JPH0928381A - Ｓ−リボヌクレアーゼ遺伝子及びプロモーター配列 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 花柱特異的に発現するプロモーター配列及び
これを含むＳ遺伝子を提供する。 【解決手段】 ２種のＳ−リボヌクレアーゼｃＤＮＡを
プローブとして用い、トマト野生種（Lycopersicon per
uvianum）の染色体から前記ｃＤＮＡに相当する２種の
Ｓ遺伝子（配列番号１、２）を単離し、花柱特異的なプ
ロモーター配列を得た。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、Ｓ−リボヌクレア
ーゼ遺伝子及びこの遺伝子のプロモーター配列に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】地球上の半数以上の高等動物は、自家不
和合性という性質を有している。自家不和合性は、雌雄
の生殖器官が正常であるにもかかわらず、受粉から受精
に至る過程でめしべや柱頭内での花粉管の伸長が阻害さ
れ、自家受精をしないという性質である。

【０００３】自家不和合性の効果としては、受粉の際に
自己と非自己の花粉を区別し、非自己の花粉のみと受精
し、近親間の交配（inbreeding）を妨げることにある。
その結果、このような性質を有する植物では、他の植物
体の花粉のみと受精（outbreeding）し、自分の子孫を
残してきた。

【０００４】トマトやタバコ、ジャガイモなどが属する
ナス科植物にみられる自家不和合性の遺伝様式は、Ｓ−
部位（S-locus）と呼ばれる単一遺伝子座を有する復対
立遺伝子系（Ｓ遺伝子）で説明される。Ｓ遺伝子による
自家不和合性は概念として知られており、その機構は明
らかではなかったが、めしべ花柱に特異的な糖タンパク
質が発見され、これが自家不和合性に関与すると考えら
れるようになってきた。この糖タンパク質は、上記のＳ
遺伝子の型の違いによって、等電点電気泳動で異なるバ
ンドを示すことから、めしべ花柱のＳ遺伝子産物である
と考えられ、Ｓ−糖タンパク質と名付けられた。また、
Ｓ遺伝子とＳ糖タンパク質は、交配において常に行動を
共にする性質がある。

【０００５】すでに３種のトマト野生種のＳ糖タンパク
質及びこれをコードする３種のｃＤＮＡを単離し、これ
らがカビのリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）のアミノ酸
配列と相同性を有することを見出されている（特開平５
−１２６２８６号公報）。これらのトマトのＳ糖タンパ
ク質は、リボヌクレアーゼの活性染色により、リボヌク
レアーゼ活性を有することが示され、Ｓ−リボヌクレア
ーゼとも呼ばれている（チョン イル キョン（Chung,
I. K.）博士学位論文（東京大学））。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】ナス科植物であって
も、食用に供されるトマト栽培種リコペルシコン エス
クレンタム（Lycopersicon esculentum）は、自家不和
合性を有していないので、果実の品質や栽培適性におい
て、より商品価値の高いＦ１植物を育成するために、除
雄作業が必要である。そこで、トマト栽培種に自家不和
合性を付与するには、トマト栽培種と同じ属（genus）
に属し、自家不和合性を有するトマト野生種からのＳ遺
伝子を導入することが有効であると考えられる。しかし
ながら、Ｓ遺伝子は花柱特異的に発現し、植物の他の組
織ではこれは類似の転写産物は見つかっていない（Chun
g, I. K. et al., Bioscience Biotechnology Biochemi
stry,57, 1172-1176 (1993), Chung, I. K., et al., P
lant Molecular Biology, 26,757-762 (1994)）。した
がって、トマト栽培種や他の野生種のナス科植物に自家
不和合性を付与するには、花柱特異的にＳ遺伝子を発現
させる必要があると考えられ、花柱特異的に発現するプ
ロモーターが必要となる。

【０００７】上述したようにＳ−リボヌクレアーゼをコ
ードするｃＤＮＡはすでに取得されているが、染色体由
来のＳ遺伝子は得られておらず、そのプロモーター配列
も知られていない。

【０００８】本発明は、上記観点からなされたものであ
り、花柱特異的に発現するプロモーター配列及びこれを
含むＳ遺伝子を提供することを課題とする。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者は、すでに知ら
れている２種のＳ−リボヌクレアーゼｃＤＮＡをプロー
ブとして用い、トマト野生種（リコペルシコン ペルビ
アナム(Lycopersiconperuvianum)）の染色体から前記ｃ
ＤＮＡに相当するＳ遺伝子を単離し、さらにこれらの遺
伝子をタバコに導入し、花柱特異的に発現することを見
出し、本発明を完成させるに至った。

【００１０】すなわち本発明は、配列番号１において塩
基番号１〜２１３６で表される塩基配列の少なくとも一
部を有し、植物の花柱でプロモーター活性を有する限り
１又は２以上の塩基の欠失、挿入又は置換を含んでいて
もよいプロモーター配列、及び配列番号２において塩基
番号１〜１３６５で表される塩基配列の少なくとも一部
を有し、植物の花柱でプロモーター活性を有する限り１
又は２以上の塩基の欠失、挿入又は置換を含んでいても
よいプロモーター配列である。

【００１１】本発明はまた、前記プロモーター配列及び
Ｓ−リボヌクレアーゼをコードするＤＮＡ配列とを含む
Ｓ−リボヌクレアーゼ遺伝子ＤＮＡを提供する。Ｓ−リ
ボヌクレアーゼをコードするＤＮＡ配列としては、配列
番号３〜５に示すアミノ酸配列のいずれかをコードする
塩基配列を有するＤＮＡ配列が挙げられる。また、Ｓ−
リボヌクレアーゼをコードするＤＮＡ配列がイントロン
を含んでいてもよい。前記Ｓ−リボヌクレアーゼ遺伝子
ＤＮＡとして具体的には、配列番号１又は２に示す塩基
配列の少なくとも一部を有するＤＮＡが挙げられる。

【００１２】さらに本発明は、前記プロモーター配列と
他のＤＮＡ配列とを連結した組換えＤＮＡを植物に導入
し、前記ＤＮＡ配列を植物細胞中で発現させることを特
徴とする、花柱特異的にＤＮＡ配列を発現させる方法を
提供する。

【００１３】尚、本明細書において、「ＤＮＡ配列を発
現させる」とは、ＤＮＡ配列がセンス配列である場合に
は、そのＤＮＡ配列から転写及び翻訳によりこのＤＮＡ
配列がコードするタンパク質を生成させることを意味
し、ＤＮＡ配列がアンチセンス配列である場合には、そ
のＤＮＡ配列に相補的なＲＮＡを転写させることをい
う。

【００１４】

【発明の実施の形態】以下、本発明を実施の形態を説明
する。トマト野生種染色体からＳ遺伝子を取得する方法
としては、Ｓ−リボヌクレアーゼのアミノ酸配列に基づ
いて調製したオリゴヌクレオチドをプライマーとするポ
リメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）による
増幅により、トマト野生種ｃＤＮＡライブラリーからＳ
−リボヌクレアーゼｃＤＮＡを単離し、これをプローブ
とするハイブリダイゼーションしてトマト野生種染色体
ライブラリーからＳ遺伝子を保持するクローンを得る方
法が挙げられる。

