JPH01500083A - 急性呼吸疾患に関連する独特のクラミジア株の検出 - Google Patents
急性呼吸疾患に関連する独特のクラミジア株の検出Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
急性呼吸疾患に関連する独特のクラミジア株の検出
技術分野
本発明は、一般的にクラミジア(Chlamydia)株の検出及びより詳しく
は、呼吸感染に関連する独特のクラミジア株の検出におけるモノクローナル抗体
及びDNAプローブの使用に関する。
背景の技術
クラミジアは、動物界を通して遍在し、そして種々の疾病を引き起こすことが知
られている偏性細胞内寄生体である。
クラミジア属は、2種の認識される種、すなわち旦、トラコマチス(C、tra
chomatis)及び旦、プシタン(C、psittaci)並びに3種のバ
イオバーへの旦、トラコマチスの派生を有する。C、トラコマチス、すなわち一
次性ヒト病原体であるこの種は、目、呼吸及び尿生殖器感染を引き起こす。旦、
上皇コマチスは初めに、粘膜、たとえば粘膜、鼻咽頭、直腸、尿道及び頚管上に
コロニー形成することができ、この後、その感染は分散し、より深い器官系に影
響を及ぼす。
クラミジアの他の種、すなわちC,プ之え之は、ヒト呼吸疾患、すなわちオウム
病の原因である。オウム病は、通常、感染された鳥類への接触によって感染し、
オウム病の発生は、客の間で起こる。その疾患はしばしば異型肺炎に類似し、そ
して軽いものから利金的なものまでの範囲を有する。そのような肺炎の流行病は
通常、感染された鳥類に由来したが、鳥類のベクターは必ずしも見出されない。
たとえば、1987年北フインランドにおける放射線撮影法による調査の間、軽
い肺炎の流行病が2つの集落に見出された。しかしながら、鳥類による伝染は見
出されなかった。
血清疫学研究は、化ヨーロッパにおいてこの及びいくつかの他の肺炎流行病にお
け句Li主区ヱの通常の菌株を抱合した。このえiま区ヱの新規菌株は、つい最
近、重要な呼吸病原菌として確立され、そしてそれは研究された成人集団におけ
るたぶん12%までの異型肺炎患者を引き起こした。しかしながらほとんどの感
染は、原因物質がマイコプラスマ 1主ウモニアエ(Mycoplasma p
neumoniae )又はインフルエンザA型又はB型ウィルスであるまちが
った確信のために、抗生物質により不適切に治療された。X、プネウモニアエの
ために使用される少量でのエリスロマイシンによる抗生物質治療は、ヱ土ユ1立
久ヱ感染に対して効果的があるが、この投与量でのエリスロマイシンはクラミジ
ア感染に対して効果的でない。さらに、これらの感染は、症状が明確に緩和した
後、再発する疾病によってしばしば特徴づけられる。
新菌株のえU乏ヱと急性呼吸疾患とのこの関連の観点がら、この新菌株の存在を
診断するための正確且つ費用的に有効な方法を提供することがひじょうに所望さ
れ、それにょって−次感染の有効な抗生物質治療を可能にするであろう。本発明
は、そのような方法を提供し、そしてさらに他の関連する利点によって特徴づけ
られる。
発明の開示
簡単に言えば、本発明は、生物学的サンプル中におけるクラミジアのTWAR生
物体の存在を検出するための方法を提供する。これらの方法は、TWAR生物体
の抗原決定基に対して向けられたモノクローナル抗体又はTWAR生物体に対し
て特異的なりNAプローブのいづれかを使用する。
本発明の1つの観点において、その方法は、(a) TWAR生物体の抗原決定
基に対して向けられた、ラベルされたモノクローナル抗体に、そのTWAR生物
体を含むと思われる生物学的サンプルを暴露する段階;及び(b)前記モノクロ
ーナル抗体と前記TWAR生物体との間に形成される免疫複合体の存在を検出す
る段階を含んで成る。
TWAR生物体の存在を検出するための関連方法は、(a) TWAR生物体が
細胞内に含まれるようにHeLa細胞とTWAR生物体を含むと思われる生物学
的サンプルとを混合し;(b)前記TWAR生物体を含むHeLa細胞をインキ
ュベートし; (C) TWAR生物体の抗原決定基に対して向けられた、ラベ
ルされたモノクローナル抗体に前記HeLa細胞/TWAR生物体を暴露し;そ
して(d)前記TWAR生物体と前記ラベルされたモノクローナル抗体との間に
形成される免疫複合体の存在を検出することを含んで成る。
本発明の特に好ましい態様においては;前記混合段階は、サンプルよりHeLa
細胞を接種し、そして続いてそのHeLa細胞上での接種されたサンプルを遠心
分離にかけることを含んで成る。DEAE−デキストラン及びシクロヘキサアミ
ドにより前処理することがまた好ましい。
本発明の3番目の観点は、生物学的サンプル中において一?一旦マクヱのTWA
R生物体に対する抗体の存在を決定するための方法を開示する。その方法は、一
般的に、(a)反応混合物を形成するためにTWAR生物体の基本体と共に生物
学的サンプルをインキュベートし;そして(b)そのTWAR生物体に対する抗
体の存在を決定するために前記反応混合物を分析することを含んで成る。好まし
い態様においては、前記分析段階は、抗体に対するラベルされた特異的な結合パ
ートナ−と前記反応混合物を接触せしめ、そしてそのラベルを検出することを含
んで成る。これに関しては、その特異的な結合パートナ−は、ヤギ抗−ヒトIg
M又はヤギ抗−ヒトIgGである。
上記に簡単に記載された方法のすべてにおいて、モノクローナル抗体は、酵素、
蛍光体、放射性同位体又は発光体によりラベルされ得る。これに関して、検出の
段階は、通常、それぞれ酵素反応、蛍光、放射能又は発光によって存在するので
あろう。
上記に説明された方法は、TWAR生物体又はそのTWAR生物体に対する抗体
の存在を検出するために種々の生物学的サンプルに適用され得る。体分泌液1体
液及び組織検体は適切なサンプルである。体分泌液の例は、頚管分泌液、気管−
気管支分泌液、及び咽頭分泌液を含む。適切な体液は、血液、涙及び中枢神経系
液を含む。組織検体の例は、種々のバイオプシー、たとえば肺組織又はらっは骨
組織のバイオプシーを含む。
さらに実質的にすべての部分からの組¥8(心wt組織及び肺組織)が、検死実
験内で試験され得る。
本発明によれば、上記に記載された方法に使用するためにTWAR生物体の抗原
決定基に対して向けられたモノクローナル抗体を産生ずる連続したハイブリッド
細胞系が確立される。
特に好ましい態様においては、その細胞系は、ハイブリドーマクローンRR40
2又はTT 205を含んで成る。そのような細胞系により産出されるモノクロ
ーナル抗体もまた開示されている。
上記に示されるように、本発明はまた、TWAR生物体に対して特異的なりNA
プローブも開示する。TWAR生物体のDNA配列の少なくとも一部を含むその
プローブが、生物学的サンプル中におけるTWAR生物体の存在を検出するため
の方法に使用され得る。
本発明の1つの観点において、その方法は、(a)サンプルに関連するDNAを
単離するためにTWAR生物体を含むと思われる生物学的サンプルを処理する段
階;(b)基質にその単離されたDNAを添加する段階; (c) TWAR生
物体のDNA配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズすることができる
ラベルされたDNAプローブと共にDNA担持基質をインキュベートする段階;
(d)前記基質からハイブリダイズしなかったプローブを分離する段階;及び(
e)前記基質に関連するラベルの量を検出し、そしてそれからTWAR生物体の
存在又は不在を決定する段階を含んで成る。
本発明のもう1つの観点の範囲内の方法は、(a)基質にTWAR生物体を含む
と思われる生物学的サンプルを添加し;(b)該サンプルに関連するDNAを暴
露するために前記添加されたサンプルを担持する基質を処理し:(C)前記TW
