Immunologie. Proteinsequenzen, welche als Ergebnis molekularer Klonierungstechniken verfügbar werden, können chemisch in großen Mengen fürstrukturelle, funktionelle und immunologische Untersuchungen synthetisiert werden. Peptide, welche immunologisch bedeutsamen Epitopen entsprechen, die auf viralen und bakteriellen Proteinen gefunden wurden, haben sich auch als hochspezifische Reagenzien erwiesen, welche für den Nachweis von Antikörpern und die Diagnose einer Infektion eingesetzt werden können.
  • Trotz der vielen Vorteile, die synthetische Peptide bieten, sind eine Reihe von Nachteilen mit ihrem Einsatz verbunden. Aufgrund ihrer relativ geringen Größe (im allgemeinen weniger als 50 Aminosäuren Länge) kann deren Struktur in der Abwesenheit des stabilisierenden Einflusses intramolekularer Wechselwirkungen, die im vollständigen Protein vorhanden sind, zwischen vielen verschiedenen Konformationen fluktuieren. Ferner bedeutet die geringe Größe dieser Peptide, daß deren chemische Eigenschaften und Löslichkeiten häufig recht verschieden von denjenigen des Proteins vollständiger Länge sein werden und daß der Beitrag individueller Aminosäuren in der Peptidsequenz hinsichtlich der Bestimmung der gesamten chemischen Eigenschaften des Peptids proportional größer sein wird.
  • Viele immunologische Assays erfordern, daß das zum Antikörpernachweis eingesetzte Antigen auf einem festen Träger immobilisiert ist. Die meisten Enzym-verknüpften Immuno-sorbens-Assays (ELISA) verwenden Polystyrol als feste Phase. Viele Proteine können stabil an die feste Phase adsorbiert werden und präsentieren Sequenzen, welche für nachfolgende Wechselwirkungen mit Antikörpern zur Verfügung stehen. Aufgrund ihrer geringen Größe führt die direkte Adsorption von Peptiden an die feste Phase aus einer Reihe von Gründen häufig zu unbefriedigenden Ergebnissen.
  • Erstens kann das Peptid nicht die richtige Gesamtladung oder Aminosäurezusammensetzung besitzen, welche dem Peptid die Bindung an die feste Phase ermöglichen würde. Zweitens können dieselben Aminosäurereste, welche für die Bindung an die feste Phase erforderlich sind, auch für Antikörpererkennung erforderlich sein und deshalb für die Antikörperbindung nicht zur Verfügung stehen. Drittens kann das Peptid nach der Bindung an die feste Phase in einer ungünstigen Konformation fixiert werden, welche es für Antikörpermoleküle nicht erkennbar macht. In vielen Fällen ist es weder möglich noch erforderlich, zwischen diesen Möglichkeiten zu unterscheiden. Die Bindung an die feste Phase kann erhöht und weniger beeinflußbar durch die spezifischen chemischen Eigenschaften eines Peptids gemacht werden, indem das Peptid zuerst an ein großes Trägermolekül gekoppelt wird. Typischerweise ist das Trägermolekül ein Protein.
  • Während die Menge des an die feste Phase gebundenen Peptids, obgleich indirekt, in einigen Fällen mit dieser Methode erhöht werden kann, steht diesem Ansatz die Tatsache entgegen, daß an der Verknüpfung zwischen dem Peptid und dem Trägerprotein häufig die Seitenketten von internen trifunktionellen Aminosäuren beteiligt sind, deren Integrität für die Erkennung durch Antikörper unverzichtbar sein mag. Die Bindungsaffinität von Antiseren für das intern modifizierte Peptid ist häufig im Vergleich zu dem unmodifizierten Peptid oder dem nativen Protein sehr stark verringert.
  • Die Produktion von Antiseren gegen synthetische Peptide erfordert ebenfalls in den meisten Fällen, daß das Peptid an einen Träger gekoppelt ist. Wiederum ist es wahrscheinlich, daß die Kopplungsreaktion zwischen einer internen trifunktionellen Aminosäure des Peptids und dem Träger die immunogenen Eigenschaften des Peptids ändert.
  • Es existieren viele Verfahren zur Durchführung von Kopplungsreaktionen und die meisten der gegenwärtig eingesetzten Verfahren werden detailliert erörtert in Van Regenmortel, M.H.V., Briand, J.P., Muller, S., und Plaue, S.; Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Bd. 19, Synthetic Polypeptides as Antigens, Elsevier Press, Amsterdam, New York, Oxford, 1988. Außer mit diesen Verfahren können ungeschützte Peptide auch unter Verwendung von im Handel erhältlichen Reagenzien wie N-Hydroxysuccinimidobiotin oder Biotinamidocaproat-N-hydroxysuccinimidester biotinyliert werden. Viele dieser Reagenzien werden in Billingsley, M.L., Pennypacker, K.R., Hoover, C.G., und Kincaid, R.L., Biotechniques (1987) 5(1):22-31, erörtert. Biotinylierte Peptide sind imstande, von den Proteinen Streptavidin und Avidin, zwei Proteinen, welche eine Bindung an Biotin von außerordentlich hoher Affinität zeigen, gebunden zu werden.
  • In bestimmten Fällen ist es möglich, Biotin selektiv an ein ungeschütztes Peptid zu koppeln oder ein ungeschütztes Peptid an einen Träger zu koppeln. Dies kann erreicht werden, indem das Peptid mit einer zusätzlichen, einem der Enden hinzugefügten, trifunktionellen Aminosäure synthetisiert wird, welche imstande ist, an der Kopplungsreaktion teilzunehmen. Dieser Ansatz wird jedoch nur erfolgreich sein, wenn diese Aminosäure kein entscheidender Rest in der immunogenen Sequenz von Interesse ist und wenn das gewählte Kopplungsmittelausreichend selektiv ist. Keine einzige Technik ist auf alle ungeschützten Peptide ungeachtet ihrer Aminosäurezusammensetzung anwendbar.
  • Das ätiologische Agens, welches für Non-A-Non-B-Hepatitis verantwortlich ist, wurde identifiziert und als Hepatitis C-Virus (HCV) bezeichnet. Die Patentanmeldung EP-A-0 318 216 offenbart Sequenzen, die etwa 80 % des viralen Genoms entsprechen. Die Verfügbarkeit dieser Sequenzen führte schnell zur Aufklärung der restlichen kodierenden Sequenzen, insbesondere der im 5'-Ende des Genoms lokalisierten Sequenzen (Okamoto; J. Exp. Med. 60, 167–177, 1990). Das HCV-Genom ist ein lineares Plus-Strang-RNA-Molekül mit einer Länge von etwa 9400 Nukleotiden. Mit Ausnahme von relativ kurzen nicht-translatierten Regionen an den Termini besteht das Genom aus einem großen ununterbrochenen offenen Leserahmen, der für ein Polyprotein von etwa 3000 Aminosäuren kodiert. Es wurde gezeigt, daß dieses Polyprotein mit der Translation in individuelle strukturelle und nicht-strukturelle (NS) virale Regionen gespalten wird. Die Strukturprotein-Region wird weiter in Capsid (Core)- und Hüll (E1 und E2) -Proteine unterteilt. Die NS-Regionen werden in die Regionen NS-1 bis NS-5 unterteilt.
  • In einer Reihe von unabhängigen Patentanmeldungen wurden eine Vielfalt von Strategien angewandt, um die Positionen von diagnostisch bedeutsamen Aminosäuresequenzen festzustellen, und viele dieser Studien führten zur Identifizierung ähnlicher Regionen des HCV-Polyproteins.
  • Die NS4-Region wurde hauptsächlich untersucht in EP-A-0 318 216, EP-A-0 442 394, US-5,106,726, EP-A-0 489 986, EP-A-0 484 787 und EP-A-0 445 801. Unglücklicherweise bilden nur 70 % der HCV-infizierten Personen Antikörper gegen NS4, weder die synthetischen noch die rekombinanten Proteine, welche Sequenzen aus dieser Region enthalten, eignen sich zur Identifizierung aller infizierten Serumproben. Die Nukleocapsid- oder Core-Region wurde in den Patentanmeldungen EP-A-0 442 394, US-5,106,726, EP-A-0 489 986, EP-A-0 445 801, EP-A-0 451 891 und EP-A-0 479 376 untersucht. Es wurde festgestellt, daß diese Peptide, oft als Mischungen eingesetzt, häufiger von Antikörpern (85–90 %) in Seren von chronisch infizierten Personen erkannt wurden als die von NS4 abgeleiteten Peptide. Die NS5-Region wurde in den Patentanmeldungen EP-A-0 489 986 und EP-A-0 468 527 untersucht. Je nach der eingesetzten Serumauswahl läßt sich bei mehr als 60 % von NANB-Hepatitis zeigen, daß gegen diese Peptide gerichtete Antikörper enthalten sind. Die NS3-Region wurde ebenfalls in der Patentanmeldung EP-A-0 468 527 untersucht. Alles verfügbare Beweismaterial legt nahe, daß das am stärksten dominierende Epitop von NS3 diskontinuierlicher Natur ist und von synthetischen Peptiden nicht adäquat dargestellt werden kann. Die E1-Region, welche als eine Region von der äußeren Oberfläche der Viruspartikel (mögliche immunogene Epitope) potentiell von Interesse ist, wurde in den beiden Patentanmeldungen EP-A-0 468 527 und EP-A-0 507 615 untersucht. Die E2/NS1-Region wurde aus demselben Grund wie E1 untersucht. Vergleiche dieser Region aus verschiedenen HCV-Varianten offenbarten, daß dieses Protein variable Regionen enthält, welche an die HIV-V3-Loop-Region des gp120-Hüllproteins erinnern. Vier Peptide wurden in EP-A-0 468 527 gefunden, von denen gezeigt wurde, daß sie relativ selten erkannte Epitope enthalten. Schließlich wurde die NS2-Region von HCV in EP-A-0 468 527 analysiert. Der diagnostische Wert dieser Region ist jedoch noch nicht klar. Praktisch alle Patentanmeldungen, welche diagnostisch nützliche synthetische Peptide für den Antikörpernachweis betreffen, beschreiben bevorzugte Kombinationen von Peptiden. Die meisten davon enthalten Peptide von dem HCV-Core-Protein und NS4. In einigen Fällen sind Peptide von NS5 (EP-A-0 489 968 und EP-A-0 468 527) und E1 und E2/NS1 enthalten (EP-A-0 507 615 und EP-A-0 468 527).
  • Die Entscheidung, ob ein Epitop von diagnostischem Nutzen ist oder nicht, ist immer klar und hängt bis zu einem gewissen Grad von der speziellen Konfiguration des Tests ab, in den es einbezogen wird. Es sollte Idealerweise ein immundominantes Epitop sein, welches von einem großen Prozentsatz tatsächlich positiver Seren erkannt wird, oder sollte imstande sein, andere Antigene in dem Test zu komplementieren, um die Nachweisrate zu erhöhen. Epitope, welche nicht häufig erkannt werden, können von diagnostischem Nutzen sein oder nicht, je nach dem Beitrag, den sie zur Erhöhung der Nachweisrate von Antikörpern in tatsächlich positiven Seren leisten, und dem Grad, in dem sich die Inkorporation dieser Epitope nachteilig auf die Empfindlichkeit des Tests aufgrund der Verdünnung anderer stärkerer Epitope auswirkt.
  • Peptide können deshalb eingesetzt werden, um Regionen von Proteinen zu identifizieren, welche spezifisch von Antikörpern erkannt werden, die als Folge von Infektion oder Immunisierung gebildet wurden. Im allgemeinen gibt es zwei Strategien, die verfolgt werden können. Eine dieser Strategien wurde von Geysen, H.M., Meloen, R.H., und Barteling, S.J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81:3998-4002, beschrieben. Dieser Ansatz beinhaltet die Synthese einer umfangreichen Serie von kurzen, überlappenden Peptiden auf Polyethylen-Stäbchen, die mit einem nicht-spaltbaren Linker derivatisiert sind, so daß die gesamte Länge des Proteins oder Proteinfragments von Interesse repräsentiert wird.