【００１５】トマト野生種ｃＤＮＡライブラリーからの
Ｓ−リボヌクレアーゼｃＤＮＡの単離は、特開平５−１
２６２８６号公報に記載されている方法に従って行うこ
とができる。すなわち、タバコのＳ−糖タンパク質はリ
ボヌクレアーゼ活性をもち、そのアミノ酸配列が２種類
のカビ（リゾプス・ニベウス(Rhizopus niveus)、アス
ペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)）のリボヌク
レアーゼと相同性があること、及び植物から得られたＳ
−糖タンパク質にリボヌクレアーゼ活性の保存領域が存
在することから、これらの既知のＳ−リボヌクレアーゼ
に共通する保存領域のアミノ酸配列に基づいてオリゴヌ
クレオチドプライマーを合成する。このプライマー及び
ｍＲＮＡのpoly(A)鎖に相当するオリゴｄＴを用い、ト
マト野生種花柱由来のポリ（Ａ）ＲＮＡを鋳型とするＰ
ＣＲにより、Ｓ−リボヌクレアーゼｃＤＮＡを増幅する
ことができる。このようなプライマーの塩基配列を、配
列番号６及び７に示す。

【００１６】このようにして、系統の異なる３種のトマ
ト野生種から得られたＳ−リボヌクレアーゼｃＤＮＡの
塩基配列及びそれから予想されるアミノ酸配列を、配列
表の配列番３〜５に示した。また、これらのｃＤＮＡ配
列をプラスミドベクターｐＵＣ１１８又はｐＵＣ１１９
に挿入した組換えプラスミドで形質転換した大腸菌ＭＶ
１１９０株は、工業技術院生命工学工業技術研究所に、
ＦＥＲＭ Ｐ−１３６４２、ＦＥＲＭ Ｐ−１３６４３、
ＦＥＲＭ Ｐ−１３６４４として寄託されている。

【００１７】次に、上記のようにして得られたＳ−リボ
ヌクレアーゼｃＤＮＡを用いて、トマト野生種染色体ラ
イブラリーからＳ遺伝子を単離する。染色体ライブラリ
ーは、通常の方法によって調製することができる。すな
わち、トマトの葉などの組織からＤＮＡを調製し、これ
を制限酵素で部分的に切断し、ショ糖密度勾配遠心ある
いはアガロースゲル電気泳動により長いＤＮＡ断片を分
画し、これを適当なベクターに連結し、得られた組換え
ベクターを大腸菌などの宿主に導入することにより、染
色体ＤＮＡライブラリーが得られる。ベクターは、プラ
スミドを用いてもよいが、λファージベクターやコトミ
ドベクターを用いると、より長い断片を挿入することが
できる点で好ましい。

【００１８】得られたライブラリーから、Ｓ−リボヌク
レアーゼｃＤＮＡをプローブとするハイブリダイゼーシ
ョンを行うことにより、Ｓ遺伝子を保持するクローンを
得ることができる。続いて、得られたクローンから組換
えベクターを回収し、挿入フラグメントの塩基配列を決
定し、Ｓ−リボヌクレアーゼをコードしていることを確
認する。１つのクローンに完全長のＳ遺伝子が含まれて
いない場合には、再度スクリーニングを行ってもよい
が、複数のクローンに含まれる挿入フラグメントを連結
することによって、完全長遺伝子を得ることもできる。

【００１９】ｃＤＮＡの合成、ＤＮＡの合成、切断、連
結、形質転換等の方法は、各操作に使用する市販の酵
素、キット等に添付されている説明書に記載されている
方法をそのまま用いることができる。また、これらの操
作、遺伝子の塩基配列の決定、ハイブリダイゼーション
等一般の遺伝子組換えに必要な方法は、Molecular clon
ing (Maniatis T. et al. Cold Spring Harbor Laborat
ory Press)に記載されている。

【００２０】上記のようにして得られたＳ遺伝子の塩基
配列及びこの配列から予想されるアミノ酸配列を配列番
号１及び２に示す。配列番号１において塩基番号１〜２
１３６で表される塩基配列及び配列番号２において塩基
番号１〜１３６５で表される塩基配列は、プロモーター
領域を含んでいる。より具体的には、プロモーター配列
は、開始コドン（ＡＴＧ）の上流側約３００ｂｐ以内に
含まれていると考えられる。これらのプロモーター配列
は、花柱特異的にＤＮＡ配列を発現させる機能を有して
いる。このプロモーター配列は、花柱細胞中でプロモー
ター活性を有する限り、１又は２以上の塩基の欠失、挿
入又は置換を含んでいてもよい。

【００２１】このようなＳ遺伝子を自家不和合性を有し
ない植物に導入すると、花柱でＳ−リボヌクレアーゼを
発現させることができる。Ｓ遺伝子のコード領域として
は、配列番号３〜５に示すアミノ酸配列のいずれかをコ
ードする配列が挙げられる。具体的には、配列番号３〜
５のコード領域の塩基配列が挙げられる。さらに、配列
番号１又は２に示すコード領域のように、コード領域中
にイントロンを含んでいてもよい。

【００２２】また、前記プロモーター配列と他のＤＮＡ
配列とを連結した組換えＤＮＡを植物に導入し、前記Ｄ
ＮＡ配列を植物細胞中で発現させることにより、花柱特
異的にＤＮＡ配列を発現させることができる。他のＤＮ
Ａとしては、タンパク質又はペプチドをコードする配列
であってもよいし、これらをコードするＤＮＡ配列に対
するアンチセンス配列であってもよい。タンパク質又は
ペプチドをコードする配列を導入した場合には、これら
のタンパク質又はペプチドが花柱特異的に発現され、ア
ンチセンス配列を導入した場合には、これらのタンパク
質又はペプチドの発現が花柱特異的に抑制される。

【００２３】上記のようにして得られるＳ遺伝子を自家
不和合性を示さない植物に導入し、花柱でＳ−リボヌク
レアーゼを発現させることにより、自家不和合性を付与
することができることが期待される。所望の性質を有す
る植物を育種するためには、２種の植物を交雑してＦ１
植物を得るのが一般的であるが、交雑に用いる親植物の
それぞれに異なる自家不和合性遺伝子を導入し、自家和
合性を阻害するとともに、Ｓ遺伝子の発現量を高めるこ
とが望ましい。本発明により得られたＳ遺伝子は２種類
であり、上記のような利用に好適であると考えられる。

【００２４】また、本発明により得られたプロモーター
配列は花柱特異的に機能するので、遺伝子の発現制御の
研究や応用に利用することができると期待される。

【００２５】

【実施例】以下に、本発明を実施例によりさらに具体的
に説明する。 ＜１＞トマト野生種ｃＤＮＡライブラリーからのＳ−リ
ボヌクレアーゼｃＤＮＡの単離 （１）トマト野生種ｃＤＮＡライブラリーの作製 自家不和合性を有するトマト野生種（L. peruvianum）
のめしべ、花弁（花粉を一部含む）及び葉から、各々 K
ingston and Gilman の方法（Kingston, R.E.,Gilman,
M., "Current Protocols in Molecular Biology", ed.
by Ausubel, F.M. et al. Wiley and Sons, Inc., 198
7, P.4.3.1-4.5.3）に従って、全ＲＮＡを抽出し、さら
にpoly(A)鎖を有するｍＲＮＡ（poly(A)⁺ＲＮＡ）を得
た。

【００２６】上記で得られたpoly(A)⁺ＲＮＡを鋳型と
し、逆転写酵素を用いて１本鎖のｃＤＮＡを作製し、さ
らにこの１本鎖のｃＤＮＡをもとにして、ＤＮＡポリメ
ラーゼ（E.coli ＤＮＡ polymerase）、ＤＮＡリガーゼ
（E.coli ＤＮＡ ligase）、RNase H（E.coli RNase
H）を用いて２本鎖のｃＤＮＡを合成した。得られた２
本鎖ｃＤＮＡの両末端にＥｃｏＲＩアダプターを連結
し、それをファージベクターλｇｔ１１のＥｃｏＲＩ部
位に挿入し、イン・ビトロ パッケージングキット（Gi
gapack-plusキット：Stratagene社製）を用い、キット
添付の説明書の記載に従ってｃＤＮＡを含むファージの
再構築を行い、各々の組織ごとのｃＤＮＡライブラリー
とした。

