JPH09500444A - 機能性にした表面を有する導波管を通過する電磁放射の干渉を利用するセンサ - Google Patents
機能性にした表面を有する導波管を通過する電磁放射の干渉を利用するセンサInfo
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Abstract
(57)【要約】
ケミカルセンサおよびバイオセンサが開示されている。光導波管(11)を使用して電磁放射を、全内部反射により、基準光導波管部分(12)および少なくとも1個の検体導波管部分(14)内を、平行に導く。電磁放射は収斂して射出放射になる。少なくとも検体部分の外部表面は、基準部分と比較して、共有結合によって変性されている、すなわち機能性になっている。機能性にした表面と検体を含有する分子との内部反応が生起して、射出ビームに対応する測定可能な干渉パターンを生じさせるのに十分な基準部分に対する位相変化を、検体部分を通過する電磁放射に生じさせる。
Description
【発明の詳細な説明】
機能性にした表面を有する導波管を通過する電磁放射の干渉を利用するセンサ
本発明は、ナショナル インスティテュート オブ ジェネラル メディカル
サイエンスからの許可番号GM27137およびオフィス オブ ネイバル
リサーチからの許可番号N00014−92−J−1412(R&T コード
413t011)の下、ある合衆国政府の支援でなされた。合衆国政府は本発明
に権利を有する。発明の分野
本発明はケミカルセンサおよびバイオセンサに属し、特に、このようなセンサ
は光導波管を使用し、光導波管の表面に化学的変性により決定した応答特性を有
する。背景の一般的な議論
本発明は、幾つかの科学技術に基づいており、それは、すなわち、ケミカルセ
ンサおよびバイオセンサ、表面の化学変性、並びに、干渉計技術である。
センサ技術の主な目的は、より小さく、より高感度に、である。また、特異的
選択的監視のより厳しい要求があり、特に、環境監視および制御、生理学上の監
視、診断上の監視、バイオプロセシング、農業、薬学、治療上の監視、並びに更
に防御および石油化学のような分野においては強要される。
「センサ」は変換器の1つの型である。すなわち、装置は、外部の刺激あるい
は入力信号の大きさに関連する大きさで測定可能に応答する外部の刺激あるいは
入力信号に応答する。
「ケミカルセンサ」はセンサ中あるいはセンサ上の化学反応あるいは分子変化
がセンサで測定可能な応答を生ずることが重要な観点となるセンサである。
バイオセンサは多くの型の生物分子と他の化合物の分子との相互作用の高特異
性のために重大な注意を主題とする。例えば、Vadgama氏等、「Bios
ensors:Recent Trends」、Analyst 117:16
57〜1670(1992)参照。しかし、生物分子を含む特別な反応の知識と
バイオセンサにおける反応の開発との間のギャップをつなぐことは困難であるこ
とがよく証明される。例えば、バイオセンサにおいて、生物的成分は、しばしば
準安定な生物層の形態で通常存在する。このように、現代の多くのバイオセンサ
は環境の影響を曖昧にされる。第2に、生物層は、目的の検体への生物層の応答
を妨害し得る、あるいは生物層に界面的に活性であり得る、および/または、有
害の可能性のある多数の他の化合物を含む複雑な混合物中にしばしば存在する検
体に直接接触させることが通常は必要である。
センサを作るにおいて直面する重要な問題は、検出化合物の分子(すなわち、
「検出分子」)を適当な基体表面のようなセンサ中あるいはセンサ上の特別な部
位にいかにして固定するかである。検出分子が検体の分子にさらされあるいはさ
もなければ接触される場合は、このような固定化は、測定されるパラメータにお
ける重要な変化に応答するための検出分子の能力にほとんど有利に影響し得ない
。検出分子がその部位に結合される場合でさえ、このような固定化は、検出分子
が対応する検体への反応特異性を保持することを要求する。
検出分子を部位に固定する1つの方法は、その部位に検出分子を化学的に結合
することである。しかし、特に、生物分子については、従来の結合技術による検
出分子の固定化は、検出分子に、検体へ応答するための検出分子の容量を減じる
かあるいは破壊し得るコンホメイションの変化あるいは幾つかの他の変化を生じ
させ得る。
しばしば直面する別の問題は、重合性基体のような多くの基体は基体としての
使用に対して望ましい性質を与えるが、特に、基体、検出分子、あるいは両方に
損傷を起こさない化学を使用して、検出分子を基体に結合することは現代の方法
ではしばしば困難かあるいは不可能である、ということである。
検出分子を基体に結合することは、基体の化学的変性あるいは「機能性化」の
形態として考えられ得る。
表面の化学的変性は徹底的な研究の主題である。このような表面の例としては
、重合体(Braybrook氏等、「Prog.Polym.Sci.」15
:715〜734(1990))、金属(Stratmann氏、「Adv.M
ater.」2:191〜195(1990))、シリカ(Bhatia氏等、
「J.Am.Chem.Soc.」114:432〜4433(1992)、お
よびグラファイト(Delamer氏、「J.Am.Chem.Soc.114
:5883〜5884(1992)が挙げられる。この研究は、新規な合成物(
Baum氏等、「Chem.Mater.」3:714〜720(1991))
、レジスト材料(MacDonald氏等、「Chem.Mater.」3:4
35〜442(1991))、バイオセンサ(Pantano氏等、「J.Am
.Chem.Soc.113:1832〜1833(1991))、および生体
適合物質(Allcock氏等、「Chem.Mater.」3:450〜45
4(1991))の開発に原理的に向けられる。最近、表面変性はフォトリソグ
ラフィと結合し、ペプチドあるいはオリゴヌクレオチドの合成(Fodor氏等
、「Science」251:767〜773(1991)およびKieder
owski氏「Angew.Chem.Int.Ed.Eng.」30:822
〜823(1991))およびバイオ重合体の固定化を空間的に目指す。Roz
snyai氏等、「Angew.Chem.Int.Ed.Eng.」31:7
59〜761(1992)。この技術において知られるほとんどの表面変性の方
法は化学試薬を用いた表面の連続的な処理を含む。このような研究のほんのわず
かのものが、表面変性試薬としてアジ化物の使用を含む。Breslow氏、S
criven編「Azides and Nitrenes」10章、Acad
emic Press、NY(1984)、Harmer氏、「Langmui
r」7:2010〜2012(1991).
重合体フィルムを変性するための現存する方法を例示すると、ポリスチレンの
スルホン化(Gibson氏等、「Macromolecules」13:34
(1980))、ポリ(アリロキシ)ホスファゼン(Allcock氏等、「C
hem.Mater.」3:1120(1991))、ポリエステルのプラズマ
処理(Porta氏等、「Chem.Mater.」3:293(1991)、
ポリイミドの塩基加水分解(Lee氏等、「Macromolecules」2 3
:2097(1990))、ポリホスファゼンの塩基加水分解(Allcoc
k氏等、「Chem.Mater.」3:1441(1991))、およびポリ
(フッ化ビニリデン)の塩基処理(Dias氏等、「Macromolecul
es」17:2529(1984)が挙げられる。
重合体を変性するための別の従来の方法は、ポリエチレンのような炭化水素重
合体の表面を、気位相中で生成したナイトレンあるいはカルベン中間体にさらす
ことを含む。Breslow氏、Scriven編「Azides and N
itrenes」10章、Academic Press、NY(1984)。
また、溶液中で生成したジフルオロカルベンは1,4−ポリブタジエンを変性す
ることが報告された。Siddiqui氏等、「Macromolecules
」19:595(1986)。
ペルフルオロフェニルアジ化物(PFPA)は、PFPAをシクロヘキサンあ
るいはトルエンのような炭化水素溶媒中で光分解する場合、非フッ素化類似物上
の改良したCH−挿入効率を現すことが示された。Keana氏等、「Fluo
rine Chem.」43:151(1989)、Keana氏等、「J.O
rg.Chem.」55:3640(1990)、Leyva氏等、「J.Or
g.Chem.」54:5938(1989)、およびSoundararaj
an氏等、「J.Org.Chem.」55:2034(1990)。PFPA
は有効な光標識化試薬として初期に発達した。Cai氏等、「Bioconju
gate Chem.」2:38(1991)、Pinney氏等、「J.Or
g.Chem.」56:3125(1991)、およびCrocker氏等、「
Bioconjugate Chem.」1:419(1990)。近年、ビス
−(PFPA)がポリスチレン(Cai氏等、「Chem.Mater.」2:
631(1990))、およびポリ(3−オクチルチオフェン)(Cai氏等、
「J.Molec.Electron」7:63(1991))に対する有効な
架橋剤であることが示された。
ケミカルセンサおよびバイオセンサは表面変性技術のある観点を開発すること
が知られている。例えば、Kepley氏等、「Anal.Chem.」64:
3191〜3193(1992)において開示されるように、質量感受性表面音
波(SAW)基体は、カルボキシレート末端に結合したCu2+イオンにより末端
化された、カルボキシレート末端n−アルカンチオール分子の単層により化学的
に変性される。このうなセンサは、末端Cu2+イオンへの類似物の分子結合
により、神経系に作用する物質類似ジイソプロピルメチルホスホネートに化学的
に応答する。このような結合により末端Cu2+イオンに結合した類似物の質量に
比例するSAWにおいて摂動が生じる。
また、光導波管を通過した光の変化に応答するケミカルセンサおよびバイオセ
ンサが作られた。このようなセンサの1例は、Norris氏、「Analys
t」114:1359(1989)に開示されており、ここでは、光導波管を介
した伝達の間に光により経験された総内部反射率が開発される。総内部反射率は
、光導波管の表面に光導波管を介して通過した光により有効に「質疑応答」され
る。
別の例では(Tan氏等、「Anal.Chem.」64:2985〜299
0(1992))、光ファイバーは、pHプローブとして使用するために化学的
に変性されるサブミクロン光ファイバーチップに引っ張られる。チップの化学的
変性はフルオレセインアミンをアクリルアミド−メチレン−ビス(アクリルアミ
ド)共重合体に結合し、光開始した重合により共重合体をシラン化したファイバ
ーチップに共有結合的に結合することにより行う。発明の概要
本発明は、光導波管(optical waveguide)内における電磁放射の全内部反射を
利用するセンサ素子およびセンサを提供する。本発明の一つの面においては、光
導波管は、この技術分野において知られている「マッハ・ツェーンダ(Mach-Zeh
nder)」干渉計と、いくつかの特徴を共有している。すなわち、本発明に係る光
導波管は少なくとも2個の別個の部分を有する。電磁放射は平行になって前記光
導波管部分を下方に通過し、次いで収斂して「射出ビーム」になる。光導波管は
電磁放射に対して屈折率を示す材料から製造する。
本発明の他の面においては、電磁放射が平行になって通過する前記導波管部分