  • Die Stäbchen werden mit Antiseren inkubiert und die Antikörperbindung mit Hilfe eines Anti-Immunglobulin : Enzym-Konjugats nachgewiesen. Eine positive Reaktion identifiziert sofort die Lage und Sequenz von Epitopen, die in der Proteinsequenz vorhanden sind. Diese Technik hat den Vorteil, daß alle Peptide gleichmäßig über ihren Carboxyterminus mit dem festen Träger verknüpft sind. Während dieses Verfahren eine sehr genaue Kartierung von linearen Epitopen ermöglicht, ist die Länge der Peptide beschränkt, welche zuverlässig auf den Stäbchen synthetisiert werden können. Dies kann manchmal Probleme mit sich bringen, wenn die Länge des Epitops die Länge der synthetisierten Peptide übertrifft.
  • Ein zweiter Ansatz zur Epitop-Kartierung beinhaltet die Synthese größerer Peptide, gewöhnlich zwischen 15 und 30 Aminosäuren Länge, entlang der Sequenz des zu analysierenden Proteins. Aufeinanderfolgende Peptide können aneinander anschließen, sind jedoch vorzugsweise überlappend. Nach der Spaltung wird die Bewertung der Antikörperbindung an die individuellen Peptide durchgeführt und die ungefähren Positionen der Epitope können identifiziert werden. Ein Beispiel dieses Ansatzes wird in Neurath, A.R., Strick, N., und Lee, E.S.Y., J. Gen. Virol. (1990) 71:85-95, gegeben. Dieser Ansatz hat den Vorteil, daß längere Peptide synthetisiert werden können, welche mutmaßlich der homologen Sequenz im nativen Protein eher ähneln und welche bessere Targets für die Antikörperbindung bieten. Der Nachteil dieses Ansatzes ist, daß jedes Peptid chemisch einzigartig ist und daß die Bedingungen, unter denen jedes Peptid optimal eine feste Phase zur immunologischen Bewertung beschichten kann, hinsichtlich solcher Faktoren wie pH-Wert, Ionenstärke und Pufferzusammen setzung stark variieren können. Die Menge an Peptid, welche an die feste Phase adsorbiert werden kann, ist ebenfalls ein unkontrollierter Faktor, der für jedes Peptid einzigartig ist.
  • Von Grünigen et al. (Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 1991, 372:163-172) offenbaren zwei N-terminale Biotinylgastrin-Derivate, welche von an Polystyrol absorbiertem Avidin oder Streptavidin gebunden werden. Nach der Immobilisierung behalten diese Biotinylgastrine ihre antikörperbindende Kapazität vollständig, was die Entwicklung eines Sandwich-ELISA mit einer um eine Größenordnung höheren Empfindlichkeit als derStandard-ELISA mit Polystyrol-adsorbiertem Gastrin erlaubt.
  • Chan et al., (The Lancet, 1991, 338 : 1391) beschreiben serologische Auswirkungen auf die Infektion mit drei verschiedenen Typen des Hepatitis C-Virus.
  • Pollet et al. (Clinical Chemistry, 1991, 37:6, Abstract Nr. 0547) beschreiben die Verwendung synthetischer HCV-20-mer-Peptide zum Nachweis von HCV-Antikörpern. Eine Kombination von Peptiden aus den NS5-, NS4- und Core-Regionen war zur Maximierung der Anzahl reaktiver Seren erforderlich.
  • Das Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von Zusammensetzungen, enthaltend Peptide, die immunologisch bedeutsamen Epitopen auf Proteinen entsprechen sollen; für diagnostische Zwecke.
  • Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist auch die Bereitstellung von Zusammensetzungen, enthaltend Peptide, die immunologisch bedeutsamen Epitopen auf Proteinen entsprechen sollen, für Vakzin-Zwecke.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde eine Reihe von Peptiden, die immunologisch bedeutsame Regionen von viralen Proteinen repräsentieren, identifiziert und durch eine Festphasen-Peptidsynthese hergestellt. Es wurde festgestellt, daß diese Peptide sehr nützlich sind für (i) den Nachweis von Antikörpern gegen HCV. In einigen bevorzugten Anordnungen konnte für diese Peptide auch gefunden werden oder wurde zumindestens erwartet, daß sie bei der Stimulierung der Produktion von Antikörpern gegen HCV in gesunden Tieren, wie z.B. BALB/C-Mäusen, und in einer Vakzin-Zusammensetzung zur Verhinderung von HCV-Infektion von Nutzen sind.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft konkreter ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der folgendermaßen zusammengesetzten Gruppe:
    Figure 00070001
    worin A, falls vorhanden, wie in runden Klammern bezeichnet (eine) Aminosäure(n), eine Aminogruppe oder eine chemische Modifizierung des Aminoterminus der Peptidkette darstellt;
    • B – Biotin darstellt;
    • X – eine biotinylierte Verbindung, die während der Syntheseprozesses integriert ist, darstellt;
    • Y – eine kovalente Bindung darstellt;
    • B und X stehen in runden Klammern und weisen darauf hin, dass das Vorhandensein von Biotin oder einer biotinylierten Verbindung in diesen Position optional ist, mit der einzigen Bedingung, dass B oder X in mindestens einer der gezeigten Positionen vorhanden sind;
    • Z – (eine) Aminosäure(n), eine OH-Gruppe, eine NH2-Gruppe oder irgendeine dieser zwei Gruppen einschließende Verknüpfung darstellt; oder
    • Varianten von irgendeinem der oben festgelegten Peptide, wobei die Varianten Insertionen und konservierende sowie nicht-konservierende Aminosäuresubstitutionen hinsichtlich irgendeiner der oben festgelegten Aminosäuresequenzen darstellen, mit der Maßgabe, daß die Peptidvarianten in der Lage sind, einen immunologischen Kompetiton mit mindestens einer HCV-Typ-3-Art zu bewirken, oder
    • cyclische Versionen von irgendeinem der oben festgelegten Peptide, die durch Einbau einer thiolhaltigen Verbindung in die Peptidkette der oben festgelegten Aminosäuresequenzen so erhältlich sind, daß Mercaptogruppen bereitgestellt werden, die in einem anschließenden Cyclisierungsschritt zu verwenden sind.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Peptid wie oben definiert mit einer Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der folgendermaßen zusammengesetzten Gruppe:
    Figure 00080001
    worin A, B; X, Y und Z gleiche Bedeutung, wie oben beschrieben, haben.
  • Die Peptide von Interesse sollen immunologische Proteine oder Domänen von Proteinen, die von HCV kodiert werden, nachbilden. Nachdem für HCV Sequenzvariabilität festgestellt wurde, kann es wünschenswert sein, eine oder mehrere Aminosäure(n) zu variieren, um die Epitope verschiedener Stämme besser nachzubilden. Es versteht sich, daß die beschriebenen Peptide nicht mit irgendeiner bestimmten HCV-Sequenz identisch sein müssen, solange die betreffenden Verbindungen imstande sind, eine immunologische Kompetition mit mindestens einem Stamm von HCV zu bewirken. Die Peptide können deshalb Gegenstand von Insertionen und konservierenden sowie nicht-konservierenden Aminosäuresubstitutionen sein, wenn solche Änderungen bestimmte Vorteile hinsichtlich ihrer Verwendung bieten könnten. In bestimmten Fällen kann es wün-schenswert sein, zwei oder mehr Peptide zusammen zu einer Einzelstruktur zu verbinden. Die Bildung eines solches Verbunds kann kovalente oder nicht-kovalente Bindungen beinhalten.
  • Von besonderem Interesse sind biotinylierte Peptide von HCV, in welche Cystein, Thioglycolsäure oder andere thiolhaltige Verbindungen in die Peptidkette inkorporiert wurden, um Mercaptogruppen bereitzustellen, welche zur Cyclisierung der Peptide eingesetzt werden können.
  • Es versteht sich, daß auch andere Peptide, entsprechend HCV-Typ-3-Isolat-Sequenzen, die immunologisch bedeutsamen Regionen entsprechen, wie sie für HCV Typ 1 und Typ 2 bestimmt wurden, ebenfalls in der erfndungsgemäßen Zusammensetzung enthalten sein können.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Hybridpeptid, welches in seiner Aminosäuresequenz eine kovalent oder nicht-kovalent verbundene Kombination aus mindestens zwei Peptiden wie oben definiert umfaßt, die möglicherweise durch Spacergruppen, vorzugsweise Gly- und/oder Ser-Gruppen, getrennt sind.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Peptid, welches an Streptavidin oder Avidin gebunden ist, wobei das Streptavidin bzw. Avidin seinerseits möglicherweise an eine feste Phase gebunden ist.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Peptid wie oben definiert, wobei das Peptid über seine Biotingruppe an auf einer Nylonmembran vorliegendes Streptavidin gebunden ist.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Peptid wie oben definiert, wobei das Peptid mit einem festen Träger über kovalente oder nicht-kovalente Wechselwirkungen verankert ist.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Nachweis von in einer biologischen Probe vorliegenden Antikörpern gegen HCV, umfassend:
    • (i) Kontaktieren der biologischen Probe, die auf die Gegenwart von HCV zu analysieren ist, mit Peptid(en) wie oben definiert,
    • (ii) Nachweis des zwischen den Antikörpern und dem (den) Peptid(en) gebildeten Immunkomplexes.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Bestimmung des in einer Probe vorhandenen HCV-Typs, umfassend:
    • (i) Kontaktieren der biologischen Probe, die auf die Gegenwart von HCV zu analysieren ist, mit Peptid(en) wie oben definiert,
    • (ii) Nachweis des zwischen den Antikörpern und dem (den) Peptid(en) gebildeten Immunkomplexes.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren wie oben definiert, wobei in Schritt (i) die biologische Probe auch mit mindestens einem HCV-Typ-2-NS4-Peptid kontaktiert wird, das ausgewählt ist aus:
  • Figure 00100001
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren wie oben definiert, wobei die biologische Probe auch mit mindestens einem HCV-Typ-1-NS4-Peptid kontaktiert wird, das ausgewählt ist aus:
  • Figure 00100002
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen immunologischen Assay zum Nachweis von HCV-Antikörpern unter Einsatz eines Peptids (von Peptiden) wie oben definiert.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen immunologischen Assay zum Nachweis von HCV-Antikörpern unter Einsatz eines Peptids wie oben definiert, wobei das Peptid mit einem Antigen oder einem an eine feste Phase gebundenen Peptid, wie oben definiert, konkurrieren kann.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen immunologischen Assay zum Nachweis von HCV-Antikörpern wie oben definiert, wobei die Peptide an eine Membran in Form paralleler Linien gebunden sind.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen immunologischen Assay zum simultanen Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit von Antikörpern gegenüber verschiedenen HCV-Genotypen in einer Probe unter Einsatz eines Peptids wie oben definiert.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft einen immunologischen Assay wie oben definiert, bei dem ferner ein wie oben definiertes NS4-Typ-2-Peptid eingesetzt wird.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft einen immunologischen Assay wie oben definiert, bei dem ferner ein wie oben definiertes HCV-NS4-Typ-1-Peptid eingesetzt wird.
  • Die Synthese der Peptide kann in Lösung oder auf einem festen Träger erzielt werden. Syntheseprotokolle verwenden im allgemeinen t-Butyloxycarbonyl- oder 9-Fiuorenylmethoxycarbonyl-geschützte aktivierte Aminosäuren. Die Verfahren zur Durchführung der Synthese, die Aminosäureaktivierungstechniken, die Arten der Seitenkettenherstellung und die Spaltverfahren werden eingehend in beispielsweise Stewart und Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2. Auflage, Pierce Chemical Company, 1984, und Atherton und Sheppard, Solid Phase Peptide Synthesis, IRL Press, 1989, beschrieben.
  • Der Einsatz von biotinylierten Peptiden zur Bestimmung von Antikörpern ist bezüglich der Peptidlänge nicht beschränkt und vermeidet die Schwierigkeiten, welche mit der direkten Beschichtung der festen Phase mit Peptiden für die immunologische Bewertung verbunden sind.
  • Die Verwendung von biotinylierten Peptiden im erfindungsgemäßen Verfahren ergibt eine solche Verankerung der Peptide an einem festen Träger, daß sie die essentiellen Aminosäuren frei für eine Erkennung durch Antikörper beläßt.
  • Der Begriff „Verankerung eines Peptids an einem festen Träger" bedeutet die Verknüpfung des Peptids mit einem Träger über kovalente Bindungen oder nicht-kovalente Wechsel-Wirkungen, so daß das Peptid immobilisiert wird.
