JPH09267085A - Biologically restoring and purifying method for contaminated soil - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To reduce not only the decomposition efficiency of a contaminated substance but also an equipment and the cost required to soil restoration by using a decomposition microorganism precultured in a range within a specified temp. difference with a previously monitored contaminated soil as the decomposition microorganism to be brought into contact with the contaminated soil. SOLUTION: The decomposition microorganism to be brought into contact with the contaminated soil is the decomposition microorganism precultured at a range within 5 deg.C temp. difference between the previously monitored contaminated soil. The effective proliferation of a decomposed matter and activity are obtained without especially increasing the temp. of the soil since a temp shift at series of growth process including from the preculture of the decomposition microorganism having the decomposition ability of the contaminated substance to the growth in the soil affects largely to its decomposition ability, and moreover, the decomposition microorganism cultured by the preculture at which the temp. difference with the soil is within 5 deg.C is charged to the contaminated soil, thereby not only the decomposition efficiency of the contaminated substance but also the reducing of the equipment and the cost required for the soil restoration are possible.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、芳香族化合物及び
有機塩素化合物の少なくとも１種により汚染された土壌
の修復に有効な生物的修復浄化方法に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a biological remediation and purification method effective for remediating soil contaminated with at least one of aromatic compounds and organic chlorine compounds.

【０００２】[0002]

【従来の技術】近年、生体に対し有害でありかつ難分解
性である有機塩素化合物による環境汚染が大きな間題と
なってきている。特に、国内外のＩＣ工場等のハイテク
産業地域の土壌中にはテトラクロロエチレン（ＰＣＥ）
やトリクロロエチレン（ＴＣＥ）、ジクロロエチレン
（ＤＣＥ）等の塩素化脂肪族炭化水素化合物による汚染
がかなりの範囲で拡がっていると考えられており、実際
に環境調査等で検出された事例が多数報告されている。
これらの有機塩素化合物は土壌中に残留したものが雨水
等により地下水中に溶解して周辺地域一帯に拡がるとさ
れている。このような化合物は発癌性や生殖毒性の疑い
があり、また環境中で非常に安定であるため、特に飲料
水の水源として利用されている地下水の汚染は大きな社
会間題とされている。2. Description of the Related Art In recent years, environmental pollution due to organic chlorine compounds, which are harmful to living bodies and hardly decomposed, has become a major issue. Especially, tetrachlorethylene (PCE) is found in the soil of high-tech industrial areas such as IC factories in Japan and overseas.
It is considered that the contamination by chlorinated aliphatic hydrocarbon compounds such as trichlorethylene (TCE) and dichloroethylene (DCE) has spread to a considerable extent, and many cases actually detected by environmental surveys have been reported. There is.
It is said that those organic chlorine compounds remaining in the soil are dissolved in groundwater by rainwater or the like and spread throughout the surrounding area. Since such compounds are suspected to have carcinogenicity and reproductive toxicity and are extremely stable in the environment, pollution of groundwater used as a water source for drinking water is a major social issue.

【０００３】このようなことから、有機塩素化合物の除
去・分解による土壌の浄化修復は、環境保全の視点から
重要な課題であり、浄化に必要な種々の技術関発が行わ
れてきている。例えば、活性炭による吸着処理、光や熱
による分解処理等が検討されてきたが、これらの方法は
コストや操作性の面から必ずしも実用的であるとはいえ
ない。From the above, the purification and restoration of soil by removing and decomposing organic chlorine compounds is an important issue from the viewpoint of environmental protection, and various technical incentives necessary for purification have been made. For example, adsorption treatment with activated carbon and decomposition treatment with light and heat have been studied, but these methods are not always practical in terms of cost and operability.

【０００４】一方、環境中では安定である（ＴＣＥ）等
の有機塩素化合物に対して近年微生物による分解が報告
され、その実用化に向けた研究がなされ始めている。即
ち、微生物を用いた生物分解処理では、用いる微生物を
選択することで有機塩素化合物を無害な物質までに分解
できること、基本的に特別な薬品が不要であること、メ
ンテナンスにかかる労力やコストを軽減できること等の
利点がある。On the other hand, in recent years, decomposition of organic chlorine compounds such as (TCE), which is stable in the environment, by microorganisms has been reported in recent years, and studies for their practical use have begun. That is, in the biodegradation treatment using microorganisms, it is possible to decompose organic chlorine compounds into harmless substances by selecting the microorganisms to be used, basically no special chemicals are required, and maintenance labor and cost are reduced. There are advantages such as what can be done.