AR生物体のDNA配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズすることが
できるラベルされたDNAプローブと共に前記DNA担持基質をインキュベート
し;(d)前記基質からハイブリダイズされなかったプローブを分離し、そして
(e)前記基質に関連するラベルの量を検出し、そしてそれからTWAR生物体
の存在又は不在を決定することを含んで成る。
前記方法内のプローブは、完全な染色体DNAプローブ又はTWAR生物体に由
来したDNAフラグメントプローブである。
本発明のこれらの及び他の観点は、次の詳細な説明及び添付図面によって明確に
なるであろう。
図面の簡単な説明
第1A図は、C、プシタシの形態学的特徴のTMAR封入体を示す写真である。
第1B図は、C、トラコマチスの特徴的な空砲構造を示す写真である。
第2図は、TWAR単離体AR−39からのニックトランスレートされた完全な
染色体DNAによりプローブされた旦、上皇ユマチス、旦、プシタシ及びTWA
Rからの変性されたDNAの点のオートラジオグラフである。
第3A図は、TWAR株AR−39DNAの遺伝子バンクから単離された3、8
kbpのPstIフラグメントによりプローブされた、竺辻■により消化された
DNAのサザンハイブリダイゼーションのオートラジオグラフである。
第3B図は、TWAR株AR−39DNAの遺伝子バンクから単離された3、2
kbpのPstlフラグメントによりプローブされた、肛皿■により消化された
DNAのサザンハイブリダイゼーションのオートラジオグラフである。
第4図は、Pstlにより消化されたTWARDNAから成る遺伝子バンクから
単離され、そして精製された3種のTWAR−特異性DNAプローブによりプロ
ーブされたTWARSC,−ズ」じL乞及び旦、上iユヱ天スからの変性された
完全な染色体DNAの点のオートラジオグラフである。
Hるための の、能
上記に示されるように、血清疫学研究は、化ヨーロッパ及び他の国においていく
つかの肺炎流行病におけ剣久久え/ヱの通常の菌株を包含した。このLil乏ヱ
の新規菌株は、初めの2種の単離体の実験用名称(TW−183及びAR−39
)から’TWAR”として本発明において言及される。TWARは、クラミグヱ
属に属することが示されているが、しかし、いくつかの基準によって旦、トリコ
マチス及び旦、プシクシから区別され得る。封入体の形態及び封入体におけるグ
リコーゲンの存在に関しては、TWAR封入体は、グリコーゲンを含む旦、王立
コマチス封入体の空胞性質とは違って、それらの卵形且つ密集した出現及びグリ
コーゲンの不在に基づいてC012文2により密接に関連される。さらにTWA
R生物体は、−Q−0王立ユマチス種−特異性モツクローナル抗体と反応しない
(Stephensなど、、J、 Immunol、128 : 1083.1
982)。
TMAR生物体は明らかに、C,)リコマチス種に属さないが、それはまた現在
認識されている旦、プシタシ株とも重要な相違を示す。TWAR及び他の旦、プ
之叉之株は免疫学的に異なる。
すなわち、他の旦、1212株との交叉反応は見出されていない。さらに、TW
AR生物体に対するモノクローナル抗体の産生において(下記により十分に記載
されている)、c、7”、zU種−特異性抗体は検出されず、属−及び菌株−(
TWARセロバー)特異性抗体のみが見出された。プラスミドは、試験されたほ
とんどすべての旦、プ之叉之及びC,トーコマチスクラミジア株に見出されたが
、TWAR生物体はプラスミドを持たないことを注目することはまた興味の対象
である。さらに、すべての既知のC,プ2叉之株は動物又は鳥宿主を有するが、
TWAR生物体のための動物又は鳥宿主は見出されていない。本発明によれば、
TWAR生物体は、C,7”之え2に形態的に類似するが、しかしそれとは異な
り、そして現在認識されている旦、プシタシ株とは免疫学的に異なるいづれかの
Liま21株を含むことが定義される。代表的なTWAR株(AR−39)は、
American Type Ca1turo Co11ectionに寄託さ
れ、そして寄託番号第53592号を得た。
ハイブリドーマ形成及びモノクローナル抗体の産生は、種々の微生物疾患の免疫
診断に有用であることが示された。より詳しくは、モノクローナル抗体は、ヒト
感染の検出及び血清学的な分類を可能にする。さらに、これらのモノクローナル
抗体は、属−及び種−特異性抗原の同定を促進せしめる。
上記に示されたように、TWAR生物体の抗原決定基に対するモノクローナル抗
体を産生ずることができる連続したハイブリッド細胞系が確立される。そのよう
な細胞系を確立するための一般的な方法は、実験動物、通常マウスを適切な抗原
により免疫化することを含む。次に、免疫肺臓細胞を単離し、その化学物質、た
とえばポリエチレングリコールに暴露することによって骨髄腫又はリンパ腫細胞
と融合せしめる。次に、融合されたハイブリッド細胞を、悪性細胞系の増殖を妨
げる選択培地、たとえばHAT培地中でインキュベートする。ハイブリドーマ細
胞を限界希釈法によりクローンし、そして培養上清液を、所望の特異性を有する
モノクローナル抗体の分泌のために検定する。選択されたモノクローナル抗体の
多くの収量が、ハイブリドーマの47 M±での腹水増殖を通して得られた。
TWAR生物体に対して特異的であるモノクローナル抗体を得るために、適切な
TWAR抗原が調製されるべきである。患者ののど(咽頭)からのTWAR単離
体を真核細胞培養又は胎児性卵黄のう培養のいづれかを通して、培養することが
できる。はとんどの−次単離物は、好結果をもたらす真核細胞培養の前、TWA
R生物体の卵順応性を特徴とする特に、TWAR単離物を卵黄のう培養物に1度
又は2度通し、そして次にバイアル中に増殖されたHeLa 229細胞の培養
物上にそれらを接種することが好ましい。そのHeLa細胞をDEAE−デキス
トラン及びシクロへキサアミドにより前処理することもまた好ましい。そのTW
AR単離体は、くり返された培養物通過により細胞培養物中で増殖することが適
合され得る。特に、約10又はそれよりも多くの一連の培養物通過がHeLa細
胞増殖への適合のために好都合であろう。
第1A及び18図を参照すれば、それぞれThAR生物体及び旦、)うp二しチ
クヨにより感染された1(eLa 229細胞の単層を示す顕微鏡写真が、存在
する。TWARによる感染は、核を切り離さず又は置換していない比較的密集し
た細胞質封入体を示す。
対照的に、第1B図は、核を切り離している、−C−0上立ユヱ±困の典型的な
空胞性封入を示す。
感染された細胞培養物は、通常、TWAR生物体の感染度のためにモニターされ
;そして数パーセントの細胞が感染される場合、多数のバイアル培養物は、大き
な培養ボトル中での増殖のために調製物に接種される。好ましい態様においては
、50%の感染度が得られる場合、20〜30個のHeLa 229細胞のバイ
アルが、32−オンスの調剤ボトル培養物に植え込みを提供するために感染され
得る。続く一連の経過は、TWAR株旦ミジアの数を高めるであろう。この適合
及び拡大は、モノクローナル抗体の産生及びスクリーニングのためにTWAR抗
原の十分な量を与えるであろう。
本発明に使用されるハイブリドーマ産生のための免疫原は、精製されたTWAR
抗原であった。好ましい態様において、その抗原は、レッグラフインにより精製
されたTWAR基本体(〉99%に精製された)である。ハイブリドーマは、免
疫マウス肺臓細胞とN5−0骨髄腫細胞との融合によって調製され、そして抗−
クラミシア抗体を分泌するノXイブリド−マクローンが同定される。好ましい態
様においては、ハイブリドーマ培養上清液を、ELISAによってスクリーンす
る。特に好ましい態様においては、ELISAは、ペルオキシダーゼ接合性抗−
マウス免疫グロブリン及び比色検出システムを使用する。
ミクロ−イムノフルオレセンス技法(S、 p、 Wang及びJ、 T。