の一方は「基準」部分として作用し、前記導波管部分の他方は「検体」部分とし
て作用する。
本発明のさらに他の面においては、検体部分は、検体を含む分子と相互作用す
るように化学的にに変性した、すなわち「機能性」にした外部表面を有する。機
能性にした表面と検体との相互作用、例えば、機能性にした表面に対する検体の
結合は、検体部分を通過する電磁放射に、基準部分を通過する電磁放射に対する
位相変化を与えるのに十分である。この位相変化は射出ビームに対応する干渉パ
ターンを生じさせるのに十分である。射出ビームにおける干渉パターンは、射出
ビームを、検体部分の表面上に検体が存在していない場合に生じる射出ビームと
は検出可能に相違させる。
本発明の他の面においては、光導波管の基準部分および検体部分は、それぞれ
第1端部および第2端部を有し、第1端部は光導波管の入射部分に連結され、第
2端部は光導波管の射出部分に連結されている。入射部分は電磁放射を第1端部
に導入する作用をする。射出部分は第2端部を出る電磁放射を収斂させる作用を
する。
本発明のさらに他の面においては、光導波管を極めて小形にすることができる
。例えば、電磁スペクトルの可視部またはその近傍の電磁放射の波長を単一モー
ドで伝送する場合には、光導波管の横寸法をミクロメーター程度とすることがで
きる。従って、生成したセンサを、実際に、生細胞の存在下を含む任意の検知場
所に配置することができ、極めて迅速な応答時間を有する。さらに、生成したセ
ンサは極小量の検体に対して鋭敏な感度を示す。本発明の他の面においては、光
導波管の屈折率より小さい屈折率を有する硬い基礎材料の表面上に、上述のよう
な小形光導波管を製造することができる。所要に応じて、先ず、十分に小さい屈
折率を有する中間材料を、光導波管の屈折率に較べて大きすぎる屈折率を有する
基礎材料の表面上に、被着させることができる。
本発明のセンサはバイオセンサであることができる。このようなバイオセンサ
を製造するには、光導波管の検体部分を、これにタンパク質または抗体のような
生体物質の分子を結合させることにより機能性にする。このようなセンサは検体
に対して応答し(これは検体部分の表面にどのような官能基が結合しているかに
全く依存している)、検体としてはウィルスおよび他の微生物、細胞、細胞小器
官、膜成分、および広範囲の生体分子のような生体構造物を含めることができる
。
光導波管は、該光導波管を通過する電磁放射に対して屈折率を示す非流体物質
から作ることができる。例えば、光導波管物質としては、広範囲の重合体材料お
よびケイ質材料を使用することができるが、これらの材料に限定されるものでは
ない。また、光導波管材料としては、ケイ素、酸化ケイ素、ヒ化ガリウム、およ
び他の半導電性材料(ドープされた材料またはドープされていない材料)を使用
することができる。
本発明の更に他の面においては、光導波管表面を、光子、電子、または熱のよ
うな反応エネルギー供給源の存在下に、ニトレン含有(nitrenogenic)機能性化
試薬に接触させることにより、光導波管を機能性にする。反応エネルギー供給源
の存在下に、機能性化試薬はニトレン中間体を生成し、この中間体は光導波管上
のCH、−NH、−OH、−C=C−、−C−C−基または他の基と電子対を共
有するように反応して、光導波管の表面に対する機能性化試薬の「ニトレン付加
」または「ニトレン挿入」作用を生じさせる。
ニトレン中間体を生成させるには、機能性化試薬は、反応エネルギー供給源に
さらされた際に反応性ニトレンを生成することができるアジド基または類似した
化学基によって終端させる必要がある。
光導波管表面は1段法または多段法によって機能性にすることができる。多段
法では、代表的な例においては、各段で異なる機能性化試薬を使用する。1段法
および多段法のいずれにおいても、少なくとも1つの段でニトレン含有機能性化
試薬を使用する。
1段法においては、機能性化試薬の各分子は、ニトレン含有基のほかに、ニト
レン含有基と共有結合によって結合している機能性化基を有する。機能性化基は
、実際に、ニトレン中間体と架橋反応しない所望の化学基、あるいはそうではな
く基体表面と機能性化試薬とのニトレン付加反応を有意は妨害しない所望の化学
基とすることができる。例えば、機能性化基は、放射性ラベル、蛍光ラベル、酵
素、薬理学的に活性な基、診断学的に活性な基、抗体、核酸、界面活性剤、およ
び広範囲の他の基のうちの任意のものから選択することができるが、これらに限
定されるものではない。
多段反応において光導波管表面を機能性にするのに適した官能性化試薬は、い
くつかの方法で製造することができる。1つの方法によれば、第1機能性化試薬
を光導波管表面と反応させて、第1機能性化試薬分子の光導波管表面に対する共
有結合を達成し、次いで第2機能性化試薬を添加して前記共有結合している第1
機能性化試薬分子と反応させる、従って共有結合させる。このような方法におい
ては、第1機能性化試薬は、それぞれの分子が、窒素含有基のほかに、第1機能
性化試薬がニトレン付加を経て基体表面に共有結合した後に、下流の化学反応に
関与するのに適した第1機能性化基を有している分子から成る。例えば、第1機
能性化基は、第2機能性化試薬の分子の上の−NH基、−OH基、または他の求
核基と反応する活性エステルとすることができる。第2機能性化試薬は、酵素、
抗体、診断薬、または治療薬のような最終的に光導波管表面に結合させるのが望
ましい第2機能性化基を提供することができる。
別の多段プロセスでは、先ず第2機能性化試薬(これは第2機能性化基、すな
わち最終的に望ましい機能性化基を有する)と、第1機能性化試薬(これはニト
レン含有基を有する)とを反応させ;次いで第2反応において、第1反応の生成
物と光導波管表面とを反応エネルギー供給源の存在下に反応させて、ニトレン付
加を経由する光導波管表面に対する第1反応生成物と共有結合させる。
本発明における1段法および多段法に好ましい1組の機能性化試薬は、N−ヒ
ドロキシスクシンイミド活性エステル機能性化パーフルオロフェニルアジド(N
HS−PFPA)から成る。NHS活性エステル基は、試薬分子のPFPA部分
から得られる反応性の大きいニトレン中間体の反応中に生成して、光導波管表面
に共有結合する。(ニトレン中間体の反応性ニトレン部分は、ニトレン部分がN
HS活性エステル部分と分子内反応することができないように、構造的に拘束さ
れているのが好ましい。)このようにして、光導波管表面は「変性」された状態
(すなわち「機能性化」された状態)になる。その後、活性エステルは第1アミ
ンまたはヒドロキシル基を有する種々の試薬(例えばバイオ分子)とのさらなる
反応に、それぞれアミドまたはエステルの形成を経て、関与することができる。図面の簡単な説明
図1は本発明の干渉計の実施態様の概略図である。
図2は実施例4で説明したポリスチレンフィルムの表面変性を示す蛍光顕微鏡
(450〜490nm励起波長>510nm照射)の下で観察されたミクロサイ
ズのパターンの写真である。
図3Aは実施例5で説明した予備形成したポリスチレンパターンをPFPA化
合物(図1中の化合物1a)で処理し、続いて光分解し、その後、N−(5−ア
ミノペンチル)ビオチンアミド、続いてフルオレセイン−アビジンにより処理す
ることにより形成した蛍光プロテインの顕微鏡写真である。
図3Bは実施例5で説明した実施例のコントロールの光顕微鏡写真であり、こ
こで、ポリスチレンはフルオレセイン−アビジンで処理した。
図4Aは実施例6で説明した第1にNHS−PFPAで、次にセイヨウワサビ
ペルオキシダーゼで機能性化した新たに付着したグラファイト表面の原子間力の
顕微鏡で得た映像である。
図4Bは実施例6で説明した実施例のコントロールの原子間力の顕微鏡映像で
あり、ここで、新たに付着したグラファイト表面はNHS−PFPAでなくセイ
ヨウワサビペルオキシダーゼで処理した。
図5Aは実施例10で説明した反応エネルギー源として電子ビームを使用して
NHS−PFPAを用いて機能性化したポリスチレン表面の蛍光顕微鏡(450
〜490nm励起波長>510nm照射波長)を使用して得た光顕微鏡写真であ
る。
図5Bはビーム線量および線幅を示す図5Aの説明図である。
図6はシリコン支持材料上のポリスチレンから作られた6つの光導波管を示す
実施例11に関係する写真である。
図7はポリスチレン干渉計を示す実施例11に関係する写真であり、そのうち
2つはフルオレセインで機能性化し蛍光顕微鏡を使用して可視化した検体枝管を
有する。詳細な説明 1.一般的なセンサの形態
本発明では、干渉計として構成したケミカルセンサおよびバイオセンサを提供
する。好ましい形態は、検体との相互作用に適合される基準枝管および少なくと
も1つの枝管(「検体枝管」という)を有する変性したマッハ−ツェンダー干渉
計である。
干渉計は、一般に、電磁放射のビームを別々の通路に沿って送られその後再結
合される2以上のビームに分割する装置である。分割したビームの一方が他方の
ビームとの比較における変化により、再結合ビーム中に干渉パターンを生成し得
る。干渉計はフィルム厚さ(例えば、「フィゾー干渉計」)、表面マイクロトポ
グラフィ、光素子の性能(例えば、「トワイマン−グリーン干渉計」)、および
気体密度を測定するために使用される。更に、光干渉は分光学を実施するために
開発された(例えば、「チェルニー−ターナーモノクロメーター」、「ファブリ
ー−ペロ分光学」)。
従来のマッハ−ツェンダー干渉計では、第1ビームスプリッターを使用して電
磁放射の単一ビーム源からの少なくとも2つの分割したビームを生成する。各枝
管ビームは分割したビームを収束するために反射される。収束したビームは第2
ビームスプリッターを使用して再結合される。マッハ−ツェンダー干渉計は風洞
等中の障害物周りの気体流を測定するために典型的に使用される。気体の屈折率
は多くの場合気体密度に比例するので、これが可能となる。試験室は1つの枝管
ビームがこれを通ることができるように配置され、別の枝管ビームは基準ビーム
として役立つ。干渉縞のパターンは枝管ビームの再結合から生じる。気体密度が
局所的な圧縮の結果として変化する場合、第1枝管ビームを変化させ、干渉パタ
ーンは対応して変性される。
マッハ−ツェンダー干渉計の実験室バージョンでは、気体(空気のような)を
介して光ビームを通し、ミラーおよび従来のビームスプリッターを頼る。本発明
では、完全な干渉計が、単一光導波管ユニットとして、屈折率を示す材料から光
導波管を介して通る適当な型の電磁放射まで好ましく作られる。
ここで使用したように、「光」は、一般に、関心のある検体および干渉計を作
る材料に適した波長(あるいは波長の範囲)を有する電磁放射を意味すると理解
される。電磁放射は可視光であり得るが、また限定しないが赤外線および紫外線
のような他の波長であり得る。好ましくは、本発明の干渉計で使用される光の波
長は、約0.3〜約2.0μmの範囲内である。電磁放射は非偏光あるいは偏光
であり得る。
本発明を代表する干渉計10は図1に示される。干渉計10は基準枝管12お
よび検体枝管14を有する単一光導波管から構成される。基準枝管12および検
体枝管14は第1接合部15にて入射光導波管16に結合され、第2接合部17
にて出射光導波管18に結合される。光(hν)は末端20にてあるいは近傍に
て入射光導波管16に入り、第1接合部15に向かって入射光導波管16の長さ
をビームとして下方に伝達する。第1接合部15にて、光ビームの一部を基準枝
管12におよび一部を検体枝管14に通すために、光導波管は光ビームを分割す
る。基準枝管および検体枝管を介して通った後、光ビームは第2接合部17にて
再結合し、出射光導波管18に入る。基準枝管12を介して通る光に関連した検