  • Der feste Träger kann Nitrocellulose, Polystyrol, Nylon oder irgendein anderes natürliches oder synthetisches Polymer sein.
  • Der Einsatz von biotinylierten Peptiden im erfindungsgemäßen Verfahren ermöglicht es den biotinylierten Peptiden, frei ein breites Spektrum von Konformationen einzunehmen, von denen mindestens eine für die Bindung von Antikörpern an diese biotinylierten Peptide geeignet ist.
  • Biotinylierte Peptide können zur Verwendung im Verfahren der Erfindung ausgewählt werden. Jedoch sind einige davon auch ohne Biotinylierung und ohne Beteiligung an einem Komplex von Avidin oder Streptavidin imstande, an einem festen Träger verankert zu werden und mit Antikörpern zu reagieren, welche spezifisch das Epitop innerhalb dieses Peptids erkennen. In diesem Fall resultiert der Einsatz von biotinylierten Peptiden in einer offensichtlichen Erhöhung der Antigenizität von Peptiden bezüglich der beobachteten Antigenizität, wenn die Peptide nicht biotinyliert sind. Der Ausdruck „offensichtlich" soll eine beobachtete Veränderung anzeigen, welche unter ähnlichen Testbedingungen erhalten wird, ungeachtet des absoluten Grundes der beobachteten Veränderung.
  • „Antigenizität" bedeutet die Eigenschaft eines Peptids, von einem Antikörper gebunden zu werden.
  • „Erhöhung der Antigenizität" bedeutet, daß ein positives Signal für eine Verdünnung erhalten wird, welche mindestens zweimal die Verdünnung der nicht-biotinylierten Peptide ist. Dieses positive Signal ist von derselben Größenordnung, wie das für nicht-biotinylierte Peptide erhaltene Signal.
  • Mit anderen Worten, der Erhalt eines positiven Signals kann für eine kleinere Mengebiotinylierten Peptids im Vergleich zur Menge des nicht-biotinylierten Peptids erreicht werden.
  • Ein bevorzugtes Verfahren zur Durchführung der in vitro-Bestimmung von Antikörpern erfolgt mit Hilfe eines Enzym-verknüpften Immunosorbens-Assays (ELISA). Dieser Assay verwendet eine feste Phase, welche im allgemeinen eine Polystyrol-Mikrotiterplatte oder -Perle ist. Die feste Phase kann jedoch jegliches Material sein, welches zur Bindung eines Proteins imstande ist, entweder chemisch über eine kovalente Bindung oder durch passive Adsorption. In dieser Hinsicht können Membranen auf Nylonbasis ebenfalls als besonders vorteilhaft betrachtet werden. Die feste Phase ist mit Streptavidin oder Avidin beschichtet und nach einer geeigneten Zeitspanne wird überschüssiges ungebundenes Protein durch Waschen entfernt. Jegliche unbesetzten Bindungsstellen auf der festen Phase werden dann mit einem irrelevanten Protein wie Rinderserumalbumin oder Casein blockiert.
  • Eine Lösung, welche die Mischung oder Auswahl von biotinylierten Peptiden enthält, wird anschließend mit der Streptavidin- oder Avidin-beschichteten Oberfläche in Kontakt gebracht und die Bindung ermöglicht. Ungebundenes Peptid wird durch Waschen entfernt. Alternativ wird biotinylierten Peptiden die Bildung von Komplexen mit entweder Avidin oder Streptavidin gestattet. Die resultierenden Komplexe werden zur Beschichtung der festen Phase eingesetzt. Nach einer geeigneten Inkubationsspanne wird ungebundener Komplex durch Waschen entfernt. Eine geeignete Verdünnung eines Antiserums oder einer anderen Körperflüssigkeit wird mit der festen Phase in Kontakt gebracht, an die das Peptid gebunden ist. Die Inkubation wird für eine ausreichende Zeit durchgeführt, um das Stattfinden der Bindungsreaktion zu ermöglichen. Anschließend werden ungebundene Komponenten durch Waschen der festen Phase entfernt. Der Nachweis der Immunkomplexe wird durch den Einsatz von heterologen Antikörpern erzielt, welche spezifisch an die im Testserum vorhandenen Antikörper binden und welche mit einem Enzym konjugiert wurden, vorzugsweise, jedoch nicht beschränkt auf, Meerrettichperoxidase, alkalische Phosphatase oder β-Galaktosidase, welches imstande ist, ein farbloses oder nahezu farbloses Substrat oder Co-Substrat in ein stark gefärbtes Produkt zu überführen oder in ein Produkt, welches imstande ist, einen gefärbten Komplex mit einem Chromogen zu bilden, der bzw. das visuell nachgewiesen oder spektralphotometrisch gemessen werden kann.
  • Andere im Stand der Technik bekannte Nachweissysteme können jedoch eingesetzt werden und schließen diejenigen ein, bei denen die Menge des gebildeten Produkts elektrochemisch oder luminometrisch gemessen wird. Das Nachweissystem kann auch radioaktiv markierte Antikörper einsetzen, in welchem Fall die Menge des Immunkomplexes mittels Szintillationszählung oder Zählung quantitativ bestimmt wird. Im Prinzip kann jede Art eines biologischen Tests zum Nachweis von Antikörpern eingesetzt werden, solange der Test von dem Komplex zwischen entweder Streptavidin oder Avidin und (einem) wie oben beschrieben synthetisierten biotinyliertem(en) Peptid(en) Gebrauch macht.
  • Ebenfalls eingeschlossen sind Kompetitions-Assays, bei denen man Streptavidin- oder Avidinbiotinyliertes-Peptid-Komplexe in Lösung mit dem an eine feste Phase gebundenen Antigen um Antikörperbindung konkurrieren läßt, oder Assays, bei denen man freies Peptid in Lösung mit an eine feste Phase gebundenen Streptavidin- oder Avidin:biotinyliertes-Peptid-Komplexen konkurrieren läßt. Beispielsweise werden die vielen Arten von immunologischen Assays zum Nachweis und zur quantitativen Bestimmung von Antikörpern und Antigen detailliert erörtert (Tijssen, P., Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, Elsevier Press, Amsterdam, Oxford, New York, 1985).
  • Die immunologischen Assays können auf einzelne biotinylierte Peptide beschränkt sein. Vorzugsweise wird jedoch eine Mischung von biotinylierten Peptiden eingesetzt, die mehr als ein Epitop einschließt, das von dem oder den infektiösen Agens/Agenzien abgeleitet ist, für welches) die Anwesenheit spezifischer Antikörper gemessen werden soll.
  • Ein weiteres bevorzugtes Verfahren zur Durchführung der in vitro-Bestimmung von Antikörpernachweis ist der Linien-Immun-Assay (LIA).
  • Dieses Verfahren zum Antikörpernachweis besteht im wesentlichen aus den folgenden Schritten:
    • – die Antigene, in Form der zu testenden oder einzusetzenden biotinyliertes-Peptid:Streptavidin- oder Avidin-Komplexe, werden als parallele Linien auf eine Membran aufgebracht, welche imstande ist, das zu testende Antigen kovalent oder nicht-kovalent zu binden,
    • – nicht besetzte Bindungsstellen auf der Membran werden mit einem irrelevanten Protein wie Casein oder Rinderserumalbumin blockiert,
    • – die Membran wird in Streifen geschnitten in einer Richtung senkrecht zu derjenigen Richtung, in der die Antigen (biotinyliertes Peptid)-Linien aufgebracht sind,
    • – eine geeignete Verdünnung eines Antiserums oder einer anderen Körperflüssigkeit (enthaltend nachzuweisende Antikörper) wird in Kontakt mit einem Streifen gebracht, an den die Antigene gebunden sind, und für eine ausreichende Zeitspanne inkubiert gelassen, um das Stattfinden der Bindungsreaktion zu ermöglichen,
    • – nicht gebundene Komponenten werden durch Waschen des Streifens entfernt,
    • – der Nachweis von Immunkomplexen wird erzielt durch Inkubation des Streifens mit heterologen Antikörpern, welche spezifisch an die Antikörper in dem Testserum binden und welche mit einem Enzym wie Meerrettichperoxidase konjugiert wurden,
    • – die Inkubation wird für eine ausreichende Zeitspanne durchgeführt, um das Stattfinden der Bindung zu ermöglichen,
    • – die Anwesenheit von gebundenem Konjugat wird nachgewiesen durch die Zugabe des erforderlichen Substrats oder der Co-Substrate, welches) durch die Einwirkung des Enzyms in ein gefärbtes Produkt überführt wird/werden,
    • – die Reaktionen werden visuell nachgewiesen oder können quantitativ durch Densitometrie bestimmt werden.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Erhalt biotinylierter Peptide wie oben definiert, in dem N-α-Fmoc-X(N-y-Biotin) oder ein N-α-Fmoc-X(N-y-Biotin)-Derivat als Zwischenprodukt verwendet wird, worin X darstellt:
    Figure 00150001
    worin Fmoc 9-Fluorenylmethoxycarbonyl darstellt, wobei n mindestens 1, aber weniger als 10 ist und vorzugsweise zwischen 3 und 6 ist, und wobei eine Aminogruppe an das Cα-Atom gebunden ist, während die andere an den Cy-Kohlenstoff gebunden ist, welcher der am weitesten entfernte Kohlenstoff in der Seitenkette ist; und y die Position des am weitesten entfernten Kohlenstoffatoms in bezug auf das die COOH-Gruppe tragende Kohlenstoffatom (Cα-Atom) darstellt, oder deren mit einem Alkohol erhaltenen Ester, und insbesondere der Pentafluorphenylester.
  • Dieses Biotin-Derivat wird als Zwischenprodukt bezeichnet werden und die oben definierten Zwischenprodukte sind neue Verbindungen, die gemäß dem Verfahren der Erfindung bestimmt wurden.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren wie oben definiert, in dem N-α-Fmoc-X(N-y-Biotin) N-α-Fmoc-Lys(N-ε-Biotin) oder N-α-Fmoc-Ornithinyl (N-ε-Biotin) ist, worin Fmoc 9-Fluorenylmethoxycarbonyl darstellt.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines carboxyterminalen biotinylierten Peptids wie oben definiert, umfassend die folgenden Schritte:
    • – Kopplung eines carboxyaktivierten Produkts aus dem Zwischenprodukt wie oben definiert an einen an das Harz gebundenen, abspaltbaren Linker, zum Beispiel, um die folgende Verbindung zu erhalten:
      Figure 00160001
      worin Fmoc 9-Fluorenylmethoxycarbonyl darstellt, worin L wie oben definiertes X darstellt und worin B Biotin darstellt,
    • – Entschützung der α-Aminogruppe der Zwischenverbindung, zum Beispiel durch Piperidin unter Erhalt von:
      Figure 00160002
    • – schrittweise Addition der vorschriftsmäßig geschützten, aufeinander folgenden Aminosäuren AA1.....AAn, an:
      Figure 00160003
      zum Erhalt von:
      Figure 00170001
    • – Entschützung des NH2-Terminus, zum Beispiel durch Piperidin,
    • – Entschützung der erhaltenen Verbindung, Abspaltung vom Harz, Extraktion und Reinigung des erhaltenen, an dessen carboxyterminalen Ende biotinylierten Peptids, wobei die Schritte der Seitenkettenentschützung und Abspaltung leicht gleichzeitig oder getrennt durchzuführen sind, und insbesondere Entschützung des NH2-Terminus, zum Beispiel durch Piperidin,
    • – Abspaltung vom Harz, z.B. mit Trifluoressigsäure, in Gegenwart von Radikalfängern wie Ethandithiol oder Thioanisol oder Anisol,
    • – Extraktion des Peptids mit einem Lösungsmittel wie Diethylester, um den größten Teil der Säure und der Radikalfänger zu entfernen,
    • – Reinigung, wie mit HPLC, zum Erhalt von
      Figure 00170002
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines N-terminal biotinylierten Peptids wie oben definiert, umfassend die folgenden Schritte:
    • – Addition der vorschriftsmäßig geschützten, aufeinanderfolgenden Aminosäuren an das Harz zum Erhalt von: Fmoc – AA1......AAn – Harz, worin Fmoc 9-Fluorenylmethoxycarbonyl darstellt,
    • – Entschützung des NH2-Terminus, beispielsweise durch Piperidin,
    • – Addition des Zwischenprodukts:
      Figure 00170003
      worin L wie in Anspruch 18 definiertes X darstellt und BBiotin darstellt, über seine COOH-Gruppe an den NH2-Terminus zum Erhalt von:
      Figure 00180001
    • – Entschützung der NH2-terminalen Gruppe der erhaltenen Verbindung, Abspaltung vom Harz, Extraktion und Reinigung des erhaltenen, an seinem Aminoterminus biotinylierten Peptids, wobei die Schritte der Seitenkettenentschützung und Abspaltung leicht gleichzeitig oder getrennt durchzuführen sind, sowie insbesondere Entschützung der NH2-terminalen Gruppe der Zwischengruppe, zum Beispiel durch Piperidin,
    • – Abspaltung vom Harz, z.B. mit einer Säure wie Trifluoressigsäure, in Gegenwart von Radikalfängern wie Ethandithiol oder Thioanisol oder Anisol,
    • – Extraktion des Peptids mit einem Lösungsmittel wie Diethylether, um den größten Teil der Säure und der Radikalfänger zu entfernen,
    • – Reinigung, wie mit HPLC, zum Erhalt von:
      Figure 00180002
  • Biotin kann bequem an den freien Aminoterminus einer ansonsten vollständig geschützten Peptidkette ebenfalls unter Anwendung üblicher Aktivierungsverfahren gekoppelt werden. Weil Biotin eine Carboxylgruppe und keine Aminogruppen besitzt, wirkt Biotin im wesentlichen als Kettenterminator. Bevorzugte Aktivierungsmittel für eine in situ-Aktivierung umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Benzotriazol-1-yl-oxy-tripyrrolidinophosphoniumhexafluorphosphat (PyBOP), O-Benzotriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorphosphat (HBTU) und O-(1H-Benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluroniumtetrafluorborat (TBTU). Die Aktivierungsverfahren unter Einsatz dieser und verwandter Verbindungen sind Fachleuten auf dem Gebiet der Festphasen-Peptidsynthese bekannt und die Kopplung von Biotin beinhaltet keine signifikante Abweichung von Standard-Kopplungsprotokollen.