Grayston 、ハer、 J、 Ohthal、 70 : 3678
、1970)によるモノローナル抗体の特異性の試験がまた好ましい。
TWARにより誘発されたハイブリドーマは、同系のBALB/cマウス中に腹
腔的接種され得る。接種する前、2週間、マウスをブリスタンにより感作するこ
とが好ましい。その得られた腹水を収穫し、そしてモノクローナル抗体を精製す
ることができる。好ましい様態においては、腹水性モノクローナル抗体を、プロ
ティンA−セファロースカラム上でアフィニティー精製する。
選択されたTWARモノクローナル抗体を、本発明に記載された方法に使用する
ためにラベル化するさことができる。好ましいラベルは、酵素、蛍光体、放射性
同位体及び発光体を含む。これらの及び他のラベルは当業界において良く知られ
ている。これに関する特に好ましいラベルは、フルオレセインである。次に、そ
のラベルされたTWARモノクローナル抗体を、属−1種−及び株−特異性につ
いて試験することができる。
第1表に示されるように、ミクロ−イノ1ノフルオレセンスアフセイに使用され
る場合、TWARにより誘発されたモノクローナル抗体は、TWAR単離体と反
応したが、しかし旦、上旦旦マチルまたはc、プ之叉之はそうではなかった。
第一よ−1
TWARによ 沃 れたモノクロ−ル の。
TWAR−T讐 183 6400 3200AI? 39 6400 320
0
AR27764003200
AR38864003200
旦゛そ躇Mさ、 。 3200
フルオレセイン接合性TWARモノクローナル抗体は、感染された培養細胞中に
おけるTWAR基本体及びTWAR封入体を特異的に染色するが、しかし他のク
ラミジア株を染色しなかった。従って、本発明は、TWAR特異性抗原決定基に
結合するモノクローナル抗体を提供する。
本発明の範囲内で、TWAR特異性モノクローナル抗体が、生物学的検体の診断
アッセイに使用されて来た。特に、本発明は、臨床的検体のスミア及び接種され
た細胞培養物中におけるTWAR生物体を検出するための方法を提供する。これ
らの方法は、固定された検体におけるTWAR−特異性抗体決定基に直接的に結
合する、ラベルされたTWAR特異性モノクローナル抗体を使用する。その検体
は、固体支持体、たとえばガラススライド、カバースリップ又はミクロタイター
ウェル上に固定され得る。その検体又は生物学的サンプルはまた、メタノール又
はエタノールにより、固体支持体に固定されるべきである。サンプルがその表面
に固定又は結合された後、そのサンプルは、ラベルされたモノクローナル抗体に
暴露される。他方、TWAR特異性モノクローナル抗体に結合することができる
ラベルされた第二抗体が使用される。この方法の変法は、ラベルのシグナルの増
強を提供することができる。直接的な蛍光抗体技法によるスミア検体中のTWA
R生物体の同定は、迅速であり、簡単であり、そして比較的安価である。そのス
ミア技法は、臨床的調整(初期診断、原因生物体の単離のための改良された機会
、治療の成功に基づく追跡調査)及び表皮学的調整の両者に使用され得る。
TWAR生物体の存在を検出するための方法を提供する他に、本発明は、生物学
的サンプル中におけるTWAR生物体に対する抗体の存在を決定するための方法
を提供する。TWAR抗体のための血清又は体液のスクリーニングのための特に
好ましい態様は、ミクロ−IFアッセイである。典型的には、抗原(スラミジア
基本体抗原)を、顕微鏡のスライド上に固定し、そしてそのスライドを、TWA
R抗体を含むと思われるサンプルと共にインキュベートする。次に、ラベルされ
た特異的結合パートナ−(たとえばフルオレセイン接合性抗−マウス免疫グロブ
リン)を添加し、そしてその反応を、TWAR生物体に対する抗体の存在を決定
するために観察する。
DNAプローブの使用はまた、種々の微生物学的疾患の診断に有用であることが
示されて来た。より詳しく番よ、DNAプローブを用いて、精製されたDNAを
検出し、単離されたコロニー中の精製されていないDNAを検出し、又は組織。
体液2食物及び水中のDNAを直接的に検出することができる。DNAプローブ
の使用の1つの利点は、その生物体が、臨界的な結合部位のマスキングを通して
免疫学的検出を妨げることができる共存する抗体の存在において検出され得るこ
とである。さらに、DNAプローブは、免疫蛍光技法によって容易に検定され得
ないサンプルに対して使用されるべ(可能性を有する。いくつかの異なったアブ
ローチグ、特定の病原体に対して特異的なりNAプローブの開発に使用されて来
た。これらのアプローチは、(a)完全な染色体DNA ;(b)その病原体に
対してユニークなウィルス性機能に関連する配列;(C)プラスミドDNA;(
d) リポソームRNA遺伝子;及び(e)前記生物体に対して特異的な、クロ
ーンされたランダム配列を含む。
しかしながら、TWARはプラスミドDNAを含まず、そしてウィルス性因子は
この生物体のために同定されていないので、本発明は、完全な染色体DNAプロ
ーブ及びTWAR生物体に対して特異的であるTWARD N Aの代表的なり
ローンされたフラグメントの両者を開示する。これらのプローブの使用は、旦、
−ヒラ」二乙チノヨ及び旦、プシタシとTWARとの区別を可能にする。
下記により詳細に説明されているように、DNAプローブは、TWARのDNA
配列とハイブリダイズするそれらの能力、及び旦、トラコマチス及びC812叉
之からのDNAとのハイブリダイゼーションのそれらの欠失によって選択された
。
簡単に言えば、完全な染色体DNAプローブに関しては、TWARのDNAを、
精製された基本体から単離し、二、クートランスレーションし、そしてトンドブ
ロフトハイブリダイゼーションにおいてプローブとして使用した。第2図に示さ
れるように、完全な染色体DNAプローブを用いて、旦、上皇コマチス及び−C
−12叉之からTWAR生物体を同定し、そして区別することができる。
手短に言えば、D N Aフラグメントプローブに関しては、TWAR株を適切
な生物学的サンプルから単離し、そしてそのDNAを精製した。制限エンドヌク
レアーゼによる消化の後、D N Aフラグメントの混合物を、アガロースゲル
電気泳動によって分離した。次に、そのDNAフラグメントを、プロソチング又
は電気溶離のいづれかによってニトロセルロース紙に移した。次に、ハイブリダ
イゼーションプローブを添加し、相同配列を検出した。より詳しくは、約500
bp 、900bp 。
1200bp 、 3200bp及び3800bpのザイズを有する、5種のク
ローンされたT−八Rの−I艷二巨二jlDNAフラグメントを、AR−39D
NAの遺伝子バンクから精製し、そして染色体消化物をプローブするために使用
した。第3図に示されるように、それぞれの場合のハイブリダイジングフラグメ
ントは、すべてのTWAR単離体に関して同じであった。さらに、活性は、旦、
上皇ユヱ±ス又はc、1之り之に関しては観察されなかったが、そのプローブは
、TWAR特異性であった。
臨床的な用途に使用するために、クローンされ、そして精製されたTWARフラ
グメントを、ドツトプロットハイブリダイゼーションににおいてプローブとして
使用することができる。第4図に示されるように、TWAR、C,−ス之!−之
及び−C,王立ユヱ±困の分解された基本体を試験する場合、前記フラグメント
がTWARとのみ反応した。簡単に言えば、どちらかのタイプのプローブに関し
ては、感染物質を含むと思われる患者からの生物学的サンプルを破壊し、そのD
NAを開放し、そしてそのDNAを、物理的(加熱)及び化学的(塩、界面活性
剤)手段によってニトロセルロース上にスポットとして結合せしめる。ニトロセ
ルロースに適用する前のサンプル調製の方法は、そのサンプル源に依存するであ
ろう。
すべての場合、そのニトロセルロースは、DNAの結合を高めるためにIMの酢