【０００５】有機塩素化合物分解能を有する微生物で単
離された報告としては、例えば、ＴＣＥ分解菌として
は、Welchia alkenophila sero 5 (USP 4877736、ATCC5
370)、Welchia alkenophila sero 33 (USP4877736, ATC
C53571)、Methylocystis sp. strain M ［Agric. Biol.
Chem., 53, 2903 (1989)、Biosci. Biotech. Bioche
m., 56, 486 (1992)、同56,736(1992))、Methylosinus
trichosprium OB3b (Am. Chem. Soc. Natl. Meet. Dev.
Environ. Microbiol., 29, 365 (1989)、Appl. Enviro
n. Microbiol., 55, 3155 (1989)、Appl. Biochem. Bio
technol., 28, 877(1991)、特開平02-92274号公報、特
開平03-292970号公報］、Methylomonas sp.MM2 (Appl.
Environ. Microbiol., 57, 236 (1991))、Alcaligenes
denitrificans ssp. xylosoxidans JE75 (Arch. microb
iol., 154, 410 (1990))、Alcaligenes eutrophus JMP1
34 (Appl. Environ. Microbiol., 56, 1179(1990))、Al
caligenes eutrophus KSO1（特開平07-123976号公
報）、Mycobacterium vaccae JOB5(J. Gen. Microbio
l., 82, 163 (1974)、Appl. Environ. Microbiol., 54,
2960(1989)、ATCC29678)、Pseudomonas putida BH［下
水道協会誌、24,27(1987)、Acinetobactor sp. strain
G4 (Appl. Environ. Microbiol., 52, 383 (1986)、同5
3,949 (1987)、同54,951 (1989)、同56,279 (1990)、同
57,193 (1991)、USP4925802、ATCC53617、この菌は初め
Pseudomonas cepaciaと分類されていたが、Acinetobact
or sp.に変更された］、Pseudomonas mendocina KR-1
［Bio/Technol., 7, 282 (1989)、Pseudomonas putida
F1 (Appl. Environ. Microbiol., 54.,1703 (1988)、同
54,2578 (1988)］、Pseudomonas fluorescens PFL12 (A
ppl. Environ. Microbiol., 54, 2578 (1988))、Pseudo
monas fluorescens NRRL-B-18296 (USP 4853334)、Pseu
domonas putida KWl-9（特開平06-70753号公報）、Pseu
domonas cepacia KK01（特開平06-227769号公報）、Nit
rosomonas europaea (Appl. Environ. Microbiol., 56,
1169 (1990))、Lactobacillus vaginalis sp. nov (In
t. J. Syst. Bacteriol., 39, 368 (1989)、ATCC49540)
等が知られている。As a report isolated from a microorganism capable of degrading an organic chlorine compound, for example, as a TCE-degrading bacterium, Welchia alkenophila sero 5 (USP 4877736, ATCC5
370), Welchia alkenophila sero 33 (USP4877736, ATC
C53571), Methylocystis sp. Strain M [Agric. Biol.
Chem., 53, 2903 (1989), Biosci. Biotech. Bioche
m., 56, 486 (1992), ibid. 56,736 (1992)), Methylosinus
trichosprium OB3b (Am. Chem. Soc. Natl. Meet. Dev.
Environ. Microbiol., 29, 365 (1989), Appl. Enviro
n. Microbiol., 55, 3155 (1989), Appl. Biochem. Bio
technol., 28, 877 (1991), JP 02-92274 A, JP 03-292970 A], Methylomonas sp.MM2 (Appl.
Environ. Microbiol., 57, 236 (1991)), Alcaligenes
denitrificans ssp. xylosoxidans JE75 (Arch. microb
iol., 154, 410 (1990)), Alcaligenes eutrophus JMP1
34 (Appl. Environ. Microbiol., 56, 1179 (1990)), Al
caligenes eutrophus KSO1 (JP 07-123976), Mycobacterium vaccae JOB5 (J. Gen. Microbio
l., 82, 163 (1974), Appl. Environ. Microbiol., 54,
2960 (1989), ATCC29678), Pseudomonas putida BH [Sewer Association Journal, 24, 27 (1987), Acinetobactor sp. Strain
G4 (Appl. Environ. Microbiol., 52, 383 (1986), 5
3,949 (1987), 54,951 (1989), 56,279 (1990),
57,193 (1991), USP4925802, ATCC53617,
It was classified as Pseudomonas cepacia, but Acinetobact
or sp.], Pseudomonas mendocina KR-1
[Bio / Technol., 7, 282 (1989), Pseudomonas putida
F1 (Appl. Environ. Microbiol., 54., 1703 (1988), same
54,2578 (1988)], Pseudomonas fluorescens PFL12 (A
ppl. Environ. Microbiol., 54, 2578 (1988)), Pseudo
monas fluorescens NRRL-B-18296 (USP 4853334), Pseu
domonas putida KWl-9 (Japanese Patent Laid-Open No. 06-70753), Pseu
domonas cepacia KK01 (Japanese Patent Laid-Open No. 06-227769), Nit
rosomonas europaea (Appl. Environ. Microbiol., 56,
1169 (1990)), Lactobacillus vaginalis sp. Nov (In
t. J. Syst. Bacteriol., 39, 368 (1989), ATCC49540)
Etc. are known.