  • Es kann auch Biotip in einer voraktivierten Form eingesetzt werden. Entweder N-Hydroxysuccinimidobiotin oder Biotinamidocaproat-N-hydroxysuccinimidester werden günstigerweise eingesetzt und sind beide im Handel erhältlich. Dieses Verfahren der Kopplung wurde von Lobl, T.J., Deibel, M.R., und Yem, A.W., Anal. Biochem. (1988), 170(2):502-511, beschrieben. Nach Addition des N-terminalen Biotins wird das Peptin vom Harz in Gegenwart von Radikalfängern abgespalten, deren Wahl von den üblichen Faktoren der Aminosäurezusammensetzung des Peptids und der Art der eingesetzten Schutzgruppen abhängen wird.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines internbiotinylierten Peptids wie oben definiert, umfassend die folgenden Schritte:
    • – Addition von vorschriftsmäßig geschützten, aufeinanderfolgenden Aminosäuren an das Harz zum Erhalt von: Fmoc – AA1......AAn – Harz, worin Fmoc 9-Fluorenylmethoxycarbonyl darstellt,
    • – Entschützung des NH2-Terminus,
    • – Addition des Zwischenprodukts:
      Figure 00190001
      worin L wie oben definiertes X darstellt und B Biotin darstellt, über seine COOH-Gruppe an den NH2-Terminus zum Erhalt von:
      Figure 00190002
    • – Entschützung der α-Aminogruppe der Zwischengruppe, zum Beispiel durch Piperidin, zum Erhalt von:
      Figure 00190003
    • – Addition der vorschriftsmäßig geschützten, anschließenden Aminosäuren an das Harz zum Erhalt von:
      Figure 00200001
    • – Entschützung der NH2-terminalen Gruppe der erhaltenen Verbindung, Abspaltung vom Harz, Extraktion und Reinigung des erhaltenen, an seinem Aminoterminus biotinylierten Peptids, wobei die Schritte der Seitenkettenentschützung und Abspaltung leicht gleichzeitig oder getrennt durchzuführen sind, sowie insbesondere Entschützung der NH2-terminalen Gruppe des Peptids, zum Beispiel durch Piperidin,
    • – Abspaltung vom Harz, z.B. mit Trifluoressigsäure, in Gegenwart von Radikalfängern wie Ethandithiol oder Thioanisol oder Anisol,
    • – Extraktion des Peptids mit einem Lösungsmittel wie Diethylether, um den größten Teil der Säure und der Radikalfänger zu entfernen,
    • – Reinigung, wie mit HPLC, zum Erhalt von:
      Figure 00200002
  • Die vorliegende Erfindung betrifft (ein) Peptid(e) wie oben definiert zur Verwendung in einem Immunisierungsverfahren gegen HCV-Infektion.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines Peptids wie oben definiert, wobei die Synthese der Peptide in Lösung oder auf einem festen Träger erreicht wird.
  • In bestimmten Fällen kann es sich als besonders vorteilhaft erweisen, in der Lage zu sein, ein Peptid intern oder an seinem Carboxyterminus zu biotinylieren. Solche Fälle treten beispielsweise auf, wenn die Aminosäuresequenz eines Peptids der aminoterminalen Sequenz eines Proteins entspricht. Die Verknüpfung eines Biotins mit dem Aminoterminus eines solchen Peptids resultiert in einer Struktur, welche sich signifikant von der in dem nativen Protein gefundenen Struktur unterscheidet und als Folge die Bindungseigenschaften oder biochemischen Eigenschaften des Peptids beeinträchtigen kann. Es ist auch möglich, daß sogar bei Peptiden, die internen Proteinsequenzen entsprechen, deren Erkennung durch Bindeproteine oder Immunglobuline davon abhängen kann, welches Ende des Peptids für die Bindung präsentiert wird und auf welche Art und Weise dies geschieht. Die Bedeutung der Peptidorientierung wurde von Dyrberg, T., und Oldstone, M.B.A., J. Exp. Med. (1986) 164:1344-1349, beschrieben.
  • Um in der Lage zu sein, eine Biotinylgruppierung in ein Peptid in einer von Position und Sequenz unabhängigen Weise zu inkorporieren, wurden Versuche unternommen, ein geeignetes Reagens zu synthetisieren, welches unter Anwendung herkömmlicher Verfahren gekoppelt werden kann. Ein bequemes Reagens für C-terminale oder interne Biotinylierung ist N-ε-Biotinyllysin. Unter der Voraussetzung, daß die α-Aminogruppe dieser Verbindung geeignet geschützt ist (Fmoc und tBoc), kann dieses Reagens zur Einführung eines Biotins an beliebiger Stelle in der Peptidkette, einschließlich des Aminoterminus, nach den bei der Festphasen-Peptidsynthese angewandten Standardverfahren eingesetzt werden. Die Synthese des t-Boc-geschützten Derivats wurde beschrieben (Bodansky, M., und Fagan, D.T., J. Arn. Chem. Soc. (1977) 99:235-239) und wurde zur Synthese von kurzen Peptiden zur Verwendung bei der Untersuchung der Enzymaktivitäten bestimmter Transcarboxylasen eingesetzt.
  • Im Unterschied zu dem t-Boc-Derivat wurde die Synthese von N-α-Fmoc-Lys(N-ε-Biotin) nicht beschrieben und in Anbetracht des wachsenden Interesses an auf Fmoc basierenden Synthesestrategien wird diese Verbindung als besonders vorteilhaft betrachtet.
  • Es gibt eine Reihe möglicher Wege, welche eingeschlagen werden können, um zu der gewünschen Fmoc-geschützten Verbindung zu gelangen. Diese sind in 1 dargestellt. Bei dem ersten Ansatz kann im Handel erhältliches N-α-Fmoc-Lys(N-ε-tBoc) als Ausgangsmaterial eingesetzt werden. Der N-ε-tBoc-Schutz wird unter Verwendung von Trifluoressigsäure und einem Radikalfänger wie Wasser entfernt. Ein leichter molarer Überschuß des so erhaltenen N-α-Fmoc-Lysins wird dann mit carboxyaktiviertem Biotin umgesetzt. Das resultierende Produkt kann ohne weiteres durch selektive Extraktionen und Standard-Chromatographietechniken gereinigt werden. Bei einem alternativen Ansatz kann N-α-Fmoc-Lys (N-ε-Biotin) aus im Handel erhältlichem N-ε-Biotinyllysin (Biocytin) durch Umsetzung mit Fluorenylmethylsuccinimidylcarbonat hergestellt werden. Zahlreiche Beispiele dieser Reaktionen, welche als Richtlinien verwendet werden können, werden in Atherton und Sheppard, Solid Phase Peptide Synthesis, IRL Press, 1989, angegeben.
  • Die in 1 (Verfahren A) dargestellte Strategie kann auch zur Synthese von N-α-Fmoc-Ornithin (N-δ-Biotin) aus im Handel erhältlichem N-α-Fmoc-Ornithin (N-δ-tBoc) eingesetzt werden. Das Ornithin-Derivat unterscheidet sich von dem Lysin-Derivat nur in der Länge der Seitenkette, welche für das Ornithin-Derivat um ein Kohlenstoffatom kürzer ist. Das N-α-Fmoc-Lys kann unter Verwendung derselben Reagenzien zur in situ-Aktivierung, die für freies Biotip beschrieben wurden, bequem in die Peptidkette inkorporiert werden.
  • Alternativ kann N-α-Fmoc-Lys (N-ε-Biotin)-O-pentafluorphenylester bequem aus N-α-Fmoc-Lys (N-ε-Biotin) und Pentafluorphenyltrifluoracetat unter Anwendung der basenkatalysierten Umesterungsreaktion, die von Green, M., und Berman, J., Tetrahedron Lett. (1990) 31:5851-5852, zur Herstellung von O-Pentafluorphenylestern von Aminosäuren beschrieben wurde, synthetisiert werden. Dieser aktive Ester kann direkt zur Inkorporation von N-α-Fmoc-Lys (N-ε-Biotin) in die Peptidkette eingesetzt werden. Die Klasse der oben definierten Zwischenprodukte kann nach einem Verfahren hergestellt werden, welches die folgenden Schritte umfaßt:
    • – Umsetzung einer Diaminomonocarbonsäure, wie zuvor beschrieben, mit Fluorenylmethylsuccinimidylcarbonat oder Fluorenylmethylchlorformiat unter Bedingungen eines sorgfältig eingestellten pH-Werts, um das einfach geschützte N-α-Fmoc-Derivat zu ergeben,
    • – oder alternativ Einsatz von im Handel erhältlichen, N-α-Fmoc-geschützten Diaminomonocarbonsäuren, bei denen die Seitenketten-Aminogruppe mit einer Schutzgruppe versehen ist, welche sich von der zum Schutz der α-Aminogruppe eingesetzten Fmoc-Gruppe unterscheidet, wobei der Schutz der Seitenketten-Aminogruppe leicht selektiv unter Bedingungen entfernt werden kann, welche die N-α-Fmoc-Gruppe intakt lassen,
    • – Reinigung des mono-geschützten N-α-Fmoc-Diaminomonocarbonsäure-Derivats durch selektive Extraktionen und Chromatographie,
    • – Umsetzung des erhaltenen Derivats mit einem carboxyaktivierten Derivat von Biotin, wie z.B. N-Hydroxysuccinimid-Biotin, um das (N-α-Fmoc)-(N-y-Biotin)-Derivat zu erhalten, welches das gewünschte Zwischenprodukt ist,
    • – Reinigung des Zwischenprodukts durch selektive Extraktionen, Fällungen oder Chromatographie.
  • Wenn die im Verfahren der Erfindung eingesetzten biotinylierten Peptide mit Linkerarmen versehen werden sollen, können diese chemischen Gruppierungen bequem entweder mit dem N- oder C-Terminus einer Peptidsequenz während der Festphasensynthese unter Anwendung von Standard-Kopplungsprotokollen verbunden werden, vorausgesetzt, daß die Aminogruppen dieser Verbindungen mit einem geeigneten vorübergehenden Aminogruppenschutz versehen sind.