【００２７】（２）既知のＳ−リボヌクレアーゼの配列
を利用したＰＣＲ法によるＳ−リボヌクレアーゼｃＤＮ
Ａの増幅 プライマーの作製 上記で得られたｃＤＮＡライブラリーからＳ−リボヌク
レアーゼｃＤＮＡを単離するために、ＰＣＲ法による増
幅を行った。この方法は、二本鎖ＤＮＡの一本鎖ＤＮＡ
への熱変性、増幅を目的とする部位の両端の配列に相当
する２種類のオリゴヌクレオチドプライマーと、前記熱
変性ＤＮＡとのアニーリング、前記オリゴヌクレオチド
をプライマーとしたポリメラーゼ反応からなる増幅サイ
クルを繰り返すことにより、前記ＤＮＡ配列を指数関数
的に増幅する方法である。

【００２８】はじめに、上記プライマーとして、数種類
のニコチアナ・アラータのＳ−リボヌクレアーゼ（Ande
rson, M.A. et al. Nature 321, 38-44 (1986)、Kheyr-
Pour, A. et al. Sex Plant Reprod. 3, 88-97 (199
0)）およびカビ（Rhizopus niveus、Aspergillus oryza
e）のリボヌクレアーゼ（Horiuchi, H. et al. J. Bioc
hem 103, 408-418 (1988)、Kawata, Y. et al. Eur. J.
Biochem 176, 683-697 (1988)）にみられる共通したリ
ボヌクレアーゼ活性をもつ保存領域のアミノ酸配列をも
とにして、２種類のプライマー（オリゴヌクレオチド
Ａ：配列番号６、オリゴヌクレオチドＢ：配列番号７）
をＤＮＡ合成機（Applied Biosystem社）で合成した。

【００２９】ＰＣＲ法によるＳ−リボヌクレアーゼｃ
ＤＮＡ断片の増幅 上記プライマーＡ及びＢを用いてｃＤＮＡを鋳型とする
ＰＣＲ反応を行ったが、既知のＳ−リボヌクレアーゼと
相同なｃＤＮＡ断片を得ることはできなかった。そこ
で、そこで、ｍＲＮＡの３’末端に存在するpoly(A)に
対応するようにオリゴｄＴ（オリゴヌクレオチドＤ：配
列番号８）を３’側のプライマーとし、これと上記オリ
ゴヌクレオチドＡを用いてＰＣＲ増幅反応を行った。Ｐ
ＣＲ反応に用いた反応液の組成は以下の通りである。
尚、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼには、Taq ポリメラーゼ
（製品名 AmpliTaq、宝酒造（株）から購入）を用い
た。

【００３０】

【表１】 Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．３ １０ｍＭ ５０ｍＭ ＫＣｌ ＭｇＣｌ₂ １．５ｍＭ ゼラチン ０．０１％（Ｗ／Ｖ） 各ｄＮＴＰ ０．２ｍＭ 耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ ２．５Ｕ ｃＤＮＡ ０．２μｇ 各プライマー ５０ｐｍｏｌ ─────────────────────────
── 滅菌水を足して全量を５０μｌにする

【００３１】また、ＰＣＲ反応の条件は以下の通りであ
る。 ＤＮＡの熱変性 ：９４℃ １分間 プライマーの会合：４２℃ ２分間 ＤＮＡの伸長 ：７２℃ ３分間

【００３２】以上の反応サイクルを１サイクルとして、
自動反応機（DNA Thermal Cycle 480：Perkin Elmer Ce
tus社製）を用いて、反応を３０サイクル繰り返した。
増幅反応産物を１．５％アガロースを用いたゲル電気泳
動で分離し、分離されたＤＮＡをナイロンメンブレン
（Hybond N+、Amersham社製）に写し取り、オリゴヌク
レオチドＡ及びオリゴヌクレオチドＣをハイブリダイゼ
ーションのプローブに用いたサザン解析を行ったとこ
ろ、プローブが特異的にハイブリダイズするバンドが検
出された。このバンドをアガロースゲルから切り出し、
ゲル切片からＤＮＡを抽出した。抽出されたＤＮＡ断片
の両末端を平滑化してプラスミドベクターｐＵＣ１１８
又はｐＵＣ１１９のＳｍａＩ部位に挿入し、得られた組
換えプラスミドを用いて大腸菌ＭＶ１１９０株を形質転
換し、約２００個のクローンを得た。

【００３３】上記で得られたクローンがＳ−リボヌクレ
アーゼ遺伝子断片を含むかどうかについて、オリゴヌク
レオチドＢおよびＤを用いてサザン解析を行った結果、
１８個のポジティブクローンを得た。各々のポジティブ
クローンに対する制限酵素切断解析および相互のサザン
解析の結果から、これらはすべて同一のｍＲＮＡを起源
とすることが予想された。しかし、これらのＤＮＡの塩
基配列を、塩基配列決定キット（Sequenase ver.2：Bio
chemical corporation社製）を用いたダイデオキシ法で
決定したところ poly(A)領域を含む３’側の非翻訳領域
の塩基配列が異なる２種類のｃＤＮＡクローン（クロー
ンＩ：７３０塩基対、クローンII：８２６塩基対）があ
ることがわかった。これらは、どちらも１６２個のアミ
ノ酸をコードする同一の読み取り枠（open reading fra
me）を持ち、ニコチアナ・アラータ及びカビのＳ−リボ
ヌクレアーゼのアミノ酸配列に見られる保存領域を含ん
でいた。尚、クローンIIは、ｐＵＣ１１８のＳｍａＩ部
位に挿入されている。

【００３４】さらに、クローンIIをプローブに用い、め
しべ、花弁、がく、葉から得たｍＲＮＡについてサザン
解析を行ったところ、約１０００塩基に相当するめしべ
のｍＲＮＡのみと強く結合した。このことからクローン
IIは、めしべ特異的なＳ−リボヌクレアーゼであること
が強く示唆される。また、クローンIIが８２６塩基対か
らなることから、このクローンはＳ−リボヌクレアーゼ
のｍＲＮＡの約８０％をカバーすると考えられる。

【００３５】次に、上記のトマト野生種とは自家不和合
性の系統の異なる、すなわちＳ−リボヌクレアーゼのジ
ェノタイプが異なるトマト野生種（L. peruvianum）２
種からも、Ｓ−リボヌクレアーゼｃＤＮＡのスクリーニ
ングを行った。上記と同様にしてｃＤＮＡにＥｃｏＲＩ
アダプターを連結し、λｇｔ１１をベクターとしてｃＤ
ＮＡライブラリーを作製した。クローンIIをプローブと
したプラーク・ハイブリダイゼーションにより、各々の
ライブラリーからＳ−リボヌクレアーゼｃＤＮＡを得
た。さらにサザン解析を行い、各ライブラリーから１つ
ずつのクローン（クローンIII、クローンIV）を得た。

【００３６】クローンIII、クローンIVの挿入断片を、
各々ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩを用いてベクターから切り
出し、各々をｐＵＣ１１８のＢａｍＨＩ部位、ｐＵＣ１
１９のＥｃｏＲＩ部位に挿入し、ｐＵＣ１１８−Ｓ１
２、ｐＵＣ１１９−Ｓ１３を得た。

【００３７】前記のクローンIIが挿入されているプラス
ミド（ｐＵＣ１１８−１１Ａ）、あるいはｐＵＣ１１８
−Ｓ１２、ｐＵＣ１１９−Ｓ１３を保持する大腸菌ＭＶ
１１９０（各々、E. coli TSSR-1、E. coli TSSR-2、E.
coli TSSR-3）は、工業技術院生命工学工業技術研究所
に、各々ＦＥＲＭ Ｐ−１３６４２、ＦＥＲＭ Ｐ−１３
６４３、ＦＥＲＭ Ｐ−１３６４４として寄託されてい
る。

