JPH09285288A - 急性呼吸性疾患に関連する独特のクラミジア株の検出 - Google Patents
急性呼吸性疾患に関連する独特のクラミジア株の検出Info
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- JPH09285288A JPH09285288A JP8294439A JP29443996A JPH09285288A JP H09285288 A JPH09285288 A JP H09285288A JP 8294439 A JP8294439 A JP 8294439A JP 29443996 A JP29443996 A JP 29443996A JP H09285288 A JPH09285288 A JP H09285288A
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- C07K14/295—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Chlamydiales (O)
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- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56911—Bacteria
- G01N33/56927—Chlamydia
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 クラミジア・ニューモニアを特異的に検出す
るためのプローブの提供。 【解決手段】 クラミジア・トラコマチスのDNA及び
クラミジア・プシタシのDNAとはハイブリダイズせ
ず、クラミジア・ニューモニアのDNAと特異的にハイ
ブリダイズするプローブ。 【効果】 クラミジアの内クラミジア・ニューモニアを
特異的に検出することができる。
るためのプローブの提供。 【解決手段】 クラミジア・トラコマチスのDNA及び
クラミジア・プシタシのDNAとはハイブリダイズせ
ず、クラミジア・ニューモニアのDNAと特異的にハイ
ブリダイズするプローブ。 【効果】 クラミジアの内クラミジア・ニューモニアを
特異的に検出することができる。
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、一般的にクラミジ
ア(Chlamydia)株の検出及びより詳しくは、
呼吸感染に関連する独特のクラミジア株の検出における
モノクローナル抗体及びDNAプローブの使用に関す
る。
ア(Chlamydia)株の検出及びより詳しくは、
呼吸感染に関連する独特のクラミジア株の検出における
モノクローナル抗体及びDNAプローブの使用に関す
る。
【0002】
【従来の技術】クラミジアは、動物界を通して遍在し、
そして種々の疾病を引き起こすことが知られている偏性
細胞内寄生体である。クラミジア属は、2種の認識され
る種、すなわちC.トラコマチス(C.trachom
atis)及びC.プシタシ(C.psittaci)
並びに3種のバイオバーへのC.トラコマチスの派生を
有する。C.トラコマチス、すなわち一次性ヒト病原体
であるこの種は、目、呼吸及び尿生殖器感染を引き起こ
す。C.トラコマチスは初めに、粘膜、たとえば結膜、
鼻咽頭、直腸、尿道及び頸管上にコロニー形成すること
ができ、この後、その感染は分散し、より深い器官系に
影響を及ぼす。
そして種々の疾病を引き起こすことが知られている偏性
細胞内寄生体である。クラミジア属は、2種の認識され
る種、すなわちC.トラコマチス(C.trachom
atis)及びC.プシタシ(C.psittaci)
並びに3種のバイオバーへのC.トラコマチスの派生を
有する。C.トラコマチス、すなわち一次性ヒト病原体
であるこの種は、目、呼吸及び尿生殖器感染を引き起こ
す。C.トラコマチスは初めに、粘膜、たとえば結膜、
鼻咽頭、直腸、尿道及び頸管上にコロニー形成すること
ができ、この後、その感染は分散し、より深い器官系に
影響を及ぼす。
【0003】クラミジアの他の種、すなわちC.プシタ
シは、ヒト呼吸疾患、すなわちオウム病の原因である。
オウム病は、通常、感染された鳥類への接触によって感
染し、オウム病の発生は、シチメンチョウ及びカモに関
連して、及びペットショップの客の間で起こる。その疾
患はしばしば異型肺炎に類似し、そして軽いものから致
命的なものまでの範囲を有する。そのような肺炎の流行
病は通常、感染された鳥類に由来したが、鳥類のベクタ
ーは必ずしも見出されない。たとえば、1987年北フ
ィンランドにおける放射線撮影法による調査の間、軽い
肺炎の流行病が2つの集落に見出された。しかしなが
ら、鳥類による伝染は見出されなかった。
シは、ヒト呼吸疾患、すなわちオウム病の原因である。
オウム病は、通常、感染された鳥類への接触によって感
染し、オウム病の発生は、シチメンチョウ及びカモに関
連して、及びペットショップの客の間で起こる。その疾
患はしばしば異型肺炎に類似し、そして軽いものから致
命的なものまでの範囲を有する。そのような肺炎の流行
病は通常、感染された鳥類に由来したが、鳥類のベクタ
ーは必ずしも見出されない。たとえば、1987年北フ
ィンランドにおける放射線撮影法による調査の間、軽い
肺炎の流行病が2つの集落に見出された。しかしなが
ら、鳥類による伝染は見出されなかった。
【0004】血清疫学研究は、北ヨーロッパにおいてこ
の及びいくつかの他の肺炎流行病におけるクラミジアの
通常の菌株を抱合した。このクラミジアの新規菌株は、
つい最近、重要な呼吸病原菌として確立され、そしてそ
れは研究された成人集団におけるたぶん12%までの異
型肺炎患者を引き起こした。しかしながらほとんどの感
染は、原因物質がマイコプラスマ・ニューモニア(My
coplasma pneumoniae)又はインフ
ルエンザA型又はB型ウィルスであるまちがった確信の
ために、抗生物質により不適切に治療された。M.ニュ
ーモニアのために使用される少量でのエリスロマイシン
による抗生物質治療は、マイコプラスマ感染に対して効
果的であるが、この投与量でのエリスロマイシンはクラ
ミジア感染に対して効果的でない。さらに、これらの感
染は、病状が明確に緩和した後、再発する疾病によって
しばしば特徴づけられる。
の及びいくつかの他の肺炎流行病におけるクラミジアの
通常の菌株を抱合した。このクラミジアの新規菌株は、
つい最近、重要な呼吸病原菌として確立され、そしてそ
れは研究された成人集団におけるたぶん12%までの異
型肺炎患者を引き起こした。しかしながらほとんどの感
染は、原因物質がマイコプラスマ・ニューモニア(My
coplasma pneumoniae)又はインフ
ルエンザA型又はB型ウィルスであるまちがった確信の
ために、抗生物質により不適切に治療された。M.ニュ
ーモニアのために使用される少量でのエリスロマイシン
による抗生物質治療は、マイコプラスマ感染に対して効
果的であるが、この投与量でのエリスロマイシンはクラ
ミジア感染に対して効果的でない。さらに、これらの感
染は、病状が明確に緩和した後、再発する疾病によって
しばしば特徴づけられる。
【0005】
【発明が解決しようとする課題】新菌株のクラミジアと
急性呼吸疾患とのこの関連の観点から、この新菌株の存
在を診断するための正確且つ費用的に有効な方法を提供
することがひじょうに所望され、それによって一次感染
の有効な抗生物質治療を可能にするであろう。本発明
は、そのような方法を提供し、そしてさらに他の関連す
る利点によって特徴づけられる。
急性呼吸疾患とのこの関連の観点から、この新菌株の存
在を診断するための正確且つ費用的に有効な方法を提供
することがひじょうに所望され、それによって一次感染
の有効な抗生物質治療を可能にするであろう。本発明
は、そのような方法を提供し、そしてさらに他の関連す
る利点によって特徴づけられる。
【0006】
【課題を解決するための手段】簡単に言えば、本発明
は、生物学的サンプル中におけるクラミジア・ニューモ
ニア(Chlamidia pneumonia)(以
下TWAR生物体と称する)の存在を検出するための方
法を提供する。これらの方法は、TWAR生物体の抗原
決定基に対して向けられたモノクローナル抗体又はTW
AR生物体に対して特異的なDNAプローブのいづれか
を使用する。
は、生物学的サンプル中におけるクラミジア・ニューモ
ニア(Chlamidia pneumonia)(以
下TWAR生物体と称する)の存在を検出するための方
法を提供する。これらの方法は、TWAR生物体の抗原
決定基に対して向けられたモノクローナル抗体又はTW
AR生物体に対して特異的なDNAプローブのいづれか
を使用する。
【0007】本発明の1つの観点において、その方法
は、(a)TWAR生物体の抗原決定基に対して向けら
れた、ラベルされたモノクローナル抗体に、そのTWA
R生物体を含むと思われる生物学的サンプルを暴露する
段階;及び(b)前記モノクローナル抗体と前記TWA
R生物体との間に形成される免疫複合体の存在を検出す
る段階を含んで成る。
は、(a)TWAR生物体の抗原決定基に対して向けら
れた、ラベルされたモノクローナル抗体に、そのTWA
R生物体を含むと思われる生物学的サンプルを暴露する
段階;及び(b)前記モノクローナル抗体と前記TWA
R生物体との間に形成される免疫複合体の存在を検出す
る段階を含んで成る。
【0008】TWAR生物体の存在を検出するための関
連方法は、(a)TWAR生物体が細胞内に含まれるよ
うにHeLa細胞とTWAR生物体を含むと思われる生
物学的サンプルとを混合し;(b)前記TWAR生物体
を含むHeLa細胞をインキュベートし;(c)TWA
R生物体の抗原決定基に対して向けられた、ラベルされ
たモノクローナル抗体に前記HeLa細胞/TWAR生
物体を暴露し;そして(d)前記TWAR生物体と前記
ラベルされたモノクローナル抗体との間に形成される免
疫複合体の存在を検出することを含んで成る。本発明の
特に好ましい態様においては;前記混合段階は、サンプ
ルよりHeLa細胞を接種し、そして続いてそのHeL
a細胞上での接種されたサンプルを遠心分離にかけるこ
とを含んで成る。DEAE−デキストラン及びシクロヘ
キサアミドにより前処理することがまた好ましい。
連方法は、(a)TWAR生物体が細胞内に含まれるよ
うにHeLa細胞とTWAR生物体を含むと思われる生
物学的サンプルとを混合し;(b)前記TWAR生物体
を含むHeLa細胞をインキュベートし;(c)TWA
R生物体の抗原決定基に対して向けられた、ラベルされ
たモノクローナル抗体に前記HeLa細胞/TWAR生
物体を暴露し;そして(d)前記TWAR生物体と前記
ラベルされたモノクローナル抗体との間に形成される免
疫複合体の存在を検出することを含んで成る。本発明の
特に好ましい態様においては;前記混合段階は、サンプ
ルよりHeLa細胞を接種し、そして続いてそのHeL
a細胞上での接種されたサンプルを遠心分離にかけるこ
とを含んで成る。DEAE−デキストラン及びシクロヘ
キサアミドにより前処理することがまた好ましい。
【0009】本発明の3番目の観点は、生物学的サンプ
ル中においてクラミジアのTWAR生物体に対する抗体
の存在を決定するための方法を開示する。その方法は、
一般的に、(a)反応混合物を形成するためにTWAR
生物体の基本体と共に生物学的サンプルをインキュベー
トし;そして(b)そのTWAR生物体に対する抗体の
存在を決定するために前記反応混合物を分析することを
含んで成る。好ましい態様においては、前記分析段階
は、抗体に対するラベルされた特異的な結合パートナー
と前記反応混合物を接触せしめ、そしてそのラベルを検
出することを含んで成る。これに関しては、その特異的
な結合パートナーは、ヤギ抗−ヒトIgM又はヤギ抗−
ヒトIgGである。
ル中においてクラミジアのTWAR生物体に対する抗体
の存在を決定するための方法を開示する。その方法は、
一般的に、(a)反応混合物を形成するためにTWAR
生物体の基本体と共に生物学的サンプルをインキュベー
トし;そして(b)そのTWAR生物体に対する抗体の
存在を決定するために前記反応混合物を分析することを
含んで成る。好ましい態様においては、前記分析段階
は、抗体に対するラベルされた特異的な結合パートナー
と前記反応混合物を接触せしめ、そしてそのラベルを検
出することを含んで成る。これに関しては、その特異的
な結合パートナーは、ヤギ抗−ヒトIgM又はヤギ抗−
ヒトIgGである。
【0010】上記に簡単に記載された方法のすべてにお
いて、モノクローナル抗体は、酵素、蛍光体、放射性同
位体又は発光体によりラベルされ得る。これに関して、
検出の段階は、通常、それぞれ酵素反応、蛍光、放射能
又は発光によって存在するのであろう。上記に説明され
た方法は、TWAR生物体又はそのTWAR生物体に対
する抗体の存在を検出するために種々の生物学的サンプ
ルに適用され得る。体分泌液、体液及び組織検体は適切
なサンプルである。体分泌液の例は、頸管分泌液、気管
−気管支分泌液、及び咽頭分泌液を含む。適切な体液
は、血液、涙及び中枢神経系液を含む。組織検体の例
は、種々のバイオプシー、たとえば肺組織又はらっぱ管
組織のバイオプシーを含む。さらに実質的にすべての部
分からの組織(心臓組織及び肺組織)が、検死実験内で
試験され得る。
いて、モノクローナル抗体は、酵素、蛍光体、放射性同
位体又は発光体によりラベルされ得る。これに関して、
検出の段階は、通常、それぞれ酵素反応、蛍光、放射能
又は発光によって存在するのであろう。上記に説明され
た方法は、TWAR生物体又はそのTWAR生物体に対
する抗体の存在を検出するために種々の生物学的サンプ
ルに適用され得る。体分泌液、体液及び組織検体は適切
なサンプルである。体分泌液の例は、頸管分泌液、気管
−気管支分泌液、及び咽頭分泌液を含む。適切な体液
は、血液、涙及び中枢神経系液を含む。組織検体の例
は、種々のバイオプシー、たとえば肺組織又はらっぱ管
組織のバイオプシーを含む。さらに実質的にすべての部
分からの組織(心臓組織及び肺組織)が、検死実験内で
試験され得る。
【0011】本発明によれば、上記に記載された方法に
使用するためにTWAR生物体の抗原決定基に対して向
けられたモノクローナル抗体を産生する連続したハイブ
リッド細胞系が確立される。特に好ましい態様において
は、その細胞系は、ハイブリドーマクローンRR 40
2又はTT 205を含んで成る。そのような細胞系に
より産出されるモノクローナル抗体もまた開示されてい
る。上記に示されるように、本発明はまた、TWAR生
物体に対して特異的なDNAプローブも開示する。TW
AR生物体のDNA配列の少なくとも一部を含むそのプ
ローブが、生物学的サンプル中におけるTWAR生物体
の存在を検出するための方法に使用され得る。
使用するためにTWAR生物体の抗原決定基に対して向
けられたモノクローナル抗体を産生する連続したハイブ