酸アンモニウム中でブレインキュベートされる。多くのサンプルを処理し、そし
て濃縮するためには、それらのサンプルは、好ましくは、たとえばBioDot
Micro−filtration装置の使用によってニトロセルロースに適
用される。DNAが前に単離されている場合、サンプルは、0.3 MのNa(
J中で10分間、煮沸され、そして2Mの冷酢酸アンモニウムが添加される。1
0001のサンプルを、そのドツトプロット装置に適用し、そして真空下で濾過
する。ウェルを2Mの酢酸アンモニウムにより洗浄し、そのウェルに結合してい
る残留核酸を除去する。試験されるべきサンプルがEB又は培養された細菌から
成る場合、培養物を分解し、そして染色体DNAを0.5 NのNaOH中で1
0分間、煮沸することによって変性し、HClの添加によって0.5NのH(J
の最終濃度に中和し、そして6XSSCの最終濃度にする。臨床的な気道検体に
関しては、サンプルをプロテイナーゼKにより処理し、SDSの添加によって溶
解し、フェノールにより抽出し、RNase処理し、フェノールクロロホルム抽
出し、そしてエタノール沈澱せしめる。次に、そのサンプルを上記のようにして
煮沸することによって変性する。サンプル適用の後、そのフィルターを80℃で
2時間、インキュベートし、2〜4時間、プレハイブリダイズし、そして標準方
法(Maniatisすど、。
Mo1ecular Cloning : A Laboratory Man
ual、 Co1d Spring)1arbor Laboratory+
1983)によってハイブリダイズせしめる。
上記に簡単に記載された方法は、サンプル調製のために適切な方法の単に代表に
すぎないことは、当業者にとって明らかであろう。本質的に、サンプル調製の目
的は、そのサンプルに関連するDNAを生成し、そしてそのDNAを基質、たと
えばニトロセルロースに、生成の前、又は後のいづれかで添加することである。
これらの方法は、完全な染色体DNAプローブ又はDNAフラグメントプローブ
の両者を調整するために使用され得る。
患者のサンプルからの相補的DNAが存在する場合、ラベルされたハイブリダイ
ゼーションプローブが結合されるであろう。そこで相補的DNAが存在しない場
合、そのハイブリダイゼーションプローブは結合されず、そして容易に洗浄し、
除去され得る。非放射能プローブが使用される場合、そのハイブリダイゼーショ
ンプローブ上のラベルに対する基質が、測定されるべき反応のために必要であろ
う。ラベルが32pである場合、その測定は、写真フィルムの現像を含む。ラベ
ルが酵素の場合、その測定は、濃度計又は直接的な可視化のいづれかによって行
なわれ得る。
選択されたDNAプローブの感受性を決定するために、前もって決定された濃度
のTWARの種々の希釈溶液を前記のようにして破壊し、そして濾過によりニト
ロセルロースに適用することができる。TWARの粒子の計数は、コンゴレッド
によるネガティブ染色法(Gerloffなど+l J、Infect Dis
、123 :429〜432.1971)によって、又は電子顕微鏡(讐ang
など、。
−知工J工」l1ゴー+ 1443〜1454.1967)によって行なわれ得
る。
完全な染色体DNAプローブよりも本発明に記載されたTWAR特異性フラグメ
ントの1つの利点は、それらの純度である。細胞培養物のDNAによるクラミジ
ルの染色体D N Aの少々の汚染は、みずから非特異性バッククラランド反応
をもたらすであろう。この可能性ある問題を迂回するためには、完全な染色体D
NAは、TWARの増殖を十分に支持するMcCoy細胞又は他の非ヒト細胞系
において増殖されるTWAR生物体か点は、完全な染色体DNA0単離のために
多くの量のTMAR生物体を増殖するのと比べて、これらの特異的な配列の多く
の量を単離する際、容易且つ安価であることである。DNAプローブの単離のた
めに本発明に記載された方法の他に、DNAプローブの感受性が、種々の手段、
たとえば(a)−末鎖のプローブの使用及び(b) リポソームrRNA遺伝子
の単離を通して改良され得る。
次の例は、例示的であって限定するものではない。
T誓へRの びパ−
A、、ffl血捷炙勉夏垂離
急性呼吸疾患を有する患者からの、トランスポート媒体(スクロース/カリウム
/グルタメート;5PG)中のど(咽頭)の検体を、C,C,Kuoなど、(、
y、 Infect、 Dis。
125 : 665〜668.1972)からの変法に従って培養した。それぞ
れの検体を、接種の前、DEAE−デキストラン(300g/cnl)及びシク
ロへキサアミド(0,5〜0.80g/aZ)により前処理されたHeLa 2
29細胞の単層を含む3個のバイアル上に接種した。その細胞上の接種物を、室
温で60分間、2.200rpa+で遠心分離した。次に、それらのバイアルを
35℃で72時間インキュベートした(継代1)。それらのバイアルの1つから
の単層をメタノールにより固定し、そして蛍光抗体により染色し、感染を示す封
入体について調べた。他の2個のバイアルは、継代2のための接種物を供給する
ために利用され得る。
媒体中のど(咽頭)の検体を、J、 T、Graystonなど、(Proc。
Soc、 Ex 、 Biol、 Med、103 : 596.1960)の
方法に従って、胎児性卵(6〜8日目)の卵黄のう中に接種した。スト、7−ト
マイシンを、濃度が接種に基づいて卵当り10■に達するまで、その検体に添加
した。それらの卵を、35℃でインキュベートし、そして毎日、明りに透かして
調べた。死んだ後、又は12〜13日間生存した後、卵黄のうを収穫し、そして
Macchiavelloの染色変法によって染色し、久Mグヱの基本体につい
て調べた。フルオレセインに接合されたTWARモノクローナル抗体が感染され
た卵黄のうを染色するために利用可能になる場合、そのTWAR生物体を、より
一層容易に見ることができる。Macchiavel lo染色によってこれま
で陰性であると思われたいくつかの継代は、TWAR生物体を含むことが見出さ
れた。陽性培養物は普通、続く継代に基づいて多(の数の基本体を示した。
C0戸 に せしめるためのTWARの人そのようにして得られた13種の単離
体うち1つを除く他のすべては、はとんどのTWAR,lt体をHeLa 22
9細胞培養バイアルにうまく適合せしめるために、細胞培養物の接種の前、生物
体(1又は2継代)の卵適合物による、胎児性卵の卵黄のうへの初めの接種を必
要とした。
T−へR生物体の一連の紙代を、Kuoなど、 (”Nongonococca
lUrethritis and Re1atecl Infections+
” 328〜336ページ。
1977)の変法に従って、HeLa 229細胞のバイアル培養中で行なった
。細胞培養物の単離について記載されているようにして(例1.A)、バイアル
中の3種の別々のHeLa細胞単層を、それぞれの継代のために接種した。1つ
は固定され、そして染色され、感染の進行が決定され、そして残る2種の単層は
、バイアルから削り取られ、そして第1の継代について上記に説明されたように
正確に再接種された。少な(とも10回の連続した細胞培養継代が適合せしめる
ためには必要とされた。
50%以上の細胞を感染せしめるために、その感染度が高まる場合、接種される
バイアルの数を増し、大きな培養ボトル(32オンスの処方用ボトル)中への接
種のために感染された細胞の20〜30個のバイアルを供給した。連続した継代
が、細胞の100%が感染されるまで、ボトル培養中で続けられた。
例2
側…■
32オンスの処方用ボトルへのTWAR株の適合の後、その株を、HeLa 2
29細胞の追加のボトル中で増殖せしめることによって拡張した。ハンクス液2
0mj中においてガラスピーズにより細胞単層をころがすことによって、生物体
を収穫した。
その細胞を音波処理により破壊し、そしてHeLa細胞残骸を低速での遠心分A
I (1、200rpI11で10分間)により除去した。