【００３８】＜２＞トマト野生種染色体ＤＮＡライブラ
リーからのＳ遺伝子の単離 （１）トマト野生種染色体ＤＮＡライブラリーの調製 自家不和合性を有するトマト野生種（L. peruvianum）
（遺伝子型S11S12）の葉から、修正したＣＴＢＡ法（Ch
ung, I. K. et al., Plant Molecular Biology, 26, 75
7-762 (1994)）に従って、染色体ＤＮＡを抽出し、これ
を制限酵素Sau3AIで部分消化し、ショ糖密度勾配遠心に
より分画し、長鎖（９〜２３ｋｂ）のＤＮＡ断片を分取
した。

【００３９】上記で得られた長鎖のＤＮＡ断片をλファ
ージベクターＥＭＢＬ３（ストラタジーン(Stratagene)
社製）のBamHI部位に挿入し、得られた組換えベクター
をインビトロ・パッケージングキット（Gigapack-plu
s、ストラタジーン社製）を用いてファージ粒子にパッ
ケージし、約２×１０⁶個の独立クローンからなる染色
体ＤＮＡライブラリーを得た。

【００４０】（２）ライブラリーからのＳ遺伝子の単離 上述したように、交雑に用いる親植物のそれぞれに異な
る自家不和合性遺伝子を導入するために、複数のＳ遺伝
子の単離を目指し、ｐＵＣ１１８−１１Ａ及びｐＵＣ１
１８−Ｓ１２に含まれるｃＤＮＡ（各々順にＳ１１ｃＤ
ＮＡ、Ｓ１２ｃＤＮＡという）をプローブとして用い、
プラークハイブリダイゼーションによりＳ遺伝子を保持
するファージクローンのスクリーニングを行った。プロ
ーブはランダムプライマーを用いて³²Ｐ標識した。

【００４１】その結果、Ｓ１１をプローブとして用いた
場合には約５０万のファージから１個、Ｓ１２をプロー
ブとして用いた場合には約１００万のファージから４個
の陽性クローンを取得した。これらのクローンのゲノム
に含まれるインサートの制限酵素切断解析、サザン解析
及び一部の塩基配列から、これらはＳ１１ｃＤＮＡ及び
Ｓ１２ＳｃＤＮＡに相当するＳ遺伝子であることが示唆
された。Ｓ１１ｃＤＮＡに相当するＳ遺伝子をＳ１１遺
伝子（ファージクローン名：λＧＴＳ１１）、Ｓ１２ｃ
ＤＮＡに相当するＳ遺伝子をＳ１２遺伝子（ファージク
ローン名：λＧＴＳ１２）と命名した。各々の遺伝子の
制限酵素切断地図を図１に示す。図中、コード領域の開
始部位を矢印で示した。

【００４２】各クローンからＳ−リボヌクレアーゼをコ
ードする領域を含む断片を制限酵素で切り出し、ｐＵＣ
１１８にサブクローン化し、塩基配列決定キット（Seqe
nasever.2: バイオケミカルコーポレーション(Biochemi
cal Corporation)社製、TaqDNA polymerase: プロメ
ガ、マディソン(Promega、Madison)社製）を用いて、各
々の断片について塩基配列を決定した。

【００４３】その結果、Ｓ１１遺伝子は、Ｓ１１ｃＤＮ
Ａに相当し１０２ｂｐのイントロンを含むるコード領域
が、Ｓ１２遺伝子はＳ１２ｃＤＮＡに相当し９１ｂｐの
イントロンを含むコード領域が、各々認められた。Ｓ１
１遺伝子の転写開始部位を調べるためにプライマーイク
ステンションを行ったところ、配列番号１において１２
９８番目のＧ（グアニン）に相当する強い単一のバンド
が認められ、このＧが転写開始部位であると推定され
た。また、２つのＳ遺伝子のＡＴＧコドンの上流３００
ｂｐ以内には、高度類似性が高い３つのブロック（ブロ
ックＡ、Ｂ、Ｃ）が見い出された（図２）。これらは、
Ｓ遺伝子の組織特異的な発現のための転写制御配列に含
まれると考えられる。

【００４４】Ｓ１１遺伝子及びＳ１２遺伝子のサブクロ
ーンを保持するE. coli MV1190株は、通商産業省工業技
術院生命工学工業技術研究所に、それぞれ順にＦＥＲＭ
Ｐ−１５０４２、ＦＥＲＭ Ｐ−１５０４３の受託番
号で寄託されている。

【００４５】（３）Ｓ１１遺伝子及びＳ１２遺伝子の各
々の遺伝子型の確認 Ｓ１１遺伝子及びＳ１２遺伝子が由来する各々の親植物
を掛け合わせて得られた異なるＳ表現型を有する植物か
ら染色体ＤＮＡを調製し、サザン解析を行ったところ、
得られた植物はＳ１１及びＳ１２アリール（allele）を
持っていた。この結果から、Ｓ１１遺伝子及びＳ１２遺
伝子が、お互い異なるＳ表現型の植物由来であることが
確認された。

【００４６】（４）Ｓ遺伝子の栽培種植物へ導入 プロモーター配列を含むＳ１１遺伝子を、植物体へのベ
クターの導入を確認できるカナマイシン耐性遺伝子を有
する植物導入ベクターｐＢＩ１０１（クロンテック(Clo
ntech)社製）に挿入した。Ｓ１１遺伝子のサブクローン
を制限酵素ＳａｌＩ及びＸｂａＩで切断し、これと制限
酵素XbaI及びSalIで切断したｐＢＩ１０１とを連結し
（図３）、得られた組換えプラスミドをアグロバクテリ
ウム（Agrobacterium）ＬＢＡ４４０４のホーストに導
入した。これを栽培種のタバコの葉の断片と混合して２
日間培養した後、カナマイシンを添加した植物培養用培
地で生育させた。

【００４７】６カ月後、花が咲いたとき、形質転換タバ
コの花柱組織からＲＮＡ及びタンパク質を抽出し、ｃＤ
ＮＡをプローブに用いたノザン解析（図４）及びリボヌ
クレアーゼ活性染色（図５）を行った。その結果、トマ
ト野生種の花柱組織でのＳ遺伝子の転写産物及びＳ−リ
ボヌクレアーゼの含有量と同程度の発現が認められた。

【００４８】

【発明の効果】本発明により、花柱特異的に発現するプ
ロモーター配列及びこれを含むＳ遺伝子が得られたの
で、自家不和合性を有しない植物に自家不和合性を付与
することができることが期待される。また、所望のＤＮ
Ａ配列を花柱特異的に発現させることができる。