体枝管14を介して通る光におけるすべての関連した位相変化が、出射光導波管
18中で干渉を生じ、これは光の伝達強度における変化として検出されるだろう
。
干渉計は、以下に詳細に説明したように、機能性化化学を使用して検体枝管の
表面を化学的に機能性にすることにより関心のある検体に感受性を持たせる。基
準枝管は機能性にしないかあるいは検体枝管と異なった機能性にしておく。これ
より、干渉計が、検体枝管を介して通る光を、基準枝管を介して通る光と比較す
ることが可能となる。機能化は、検体枝管の表面に検体分子を結合可能とするか
、あるいはさもなければ検体枝管に検体枝管の表面化学を変える方法で検体分子
への応答性を与える。以下に長さにて説明したように、種々の官能基が検体のア
ーム部に結合でき、これにより、非常に幅広く種々の検体応答性分子あるいは化
学基を共有結合的に結合することができる。例えば、生物学的分子は、(限定さ
れないが、)酵素、抗体、核酸、酵素基質、および細胞表面抗原のような検体枝
管に結合できる。
検体枝管は、特異的検体分子のみならず無傷の生きている細胞および検体とし
て役立ち得る他の生物学的構造体のような実在物に感受性をもつために機能性に
することができる。このように、本発明のセンサを使用して、検体枝管に結合し
た細胞特異的抗体あるいは抗原に結合するある細胞の存在に対して組織分析する
ことが可能となる。同様に、本発明によると、光導波管の検体枝管に結合したビ
リオン特異的生物分子に結合するウイルスの存在に対して材料分析することが可
能となる。
以上簡単に議論したように、本発明の干渉計は、光導波管を介して光を伝達す
る。干渉計を介して通った光の一部は基準枝管を介して通り、一部は機能化した
表面を有する検体枝管を介して通る。光は、光が光導波管を介して通るとき、総
内部反射を経験する。現在理解されている総内部反射の原理によると、ビームが
反射するとき、光導波管の縦の壁部にて作られた光定常波の電気的ベクトルは、
光導波管を取り巻く媒体中に拡がる。検体分子が検体枝管光導波管の機能性にし
た表面に結合する(あるいはさもなければ機能性にした表面に化学変化が生じる
)場合、検体に対する特有の方法で、および、検体が機能性にした表面と相互作
用して、検体枝管を介して通るビームが変わる。基準枝管光導波管を介して通っ
た光ビームは類似して変わる。故に、検体枝管および基準枝管の光ビームが出て
いく光導波管に入る際に再結合する場合、特有の干渉パターンを作る。干渉パタ
ーンの生成あるいは干渉パターンにおける変化は容易に従来の方法で検出可能で
ある。
干渉計は1つのあるいは多重の検体枝管のいずれかを備えることができる。後
者の場合、干渉計は1つ以上の検体に応答性を有し、あるいは特別な検体により
感受性を有し得る。各検体枝管は類似のあるいは異なる機能性化にし得る。
干渉計の最低の実際的な大きさは、光導波管を介して伝達される電磁放射の吸
収により決定される。単一方式の操作は、光導波管の切断波長以下の波長の電磁
放射に対して生じる。光導波管の切断波長以上の波長の電磁放射が多重方式の操
作を生じる。光導波管の切断波長は光導波管技術における当業者に周知である。
横方向に非常に小さい寸法(例えばミクロンにおける)を有する光導波管は好
ましくは硬い基部上に形成され、あるいはさもなければ硬い基部に支持される。
基部材料のような干渉計光導波管を直接に接触する材料は、光導波管の屈折率よ
り小さい屈折率を有すべきである。光導波管材料に関連する基部材料の屈折率に
おける違いが大きい程より好ましい。
限定しないが、基部材料を例示すると、二酸化ケイ素(n=1.41〜1.4
9)、溶融シリカ(n=1.4)、石英(n=1.55)、ガラス(n=1.5
〜1.9、特異的な型に依存)、ヒ化ガリウム、ケイ素、および他の半導体材料
等が挙げられる。
干渉計が基部材料に支持される場合、光導波管を基部材料上に直接作ることが
できる。特に好ましい基部材料が光導波管材料に比べて高すぎる屈折率を有する
場合は、基部材料はより低い屈折率を有する媒介材料で第1被膜を形成すること
ができ、その後、光導波管は媒介材料の表面上に形成される。
多くの適当な基部材料(多くの合成重合体および二酸化ケイ素および石英のよ
うな無機材料を含む)は、多くの適当な光導波管材料と不充分に異なる屈折率を
有する。故に、基部材料と光導波管の間で基部材料より屈折率のより低い媒介材
料を挿入することがしばしば必要となるかあるいは少なくとも望ましい。
光導波管は、光導波管を介して通る電磁放射に屈折率(変数「n」により示さ
れる)を示す材料から作られる。光導波管材料の屈折率は光導波管に接触する基
部材料および(空気あるいは検体を含む液体のような)他の物質の屈折率より大
きくなければいけない。
光導波管材料は好ましくは種々の利用できる合成重合体から選択された合成重
合体である。表Iに候補に挙がる重合体のリストの一部を相当する屈折率の値(
20〜25℃にて測定)と共に示す。
上記の通り、上記リストは、全てではない。他の光導波管重合体として候補に
挙がるものとしては、ポリ(イミド)およびポリ(3−オクチルチオフェン)等
である。
光導波管を作るのに使用できる他の材料の例としては、限定されないが、酸化
ケイ素、窒化ケイ素、ヒ化ガリウム、ガラス、および他のシリカ質材料等である
。当業者には理解できるように、電磁放射の光導波管材料の「透明性」は、光導
波管を介して通そうとする電磁放射の波長に依存する。
光導波管が合成重合体から形成される場合、高分子を配向させることができる
。重合体の屈折率は配向した重合体のある軸から別の軸に実質的に変わり得るの
で、分子配向は光導波管の屈折率に影響を与える。このように、その分子が光導
波管に関連して特異な配向を有する場合に、低すぎる平均屈折率を有する重合体
はより適当である。適当な重合体は純粋な重合体のみならず重合体ブレンド物も
含む。参照:Paul氏等、「Multicomponent Polymer
MixturesJACSシンポジウムシリーズ♯211(1986)。重合
体は水性液体に不溶である必要はない。代表的な例は、1.52の屈折率を有す
るポリ(2−エチル−2−オキサゾリン)である(Chiu氏等、Glass(
ed.)「Water−Soluble Polywers. Beauty
with Performance」ACSシンポジウムシリーズ♯213、p
p.425〜433(1986)。
干渉計の性能を改良するために、基準枝管(場合によって、非機能性にしない
)ならびに入ってくるおよび出ていく光導波管は低い屈折率(光導波管に比べて
)を有する不活性材料で覆われたことが好ましい。好ましい被覆材料としては、
限定されないが、エポキシ樹脂およびポリ(メタクリル酸メチル)等である。被
覆により表面が望ましくない位相変化を引き起こす表面汚染を回避することがで
きる。
光導波管の他の物理的特性は、光導波管の性能にも影響する。例えば、光導波
管は過度にヘリ部が粗くないことが重要である。加えて、更に図1を参照し、基
準枝管12および検体枝管14の曲率半径は実際的な大きさとすべきであり、半
径は大きい程より良い。半径は製造工程の間に必要に応じ調整できる。
また、光導波管を構成する重合体を形成するために適合する技術を使用して基
部材料上に光導波管を形成できる。例えば、Saavedra氏等、「Appl
.Spectroscopy」44:1210(1990)、Saavedra
氏等、「Langmuir」7:995〜999(1991)。
横寸法が例えばマイクロメロターの光導波管を用いて、適当な波長の電磁放射
をこの技術では周知のプリズム結合あるいは回折格子結合を使用して光導波管に
導入できる。Butler氏等、「Appl.Optics」29:3879〜
3880(1990)。
送出光導波管を介して通る光波の干渉は、出射光導波管を介して伝達された光
強度における変化を測定することによりあるいは(大きな位相変化の条件下で)
フリンジ計数により検出できる。
幾つかのセンサを同時に使用して検体の別の検出を行うことができる。加えて
、所定のセンサは、それぞれ異なって機能性化された多重の検体枝管を有するこ
とができ、センサは分光センサとして使用できる。
本発明のセンサは、非常に速い応答時間を有し、特に、ミクロンのオーダーの
横の寸法をを有する。2.一般的な機能性化技術
本発明のセンサの適用のほとんどにおいては、センサの検体の枝管のみが機能
化される。しかし、本発明の干渉計は基準枝管と比べて検体枝管を介する光の伝
達が異なることをそれぞれ検出するので、基準枝管も機能性にすることができる
が、検体枝管とは異なる方法で行う。
ここでは、以下の言葉を使用する。
「基体」は、非流体材料であり、本発明では機能性化し得る表面を有し、この表
面は、上記の通り、干渉計の検体枝管(および基準枝管も可能)である。以下に
説明する機能化技術について、基体は、分子(例えば、熱可塑性高分子)、熱硬
化性分子網(例えば、架橋高分子)あるいは、あるガラスおよび結晶中に見つけ
られるような他の原子や分子結合体からなり得る。
「表面分子」は、基体表面上に存在する少なくともその一部を有する基体分子
である。
「重合体基体」は、高分子あるいは重合体分子網からなる基体である。
「高分子」は、「単量体」と呼ばれるより小さい分子の共有結合により形成さ
れる大きい分子である。高分子中に存在する単量体は、同じでも異なっていても
良い。高分子は、限定されないが、セルロース、でんぷん、蛋白質、および核酸
のような天然物でも、限定されないが、ナイロンおよびポリエチレンのような合
成物でも良い。基体では、高分子は、非共有結合的架橋網状構造(熱可塑性とし
て)あるいは共有結合的架橋網状構造(熱硬化性として)を含む幾つかのものと
互いに組み合わせることができる。
「機能性にした基体」は本発明では1またはそれ以上の官能基を共有結合した
基体である。
「官能基」は所望の化学的特性をもつために有機的な方法で1またはそれ以上
の原子を一緒に結合した群である。本発明では、本発明の基体表面に共有結合さ
れる場合、類似の官能基あるいは異なる型の官能基のいずれかと共に官能基は1
またはそれ以上の付加的な結合反応に加わる。このような結合反応により、(a
)種々の付加的な官能基のうちのいずれかの官能基への結合、あるいは(b)機
能性にした基体分子の結合(架橋)、が得られる。
「機能性にした重合体」は、機能性化重合性基体あるいは機能性化重合体分子
のどちらかに保持できる。
本発明の「機能性化試薬」は本発明の基体を機能性にするために使用する試薬
である。機能性化試薬の分子は、第2官能基に結合される少なくとも1つのニト
レン含有基(第1官能基として)を有する。ここで、ニトレン含有基は、ニトレ
ン含有基と官能基との間で機能性化試薬分子構造により好ましく強制される。ニ
トレン基は基体表面を機能性にする反応条件下で可能である。
機能性化試薬における「ニトレン含有基」は、反応エネルギー供給源にさらさ
れる場合、ニトレン基になる化学的な一部である。
「ニトレン基」(「ニトレン」あるいは「ニトレン中間体」とも一般に呼ばれ
して書くことができる特別な形の基である。ニトレンはカルベンの窒素類似体と
して当業者にみなされる。カルベンのような、ニトレンは一般に中間体として見
なされる。ニトレンは非常に反応性が高く、通常の条件下では一般には単離でき
ない。しかし、本発明の反応のようなある化学反応は、ニトレンの存在を仮定し
ないでは、既知の反応機構により説明することができない。重要なニトレン反応
を以下のようにまとめることができる。
(a)アリルニトレンを含むニトレンは、−CH部位および−NH部位におい
て付加反応を受け得る。例えば、