次に、その生物体を、高速での遠心分離(16,00Orpmで20分間)によ
りベレット化した。TWAR基本体を、16. OOOrpmで40分間、30
%Renograf in懸濁液により緩衝化しくこれは汚染物の約60%を除
去する)、そして次に23.0Orpmで90分間、30〜65%Renogr
af in直線グラジェントを通すことによって、まず精製した。T−^R基本
体の懸濁されたバンドは、99%以上精製された。使用される方法は、R,S、
5tephensなど。
(J、 Tmmunal、128 : 1083.1982)の変法であった。
例3
F 1(7)i T
BALB/cマウスを、ホルマリンにより殺された5X10’個のTWAR生物
体により、1日目に腹腔内投与し、そして同様の接種物により1週間隔で、それ
から3又は4回静脈内投与することによって免疫化した。肺臓を、最後の免疫化
の後、3日月に収穫した。
例4
ハイブリドーマの
N5−0骨髄腫細胞系を、融合工程に使用するためにMilsteinから得た
。N5−0細胞は通常、熱不活性化された15%ウシ胎児血清、1mMのグルタ
ミン及び1mMのピルベートを含むRPMI 1640(GIBCO,Gran
d l5land、 N、Y、) (”完全RPMI” として言及される)中
で増殖された。
肺臓細胞懸濁液を、紺か(切り、そして細かいナイロン製スクリーンを通してそ
の細胞を通すことによって調製した。
白血球細胞懸濁液を、血清を含まないRPMIにより3度洗浄し;N5−0細胞
を血清を含まないRPMIにより1度洗浄した。
N5−0細胞及びリンパ球を、250X’Gで10分間、遠心分離することによ
って、40%ポリエチレングリコール中で融合せしめた(1:4の割合又は1:
8の割合で)。その細胞を完全RMPIIO体積により洗浄し、そして160X
Gで5分間遠心分離した。その上滑液をアスピレートし、そしてその細胞を、H
AT培地により補充された完全RMPI (これは1.0X10−’Mのヒボキ
サンチン、4.0X10−’Mのアミノプラリン及び1.6X10−’Mのチミ
ジンを含む)により2.5 X 10%個の細胞/−に再懸濁した。このハイブ
リッド細胞懸濁液を、3〜5週才のBALB/cマウスからの胸腺リンパ球と共
に混合し、2.5 XIO’個の胸腺リンパ球/−の最終濃度にした。その最終
細胞懸濁液を、96−ウェル マイクロテスト プレート(Costar、Ca
mbridge+ Mass)のウェル中に接種した(20061体積中)。H
AT培地による追加の食餌(体積で50%の交換)を、5日及び8日目に与えた
。連続した操作、食餌計画及び希釈を限定することによるクローニングを、5t
ephensなど、 (1M)によって記載されているようにして行なった。
■−エ
バイブリド−マクローンのスクリーニング培養流体中における抗−クラミシア抗
体を、酵素結合された免疫吸着アッセイ (ELISA)によって検出した。抗
体アッセイに関しては、リン酸緩衝溶液(PBS、 p)l’7.6 > 50
0ttにおけるlXl0’個のクラミジア生物体を、37℃で一晩インキユベー
トすることによってマイクロテストプレートの個々のプレートにより吸着せしめ
た。対照プレートをマイクロタイタープレートのウェルに惑染されていない)I
eLa 229細胞(104個の細胞/ウェル)を接触することによって調整し
た。次の朝、それらのプレートのウェルを、PBS中5%ウシ血清アルブミン(
BSA) 750 ffiと共に2時間インキュベートすることによって非特異
性タンパク質の吸着から阻止した。その抗体アッセイは次の3段階で行なわれた
:(1) 培養流体5011tを、37℃で60分間、抗原吸着ウェルのそれぞ
れの中でインキュベートした。次に、結合さていない免疫グロブリンを、1%B
SAを含むPBSにより3度、洗浄することによってウェルから除去した。
(2) ペルオキシダーゼ接合の抗−マウス免疫グロブリン(500#)を;そ
れぞれのウェルに添加し、そして37℃で60分間インキュベートした。残留す
る非結合性ペルオキシダーゼ接合体を、PBSにより3度、洗浄することによっ
て除去した。
(3) その免疫反応を、基質にO−フェニレンジアミン及びH20□を添加す
ることによって検出し、そして色素反応を定量化した。
ELISAによって陽性であることが示された培養上滑液をマイクロ−IF技法
で試験することによってさらに抗体特異性を、決定した(例6を参照のこと)。
例6
モノクロ−ルー の −3
同系BALB/cマウス中への1〜5X10’個のハイブリッド細胞の腹腔内接
種が、2〜3週間内で触診できる腫瘍(ハイブリドーマ)を誘発した。腫瘍誘発
を確かめるために、同系の宿主が、Pr1stane (2、6、10、14−
テトラメチルペンタデカン、 Aldrich Chemical Co、、
Milwaukee、 Wis、) 0.5−の腹腔内接種によって2週間前に
怒作された。はとんどの場合(〉90%)、腹腔内に移植されたハイブリドーマ
の前進的増殖が、腹水(1,0〜5.0+nj/マウス)の産生によって達成さ
れた。
その腹水中に含まれるモノクローナル抗体のアイソタイプを、モノクローナル抗
体−スクリーンシステム(Zymed Labo−ratories+ San
Francisco、 Ca1if、)を用いるELISAによって決定した
。使用の前、腹水を、マイクロ−IF技法によって特定の抗体活性について試験
した。
マイクロ−IFアフセイに関しては、培養流体又は腹水を、顕微鏡メイライド上
に置かれたLiま2ヱ基本体抗原と湿潤室においで、37℃で30分間、反応せ
しめた。反応の後、そのスライドをPBSにより5度洗浄し、そして空気乾燥せ
しめた。フルオレセイン接合の抗−マウス免疫グロブリンを添加し、そして湿潤
室において37℃で30分間インキュベートした。インキュベートの後、そのス
ライドを蒸留水により5度洗浄せしめ、そして空気乾燥せしめた。FA封入流体
の一滴を添加し、そしてカバースリップをそのスライド上に置いた。その反応は
FA−顕微鏡下で観察された。封入体の染色に関しては、感染されたHeLa細
胞を無水メタノール中において10分間、固定し、そしてTWAR特異性抗体活
性について検定した。
腹水内に含まれるモノクローナル抗体を、プロティンA−セファ0−スカラム(
Pharmacia Fine Chemicals、 Uppsala。
Sweden)上でアフィニティ精製した。フルオレセインイソチオシアネート
−接合のモノクローナル抗体を、Goding(J。
In+muno11Meth、 13 : 215.1976)の方法によって
調製し、そして直接的な免疫蛍光アッセイのための滴定により決定されるように
、適切な希釈度で使用した。接合されなかったモノクローナル抗体を、間接的な
免疫蛍光技法のために1:100の希釈度で通常使用した。
A、埜北技ユ
C,上iユヱ乏囚に対するモノクローナル抗体を、臨床的な検体からのスミア−
の直接的な蛍光抗体(FA)アッセイのためにこれまで使用して来た。ふ、ブ2
え之の菌株に対して特異的なフルオレセイン接合のモノクローナル抗体を、呼吸
器検体の同様の直接的FAアフセイに使用して来た。簡単には、咽頭スワブを、
2つの前もって印を付けられた円形の部分(直径5鶴)上のガラススライド上で
ころがし、そして次に、そのスライドを95%エタノール中に10〜30間、浸
した。そのスライドを空気中で乾燥せしめた後、蛍光モノクローナル抗体接合体
を、その検体部分に通用した。そのスライドを湿潤室で37℃で30分間インキ
ュベートし、蒸留水を含む6個のジャーを通してすばや(浸し、そして乾燥せし
めた。
Bacto蛍光抗体封入液体(Difico Laboratories、 D
etroit。
Mich、)の−滴及びカバースリップを、そのスライドに適用し、次にエビフ
ルオレセンス顕微鏡(Carl Zeiss+ 0berkoehen+Wes