【００４９】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：3044 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：リコヘ゜ルシコン ヘ゜ルヒ゛アナム(Lycopersiconperuvianum) 配列の特徴 特徴を表す記号：TATA signal 存在位置：1987..1990 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：CDS 存在位置：2137..2364 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：CDS 存在位置：2467..2877 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：intron 存在位置：2365..2466 特徴を決定した方法：S 配列 GTCGACATAA ATCATATGCA AATATTAGAA GGAGAGGACT AGAATTTTCT ATAGGGGATT 60 GGGTGTTCTT TAAGGTGTCT CCGATGAAAG GGGTAATGAG GTTTGGTAAA AAAGGAAAGC 120 TGAGTCCACG CTATATATAG GGCATATAAG ATTATCCAAA AATTTGGGCA AGTAGCCTAT 180 GAGTTATATC TACCACACGA GCTTTCATCA CTTCATCCGG TGTTTCATGT TTCAATTCTA 240 GGAAAATGTG TAGGTGACCC ATATCGTATT ACTCCTACTG AAGATGTACA GTTATGAGAG 300 ATCTCACTTA TGAAGAAGTA CCCATTGCTA TTTTGGTTCT ATATGAAGCA ACCGGAAGGA 360 TTTGTGGTTC CAAGAAAGGA ACACATGGTG TGCAAGCTCA CCAGGAGCTT GTATGGACTG 420 AAACAAGCAC CAAGGCAGTG GTACAGGAGG TTTGACTCCT TCATGACCAA GAGTGGATTC 480 TTCAAAGCTG AAAGGGATCT TTGTTGTTAC TTCAAGAAAT ACACTGATTC ATATGTCTTT 540 CTACTCTTGT ACGTTGATGA TATGTTGATT GCAGGATTTA GTATGAGGGA GATTAACAAT 600 CTGAATACAA GGTTGTCTGC AGCGTTTGAG ATGAAAGATT TGGGTCCTGA AGCAGATTTT 660 GGTGATGAAG ATTTCTCGGG ATAGATCTGC TGGCACTTTA AATCTATCTC AGGAGTTGTA 720 CATTGAGAAG GTGTAGAGCA GATTTTGGGT TAATGCATTT TAAACCCAGG ATTACTCCAT 780 TGGCAAATCA CTTTAAATTG TCAATGGAGC AGTCACCCAA GACAGCCGAG GAGCGTTCAG 840 ATATGCACTT GTTTCATATC TTCTGTAAGC GGATCGCGGG AGCAGACAAG CCCGTCCCAG 900 GTCGACGGTG TTGGCGGGTG TCGGGGCTGG CTTAACTATG CGGCATCAGA GCAGATTGTA 960 CTGAGAGTGC ACCATAAAAT TGTAAACGTT AATATTTTGT TAAAATTCGC GTTAAATTTT 1020 TGTTAAATCA GCTCATTTTT AAACCAATAG GCCCAAATCG GGCAAATCCC TTACATCAAA 1080 AGAATAGCCC GAGATAGGGT TGAGTGTTGT TCCAGTTTGG GAAAAGAGTC CACTATTAAA 1140 GGACGTGGAC TCCAACGTTA AAGGGGCGAA AACCGTCTAT CAGGGCGATG GCCCCTACGT 1200 GAACCATCAC CCAAATCAAG TTTTTTGGGG TCGAGGTGCC GTAAAGCACT AAATCGGAAC 1260 CCTAAAGGGA GCCCCCGATT TAGAGCTTGA CGGGGAAAGC CGGCGAACGT GGCGAGAAAG 1320 GAAGGGAAGA AAGCAAAGGA GCGGCGCTAG GGGGCTGGCA AGTGTAGCGG TCCTGCGCGT 1380 AACCACCAAA AACACACAGC CTAATGCGCC GCTACAGGGG GCGTACTATG GTTGCTTTGA 1440 CGTATGCGGT GTGAAATACC GCACAGATGC GTAAGGAGAA AATACCGCAT CAGGCGCCAT 1500 TCGCCATTCA GCTGCGCAAC TGTTGGTAAG GGCGATCGGT GCGGGCCTCT TCGCTATTAC 1560 GCCAGCTGGC GAAAGGGGGA TGTGCTGCAA GGCGATTAAG TTGGGTAACG CCAGGGTTTT 1620 CCTGTGGTTT GTGTTTGGTG GGAGTGTGGT GGTGTGTGTG TTGTGGTGGT GGTGGGTGTG 1680 GTGGTTGGTC CCCCCCCGCC CCACCACACC ACCACCCCCA CCCCTTATCA CCACCGCCCG 1740 AAAAAAAAAG TTTTTTTAAA AAATATTTTC AATTTCATAA ATTATTTTGT ATTCTAGTAA 1800 AAATAAAAAA TATTCTTCAA AAATATTTTT CATTCATAAA TCAAACACTA AAAAATCATT 1860 TCCAAAAAAA ATTGCTACTC ATCAACCAAA CATGAGAAAA AAAGTCCAAA ATCTACTTGT 1920 TTCCAGGAAA ACATTTTCCT TCATACCAAA CACACCCTAC ATATAAAATG TAGAGGTACT 1980 CCGGATTATA ATATGATGCC TTTTATTGGA AAAAGTAGGA CTTAGCTACC AGACATCCCA 2040 CAATTTCAAT CCGGCACTCA TCAATGGAGC CTCGAGAAAA AGACTTATAT AAGGCATCCG 2100 ACGAAAGGAT ATGAAGTGAA TTGTTCAAAC TACACA ATG TTT AGA CCA CAG ATT 2154 Met Phe Arg Pro Gln Ile 1 5 ATA GGT TTC TTC ATT ATG CTT TGT GCT TTT TAT CAC GTT TAT GGG ACA 2202 Ile Gly Phe Phe Ile Met Leu Cys Ala Phe Tyr His Val Tyr Gly Thr 10 15 20 TTT GAC CAA TTG CAA CTG GTA TTA AGA TGG CCT ACA TCC TTT TGC AAT 2250 Phe Asp Gln Leu Gln Leu Val Leu Arg Trp Pro Thr Ser Phe Cys Asn 25 30 35 GGG AAA AAT TGC AAA AGA ACT CCA AAG GAC TTT ACA ATC CAT GGG CTT 2298 Gly Lys Asn Cys Lys Arg Thr Pro Lys Asp Phe Thr Ile His Gly Leu 40 45 50 TGG CCG GAT AGC GAA GCT GGA GAA CTG AAT TTT TGT AAT CCC AGA GCT 2346 Trp Pro Asp Ser Glu Ala Gly Glu Leu Asn Phe Cys Asn Pro Arg Ala 55 60 65 70 TCG TAT ACT ATT GTC AGG GTAAAGTTCC CCATTAGTTC CTCAAAAAAA 2394 Ser Tyr Thr Ile Val Arg 75 AAAATAACAA TTTATTTTTA AGATTTTATT TTTATTTTTC GCAAAAATAA GCAATTTCTT 2454 TTATGTTTAT AG CAT GGA ACA TTT GAA AAG AGG AAC AAG CAC TGG CCT 2502 His Gly Thr Phe Glu Lys Arg Asn Lys His Trp Pro 1 5 10 GAC TTG ATG CGA AGC AAA GAC AAT AGT ATG GAT AAC CAA GAA TTC TGG 2550 Asp Leu Met Arg Ser Lys Asp Asn Ser Met Asp Asn Gln Glu Phe Trp 15 20 25 AAA CAT GAA TAC ATA AAG CAT GGA TCG TGT TGT ACA GAT CTA TTC AAT 2598 Lys His Glu Tyr Ile Lys His Gly Ser Cys Cys Thr Asp Leu Phe Asn 30 35 40 GAA ACA CAA TAC TTT GAT TTA GCG TTG GTT TTA AAA GAC AGG TTT GAT 2646 Glu Thr Gln Tyr Phe Asp Leu Ala Leu Val Leu Lys Asp Arg Phe Asp 45 50 55 60 CTT CTG ACG ACT TTC AGA ATT CAT GGA ATT GTC CCT CGA TCA TCT CAT 2694 Leu Leu Thr Thr Phe Arg Ile His Gly Ile Val Pro Arg Ser Ser His 65 70 75 ACT GTT GAT AAA ATT AAA AAA ACT ATC AGG TCA GTT ACT GGG GTT CTT 2742 Thr Val Asp Lys Ile Lys Lys Thr Ile Arg Ser Val Thr Gly Val Leu 80 85 90 CCT AAT CTC TCT TGC ACT AAA AAT ATG GAT CTT TTG GAG ATA GGA ATA 2790 Pro Asn Leu Ser Cys Thr Lys Asn Met Asp Leu Leu Glu Ile Gly Ile 95 100 105 TGT TTC AAC AGA GAA GCA AGT AAG ATG ATT GAT TGT ACA AGA CCT AAG 2838 Cys Phe Asn Arg Glu Ala Ser Lys Met Ile Asp Cys Thr Arg Pro Lys 110 115 120 ACG TGC AAC CCT GGC GAA GAT AAT TTG ATT GGG TTT CCA TGATGAATAA 2887 Thr Cys Asn Pro Gly Glu Asp Asn Leu Ile Gly Phe Pro 125 130 135 CTTTTTTTTA TTTTTCTTCA TTGGTTACTC CTTTATGTTC GATGGTAAAA ATACAACAAA 2947 TAAGAAATCG ATACAAAAAT TCAAGCATAT TGAGGCAATA AGTTATTATT GAGCTACATT 3007 TTGTTGAATC AGGTCATAAT AACATTTTAA TCAACCT 3044