リッド細胞系が確立される。特に好ましい態様において
は、その細胞系は、ハイブリドーマクローンRR 40
2又はTT 205を含んで成る。そのような細胞系に
より産出されるモノクローナル抗体もまた開示されてい
る。上記に示されるように、本発明はまた、TWAR生
物体に対して特異的なDNAプローブも開示する。TW
AR生物体のDNA配列の少なくとも一部を含むそのプ
ローブが、生物学的サンプル中におけるTWAR生物体
の存在を検出するための方法に使用され得る。
【0012】本発明の1つの観点において、その方法
は、(a)サンプルに関連するDNAを単離するために
TWAR生物体を含むと思われる生物学的サンプルを処
理する段階;(b)基質にその単離されたDNAを添加
する段階;(c)TWAR生物体のDNA配列の少なく
とも一部に特異的にハイブリダイズすることができるラ
ベルされたDNAプローブと共にDNA担持基質をイン
キュベートする段階;(d)前記基質からハイブリダイ
ズしなかったプローブを分離する段階;及び(e)前記
基質に関連するラベルの量を検出し、そしてそれからT
WAR生物体の存在又は不在を決定する段階を含んで成
る。本発明のもう1つの観点の範囲内の方法は、(a)
基質にTWAR生物体を含むと思われる生物学的サンプ
ルを添加し;(b)該サンプルに関連するDNAを暴露
するために前記添加されたサンプルを担持する基質を処
理し;(c)前記TWAR生物体のDNA配列の少なく
とも一部に特異的にハイブリダイズすることができるラ
ベルされたDNAプローブと共に前記DNA担持基質を
インキュベートし;(d)前記基質からハイブリダイズ
されなかったプローブを分離し、そして(e)前記基質
に関連するラベルの量を検出し、そしてそれからTWA
R生物体の存在又は不在を決定することを含んで成る。
前記方法内のプローブは、完全な染色体DNAプローブ
又はTWAR生物体に由来したDNAフラグメントプロ
ーブである。本発明のこれらの及び他の観点は、次の詳
細な説明及び添付図面によって明確になるであろう。
は、(a)サンプルに関連するDNAを単離するために
TWAR生物体を含むと思われる生物学的サンプルを処
理する段階;(b)基質にその単離されたDNAを添加
する段階;(c)TWAR生物体のDNA配列の少なく
とも一部に特異的にハイブリダイズすることができるラ
ベルされたDNAプローブと共にDNA担持基質をイン
キュベートする段階;(d)前記基質からハイブリダイ
ズしなかったプローブを分離する段階;及び(e)前記
基質に関連するラベルの量を検出し、そしてそれからT
WAR生物体の存在又は不在を決定する段階を含んで成
る。本発明のもう1つの観点の範囲内の方法は、(a)
基質にTWAR生物体を含むと思われる生物学的サンプ
ルを添加し;(b)該サンプルに関連するDNAを暴露
するために前記添加されたサンプルを担持する基質を処
理し;(c)前記TWAR生物体のDNA配列の少なく
とも一部に特異的にハイブリダイズすることができるラ
ベルされたDNAプローブと共に前記DNA担持基質を
インキュベートし;(d)前記基質からハイブリダイズ
されなかったプローブを分離し、そして(e)前記基質
に関連するラベルの量を検出し、そしてそれからTWA
R生物体の存在又は不在を決定することを含んで成る。
前記方法内のプローブは、完全な染色体DNAプローブ
又はTWAR生物体に由来したDNAフラグメントプロ
ーブである。本発明のこれらの及び他の観点は、次の詳
細な説明及び添付図面によって明確になるであろう。
【0013】
【発明の実施の形態】上記に示されるように、血清疫学
研究は、北ヨーロッパ及び他の国においていくつかの肺
炎流行病におけるクラミジアの通常の菌株を包含した。
このクラミジアの新規菌株は、初めの2種の単離体の実
験用名称(TW−183及びAR−39)から“TWA
R”として本発明において言及される。TWARは、ク
ラミジア属に属することが示されているが、しかし、い
くつかの基準によってC.トリコマチス及びC.プシタ
シから区別され得る。封入体の形態及び封入体における
グリコーゲンの存在に関しては、TWAR封入体は、グ
リコーゲンを含むC.トラコマチス封入体の空胞性質と
は違って、それらの卵形且つ密集した出現及びグリコー
ゲンの不在に基づいてC.プシタシにより密接に関連さ
れる。さらにTWAR生物体は、C.トラコマチス種−
特異性モノクローナル抗体と反応しない(Stephensな
ど., J. Immunol. 128:1083,1982)。
研究は、北ヨーロッパ及び他の国においていくつかの肺
炎流行病におけるクラミジアの通常の菌株を包含した。
このクラミジアの新規菌株は、初めの2種の単離体の実
験用名称(TW−183及びAR−39)から“TWA
R”として本発明において言及される。TWARは、ク
ラミジア属に属することが示されているが、しかし、い
くつかの基準によってC.トリコマチス及びC.プシタ
シから区別され得る。封入体の形態及び封入体における
グリコーゲンの存在に関しては、TWAR封入体は、グ
リコーゲンを含むC.トラコマチス封入体の空胞性質と
は違って、それらの卵形且つ密集した出現及びグリコー
ゲンの不在に基づいてC.プシタシにより密接に関連さ
れる。さらにTWAR生物体は、C.トラコマチス種−
特異性モノクローナル抗体と反応しない(Stephensな
ど., J. Immunol. 128:1083,1982)。
【0014】TWAR生物体は明らかに、C.トリコマ
チス種に属さないが、それはまた現在認識されている
C.プシタシ株とも重要な相違を示す。TWAR及び他
のC.プシタシ株は免疫学的に異なる。すなわち、他の
C.プシタシ株との交叉反応は見出されていない。さら
に、TWAR生物体に対するモノクローナル抗体の産生
において(下記により十分に記載されている)、C.プ
シタシ種−特異性抗体は検出されず、属−及び菌株−
(TWARセロバー)特異性抗体のみが見出された。
チス種に属さないが、それはまた現在認識されている
C.プシタシ株とも重要な相違を示す。TWAR及び他
のC.プシタシ株は免疫学的に異なる。すなわち、他の
C.プシタシ株との交叉反応は見出されていない。さら
に、TWAR生物体に対するモノクローナル抗体の産生
において(下記により十分に記載されている)、C.プ
シタシ種−特異性抗体は検出されず、属−及び菌株−
(TWARセロバー)特異性抗体のみが見出された。
【0015】プラスミドは、試験されたほとんどすべて
のC.プシタシ及びC.トラコマチスクラミジア株に見
出されたが、TWAR生物体はプラスミドを持たないこ
とを注目することはまた興味の対象である。さらに、す
べての既知のC.プシタシ株は動物又は鳥宿主を有する
が、TWAR生物体のための動物又は鳥宿主は見出され
ていない。本発明によれば、TWAR生物体は、C.プ
シタシに形態的に類似するが、しかしそれとは異なり、
そして現在認識されているC.プシタシ株とは免疫学的
に異なるいづれかのクラミジア株を含むことが定義され
る。代表的なTWAR株(AR−39)は、American T
ype Culture Collectionに寄託され、そして寄託番号第
53592号を得た。
のC.プシタシ及びC.トラコマチスクラミジア株に見
出されたが、TWAR生物体はプラスミドを持たないこ
とを注目することはまた興味の対象である。さらに、す
べての既知のC.プシタシ株は動物又は鳥宿主を有する
が、TWAR生物体のための動物又は鳥宿主は見出され
ていない。本発明によれば、TWAR生物体は、C.プ
シタシに形態的に類似するが、しかしそれとは異なり、
そして現在認識されているC.プシタシ株とは免疫学的
に異なるいづれかのクラミジア株を含むことが定義され
る。代表的なTWAR株(AR−39)は、American T
ype Culture Collectionに寄託され、そして寄託番号第
53592号を得た。
【0016】ハイブリドーマ形成及びモノクローナル抗
体の産生は、種々の微生物疾患の免疫診断に有用である
ことが示された。より詳しくは、モノクローナル抗体
は、ヒト感染の検出及び血清学的な分類を可能にする。
さらに、これらのモノクローナル抗体は、属−及び種−
特異性抗原の同定を促進せしめる。上記に示されたよう
に、TWAR生物体の抗原決定基に対するモノクローナ
ル抗体を産生することができる連続したハイブリッド細
胞系が確立される。そのような細胞系を確立するための
一般的な方法は、実験動物、通常マウスを適切な抗原に
より免疫化することを含む。次に、免疫脾臓細胞を単離
し、その化学物質、たとえばポリエチレングリコールに
暴露することによって骨髄腫又はリンパ腫細胞と融合せ
しめる。
体の産生は、種々の微生物疾患の免疫診断に有用である
ことが示された。より詳しくは、モノクローナル抗体
は、ヒト感染の検出及び血清学的な分類を可能にする。
さらに、これらのモノクローナル抗体は、属−及び種−
特異性抗原の同定を促進せしめる。上記に示されたよう
に、TWAR生物体の抗原決定基に対するモノクローナ
ル抗体を産生することができる連続したハイブリッド細
胞系が確立される。そのような細胞系を確立するための
一般的な方法は、実験動物、通常マウスを適切な抗原に
より免疫化することを含む。次に、免疫脾臓細胞を単離
し、その化学物質、たとえばポリエチレングリコールに
暴露することによって骨髄腫又はリンパ腫細胞と融合せ
しめる。
【0017】次に、融合されたハイブリッド細胞を、悪
性細胞系の増殖を妨げる選択培地、たとえばHAT培地
中でインキュベートする。ハイブリドーマ細胞を限界希
釈法によりクローンし、そして培養上清液を、所望の特
異性を有するモノクローナル抗体の分泌のために検定す
る。選択されたモノクローナル抗体の多くの収量が、ハ
イブリドーマのイン・ビボでの腹水増殖を通して得られ
た。TWAR生物体に対して特異的であるモノクローナ
ル抗体を得るために、適切なTWAR抗原が調製される
べきである。患者ののど(咽頭)からのTWAR単離体
を真核細胞培養又は胎児性卵黄のう培養のいづれかを通
して、培養することができる。
性細胞系の増殖を妨げる選択培地、たとえばHAT培地
中でインキュベートする。ハイブリドーマ細胞を限界希
釈法によりクローンし、そして培養上清液を、所望の特
異性を有するモノクローナル抗体の分泌のために検定す
る。選択されたモノクローナル抗体の多くの収量が、ハ
イブリドーマのイン・ビボでの腹水増殖を通して得られ
た。TWAR生物体に対して特異的であるモノクローナ
ル抗体を得るために、適切なTWAR抗原が調製される
べきである。患者ののど(咽頭)からのTWAR単離体
を真核細胞培養又は胎児性卵黄のう培養のいづれかを通
して、培養することができる。
【0018】ほとんどの一次単離物は、好結果をもたら
す真核細胞培養の前、TWAR生物体の卵順応性を必要
とする。特に、TWAR単離物を卵黄のう培養物に1度
又は2度通し、そして次にバイアル中に増殖されたHe
La 229細胞の培養物上にそれらを接種することが
好ましい。そのHeLa細胞をDEAE−デキストラン
及びシクロヘキサアミドにより前処理することもまた好
ましい。そのTWAR単離体は、くり返された培養物通
過により細胞培養物中で増殖することが適合され得る。
特に、約10又はそれよりも多くの一連の培養物通過が
HeLa細胞増殖への適合のために好都合であろう。
す真核細胞培養の前、TWAR生物体の卵順応性を必要
とする。特に、TWAR単離物を卵黄のう培養物に1度
又は2度通し、そして次にバイアル中に増殖されたHe
La 229細胞の培養物上にそれらを接種することが
好ましい。そのHeLa細胞をDEAE−デキストラン
及びシクロヘキサアミドにより前処理することもまた好
ましい。そのTWAR単離体は、くり返された培養物通
過により細胞培養物中で増殖することが適合され得る。
特に、約10又はそれよりも多くの一連の培養物通過が
HeLa細胞増殖への適合のために好都合であろう。
【0019】図1のA及びBを参照すれば、それぞれT
WAR生物体及びC.トラコマチスにより感染されたH
eLa 229細胞の単層を示す顕微鏡写真が、存在す
る。TWARによる感染は、核を切り離さず又は置換し
ていない比較的密集した細胞質封入体を示す。対照的
に、図1のBは、核を切り離している、C.トラコマチ
スの典型的な空胞性封入を示す。
WAR生物体及びC.トラコマチスにより感染されたH
eLa 229細胞の単層を示す顕微鏡写真が、存在す
る。TWARによる感染は、核を切り離さず又は置換し
ていない比較的密集した細胞質封入体を示す。対照的
に、図1のBは、核を切り離している、C.トラコマチ
スの典型的な空胞性封入を示す。
【0020】感染された細胞培養物は、通常、TWAR
生物体の感染度のためにモニターされ;そして数パーセ
ントの細胞が感染される場合、多数のバイアル培養物
は、大きな培養ボトル中での増殖のために調製物に接種
される。好ましい態様においては、50%の感染度が得
られる場合、20〜30個のHeLa 229細胞のバ
イアルが、32−オンスの調剤ボトル培養物に植え込み
を提供するために感染され得る。続く一連の経過は、T
WAR株クラミジアの数を高めるであろう。この適合及
び拡大は、モノクローナル抗体の産生及びスクリーニン
グのためにTWAR抗原の十分な量を与えるであろう。
生物体の感染度のためにモニターされ;そして数パーセ
ントの細胞が感染される場合、多数のバイアル培養物
は、大きな培養ボトル中での増殖のために調製物に接種
される。好ましい態様においては、50%の感染度が得
られる場合、20〜30個のHeLa 229細胞のバ
イアルが、32−オンスの調剤ボトル培養物に植え込み
を提供するために感染され得る。続く一連の経過は、T
WAR株クラミジアの数を高めるであろう。この適合及
び拡大は、モノクローナル抗体の産生及びスクリーニン
グのためにTWAR抗原の十分な量を与えるであろう。
【0021】本発明に使用されるハイブリドーマ産生の
ための免疫原は、精製されたTWAR抗原であった。好
ましい態様において、その抗原は、レノグラフィンによ
り精製されたTWAR基本小体(elementary
body)(>99%に精製された)である。ハイブ
リドーマは、免疫マウス脾臓細胞とNS−O骨髄腫細胞
との融合によって調製され、そして抗−クラミジア抗体
を分泌するハイブリドーマクローンが同定される。好ま
しい態様においては、ハイブリドーマ培養上清液を、E
LISAによってスクリーンする。特に好ましい態様に
おいては、ELISAは、ペルオキシダーゼ接合性抗−
マウス免疫グロブリン及び比色検出システムを使用す
る。ミクロ−イムノフルオレセンス技法(S. P. Wang及
びJ. T. Grayston, Amer. J. Ophthal. 70:367
8,1970)によるモノクローナル抗体の特異性の試
験がまた好ましい。
ための免疫原は、精製されたTWAR抗原であった。好
ましい態様において、その抗原は、レノグラフィンによ