(b)また、ニトレンは−C−C−および−C=C−結合において付加を受け
得る。例えば、
ここで使用したように、表面分子との、機能性化試薬のニトレン基の反応の状
況において使用される場合、付加反応は一般に、本発明の基体表面上の分子と共
にニトレンが受け得る種々の付加反応および挿入反応のうちのいずれかである。
本発明では、機能性化反応は、ニトレン含有基を含む機能性化試薬が反応エネ
ルギー源にさらされる場合に起こり、ニトレン含有基をニトレン中間体に変える
。機能性化反応は基体表面とニトレン中間体の反応により進行する。
「反応エネルギー供給源」は、特に、基体表面と反応するニトレンに機能性化
試薬分子上のニトレン含有基を変えることにより、本発明の機能性化反応を起こ
させるエネルギー供給源である。適当な反応エネルギー供給源は、限定されない
が、光子(紫外(UV)光、ディープUV、レーザ光、X線、および赤外線ある
いは伝導加熱のかたちの熱のような)、エネルギー化電子(電子ビームのような
)、およびエネルギー化イオン(イオンビームのような)を含む。これらの反応
エネルギー源は、リソグラフィ、走査顕微鏡、および、UVおよび可視光子の場
合、光化学反応および蛍光分子の励起の実施のような仕事に対して便利に使用さ
れる。
「機能性化反応」は、基体表面が本発明にかかる機能性にされる反応である。
機能性化反応は1またはそれ以上の段階から行うことができる。少なくとも1つ
の段階は、ニトレン含有基を含む機能性化試薬の分子と共になされる基体表面の
反応エネルギー源の存在下での反応を含む。
本発明では、基体表面は化学により機能性にされ、これにより、機能性化試薬
分子における官能基は共有的に表面に結合されるようになる。このような共有結
合は、機能性化試薬分子(機能性化試薬分子も以下に示すような望ましい官能基
を含む)におけるニトレン含有基を、反応エネルギー源に機能性化試薬分子をさ
らすことにより基体表面と高度に反応性のニトレン中間体に転化することにより
達成される。
機能性化試薬は一般に以下の群から好ましく選択される:アジ化アリル、アジ
化アルキル、アジ化アルケニル、アジ化アルキニル、アジ化アクリル、およびア
ジドアセチル誘導体、可能な全ての置換体。最も好ましくは、フッ素(および/
または塩素)原子が、アジ化物基に隣接する機能性化試薬分子における位置にお
いて可能な限り最大に拡がって存在することである。
また、前述のそれぞれのアジ化物は、以下の官能基のいずれかを同じ分子内に
含んでもよく、ニトレン部分を生成した後、ニトレン部分と反応することを構造
的に強制する。
(a)カルボキシル基、ならびに、限定されないが、N−ヒドロキシスクシン
イミドエステル、N−ヒドロキシベンズトリアゾールエステル、カルボキシル基
に対応する酸ハロゲン化物、アシルイミダゾール、チオエステル、p−ニトロフ
ェニルエステル、コレステロールおよびグルコースのような生物学的に活性な(
および光学的に活性な)アルコールのエステルを含むアルキル,アルケニル,ア
ルキニルおよび芳香族エステル、アンモニア,第1および第2アミンから誘導さ
れるアミンのような種々のアミン誘導体およびエピネフリン、ドーパ、酵素、抗
体および蛍光分子のような生物学的に活性な(および光学的に活性な)アミンを
含む、ようなカルボキシル基の種々の誘導体
(b)例えば、脂肪酸、ステロイド酸、あるいはナプロシンあるいはアスピリ
ンのような薬剤であり得る適当なカルボン酸に遊離したあるいはエステル化した
アルコール基
(c)ハロアルキル基、ここで、ハロゲン化物はカルボキシレートアニオン、
チオールアニオン、カルバニオンあるいはアルコキシドイオンのような親核基で
後に置換でき、これにより、ハロゲン原子の部位にて新しい基の共有結合ができ
る。
(d)マレイミド基あるいは、例えば、エルゴステロールのような1,3−ジ
エン含有分子とのディールス−アルダー付加環化反応においてジエノフィルとし
てはたらくことができる他のジエノフィル基
(d)例えばエルゴステロールのような1,3−ジエン含有分子とのディール
スアルダー付加環化反応においてジエノフィルとして機能するマレイミド基ある
いは他のジエノフィル基
(e)ヒドラゾン、セミカルバゾン、あるいはオキシムのような周知のカルボ
ニル誘導体の形成を介してあるいはグリニャール付加あるいはアルキルリチウム
付加のような機構を介して、逐次誘導化が可能なアルデヒド基あるいはケトン基
(f)例えばスルホンアミドを形成するためにアミンとの逐次反応のためのハ
ロゲン化スルホニル基
機能性化試薬を転化してニトレン中間体にする一般的な反応は以下の通りであ
る。
ここで、Xは官能基であり、Rは芳香族環、ヘテロ芳香族環あるいは他の炭素含
有フラグメントである。
UV光を含む反応エネルギー源を、例えば、以下の代表的な方法のひとつによ
り、反応に供給できる。(a)試料を350nm、300nm、あるいは254
nm灯のいずれかで満たされたレイオネット(Rayonet)光化学反応器の
ウェル中に入れ、空気中で数分間周囲温度にて照射する。照射の時間は、調整し
て露光量を変えることができる。(b)試料は例えば、限定されないが、プロジ
ェクションUVリソグラフィにより、高分解性フォトマスクを介して照射される
。(c)光分解は接触高分解性フォトマスクを使用してKSM Karl Su
ss deep−UV接触アラインナー中で行われる。このような方法は、UV
以外の波長の光子を用いて機能性化反応を行うために一般的に使用できる。
電子を含む反応エネルギー供給源を以下の代表的な方法により反応に供給でき
る。試料を1〜40kVの範囲内で選択したエネルギーを用いて電子あるいは粒
子ビームにより真空下で照射する。(代表的な電子ビーム源は電子ビームリソグ
ラフィ用に改良したJEOL840電子顕微鏡である。)ビームは処理した基板
の表面を横切って進み、ある領域を照射し他は照射しない。各ステップにおける
滞留時間を調整して露光量を変えることができる。
特に有効な機能性化試薬を、カルボニル基が反応性エステル、アミド、酸塩化
物あるいは混合無水物生成物を介してさらに活性化される4−アザイド−2,3
,5,6−テトラフルオロ安息香酸から誘導されたアジ化ペルフルオロフェニル
(PFPA)の群から選択する。
例えば、限定しないが、代表的な機能性にしたアジ化ペルフルオロフェニルは
以下の一般式で表される構造を有する。
ここで、Xは以下のうちのいずれかである。CN,CONH2,CHO,CO2M
e,COMe,NO2,CO2H,COCl,CO−イミダゾール,CONHS,
CH2OH,CH2NH2,COCH2Br,N−マレイミド,NH−ビオチル,C
ONH−R(ここでRはポリペプチド部分),CONH−X−S−S−Y−NH
−ビオチル(ここでXとYはスペーサー原子であり、S−S結合は後段でそれぞ
れ開裂する。)およびCONHS−SO3Na。
代表的な活性化PFPAは限定されないがN−ヒドロキシスクシンイミド(N
HS)エステルA(また、設計された「NHS−PFPA」)、p−ニトロフェ
ニルエステルB、1−ヒドロキシベンゾトリアゾールエステルC、アシルイミダ
ゾールD、酸塩化物E、混合無水物F、および2,2,2−トリクロロエチルエ
ステルGを含む。
前記の候補に挙げた機能性化試薬に加えて、反応性官能基とPFPA部分の間
に位置した「スペーサー」を有する他のPFPAを使用することも可能である。
例えば、
機能性化試薬として有用な候補である他のアリールアジドは、次式:
で表される化合物のように、他のアリール部分がPFPAと入れ替わっている点
を除き、上述の例と類似している。
本発明によって機能性にすることができる候補である基体としては、重合体基
体、グラファイト、金属およびケイ質材料;ならびにケイ素、ヒ化ガリウム、お
よび他の半導体材料があるが、これらに限定されるものではない。基体は本発明
に係る干渉計の少なくとも1個の検体枝管を含んでいるから、基体が干渉計を通
過させる光の波長に対して屈折率を示すことは、勿論必要である。
ケイ質基体(例えば、ガラス、シリカ、雲母、石英)の場合には、機能性化試
薬は、対応するニトレンに転化された場合には、基体上のSiO−H基、Si−
OH基、またはSi−OSi基と反応する。
グラファイトおよび他の同素体形態の他の元素状炭素の場合には、機能性化試
薬は、対応するニトレンに転化された場合には、基体表面上の炭素環と反応する
。
本発明によって機能性にすることができる重合体基体としては、実際に、−C
H基、および/または−NH基、および/または−OH基、および/または−C
=C−基を有する高分子がある。このような重合体基体として、
(a)飽和ポリオレフィン、例えば、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリテ
トラフルオロエチレン、ポリプロピレン、ポリブテン、およびこれらの共重合体
;
(b)アクリル樹脂、例えば、アクリル酸、メタクリル酸、およびアクリロニ
トリルの重合体および共重合体[ポリ(メチルメタクリレート)、ポリ(ヘキシ
ルメタクリレート)];
(c)ポリスチレン、およびそのアナローグ、例えば、ポリ(p−クロロスチ
レン)およびポリ(p−ヒドロキシスチレン);
(d)不飽和ポリオレフィン、例えば、ポリ(イソプレン)およびポリ(ブタ
ジエン);
(e)ポリイミド、例えば、ポリイミド(ベンゾフェノンテトラカルボン酸二
無水物/テトラエチルメチレンジアニリン);
(f)ポリエステル、例えば、ポリ(アジピン酸トリメチレン)およびポリ(
セバシン酸ヘキサメチレン);
(g)導電性共役重合体、例えば、ポリ(3−アルキルチオフェン)、ポリ(
3−アルキルピロール)、およびポリアニリン;
(h)無機重合体、例えば、ポリ(アリールオキシホスファゼン)、ポリ[ビ
ス(トリフルオロエトキシ)ホスファゼン]、ポリシラン、およびポリカルボシ
ラン、シロキサン重合体、および他のケイ素含有重合体;
(i)「Chemical and Engineering News」(1992年8月31日)第8頁に記載
されているようなオルガニックメタル(すなわち、金属の性質を有する有機重合
体)、例えば、ポリクロコネイン(polycroconaine)およびポリスクアレイン(
polysquaraine);
(j)有機金属重合体、例えば、パラジウムポリインおよびフェロセン含有ポ
リアミド;および
(k)多糖類、例えば、セルロース繊維、キチン、およびでん粉
があるが、これらに限定されるものではない。他の重合体の例は先に示した表1
に記載されている。
基体表面の機能性化は、基体表面に結合させようとする官能基の種類、基体表
面への結合中に官能基を望ましくない反応から保護する必要があるかどうか、お
よび便宜上によって、1段または2段以上で行うことができる。
例えば、2段機能性化法では、各段において異なる機能性化試薬を使用する。
第1段ではNHS−PFPAのような第1機能性化試薬を使用し、この試薬を第
1段反応の進行中にニトレン中間体に転化する。例えば、重合体基体を使用する
第1段中に、NHS−PFPA分子上のNHS活性基は反応によって表面重合体
分子に共有結合する。この反応は普通次の図式1に示すように示すことができる
:
従って、第1段反応は、NHS−PFPAを反応エネルギー供給源にさらすこと
により、NHS−PFPAから誘導された反応性の大きいニトレン中間体を生成
させる必要がある。
容易に分かるように、PFPAのNHSエステル部分は第1段の化学反応に関
与しない。むしろ、NHSエステルは、基体表面分子に移動した後に、後述の第
2段の化学反応で利用される。
第2段においては、NHSエステルは第2機能性化試薬の分子と容易に反応す
る。第2機能性化試薬は第一または第二アミンおよび/またはヒドロキシル基を