【００５０】配列番号：２ 配列の長さ：2241 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：リコヘ゜ルシコン ヘ゜ルヒ゛アナム(Lycopersiconperuvianum) 配列の特徴 特徴を表す記号：TATA signal 存在位置：1255..1258 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：CDS 存在位置：1366..1596 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：CDS 存在位置：1688..2098 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：intron 存在位置：1597..1687 特徴を決定した方法：S 配列 TCCCGGAGAC GTCACAGCTT GTAAGCAATT TGGAGTTTTA TGTATGTTAT GGTCTGCACT 60 AGAGCTGATA TAGCACATGA AGTGGGAGTT GATAGCAAGG AACATGGCGA ACCCAAGGGA 120 AAGCGATTGG GAAGCTGTAA GTGGCTTCTG GAGATATCTG AGAGGTACAT CCAGTACTTC 180 ACTTTGTATT GGCAAAGGCA AGGTGACTCT ACAAGGTTTT ATGAATGCTG ATCTTGGTGG 240 GGATGTGGAC TCAAGCAAGA GTATATTCGG GTACATTTGC ACCATTGGTG GAACAACAGT 300 GAGTTGGATG TTCAGGCTTC AGAAGTGTAT TTTTCTTTCA TCTACTGAAG TTGAGTATGT 360 GGCAATAGTT GTAGCTCAGA AAGAGATGAT ATGGCTGACA GATTATCTTG AGGAAATTGG 420 CAAGAAGCAG AGCGGAAATA TTCTTTACTC AGATAGCCAG AGTGCCATAC AGTTGGTGAA 480 AAATCCAGTG TATCATTCTA CGGCAAAGGA AATCAGAAGG CGGTACCCTT TTACTCGGAT 540 GTTTAGTGGC GGATGGGGGA TACCGTGTTG GAAGTAGAGG GGCAAAAACC GCCCCTTTGG 600 GGGTCAAAAC CTCGGTTGGT CTTCTGTAGT TGTTTCTACA GATGTTGCGT GCGGTAAAGA 660 TATTGATGAT GAAGAGATTT TTTTTTTGAG AATGTATTTT TTTGGATGAC TGAATCAGTC 720 TCTCTGTGGG AGAATTGTTA GGTTGCGAGC CTGATTAATA TTTGATGTAC TTTCATATAT 780 TAATGTTTAG GCTTTACTAT TTATTCTCTG TAACCTAAAA TACTCGGATT TATTAATATA 840 TATACCCATC GCCGTGGAAG TTTACTCATG GGGTGTTACC ACGAAATATT GATTTCCCTC 900 TTTCTCTCTG ATCTCTCATC TTTCTCTCTA AAGTCCTTGT ATTTCAATTC ATCAAGTGTG 960 TGTGTGGATT CGATTCTAAC AAAAGAAAGA ACACAATCAT AACTATGGTT ATTGTGTAAG 1020 TAGAAAAAAT AACAAATCAT AATTCTCAAT TTATTGAGCT AGCTAAATAT GATCAACATC 1080 CATTATTTTT CAGTACATTT CCCATGATTT TCTTTTTATA ATACAAATTA ATTATTTAAT 1140 AATATCAGTA TGAAACTTTT TAAAAATTCA TACTCATTGG TATGGGTTTT GGCGTACACC 1200 ATAAGACTAG TAATAGTATC ATATCGAAAA AAATTAGTTA TTGGTATATT GAAATACTAA 1260 TTATCACATG GGCGAAAGAG AATTTCTAAC CCATACCGTC AATTGGATGA ATTCTATTTA 1320 TAGCATTGGA AAAAGGTAAA GAATGTGAGC TTTTCAGACT AAAGA ATG TTT AAA 1374 Met Phe Lys 1 ACA CAG CAC ACG TTA GCT TTC TTC ATT TTG CTT TGT GCT CTT CCT GAT 1422 Thr Gln His Thr Leu Ala Phe Phe Ile Leu Leu Cys Ala Leu Pro Asp 5 10 15 GTT TAT GGA ACA TTC AAC CAA TTG CAA CTA GTT TTA AGA TGG CCC GCA 1470 Val Tyr Gly Thr Phe Asn Gln Leu Gln Leu Val Leu Arg Trp Pro Ala 20 25 30 35 TCT TTT TGC AAG GGC AAG AAA TGT GAG AGA ACT CCG AAC AAC TTT ACA 1518 Ser Phe Cys Lys Gly Lys Lys Cys Glu Arg Thr Pro Asn Asn Phe Thr 40 45 50 ATC CAC GGG CTA TGG CCG GAT ATA AAG GGC ACA ATT CTT AAT AAT TGC 1566 Ile His Gly Leu Trp Pro Asp Ile Lys Gly Thr Ile Leu Asn Asn Cys 55 60 65 AAT CCC GAT GCT AAA TAT GCC TCT GTC ACG GTACATTGCA GCACGATTTT 1616 Asn Pro Asp Ala Lys Tyr Ala Ser Val Thr 70 75 CGAGAAAACT TGTTTAGTTT TGTAACATCT TTTGTCCTGA CCAAAATATG TTTCCTTTTT 1676 AATGTTTACA G GGC GGT AAA TTT GTT AAG CGG AAC AAG CAC TGG CCT GAC 1726 Gly Gly Lys Phe Val Lys Arg Asn Lys His Trp Pro Asp 1 5 10 TTG ATC CTC ACC GAA GCT GCT TCT CTG AAT AGT CAA GGT TTC TGG GCG 1774 Leu Ile Leu Thr Glu Ala Ala Ser Leu Asn Ser Gln Gly Phe Trp Ala 15 20 25 TAT CAA TTC AAA AAG CAT GGA ACA TGT TGT TCA GAT CTC TTC AAT CAA 1822 Tyr Gln Phe Lys Lys His Gly Thr Cys Cys Ser Asp Leu Phe Asn Gln 30 35 40 45 GAA AAA TAT TTT GAT TTA GCC TTG ATC TTA AAA GAC AAA TTC GAT CTT 1870 Glu Lys Tyr Phe Asp Leu Ala Leu Ile Leu Lys Asp Lys Phe Asp Leu 50 55 60 TTG ACA ACA TTC AGA AAC AAG GGA ATT ATC CCC AAA TCA ACT TGT ACC 1918 Leu Thr Thr Phe Arg Asn Lys Gly Ile Ile Pro Lys Ser Thr Cys Thr 65 70 75 ATT AAT AAA ATC CAA AAA ACC ATC CGA ACA GTT ACT GGA GTG GTT CCT 1966 Ile Asn Lys Ile Gln Lys Thr Ile Arg Thr Val Thr Gly Val Val Pro 80 85 90 AAT CTC TCC TGT ACT CCA ACA ATG GAA CTT TTG GAG GTA GGA ATA TGT 2014 Asn Leu Ser Cys Thr Pro Thr Met Glu Leu Leu Glu Val Gly Ile Cys 95 100 105 TTT AAC CGA GAT GCA AGC AAA TTG ATA GAC TGT GAT CAA CCT AAA ACA 2062 Phe Asn Arg Asp Ala Ser Lys Leu Ile Asp Cys Asp Gln Pro Lys Thr 110 115 120 125 TGC GAC ACC TCG GGA AAT ACG GAA ATT TTC TTT CCT TAACGAATGA 2108 Cys Asp Thr Ser Gly Asn Thr Glu Ile Phe Phe Pro 130 135 CATCTTTCTT TCTCTCTCTC TTACCCTGTG AAAAACGAAT GACATCTTTC TTTCTCTCTC 2168 TCTTACCCTG TGAAAAATAT AATAAAATCA ATTCCCTTGG AATCAAGTCC ATCAAGCTTA 2228 CAGTTATTCT AGA 2241