り精製されたTWAR基本小体(elementary
body)(>99%に精製された)である。ハイブ
リドーマは、免疫マウス脾臓細胞とNS−O骨髄腫細胞
との融合によって調製され、そして抗−クラミジア抗体
を分泌するハイブリドーマクローンが同定される。好ま
しい態様においては、ハイブリドーマ培養上清液を、E
LISAによってスクリーンする。特に好ましい態様に
おいては、ELISAは、ペルオキシダーゼ接合性抗−
マウス免疫グロブリン及び比色検出システムを使用す
る。ミクロ−イムノフルオレセンス技法(S. P. Wang及
びJ. T. Grayston, Amer. J. Ophthal. 70:367
8,1970)によるモノクローナル抗体の特異性の試
験がまた好ましい。
【0022】TWARにより誘発されたハイブリドーマ
は、同系のBALB/cマウス中に腹腔内接種され得
る。接種する前、2週間、マウスをプリスタンにより感
作することが好ましい。その得られた腹水を収穫し、そ
してモノクローナル抗体を精製することができる。好ま
しい態様においては、腹水性モノクローナル抗体を、プ
ロテインA−セファロースカラム上でアフィニティー精
製する。
は、同系のBALB/cマウス中に腹腔内接種され得
る。接種する前、2週間、マウスをプリスタンにより感
作することが好ましい。その得られた腹水を収穫し、そ
してモノクローナル抗体を精製することができる。好ま
しい態様においては、腹水性モノクローナル抗体を、プ
ロテインA−セファロースカラム上でアフィニティー精
製する。
【0023】選択されたTWARモノクローナル抗体
を、本発明に記載された方法に使用するためにラベル化
することができる。好ましいラベルは、酵素、蛍光体、
放射性同位体及び発光体を含む。これらの及び他のラベ
ルは当業界において良く知られている。これに関する特
に好ましいラベルは、フルオレセインである。次に、そ
のラベルされたTWARモノクローナル抗体を、属−、
種−及び株−特異性について試験することができる。第
1表に示されるように、ミクロ−イムノフルオレセンス
アッセイに使用される場合、TWARにより誘発された
モノクローナル抗体は、TWAR単離体と反応したが、
しかしC.トラコマチルまたはC.プシタシはそうでは
なかった。
を、本発明に記載された方法に使用するためにラベル化
することができる。好ましいラベルは、酵素、蛍光体、
放射性同位体及び発光体を含む。これらの及び他のラベ
ルは当業界において良く知られている。これに関する特
に好ましいラベルは、フルオレセインである。次に、そ
のラベルされたTWARモノクローナル抗体を、属−、
種−及び株−特異性について試験することができる。第
1表に示されるように、ミクロ−イムノフルオレセンス
アッセイに使用される場合、TWARにより誘発された
モノクローナル抗体は、TWAR単離体と反応したが、
しかしC.トラコマチルまたはC.プシタシはそうでは
なかった。
【0024】
【表1】
【0025】フルオレセイン接合性TWARモノクロー
ナル抗体は、感染された培養細胞中におけるTWAR基
本体及びTWAR封入体を特異的に染色するが、しかし
他のクラミジア株を染色しなかった。従って、本発明
は、TWAR特異性抗原決定基に結合するモノクローナ
ル抗体を提供する。
ナル抗体は、感染された培養細胞中におけるTWAR基
本体及びTWAR封入体を特異的に染色するが、しかし
他のクラミジア株を染色しなかった。従って、本発明
は、TWAR特異性抗原決定基に結合するモノクローナ
ル抗体を提供する。
【0026】本発明の範囲内で、TWAR特異性モノク
ローナル抗体が、生物学的検体の診断アッセイに使用さ
れて来た。特に、本発明は、臨床的検体のスミア及び接
種された細胞培養物中におけるTWAR生物体を検出す
るための方法を提供する。これらの方法は、固定された
検体におけるTWAR−特異性抗体決定基に直接的に結
合する、ラベルされたTWAR特異性モノクローナル抗
体を使用する。その検体は、固体支持体、たとえばガラ
ススライド、カバースリップ又はミクロタイターウェル
上に固定され得る。その検体又は生物学的サンプルはま
た、メタノール又はエタノールにより、固体支持体に固
定されるべきである。
ローナル抗体が、生物学的検体の診断アッセイに使用さ
れて来た。特に、本発明は、臨床的検体のスミア及び接
種された細胞培養物中におけるTWAR生物体を検出す
るための方法を提供する。これらの方法は、固定された
検体におけるTWAR−特異性抗体決定基に直接的に結
合する、ラベルされたTWAR特異性モノクローナル抗
体を使用する。その検体は、固体支持体、たとえばガラ
ススライド、カバースリップ又はミクロタイターウェル
上に固定され得る。その検体又は生物学的サンプルはま
た、メタノール又はエタノールにより、固体支持体に固
定されるべきである。
【0027】サンプルがその表面に固定又は結合された
後、そのサンプルは、ラベルされたモノクローナル抗体
に暴露される。他方、TWAR特異性モノクローナル抗
体に結合することができるラベルされた第二抗体が使用
される。この方法の変法は、ラベルのシグナルの増強を
提供することができる。直接的な蛍光抗体技法によるス
ミア検体中のTWAR生物体の同定は、迅速であり、簡
単であり、そして比較的安価である。そのスミア技法
は、臨床的調整(初期診断、原因生物体の単離のための
改良された機会、治療の成功に基づく追跡調査)及び表
皮学的調整の両者に使用され得る。
後、そのサンプルは、ラベルされたモノクローナル抗体
に暴露される。他方、TWAR特異性モノクローナル抗
体に結合することができるラベルされた第二抗体が使用
される。この方法の変法は、ラベルのシグナルの増強を
提供することができる。直接的な蛍光抗体技法によるス
ミア検体中のTWAR生物体の同定は、迅速であり、簡
単であり、そして比較的安価である。そのスミア技法
は、臨床的調整(初期診断、原因生物体の単離のための
改良された機会、治療の成功に基づく追跡調査)及び表
皮学的調整の両者に使用され得る。
【0028】TWAR生物体の存在を検出するための方
法を提供する他に、本発明は、生物学的サンプル中にお
けるTWAR生物体に対する抗体の存在を決定するため
の方法を提供する。TWAR抗体のための血清又は体液
のスクリーニングのための特に好ましい態様は、ミクロ
−IFアッセイである。典型的には、抗原(クラミジア
基本小体抗原)を、顕微鏡のスライド上に固定し、そし
てそのスライドを、TWAR抗体を含むと思われるサン
プルと共にインキュベートする。次に、ラベルされた特
異的結合パートナー(たとえばフルオレセイン接合性抗
−マウス免疫グロブリン)を添加し、そしてその反応
を、TWAR生物体に対する抗体の存在を決定するため
に観察する。
法を提供する他に、本発明は、生物学的サンプル中にお
けるTWAR生物体に対する抗体の存在を決定するため
の方法を提供する。TWAR抗体のための血清又は体液
のスクリーニングのための特に好ましい態様は、ミクロ
−IFアッセイである。典型的には、抗原(クラミジア
基本小体抗原)を、顕微鏡のスライド上に固定し、そし
てそのスライドを、TWAR抗体を含むと思われるサン
プルと共にインキュベートする。次に、ラベルされた特
異的結合パートナー(たとえばフルオレセイン接合性抗
−マウス免疫グロブリン)を添加し、そしてその反応
を、TWAR生物体に対する抗体の存在を決定するため
に観察する。
【0029】DNAプローブの使用はまた、種々の微生
物学的疾患の診断に有用であることが示されて来た。よ
り詳しくは、DNAプローブを用いて、精製されたDN
Aを検出し、単離されたコロニー中の精製されていない
DNAを検出し、又は組織、体液、食物及び水中のDN
Aを直接的に検出することができる。DNAプローブの
使用の1つの利点は、その生物体、が臨界的な結合部位
のマスキングを通して免疫学的検出を妨げることができ
る共存する抗体の存在において検出され得ることであ
る。
物学的疾患の診断に有用であることが示されて来た。よ
り詳しくは、DNAプローブを用いて、精製されたDN
Aを検出し、単離されたコロニー中の精製されていない
DNAを検出し、又は組織、体液、食物及び水中のDN
Aを直接的に検出することができる。DNAプローブの
使用の1つの利点は、その生物体、が臨界的な結合部位
のマスキングを通して免疫学的検出を妨げることができ
る共存する抗体の存在において検出され得ることであ
る。
【0030】さらに、DNAプローブは、免疫蛍光技法
によって容易に検定され得ないサンプルに対して使用さ
れるべく可能性を有する。いくつかの異なったアプロー
チが、特定の病原体に対して特異的なDNAプローブの
開発に使用されて来た。これらのアプローチは、(a)
完全な染色体DNA;(b)その病原体に対してユニー
クなウィルス性機能に関連する配列;(c)プラスミド
DNA;(d)リボソームRNA遺伝子;及び(e)前
記生物体に対して特異的な、クローンされたランダム配
列を含む。
によって容易に検定され得ないサンプルに対して使用さ
れるべく可能性を有する。いくつかの異なったアプロー
チが、特定の病原体に対して特異的なDNAプローブの
開発に使用されて来た。これらのアプローチは、(a)
完全な染色体DNA;(b)その病原体に対してユニー
クなウィルス性機能に関連する配列;(c)プラスミド
DNA;(d)リボソームRNA遺伝子;及び(e)前
記生物体に対して特異的な、クローンされたランダム配
列を含む。
【0031】しかしながら、TWARはプラスミドDN
Aを含まず、そしてウィルス性因子はこの生物体のため
に同定されていないので、本発明は、完全な染色体DN
Aプローブ及びTWAR生物体に対して特異的であるT
WARDNAの代表的なクローンされたフラグメントの
両者を開示する。これらのプローブの使用は、C.トラ
コマチス及びC.プシタシとTWARとの区別を可能に
する。下記により詳細に説明されているように、DNA
プローブは、TWARのDNA配列とハイブリダイズす
るそれらの能力、及びC.トラコマチス及びC.プシタ
シからのDNAとのハイブリダイゼーションのそれらの
欠失によって選択された。
Aを含まず、そしてウィルス性因子はこの生物体のため
に同定されていないので、本発明は、完全な染色体DN
Aプローブ及びTWAR生物体に対して特異的であるT
WARDNAの代表的なクローンされたフラグメントの
両者を開示する。これらのプローブの使用は、C.トラ
コマチス及びC.プシタシとTWARとの区別を可能に
する。下記により詳細に説明されているように、DNA
プローブは、TWARのDNA配列とハイブリダイズす
るそれらの能力、及びC.トラコマチス及びC.プシタ
シからのDNAとのハイブリダイゼーションのそれらの
欠失によって選択された。
【0032】簡単に言えば、完全な染色体DNAプロー
ブに関しては、TWARのDNAを、精製された基本体
から単離し、ニック−トランスレーションし、そしてド
ットブロットハイブリダイゼーションにおいてプローブ
として使用した。図3に示されるように、完全な染色体
DNAプローブを用いて、C.トラコマチス及びC.プ
シタシからTWAR生物体を同定し、そして区別するこ
とができる。手短に言えば、DNAフラグメントプロー
ブに関しては、TWAR株を適切な生物学的サンプルか
ら単離し、そしてそのDNAを精製した。制限エンドヌ
クレアーゼによる消化の後、DNAフラグメントの混合
物を、アガロースゲル電気泳動によって分離した。次
に、そのDNAフラグメントを、ブロッチング又は電気
溶離のいづれかによってニトロセルロース紙に移した。
次に、ハイブリダイゼーションプローブを添加し、相同
配列を検出した。
ブに関しては、TWARのDNAを、精製された基本体
から単離し、ニック−トランスレーションし、そしてド
ットブロットハイブリダイゼーションにおいてプローブ
として使用した。図3に示されるように、完全な染色体
DNAプローブを用いて、C.トラコマチス及びC.プ
シタシからTWAR生物体を同定し、そして区別するこ
とができる。手短に言えば、DNAフラグメントプロー
ブに関しては、TWAR株を適切な生物学的サンプルか
ら単離し、そしてそのDNAを精製した。制限エンドヌ
クレアーゼによる消化の後、DNAフラグメントの混合
物を、アガロースゲル電気泳動によって分離した。次
に、そのDNAフラグメントを、ブロッチング又は電気
溶離のいづれかによってニトロセルロース紙に移した。
次に、ハイブリダイゼーションプローブを添加し、相同
配列を検出した。
【0033】より詳しくは、約500bp,900bp,1
200bp,3200bp及び3800bpのサイズを有す
る、5種のクローンされたTWARのPstIDNAフ
ラグメントを、AR−39 DNAの遺伝子バンクから
精製し、そして染色体消化物をプローブするために使用
した。図2に示されるように、それぞれの場合のハイブ
リダイジングフラグメントは、すべてのTWAR単離体
に関して同じであった。さらに、活性は、C.トラコマ
チス又はC.プシタシに関しては観察されなかったが、
そのプローブは、TWAR特異性であった。
200bp,3200bp及び3800bpのサイズを有す
る、5種のクローンされたTWARのPstIDNAフ
ラグメントを、AR−39 DNAの遺伝子バンクから
精製し、そして染色体消化物をプローブするために使用
した。図2に示されるように、それぞれの場合のハイブ
リダイジングフラグメントは、すべてのTWAR単離体
に関して同じであった。さらに、活性は、C.トラコマ
チス又はC.プシタシに関しては観察されなかったが、
そのプローブは、TWAR特異性であった。
【0034】臨床的な用途に使用するために、クローン
され、そして精製されたTWARフラグメントを、ドッ
トブロットハイブリダイゼーションにおいてプローブと
して使用することができる。図4に示されるように、T
WAR,C.プシタシ及びC.トラコマチスの分解され
た基本体を試験する場合、前記フラグメントがTWAR
とのみ反応した。簡単に言えば、どちらかのタイプのプ
ローブに関しては、感染物質を含むと思われる患者から
の生物学的サンプルを破壊し、そのDNAを開放し、そ
してそのDNAを、物理的(加熱)及び化学的(塩、界
面活性剤)手段によってニトロセルロース上にスポット
として結合せしめる。
され、そして精製されたTWARフラグメントを、ドッ
トブロットハイブリダイゼーションにおいてプローブと
して使用することができる。図4に示されるように、T
WAR,C.プシタシ及びC.トラコマチスの分解され
た基本体を試験する場合、前記フラグメントがTWAR
とのみ反応した。簡単に言えば、どちらかのタイプのプ
ローブに関しては、感染物質を含むと思われる患者から
の生物学的サンプルを破壊し、そのDNAを開放し、そ
してそのDNAを、物理的(加熱)及び化学的(塩、界
面活性剤)手段によってニトロセルロース上にスポット
として結合せしめる。
【0035】ニトロセルロースに適用する前のサンプル