有する分子からなる群から選択される。NHSエステルと第一アミンとの反応は
、図式2に示すように、アミドの生成を経由して進行する:
図式2において、化合物2aおよび2bは図式1に示す化合物である。NHSエ
ステルとヒドロキシル基との反応は、図式3に示すように、エステル生成を経由
して進行する:
図3において、化合物2aおよび2bは図式1に示す化合物である。
多くの種類の生体分子がアミンおよび/またはヒドロキシル基を有しているの
で、これらの生体分子は、第1段機能性化反応において基体分子表面に共有結合
したHNSエステルとの第2段機能性化反応における反応に適した機能性化試薬
として作用することができる。従って、本発明に係る方法により、タンパク質、
核酸、炭水化物および他の種々の分子のような高分子を包含する広範囲の種々の
分子を基体に結合させることができる。
また、本発明に係る方法により、先ず、基体に結合させようとする分子(例え
ば、生体分子、医薬、検体、触媒(遷移金属を含む)、および診断薬)のニトレ
ン含有誘導体を作り、該誘導体を基体表面に被着させ、次いでこの処理表面を反
応エネルギー供給源にさらして、前記窒素含有誘導体を、ニトレン中間体を経由
して基体表面分子に共有結合させることができる。ニトレン含有部分は、ニトレ
ンが同じ分子の他の部分と容易には反応できないように、構造的に拘束されてい
る必要がある。従って、フェニル環の4位がアジド基にとって好ましい位置であ
る。
本発明を限定するものではないが、本発明の範囲を示唆するために、以下に本
発明に係る機能性化の代表例を説明する:
(a)発がん性または突然変移誘発性の多環式芳香族炭化水素を基体に結合さ
せて、これらの発がん性物質または突然変移誘発性物質と反応するのが普通であ
る検体に敏感な表面を作ることができた。このような多環式炭化水素の候補とし
ては、エチジウム化合物および種々のピレン化合物(例えば、1−ピレンメチル
アミンおよび6−アミノクリセン)がある。また、このような化合物を基体に結
合させる場合には、前記炭化水素を基体表面から「持ち上げる(lift)」作用を
する「スペーサ基(spacer group)」を使用することができる。代表的なスペー
サ含有炭化水素は1−ピレン酪酸から得られる第一アミンである。このような反
応は普通次の図式4に示すように記載することができる:
図式4において、化合物2aおよび2bは図式1に示す化合物であり、Zはスペ
ーサ基を示す。
(b)基体表面の疎水性は、第1段反応において(ニトレン中間体を経由して
)基体表面にNHSエステル基を結合させた後、第2段反応において1−アミノ
ヘキサデカンのような長鎖脂肪族アミンとNHSエステル基とを反応させること
により、変えることができる。従って、基体表面は、大かれ少なかれ、特定の疎
水性検体と結合または他の相互作用をすることができるようになる。このような
反応は普通次の図式5に示すように記載することができる:
図式5において、Rは疎水性原子の連鎖、例えば、C12H25 -、オレイル、オク
タデシル、3−β−アミノコレスタン、またはヘキシルジメチルシリル基を示し
;2aおよび2bは図式1に示す化合物である。
(c)基体表面の疎水性は、第1段反応において(ニトレン中間体を経由して
)基体表面にNHSエステル基を結合させた後、第2段反応においてアミン含有
高極性分子とNHSエステル基とを反応させることにより、変えることができる
。
このようなアミン含有極性分子としては、グルコサミン、エタノールアミン、
ポリエチレンイミン(pH7においてプロトンを加えたもの)、ポリリシン(p
H7においてプロトンを加えたもの)、グリセリン、および他のポリヒドロキシ
化合物があるが、これらに限定されるものではない。このような反応は普通図式
5に示すように記載することができ、図式5においてRはHOCH2CH2−また
はNH2(CH2CH2NH−)n−CH2CH2−基を示し;2aおよび2bは図式
1に示す化合物である。ポリアルコールの場合には、このような反応は普通図式
6に示すように記載することができる:
図式6において、Rは例えばCH−CHOH−CH2OH基を示し、2aおよび
2bは図式1に示す化合物である。
(d)基体表面は、既に第1段反応においてNHSエステル基を基体表面に結
合させた領域において、表面を活性にすることができる。表面を活性にする反応
は、種々のアミン化またはヒドロキシル化「洗剤」分子、例えば、1−アミノ−
ドデカン酸を使用することにより進行する。pH7において、この化合物を基体
に結合させた後に、カルボキシル基をイオン化し、この化合物を極性カルボキシ
レート陰イオンで終端する長い疎水性尾部として基体表面から遠ざかる方向に延
在させる。このような反応は普通図式7に示すように記載することができる:
図式7においてRは−(CH2)n−CO2H基を示し;2aおよび2bは図式1
に示す化合物である。
(e)酵素は、第1段反応において、例えば、NHS活性基によって機能性に
した基体表面に、例えば、酵素分子の上に存在するリシンアミノ基とNHS活性
エステルとの第2段反応によって、結合させることができる。従って、基体表面
は対応する酵素配位子に対して触媒的にあるいは構造的に反応するように作るこ
とができる。典型的な反応は次の図式8に示すように記載される:
図式8において、R−NH2は酵素(例えば、セイヨウワサビ・ペルオキシター
ゼ)、レクチン、または抗体のようなポリペプチドの上のリシン残基を示し;2
aおよび2bは図式1に示す化合物である。
(f)また、抗体、レクチンおよび他のタンパク質は、上述の酵素を結合させ
る反応と類似した機能性化反応によって、基体に結合させることができる。次い
で、本発明に係る干渉計の検体用枝管に結合させる場合には、このような分子を
、細胞、細胞小器官、ウィルス、膜構成物質、他の生物学的実在物(biological
entity)のような検体に対する選択的検出剤として使用することができる。
(g)特定の分子を基体表面に結合させて、基体表面の湿潤性を制御すること
ができ、あるいは基体表面に対する生細胞の接着性を変えることができる。
(h)基体表面は、1段または2段の反応でビオチニル化し、次いでこのビオ
チニル化表面を、例えば、誘導体としたアビジンまたはストレプトアビジンによ
って処理することができる。従って、アビジンまたはストレプトアビジンは、後
で他の生体分子を基体表面に結合させるための架橋ユニットとして使用される。
典型的な反応は次の2段反応(図式9)によって示される:
図式9において、2aおよび2bは図式1に示す化合物であり、RNH2は次式
:
で表わされるN−ビオチニルヘキシレンジアミンのアミノ基を示す。1段反応の
一例では、基体をビオチンのPFPA誘導体(図式12の化合物5参照)で被覆
し、次いで光分解するかあるいは電子ビームにさらす。
本発明を次の実施例について説明する。実施例1
この例では、N−ヒドロキシスクシンイミドで機能性にした(NHSで機能性
にした)パーフルオロフェニルアジド(PFPA)1aおよび1bを使用して、
代表的な重合体(ポリスチレン)の表面を変性した(図式10)。
PFPA 1aはKeana等「J.Org.Chem.」55:3640−3647(1
990)に記載されている。
PFPA 1bは、5−アミノペンタン酸を(4−アジド−2,3,5,6−
テトラフルオロベンザミド)ペンタン酸(融点(mp):160〜161℃;高分
解能質量分析計(HRMS)C12H10F4N4O3の計算値:334.0687;
実測値m/z:334.0710)でN−アシル化し、次いでこれをジシクロヘ
キシルカルボジイミドの存在下にNHSと結合させて、N−スクシンイミジル5
−(4−アジド−2,3,5,6−テトラフルオロベンズアミド)ペンタノエー
ト1b(融点:93〜95℃、HRMS C16H13F4N5O5の計算値:431
.0850;実測値m/z:431.0866)を生成することにより、製造した
。
Cai等「Chem.Mater.」4:879−884(1992)に記載されている方
法により、ガラスディスクに、キシレン中に溶解した5重量%ポリスチレン(P
S)溶液をスピンコーティングして、ガラスディスク上に厚さ約0.5μmのフ
ィルムを形成した。次いで、このPSフィルムに、ニトロメタン中に溶解した0
.5重量%1a溶液または0.5重量%1b溶液をスピンコーティングし、次い
で60℃で20分間熱処理した。この熱処理工程において残留溶媒が除去され、
表面に堆積したPFPAのPSフィルム中への拡散が容易になった。
次にこのフィルムを光分解した結果、FTIR(フーリエ変換赤外分光法)に
よって示されるように、アジド基は完全に分解した。レイオネット(Rayonet)光
反応器において254nmランプを使用して、周囲温度で光分解を5分間行った
。支持体としてNaClディスクを使用し、対照試料についてFTIRを行った
。NHSエステルおよびPFPAエステルはPS表面に共有結合して、それぞれ
2aおよび2bを生成した(図式10)。この反応は、1aまたは1bから得ら
れた反応性の大きいニトレン中間体C−H結合挿入を経由して生起した。Keana
等「J.Org.Chem.」55:3640−3647(1990);Leyva等「J.Or
g.Chem.」54:5938−5945(1989);およびPoe等「J.Am.Che
m.Soc.」114:5054−5067(1992)、参照。
NHS活性エステルは第1アミンおよび第2アミンと容易に反応してアミドを
形成するので(Anderson等「J.Am.Chem.Soc.」86:1839−1842(
1964)、原則として、生体分子を包含する種々の第1アミン含有試薬および
第2アミン含有試薬を、この方法によって、重合体表面に結合させることができ
る。実施例2
この例では、実施例1に記載したようにPFPA−NHSによって変性したP
Sフィルム上に、セイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ(HRP,シグマ社)を固
定した。これらの化合物は図式10に示されている。
フィルム2aおよび2bをNaHCO3緩衝液(pH8.2)中に溶解した5
0μMHRP溶液中で25℃において3時間温置し(Brinkley,「Bioconjugate
Chem.」3:2−13(1992))、次いでリン酸緩衝液(pH7.0)で
充分に洗浄した。生成する固定されたHRPフィルム3aおよび3bの酵素活性
を、2,2′−アジノ−ビス(3−エチルベンゼンチアゾリン−6−スルホン酸
)
ジアンモニウム塩(ABTS)および過酸化水素(ABTS1.8mM/H2O2
0.8mM)を使用したリン酸緩衝液中で、420nmおよび25℃において、
分光測光法によって測定した(Groome,「J.Clin.Chem.Clin.Biochem.」1 8
:345−349(1980))。固定されたHRPが自然のままのHRPと
同じ活性を持っていると仮定すると(Nakane等「J.Histochem.Cytochem.」2 2
:1084−1091(1974))、HRPの固定程度の計算値は3aにつ
いては0.5±0.1ng/mm2であり、スペーサを有する同族体である3b
については1.0±0.2ng/mm2であり、妥当な固定効果を示した。
HRP分子は、分子量が約40,000ダルトンであり、半径が水和状態で2
.67nmであった。steiner等「Eur.J.Biochem.」82:543−549(
1978)。重合体表面が平坦であると仮定すると、HRP単層の表面の被覆程
度は2.7g/mm2のHRPであった。
対照実験では、PFPAをスピンコーティングしなかった重合体フィルムを同