  • Alle diese speziellen biotinylierten Peptide sind neu.
  • BESCHREIBUNG DER FIGUREN
  • Alle die in den Figuren und Tabellen angegebenen Proben und Seren sind zufällig gewählte Proben und Seren, die Antikörper erhalten, welche als Folge einer natürlich eingetretenen Infektion durch ein virales Agens gebildet wurden.
  • 1 stellt die Strategien zur Synthese von N-α-Fmoc-Lysin (N-ε-Biotin) dar.
  • Konkreter:
  • Verfahren A entspricht der Synthese von N-α-Fmoc-Lys (N-ε-Biotin) aus N-ε-FmoäLys (N-ε-tBoc) und Verfahren B entspricht der Synthese von N-α-Fmoc-Lys (N-ε-Biotin) aus N-ε-Biotinyllysin.
  • 2 stellt das Diagramm dar, welches bei Umkehrphasenchromatographie der an der Herstellung der oben definierten Zwischenprodukte beteiligten Vorläufer und der Zwischenverbindungen erhalten wurde.
  • Die Umkehrphasenchromatographie wurde unter den folgenden Bedingungen durchgeführt:
    • – Gradientenbedingungen: Puffer A: 0,1 % TFA in H2O, Puffer B: 0,1 % TFA in Acetonitril, Säule: C2/C18-Umkehrphase (Pharmacia, Pep-S), Nachweis-Wellenlänge: 255 Nanometer;
    • – Gradient: 0 % B von 0 bis 1 Minute, 0 % B bis 100 % B von 1 Minute bis 60 Minuten, 0 % B von 60 Minuten bis 70 Minuten.
  • Das erste Diagramm entspricht Verfahren A (siehe 1) und das zweite Diagramm entspricht Verfahren B (siehe 1).
  • 3a stellt die Antikörperbindung an HCV-Peptid II (in einem ELISA) dar.
    • Die obere linke Kurve entspricht der Probe 8320.
    • Die obere rechte Kurve entspricht der Probe 8242.
    • Die untere linke Kurve entspricht der Probe 8243.
    • Die untere rechte Kurve entspricht der Probe 8318.
  • Bei jeder dieser Proben ist die optische Dichte (bei 450 nm) gegen die Beschichtungskonzentration, ausgedrückt in μg/ml, aufgetragen.
  • Die Kurve mit Kreuzchen entspricht nicht-biotinyliertem HCV-Peptid II und die Kurve mit Punkten entspricht biotinyliertem HCV-Peptid II.
  • 3b stellt die Antikörperbindung an HCV-Peptid XI (in einen ELISA) dar.
    • Die obere linke Kurve entspricht der Probe 8320.
    • Die obere rechte Kurve entspricht der Probe 8326.
    • Die untere linke Kurve entspricht der Probe 8242.
    • Die untere rechte Kurve entspricht der Probe 8243.
  • Bei jeder dieser Proben ist die optische Dichte (bei 450 nm) gegen die Beschichtungskonzentration, ausgedrückt in μg/ml, aufgetragen.
  • Die Kurve mit Kreuzchen entspricht nicht-biotinyliertem HCV-Peptid XI und die Kurve mit Punkten entspricht biotinyliertem HCV-Peptid XI,
  • 3c stellt die Antikörperbindung an HCV-Peptid XVI (in einem ELISA) dar.
    • Die obere linke Kurve entspricht der Probe 8326.
    • Die obere rechte Kurve entspricht der Probe 8242.
    • Die untere linke Kurve entspricht der Probe 8243.
    • Die untere rechte Kurve entspricht der Probe 8318.
  • Bei jeder dieser Proben ist die optische Dichte (bei 450 nm) gegen die Beschichtungskonzentration, ausgedrückt in μg/ml, aufgetragen.
  • Die Kurve mit Kreuzchen entspricht nicht-biotinyliertem HCV-Peptid XVI und die Kurve mit Punkten entspricht biotinyliertem HCV-Peptid XVI.
  • 4 betrifft den Nachweis von biotinylierten Peptiden, die direkt als Beschichtung aufgebracht wurden (in einem ELISA).
  • Die erste Kurve entspricht biotinyliertem HCV-Peptid (1, die zweite Kurve biotinyliertem HCV-Peptid XI und die dritte Kurve biotinyliertem HCV-Peptid XVI.
  • Bei jeder dieser Proben ist die optische Dichte (bei 450 nm) gegen die Beschichtungskonzentration, ausgedrückt in μg/ml, aufgetragen.
  • 5 stellt die Strukturen von N- und C-terminal biotinylierten HIV-1-Peptiden (hier oben als 1a.1 bezeichnet) dar, die von dem Transmembran (TM)-Protein von HIV-1 stammen.
  • 6 stellt eine Bewertung von typspezifischen HCV-NS4-Peptiden durch Linien-Imrnun-Assay (LIA) dar.
  • Tabelle 1 stellt die Antikörpererkennung von unbiotinylierten HIV-1- und HIV-2-Peptiden (als TM-HIV-1 und TM-HIV-2 bezeichnet) und biotinylierten HIV-1- und HIV-2-Peptiden (hier oben als 1a.1 und 2a bezeichnet und auch als TM-HIV-1 Bio und TM-HIV-2 Bio bezeichnet) in einem ELISA dar.
  • Tabelle 2 stellt den Vergleich der Antikörpererkennung von unbiotinylierten und biotinylierten Peptiden aus der V3-Sequenz des Isolats HIV-1 mit (auch als 1b.4 bezeichnet) in einem ELISA dar.
  • Tabelle 3 stellt den Vergleich der Antikörpererkennung des biotinylierten V3-mn-Peptids (als 1 b.4 bezeichnet), gebunden an Streptavidin und Avidin, in einem ELISA dar.
  • Tabelle 4 stellt den Vergleich der Antikörpererkennung von biotinylierten und unbiotinylierten HCV-Peptiden in einem ELISA dar.
  • Konkreter:
    • Tabelle 4A entspricht der Antikörperbindung an HCV-Peptid XI.
    • Tabelle 4B entspricht der Antikörperbindung an HCV-Peptid XVI.
    • Tabelle 4C entspricht der Antikörperbindung an HCV-Peptid II.
    • Tabelle 4D entspricht der Antikörperbindung an HCV-Peptid III.
    • Tabelle 4E entspricht der Antikörperbindung an HCV-Peptid V.
    • Tabelle 4F entspricht der Antikörperbindung an HCV-Peptid IX.
    • Tabelle 4G entspricht der Antikörperbindung an HCV-Peptid XVIII.
  • Tabelle 5 stellt einen Vergleich der Antikörperbindung an biotinylierte und nicht-biotinylierte Peptide bei verschiedenen Peptid-Beschichtungskonzentrationen in einem ELISA dar.
  • Tabelle 6 stellt den Vergleich von N- und C-terminal biotinyliertem TM-HIV-1-Peptid (als 1a.1 bezeichnet) in einem ELISA dar.
  • Tabelle 7 stellt einen Vergleich der Antikörpererkennung von unbiotinyliertem und carboxybiotinyliertem HCV-Peptid 1 dar.
  • Alle Aminosäuresequenzen sind in dem herkömmlichen und allgemein anerkannten dreibuchstabigen Code wiedergegeben und, soweit angegeben, in dem einbuchstabigen Code. Die Peptidsequenzen sind von links nach rechts wiedergegeben, welches üblicherweise die Richtung vom Aminoterminus zum Carboxyterminus ist.
  • Eine Anzahl unüblicher Codes wird ebenfalls verwendet, um chemische Gruppen oder Modifikationen darzustellen, und diese sind wie folgt definiert:
    Figure 00270001
  • BEISPIEL 1: PEPTIDSYNTHESE
  • Alle beschriebenen Peptide wurden synthetisiert auf TentaGel S-RAM (Rapp Polymere, Tübingen, Deutschland), einem Polystyrol-Polyoxyethylen-Pfropf-Copolymer, funktionalisiert mit dem säurelabilen Linker 4-(α-Fmoc-Amino-2',4'-dimethoxybenzyl)phenoxyessigsäure (Rink, Tetrahedron Lett. (1987) 28:3787), um nach Spaltungcarboxyterminale Peptid-Amide zu bilden. Es wurde ein Seitengruppenschutz auf t-Butyl-Basis und Fmoc-α-Aminoschutz verwendet. Die Guanidingruppe von Arginin wurde mit der 2,2,5,7,8-Pentamethylchroman-6-Sulfonyl-Gruppierung geschützt. Die Imidazolgruppe von Histidin wurde entweder mit t-Boc oder Trityl geschützt und die Sulfhydrylgruppe von Cystein wurde mit einer Tritylgruppe geschützt. Die Kopplungen wurden unter Verwendung von vorgebildeten O-Pentafluorphenylestern durchgeführt, mit Ausnahme des Falles von Arginin, wo TBTU als Aktivierungsmittel in Gegenwart von 1,5 Äquivalenten der Base N-Methylmorpholin eingesetzt wurde. Gelegentlich wurden Glutamin und Asparagin auch unter Einsatz von TBTU-Aktivierung gekoppelt. In diesen Fällen wurden die Trityl-geschützten Derivate dieser Aminosäuren eingesetzt. Biotin wurde unter Verwendung von entweder TBTU oder HBTU gekoppelt. Alle Synthesen wurden mit einem Milligen 9050 PepSynthesizer (Novato, Kalifornien) unter Anwendung von Durchlaufverfahren durchgeführt. Nach der Spaltung mit Trifluoressigsäure in Gegenwart von Radikalfängern und Extraktion mit Diethylether wurden alle Peptide mittels C18-Umkehrphasenchromatographie analysiert.
  • BEISPIEL 2: SYNTHESE VON N-α-Fmoc-Lys(N-ε-Biotin)
  • A. Verfahren A
  • Im Handel erhältliches N-α-Fmoc-L-Lysin (N-ε-tBoc) (1,5 g) wurde mit 20 ml 95%iger Trifluoressigsäure, 5 % H2O, 2 h lang bei Raumtemperatur behandelt. Der größte Teil der Säure wurde dann unter einem Stickstoffstrom verdampft. 10 ml Wasser wurden zugegeben und die Lösung wurde dreimal mit Diethylether extrahiert. Die wäßrige Phase wurde dann bis zur Trocknung über Phosphorpentoxid im Vakuum eingedampft. Das resultierende Pulver (N-α-Fmoc-L-Lysin) wurde mittels Umkehrphasenchromatographie analysiert und offenbarte ein homogenes Produkt, welches erwartungsgemäß hydrophiler als das Ausgangsmaterial war.
  • N-α-Fmoc-Lysin (190 mg, 0,49 mMol) wurde in 8 ml 0,1 M Boratpuffer, pH 8,7, gelöst. N-Hydroxysuccinimidobiotin (162 mg, 0,47 mMol) wurde in 4 ml Dimethylformamid gelöst und der Lösung von N-α-Fmoc-Lysin zugegeben. Der pH-Wert wurde überwacht und erforderlichenfalls mit NaOH titriert. Nach 2 h wurde die Lösung mit HCl auf pH 2,0 angesäuert, woraufhin ein weißer Niederschlag erhalten wurde.
  • Nach der Extraktion mit Ethylacetat und Zentrifugation wurde der weiße Niederschlag an der H2O:Ethylacetat-Grenzfläche gefunden. Beide Phasen wurden entfernt und der Niederschlag zweimal mit 10 mM HCl, einmal mit Ethylacetat extrahiert, gefolgt von zwei Extraktionen mit Diethylether: Der Niederschlag wurde in DMF gelöst und durch Zugabe von Diethylether gefällt. Das kristalline Pulver wurde dann im Vakuum über Phosphorpentoxid getrocknet. Das resultierende Produkt wurde mittels Umkehrphasenchromatographie analysiert und offenbarte einen Hauptpeak, welcher erwartungsgemäß später als N-α-Fmoc-Lys eluierte. Ein sehr kleiner Peak von N-α-Fmoc-Lys wurde ebenfalls beobachtet (2a).