調製の方法は、そのサンプル源に依存するであろう。す
べての場合、そのニトロセルロースは、DNAの結合を
高めるために1Mの酢酸アンニモウム中でプレインキュ
ベートされる。多くのサンプルを処理し、そして濃縮す
るためには、それらのサンプルは、好ましくは、たとえ
ばBioDot Microfiltration装置
の使用によってニトロセルロースに適用される。DNA
が前に単離されている場合、サンプルは、0.3MのN
aCl中で10分間、煮沸され、そして2Mの冷酢酸ア
ンモニウムが添加される。100μlのサンプルを、そ
のドットブロット装置に適用し、そして真空下で濾過す
る。ウェルを2Mの酢酸アンモニウムにより洗浄し、そ
のウェルに結合している残留核酸を除去する。
調製の方法は、そのサンプル源に依存するであろう。す
べての場合、そのニトロセルロースは、DNAの結合を
高めるために1Mの酢酸アンニモウム中でプレインキュ
ベートされる。多くのサンプルを処理し、そして濃縮す
るためには、それらのサンプルは、好ましくは、たとえ
ばBioDot Microfiltration装置
の使用によってニトロセルロースに適用される。DNA
が前に単離されている場合、サンプルは、0.3MのN
aCl中で10分間、煮沸され、そして2Mの冷酢酸ア
ンモニウムが添加される。100μlのサンプルを、そ
のドットブロット装置に適用し、そして真空下で濾過す
る。ウェルを2Mの酢酸アンモニウムにより洗浄し、そ
のウェルに結合している残留核酸を除去する。
【0036】試験されるべきサンプルがEB又は培養さ
れた細菌から成る場合、培養物を分解し、そして染色体
DNAを0.5NのNaOH中で10分間、煮沸するこ
とによって変性し、HClの添加によって0.5NのH
Clの最終濃度に中和し、そして6×SSCの最終濃度
にする。臨床的な気道検体に関しては、サンプルをプロ
テイナーゼKにより処理し、SDSの添加によって溶解
し、フェノールにより抽出し、RNase処理し、フェ
ノールクロロホルム抽出し、そしてエタノール沈澱せし
める。次に、そのサンプルを上記のようにして煮沸する
ことによって変性する。サンプル適用の後、そのフィル
ターを80℃で2時間、インキュベートし、2〜4時
間、プレハイブリダイズし、そして標準方法(Maniatis
など., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Co
ld Spring Harbor Laboratory,1983)によってハイ
ブリダイズせしめる。
れた細菌から成る場合、培養物を分解し、そして染色体
DNAを0.5NのNaOH中で10分間、煮沸するこ
とによって変性し、HClの添加によって0.5NのH
Clの最終濃度に中和し、そして6×SSCの最終濃度
にする。臨床的な気道検体に関しては、サンプルをプロ
テイナーゼKにより処理し、SDSの添加によって溶解
し、フェノールにより抽出し、RNase処理し、フェ
ノールクロロホルム抽出し、そしてエタノール沈澱せし
める。次に、そのサンプルを上記のようにして煮沸する
ことによって変性する。サンプル適用の後、そのフィル
ターを80℃で2時間、インキュベートし、2〜4時
間、プレハイブリダイズし、そして標準方法(Maniatis
など., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Co
ld Spring Harbor Laboratory,1983)によってハイ
ブリダイズせしめる。
【0037】上記に簡単に記載された方法は、サンプル
調製のために適切な方法の単に代表にすぎないことは、
当業者にとって明らかであろう。本質的に、サンプル調
製の目的は、そのサンプルに関連するDNAを生成し、
そしてそのDNAを基質、たとえばニトロセルロース
に、生成の前、又は後のいづれかで添加することであ
る。これらの方法は、完全な染色体DNAプローブ又は
DNAフラグメントプローブの両者を調整するために使
用され得る。
調製のために適切な方法の単に代表にすぎないことは、
当業者にとって明らかであろう。本質的に、サンプル調
製の目的は、そのサンプルに関連するDNAを生成し、
そしてそのDNAを基質、たとえばニトロセルロース
に、生成の前、又は後のいづれかで添加することであ
る。これらの方法は、完全な染色体DNAプローブ又は
DNAフラグメントプローブの両者を調整するために使
用され得る。
【0038】患者のサンプルからの相補的DNAが存在
する場合、ラベルされたハイブリダイゼーションプロー
ブが結合されるであろう。そこで相補的DNAが存在し
ない場合、そのハイブリダイゼーションプローブは結合
されず、そして容易に洗浄し、除去され得る。非放射能
プローブが使用される場合、そのハイブリダイゼーショ
ンプローブ上のラベルに対する基質が、測定されるべき
反応のために必要であろう。ラベルが32Pである場合、
その測定は、写真フィルムの現像を含む。ラベルが酵素
の場合、その測定は、濃度計又は直接的な可視化のいづ
れかによって行なわれ得る。
する場合、ラベルされたハイブリダイゼーションプロー
ブが結合されるであろう。そこで相補的DNAが存在し
ない場合、そのハイブリダイゼーションプローブは結合
されず、そして容易に洗浄し、除去され得る。非放射能
プローブが使用される場合、そのハイブリダイゼーショ
ンプローブ上のラベルに対する基質が、測定されるべき
反応のために必要であろう。ラベルが32Pである場合、
その測定は、写真フィルムの現像を含む。ラベルが酵素
の場合、その測定は、濃度計又は直接的な可視化のいづ
れかによって行なわれ得る。
【0039】選択されたDNAプローブの感受性を決定
するために、前もって決定された濃度のTWARの種々
の希釈溶液を前記のようにして破壊し、そして濾過によ
りニトロセルロースに適用することができる。TWAR
の粒子の計数は、コンゴレッドによるネガティブ染色法
(Gerloff など., J. Infect, Dis. 123:429〜
432,1971)によって、又は電子顕微鏡(Wangな
ど., Am. J. Opthal.1443〜1454,1967)
によって行なわれ得る。
するために、前もって決定された濃度のTWARの種々
の希釈溶液を前記のようにして破壊し、そして濾過によ
りニトロセルロースに適用することができる。TWAR
の粒子の計数は、コンゴレッドによるネガティブ染色法
(Gerloff など., J. Infect, Dis. 123:429〜
432,1971)によって、又は電子顕微鏡(Wangな
ど., Am. J. Opthal.1443〜1454,1967)
によって行なわれ得る。
【0040】完全な染色体DNAプローブよりも本発明
に記載されたTWAR特異性フラグメントの1つの利点
は、それらの純度である。細胞培養物のDNAによるク
ラミジアの染色体DNAの少々の汚染は、みずから非特
異性バックグラウンド反応をもたらすであろう。この可
能性ある問題を迂回するためには、完全な染色体DNA
は、TWARの増殖を十分に支持するMcCoy細胞又
は他の非ヒト細胞系において増殖されるTWAR生物体
から調製され得る。
に記載されたTWAR特異性フラグメントの1つの利点
は、それらの純度である。細胞培養物のDNAによるク
ラミジアの染色体DNAの少々の汚染は、みずから非特
異性バックグラウンド反応をもたらすであろう。この可
能性ある問題を迂回するためには、完全な染色体DNA
は、TWARの増殖を十分に支持するMcCoy細胞又
は他の非ヒト細胞系において増殖されるTWAR生物体
から調製され得る。
【0041】クローン化されたフラグメントの追加の利
点は、完全な染色体DNAの単離のために多くの量のT
WAR生物体を増殖するのと比べて、これらの特異的な
配列の多くの量を単離する際、容易且つ安価であること
である。DNAプローブの単離のために本発明に記載さ
れた方法の他に、DNAプローブの感受性が、種々の手
段、たとえば(a)一本鎖のプローブの使用及び(b)
リボソームrRNA遺伝子の単離を通して改良され得
る。次の例は、例示的であって限定するものではない。
点は、完全な染色体DNAの単離のために多くの量のT
WAR生物体を増殖するのと比べて、これらの特異的な
配列の多くの量を単離する際、容易且つ安価であること
である。DNAプローブの単離のために本発明に記載さ
れた方法の他に、DNAプローブの感受性が、種々の手
段、たとえば(a)一本鎖のプローブの使用及び(b)
リボソームrRNA遺伝子の単離を通して改良され得
る。次の例は、例示的であって限定するものではない。
【0042】例 1.TWAR生物体の増殖及び単離 A.細胞培養物の単離 急性呼吸疾患を有する患者からの、トランスポート媒体
(スクロース/カリウム/グルタメート;SPG)中の
ど(咽頭)の検体を、C. C. Kuo など.(J. Infect. D
is. 125:665〜668,1972)からの変法
に従って培養した。それぞれの検体を、接種の前、DE
AE−デキストラン(30Oeg/ml)及びシクロヘキ
サアミド(0.5〜0.8Oeg/ml)により前処理さ
れたHeLa 229細胞の単層を含む3個のバイアル
上に接種した。
(スクロース/カリウム/グルタメート;SPG)中の
ど(咽頭)の検体を、C. C. Kuo など.(J. Infect. D
is. 125:665〜668,1972)からの変法
に従って培養した。それぞれの検体を、接種の前、DE
AE−デキストラン(30Oeg/ml)及びシクロヘキ
サアミド(0.5〜0.8Oeg/ml)により前処理さ
れたHeLa 229細胞の単層を含む3個のバイアル
上に接種した。
【0043】その細胞上の接種物を、室温で60分間、
2,200rpm で遠心分離した。次に、それらのバイア
ルを35℃で72時間インキュベートした(継代1)。
それらのバイアルの1つからの単層をメタノールにより
固定し、そして蛍光抗体により染色し、感染を示す封入
体について調べた。他の2個のバイアルは、継代2のた
めの接種物を供給するために利用され得る。
2,200rpm で遠心分離した。次に、それらのバイア
ルを35℃で72時間インキュベートした(継代1)。
それらのバイアルの1つからの単層をメタノールにより
固定し、そして蛍光抗体により染色し、感染を示す封入
体について調べた。他の2個のバイアルは、継代2のた
めの接種物を供給するために利用され得る。
【0044】B.卵培養物の単離 急性呼吸疾患を有する患者からの、SPGトランスポー
ト媒体中のど(咽頭)の検体を、J. T. Graystonなど.
(Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 103:596,19
60)の方法に従って、胎児性卵(6〜8日目)の卵黄
のう中に接種した。ストレプトマイシンを、濃度が接種
に基づいて卵当り10mgに達するまで、その検体に添加
した。それらの卵を、35℃でインキュベートし、そし
て毎日、明りに透かして調べた。
ト媒体中のど(咽頭)の検体を、J. T. Graystonなど.
(Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 103:596,19
60)の方法に従って、胎児性卵(6〜8日目)の卵黄
のう中に接種した。ストレプトマイシンを、濃度が接種
に基づいて卵当り10mgに達するまで、その検体に添加
した。それらの卵を、35℃でインキュベートし、そし
て毎日、明りに透かして調べた。
【0045】死んだ後、又は12〜13日間生存した
後、卵黄のうを収穫し、そしてMacchiavell
oの染色変法によって染色し、クラミジアの基本小体に
ついて調べた。フルオレセインに接合されたTWARモ
ノクローナル抗体が感染された卵黄のうを染色するため
に利用可能になる場合、そのTWAR生物体を、より一
層容易に見ることができる。Macchiavello
染色によってこれまで陰性であると思われたいくつかの
継代は、TWAR生物体を含むことが見出された。陽性
培養物は普通、続く継代に基づいて多くの数の基本小体
を示した。
後、卵黄のうを収穫し、そしてMacchiavell
oの染色変法によって染色し、クラミジアの基本小体に
ついて調べた。フルオレセインに接合されたTWARモ
ノクローナル抗体が感染された卵黄のうを染色するため
に利用可能になる場合、そのTWAR生物体を、より一
層容易に見ることができる。Macchiavello
染色によってこれまで陰性であると思われたいくつかの
継代は、TWAR生物体を含むことが見出された。陽性
培養物は普通、続く継代に基づいて多くの数の基本小体
を示した。
【0046】C.細胞培養中に増殖せしめるためのTW
AR株の適合 そのようにして得られた13種の単離体うち1つを除く
他のすべては、ほとんどのTWAR単離体をHeLa
229細胞培養バイアルにうまく適合せしめるために、
細胞培養物の接種の前、生物体(1又は2継代)の卵適
合物による、胎児性卵の卵黄のうへの初めの接種を必要
とした。
AR株の適合 そのようにして得られた13種の単離体うち1つを除く
他のすべては、ほとんどのTWAR単離体をHeLa
229細胞培養バイアルにうまく適合せしめるために、
細胞培養物の接種の前、生物体(1又は2継代)の卵適
合物による、胎児性卵の卵黄のうへの初めの接種を必要
とした。
【0047】TWAR生物体の一連の継代を、Kuo な
ど.(“Nongonococcal Urethritis and Relatecl Infe
ctions, ”328〜336ページ、1977)の変法に
従って、HeLa 229細胞のバイアル培養中で行な
った。細胞培養物の単離について記載されているように
して(例1.A)、バイアル中の3種の別々のHeLa
細胞単層を、それぞれの継代のために接種した。1つは
固定され、そして染色され、感染の進行が決定され、そ
して残る2種の単層は、バイアルから削り取られ、そし
て第1の継代について上記に説明されたように正確に再
接種された。少なくとも10回の連続した細胞培養継代
が適合せしめるためには必要とされた。50%以上の細
胞を感染せしめるために、その感染度が高まる場合、接
種されるバイアルの数を増し、大きな培養ボトル(32
オンスの処方用ボトル)中への接種のために感染された
細胞の20〜30個のバイアルを供給した。連続した継
代が、細胞の100%が感染されるまで、ボトル培養中
で続けられた。
ど.(“Nongonococcal Urethritis and Relatecl Infe
ctions, ”328〜336ページ、1977)の変法に
従って、HeLa 229細胞のバイアル培養中で行な
った。細胞培養物の単離について記載されているように
して(例1.A)、バイアル中の3種の別々のHeLa
細胞単層を、それぞれの継代のために接種した。1つは
固定され、そして染色され、感染の進行が決定され、そ
して残る2種の単層は、バイアルから削り取られ、そし
て第1の継代について上記に説明されたように正確に再