【００５１】配列番号：３ 配列の長さ：826 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：トマト野生種（Lycopersicon peruvianum） 組織名：めしべ 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：1..489 配列 CAT GGG TTG TGG CCG GAT ATA AAG GGC ACA ATT CTT AAT AAT TGC AAT 48 His Gly Leu Trp Pro Asp Ile Lys Gly Thr Ile Leu Asn Asn Cys Asn 1 5 10 15 CCC GAT GCT AAA TAT GCC TCT GTC ACG GGC GGT AAA TTT GTT AAG CGG 96 Pro Asp Ala Lys Tyr Ala Ser Val Thr Gly Gly Lys Phe Val Lys Arg 20 25 30 AAC AAG CAC TGG CCT GAC TTG ATC CTC ACC GAA GCT GCT TCT CTG AAT 144 Asn Lys His Trp Pro Asp Leu Ile Leu Thr Glu Ala Ala Ser Leu Asn 35 40 45 AGT CAA GGT TTC TGG GCG TAT CAA TTC AAA AAG CAT GGA ACA TGT TGT 192 Ser Gln Gly Phe Trp Ala Tyr Gln Phe Lys Lys His Gly Thr Cys Cys 50 55 60 TCA GAT CTC TTC AAT CAA GAA AAA TAT TTT GAT TTA GCC TTG ATC TTA 240 Ser Asp Leu Phe Asn Gln Glu Lys Tyr Phe Asp Leu Ala Leu Ile Leu 65 70 75 80 AAA GAC AAA TTC GAT CTT TTG ACA ACA TTC AGA AAC AAG GGA ATT ATC 288 Lys Asp Lys Phe Asp Leu Leu Thr Thr Phe Arg Asn Lys Gly Ile Ile 85 90 95 CCC AAA TCA ACT TGT ACC ATT AAT AAA ATC CAA AAA ACC ATC CGA ACA 336 Pro Lys Ser Thr Cys Thr Ile Asn Lys Ile Gln Lys Thr Ile Arg Thr 100 105 110 GTT ACT GGA GTG GTT CCT AAT CTC TCC TGT ACT CCA ACA ATG GAA CTT 384 Val Thr Gly Val Val Pro Asn Leu Ser Cys Thr Pro Thr Met Glu Leu 115 120 125 TTG GAG GTA GGA ATA TGT TTT AAC CGA GAT GCA AGC AAA TTG ATA GAC 432 Leu Glu Val Gly Ile Cys Phe Asn Arg Asp Ala Ser Lys Leu Ile Asp 130 135 140 TGT GAT CAA CCT AAA ACA TGC GAC ACC TCG GGA AAT ACG GAA ATT TTC 480 Cys Asp Gln Pro Lys Thr Cys Asp Thr Ser Gly Asn Thr Glu Ile Phe 145 150 155 160 TTT GGT TAACGAATGA CATCTTTCTT TCTTTCTCTC TCTTACCCTG TGAAAATATA 536 Phe Gly ATAAAATCAA TTCCCTTGGA ATCAAGTCCA TCAGGCTTAC AGTTATTCTA GACGACAACA 596 TTAAGGAAAC AATTAGAAGT AAATTGTTGT CAGTAATGGA AAACAATAGT GGACCGAGTT 656 TATGATATTA CTTAATGATC AAGAACATTA AGTGTCTCTT ATACTACTGG CCTTGTCATT 716 ATGCTTGATT ATCCCCCAAA ATCCTAATAT AATATTTTTC TATAAAATCA AAAGTTCAAG 776 TAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 826

【００５２】配列番号：４ 配列の長さ：779 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：トマト野生種（Lycopersicon peruvianum） 組織名：めしべ 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：1..571 配列 C CAA TTG CAA CTG GTA TTA AGA TGG CCT ACA TCC TTT TGC AAT GGG AAA 49 Gln Leu Gln Leu Val Leu Arg Trp Pro Thr Ser Phe Cys Asn Gly Lys 1 5 10 15 AAT TGC AAA AGA ACT CCA AAG GAC TTT ACA ATC CAT GGG CTT TGG CCG 97 Asn Cys Lys Arg Thr Pro Lys Asp Phe Thr Ile His Gly Leu Trp Pro 20 25 30 GAT AGC GAA GCT GGA GAA CTG AAT TTT TGT AAT CCC AGA GCT TCG TAT 145 Asp Ser Glu Ala Gly Glu Leu Asn Phe Cys Asn Pro Arg Ala Ser Tyr 35 40 45 ACT ATT GTC AGG CAT GGA ACA TTT GAA AAG AGG AAC AAG CAC TGG CCT 193 Thr Ile Val Arg His Gly Thr Phe Glu Lys Arg Asn Lys His Trp Pro 50 55 60 GAC TTG ATG CGA AGC AAA GAC AAT AGT ATG GAT AAC CAA GAA TTC TGG 241 Asp Leu Met Arg Ser Lys Asp Asn Ser Met Asp Asn Gln Glu Phe Trp 65 70 75 80 AAA CAT GAA TAC ATA AAG CAT GGA TCG TGT TGT ACT GAT CTA TTC AAT 289 Lys His Glu Tyr Ile Lys His Gly Ser Cys Cys Thr Asp Leu Phe Asn 85 90 95 GAA ACA CAA TAC TTT GAT TTA GCG TTG GTT TTA AAA GAC AGG TTT GAT 337 Glu Thr Gln Tyr Phe Asp Leu Ala Leu Val Leu Lys Asp Arg Phe Asp 100 105 110 CTT CTG ACG ACT TTC AGA ATT CAT GGA ATT GTC CCT CGA TCA TCT CAT 385 Leu Leu Thr Thr Phe Arg Ile His Gly Ile Val Pro Arg Ser Ser His 115 120 125 ACT GTT GAT AAA ATT AAA AAA ACT ATC AGG TCA GTT ACT GGG GTT CTT 433 Thr Val Asp Lys Ile Lys Lys Thr Ile Arg Ser Val Thr Gly Val Leu 130 135 140 CCT AAT CTC TCT TGC ACT AAA AAT ATG GAT CTT TTG GAG ATA GGA ATA 481 Pro Asn Leu Ser Cys Thr Lys Asn Met Asp Leu Leu Glu Ile Gly Ile 145 150 155 160 TGT TTC AAC AGA GAA GCA AGT AAG ATG ATT GAT TGT ACA AGA CCT AAG 529 Cys Phe Asn Arg Glu Ala Ser Lys Met Ile Asp Cys Thr Arg Pro Lys 165 170 175 ACG TGC AAC CCT GGC GAA GAT AAT TTG ATT GGG TTT CCA TGATGAATAA 578 Thr Cys Asn Pro Gly Glu Asp Asn Leu Ile Gly Phe Pro 180 185 CTTTTTTTTA TTTTTCTTCA TTTTACTCCT TTATGTTCGA TGGTAAAAAT ACAACAAATA 638 AGAAATCGAT ACAAAAATTC AAGCATATTG AGGCAATAAG TTATTATTGA GCTACATTTT 698 GTTGAATCAG GTCATAATAA CATTTTAATC AACCTAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 758 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA A 779