様に熱処理し、露光し、HPR溶液と共に温置した。生成したフィルムはHRP
活性を示さなかった。実施例3
この例では、実施例1および2に記載した方法と同様にして、導電性重合体で
あるポリ(3−オクチルチオフェン)(P30T)の表面変性を行った(Cai等
「J.Mol.Electron.」7:63−68(1991))。PFPA−NHS−変
性P30Tフィルム上におけるHRPの固定程度は、フィルム3a(図式10)
の場合に0.2±0.1ng/mm2であり、フィルム3bの場合に0.3±0
.1ng/mm2であった。実施例4
この例では、PFPAをフォトリソグラフィーと組み合わせて使用してPS表
面の表面変性を行って、重合体表面にミクロンサイズのパターンを生成させた。
使用した化合物は図式10に示されているものであった。
PSフィルムに1aのニトロメタン溶液をスピンコーティングし、上述のよう
に熱処理し、最初構造体(feature)サイズ0.5μmの高解像度マスクを介して
露光した。光分解をKSM Karl SussディープUVコンタクトアライナー(cont
act aligner)内で行った。次いで、フィルムをニトロメタン中に20秒間浸漬し
、自然乾燥し、5−(アミノアセトアミド)フルオレセイン(米国オレゴン州ユ
ーゲン所在のモレキュラ・プローブス・インク(Molecular Probes,Inc.))を
エタノール中に溶解した溶液(4mg/mL)と25℃において1時間反応させ
、次いでエタノールで充分洗浄した。
図2は、蛍光顕微鏡下に観察されたミクロンサイズの生成パターンを示し、さ
らにこの新しい表面変性法を証明するものである。最小構造体(0.5μm)が
解像されたが、回折効果に起因すると思われる僅かなぼけが生じた。
対照として、NHS活性エステル1aをスピンコーティングしなかったPSフ
ィルムを光分解し、現像し、5−(アミノアセトアミノ)フルオレセインで処理
した。蛍光顕微鏡下に蛍光パターンは観察されなかった(データは示さず)。実施例5
この例では、予め形成した重合体ミクロ構造体の表面を変性した。使用した化
合物は図式10に示すものであった。
ディープUVリソグラフィーを使用してシリコンウエハ上に予め形成したミク
ロンパターンのPSを、1aのニトロメタン溶液中に10分間浸漬し、上述のよ
うに熱処理し、光分解した。次いで、この試料をN−(5−アミノペンチル)ビ
オチンアミド(米国オレゴン州ユーゲン所在のモレキュラ・プローブス・インク
)をDMF中に溶解した溶液中に4時間浸漬し、DMFに次いでエタノールで洗
浄した。ビオチンに対するアビジンの強い親和力を利用して(Green,「Adv.Pr
otein Chem.」29:85−133(1975);Heitzmann等「Proc.Nat.Aca
d.Sci.USA」71:3537−3541(1974))、ウエハをpH8.2
緩衝液中の蛍光タンパク質溶液(3.2mg/0.5mL)中で4時間温置する
ことにより、蛍光アビジン(米国オレゴン州ユーゲン所在のモレキュラ・ブロー
ブス・インク)を表面に結合させた。
生成したミクロサイズパターンは図3Aに示す通りであり、実験対照は図3B
に示す通りであった。これらの結果は、ビオチン−アジピン−フルオレセインの
組合せが予め形成されたPSミクロ構造体に共有結合したことを示すものである
。実施例6
この例では、グラファイト表面を機能性にした。透明接着テープを使用して、
グラファイト片を新たに劈開させ、1000rpmの速度で回転させることによ
り、乾燥ニトロメタン中の0.5%w/w N−ヒドロキシスクシンイミジル−4−
アジドテトラフルオロベンゾエート(NHS−PFPA)溶液を被覆した。この
被覆されたグラファイトを60℃で20分間熱処理し、254nmランプを使用
して空気の存在下に周囲温度において5分間露光した。次いで、このグラファイ
トをNaHCO3緩衝液(pH8.2)中の50μmセイヨウワサビ・ペルオキ
シダーゼ(HRP)溶液中で、25℃において3時間温置し、次いでリン酸緩衝
液(pH7.0)で充分洗浄した。
機能性にしたグラファイトの酵素活性を、リン酸緩衝液中において、2,2′
−アジノ−ビス(3−エチルベンズチアゾリン−6−スルホン酸)ジアンモニウ
ム塩(ABTS)および過酸化水素(ABTS1.8mM/H2O20.8mM)
を使用して、420nmおよび25℃において分光分析法によって測定した。固
定されたHRPが自然のままのHRPと同じ活性を持っていると仮定した場合に
、HRPの固定程度は2.1ng/mm2であった。
対照実験は次のように行った:新たに璧開させたグラファイト片を同様に熱処
理し、露光し、HRP溶液と共に温置した。対照の酵素活性を測定した結果0.
4ng/mm2のHRPであった。従って、対照はNHS−PFPAで処理しな
かった。
原子間力顕微鏡(AFM)を使用して、試料および対照を調べた。原子間力顕
微鏡は周囲温度で操作した。
試料の代表的なAFM像を図4Aに示し、対照の代表的なAFM像を図4Bに
示した。図4Aにおいて、明るい球は固定されたHRP分子に相当する。図4B
には僅かな薄い球が認められるにすぎず、これは対照表面に対してHRPが極め
て僅かしか固定されていないことを示す。
従って、NHS−PFPAはHRPをグラファイト表面に共有結合させるのに
必要であった。実施例7
この例の化学反応は図式11に示す通りであって、この例では2個の光活性ビ
オチンとしてPFPA−ビオチン3および5を製造した。このようなビオチニル
化された表面をさらに反応させて、アビジンのようなビオチン結合性タンパク質
を介して、生体分子を基体に結合させることができた。
N−4−アジド−2,3,5,6−テトラフルオロベンジル ビオチンアミド
(3)の合成を次のようにして行った:33mg(0.097ミリモル)のN−
スクシンイミジル−D−ビオチンを0.5mLのDMSO−d6中に溶解した溶
液に、27mg(0.12ミリモル)の4−アジド−2,3,5,6−テトラフ
ルオロベンジルアミンを添加した。生成した溶液を常温で0.5時間維持し、そ
の後NMRによって反応の完結を明らかにした。生成した溶液を10mLの水に
滴下して沈殿を生成させた。生成した沈殿を濾過し、水洗し、乾燥して36.8
mg(85%)のPFPA−ビオチン3を融点:164〜165℃のほとんど無
色の固体物質として得た。1
HNMR(CDCl3+DMSO−d6):1.157(q,2),1.40(
m,4),1.950(t,2),2.87(m,2),4.01(m,1),
4.20(m,3),5.41(m,2),7.53(m,1).IR(KBr
):3454,3290,2931,2161,2125,1704,1654
,1549,1493,1420,1239,1054cm-1.
N−4−アジド−2,3,5,6−テトラフルオロベンジル−6−(ビオチン
アミド)ヘキサンアミド(5)の合成を次のようにして行った:49.2mg(
0.108ミリモル)のN−スクシンイミジル−6−(ビオチンアミド)ヘキサ
ノエートを0.6mLの乾燥DMFに溶解した溶液に、32mg(0.14ミリ
モル)の4−アジド−2,3,5,6−テトラフルオロベンジルアミンを添加し
た。生成した溶液を常温で1時間かきまぜ、次いで10mLの水に滴下した。生
成した沈殿を濾過し、水洗し、乾燥して60.1mg(99%)のPFPA−ビ
オチン5を融点160〜161℃の無色固体物質として得た。1
HNMR(CDCl3+DMSO−d6):0.98(m,2),1.14(m
,4),1.31(m,6),1.85(m,4),2.4−2.5(m,2)
,2.8(m,3),3.92(m,1),4.10(m,3),5.52(s
,1),5.56(s,1),6.76(m,1),7.56(m,1).IR
(KBr):3438,3301,2935,2162,2177,1700,
1652,1547,1499,1416,1239,1054cm-1.実施例8
この例は重合体を機能性にすることができるいくつかのPFPAベース架橋剤
の合成に関するものである。特に、NHSエステル基とPFPA基との間の結合
長さの異なるNHSエステルで機能性にした1群のPFPAを合成した。これら
の機能性にしたPFPAは、生体高分子中のアミノ基を近くに位置する化学基を
光架橋させるのに特に適しており、また一般的に重合体を機能性にするのに特に
適していた。この化学反応の全体を図式12に示す。
上述の化学反応では、突然変異(mutation)によってATPアーゼ中に導入さ
れたシステインを位置づけるために前に使用したマレイミド含有PFAS1およ
び2を使用した(Aggeler等「Biochemistry」31:2956−2961(19
92))。
NHS含有PFPA4および5は、−CHまたは−NH挿入光化学反応によっ
て、ポリペプチド鎖中のアミノ基を近くに位置する化学基に架橋させるのに特に
適していた。また、これらのPFPAを使用して重合体をNHS基で変性するこ
とができ、次いで重合体に他の官能基を導入するためにアミノ含有基と反応させ
ることができた。
図式12では、次のようにして、カップリング剤としてジシクロヘキシルカル
ボジイミド(DCC)を使用し、酸6とグリシンエチルエステル7とを反応させ
てアミド8を生成した:217mg(1.55ミリモル)のグリシンエチルエス
テル塩酸塩と158mg(1.56ミリモル)のトリエチルアミンとの混合物を
、テトラヒドロフラン(7mL)中で20分間かきまぜた。その後、369mg
(1.57ミリモル)の4−アジド−2,3,5,6−テトラフルオロベンゾイ
ル酸6および324mgのDCCを添加した。この混合物を一夜かきまぜ、次い
で濾過した。濾液を蒸発させ、残留物を20mLの酢酸エチル中に溶解した。次
いで、この溶液を乾燥し、濾過した。濾液を0.1NHCl(2×10mL),
5%NaHCO3(2×10mL),および水(2×10mL)で洗浄した。得
られた溶液を乾燥し、蒸発させて固体生成物を得た。この生成物を分取TLCに
よって精製して160mg(収率32%)のアミド8を融点85〜86℃の無色
固体物質として得た。1
HNMR:1.321(t,3,J=7.13),4.239(d,2,J=
4.82),4,273(q,2,J=7.13),6.540(mb,1).
IR:2128,1744,1686,1649,1523,1488,122
5,1001cm-1.C11H8F4N4O3の計算値:C,41.26;H,2.5
2;N,17.50.実測値:C,41.46;H,2.37;N,17.66
.
次に、下記のようにして加水分解により酸9を総括収率31%で固体物質とし
て得た:60mgのアミド8を0.5mLのメタノール中に溶解した溶液に、0
.4mLの2.5%NaOH溶液を添加した。生成した溶液を1時間かきまぜた
。次いで、この溶液を2NHClによりpH<1まで酸性にした。生成した沈殿
を濾過し、乾燥して23mgの酸9を白色固体物質として得た。濾液をTHF/
CHCl3(1:1,3×3mL)によって抽出し、抽出液を乾燥し、蒸発させ
て追加量(32mg)の酸9を融点147〜148℃の白色固体物質(合計収量
55mg、合計収率99%)を得た。1
HNMR:(CDCl3+DMSO−d6):4.339(d,2,J=4.8
0),6.527(m,1).MS:292(2,M+),246(20,M+−
N2),190(20,NC6F4CO),162(100,NC6F4)。
下記のようにして、塩基性条件下に塩化アシル10と5−アミノペンタン酸1
1とを反応させ、次いで酸性にすることにより酸12を生成した:238mg(
2.03ミリモル)の5−アミノペンタン酸11を50%NaOH水溶液(0.