接種された。少なくとも10回の連続した細胞培養継代
が適合せしめるためには必要とされた。50%以上の細
胞を感染せしめるために、その感染度が高まる場合、接
種されるバイアルの数を増し、大きな培養ボトル(32
オンスの処方用ボトル)中への接種のために感染された
細胞の20〜30個のバイアルを供給した。連続した継
代が、細胞の100%が感染されるまで、ボトル培養中
で続けられた。
【0048】例 2.TWAR抗原の調製 32オンスの処方用ボトルへのTWAR株の適合の後、
その株を、HeLa229細胞の追加のボトル中で増殖
せしめることによって拡張した。ハンクス液20ml中に
おいてガラスビーズにより細胞単層をころがすことによ
って、生物体を収穫した。その細胞を音波処理により破
壊し、そしてHeLa細胞残骸を低速での遠心分離
(1,200rpm で10分間)により除去した。次に、
その生物体を、高速での遠心分離(16,000rpm で
20分間)によりペレット化した。
その株を、HeLa229細胞の追加のボトル中で増殖
せしめることによって拡張した。ハンクス液20ml中に
おいてガラスビーズにより細胞単層をころがすことによ
って、生物体を収穫した。その細胞を音波処理により破
壊し、そしてHeLa細胞残骸を低速での遠心分離
(1,200rpm で10分間)により除去した。次に、
その生物体を、高速での遠心分離(16,000rpm で
20分間)によりペレット化した。
【0049】TWAR基本体を、16,000rpm で4
0分間、30%Renografin懸濁液により緩衝
化し(これは汚染物の約60%を除去する)、そして次
に23,000rpm で90分間、30〜65%Reno
grafin直線グラジェントを通すことによって、ま
ず精製した。TWAR基本体の懸濁されたバンドは、9
9%以上精製された。使用される方法は、R. S. Stephe
nsなど.(J. Immunal. 128:1083,198
2)の変法であった。
0分間、30%Renografin懸濁液により緩衝
化し(これは汚染物の約60%を除去する)、そして次
に23,000rpm で90分間、30〜65%Reno
grafin直線グラジェントを通すことによって、ま
ず精製した。TWAR基本体の懸濁されたバンドは、9
9%以上精製された。使用される方法は、R. S. Stephe
nsなど.(J. Immunal. 128:1083,198
2)の変法であった。
【0050】例 3.免疫化の計画 BALB/cマウスを、ホルマリンにより殺された5×
107 個のTWAR生物体により、1日目に腹腔内投与
し、そして同様の接種物により1週間隔で、それから3
又は4回静脈内投与することによって免疫化した。脾臓
を、最後の免疫化の後、3日目に収穫した。
107 個のTWAR生物体により、1日目に腹腔内投与
し、そして同様の接種物により1週間隔で、それから3
又は4回静脈内投与することによって免疫化した。脾臓
を、最後の免疫化の後、3日目に収穫した。
【0051】例 4.ハイブリドーマの構成 NS−O骨髄腫細胞系を、融合工程に使用するためにMi
lsteinから得た。NS−O細胞は通常、熱不活性化され
た15%ウシ胎児血清、1mMのグルタミン及び1mMのピ
ルベートを含むRPMI 1640(GIBCO, Grand Isl
and, N.Y.)(“完全RPMI”として言及される)中で
増殖された。脾臓細胞懸濁液を、細かく切り、そして細
かいナイロン製スクリーンを通してその細胞を通すこと
によって調製した。白血球細胞懸濁液を、血清を含まな
いRPMIにより3度洗浄し;NS−O細胞を血清を含
まないRPMIにより1度洗浄した。
lsteinから得た。NS−O細胞は通常、熱不活性化され
た15%ウシ胎児血清、1mMのグルタミン及び1mMのピ
ルベートを含むRPMI 1640(GIBCO, Grand Isl
and, N.Y.)(“完全RPMI”として言及される)中で
増殖された。脾臓細胞懸濁液を、細かく切り、そして細
かいナイロン製スクリーンを通してその細胞を通すこと
によって調製した。白血球細胞懸濁液を、血清を含まな
いRPMIにより3度洗浄し;NS−O細胞を血清を含
まないRPMIにより1度洗浄した。
【0052】NS−O細胞及びリンパ球を、250×G
で10分間、遠心分離することによって、40%ポリエ
チレングリコール中で融合せしめた(1:4の割合又は
1:8の割合で)。その細胞を完全RMPI10体積に
より洗浄し、そして160×Gで5分間遠心分離した。
その上清液をアスピレートし、そしてその細胞を、HA
T培地により補充された完全RMPI(これは1.0×
10-4Mのヒポキサンチン、4.0×10-7Mのアミノ
プラリン及び1.6×10-5Mのチミジンを含む)によ
り2.5×106 個の細胞/mlに再懸濁した。
で10分間、遠心分離することによって、40%ポリエ
チレングリコール中で融合せしめた(1:4の割合又は
1:8の割合で)。その細胞を完全RMPI10体積に
より洗浄し、そして160×Gで5分間遠心分離した。
その上清液をアスピレートし、そしてその細胞を、HA
T培地により補充された完全RMPI(これは1.0×
10-4Mのヒポキサンチン、4.0×10-7Mのアミノ
プラリン及び1.6×10-5Mのチミジンを含む)によ
り2.5×106 個の細胞/mlに再懸濁した。
【0053】このハイブリッド細胞懸濁液を、3〜5週
才のBALB/cマウスからの胸線リンパ球と共に混合
し、2.5×106 個の胸線リンパ球/mlの最終濃度に
した。その最終細胞懸濁液を、96−ウェル マイクロ
テスト プレート(Costar,Cambridge, Mass)のウェル
中に接種した(200Oel体積中)。HAT培地によ
る追加の食餌(体積で50%の交換)を、5日及び8日
目に与えた。連続した操作、フィーデイング計画及び希
釈を限定することによるクローニングを、Stephensな
ど.(前記)によって記載されているようにして行なっ
た。
才のBALB/cマウスからの胸線リンパ球と共に混合
し、2.5×106 個の胸線リンパ球/mlの最終濃度に
した。その最終細胞懸濁液を、96−ウェル マイクロ
テスト プレート(Costar,Cambridge, Mass)のウェル
中に接種した(200Oel体積中)。HAT培地によ
る追加の食餌(体積で50%の交換)を、5日及び8日
目に与えた。連続した操作、フィーデイング計画及び希
釈を限定することによるクローニングを、Stephensな
ど.(前記)によって記載されているようにして行なっ
た。
【0054】例 5.ハイブリドーマクローンのスクリ
ーニング 培養流体中における抗−クラミジア抗体を、酵素結合さ
れた免疫吸着アッセイ(ELISA)によって検出し
た。抗体アッセイに関しては、リン酸緩衝溶液(PB
S,pH7.6)50Oelにおける1×105 個のクラ
ミジア生物体を、37℃で一晩インキュベートすること
によってマイクロテストプレートの個々のプレートによ
り吸着せしめた。対照プレートをマイクロタイタープレ
ートのウェルに感染されていないHeLa229細胞
(104 個の細胞/ウェル)を接触することによって調
整した。次の朝、それらのプレートのウェルを、PBS
中5%ウシ血清アルブミン(BSA)75μlと共に2
時間インキュベートすることによって非特異性タンパク
質の吸着から阻止した。その抗体アッセイは次の3段階
で行われた:
ーニング 培養流体中における抗−クラミジア抗体を、酵素結合さ
れた免疫吸着アッセイ(ELISA)によって検出し
た。抗体アッセイに関しては、リン酸緩衝溶液(PB
S,pH7.6)50Oelにおける1×105 個のクラ
ミジア生物体を、37℃で一晩インキュベートすること
によってマイクロテストプレートの個々のプレートによ
り吸着せしめた。対照プレートをマイクロタイタープレ
ートのウェルに感染されていないHeLa229細胞
(104 個の細胞/ウェル)を接触することによって調
整した。次の朝、それらのプレートのウェルを、PBS
中5%ウシ血清アルブミン(BSA)75μlと共に2
時間インキュベートすることによって非特異性タンパク
質の吸着から阻止した。その抗体アッセイは次の3段階
で行われた:
【0055】(1)培養流体50μlを、37℃で60
分間、抗原吸着ウェルのそれぞれの中でインキュベート
した。次に、結合されていない免疫グロブリンを、1%
BSAを含むPBSにより3度、洗浄することによって
ウェルから除去した。 (2)ペルオキシダーゼ接合の抗−マウス免疫グロブリ
ン(50μl)を、それぞれのウェルに添加し、そして
37℃で60分間インキュベートした。残留する非結合
性ペルオキシダーゼ接合体を、PBSにより3度、洗浄
することによって除去した。 (3)その免疫反応を、基質にO−フェニレンジアミン
及びH2 O2 を添加することによって検出し、そして色
素反応を定量化した。ELISAによって陽性であるこ
とが示された培養上清液をマイクロ−IF技法で試験す
ることによってさらに抗体特異性を、決定した(例6を
参照のこと)。
分間、抗原吸着ウェルのそれぞれの中でインキュベート
した。次に、結合されていない免疫グロブリンを、1%
BSAを含むPBSにより3度、洗浄することによって
ウェルから除去した。 (2)ペルオキシダーゼ接合の抗−マウス免疫グロブリ
ン(50μl)を、それぞれのウェルに添加し、そして
37℃で60分間インキュベートした。残留する非結合
性ペルオキシダーゼ接合体を、PBSにより3度、洗浄
することによって除去した。 (3)その免疫反応を、基質にO−フェニレンジアミン
及びH2 O2 を添加することによって検出し、そして色
素反応を定量化した。ELISAによって陽性であるこ
とが示された培養上清液をマイクロ−IF技法で試験す
ることによってさらに抗体特異性を、決定した(例6を
参照のこと)。
【0056】例 6.モノクローナル抗体の産生 同系BALB/cマウス中への1〜5×106 個のハイ
ブリッド細胞の腹腔内接種が、2〜3週間内で触診でき
る腫瘍(ハイブリドーマ)を誘発した。腫瘍誘発を確か
めるために、同系の宿主が、Pristane(2,6,10,
14−テトラメチルペンタデカン、Aldrich Chemical C
o., Milwaukee, Wis.)0.5mlの腹腔内接種によって2
週間前に感作された。ほとんどの場合(>90%)、腹
腔内に移植されたハイブリドーマの前進的増殖が、腹水
(1.0〜0.5ml/マウス)の産生によって達成され
た。
ブリッド細胞の腹腔内接種が、2〜3週間内で触診でき
る腫瘍(ハイブリドーマ)を誘発した。腫瘍誘発を確か
めるために、同系の宿主が、Pristane(2,6,10,
14−テトラメチルペンタデカン、Aldrich Chemical C
o., Milwaukee, Wis.)0.5mlの腹腔内接種によって2
週間前に感作された。ほとんどの場合(>90%)、腹
腔内に移植されたハイブリドーマの前進的増殖が、腹水
(1.0〜0.5ml/マウス)の産生によって達成され
た。
【0057】その腹水中に含まれるモノクローナル抗体
のアイソタイプを、モノクローナル抗体−スクリーンシ
ステム(Zymed Laboratories, San Francisco, Calif.)
を用いるELISAによって決定した。使用の前、腹水
を、マイクロ−IF技法によって特定の抗体活性につい
て試験した。
のアイソタイプを、モノクローナル抗体−スクリーンシ
ステム(Zymed Laboratories, San Francisco, Calif.)
を用いるELISAによって決定した。使用の前、腹水
を、マイクロ−IF技法によって特定の抗体活性につい
て試験した。
【0058】マイクロ−IFアッセイに関しては、培養
流体又は腹水を、顕微鏡スライド上に置かれたクラミジ
ア基本体抗原と湿潤室において、37℃で30分間、反
応せしめた。反応の後、そのスライドをPBSにより5
度洗浄し、そして空気乾燥せしめた。フルオレセイン接
合の抗−マウス免疫グロブリンを添加し、そして湿潤室
において37℃で30分間インキュベートした。インキ
ュベートの後、そのスライドを蒸留水により5度洗浄せ
しめ、そして空気乾燥せしめた。FA封入流体の一滴を
添加し、そしてカバースリップをそのスライド上に置い
た。その反応はFA−顕微鏡下で観察された。封入体の
染色に関しては、感染されたHeLa細胞を無水メタノ
ール中において10分間、固定し、そしてTWAR特異
性抗体活性について検定した。
流体又は腹水を、顕微鏡スライド上に置かれたクラミジ
ア基本体抗原と湿潤室において、37℃で30分間、反
応せしめた。反応の後、そのスライドをPBSにより5
度洗浄し、そして空気乾燥せしめた。フルオレセイン接
合の抗−マウス免疫グロブリンを添加し、そして湿潤室
において37℃で30分間インキュベートした。インキ
ュベートの後、そのスライドを蒸留水により5度洗浄せ
しめ、そして空気乾燥せしめた。FA封入流体の一滴を
添加し、そしてカバースリップをそのスライド上に置い
た。その反応はFA−顕微鏡下で観察された。封入体の
染色に関しては、感染されたHeLa細胞を無水メタノ
ール中において10分間、固定し、そしてTWAR特異
性抗体活性について検定した。
【0059】腹水内に含まれるモノクローナル抗体を、
プロテインA−セファロースカラム(Pharmacia Fine C
hemicals, Uppsala, Sweden)上でアフィニティ精製し
た。フルオレセインイソチオシアネート−接合のモノク
ローナル抗体を、Goding(J. Immunol. Meth. 13:2
15,1976)の方法によって調製し、そして直接的
な免疫蛍光アッセイのための滴定により決定されるよう
に、適切な希釈度で使用した。接合されなかったモノク
ローナル抗体を、間接的な免疫蛍光技法のために1:1
00の希釈度で通常使用した。
プロテインA−セファロースカラム(Pharmacia Fine C
hemicals, Uppsala, Sweden)上でアフィニティ精製し
た。フルオレセインイソチオシアネート−接合のモノク
ローナル抗体を、Goding(J. Immunol. Meth. 13:2
15,1976)の方法によって調製し、そして直接的
な免疫蛍光アッセイのための滴定により決定されるよう
に、適切な希釈度で使用した。接合されなかったモノク
ローナル抗体を、間接的な免疫蛍光技法のために1:1
00の希釈度で通常使用した。
【0060】例 7.診断アッセイ A.塗抹技法 C.トラコマチスに対するモノクローナル抗体を、臨床
的な検体からのスミアーの直接的な蛍光抗体(FA)ア
ッセイのためにこれまで使用して来た。C.プシタシの
菌株に対して特異的なフルオレセイン接合のモノクロー
ナル抗体を、呼吸器検体の同様の直接的FAアッセイに
使用して来た。簡単には、咽頭スワブを、2つの前もっ
て印を付けられた円形の部分(直径5mm) 上のガラスス
ライド上でころがし、そして次に、そのスライドを95