【０００６】最近になって、これらの分解菌を用いて実
際に芳香族化合物及び／または有機塩素化合物によって
汚染された土壌を修復しようとする試みがなされてい
る。[0006] Recently, attempts have been made to use these degrading bacteria to actually repair soil contaminated with aromatic compounds and / or organic chlorine compounds.

【０００７】しかし、自然環境である土壌には、当然の
ことながら実験室での理想的な培養系とは異なった、ｐ
Ｈ、含水量、温度、酸素量等様々な土壌に特有の要因が
存在しており、これらの要因が分解微生物の増殖及び分
解活性発現の最適化を困難なものとしている。その結果
として分解微生物による土壌修復には末だ多くの課題が
残されているのが現状である。However, in the soil which is a natural environment, it is natural that p, which is different from the ideal culture system in the laboratory,
There are various factors peculiar to soil such as H, water content, temperature and oxygen content, and these factors make it difficult to optimize the growth of degrading microorganisms and expression of degrading activity. As a result, many problems remain for soil restoration by degrading microorganisms.

【０００８】その中でも温度条件は、分解微生物の増殖
及び分解活性発現に直接的に関与するため非常に重要で
ある。通常日本のような温帯地域での土壌中の温度は一
年を通じて１５℃程度でほぽ一定しているといわれてお
り、一般的な微生物の培養温度としてはかなり低い。Among them, the temperature condition is very important because it is directly involved in the growth of the degrading microorganism and the expression of the degrading activity. It is generally said that the temperature in soil in a temperate zone such as Japan is about 15 ° C. throughout the year, which is fairly low as a general microorganism culture temperature.

【０００９】これに対し、これまでにも、このような土
壌中の温度を制御することにより、分解微生物による土
壌修復の効率化を図る試みがなされている。[0009] On the other hand, attempts have been made so far to increase the efficiency of soil restoration by degrading microorganisms by controlling the temperature in the soil.

【００１０】特表平４−５０３５２８では、ロドコツク
ス属及びマイコバクテリウム属に属する微生物を用いた
土壌中のクロロフェノール類の分解において、ｐＨ、水
分、酸化還元電位、栄養、通気等と並んで温度を調整す
ることにより微生物の生物活性機能を改善することが開
示されている。具体的には、例えば、熱を発生するコン
ポスト化や、外部加熱手段によつて土壌を加熱すること
で微生物の生物活性温度である２０℃から３５℃に土壌
温度を維持するというものである。In Japanese Patent Publication No. Hei 4-503528, in the decomposition of chlorophenols in soil using microorganisms belonging to the genus Rhodococcus and the genus Mycobacterium, the temperature along with pH, moisture, redox potential, nutrition, aeration, etc. It is disclosed that the bioactive function of microorganisms is improved by adjusting Specifically, for example, composting that generates heat or heating the soil by an external heating means maintains the soil temperature at 20 ° C. to 35 ° C., which is the biological activity temperature of microorganisms.