  • B. Verfahren B
  • Im Handel erhältliches N-ε-Biotinyllysin (Biocytin, Sigma, 249 mg, 0,67 mMol) wurde in 8 ml 1 M Na2CO3 gelöst und auf Eis gekühlt. Fluorenylmethylsuccinimidylcarbonat (222 mg, 0,66 mMol) wurde in 2 ml Aceton gelöst und der Biotinyllysin-Lösung über einen Zeitraum von 30 Minuten unter heftigem Rühren zugegeben. Das Rühren wurde 5 h lang bei Raumtemperatur fortgesetzt. Der pH-Wert wurde erforderlichenfalls durch die Zugabe von 1 M NaCO, zwischen 8 und 9 gehalten. Das Aceton wurde dann im Vakuum verdampft und 1,0 M HCl zugegeben, bis der pH-Wert der Lösung etwa 2 betrug. Nach Ansäuern der Lösung trat ein weißer Niederschlag auf, welcher zweimal mit 10 mM HCl, zweimal mit Ethylacetat und zweimal mit Diethylether gewaschen wurde. Der Niederschlag wurde in DMF gelöst und durch Zugabe von Diethylether gefällt. Das kristalline Pulver wurde dann sorgfältig im Vakuum über Phosphorpentoxid getrocknet. Das resultierende Produkt wurde mittels Umkehrphasenchromatographie analysiert und offenbarte einen Hauptpeak, der mit derselben Retentionszeit (30,5 Minuten) wie das unter Anwendung des Verfahrens 1 erhaltene Produkteluierte ( 2b).
  • BEISPIEL 3: VERFAHREN ZUR BESTIMMUNG VON PEPTIDEN, DIE IMMUNOLOGISCH BEDEUTSAMEN EPITOPEN ENTSPRECHEN, IN EINEM ENZYM-VERKNÜPFTEN IMMUNOSORBENS-ASSAY (ELISA) UNTER EINSATZ SPEZIFISCHER ANTIKÖRPER
  • Wenn Peptide direkt als Beschichtung aufgebracht werden sollten, wurden Stammlösungen der Peptide in Natriumcarbonatpuffer, pH 9,6, verdünnt und zur Beschichtung von Polystyrol-Mikrotiterplatten in einer Peptidkonzentration von 2 bis 5 μg/ml für 1 h bei 37° C eingesetzt. In Fällen, in denen biotinylierte Peptide beurteilt werden sollten, wurden die Platten zuerst mit Streptavidin in Natriumcarbonatpuffer, pH 9,6, in einer Konzentration von 3 μg/ml für 1 h bei 37° C beschichtet. Die Platten wurden dann gewaschen, um überschüssiges ungebundenes Protein zu entfernen. Eine Arbeitslösung des biotinylierten Peptids mit 1 μg/ml in Natriumcarbonatpuffer wurde dann den Vertiefungen der Mikrotiterplatte zugegeben und 1 h lang bei 37° C inkubiert.
  • Nachdem die Platten mit Antigen beschichtet worden waren, wurden etwaige verbleibende freie Bindungsstellen auf dem Kunststoff mit Casein blockiert. Nach Waschen wurde eine Verdünnung der geeigneten Antiseren, gewöhnlich 1:100, den Vertiefungen der Platten zugegeben und 1 h lang bei 37°C inkubiert.
  • Nach Waschen zur Entfernung ungebundenen Materials wurde spezifische Antikörper-bindung durch Inkubation der Platten mit Anti-Human-Immunglobulin-Ziegenantikörper, konjugiert an das Enzym Meerrettichperoxidase, nachgewiesen. Nach der Entfernung von ungebundenem Konjugat durch Waschen wurde eine H2O2 und 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin enthaltende Lösung zugegeben.
  • Die Reaktionen wurden nach einer geeigneten Zeitspanne durch Zugabe von Schwefelsäure beendet. Positive Reaktionen führten zu einer gelben Farbe, welche mit Hilfe einesherkömmlichen Mikrotiterplattenlesegeräts quantitativ bestimmt wurde. Extinktionsmessungen erfolgten bei einer Wellenlänge von 450 nm und alle Daten sind als Wert der optischen Dichte bei dieser Wellenlänge ausgedrückt.
  • BEISPIEL 4: VERWENDUNG VON BIOTINYLIERTEN HIV-PEPTIDEN ZUM NACHWEIS VON HIV-SPEZIFISCHEN ANTIKÖRPERN
  • Es wurden Versuche durchgeführt, um die Antikörpererkennung von kurzen N-acetylierten Peptiden von 10 Aminosäuren Länge zu beurteilen, welche anderen, in den Transmembranproteinen von HIV-1 und HIV-2 enthaltenen Peptiden entsprachen. Eine direkte Beschichtung der Vertiefungen von Mikrotiterplatten mit diesen Peptiden ergab sehr schlechte Ergebnisse, wenn die Antikörperbindung in einem ELISA bewertet wurde. Da vermutet wurde, daß die Peptide nicht gut an die Polystyrol-Festphase banden, wurden die Peptide auf demselben Weg erneut synthetisiert, mit Ausnahme dessen, daß Biotin mit dem Aminoterminus der Peptide verknüpft wurde, von der Decamer-Peptidsequenz durch drei Glycinreste getrennt, deren Funktion darin bestand, als Linkerarm zu dienen. Die für den Vergleich eingesetzten Peptide waren wie folgt:
  • Figure 00300001
  • Die biotinylierten Peptide wurden auf Mikrotiterplatten aufgetragen, welche mit Streptavidin beschichtet worden waren. Die Antikörperbindung an diese Peptide wurde verglichen mit der Antikörperbindung an die unbiotinylierten Peptide, mit denen Mikrotiterplatten direkt beschichtet worden waren. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. Es ist ersichtlich, daß die biotinylierten Peptide von den HIV-1- oder HIV-2-Transmembranproteinen, gebunden an Streptavidin, sehr gut von Antiseren von HIV-1- bzw. HIV-2-infizierten Personen erkannt werden. Dies steht in Gegensatz zu den unbiotinylierten Versionen dieser Peptide, mit denen Polystyrolplatten direkt beschichtet wurden. Weitere Kontrollexperimente zeigten, daß die Zunahme der Antikörperbindung das Ergebnis der spezifischen Wechselwirkung zwischen dem biotinylierten Peptid und Streptavidin war, da es keinen Unterschied in der Antikörpererkennung der biotinylierten oder unbiotinylierten Peptide gab, wenn die Mikrotiterplatte direkt mit beiden beschichtet wurde.
  • Einige Peptide, insbesondere diejenigen, welche eine Länge von 15Aminosäuren oder länger aufweisen, binden ausreichend an die feste Phase, um den Nachweis spezifischer Antikörper zu erlauben, welche (ein) Epitop(e) erkennen, das/die in der Peptidsequenz vorliegt bzw. vorliegen.
  • Zur Feststellung, ob die Biotinylierungng auch die Antikörpererkennung längerer Peptide verbessern würde, wurden sowohl die biotinylierten als auch unbiotinylierten Versionen der partiellen V3-Loop-Sequenz des Isolats HIV-1 mit synthetisiert. Die Sequenz und das Syntheseverfahren beider Peptide wurde einfach mit Ausnahme des Aminoterminus identisch. Das unbiotinylierte Peptid wurde einfach acetyliert, wohingegen in der biotinylierten Version zwei Glycinreste als Linkerarm hinzugefügt waren, um das Peptid von der Biotinylgruppierung zu trennen.
  • Die Sequenzen der beiden eingesetzten Peptide sind wie folgt:
    • – unbiotinyliertes V3 mn-Peptid
      Figure 00310001
    • – biotinyliertes V3 mn-Peptid (Peptid 1 b.4)
      Figure 00310002
      Figure 00320001
  • Mit dem unbiotinylierten Peptid wurden die Vertiefungen einer Polystyrol-Mikrotiterplatte direkt beschichtet, während das biotinylierte Peptid an Vertiefungen gebunden wurde, welche vorher mit Streptavidin beschichtet worden waren. Die in Tabelle 2 gezeigten Ergebnissedemonstrieren, daß die Antikörperbindung an das biotinylierte Peptid der Antikörperbindung an Peptid, mit dem Kunststoff direkt beschichtet worden war, überlegen ist.
  • BEISPIEL 5: VERWENDUNG VON BIOTINYLIERTE-PEPTIDE-AVIDIN-KOMPLEXEN ZUM ANTIKÖRPERNACHWEIS
  • Nach der Demonstration, daß die Antikörpererkennung dieses Peptids verbessert ist, wenn das Peptid biotinyliert und an Streptavidin gebunden ist, wurde ein zusätzliches Experiment durchgeführt, um festzustellen, ob Streptavidin durch Avidin ersetzt werden konnte. Die in Tabelle 3 dargestellten Ergebnisse zeigen, daß dies der Fall ist und daß an Avidin gebundene biotinylierte Peptide sehr effizient von spezifischen Antikörpern erkannt werden.
  • BEISPIEL 6: VERWENDUNG VON BIOTINYLIERTEN HCV-PEPTIDEN ZUM NACHWEIS VON HCV-SPEZIFISCHEN ANTIKÖRPERN
  • Zur Feststellung, ob die erhöhte Antikörpererkennung von biotinylierten Peptiden ein allgemeines Phänomen war, wurde eine Reihe von zusätzlichen Peptiden von 20 Aminosäuren Länge synthetisiert, welche Sequenzen entsprachen, die von dem Hepatitis C-Virus (HCV)-Polyprotein abgeleitet waren. Die bewertetenAminosäuresequenzen waren wie folgt:
  • a. HCV-Peptid XI
    Figure 00320002
  • b. HCV-Peptid XVI
    Figure 00320003
  • c. HCV-Peptid II
    Figure 00320004
  • d. HCV-Peptid Ill
    Figure 00330001
  • e. HCV-Peptid V
    Figure 00330002
  • f. HCV-Peptid IX
    Figure 00330003
  • g. HCV-Peptid XVIII
    Figure 00330004
  • In jedem Fall wurden zwei Versionen des Peptids synthetisiert. Bei der unbiotinylierten Version war das Peptid am Aminoterminus acetyliert. Die biotinylierten Versionen waren alle N-terminal biotinyliert. Ein Linkerarm, bestehend aus zwei Glycinresten, trennte die Biotinylgruppe von den Aminosäuren, welche die HCV-Sequenz umfaßten.
  • Die unbiotinylierten Peptide wurden an die Veriefungen von Polystyrol-Mikrotiterplatten bei einer Konzentration von 3 μg/ml adsorbiert.
  • Die biotinylierten Peptide wurden bei einer Konzentration von 1 μg/ml an Streptavidinbeschich-tete Mikrotiterplatten gebunden. Seren, von denen bekannt war, daß sie Antikörper gegen diese Peptide enthielten, wurden zur Bewertung eingesetzt und bei 20facher Verdünnung getestet. Die Ergebnisse dieser Vergleiche sind in Tabelle 4, a bis g, dargestellt.
  • Diese Ergebnisse zeigen eindeutig, daß die Antikörpererkennung von an Streptavidin gebundenen biotinylierten Peptiden im Verhältnis zu derjenigen von Peptiden erhöht ist, mit denen die Vertiefungen der Mikrotiterplatte direkt beschichtet worden waren.
  • BEISPIEL 7: EINFLUß DER BESCHICHTUNGSKONZENTRATION AUF DIE ANTIKÖRPERERKENNUNG
  • Zur weiteren Untersuchung der erhöhten Antikörpererkennung von biotinylierten HCV-Peptiden, die an Streptavidin oder Avidin gebunden waren, im Vergleich zur direkten Adsorption an Kunststoff, wurde der Einfluß der Beschichtungskonzentration des Peptids untersucht. Drei Peptide (HCV-Peptide II, XI und XVI) wurden in Konzentrationen im Bereich von 10 μg/ml bis 3 μg/ml in einem Volumen von 200 μl pro Mikrotiterplattenvertiefung als Beschichtung aufgebracht. Für die direkte Beschichtung wurden die unbiotinylierten Versionen dieser Peptide eingesetzt. Die biotinylierten Versionen dieser Peptide wurde eingesetzt, um Vertiefungen zu beschichten, an die zuvor Streptavidin adsorbiert worden war. Seren, welche bekanntermaßen Antikörper gegen diese Peptide enthielten, wurden in einer Verdünnung von 1 bis 100 eingesetzt, um die Größenordnung der Antikörperbindung zu beurteilen.
  • Die numerischen Ergebnisse dieses Experiments sind in Tabelle 5 dargestellt und graphisch in 3, a-c, dargestellt.