%エタノール中に10〜30分間、浸した。そのスライ
ドを空気中で乾燥せしめた後、蛍光モノクローナル抗体
接合体を、その検体部分に適用した。
的な検体からのスミアーの直接的な蛍光抗体(FA)ア
ッセイのためにこれまで使用して来た。C.プシタシの
菌株に対して特異的なフルオレセイン接合のモノクロー
ナル抗体を、呼吸器検体の同様の直接的FAアッセイに
使用して来た。簡単には、咽頭スワブを、2つの前もっ
て印を付けられた円形の部分(直径5mm) 上のガラスス
ライド上でころがし、そして次に、そのスライドを95
%エタノール中に10〜30分間、浸した。そのスライ
ドを空気中で乾燥せしめた後、蛍光モノクローナル抗体
接合体を、その検体部分に適用した。
【0061】そのスライドを湿潤室で37℃で30分間
インキュベートし、蒸留水を含む6個のジャーを通して
すばやく浸し、そして乾燥せしめた。Bacto 蛍光抗体封
入液体(Difico Laboratories, Detroit, Mich.)の一滴
及びカバースリップを、そのスライドに適用し、次にエ
ピフルオレセンス顕微鏡(Carl Zeiss, Oberkochen,Wes
t Germany) により油含浸下で500倍で試験した。ス
ミアーの全部分を試験した。スライド上の調査結果は、
少なくとも5個の蛍光性基本体が検体中に見出される場
合、TWAR株に関しては陽性として考慮された。陰性
の調査結果を有するスライドを、5分間読み取った。T
WAR単離物を有する7人の患者のうち6人からの咽の
スワブスミアーを、蛍光TWARモノクローナル抗体に
より染色した。4人の患者において、クラミジアの典型
的な基本体が示された。
インキュベートし、蒸留水を含む6個のジャーを通して
すばやく浸し、そして乾燥せしめた。Bacto 蛍光抗体封
入液体(Difico Laboratories, Detroit, Mich.)の一滴
及びカバースリップを、そのスライドに適用し、次にエ
ピフルオレセンス顕微鏡(Carl Zeiss, Oberkochen,Wes
t Germany) により油含浸下で500倍で試験した。ス
ミアーの全部分を試験した。スライド上の調査結果は、
少なくとも5個の蛍光性基本体が検体中に見出される場
合、TWAR株に関しては陽性として考慮された。陰性
の調査結果を有するスライドを、5分間読み取った。T
WAR単離物を有する7人の患者のうち6人からの咽の
スワブスミアーを、蛍光TWARモノクローナル抗体に
より染色した。4人の患者において、クラミジアの典型
的な基本体が示された。
【0062】B.培養技法 フルオレセイン接合のTWAR株−特異性モノクローナ
ル抗体を使用して、初期HeLa229細胞培養継代に
おけるTWAR単離体を同定した。その細胞培養単離技
法は、例1.A.に記載されている。TWAR株−特異
性モノクローナル抗体による直接的な蛍光抗体(FA)
染色は、TWAR単離体の同定をひじょうに促進せし
め、そしてこれらの単離体の直接的な継代を可能にし
た。TWAR単離体のそれぞれは、封入体の直接的なF
A染色によって一次HeLa229細胞培養継代中に同
定された。
ル抗体を使用して、初期HeLa229細胞培養継代に
おけるTWAR単離体を同定した。その細胞培養単離技
法は、例1.A.に記載されている。TWAR株−特異
性モノクローナル抗体による直接的な蛍光抗体(FA)
染色は、TWAR単離体の同定をひじょうに促進せし
め、そしてこれらの単離体の直接的な継代を可能にし
た。TWAR単離体のそれぞれは、封入体の直接的なF
A染色によって一次HeLa229細胞培養継代中に同
定された。
【0063】C.血清学的技法 正常な3%卵黄のうホモジネートと混合された(スライ
ド上に抗原の局在化及び付着を助けるために)TWAR
抗原を、顕微鏡のスライド上に点在せしめ、空気乾燥せ
しめ、アセトンにより15分間、固定し、そして空気乾
燥せしめた。連続した2倍希釈の血清又は体液(たとえ
ば涙)を、抗原上に適用し、そして、30℃で30分
間、湿潤室でインキュベートした。このアッセイ内で、
その流体は、クラミジア基本小体抗原と反応された。
ド上に抗原の局在化及び付着を助けるために)TWAR
抗原を、顕微鏡のスライド上に点在せしめ、空気乾燥せ
しめ、アセトンにより15分間、固定し、そして空気乾
燥せしめた。連続した2倍希釈の血清又は体液(たとえ
ば涙)を、抗原上に適用し、そして、30℃で30分
間、湿潤室でインキュベートした。このアッセイ内で、
その流体は、クラミジア基本小体抗原と反応された。
【0064】反応の後、そのスライドをPBSにより5
度洗浄し、そして空気乾燥せしめた。フルオレセイン接
合の抗−マウス免疫グロブリンを添加し、そして37℃
で30分間、湿潤室でインキュベートせしめた。インキ
ュベートの後、スライドを蒸留水により5度洗浄し、そ
して空気乾燥せしめた。FA封入流体の一滴を添加し、
そしてカバースリップをそのスライド上に置いた。その
反応をFA−顕微鏡下で観察した。封入体の染色のため
には、感染されたHeLa細胞を無水メタノール中にお
いて10分間固定し、そしてTWAR−特異性抗体活性
についてアッセイした。第2表は、世界の7つの異なっ
た領域からの成人の血清中に存在する、高い頻度のTW
AR抗体を示す。さらに、抗体は、女性よりも男性にお
いてより頻繁に存在することが見出された。
度洗浄し、そして空気乾燥せしめた。フルオレセイン接
合の抗−マウス免疫グロブリンを添加し、そして37℃
で30分間、湿潤室でインキュベートせしめた。インキ
ュベートの後、スライドを蒸留水により5度洗浄し、そ
して空気乾燥せしめた。FA封入流体の一滴を添加し、
そしてカバースリップをそのスライド上に置いた。その
反応をFA−顕微鏡下で観察した。封入体の染色のため
には、感染されたHeLa細胞を無水メタノール中にお
いて10分間固定し、そしてTWAR−特異性抗体活性
についてアッセイした。第2表は、世界の7つの異なっ
た領域からの成人の血清中に存在する、高い頻度のTW
AR抗体を示す。さらに、抗体は、女性よりも男性にお
いてより頻繁に存在することが見出された。
【0065】
【表2】
【0066】例 8. TWARのDNAの特徴化を通して、この例は、そのT
WAR生物体が、C.トラコマチス及びC.プシタシと
異なることを示す。 A.クラミジア株:研究されたクラミジア株は、 (1)TWAR:TW−183,AR−39,AR−2
31,AR−277,AR−388,AR−427,A
R−458及びLR−65(2,3); (2)C.プシタシ:6BC、骨髄肺炎(Mn)、ネコ
肺炎(FP)、テンジクネズミ封入体結膜炎(GPI
C)及び羊流産(OA)、及び (3)C.トラコマチス:B/TW−5/OT,D/U
W−3/Cx及びL2/434/Buを含んだ。すべて
のTWAR株は、1985年シアトルから得られた咽頭
単離体であった。但し、TW−183(これは、196
5年タイワンの子供の結膜炎から単離された)を除く。
すべてのクラミジア株は、HeLa229細胞培養物中
での増殖に適合され、そしてRenografinの直線グラジェ
ントを通して精製された。
WAR生物体が、C.トラコマチス及びC.プシタシと
異なることを示す。 A.クラミジア株:研究されたクラミジア株は、 (1)TWAR:TW−183,AR−39,AR−2
31,AR−277,AR−388,AR−427,A
R−458及びLR−65(2,3); (2)C.プシタシ:6BC、骨髄肺炎(Mn)、ネコ
肺炎(FP)、テンジクネズミ封入体結膜炎(GPI
C)及び羊流産(OA)、及び (3)C.トラコマチス:B/TW−5/OT,D/U
W−3/Cx及びL2/434/Buを含んだ。すべて
のTWAR株は、1985年シアトルから得られた咽頭
単離体であった。但し、TW−183(これは、196
5年タイワンの子供の結膜炎から単離された)を除く。
すべてのクラミジア株は、HeLa229細胞培養物中
での増殖に適合され、そしてRenografinの直線グラジェ
ントを通して精製された。
【0067】B.クラミジアDNAの単離:クラミジア
のDNAを、C.トラコマチスのために前に記載したよ
うにして単離した(Stephensなど., Infect. Immun.
47:713〜718,1985)。基本的には、精製
された基本体を、37℃で1時間、プロテイナーゼK
(64μg/ml) により処理し、そして1%SDS中に
溶解した。フェノールによる抽出の後、水性層を37℃
で30分間、RNase(50μg/ml) により処理
し、フェノール/クロロホルムにより抽出し、そしてエ
タノールにより沈澱せしめた。
のDNAを、C.トラコマチスのために前に記載したよ
うにして単離した(Stephensなど., Infect. Immun.
47:713〜718,1985)。基本的には、精製
された基本体を、37℃で1時間、プロテイナーゼK
(64μg/ml) により処理し、そして1%SDS中に
溶解した。フェノールによる抽出の後、水性層を37℃
で30分間、RNase(50μg/ml) により処理
し、フェノール/クロロホルムにより抽出し、そしてエ
タノールにより沈澱せしめた。
【0068】C. プラスミドのスクリーニング:試験さ
れた8種のTWAR単離体は、アガロースゲル電気泳動
によって決定される場合、それぞれ7.3及び6.2Kb
p のプラスミドを含む、C.トラコマチス及びC.プシ
タシ対照と比べて、明確なプラスミドDNAを含まなか
った(Weiss など., Infect. Immum. 2:244〜2
48,1970)。
れた8種のTWAR単離体は、アガロースゲル電気泳動
によって決定される場合、それぞれ7.3及び6.2Kb
p のプラスミドを含む、C.トラコマチス及びC.プシ
タシ対照と比べて、明確なプラスミドDNAを含まなか
った(Weiss など., Infect. Immum. 2:244〜2
48,1970)。
【0069】D.制限エンドヌクレアーゼ分析及びハイ
ブリダイゼーション:使用される制限酵素は、BamH
I,BstEII, DpnI,EcoRI,HindIII,
MboI, MspI,PstI,San3A、及びS
stIであった。すべての技法は、高い緊縮条件下で行
われたハイブリダイゼーションによる標準法によって行
われた(Kingsburg, J. Bacteriol. 98:1400〜
1401,1969)。制限エンドヌクレアーゼ分析
は、お互い及び2種のクラミジアの株とTWAR単離体
との比較のために使用された。使用されるそれぞれの制
限酵素により、TWAR単離体は、トラホーム及びC.
トラコマチスのLGVバイオバーから容易に識別され、
そして5種の異なるC.プシタシの株が試験された。こ
の方法の分析の範囲によれば、TWAR単離体の結合パ
ターンが、使用される酵素のうち8種と同一であった。
ブリダイゼーション:使用される制限酵素は、BamH
I,BstEII, DpnI,EcoRI,HindIII,
MboI, MspI,PstI,San3A、及びS
stIであった。すべての技法は、高い緊縮条件下で行
われたハイブリダイゼーションによる標準法によって行
われた(Kingsburg, J. Bacteriol. 98:1400〜
1401,1969)。制限エンドヌクレアーゼ分析
は、お互い及び2種のクラミジアの株とTWAR単離体
との比較のために使用された。使用されるそれぞれの制
限酵素により、TWAR単離体は、トラホーム及びC.
トラコマチスのLGVバイオバーから容易に識別され、
そして5種の異なるC.プシタシの株が試験された。こ
の方法の分析の範囲によれば、TWAR単離体の結合パ
ターンが、使用される酵素のうち8種と同一であった。
【0070】E.サザン ハイブリダイゼーション:T
WAR単離体の間の関係及び他のクラミジアとの関係を
さらに調査するために、約500bp, 900bp,120
0bp,3200bp及び3800bpのサイズの5種のラン
ダムなTWARのDNAフラグメントを、AR−39の
DNAの遺伝子バンクから精製し、そして染色体消化物
をプローブするために使用した。図2に示されるよう
に、3. 8kbp(図2のA)のTWARフラグメント又は
3.2kbp(図2のB)のフラグメントが、それぞれMs
pI又はHindIII により消化されたクラミジアDN
Aのプローブとして使用される場合、それぞれの場合に
おいてハイブリダイズするフラグメントは、すべてのT
WAR単離体のために同じであった。さらに、反応性は
試験されたC.トラコマチス又はC.プシタシに関して
観察されなかったが、両プローブはTWAR特異性であ
った。同じ結果が他の3種のプローブに関して得られ
た。
WAR単離体の間の関係及び他のクラミジアとの関係を
さらに調査するために、約500bp, 900bp,120
0bp,3200bp及び3800bpのサイズの5種のラン
ダムなTWARのDNAフラグメントを、AR−39の
DNAの遺伝子バンクから精製し、そして染色体消化物
をプローブするために使用した。図2に示されるよう
に、3. 8kbp(図2のA)のTWARフラグメント又は
3.2kbp(図2のB)のフラグメントが、それぞれMs
pI又はHindIII により消化されたクラミジアDN
Aのプローブとして使用される場合、それぞれの場合に
おいてハイブリダイズするフラグメントは、すべてのT
WAR単離体のために同じであった。さらに、反応性は
試験されたC.トラコマチス又はC.プシタシに関して
観察されなかったが、両プローブはTWAR特異性であ
った。同じ結果が他の3種のプローブに関して得られ
た。
【0071】F.プローブとして完全な染色体DNAを
用いるドットブロットハイブリダイゼーションを用いて
のDNA相同体の研究:C.トラコマチス及びC.プシ
タシに対するTWARの関係を決定するために、ドット
ブロット分析が、プローブとして完全な染色体DNAを
用いて行われた。簡単に言えば、精製されたEBのDN
A0.2〜5μgを、0.3MのNaCl中で10分間
煮沸した。続いて、2.0Mの酢酸アンモニウムを添加
し、100μlの最終体積にした。サンプルを、Bio-Do
t Microfiltration 装置(Bio-Kad, Richmond, Calif.)
の使用によってニトロセルロース(Trans-Blot, Bio-Ka
d, Richmond, Calif.)に適用した。
用いるドットブロットハイブリダイゼーションを用いて
のDNA相同体の研究:C.トラコマチス及びC.プシ
タシに対するTWARの関係を決定するために、ドット
ブロット分析が、プローブとして完全な染色体DNAを
用いて行われた。簡単に言えば、精製されたEBのDN
A0.2〜5μgを、0.3MのNaCl中で10分間
煮沸した。続いて、2.0Mの酢酸アンモニウムを添加
し、100μlの最終体積にした。サンプルを、Bio-Do
t Microfiltration 装置(Bio-Kad, Richmond, Calif.)