【００１１】ＤＥ３７２０８３３Ａ１においても、汚染
土壌の微生物処理に対して土壌に温風を導入することに
より土壌中の温度を高め（１５℃から５０℃程度）、該
微生物の活性を維持する方法が開示されている。DE 3720833A1 also discloses a method for maintaining the activity of the microorganism by increasing the temperature in the soil (about 15 ° C. to 50 ° C.) by introducing warm air into the soil to treat the contaminated soil. ing.

【００１２】その他、汚染土壌のバイオリアクター処理
（ＤＥ３９２１０６６Ｃ２）や、地下水汲み揚げ処理
（特開昭５７一２０９６９２）においても温度を上げる
方法で分解微生物の活性を高める方法がとられている。In addition, in the bioreactor treatment of contaminated soil (DE3921066C2) and the groundwater pumping treatment (Japanese Patent Laid-Open No. 57-209692), a method of increasing the activity of the degrading microorganisms is employed by increasing the temperature.

【００１３】このように従来の技術においては、分解微
生物の活性を高めるために環境中（土壌の温度を高める
といった手段が採られていた。As described above, in the conventional technique, means for raising the temperature of the environment (soil temperature) has been adopted in order to enhance the activity of the degrading microorganisms.

【００１４】[0014]

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記の
土壌の温度管理を行う方法では、土壌温度を上昇させる
ために多大なエネルギーや特別な設備を要する等の問題
があり、経済的な効率において課題を有するものであっ
た。However, the above-mentioned method for controlling the temperature of soil has a problem that a large amount of energy and special equipment are required to raise the soil temperature, which is a problem in terms of economical efficiency. It was something that had.

【００１５】本発明の目的は、汚染物質の分解効率のみ
ならず、土壌修復に要する設備や経費における低減化を
可能とし、経済的にも効率的な汚染土壌の生物的修復浄
化方法を提供することにある。An object of the present invention is to provide not only the efficiency of decomposing pollutants, but also the equipment and cost required for soil restoration, and an economically efficient biological restoration and purification method for contaminated soil. Especially.

【００１６】[0016]

【課題を解決するための手段】本発明の汚染土壌の生物
的修復浄化方法は、芳香族化合物及び有機塩素化合物の
少なくとも１種で汚染された汚染土壌に、該化合物を分
解し得る分解微生物を接触させて該化合物を分解するこ
とにより前記汚染土壌を修復浄化する方法において、前
記汚染土壌に接触させる分解微生物が、予めモニターし
た汚染土壌との温度差が５℃以内の範囲で前培養した分
解微生物であることを特徴とする。The method for biological remediation and purification of contaminated soil according to the present invention provides a degrading microorganism capable of decomposing the compound in contaminated soil contaminated with at least one of an aromatic compound and an organic chlorine compound. In the method for repairing and purifying the contaminated soil by contacting and decomposing the compound, the degrading microorganisms that come into contact with the contaminated soil are pre-cultured within a temperature difference of 5 ° C. or less with the previously monitored contaminated soil. It is characterized by being a microorganism.

【００１７】本発明は、汚染物質の分解能を有する分解
微生物の前培養から土壌中での増殖を含む一連の増殖過
程における温度シフト（温度ギャップ）がその分解能に
大きな影響を与えること、更には、汚染土壌の修復浄化
に分解微生物を適用する場合、土壌の温度を該分解微生
物が活発に増殖する、あるいは高活性を発揮する比較的
高い至適温度に土壌の温度を上げるよりも、土壌との温
度差を５℃以内とした前培養で培養した分解微生物を汚
染土壌に投与することで、土壌温度を外部加熱手段によ
って特に上昇させなくても、十分かつ効率的な分解微生
物の増殖及び活性が土壌中で得られる、という本発明者
らによる新たな知見に基づいてなされたものである。According to the present invention, a temperature shift (temperature gap) in a series of growth processes including pre-culture of a degrading microorganism having the ability to decompose pollutants and growth in soil has a great influence on the resolution. When applying degrading microorganisms for repair and purification of contaminated soil, rather than raising the temperature of the soil to a relatively high optimum temperature at which the degrading microorganisms actively grow or exhibit high activity, By administering the degrading microorganisms cultivated by pre-culturing with a temperature difference of 5 ° C or less to the contaminated soil, sufficient and efficient growth and activity of the degrading microorganisms can be achieved without increasing the soil temperature by an external heating means. It was made based on a new finding by the present inventors that it can be obtained in soil.