  • Es ist ersichtlich, daß mit wenigen Ausnahmen das biotinylierte Peptid selbst bei der geringsten getesteten Konzentration (10 ng/ml, 2 ng pro Vertiefung) sehr gut erkannt wird. In vielen Fällen werden Werte der optischen Dichte, welche nahe dem maximal erhältlichen Wert liegen, bei einer Peptidkonzentration von nur 30 ng/ml (6 ng pro Vertiefung) beobachtet. Im Gegensatz dazu werden jedoch die direkt an den Kunststoff adsorbierten, unbiotinylierten Peptide von Antikörper, falls überhaupt, schlecht gebunden.
  • BEISPIEL 8: EINFLUß DER BIOTINYLIERUNG VON PEPTIDEN AUF DIE BESCHICHTUNGSEFFIZIENZ DER PEPTIDE AUF EINER FESTEN PHASE
  • Zur Feststellung, ob die Abwesenheit eines Signals auf fehlende Peptidadsorption zurückzuführen war, wenn die Peptide direkt als Beschichtung aufgetragen wurden, wurde ein zusätzliches Experiment durchgeführt. In diesem Fall wurde der Kunststoff direkt mit den biotinylierten Versionen der Peptide in denselben Konzentrationen beschichtet, wie sie im vorherigen Experiment für die unbiotinylierten Versionen eingesetzt wurden. Zur Feststellung, ob Biotin-markiertes Peptid gebunden war, wurden die Mikrotiterplatten mit einem Streptavidin: Meerrettichperoxidase-Konjugat inkubiert. Weil jedes Peptid eine einzige Biotinylgruppe enthält, sind die resultierenden optischen Dichten ein Maß der Menge des gebundenen Peptids, obwohl die absolute Menge an gebundenem Peptid nicht bekannt ist. Die in 4 graphisch dargestellten Ergebnisse demonstrieren, daß Kunststoff-gebundenes Peptid nachgewiesen werden kann. Erwartungsgemäß unterscheiden sich die Kurven für jedes Peptid, was deren chemische Einzigartigkeit reflektiert. Zwei der Peptide, die HCV-Peptide XI und XVI, scheinen nur schwach an die Vertiefungen der Polystyrol-Mikrotiterplatte zu binden und diese schwache Bindung wird reflektiert von den im ELISA erhaltenen niedrigen Werfen der optischen Dichte. Nachdem die Bindung der biotinylierten Peptide an Streptavidin-beschichtete Vertiefungen zu sehr guter Antikörpererkennung führt, ist offensichtlich, daß die schlechte Bindung des Peptids an die feste Phase keine Beschränkung darstellt, wenn die Wechselwirkung zwischen Biotin und Streptavidin ausgenützt wird.
  • Auf der anderen Seite zeigt eines der Peptide, HCV-Peptid II, eine sehr signifikante Bindung an die feste Phase, insbesondere bei höheren Beschichtungskonzentrationen. Jedoch kam das Signal, welches bei direkter Beschichtung des Peptids erhalten wurde, bei keiner Beschichtungskonzentration jemals dem Signal gleich, welches erhalten wurde, wenn das biotinylierte Peptid an Streptavidin gebunden wurde. Nachdem die Streptavidin-gebundenen biotinylierten Versionen dieses Peptids selbst bei der niedrigsten getesteten Konzentration eindeutig ein positives Signal mit den getesteten Antiseren ergeben, scheinen die Ergebnisse anzuzeigen, daß entweder die direkte Beschichtung dieses Peptids außerordentlich ineffizient ist oder andere Faktoren neben der einfachen Bindung des Peptids an die feste Phase von Bedeutung sind.
  • Obwohl schwierig zu quantifizieren, betrifft einer der Faktoren fast sicher die Art und Weise, in der das Peptid gebunden ist und für die Antikörperbindung zur Verfügung steht. Im Falle von Peptiden, mit denen die feste Phase direkt beschichtet ist, ist es praktisch unvermeidlich, daß ein gewisser Anteil der Peptidmoleküle mit der festen Phase über Aminoseitenketten Wechselwirken wird, welche auch für die Antikörpererkennung essentiell sind. Diese Peptidmoleküle werden deshalb nicht in der Lage sein, an der Bindungsreaktion mit Antikörpern teilzunehmen. Dieses Problem tritt mit den biotinylierten Peptiden, welche alle an die feste Phase über die Wechselwirkung zwischen Biotin und dem an die feste Phase gebundenen Streptavidin gebunden sind, nicht auf.
  • BEISPIEL 9: VERWENDUNG VON C-TERMINAL BIOTINYLIERTEN HIV-PEPTIDEN ZUR SPEZIFISCHEN ANTIKÖRPERERKENNUNG
  • Zur Feststellung, ob die an ihrem Carboxyterminus biotinylierten Peptide ebenfalls eine erhöhte Antikörpererkennung ergeben, wurde eine carboxybiotinylierte Version des TM-HIV-1-Peptids synthetisiert. N-α-Fmoc-Lys (N-ε-Biotin), hergestellt nach Verfahren A wie beschrie-ben, wurde direkt mit Harz gekoppelt, welches mit dem säurelabilen Linker 4-(α-Fmoc-Amino-2',4'-dimethoxybenzyl)phenoxyessigsäure nach Entfernung der linkergebundenen Fmoc-Gruppe mit 20 % Piperidin funktionalisiert worden war. Die Kopplung wurde durchgeführt unter Verwendung eines dreifachen molaren Überschusses an N-α-Fmoc-Lys (N-ε-Biotin), bezogen auf funktionelle Gruppen des Harzes. Die Carboxylgruppenaktivierung wurde erzielt durch Verwendung eines Äquivalents HBTU, eines Äquivalents 1-Hydroxybenzotriazol und 1,5 Äquivalenten N-Methylmorpholin. N-Methylmorpholin wurde als 0,6 M Lösung in Dimethylformamid, enthaltend 40 % Dirnethylsulfoxid, welches zur Erreichung einer vollständigen Lösung des N-α-Fmoc-Lys (N-ε-Biotins) erforderlich war, zugegeben. Die Überprüfung des Peaks der Fmoc-Entschützung, gefolgt von Kopplung des N-α-Fmoc-Lys (N-ε-Biotins) zeigte an, daß die Kopplung glatt und effizient erfolgt war. Zwei Glycinreste wurden angekoppelt, um das Biotinyllysin von der TM-HIV-1-Aminosäuresequenz zu trennen. Nach der Synthese des Peptids wurde der Aminoterminus mit Essigsäureanhydrid acetyliert. Die resultierende Struktur des carboxybiotinylierten Peptids unterscheidet sich signifikant von dem Peptid, welches am Aminoterminus biotinyliert ist. Ein Vergleich dieser Strukturen ist in 5 dargestellt.
  • Zur Bewertung der Antikörpererkennung dieser beiden Peptide wurden die Peptide individuell an Streptavidin-beschichtete Mikrotiterplatten gebunden und mit Hilfe einer Auswahl von Antiseren von HIV-1-seropositiven Donoren getestet. Die Ergebnisse dieses Vergleichs sind in Tabelle 6 dargestellt. Die Antikörpererkennung des C-terminal biotinylierten Peptids stellt sich im Vergleich eindeutig sehr günstig gegenüber derjenigen des N-terminal biotinylierten Peptids dar. Diese Ergebnisse bestätigen auch die Einsetzbarkeit des Reagens N-α-Fmoc-Lys (14-ε-Biotin) zur carboxyterminalen Biotinylierung.
  • BEISPIEL 10: VERGLEICH DER ANTIKÖRPERERKENNUNG VON HCV-PEPTID 1 ALS DIREKTE BESCHICHTUNG (UNBIOTINYLIERT) ODER GEBUNDEN AN STREPTAVIDIN-BESCHICHTETE PLATTEN (CARBOXYTERMINALE BIOTINYLIERUNG)
  • Ein ähnliches Experiment wurde unter Verwendung eines Peptids durchgeführt, welches relativ gut an Polystyrol-ELISA-Platten bindet, um festzustellen, ob diecarboxybiotinylierte Form des Peptids zu einer überlegenen Antikörpererkennung im Vergleich zur unbiotinylierten Form des Peptids führen würde. Das gewählte Peptid war HCV-Peptid I, welches in den folgenden Versionen synthetisiert wurde:
  • a. unbiotinylierte Version:
    Figure 00370001
  • b. carboxybiotinylierte Version:
    Figure 00370002
  • Ein Spacer, bestehend aus zwei Glycinresten, wurde am Carboxyterminus hinzugefügt, um den HCV-Anteil des eigentlichen Peptids physisch von dem Lys (N-ε-Bio) zu trennen. Die Synthese wurde auf Harz durchgeführt, welches mit 4-(α-Fmoc-Amino-2',4'-dimethoxybenzyl)phenoxyessigsäure-Linker funktionalisiert worden war, um nach Spaltung carboxyterminale Amide zu bilden. Die Kopplung des N-α-Fmoc-Lys (N-ε-Biotips) mit dem Linker wurde durchgeführt unter Verwendung eines dreifachen molaren Überschusses des Zwischenprodukts, bezogen auf den Linker. Die Aktivierung des N-α-Fmoc-Lys (N-ε-Biotins) wurde erzielt unter Verwendung von einem Äquivalent TBTU, einem Äquivalent 1-Hydroxybenzotriazol und 1,5 Äquivalenten N-Methylmorpholin. Die Kopplung aller anderen Aminosäuren erfolgte nach üblichen Protokollen. Nach der Spaltung der Peptide in Trifluoressigsäure in Gegenwart der geeigneten Radikalfänger wurden die Peptide gefällt und mit Diethylether extrahiert.
  • Mit dem unbiotinylierten HCV-Peptid I wurden Vertiefungen einer Polystyrol-ELISA-Platte bei einer Konzentration von 3 μg/ml in Natriumcarbonatpuffer, pH 9,6, direkt beschichtet. Biotinyliertes HCV-Peptid I wurde an Streptavidin-beschichtete Vertiefungen gebunden unter Verwendung einer Stammlösung, welche das Peptid in einer Konzentration von 1 μg/ml enthielt. Die resultierenden Platten wurden dann parallel mit einer Auswahl von Seren aus HCV-seropositiven Donoren inkubiert. Die Ergebnisse dieses Vergleichs sind in Tabelle 7 dargestellt. Das biotinylierte Peptid ergibt im Vergleich zur unbiotinylierten Version derselben Sequenz eindeutig bessere Ergebnisse. Zwei der Seren (8326 und 8244) erkennen die biotinylierte Version dieses Peptids wesentlich besser als die unbiotinylierte Version. Die Spezifität der Antikörperreaktion wird auch reflektiert durch die niedrigen Werte der optischen Dichte, welche für 5 Serumproben von uninfizierten Donoren (F88, F89, F76, F136 und F6) erhalten wurden.
  • BEISPIEL 11: VERWENDUNG VON TYPSPEZIFISCHEN HCV-NS4-PEPTIDEN FÜR DEN NACHWEIS VON ANTIKÖRPERN DURCH LIA
  • Äquivalente Peptide, enthaltend HCV-Typ-2- und -Typ-3-NS4-Sequenzen, die denjenigen Typ-1-Peptiden entsprechen, für die gefunden wurde, Epitope in NS4 zu enthalten, wurden synthetisiert. Die Sequenzen dieser Peptide sind unten gezeigt. Zum Vergleich:
  • Figure 00380001
  • Unter Verwendung dieser neun Peptide wurden LIA-Streifen hergestellt, welche anschließend mit verschiedenen Seren inkubiert wurden. Die Ergebnisse sind in 6 dargestellt. Zwei dieser Seren, welche zuvor negativ mit Typ-1-NS4-Peptiden waren, ergaben eine positive Reaktion mit den Typ-3- und Typ-2-Peptiden. Dies zeigt, daß es möglich ist, die NS4-Nachweisrate durch Verwendung dieser Peptide zu erhöhen.