の使用によってニトロセルロース(Trans-Blot, Bio-Ka
d, Richmond, Calif.)に適用した。
【0072】濾過の前、そのニトロセルロースを、1M
の酢酸アンモニウム中で洗浄し、DNA付着を高めた。
そのニトロセルロースを、前に記載したようにプレハイ
ブリダイズする前及び後で、80℃で2時間、ベークし
た。ニック−トランスレートされた完全な染色体クラミ
ジアDNAを、煮沸し、そして続いて急速な冷却によっ
て変性し、そしてこれらのハイブリダイゼーション実験
においてプローブとして使用した。相同性%を大まかに
定量化するために、前記ニトロセルロースを、シンチレ
ーション計数のために、Omnifluor (Dnpont, Boston, M
ass.) 中に懸濁された個々のドットに切断した。
の酢酸アンモニウム中で洗浄し、DNA付着を高めた。
そのニトロセルロースを、前に記載したようにプレハイ
ブリダイズする前及び後で、80℃で2時間、ベークし
た。ニック−トランスレートされた完全な染色体クラミ
ジアDNAを、煮沸し、そして続いて急速な冷却によっ
て変性し、そしてこれらのハイブリダイゼーション実験
においてプローブとして使用した。相同性%を大まかに
定量化するために、前記ニトロセルロースを、シンチレ
ーション計数のために、Omnifluor (Dnpont, Boston, M
ass.) 中に懸濁された個々のドットに切断した。
【0073】すべての実験において、ほとんどのクラミ
ジアDNA調整物は少量のHeLaのDNA汚染物を含
むけれどもHeLaのDNAを対照としてスポット化し
た。TWAR株AR−39,C.トラコマチスセロバー
D及びC.プシタシ株6BC,FP, OA及びMnの完
全な染色体DNAをニック−トランスレートし、そして
種々の単離物の変性された染色体DNAを含むドットブ
ロットのプローブとして使用した。図3に示されるよう
に、2種のC.トラコマチスバイオバーも5種のC.プ
シタシ株のいづれも、AR−39プローブに対して有意
な相同性を示さなかった。他方、すべてのTWAR単離
体は、強いハイブリダイゼーションシグナルを示した。
TW−183がプローブとして使用される場合、類似す
る結果が得られた。相反する実験がC.トラコマチス又
はC.プシタシのDNAをプローブとして使用して行わ
れる場合、バックグラウンド上の反応性が、いづれかの
TWAR単離体により示された(データは示されていな
い)。
ジアDNA調整物は少量のHeLaのDNA汚染物を含
むけれどもHeLaのDNAを対照としてスポット化し
た。TWAR株AR−39,C.トラコマチスセロバー
D及びC.プシタシ株6BC,FP, OA及びMnの完
全な染色体DNAをニック−トランスレートし、そして
種々の単離物の変性された染色体DNAを含むドットブ
ロットのプローブとして使用した。図3に示されるよう
に、2種のC.トラコマチスバイオバーも5種のC.プ
シタシ株のいづれも、AR−39プローブに対して有意
な相同性を示さなかった。他方、すべてのTWAR単離
体は、強いハイブリダイゼーションシグナルを示した。
TW−183がプローブとして使用される場合、類似す
る結果が得られた。相反する実験がC.トラコマチス又
はC.プシタシのDNAをプローブとして使用して行わ
れる場合、バックグラウンド上の反応性が、いづれかの
TWAR単離体により示された(データは示されていな
い)。
【0074】例 9.TWAR−特異性プローブを使用
するアッセイ 上記及び図3及び図4に示されるように、クローンさ
れ、精製されたTWARフラグメントが、TWAR、
C.プシタシ及びC.トラコマチスの分解された基本小
体のドットブロットにおいてプローブとして使用される
場合、試験された3種のフラグメント(900bp,12
00bp及び3200bp)は、TWARとのみ反応した。
上記に示されるように、DNAプローブの感受性は、
(a)一本鎖のプローブの使用;及び(b)リボソーム
rRNA遺伝子の単離を通して改良され得る。
するアッセイ 上記及び図3及び図4に示されるように、クローンさ
れ、精製されたTWARフラグメントが、TWAR、
C.プシタシ及びC.トラコマチスの分解された基本小
体のドットブロットにおいてプローブとして使用される
場合、試験された3種のフラグメント(900bp,12
00bp及び3200bp)は、TWARとのみ反応した。
上記に示されるように、DNAプローブの感受性は、
(a)一本鎖のプローブの使用;及び(b)リボソーム
rRNA遺伝子の単離を通して改良され得る。
【0075】一本鎖のプローブの改良 二本鎖DNAプローブは、プローブの再アニーリングに
より効率的にハイブリダイズしないので、ハイブリダイ
ゼーションのために利用できるプローブの濃度は低めら
れる。従って、ハイブリダイゼーションにおいて一本鎖
のプローブを用いることによってプローブの感受性を高
めることができる。この方法の主な制限は、十分に高い
比活性へのその一本鎖のラベリングである。この問題
は、DNAプローブの一本鎖挿入体を含む二本鎖ベクタ
ーをもたらす条件を用いることによって避けられ得る
(Arrand, Nuclcic Acid Hybridization:A Practical
Approach中の“Preparation of Nucleic Acid Probes,
”17〜45ページ、Oxford,Press, Oxford, Englan
d, 1985)。
より効率的にハイブリダイズしないので、ハイブリダイ
ゼーションのために利用できるプローブの濃度は低めら
れる。従って、ハイブリダイゼーションにおいて一本鎖
のプローブを用いることによってプローブの感受性を高
めることができる。この方法の主な制限は、十分に高い
比活性へのその一本鎖のラベリングである。この問題
は、DNAプローブの一本鎖挿入体を含む二本鎖ベクタ
ーをもたらす条件を用いることによって避けられ得る
(Arrand, Nuclcic Acid Hybridization:A Practical
Approach中の“Preparation of Nucleic Acid Probes,
”17〜45ページ、Oxford,Press, Oxford, Englan
d, 1985)。
【0076】pUCベクターにおけるTWAR遺伝子バ
ンクの初期構造は、一本鎖のバクテリオファージM13
mp18の複製型(RF)へのサブクローニングを促進す
る。なぜならば、これらのベクターは、同じlacZ′
/複数クローニング部位を共有するからである。M13
“偶数の”ファージベクター(たとえば、M13mp1
8)が、pBB322由来の配列(前記)にハイブリダ
イズするであろうラベルされたプローブの産生を妨げる
ために、奇数シリーズ(たとえば、M13mp18)の代
わりに使用するために推薦される。この一本鎖DNAプ
ローブは、Hu及びMessing(Gene17:271〜27
7,1983)の方法によって調製され得る。このプロ
ーブを放射性ラベルするために、市販されている一般の
プローブプライマーを使用することができる。
ンクの初期構造は、一本鎖のバクテリオファージM13
mp18の複製型(RF)へのサブクローニングを促進す
る。なぜならば、これらのベクターは、同じlacZ′
/複数クローニング部位を共有するからである。M13
“偶数の”ファージベクター(たとえば、M13mp1
8)が、pBB322由来の配列(前記)にハイブリダ
イズするであろうラベルされたプローブの産生を妨げる
ために、奇数シリーズ(たとえば、M13mp18)の代
わりに使用するために推薦される。この一本鎖DNAプ
ローブは、Hu及びMessing(Gene17:271〜27
7,1983)の方法によって調製され得る。このプロ
ーブを放射性ラベルするために、市販されている一般の
プローブプライマーを使用することができる。
【0077】このプライマーは、ベクターDNAの合成
を指図し、そして制限された濃度の放射性前駆体の存在
下において、そのプライマー付加部分は、一本鎖DNA
プローブ挿入体を含む二本鎖ベクター(M13)をもた
らす。M13mpバクテリオファージのRF型の単離、M
13中へのpUCサブクローニングのための組換え体の
サブクローニング及びM13配列の選択的合成(及びラ
ベリング)のためのすべての方法は、Messing(Meth. En
zymol. 101:20〜79,1983)によって記載
されているようにして、標準方法によって行われ得る。
このプローブがサザンハイブリダイゼーションに使用さ
れる場合、それはハイブリダイゼーションの前、変性さ
れない。
を指図し、そして制限された濃度の放射性前駆体の存在
下において、そのプライマー付加部分は、一本鎖DNA
プローブ挿入体を含む二本鎖ベクター(M13)をもた
らす。M13mpバクテリオファージのRF型の単離、M
13中へのpUCサブクローニングのための組換え体の
サブクローニング及びM13配列の選択的合成(及びラ
ベリング)のためのすべての方法は、Messing(Meth. En
zymol. 101:20〜79,1983)によって記載
されているようにして、標準方法によって行われ得る。
このプローブがサザンハイブリダイゼーションに使用さ
れる場合、それはハイブリダイゼーションの前、変性さ
れない。
【0078】リボソームRNA遺伝子の単離。 DNAプローブの感受性を高めるためのもう1つの方法
は、複数コピー配列を認識するDNAプローブを使用す
ることである。リボソームRNAに対して特異的なクロ
ーン化されたDNAの使用は、細胞当りの目標分子(リ
ボソーム)の多くの数によって、1000倍まで検出を
高めるための手段として記録されている(Edelstein,
J. Clin. Microbiol. 22:425〜427,198
6;Kingsbury, Rapid Detection and Identification
of Infections Agents, 91〜95ページ、Academic P
ress, N.Y., 1985;Palmer及びFalkow, Microbiolo
gy1986,91〜95ページ、American Society for
Microbiology, Washington, D.C.,1986)。1つの
そのような方法が下記に説明される。
は、複数コピー配列を認識するDNAプローブを使用す
ることである。リボソームRNAに対して特異的なクロ
ーン化されたDNAの使用は、細胞当りの目標分子(リ
ボソーム)の多くの数によって、1000倍まで検出を
高めるための手段として記録されている(Edelstein,
J. Clin. Microbiol. 22:425〜427,198
6;Kingsbury, Rapid Detection and Identification
of Infections Agents, 91〜95ページ、Academic P
ress, N.Y., 1985;Palmer及びFalkow, Microbiolo
gy1986,91〜95ページ、American Society for
Microbiology, Washington, D.C.,1986)。1つの
そのような方法が下記に説明される。
【0079】合計のRANが16sのrRNAの単離の
ために、最適な時間での後接種の決定のために感染せし
めた後、種々の時間でTWAR培養物から単離される。
rRNAは、Kirby (Kirk など., Bioch. J.104:2
58〜262,1967;JOhnson, Method in Microbi
olgy 18;33〜77,1986)の変法によって単
離され得る。この方法は、DNA,mRNAを実質的に
含まないが、しかしひじょうに少量のtRNAを含む細
菌性rRNAの単離をもたらす(Johnson 、前記) 。R
Naseを含まない緩衝液を得るために、ジエチルピロ
カーボネート(0.2%)を、1時間水溶液に添加し、
そして続いてオートクレーブ処理する。ガラス器具は、
乾燥加熱オーブン中で焼くことによって、RNaseを
含まないようにされ得る。
ために、最適な時間での後接種の決定のために感染せし
めた後、種々の時間でTWAR培養物から単離される。
rRNAは、Kirby (Kirk など., Bioch. J.104:2
58〜262,1967;JOhnson, Method in Microbi
olgy 18;33〜77,1986)の変法によって単
離され得る。この方法は、DNA,mRNAを実質的に
含まないが、しかしひじょうに少量のtRNAを含む細
菌性rRNAの単離をもたらす(Johnson 、前記) 。R
Naseを含まない緩衝液を得るために、ジエチルピロ
カーボネート(0.2%)を、1時間水溶液に添加し、
そして続いてオートクレーブ処理する。ガラス器具は、
乾燥加熱オーブン中で焼くことによって、RNaseを
含まないようにされ得る。
【0080】精製された粒子を、遠心分離により収穫
し、dH2 O中に懸濁し、そして10%ナフタレンジス
ルホーネート及び75Oelのジエチルピロカーボネー
トを添加する。フレンチプレスによって細胞をフェノー
ル−クレゾール及び0.5%ナフタレンジスルホネート
の混合物中に通すことによって、細胞を分解する。振っ
た後、その混合物を、17,000×Gで10分間、遠
心分離し、そして水性層を取り出す。20×SSC10
mlを添加し、そしてSDSを添加し、0.1%の最終濃
度にし、続いてもう1つのフェノール−クレゾール抽出
を行う。RNAを、2体積のエタノールの添加により沈
澱せしめ、そして遠心分離によりペレット化する。残留
DNA,mRNA及びtRNAをさらに抽出するため
に、3Mの冷酢酸ナトリウムを添加し、その混合物を均
質化し、遠心分離にかけ、そして再沈澱せしめる。
し、dH2 O中に懸濁し、そして10%ナフタレンジス
ルホーネート及び75Oelのジエチルピロカーボネー
トを添加する。フレンチプレスによって細胞をフェノー
ル−クレゾール及び0.5%ナフタレンジスルホネート
の混合物中に通すことによって、細胞を分解する。振っ
た後、その混合物を、17,000×Gで10分間、遠
心分離し、そして水性層を取り出す。20×SSC10
mlを添加し、そしてSDSを添加し、0.1%の最終濃
度にし、続いてもう1つのフェノール−クレゾール抽出
を行う。RNAを、2体積のエタノールの添加により沈
澱せしめ、そして遠心分離によりペレット化する。残留
DNA,mRNA及びtRNAをさらに抽出するため
に、3Mの冷酢酸ナトリウムを添加し、その混合物を均
質化し、遠心分離にかけ、そして再沈澱せしめる。
【0081】5s,16s及び23sのリボソームKN
Aが、Grierson(Gel Electrophoresis of Niucleic Aci
ds, 1〜139ページ、IRL Press, Oxford,1982)
によって記載されているように、1.5%アガロースゲ
ルから電気溶離により精製される。50mMのTris−
HCl中で加熱することによって、RNAを軽いアルカ
リ加水分解にゆだね、そしてインキュベートの時間及び
温度はRNA種に依存して異なる(Maizels, Cell 9:
431〜438,1976)。
Aが、Grierson(Gel Electrophoresis of Niucleic Aci
ds, 1〜139ページ、IRL Press, Oxford,1982)
によって記載されているように、1.5%アガロースゲ
ルから電気溶離により精製される。50mMのTris−
HCl中で加熱することによって、RNAを軽いアルカ
リ加水分解にゆだね、そしてインキュベートの時間及び
温度はRNA種に依存して異なる(Maizels, Cell 9:
431〜438,1976)。
【0082】この加水分解段階は、ポリヌクレオチドキ
ナーゼのための基質として5′ヒドロキシル基を利用す
るためにそれらの基を開放する。rRNAは、標準方法
(Maniatis, 前記) によって、T4ポリヌクレオチドキ
ナーゼによる32P ATPにより末端をラベル化される。
おのおのの種は、種々の制限rRNA遺伝子により調整
されたTWARのサザンハイブリダイゼーションのプロ
ーブとして使用され得る。
ナーゼのための基質として5′ヒドロキシル基を利用す
るためにそれらの基を開放する。rRNAは、標準方法
(Maniatis, 前記) によって、T4ポリヌクレオチドキ
ナーゼによる32P ATPにより末端をラベル化される。
おのおのの種は、種々の制限rRNA遺伝子により調整
されたTWARのサザンハイブリダイゼーションのプロ
ーブとして使用され得る。
【0083】なぜならばほとんどの細菌種は、rRNA
配列の複数の遺伝子コピーを含むからである。クローン
化されたTWARのrRNA遺伝子を、TWAR検出に
おけるそれらの感受性及びC.トラコマチス及びC.プ
シタシとのそれらの反応性のために試験する。サザンハ
イブリダイゼーションデーターに依存して、完全な遺伝
子を含むと思われるいづれかの制限フラグメントがアガ
ロースゲルから電気溶離され、そして同様にして消化さ
れたpUC18中にクローン化され、又は前に構成され
た遺伝子バンクがプローブとして異なったrRNA種を
用いてスクリーンされる。
配列の複数の遺伝子コピーを含むからである。クローン
化されたTWARのrRNA遺伝子を、TWAR検出に
おけるそれらの感受性及びC.トラコマチス及びC.プ
シタシとのそれらの反応性のために試験する。サザンハ
イブリダイゼーションデーターに依存して、完全な遺伝
子を含むと思われるいづれかの制限フラグメントがアガ
ロースゲルから電気溶離され、そして同様にして消化さ
れたpUC18中にクローン化され、又は前に構成され
た遺伝子バンクがプローブとして異なったrRNA種を
用いてスクリーンされる。
【0084】TWARの16s rRNA遺伝子を含む
フラグメントサイズに依存して、その遺伝子は、両方向
におけるDNA配列決定のために、M13mp18及びM
13mp19中に直接的にサブクローンされるか、又は小
さなフラグメントに消化され、そしてそれらにサブクロ
ーンされる。すべてのDNA配列決定は、BRLからの
市販されているキットを用いて、標準方法によるジデオ
キシヌクレオチド鎖ターミネーター法(Sangerなど., P
roc. Nacl. Acad. Sci. 74:5463〜5467,
1977)によって行われ得る。クローン化されたTW
ARのrRNA遺伝子は、TWAR検出におけるそれら
の感受性及びC.トラコマチス及びC.プシタシとのそ
れらの反応性について試験され得る。本発明の特定の態
様が例示する目的のためにここで記載されたけれども、
種々の修飾が本発明の範囲内で行われ得る。
フラグメントサイズに依存して、その遺伝子は、両方向
におけるDNA配列決定のために、M13mp18及びM
13mp19中に直接的にサブクローンされるか、又は小
さなフラグメントに消化され、そしてそれらにサブクロ
ーンされる。すべてのDNA配列決定は、BRLからの
市販されているキットを用いて、標準方法によるジデオ
キシヌクレオチド鎖ターミネーター法(Sangerなど., P
roc. Nacl. Acad. Sci. 74:5463〜5467,
1977)によって行われ得る。クローン化されたTW
ARのrRNA遺伝子は、TWAR検出におけるそれら
の感受性及びC.トラコマチス及びC.プシタシとのそ
れらの反応性について試験され得る。本発明の特定の態
様が例示する目的のためにここで記載されたけれども、
種々の修飾が本発明の範囲内で行われ得る。
【図1】図1のAは、C.プシタシの形態学的特徴のT
WAR封入体を示す写真である。図1のBは、C.トラ
コマチスの特徴的な空砲構造を示す写真である。
WAR封入体を示す写真である。図1のBは、C.トラ
コマチスの特徴的な空砲構造を示す写真である。
【図2】図2のAは、TWAR株AR−39DNAの遺
伝子バンクから単離された3.8kbp のPstIフラグ
メントによりプローブされた、MspIにより消化され
たDNAのサザンハイブリダイゼーションのオートラジ
オグラフである。図2のBは、TWAR株AR−39D