4mL)および2.6mLの水に溶解した溶液に、239mg(0.942ミリ
モル)の4−アジド−2,3,5,6−テトラフルオロベンゾイルクロリド10
を添加した。沈殿が直ちに認められた。この混合物を5分間かきまぜ、次いで3
mLの水で希釈した。次いで、この混合物をさらに15分間かきまぜ、2N H
Clを使用してpH<1まで酸性にした。沈殿を濾過し、0.1NHCl(1m
L)および2mLの水で洗浄し、乾燥して231mgの固体生成物を得た。この
固体生成物を1mLのエーテルで洗浄し、テトラヒドロフランとエーテルとの混
合物中で晶出させて71mg(収率54%)の酸12を融点160〜161℃の
無色固体物質として得た。1
HNMR:(CDCl3+DMSO−d6):1.753(m,4),2.54
0(t,2,J=6.73),3.504(q,2,J=5.90),6.1(
m,1).MS:334(5,M+),317(4,M+−OH),306(40
,M+−N2),190(15,NC6F4CO),162(100,NC6F4)
高分解能MS:C12H10F4N4O3の計算値:334.0687;実測値:33
4.0710。
NHS活性エステル4および5を、それぞれ、DCCの存在下における酸9お
よび12とN−ヒドロキシスクシンイミドとの反応によって製造した。特に、N
HSエステル4を製造するためには、39.3mg(0.134ミリモル)の酸
9、29.3mg(0.142ミリモル)のDCC、および16.6mgのNH
Sを0.5mLのTHF中に溶解した溶液を、25℃において一夜かきまぜた。
生成した混合物を濾過した。濾液を蒸発させて固体物質を得、これを1mLのC
H2Cl2中に再溶解した。生成した混合物を濾過した。濾液を蒸発させて42m
g(収率80%)のエステル4を無色の固体物質として得た。アセトン/ヘキサ
ン中で再結晶させることにより、分析試料を融点:145〜146℃の無色固体
物質として得た。1
H−NMR:2.883(s,4),4.637(d,2,J=5.40),
6.548(mb,1)。IR:2129,1792,1748,1718,1
699,1649,1520,1489,1204cm-1。MS:389(8,
M+),275(60,M+−NHS),247(27,M+−NHS−N2),2
18(65,M+−CONHS−N2−H),190(45,NC6F4CO),1
62(100,NC6F4)。高分解能MS:C13H7F4N5O5の計算値:389
.0382;実測値:389.0405。
NHSエステル5を酸12から、NHSエステル4と同様にして製造し、NH
Sエステル5を融点:93〜95℃の無色の固体物質として91%の収率で得た
。1
H−NMR:1.77(m,2),1.85(m,2),2.691(t,2
,J=6.65),2.841(s,4),3.512(q,2,J=6.24
),6.22(m,1)。IR:2127,1817,1786,1742,1
681,1649,1602,1526,1487,1260,1209,10
69cm-1。MS:431(5,M+),403(3,M+−N2),317(2
2,M+−NHS),289(8,M+−NHS−N2),162(100,NC6
F4)。高分解能MS:C16H13F4N5O5の計算値:431.0850;実測値
:431.0866。
2種のNHSエステル4および5は、NHS活性エステル3と共に、PFPA
とNHS基との間の長さの異なるリンカー(linker)を有する1群のNHS含有
PFPAを形成した。従って、化合物3,4および5は、ポリペプチド鎖のよう
な生体高分子中のアミノ基を、NHS基を介して機能性にし、次いで光によって
生成したニトレン中間体によって近くに位置する生体高分子に架橋させるのに有
用であった。また、これらの化合物は、高分子物質を包含する物質を機能性にす
るのにも使用することができた。実施例9
この例は、次式:
で表わされる2種のヘテロ二官能性で開裂可能なPFPAベース架橋剤を合成し
た点を除き、実施例8と同様である。例えば、次式:
で表わされる化合物を合成した。一般的に、分子のPFPA部分は基体を機能性
にするのに使用することができ、マレイミド部分は他の官能基と結合させるのに
使用することができた(ディールス・アルダー型反応におけるSH含有分子また
は1,3−ジエン含有分子との反応を経由して)。次に、その後に、マレイミド
側鎖を温和な条件下に表面から開裂させることができた。他の開裂可能な基とし
て、過沃素酸を用いて開裂させることができる1,2−ジ・オール結合を使用す
ることができた。実施例10
この例はポリスチレンの機能性化に関するものである。
1cm2のケイ素ウエハ片に、スピンコーティングにより、5%W/Wポリスチレ
ン溶液を被覆した。次いでこのウエハに、ニトロメタンに溶解した0.5%W/W
N−ヒドロキシスクシンイミジル−4−アミド−2,3,5,6−テトラフルオ
ロベンゾエート溶液を、1000rpmの速度でスピンコーティングし、60℃
において20時間熱処理し、電子ビームリソグラフィーを行った。この被覆され
たウエハをニトロメタン中に20秒間浸漬して未結合PFPAを除去し、自然乾
燥し、エタノール中に溶解した2mg/mL5−(アミノアセトアミド)フルオ
レセイン溶液と25℃において1時間反応させた。次いで、このウエハをエタノ
ール中に一夜浸漬して共有結合していないフルオレセイン残留物を除去した。
得られた結果を図5Aに示した(図5Bに説明を記載した)。これらの図は蛍
光顕微鏡(励起:450〜490nm,放射:>510nm)下に観察されたパ
ターンを示す。これらのパターンは、ライン幅(最も広いものから最も狭いもの
の順に)を5μm,2μm,1μm,0.5μm,0.2μmおよび0.1μm
(図5B)とした電子ビームリソグラフィーによって描いたものである。図5B
に示すように、線量は、幅が5,2および1μmの場合には左から右に、また幅
が0.5,0.2および0.1μmの場合には右から左に、40,35,30,
25,20,15,10,5および1μC/cm2であった。
図5Aにおいて、0.2μmの構造物(feature)が解像された。最小構造物(
0.1μm)はこの最適ではない実験では解像されなかった。感度は約10〜約
30μC/cm2であった。実施例11
この例では、ポリスチレン光導波管をSiO2で被覆されているケイ素ウエハ
上に製造した。先ず、この被覆されているシリコンウエハをアセトン中で清浄に
した。次いで、このウエハに、キシレン中の5%W/W スチレン(PS)および4
.6%(PSに対するW/W)ビスパーフルオロフェニルアジド(架橋剤)をスピ
ンコーティングした。スピンコーティングは4000rpmにおいて20秒間行
った。次いで、このウエハを70℃において30分間熱処理した。
15kV電子ビームを使用して、5〜30μC/cm2の範囲の線量でPSフ
ィルムに光導波管構造体を描いた。また、次の機能性化操作中に使用するために
、ウエハ上でアラインメントマーク(aligment mark)を露出させた。電子ビーム
は、これと接触したPSの区域を、後で行う溶媒洗浄工程中で不溶性にするのに
充分な程度まで架橋させた。
電子ビームに露光させた後に、生成したフィルムをキシレン中で20秒間現像
して、電子ビームに露光されなかったすべてのPSを除去し、IPA中で洗浄し
、次いで窒素ガスを使用して送風乾燥した。
これらのフィルムを使用した場合に、10μC/cm2の線量によって最良の
光導波管構造体が得られることが分った。図6は、PSから製造した6個の光導
波管を示す。電子ビーム線量は、上左から下右まで、それぞれ、5,10,15
,20,25および30μC/cm2であった。
光導波管の物理的寸法は光導波管の使用目的に応じて容易に変更することがで
きた。
得られたPS光導波管構造体を、先ず得られたPS光導波管構造体を支持する
ウエハに、ニトロメタン中に溶解した0.5%W/W パーフルオロフェニルアジド
(PFPA)溶液を、上述と同じスピンパラメーターを使用してスピンコーティ
ングすることにより、機能性にした。次いで、このフィルムを70℃において3
0分間熱処理した。アラインメントマークを使用して電子ビームを光導波管に整
列させ、各光導波管の1個の枝管(検体用枝管となるもの)のみを20μC/c
m2の線量で15−kVエレクトロンビームに露光させた。次いで、このフィル
ムをニトロメタン中で20分間現像し、窒素中で送風乾燥した。このようにして
、各光導波管の検体用枝管のみを機能性にした。
光導波管の機能性にした枝管は、該枝管上にフルオレセインを固定し、次いで
光導波管を蛍光顕微鏡下で観察することにより、目に見えるようになった。フル
オレセインは、5−(アミノアセトアミド)フルオレセインをNaHCO3緩衝
液に溶解した溶液(pH8.2;0.4mg/0.5mL)中にウエハを3時間
浸漬することにより、固定した。次いで、生成したフィルムを前記緩衝液によっ
て充分洗浄し、自然乾燥した。次いで、蛍光顕微鏡を450〜480nmにおい
て使用して、フィルムを照射した。この結果生じた>510nmにおける放射が
容易に目に見えた。
図7は、1個のシリコンウエハ上に設けられている機能性にした2個のポリス
チレン干渉計および2個の対照を、蛍光顕微鏡によって観察した写真である。上
述のように上右と下左の干渉計が機能性化されている。他の2個は対照であって
、機能性化されていない。機能性化は、検体枝管(上右の干渉計における右側の
枝管および下左の干渉計における左側の枝管)におけるフルオレセインの存在に
よって明示されている。前記写真の3個の隅角部における大きな明るいスポット
はアラインメントマークである。
この例において形成された光導波管はリッヂ導波管として分類される。これら
のデバイスにおける伝送損失(transmission loss)にとって重要なのは、これら
のデバイスの端縁の粗さである。Tein,「Appl.Optics」10:2395(19
71),参照。これらの光導波管の端縁粗さは約50nmであると評価した。
光導波管に光をカップリングインあるいはカップリングアウトすることは、既
知のプリズムカップリング法またはグレイティングカップリング法を使用して達
成することができた。
本発明を好適な具体例および多数の実施例について説明してきたが、本発明は
これらの例に限定されるものではない。それどころか、本発明は、請求の範囲に
規定されているような、本発明の思想および範囲内に包含されるすべての代替,
変更および同等のものを包含するものである。
【手続補正書】特許法第184条の7第1項
【提出日】1994年7月28日
【補正内容】
請求の範囲
1.(a)光導波管を具え、該光導波管は基準導波管部分および検体導波管部分
を具え、両導波管部分は電磁放射に対して屈折率を示す材料から製造されており
、かつ両導波管部分は第1端部および第2端部を具え;
(b)電磁放射が、全内部反射によって、前記両導波管部分の第1端部から
第2端部まで、前記基準導波管部分内および前記検体導波管部分内を平行して通
過するように、前記電磁放射を前記両導波管部分の第1端部に導入する手段を具
え;
(c)前記両導波管部分の第2端部において前記電磁放射を収斂させて前記
電磁放射の射出ビームとする手段を具え;かつ
(d)前記検体導波管部分は、該検体導波管部分内を通過する電磁放射に、
前記基準導波管部分内を通過する電磁放射に対する位相変化を与え、かつ該位相
変化が対応する干渉パターンを射出ビームに生じさせるのに充分な変化になるよ
う、前記検体導波管部分の外部表面が検体分子と選択的に相互作用できるように
、前記基準導波管部分に対して機能性にした外部表面を具えている