  • Figure 00390001
  • Figure 00400001
  • Figure 00410001
  • Figure 00420001
  • Figure 00430001
  • Figure 00440001
  • Figure 00450001
  • Figure 00460001
  • Figure 00470001
  • Figure 00480001
  • Figure 00490001
  • Figure 00500001
  • Figure 00510001
  • Figure 00520001
  • Figure 00530001
  • Figure 00540001
  • Figure 00550001
  • Figure 00560001
  • Figure 00570001
  • Figure 00580001
  • Figure 00590001

Claims (23)

  1. Peptid mit einer Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der forgendermaßen zusammengesetzten Gruppe: Peptid NS4-1 (3)
    Figure 00600001
    Peptid NS4-5 (3)
    Figure 00600002
    Peptid NS4-7 (3)
    Figure 00600003
    worin A, falls vorhanden, wie durch die Klammern angedeutet, (eine) Aminosäure(n), eine Aminogruppe oder eine chemische Modifizierung des Aminoterminus der Peptidkette darstellt; B für Biotin steht; X für eine biotinylierte Verbindung, die während des Synthesevorgangs eingebaut wird, steht; Y für eine kovalente Bindung steht, wobei B und X eingeklammert sind, um anzudeuten, dass das Vorhandensein von Biotin oder einer biotinylierten Verbindung in diesen Positionen optional ist, wobei die einzige Bedingung darin besteht, dass B oder X in mindestens einer der gezeigten Positionen vorhanden ist; Z (eine) Aminosäure(n), eine OH-Gruppe, eine NH2-Gruppe oder eine irgendeine dieser zwei Gruppen einschließende Verknüpfung darstellt; oder Varianten von irgendeinem der oben festgelegten Peptide, wobei die Varianten Insertionen und konservierende, sowie nichtkonvervierende Aminosäuresubstitutionen hinsichtlich irgendeiner der oben festgelegten Aminosäuresequenzen darstellen, mit der Maßgabe, dass die Peptidvarianten in der Lage sind, einen immunologischen Wettbewerb mit mindestens einer HCV-3-Art zu liefern, oder cyclische Versionen von irgendeinem der oben festgelegten Peptide, die durch Einbau einer thiolhaltigen Verbindung in die Peptidkette der oben festgelegten Aminosäuresequenzen so erhältlich sind, dass Mercaptogruppen bereitgestellt werden, die in einem anschließenden Cyclisierungsschritt zu verwenden sind.
  2. Peptid nach Anspruch 1 mit einer Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der folgendermaßen zusammengesetzten Gruppe: Peptid NS4-1 (3)
    Figure 00610001
    Peptid NS4-5 (3)
    Figure 00620001
    Peptid NS4-7 (3)
    Figure 00620002
    worin A, B, X, Y und Z die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung aufweisen.
  3. Hybridpeptid, welches in seiner Aminosäuresequenz eine kovalent oder nichtkovalent verbundene Kombination aus mindestens zwei der Peptide nach einem der Ansprüche 1 bis 2 umfasst, welche möglicherweise durch Spacergruppen, vorzugsweise Gly- und/oder Ser-Gruppen, getrennt sind.
  4. Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3, welche mit Streptavidin oder Avidin verbunden ist, wobei das Streptavidin bzw. Avidin seinerseits möglicherweise an eine feste Phase gebunden ist.
  5. Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Peptid über seine Biotingruppe an auf einer Nylonmembran vorhandenem Streptavidin gebunden ist.
  6. Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Peptid mit einem festen Träger über kovalente oder nichtkovalente Wechselwirkungen verankert ist.
  7. Verfahren zum Nachweis von in einer biologischen Probe vorhandenen Antikörpern gegenüber HCV, umfassend: (i) Kontaktieren der biologischen Probe, die auf die Gegenwart von HCV zu analysieren ist, mit Peptid(en) nach einem der Ansprüche 1 bis 6, (ii) Nachweis der zwischen den Antikörpern und dem (den) Peptid(en) gebildeten Immunkomplexes.
  8. Verfahren zur Bestimmung des in einer Probe vorhandenen HCV-Typs, umfassend: (i) Kontaktieren der biologischen Probe, die auf die Gegenwart von HCV zu analysieren ist, mit Peptid(en) nach einem der Ansprüche 1 bis 6, (ii) Nachweis der zwischen den Antikörpern und dem (den) Peptid(en) gebildeten Immunkomplexes.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei in Schritt (i) die biologische Probe auch mit mindestens einem HCV-Typ-2-NS4-Peptid kontaktiert wird, das ausgewählt ist aus:
    Figure 00630001
    worin A, B, X, Y und Z dieselbe Bedeutung haben, wie in Anspruch 1 beschrieben.
  10. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 9, wobei in Schritt (i) die biologische Probe auch mit mindestens einem HCV-Typ-1-NS4-Peptid kontaktiert wird, das ausgewählt ist aus:
    Figure 00640001
    worin A, B, A, Y und Z dieselbe Bedeutung wie in Anspruch 1 haben.
  11. Immunologischer Assay zum Nachweis von HCV-Antikörpern unter Einsatz eines Peptids (von Peptiden) nach einem der Ansprüche 1 bis 6.
  12. Immunologischer Assay zum Nachweis von HCV-Antikörpern unter Einsatz eines Peptids nach den Ansprüchen 1 bis 3, wobei das Peptid mit einem Antigen oder einem an eine feste Phase gebundenen Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 6 konkurrieren kann.
  13. Immunologischer Assay zum Nachweis von HCV-Antikörpern nach den Ansprüchen 11 bis 12, wobei die Peptide an eine Membran in Form paralleler Linien gebunden sind.
  14. Immunologischer Assay zum simultanen Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit von Antikörpern gegenüber verschiedenen HCV-Genotypen in einer Probe unter Einsatz eines Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 6.
  15. Immunologischer Assay nach Anspruch 14, ferner eine wie in Anspruch 9 definiertes NS4-Typ-2-Peptid einsetzend.
  16. Immunologische Untersuchung nach einem der Ansprüche 14 oder 15, ferner ein wie in Anspruch 10 definiertes NS4-Typ-1-Peptid einsetzend.
  17. Verfahren zum Erhalt biotinylierter Peptide nach einem der Ansprüche 1 bis 3, in dem N-α-Fmoc (N-y-Biotin) oder ein N-α-Fmoc-X(N-y-Biotin)-Derivat als Zwischenprodukt verwendet wird, worin X darstellt:
    Figure 00650001
    und Fmoc 9-Fluorenylmethoxycarbonyl darstellt, wobei n mindestens 1, aber weniger als 10 ist und vorzugsweise zwischen 3 und 6 liegt, und wobei eine Aminogruppe an das Cα-Atom gebunden ist, während die andere an den Cy-Kohlenstoff gebunden ist, der der am weitesten entfernte Kohlenstoff in der Seitenkette ist; und y die Position des am weitesten entfernten Kohlenstoffatoms in Bezug auf das die COOH-Gruppe tragende Kohlenstoffatom (Cα-Atom) darstellt; oder deren mit einem Alkohol erhaltenen Ester, insbesondere der Pentafluorphenylester.
  18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei N-α-Fmoc-X(N-y-Biotin) N-α-Fmoc-Lys(N-ε-Biotin) ist, worin Fmoc 9-Fluorenylmethoxycyrbonyl darstellt.
  19. Verfahren zur Herstellung eines Carboxy-terminalen biotinylierten Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 3, welches die folgenden Schritte umfasst: Kopplung eines carboxyaktivierten Produkts aus dem Zwischenprodukt gemäß Anspruch 17 oder 18 an einen an das Harz gebundenen abspaltbaren Linker, z.B. um folgende Verbindung zu erhalten:
    Figure 00660001
    worin Fmoc 9-Fluorenylmethoxycyrbonyl darstellt, worin L wie in Anspruch 17 definiertes X darstellt, und worin B Biotin darstellt, Entschützung der α-Aminogruppe der Zwischenverbindung, z.B. durch Piperidin unter Erhalt von:
    Figure 00660002
    schrittweise Addition der vorschriftsmäßig geschützten, aufeinanderfolgenden Aminosäuren AA1........AAn an:
    Figure 00660003
    zum Erhalt von:
    Figure 00660004
    Entschützung des NH2-Terminus, z.B. durch Piperidin, Entschützung der erhaltenen Verbindung, Abspaltung vom Harz, Extraktion und Reinigung des erhaltenen, an dessen Carboxy-terminalen Ende biotinylierten Peptids, wobei die Schritte der Seitenkettenentschützung und Abspaltung leicht gleichzeitig oder getrennt durchzuführen sind, und insbesondere Entschützung des NH2-Terminus, z.B. durch Piperidin, Abspaltung vom Harz, z.B. mit Trifluoressigsäure, in Gegenwart von Radikalfängern wie Ethandithiol oder Thioanisol oder Anisol, Extraktion des Peptids mit einem Lösungsmittel wie Diethylether, um den größten Teil der Säure und der Radikalfänger zu entfernen, Reinigung, wie mit HPLC, unter Erhalt von:
    Figure 00670001
  20. Verfahren zur Herstellung eines N-terminalen biotinylierten Peptids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, das die folgenden Schritte umfasst: Addition der vorschriftsmäßig geschützten, aufeinanderfolgenden Aminosäuren an das Harz zum Erhalt von: Fmoc-AA1........AAn-Harz, worin Fmoc 9-Fluorenylmethoxycarbonyl darstellt, Entschützung des NH2-Terminus, z.B. durch Piperidin, Addition des Zwischenprodukts:
    Figure 00670002
    worin L wie in Anspruch 17 definiertes X darstellt und B Biotin darstellt, über seine COOH-Gruppe an den NH2-Terminus zum Erhalt von:
    Figure 00680001
    Entschützen der NH2-terminalen Gruppe der erhaltenen Verbindung, Abspalten vom Harz, Extraktion und Reinigung des erhaltenen, an seinem Aminoterminus biotinylierten Peptids, wobei die Schritte der Seitenkettenentschützung und Abspaltung leicht gleichzeitig oder getrennt durchzuführen sind, sowie insbesondere Entschützung der NH2-terminalen Gruppe der Zwischengruppe, z.B. durch Piperidin, Abspaltung vom Harz, z.B. mit einer Säure wie Trifluoressigsäure, in Gegenwart von Radikalfängern wie Ethandithiol oder Thioanisol oder Anisol, Extraktion des Peptids mit einem Lösungsmittel wie Diethylether, um den größten Teil der Säure und der Radikalfänger zu entfernen, Reinigung, wie mit HPLC, zum Erhalt von:
    Figure 00680002
  21. Verfahren zur Herstellung eines intern biotinylierten Peptids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, das die folgenden Schritte umfasst: Addition der vorschriftsmäßig geschützten, aufeinanderfolgenden Aminosäuren auf das Harz zum Erhalt von: Fmoc-AA1........AAn-Harz, worin Fmoc 9-Fluorenylmethoxycarbonyl darstellt, Entschützung des NH2-Terminus, Addition des Zwischenprodukts;
    Figure 00690001
    worin L wie in Anspruch 17 definiertes X darstellt, und B Biotin darstellt, über seine COOH-Gruppe mit dem NH2-Terminus zum Erhalt von:
    Figure 00690002
    Entschützen der α-Gruppe der Zwischengruppe, z.B. durch Piperidin zum Erhalt von:
    Figure 00690003
    Addition der vorschriftsmäßig geschützten, anschließenden Aminosäuren auf das Harz zum Erhalt von:
    Figure 00690004
    Entschützung der NH2-terminalen Gruppe der erhaltenen Verbindung, Abspaltung vom Harz, Extraktion und Reinigung des erhaltenen, an seinem Aminoterminus biotinylierten Peptids, wobei die Schritte der Seitenkettenentschützung und Abspaltung leicht gleichzeitig oder getrennt durchzuführen sind, sowie insbesondere Entschützung der NH2-terminalen Gruppe der Zwischengruppe, z.B. durch Piperidin, Abspaltung vom Harz, z.B. mit Trifluoressigsäure, in Gegenwart von Radikalfängern wie Ethandithiol oder Thioanisol oder Anisol, Extraktion des Peptids mit einem Lösungsmittel wie Diethylether, um den größten Teil der Säure und der Radikalfänger zu entfernen, Reinigung, wie mit HPLC zum Erhalt von:
    Figure 00700001
  22. Peptid(e) nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Verwendung in einem Immunisierungsverfahren gegen HCV-Infektion.
  23. Verfahren zur Herstellung eines Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Synthese der Peptide in Lösung oder auf einem festen Träger erreicht wird.
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