NAの遺伝子バンクから単離された3.2kbp のPst
Iフラグメントによりプローブされた、HindIII に
より消化されたDNAのサザンハイブリダイゼーション
のオートラジオグラフである。
伝子バンクから単離された3.8kbp のPstIフラグ
メントによりプローブされた、MspIにより消化され
たDNAのサザンハイブリダイゼーションのオートラジ
オグラフである。図2のBは、TWAR株AR−39D
NAの遺伝子バンクから単離された3.2kbp のPst
Iフラグメントによりプローブされた、HindIII に
より消化されたDNAのサザンハイブリダイゼーション
のオートラジオグラフである。
【図3】図3は、TWAR単離体AR−39からのニッ
クトランスレートされた完全な染色体DNAによりプロ
ーブされたC.トラコマチス,C.プシタシ及びTWA
Rからの変性されたDNAの点のオートラジオグラフで
ある。
クトランスレートされた完全な染色体DNAによりプロ
ーブされたC.トラコマチス,C.プシタシ及びTWA
Rからの変性されたDNAの点のオートラジオグラフで
ある。
【図4】図4は、PstIにより消化されたTWAR
DNAから成る遺伝子バンクから単離され、そして精製
された3種のTWAR−特異性DNAプローブによりプ
ローブされたTWAR,C.プシタシ及びC.トラコマ
チスからの変性された完全な染色体DNAの点のオート
ラジオグラフである。
DNAから成る遺伝子バンクから単離され、そして精製
された3種のTWAR−特異性DNAプローブによりプ
ローブされたTWAR,C.プシタシ及びC.トラコマ
チスからの変性された完全な染色体DNAの点のオート
ラジオグラフである。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成9年5月8日
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図1】図1のAは、C.プシタシの形態学的特徴のT
WAR封入体を示す写真であり、図1のBは、C.トラ
コマチスの特徴的な空砲構造を示す写真であり、いずれ
も生物の形態を示す図面代用写真である。
WAR封入体を示す写真であり、図1のBは、C.トラ
コマチスの特徴的な空砲構造を示す写真であり、いずれ
も生物の形態を示す図面代用写真である。
【図2】図2は、TWAR単離体AR−39からのニッ
クトランスレートされた完全な染色体DNAによりプロ
ーブされたC.トラコマチス,C.プシタシ及びTWA
Rからの変性されたDNAの点のオートラジオグラフで
あり、図面代用写真である。
クトランスレートされた完全な染色体DNAによりプロ
ーブされたC.トラコマチス,C.プシタシ及びTWA
Rからの変性されたDNAの点のオートラジオグラフで
あり、図面代用写真である。
【図3】図3のAは、TWAR株AR−39DNAの遺
伝子バンクから単離された3.8kbp のPstIフラグ
メントによりプローブされた、MspIにより消化され
たDNAのサザンハイブリダイゼーションのオートラジ
オグラフである。図3のBは、TWAR株AR−39D
NAの遺伝子バンクから単離された3.2kbp のPst
Iフラグメントによりプローブされた、HindIII に
より消化されたDNAのサザンハイブリダイゼーション
のオートラジオグラフであり、電気泳動の結果を示す図
面代用写真である。
伝子バンクから単離された3.8kbp のPstIフラグ
メントによりプローブされた、MspIにより消化され
たDNAのサザンハイブリダイゼーションのオートラジ
オグラフである。図3のBは、TWAR株AR−39D
NAの遺伝子バンクから単離された3.2kbp のPst
Iフラグメントによりプローブされた、HindIII に
より消化されたDNAのサザンハイブリダイゼーション
のオートラジオグラフであり、電気泳動の結果を示す図
面代用写真である。
【図4】図4は、PstIにより消化されたTWAR
DNAから成る遺伝子バンクから単離され、そして精製
された3種のTWAR−特異性DNAプローブによりプ
ローブされたTWAR,C.プシタシ及びC.トラコマ
チスからの変性された完全な染色体DNAの点のオート
ラジオグラフであり、図面代用写真である。
DNAから成る遺伝子バンクから単離され、そして精製
された3種のTWAR−特異性DNAプローブによりプ
ローブされたTWAR,C.プシタシ及びC.トラコマ
チスからの変性された完全な染色体DNAの点のオート
ラジオグラフであり、図面代用写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 // C12P 21/08 C12N 5/00 B (C12N 5/10 C12R 1:91) (C12P 21/08 C12R 1:91) (72)発明者 クオ,チョ−チョウ アメリカ合衆国,ワシントン 98115,シ アトル,エヌ.イー.,ツウェンティナイ ンス アベニュ−6531 (72)発明者 ワン,サン−ピン アメリカ合衆国,ワシントン 98052,レ ッドモンド,エヌ.イー.,ワンハンドレ ッドエイティセカンド アベニュ−2050 (72)発明者 キャンベル,リー,アン アメリカ合衆国,ワシントン 98155,シ アトル,エヌ.イー.,エイス アベニュ −17515
Claims (12)
- 【請求項1】 クラミジア・トラコマチス(C.tra
chomatis)又はクラミジア・プシタシ(C.p
sittaci)に対してではなく、クラミジア・プネ
ウモニアエ(C.pneumoniae)の抗原決定基
に対して結合するモノクローナル抗体を産生する連続細
胞系。 - 【請求項2】 前記ハイブリッド細胞系がRR 402
として同定されるハイブリドーマクローンを含んで成る
請求項1に記載の細胞系。 - 【請求項3】 生物学的サンプル中においてクラミジア
・プネウモニアエに対する抗体の存在を決定するための
方法であって:反応混合物を形成するために、クラミジ
ア・プネウモニアエ又はクラミジア・プネウモニアエ−
特異的抗原と共に前記生物学的サンプルをインキュベー
トし;そしてクラミジア・プネウモニアエに対する抗体
の存在を決定するために前記反応混合物を分析すること
を含んで成る方法。 - 【請求項4】 前記分析段階が、抗体のためのラベルさ
れた特異的結合パートナーと反応混合物とを接触し、そ
してそのラベルを検出することを含んで成る請求項3に
記載の方法。 - 【請求項5】 C.トラコマチス又はC.プシタシに対
してではなく、クラミジア・プネウモニアエのDNA又
はrRNAに特異的にハイブリダイズする単離されたオ
リゴヌクレオチドプローブ。 - 【請求項6】 前記DNAプローブが、クラミジア・プ
ネウモニアエに由来する完全な染色体DNAプロブ又は
DNAフラグメントプローブである請求項5に記載のオ
リゴヌクレオチドプローブ。 - 【請求項7】 検出可能マーカーによりラベルされる請
求項5に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。 - 【請求項8】 生物学的サンプルにおいてクラミジア・
プネウモニアエの存在を検出するための方法であって:
サンプルに関連するDNAを単離するクラミジア・プネ
ウモニアエを含むと思われる生物学的サンプルを処理
し;その単離されたDNAを基質に添加し;C.トラコ
マチス又はC.プシタシのDNA配列の一部ではなく、
クラミジア・プネウモニアエのDNA配列の少なくとも
一部に特異的にハイブリダイズすることができるラベル
された単離DNAプローブと共に前記DNA担持基質を
インキュベートし;前記基質からハイブリダイズされな
かったプローブを分離し;そして前記基質に結合される
DNAに関連するラベルの量を検出し、そしてそれから
クラミジア・プネウモニアエの存在又は不在かを決定す
ることを含んで成る方法。 - 【請求項9】 生物学的サンプルにおけるクラミジア・
プネウモニアエの存在を検出するための方法であって、 サンプルにDNAを開放するクラミジア・プネウモニア
エを含むと思われる生物学的サンプルを処理し;C.ト
ラコマチス又はC.プシタシのDNA配列の一部ではな
く、クラミジア・プネウモニアエのDNA配列の少なく
とも一部に特異的にハイブリダイズすることができる単
離されたオリゴヌクレオチド分子と共に前記処理された
サンプルのDNAをインキュベートし;そしてC.トラ
コマチス又はC.プシタシのDNA配列の一部ではな
く、TWAR生物体のDNA配列の少なくとも一部に特
異的にハイブリダイズすることができる単離されたオリ
ゴヌクレオチド分子に関連するラベルを検出し、そして
それによって、サンプルにおけるクラミジア・プネウモ
ニアエの存在又は不在を決定することを含んで成る方
法。 - 【請求項10】 前記単離されたオリゴヌクレオチド
が、C.トラコマチス又はC.プシタシには結合しない
が、約500塩基対のクラミジア・プネウモニアエDN
AのPstI制限エンドヌクレアーゼフラグメントに特
異的にハイブリダイズする請求項9に記載の方法。 - 【請求項11】 生物学的サンプルにおけるクラミジア
・プネウモニアエの存在を検出するための方法であっ
て、 サンプルに細胞材料からの核酸を開放するクラミジア・
プネウモニアエを含むと思われる生物学的サンプルを処
理し;C.トラコマチス又はC.プシタシのrRNAに
対してではなく、クラミジア・プネウモニアエのrRN
Aに対して特異的にハイブリダイズすることができる単
離されたオリゴヌクレオチド分子と共に前記処理された
サンプルをインキュベートし;そして前記単離されたオ
リゴヌクレオチド分子と前記単離されたrRNAとの間
でのいづれかのハイブリダイゼーションを検出し、それ
によって、サンプルにおけるTWAR生物体の存在又は
不在を検出することを含んで成る方法。 - 【請求項12】 単離されたTWAR rRNA遺伝
子。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US85838086A | 1986-05-01 | 1986-05-01 | |
US858380 | 1986-05-01 |
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Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP62502959A Division JP2675564B2 (ja) | 1986-05-01 | 1987-05-01 | 急性呼吸疾患に関連する独特のクラミジア株の検出 |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP10236626A Division JPH11123077A (ja) | 1986-05-01 | 1998-08-10 | 急性呼吸性疾患に関連する独特のクラミジア株の検出 |
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Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH09285288A true JPH09285288A (ja) | 1997-11-04 |
Family
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Family Applications (3)
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---|---|---|---|
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JP8294439A Pending JPH09285288A (ja) | 1986-05-01 | 1996-10-16 | 急性呼吸性疾患に関連する独特のクラミジア株の検出 |
JP10236626A Pending JPH11123077A (ja) | 1986-05-01 | 1998-08-10 | 急性呼吸性疾患に関連する独特のクラミジア株の検出 |
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Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP62502959A Expired - Fee Related JP2675564B2 (ja) | 1986-05-01 | 1987-05-01 | 急性呼吸疾患に関連する独特のクラミジア株の検出 |
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Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP10236626A Pending JPH11123077A (ja) | 1986-05-01 | 1998-08-10 | 急性呼吸性疾患に関連する独特のクラミジア株の検出 |
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---|---|
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CA (1) | CA1341065C (ja) |
DE (1) | DE3789597T3 (ja) |
ES (1) | ES2005569A6 (ja) |
WO (1) | WO1987006617A2 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2008541782A (ja) * | 2005-06-06 | 2008-11-27 | ジェン−プロウブ インコーポレイテッド | テスト試料中のChlamydophilapneumoniaeの存在を決定するための、組成物、方法およびキット |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1992022819A1 (en) * | 1991-06-14 | 1992-12-23 | Board Of Regents Of The University Of Washington | Diagnosis and treatment of arterial chlamydial granuloma |
EP0784059B1 (en) | 1994-09-20 | 2009-02-11 | Hitachi Chemical Co., Ltd. | Polynucleotides encoding an antigenic polypeptide of chlamydia pneumoniae |
US6210876B1 (en) * | 1996-06-06 | 2001-04-03 | Abbott Laboratories | Nucleic acid primers and probes for detecting Chlamydia pneumoniae |
JP5219057B2 (ja) * | 1998-07-31 | 2013-06-26 | 旭化成株式会社 | 微生物検出用抗体 |
US20220243281A1 (en) * | 2019-05-28 | 2022-08-04 | Case Western Reserve University | Compositions and methods for preserving dna methylation |
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---|---|---|---|---|
IL71699A0 (en) * | 1983-05-02 | 1984-07-31 | Enzo Biochem Inc | Methods and kits for the analysis and detection of biological or genetic material |
WO1985002685A1 (en) * | 1983-12-12 | 1985-06-20 | Meru, Inc. | Method and materials for the identification of lipopolysaccharide producing microorganisms |
FI71768C (fi) * | 1984-02-17 | 1987-02-09 | Orion Yhtymae Oy | Foerbaettrade nykleinsyrareagenser och foerfarande foer deras framstaellning. |
GB8426468D0 (en) * | 1984-10-19 | 1984-11-28 | Technology Licence Co Ltd | Monoclonal antibodies |
-
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- 1987-05-01 EP EP93110955A patent/EP0577144A1/en not_active Withdrawn
- 1987-05-01 CA CA000536215A patent/CA1341065C/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-05-01 WO PCT/US1987/001011 patent/WO1987006617A2/en active IP Right Grant
- 1987-05-01 DE DE3789597T patent/DE3789597T3/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-05-01 EP EP87903197A patent/EP0264434B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-05-01 JP JP62502959A patent/JP2675564B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1987-05-01 AT AT87903197T patent/ATE104355T1/de not_active IP Right Cessation
- 1987-05-04 ES ES8701325A patent/ES2005569A6/es not_active Expired
-
1996
- 1996-10-16 JP JP8294439A patent/JPH09285288A/ja active Pending
-
1998
- 1998-08-10 JP JP10236626A patent/JPH11123077A/ja active Pending
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2008541782A (ja) * | 2005-06-06 | 2008-11-27 | ジェン−プロウブ インコーポレイテッド | テスト試料中のChlamydophilapneumoniaeの存在を決定するための、組成物、方法およびキット |
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WO1987006617A2 (en) | 1987-11-05 |
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EP0577144A1 (en) | 1994-01-05 |
JPH01500083A (ja) | 1989-01-19 |
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JPH11123077A (ja) | 1999-05-11 |
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