t Germany)により油含浸下で500倍で試験した。スミア−の全部分
を試験した。スライド上の調査結果は、少なくとも5個の蛍光性基本体が検体中
に見出される場合、TWAR株に関しては陽性として考慮された。陰性の調査結
果を有するスライドを、5分間読み取った。
TWAR単離物を有する7人の患者のうち6人からの咽のスワブスミア−を、蛍
光TWARモノクローナル抗体により染色した。
4人の患者において、クラミジアの典型的な基本体が示された。
B0月J目剋矢
フルオレセイン接合のTWAR株−特異性モツクローナル抗体を使用して、初期
HeLa 229細胞培養継代におけるTWAR単甜体単量体した。その細胞培
養単離技法は、例1.A、に記載されている。TWAR株−特異性モツクローナ
ル抗体による直接的な蛍光抗体(FA)染色は、TWAR単離体の同定をひじよ
うに促進せしめ、そしてこれらの単離体の直接的な継代を可能にした。
TWAR単離体のそれぞれは、封入体の直接的なFA染色によって一次HeLa
229細胞培養継代中に同定された。
C3皿痘学朔荻法
正常な3%卵黄のうホモジネートと混合された(スライド上に抗原の局在化及び
付着を助けるために) TWAR抗原を、顕微鏡のスライド上に点在せしめ、空
気乾燥せしめ、アセトンにより15分間、固定し、そして空気乾燥せしめた。連
続した2倍希釈の血清又は体液(たとえば涙)を、抗原上に適用し、そして、3
0℃で30分間、湿潤室でインキュベートした。このアッセイ内で、その流体は
、クラミジア基本体抗原と反応された。反応の後、そのスライドをPBSにより
5度洗浄し、そして空気乾燥せしめた。フルオレセイン接合の抗−マウス免疫グ
ロブリンを添加し、そして37℃で30分間、湿潤室でインキュベートせしめた
。インキュベートの後、スライドを蒸留水により5度洗浄し、そして空気乾燥せ
しめた。
FA封入流体の一滴を添加し、そしてカバースリ、ブをそのスライド上に置いた
。その反応をFA−顕微鏡下で観察した。
封入体の染色のためには、感染されたHeLa細胞を無水メタノール中において
10分間固定し、そしてTWAR−特異性抗体活性についてアッセイした。
第2表は、世界の7つの異なった領域からの成人の血清中に存在する、高い頻度
のTWAR抗体を示す。さらに、抗体は、女性よりも男性においてより頻繁に存
在することが見出され′た。
第2表
ヱlヱユL へルシンキ ノバスコチア試験された数 555 271 200
%TWAR抗体
男性 48 47 35
女性 41 36 18
試験された数 64 196 934 1042%TWAR抗体
男性 59 45 45
女性 52 40 36
例8
TMARのDNAの特徴化を通して、この例は、そのTWAR生物体が、p、−
トラコニ乙±21及び旦、−ズ」りし区と異なることを示す。
A、文旦マクヱ株:研究されたクラミジア株は、(1) TWAR: TW−1
83、AR−39、AR−231、AR−277、AR−388。
AR−427、AR−458及びLR−65(2、3) ;(2) C、1之交
之: 6 BC、骨髄肺炎(Mn)、ネコ肺炎(FP) 。
テンジクネズミ封入体結膜炎(GPIC)及び羊流産(OA) 、及び(3)旦
、生立ユヱ天ス: B/TW−510T 、D/UW−3/Cx及びL2/43
4 /BLIを含んだ。すべてのTWAR株は、1985年シアトルから得られ
た咽頭単離体であった。但し、TW−183(これは、1965年タイワンの子
供の結膜炎から単離された)を除く。すべてのLiま21株は、HeLa 22
9細胞培養物中での増殖に適合され、そしてRenografinの直線グラジ
ェントを通して精製された。
B、クーミジアDNAの゛−二又立ま乏ヱのDNAを、旦、トラコマチスのため
に前に記載したようにして単離した(Stephensなど、、 Infect
、 Immun、 47 : 713〜718.1985)。
基本的には、精製された基本体を、37℃で1時間、プロテイナーゼK (64
<3g/d)により処理し、そして1%SDS中に溶解した。フェノールによる
抽出の後、水性層を37℃で30分間、RNase(50<15 g / rr
! )により処理し、フェノール/クロロホルムにより抽出し、そしてエタノー
ルにより沈澱せしめた。
0.1立スま土(7)IIJ−=7’l”:試験サレ8 種ノTWARjl離体
は、アガロースゲル電気泳動によって決定される場合、それぞれ7.3及び6.
2 Kbpのプラスミドを含む、旦、上土且マチス及び旦−工之又之対照と比べ
て、明確なプラスミドDNAを含まなかった(Weissなど+l Infec
t、 IIIIIIILIIll、2 :244〜248.1970)。
使用される制限酵素は、BamHI 、 BstEII 、 Dpn I 、
EcoRI +HindI[[、Mbol 、 Mspl 、 Pstl、 5
an3A、及び5stlでありグイゼーションによる標準法によって行なわれた
(影ユ■畑扛Lエム」壇倶μm鄭ユ怒: 1400〜1401.1969)。制
限エンドヌクレアーゼ分析は、お互い及び2種のLiまグヱの株とTWAR単離
体との比較のために使用された。使用されるそれぞれの制限酵素により、TWA
R$離体は、トラホーム及び旦、上皇ユヱ±久のLGVバイオバーから容易に識
別され、そして5種の異なる旦、ブシタシの株が試験された。この方法の分析の
範囲によれば、TWAR単離体の結合パターンが、使用される酵素のうち8種と
同一であった。
E、サザン ハイブリダイゼーションS TWAR単離体の間の関係及び他のク
ラミジアとの関係をさらに調査するために、約500bp 、900bp 、
1200bp 、 3200bp及び3800b、のサイズの5種のランダムな
TWARのDNAフラグメントを、AR−39のDNAの遺伝子バンクから精製
し、そして染色体消化物をプローブするために使用した。第3図に示されるよう
に、3.8 kbp(第3A図)のTWARフラグメント又は3.2kbP(第
3B図)のフラグメントが、それぞれMspl又は旧ndI[Iにより消化され
た工旦亙工1D N Aのプローブとして使用される場合、それぞれの場合にお
いてハイブリダイズするフラグメントは、すべてのTWAR単離体のために同じ
であった。さらに、反応性は試験されたーC−、トラコマチス又は−q−、プ之
り之に関して観察されなかったが、両プローブはTWAR特異性であった。同じ
結果が他の3種のプローブに関して得られた。
F、プローブとして6 な” DNAG いるド・ トブロ・ トハイブ1 ゛
イゼーションオ いてのn311z: (、トラコマチス及び−C−1之り之に
対するTWARの関係を決定するために、ドツトプロット分析が、プローブとし
て完全な染色体DNAを用いて行なわれた。簡単に言えば、精製されたEBのD
NA0.2〜50gを、0.3MのNaC1中で10分間煮沸した。続いて、2
.0Mの酢酸アンモニウムを添加し、10001の最終体積にした。サンプルを
、Bio−DotMicrofiltration装置(Bio−Kad、 R
ichmond、 Ca1if、)の使用によってニトロセルロース(Tran
s−Blot、 Bio−Rad、 Richmond。
Ca1if、)に適用した。濾過の前、そのニトロセルロースを、IMの酢酸ア
ンモニづム中で洗浄し、DNA付着を高めた。
そのニトロセルロースを、前に記載したようにプレハイブリダイズする前及び後
で、80℃で2時間、焼いた。ニック−トランスレートされた完全な染色体クラ
ミジアDNAを、煮沸し、そして続いて急速な冷却によって変性し、そしてこれ
らのハイブリダイゼーション実験においてプローブとして使用した。 %相同体
を大まかに定量化するために、前記ニトロセルロースを、シンチレーション計数
のために、0mn1−fluor(Dnpont、 Boston、 Mass
、)中に懸濁された個々のドツトに切断した。