【００１８】本発明によれば、汚染物質の分解効率のみ
ならず、土壌修復に要する設備や経費における低減化を
可能とし、経済的にも効率的な汚染土壌の生物的修復浄
化方法を提供することが可能となる。According to the present invention, not only the efficiency of decomposing pollutants but also the equipment and cost required for soil restoration can be reduced, and an economically efficient biological restoration and purification method for contaminated soil is provided. It becomes possible.

【００１９】例えば、先に挙げた従来例においては、予
め通常の培養温度（一般に２５℃から３７℃前後）で培
養した分解微生物を土壌中に導入している。しかし、こ
のような場合、導入時点において既に培地と土壌との温
度差（ギャップ）が存在し、その温度差が該分解微生物
の増殖及び活性に悪影響を及ぼす。即ち、該温度差によ
るダメージのために分解微生物の初期的な増殖及び活性
が不十分となる一方で、元々土壌中に存在する微生物
（土着微生物）に該分解微生物の増殖及び活性化を達成
する目的で導入した酸素や栄養素が消費されてしまい、
結果的に十分な分解活性が発揮されないことになる場合
がある。また、分解微生物導入前に予め土壌中の温度を
２５℃から３０℃前後に高めた揚合には、増殖至適温度
が分解微生物と近く、分解微生物と競合する土着微生物
の働きを活性化する要因となり、この方法も得策ではな
い。For example, in the above-mentioned conventional example, a degrading microorganism previously cultivated at a normal culturing temperature (generally around 25 ° C. to 37 ° C.) is introduced into the soil. However, in such a case, there is already a temperature difference (gap) between the medium and the soil at the time of introduction, and the temperature difference adversely affects the growth and activity of the degrading microorganism. That is, the initial growth and activity of the degrading microorganisms are insufficient due to the damage due to the temperature difference, while the growth and activation of the degrading microorganisms are achieved by the microorganisms originally present in the soil (indigenous microorganisms). Oxygen and nutrients introduced for the purpose are consumed,
As a result, sufficient decomposition activity may not be exhibited. In addition, when the temperature in the soil is raised from 25 ° C to around 30 ° C before the introduction of the degrading microorganisms, the optimum growth temperature is close to that of the degrading microorganisms and activates the action of the indigenous microorganisms that compete with the degrading microorganisms. It becomes a factor and this method is not a good idea.

【００２０】[0020]

【発明の実施の形態】本発明は、特に、土壌中の温度
が、用いる分解微生物が増殖する下限の温度よりも高
く、２０℃以下の場合、即ち、米国農務省の定めるＳｏ
ｉｌ Ｔａｘｏｎｏｍｙにおけるフリジット（ｆｒｉｇ
ｉｄ）、メシック（ｍｅｓｉｃ）、サーミック（ｔｈｅ
ｒｍｉｃ）土壌において効果を発揮する。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION The present invention is particularly applicable to a case where the temperature in soil is higher than the lower limit temperature at which the degrading microorganism used grows and is 20 ° C. or less, that is, the SoD determined by the US Department of Agriculture.
fl Taxi in il Taxonomy
id, mesic, thermic (the)
rmic) Effective in soil.

【００２１】本発明においては、例えば、温度が１５℃
の土壌に通常培養温度が２５℃程度の微生物を投入する
場合は、前培養条件を適宜調整して、培養温度が１０℃
〜２０℃程度の間となるように前培養を行なう。In the present invention, for example, the temperature is 15 ° C.
When microorganisms with a normal cultivation temperature of about 25 ° C are added to the soil, the pre-cultivation conditions are adjusted appropriately so that the cultivation temperature is 10 ° C.
Pre-culture is performed so that the temperature is between about -20 ° C.