【００５３】配列番号：５ 配列の長さ：817 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：トマト野生種（Lycopersicon peruvianum） 組織名：めしべ 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：1..622 配列 T TCA ACC ATA TCC ATT TAT GGG TCA TTC GAC CAT TGG CAA CTT GTT 46 Ser Thr Ile Ser Ile Tyr Gly Ser Phe Asp His Trp Gln Leu Val 1 5 10 15 TTG ACT TGG CCA GCA GGC TTC TGC AAA ACT AAG GAT TGT CCT AGA AAA 94 Leu Thr Trp Pro Ala Gly Phe Cys Lys Thr Lys Asp Cys Pro Arg Lys 20 25 30 GAT ATT CCA AAC AAC TTT ACC ATT CAT GGC GTT TGG CCA GAT CAC ACC 142 Asp Ile Pro Asn Asn Phe Thr Ile His Gly Val Trp Pro Asp His Thr 35 40 45 TCC TTC GTC ATG TAT GAC TGT GAT CCC CTA AAA AAG TAT AAA ACA ATA 190 Ser Phe Val Met Tyr Asp Cys Asp Pro Leu Lys Lys Tyr Lys Thr Ile 50 55 60 GAT GAT ACA AAT ATA CTC ACT GAA CTG GAT GCC CGC TGG CCT CAA TTG 238 Asp Asp Thr Asn Ile Leu Thr Glu Leu Asp Ala Arg Trp Pro Gln Leu 65 70 75 ACT TCC ACC AAA ATA ATT GGG TTG CAA TTT CAA AGA TTC TGG GAA TAT 286 Thr Ser Thr Lys Ile Ile Gly Leu Gln Phe Gln Arg Phe Trp Glu Tyr 80 85 90 95 GAA TAT AGA AAG CAT GGA ACG TGT TGT GCA GAT GTC TTC AAT CAA TCT 334 Glu Tyr Arg Lys His Gly Thr Cys Cys Ala Asp Val Phe Asn Gln Ser 100 105 110 ATG TAT TTT GAC ATA TCC ATG AAA TTA ACA GAT TCG ATT GAT CTT TTG 382 Met Tyr Phe Asp Ile Ser Met Lys Leu Thr Asp Ser Ile Asp Leu Leu 115 120 125 AAA ATT CTA AGA ACA AAG GGA ATT AAA CCT GGA TAT ACT TAT ACC GGT 430 Lys Ile Leu Arg Thr Lys Gly Ile Lys Pro Gly Tyr Thr Tyr Thr Gly 130 135 140 GAC CAA ATC AGT CGT GCC ATT AAG TCA GTT ACT CAA AAT AAT CCA AAC 478 Asp Gln Ile Ser Arg Ala Ile Lys Ser Val Thr Gln Asn Asn Pro Asn 145 150 155 CCC AAG TGC ACT TAT ATA GGG AGA AGC TTG GAA CTA ATT GAG ATA GGC 526 Pro Lys Cys Thr Tyr Ile Gly Arg Ser Leu Glu Leu Ile Glu Ile Gly 160 165 170 175 ATA TGT TTC AAC CGA ACA ACA AAT GCT CTG ATG CCA TGC CCT CGA ATC 574 Ile Cys Phe Asn Arg Thr Thr Asn Ala Leu Met Pro Cys Pro Arg Ile 180 185 190 AGT ACG TCA TGC AAG TTA GGG ACC TTA GAA GGG GTA AAG TTT CGA 619 Ser Thr Ser Cys Lys Leu Gly Thr Leu Glu Gly Val Lys Phe Arg 195 200 205 TGATCATCTC TTTCTTTCTT TTTCTTGATA ATGTATAATA AAACGTCAGA GACATCCGTG 679 ACCGACATAA CTATAAAGAA AAATGTTATT CTTGTTGACG GCATTACGGA ACCAGTGGAA 739 GGGAATGTCT TGTTAATCAA TTTATGATCA GTACAAAATA GCCATACTCA AGATATGAAT 799 GTTGGATACC TCGTTAAA 817

【００５４】配列番号：６ 配列の長さ：17 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CAYGGNYTNT GGCCNGA 17

【００５５】配列番号：７ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GTNCCRTGYT TDWYRYAYTC 20

【００５６】配列番号：８ 配列の長さ：15 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TTTTTTTTTT TTTTT 15

【００５７】配列番号：９ 配列の長さ：13 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 モチーフＡ配列 配列 AAAAATAAMA AAT 13

【図面の簡単な説明】

【図１】 Ｓ１１遺伝子（λＧＴＳ１１）及びＳ１２遺
伝子（λＧＴＳ１２）の制限酵素切断地図。図中、Ｅ、
Ｂ、Ｈ、ＳＩ、Ｓ及びＸは、各々EcoRI、BamHI、HindII
I、SalI、SacI及びXbaIを表す。

【図２】 Ｓ遺伝子プロモーター領域における組織特異
的な発現様式を示すと考えられる配列の比較を示す図。

【図３】 Ｓ１１遺伝子とｐＢＩ１０１との結合を示す
図。

【図４】 形質転換タバコの花柱組織ＲＮＡ及びトマト
野生種花柱組織ＲＮＡのノザン解析の結果を示す図（電
気泳動写真）。

【図５】 形質転換タバコの花柱組織タンパク質及びト
マト野生種花柱タンパク質の組織のリボヌクレアーゼ活
性染色の結果を示す図（電気泳動写真）。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 9/22 9281−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 南 洪吉 大韓民国浦項市池谷洞山31 (72)発明者 高木 正道 東京都府中市栄町１−31−10

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１において塩基番号１〜２１３
   ６で表される塩基配列の少なくとも一部を有し、植物の
   花柱でプロモーター活性を有する限り１又は２以上の塩
   基の欠失、挿入又は置換を含んでいてもよいプロモータ
   ー配列。
2. 【請求項２】 配列番号２において塩基番号１〜１３６
   ５で表される塩基配列の少なくとも一部を有し、植物の
   花柱でプロモーター活性を有する限り１又は２以上の塩
   基の欠失、挿入又は置換を含んでいてもよいプロモータ
   ー配列。
3. 【請求項３】 請求項１または２記載のプロモーター配
   列及びＳ−リボヌクレアーゼをコードするＤＮＡ配列と
   を含むＳ−リボヌクレアーゼ遺伝子ＤＮＡ。
4. 【請求項４】 Ｓ−リボヌクレアーゼをコードするＤＮ
   Ａ配列が、配列番号３〜５に示すアミノ酸配列のいずれ
   かをコードする塩基配列を有する請求項３記載のＳ−リ
   ボヌクレアーゼ遺伝子ＤＮＡ。
5. 【請求項５】 Ｓ−リボヌクレアーゼをコードするＤＮ
   Ａ配列がイントロンを含む請求項４記載のＳ−リボヌク
   レアーゼ遺伝子ＤＮＡ。
6. 【請求項６】 配列番号１又は２に示す塩基配列の少な
   くとも一部を有する請求項５記載のＳ−リボヌクレアー
   ゼ遺伝子ＤＮＡ。
7. 【請求項７】 請求項１又は２に記載のプロモーター配
   列と他のＤＮＡ配列とを連結した組換えＤＮＡを植物に
   導入し、前記ＤＮＡ配列を植物細胞中で発現させること
   を特徴とする、花柱特異的にＤＮＡ配列を発現させる方
   法。