すべての実験において、はとんどの文旦マ乏ヱDNA調整物は少量のHeLaの
DNA汚染物を含むけれどもHeLaのDNAを対照としてスポット化した。T
WAR株AR−39,C,上立ユヱ±スセロバーD及び旦、プ之又之株6 BC
、FP 、 OA及びMnの完全な染色体DNAをニック−トランスレートし、
そして種々の単離物の変性された染色体DNAを含むドツトプロットのプローブ
として使用した。第2図に示されるように、2種の旦、トラコマチスバイオバー
も5種の−g−、プシタシ株のいづれも、AR−39プローブに対して有意な相
同性を示さなかった。他方、すべてのTWAR単離体は、強いハイブリダイゼー
ションシグナルを示した。TW483がプローブとして使用される場合、類似す
る結果が得られた。相反する実験が旦、トラコマチス又は−g−、プシタシのD
NAをプローブとして使用して行なわれる場合、バンクグラウンド上の反応性が
、いづれかのTWAR単離体により示された(データは示されていない)。
図及び第4図に示されるように、クローンされ、精製されたTWARフラグメン
トが、TWAR,C,7’之又之及びC,)ラコマ±困の分解された基本体のド
ツトプロットにおいてプローブとして使用される場合、試験された3種のフラグ
メント(900bp 、 1200bp及び3200bp)は、TWARとのみ
反応した。
上記に示されるように、DNAプローブの感受性は、(a)−末鎖のプローブの
使用;及び(b) リポソームrRNA遺伝子の単離を通して改良され得る。
ニオ言゛″のプローブの
二本鎖DNAプローブは、プローブの再アニーリングにより効率的にハイブリダ
イズしないので、ハイブリダイゼーションのために利用できるプローブの濃度は
低められる。従って、ハイブリダイゼーションにおいて一本鎖のプローブを用い
ることによってプローブの感受性を高めることができる。
この方法の主な制限は、十分に高い比活性へのその一本鎖のラベリングである。
この問題は、D N Aプローブの一本鎖挿入体を含む二本鎖ベクターをもたら
す条件を用いることによって避けられ得る(Arrand、 Nuclcic
Ac1d Hbridization :A Practica上m−中の”P
reparation of Nucleic Ac1dProbes+ ”1
7〜45ページ+ 0xford Press+ 0xford、 Engla
nd+1985)。pUCベクターにおけるTWAR遺伝子バンクの初期構造は
、−末鎖のバタテリオファージM13mp18の複製型(RF)へのサブクロー
ニングを促進する。なぜならば、これらのベクターは、同じ1acZ’/複数ク
ロ一ニング部位を共有するからである。M13“偶数の”ファージベクター(た
とえば、M13mp18)が、pB8322由来の配列(前記)にハイブリダイ
ズするであろうラベルされたプローブの産生を妨げるために、寄数シリーズ(た
とえば、M13mp18)の代わりに使用するために推薦される。この一本iJ
t D N Aプローブは、Hu及びMess ing(Gene 17 :
271〜277、1983)の方法によって調製され得る。
このプローブを放射性ラベルするために、市販されている一般のプローブプライ
マーを使用することができる。このプライマーは、ベクターDNAの合成を指図
し、そして制限された濃度の放射性前駆体の存在下において、そのプライマー付
加部分は、−零値DNAプローブ挿入体を含む二本鎖ベクター(M13)をもた
らす。M13mpバクテリオファージのRF型の単離、M13中へのptlcの
サブクローニングのための組換え体のサブクローニング及びM13100選択的
合成(及びラベリング)のためのすべての方法は、Messing(Meth、
Enz mol。
101 :20〜79.1983)によって記載されているようにして、標準方
法によって行なわれ得る。このプローブがサザンハイプリダイゼーションに使用
される場合、それはハイブリダイゼーションの前、変性されない。
リポソームRNA’ 云 の“。
DNAプローブの感受性を高めるためのもう1つの方法は、複数コピー配列を認
識するDNAプローブを使用することである。リポソームRNAに対して特異的
なりローン化されたDNAの使用は、細胞当りの目標分子(リポソーム)の多く
の数によって、1000倍まで検出を高めるための手段として記録されている(
Edelstein、 J、 Cl1n、 Microbiol、 22 :
425〜427+ 1986; Kingsbury、 Ra id Dete
ction and Identificationof Infection
s A enjs+ 91〜95ページ、 Academtc Press、
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1985; Palmer及びFalkoiv、 Microbioハ■198
6+ 91〜95ページ、 American 5ociety for Mi
crobiology、 Washington、 D、C,。
1986)。1つのそのような方法が下記に説明される。
合計のRANが、16sのrRNAの単離のために、最適な時間での後接種の決
定のために怒染せしめた後、種々の時間でTWAR培養物から単離される。rR
NAは、Kirby(Kirkなど、。
Bioch、 J、104: 258〜262.1967: Johnson、
Method in肛江吐棧包■ 月133〜71.1986)の変法によっ
て単離され得る。この方法は、DNA 、mRNAを実質的に含まないが、しか
しひじょうに少量のtRNAを含む細菌性rRNAO単離をもたらす(John
son、前記)。RNaseを含まない緩衝液を得るために、ジエチルピロカー
ボネー)(0,2%)を、1時間水溶液に添加し、そして続いてオートクレーブ
処理する。
ガラス器具は、乾燥加熱オーブン中で焼くことよって、RNaseを含まないよ
うにされ得る。精製された粒子を、遠心分離により収程し、dH20中に懸濁し
、そして10%ナフタレンジスルホネート及び75C+fのジエチルピロカーボ
ネートを添加する。フレンチプレスによって細胞をフェノール−クレゾール及び
0.5%ナフタレンジスルホネートの混合物中に通すことによって、細胞を分解
する。振った後、その混合物を、17.000xGで10分間、遠心分離し、そ
して水性層を取り出す。20X S S Cl0m/を添加し、そしてSDSを
添加し、0.1%の最終濃度にし、続いてもう1つのフェノール−クレゾール抽
出を行なう。RNAを、2体積のエタノールの添加により沈澱せしめ、そして遠
心分離によりペレット化する。残留D N A 、 m RN A及びtRNA
をさらに抽出するために、3Mの冷酢酸ナトリウムを添加し、その混合物を均質
化し、遠心分離にかけ、そして再沈澱せしめる。5s、16s及び23sのリポ
ソームKNAが、Grierson(Gel Electro horesis
of N1ucleic Ac1ds+ 1〜139ページ、IRL Pres
s+ 0xford。
1982)によって記載されているように、1.5%アガロースゲルから電気溶
離により精製される。50mMのTris −H(J中で加熱することによって
、RNAを軽いアルカリ加水分解にゆだね、そしてインキュベートの時間及び温
度はRNA種に依存して異なる(Maizels、皿 9 : 431〜438
.1976)。この加水分解段階は、ポリヌクレオチドキナーゼのための基質と
して5′ヒドロキシル基を利用するためにそれらの基を開放する。rRNAは、
標準方法(Maniatis、 g)によって、T4ポリヌクレオチドキナーゼ
による”PATPにより末端をラベル化される。おのおのの種は、種々の制限r
RNA遺伝子により調整されたTWARのサザンハイプリダイゼーションのプロ
ーブとして使用され得る。なぜならばほとんどの細菌種は、rRNA配列の複数
の遺伝子コピーを含むからである。