ことを特徴とするセンサ素子。
2.光導波管を具え、該光導波管は入射導波管部分、基準導波管部分、検体導波
管部分、および射出導波管部分を具え;前記光導波管は電磁放射に対して屈折率
を示す材料から製造されており;前記基準導波管部分および前記検体導波管部分
はいずれも前記入射導波管部分に連結された第1端部および前記射出導波管部分
に連結された第2端部を具えていて、前記光導波管は、前記入射導波管部分に入
射する電磁放射が、全反射によって、前記入射導波管部分内を通過し、次いで前
記基準導波管部分内および前記検体導波管部分内を平行して通過し、その後前記
射出導波管部分内を通過することができるように構成され;前記検体導波管部分
は、該検体導波管部分内を通過する電磁放射に、前記基準導波管部分を通過する
電磁放射に対する位相変化を与え、かつ位相変化がこの位相変化と相関する干渉
パターンを生じさせるのに充分な変化になるよう、前記検
体導波管部分の外部表面が検体分子と選択的に相互作用できるように、前記基準
導波管部分に対して機能性にした外部表面を具えていることを特徴とするセンサ
素子。
3.(a)光導波管を具え;該光導波管は電磁放射に対して屈折率を示す材料か
ら成り;前記光導波管は入射導波管部分、基準導波管部分、検体導波管部分,お
よび射出導波管部分を具え;前記基準導波管部分および前記検体導波管部分はい
ずれも前記入射導波管部分に連結された第1端部および前記射出導波管部分に連
結された第2端部を具えていて、前記入射導波管部分に入射する電磁放射を、全
内部反射によって、前記入射導波管部分内に導き、次いで前記基準導波管部分内
および前記検体導波管部分内に平行に導き、その後前記射出導波管部分内に導い
て、前記射出導波管部分内を通過する電磁放射に干渉パターンを形成するように
構成され;前記検体導波管部分は、該検体導波管部分内を通過する電磁放射に、
前記基準導波管部分を通過する電磁放射に対する変化を与え、かつ該変化が干渉
パターンに変化を生じさせるのに充分な変化になるよう、前記検体導波管部分を
検体分子と選択的に相互作用できるように、前記基準導波管部分に対して化学的
に機能性にした外部表面を具え;
(b)電磁放射を前記入射導波管部分に導入するための電磁放射供給源を具
え;かつ
(c)前記干渉パターンを検出するための手段を具える
ことを特徴とするセンサ。
4.(a)第1光導波管を具え、該第1光導波管は基準導波管部分および検体導
波管部分を具え、両導波管部分は電磁放射に対して屈折率を示す材料から製造さ
れており、かつ両導波管部分は第1端部および第2端部を具え;
(b)電磁放射が、全内部反射によって、前記両導波管部分の第1端部から
第2端部まで、前記基準導波管部分内および前記検体導波管部分内を平行して通
過するように、前記電磁放射を前記両導波管部分の第1端部に導入するための、
前記第1光導波管の両第1端部に連結されている第2光導波管を具え;
(c)前記両導波管部分の第2端部において前記電磁放射を収斂させて干渉
パターンを示す前記電磁放射のビームとするための、前記第1光導波管の両第2
端部に連結されている第3光導波管を具え;かつ
(d)前記検体導波管部分は、該検体導波管部分内を通過する電磁放射に、
前記基準導波管部分内を通過する電磁放射に対する変化を与え、かつ該変化が干
渉パターンに変化を生じさせるのに充分な変化になるよう、前記検体導波管部分
の外部表面を検体分子と選択的に相互作用できるように、前記基準導波管部分に
対して化学的に機能性にした外部表面を具え;
(e)前記干渉パターンを検出するための検出器を具える
ことを特徴とするセンサ。
5.(a)第1光導波管を具え;該第1光導波管は電磁放射に対して屈折率を示
す材料から製造されており;該第1光導波管は基準導波管部分および検体導波管
部分を具え、かつ両導波管部分は第1端部および第2端部を具え;前記第1光導
波管は電磁放射を前記両導波管部分の第1端部から第2端部まで、前記基準導波
管部分内および前記検体導波管部分内を同時に平行に導くように構成され;前記
検体導波管部分は、該検体導波管部分の外部表面が検体分子と化学的に反応でき
るよう、前記基準導波管部分に対して機能性にした外部表面を具え;
(b)放射供給源を具え、該放射供給源は、電磁放射が、前記両導波管部分
の第1端部から第2端部まで、前記基準導波管部分内および前記検体導波管部分
内を平行して通過するように、前記電磁放射および直接電磁放射を前記第1光導
波管の両第1端部中に生成するように構成され;
(c)第2光導波管を具え;該第2光導波管は電磁放射に対して屈折率を示
す材料から製造されており;該第2光導波管は前記基準導波管部分および前記検
体導波管部分の第2端部に連結され;前記第2光導波管は前記基準導波管部分お
よび前記検体導波管部分から出射する電磁放射を同時に導く作用をなし、これに
より電磁放射の干渉パターンを生じさせ、かつ前記検体導波管部分の機能性にし
た表面と検体分子との相互作用よって前記干渉パターンに変化を生じ
させるよう構成され;さらに
(d)前記干渉パターンの変化を検出するように前記第2光導波管に光学的に
連結されている検出器を具える
ことを特徴とするセンサ。
6.(a)基準導波管部分、検体導波管部分、および射出導波管部分を具える光
導波管を使用し;該光導波管を電磁放射に対して屈折率を示す材料から製造し;
前記基準導波管部分および前記検体導波管部分にはいずれも前記入射導波管部分
に連結された端部を設け、前記光導波管が電磁放射を前記基準導波管部分内およ
び前記検体導波部分内に同時に平行して通過させ、次いで前記射出導波管部分内
を通過させることがてきるようにし;前記検体導波管部分には、該検体導波管部
分の外部表面が検体分子と選択的に相互作用できるよう前記基準導波管部分に対
して機能性にした外部表面を設け;
(b)電磁放射を、前記基準導波管部分内および前記検体導波管部分内に同
時に平行に導き、次いで前記射出導波管部分内に導いて、前記射出導波管部分に
おいて干渉パターンを生じさせ;次いで
(c)前記検体導波管部分の外部表面を前記検体分子と接触させて、該検体
分子を前記機能性にした表面と選択的に相互作用させ、これにより前記検体導波
管部分を通過する電磁放射に、前記基準導波管部分に対する変化を生じさせ、該
変化が前記干渉パターンに変化を生じさせるのに充分な変化になるようにし;
(d)前記干渉パターンの変化を検出する
ことを特徴とする検体分子の検出方法。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 ツァイ スイ ション
アメリカ合衆国 オレゴン州 97402 ユ
ージン ダブリュー セブンティーンス
アヴェニュー 2155
(72)発明者 ヤン ミンディ
アメリカ合衆国 オレゴン州 97405 ユ
ージン パターソン 2157 1
(72)発明者 ウー ジョン
アメリカ合衆国 オレゴン州 97402 ユ
ージン ウエスト シックスティーンス
アヴェニュー 2163
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.(a)光導波管を具え、該光導波管は基準導波管部分および検体導波管部分 を具え、両導波管部分は電磁放射に対して屈折率を示す材料から製造されており 、かつ両導波管部分は第1端部および第2端部を具え; (b)電磁放射が、全内部反射によって、前記両導波管部分の第1端部から 第2端部まで、前記基準導波管部分内および前記検体導波管部分内を平行して通 過するように、前記電磁放射を前記両導波管部分の第1端部に導入する手段を具 え; (c)前記両導波管部分の第2端部において前記電磁放射を収斂させて前記 電磁放射の射出ビームとする手段を具え;かつ (d)前記検体導波管部分は、該検体導波管部分内を通過する電磁放射に、 前記基準導波管部分内を通過する電磁放射に対する位相変化を与え、かつ該位相 変化が対応する干渉パターンを射出ビームに生じさせるのに充分な変化になるよ う、前記検体導波管部分の外部表面が検体分子と相互作用できるように、前記基 準導波管部分に対して機能性にした外部表面を具えている ことを特徴とするセンサ素子。 2.光導波管を具え、該光導波管は入射導波管部分、基準導波管部分、検体導波 管部分、および射出導波管部分を具え;前記光導波管は電磁放射に対して屈折率 を示す材料から製造されており;前記基準導波管部分および前記検体導波管部分 はいずれも前記入射導波管部分に連結された第1端部および前記射出導波管部分 に連結された第2端部を具えていて、前記光導波管は、前記入射導波管部分に入 射する電磁放射が、全反射によって、前記入射導波管部分内を通過し、次いで前 記基準導波管部分内および前記検体導波管部分内を平行して通過し、その後前記 射出導波管部分内を通過することができるように構成され;前記検体導波管部分 は、該検体導波管部分内を通過する電磁放射に、前記基準導波管部分を通過する 電磁放射に対する位相変化を与え、かつ該位相変化がこの位相変化と相関する干 渉パターンを生じさせるのに充分な変化になるよう、前記 検体導波管部分の外部表面が検体分子と相互作用できるように、前記基準導波管 部分に対して機能性にした外部表面を具えていることを特徴とするセンサ素子。 3.(a)光導波管を具え;該光導波管は電磁放射に対して屈折率を示す材料か ら成り;前記光導波管は入射導波管部分、基準導波管部分、検体導波管部分,お よび射出導波管部分を具え;前記基準導波管部分および前記検体導波管部分はい ずれも前記入射導波管部分に連結された第1端部および前記射出導波管部分に連 結された第2端部を具えていて、前記入射導波管部分に入射する電磁放射を、全 内部反射によって、前記入射導波管部分内に導き、次いで前記基準導波管部分内 および前記検体導波管部分内に平行に導き、その後前記射出導波管部分内に導い て、前記射出導波管部分内を通過する電磁放射に干渉パターンを形成するように 構成され;前記検体導波管部分は、該検体導波管部分内を通過する電磁放射に、 前記基準導波管部分を通過する電磁放射に対する変化を与え、かつ該変化が干渉 パターンに変化を生じさせるのに充分な変化になるよう、前記検体導波管部分を 検体分子と相互作用できるように、前記基準導波管部分に対して化学的に機能性 にした外部表面を具え; (b)電磁放射を前記入射導波管部分に導入する手段を具え;かつ (c)前記干渉パターンを検出するための手段を具える ことを特徴とするセンサ。 4.(a)光導波管を具え、該光導波管は基準導波管部分および検体導波管部分 を具え、両導波管部分は電磁放射に対して屈折率を示す材料から製造されており 、かつ両導波管部分は第1端部および第2端部を具え; (b)電磁放射が、全内部反射によって、前記両導波管部分の第1端部から 第2端部まで、前記基準導波管部分内および前記検体導波管部分内を平行して通 過するように、前記電磁放射を前記両導波管部分の第1端部に導入する手段を具 え; (c)前記両導波管部分の第2端部において前記電磁放射を収斂させて干渉 パターンを示す前記電磁放射のビームとする手段を具え;かつ (d)前記検体導波管部分は、該検体導波管部分内を通過する電磁放射に、 前記基準導波管部分内を通過する電磁放射に対する変化を与え、かつ該変化が干 渉パターンに変化を生じさせるのに充分な変化になるよう、前記検体導波管部分 の外部表面を検体分子と相互作用できるように、前記基準導波管部分に対して化 学的に機能性にした外部表面を具え; (e)前記干渉パターンを検出する手段を具える ことを特徴とするセンサ。
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