クローン化されたTWARのrRNA遺伝子を、TWAR検出におけるそれらの
感受性及び旦、トラコマチス及び旦、プ之り之とのそれらの反応性のために試験
する。サザンハイブリダイゼーションデーターに依存して、完全な遺伝子を含む
と思われるいづれかの制限フラグメントがアガロースゲルから電気溶離され、そ
して同様にして消化されたptlcI8中にクローン化され、又は前に構成され
た遺伝子バンクがプローブとして異なったrRNA種を用いてスクリーンされる
。TWARの16sr RN A遺伝子を含むフラグメントサイズに依存して、
その遺伝子は、両方向におけるDNA配列決定のために、M13mp18及びM
13mp19中に直接的にサブクローンされるか、又は小さなフラグメントに
消化、され、そしてそれらにサブクローンされる。すべてのDNA配列決定は、
BRLからの市販されているキットを用いて、標準方法によるジデオキシヌクレ
オチド鎖ターミネータ−法(Sangerなど+l Proc、 Nacl 、
Acad。
拡 74 : 5463〜5467、1977)によって行なわれ得る。クロー
ン化されたTWARのrRNA遺伝子は、TWAR検出におけるそれらの感受性
及び旦、王立ユヱ±ス及び旦、1ノ久之とのそれらの反応性について試験され得
る。
本発明の特定の態様が例示する目的のためにここで記載されたけれども、種々の
修飾が本発明の範囲内で行なわれ得る。
0^
FIG。2
A ・ ・
B・ ・
G ・
FIG、4
手続補正書(方式)
%式%
1、事件の表示
PCT/US87101011
、発明の名称
急性呼吸疾患に関連する独特のクラミジア株の検出
3、補正をする者
事件との関係 特許出願人
名称 ワシントンリサーチファウンデイション4、代理人
住所 〒105東京都港区虎ノ門−丁目8番10号5、補正命令の日付
6、補正の対象
(1) 特許法第184条の5第1項の規定による書面の「特許出願人の代表者
」の欄
(2)委任状
(3)明細書及び請求の範囲の翻訳文
7、補正の内容
+13 +21 別紙の通り
(3)明細書、請求の範囲の翻訳文の浄書(内容に変更なし)
8、添付書類の目録
(1) 訂正した特許法第184条の
5第1項の規定による書面 1通
(2)委任状及びその翻訳文 各1通
(3)明細書及び請求の範囲の翻訳文 各1通国際調査報告
国際調査報告
n=Mtbtuuiep−IC欝噸familymembexre+−+i++
(+a+bep−+cv++a昏Cunwmscnem=1高唐■≠窒■|me
nむ−w4自nferロー+isamwstthnp憂n。
1111fim ye at eam3i#4 is +be Eur@%2a
l’JIMI 0rke l’nl’ lik 中61 I1llII+ut
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leIy+hぜ)Cp−rl+eulxsh<hsee+n■窒モP4++ic
*161thepurp・拳Celinlarw+nna。
Claims (22)
- 1.TWAR生物体の抗原決定基に対して向けられたモノクローナル抗体。
- 2.急性呼吸疾患を引き起こすクラミジア株の抗原に結合するモノクローナル抗 体。
- 3.前記モノクローナル抗体が、前記抗原又は抗原決定基への、細胞系RR40 2によって産生された抗体の結合を阻止する請求の範囲第1又は第2項記載のモ ノクローナル抗体。
- 4.TWAR生物体の抗原決定基に対して向けられたモノクローナル抗体を産生 する連続したハイブリット細胞系。
- 5.前記ハイブリッド細胞系がRR402として同定されるハイブリドーマクロ ーンを含んで成る請求の範囲第4項記載の細胞系。
- 6.前記細胞系が、TWAR生物体に対する抗体を産生することができる免疫脾 臓細胞と骨髄腫細胞とのハイブリットである請求の範囲第4項記載の細胞系。
- 7.細胞系RR402。
- 8.請求の範囲第7項記載の細胞系によって産生されるモノクローナル抗体。
- 9.生物学的サンプル中においてTWAR生物体の存在を検出するための方法で あって: 請求の範囲第1〜3項のいづれかのラベルされたモノクローナル抗体に、TWA R生物体を含むと思われる生物学的サンプルを暴露し;そして 前記モノクローナル抗体とTWAR生物体との間に形成される免疫複合体の存在 を検出することを含んで成る方法。
- 10.前記ラベルを、酵素,蛍光団,放射性同位体及び発光体から成る群から選 択する請求の範囲第9項記載の方法。
- 11.前記検出の段階が酵素反応、蛍光、発光放射及び放射能によってである請 求の範囲第9項記載の方法。
- 12.前記生物学的サンプルを、体分泌物,体液及び組織検体から成る群から選 択する特許請求の範囲第9項記載の方法。
- 13.生物学的サンプル中においてTWAR生物体に対する抗体の存在を決定す るための方法であって:反応混合物を形成するために、TWAR生物体の基本体 と共に生物学的サンプルをインキュベートし;そしてTWAR生物体に対する抗 体の存在を決定するために前記反応混合物を分析することを含んで成る方法。
- 14.前記分析段階が、抗体のためのラベルされた特異的結合パートナーと反応 混合物とを接触し、そしてそのラベルを検出することを含んで成る請求の範囲第 13項記載の方法。
- 15.生物学的サンプルにおいてTWAR生物体の存在を検出するための方法で あって: TWAR生物体が細胞内に取り込まれるように、HeLa細胞と共にTWAR生 物体を含むと思われる生物学的サンプルを混合し;TWAR生物体を含むHeL a細胞をインキュベートし;TWAR生物体の抗原決定基に対して向けられた、 ラベルされたモノクローナル抗体にHeLa細胞/TWAR株を暴露し;そして TWAR生物体とラベルされたモノクローナル抗体との間に形成される免疫複合 体の存在を検出することを含んで成る方法。
- 16.前記混合段階が、サンプルによりHeLa細胞を接種し、そして続いてH eLa細胞上でその接種されたサンプルを遠心分離することを含んで成る請求の 範囲第15項記載の方法。
- 17.前記暴露段階がメタノールにより単層を固定することを含む請求の範囲第 15項記載の方法。
- 18.TWARを特異的に認識するDNAプローブ。
- 19.活性治療物質として使用する請求の範囲第18項記載のDNAプローブ。
- 20.前記DNAプローブが、TWAR生物体に由来する完全な染色体DNAプ ロブ又はDNAフラグメントプローブである請求の範囲第18項記載のDNAプ ローブ。
- 21.生物学的サンプルにおいてTWAR生物体の存在を検出するための方法で あって: サンプルに関連するDNAを単離するために、TWAR生物体を含むと思われる 生物学的サンプルを処理し;その単離されたDNAを基質に添加し;TWAR生 物体のDNA配列の少なくとも一部に特異的にハイプリダイズすることができる ラベルされたDNAプローブと共にそのDNA担持基質をインキュベートし;そ の基質からハイブリダイズされなかったプローブを分離し;そして 前記基質に関連するラベルの量を検出し、そしてそれからTWAR生物体の存在 又は不在かを決定することを含んで成る方法。
- 22.生物学的サンプルにおいてTWAR生物体の存在を検出するための方法で あって: TWAR生物体を含むと思われる生物学的サンプルを基質に添加し; サンプルに関連するDNAを暴露するために、前記付着されたサンプルを担持す る基質を処理し;TWAR生物体のDNA配列の少なくとも一部に特異的にハイ ブリダイズすることができるラベルされたDNAプローブと共に前記DNA担持 基質をインキュベートし;前記基質からハイブリダイズされなかったプローブを 分離し;そして その基質に関連するラベルの量を検出し、そしてそれからTWAR生物体の存在 又は不在かを決定することを含んで成る方法。
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