【００２２】その際、２５℃で培養した場合と同等の菌
数を確保できる条件を設定するのが好ましい。この場
合、２５℃で培養した場合に比べて目的とする菌数に増
殖するまでに時間がかかるが、通常活性自体も増殖に伴
って向上するので何ら問題はない。そして、設定した温
度で培養した微生物を土壌中に導入すると、２５℃で培
養した場合よりも土壌温度とのギャップが少なくなり、
それだけスム−ズに増殖する。At this time, it is preferable to set the conditions that can secure the same number of bacteria as in the case of culturing at 25 ° C. In this case, it takes longer to grow to the target number of bacteria than in the case of culturing at 25 ° C. However, there is no problem because the activity itself is usually improved with the growth. Then, when the microorganisms cultivated at the set temperature are introduced into the soil, the gap with the soil temperature becomes smaller than that when cultivated at 25 ° C,
Only that much grows smoothly.

【００２３】土着微生物の増殖が活発になるまでに一旦
１０⁷ｃｅｌｌ／ｇ土壌程度の菌数が確保されると、土
着微生物の増殖もある程度抑制され、速やかでかつ継続
的な分解活性の発現が行われる。Once the number of bacteria of about 10 ⁷ cells / g soil is secured before the growth of the indigenous microorganisms becomes active, the growth of the indigenous microorganisms is suppressed to some extent, and the rapid and continuous expression of degrading activity is achieved. Done.

【００２４】本発明に用いる分解微生物としては、導入
される土壌の温度において増殖可能であり、芳香族化合
物及び／または有機塩素化合物を分解し得る微生物であ
れば特に限定されない。例えば、オキシゲナーゼを発現
し、これらの有機化合物の少なくとも一方の分解活性を
有するものを好適に用いることができる。そのような微
生物としては、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍ
ｏｎａｓ）属、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａ
ｃｔｅｒ）属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅ
ｓ）属、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属、ノカルジア（Ｎ
ｏｃａｒｄｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）
属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）
属、アクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）
属、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）
属、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、マ
イコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、
メチロシナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）属、メチロ
モナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）属、ベルキア（Ｗ
ｅｌｃｈｉａ）属、メチロシスチス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃ
ｙｓｔｉｓ）属、二トロゾモナス（Ｎｉｔｏｒｏｓｏｍ
ｏｎａｓ）属、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、トルロプ
シス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）属に属する微生物が挙げ
られ、分解対象としての汚染物質の種類に応じて、これ
らの１種以上を適宜選択して用いることができる。The degrading microorganism used in the present invention is not particularly limited as long as it can grow at the temperature of the introduced soil and can decompose an aromatic compound and / or an organic chlorine compound. For example, those expressing an oxygenase and having a decomposing activity of at least one of these organic compounds can be preferably used. Corynebacterium (Coryneba) is one of such microorganisms.
genus Cterium, Pseudomonas
onas), Acinetobacter (Acinetoba)
genus Cter, Alcaligenes
s) genus, Vibrio genus, Nocardia (N)
genus ocardia), Bacillus
Genus Lactobacillus
Genus, Achromobacter
Genus, Arthrobacter
Genus, Micrococcus genus, Mycobacterium genus,
Methylosinus genus, Methylomonas genus, Belchia (W
genus elchia, Methylocistis (Methyloc)
genus ytisis, Nitrosomom
onas), Saccharomyces
ces genus, Candida genus, and Torulopsis genus, and one or more of them can be appropriately selected and used according to the type of pollutant to be decomposed.

【００２５】好適な菌株としては、例えば、Ｊ１株（Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−５１０２）、ＪＭ１株（ＦＥＲＭ ＢＰ
−５３５２）、シュードモナス・スピ−シズ ＴＬ１株
（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＴＬ１；ＦＥＲＭ
Ｐ−１４７２６）、アルカリゲネス・スピ−シズ ＴＬ
２株（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｓｐ．ＴＬ２；ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１４６４２）等を挙げることができる。[0025] Suitable strains include, for example, J1 strain (F
ERM BP-5102), JM1 strain (FERM BP
-5352), Pseudomonas sp. TL1 strain; FERM.
P-14726), Alcaligenes Spices TL
2 strains (Alcaligenes sp. TL2; FER
MP-14642) and the like.

【００２６】なお、「ＦＥＲＭ Ｐ」または「ＦＥＲＭ
ＢＰ」で示された受託番号を有する菌株は、通商産業
省、工業技術院、生命工学工業技術研究所（茨城県つく
ば市東１丁目１番３号）に寄託されており、ＢＰ番号を
有するものはブダペスト条約下での国際寄託である。こ
れらの寄託日は以下のとおりである。 Ｊ１；ＦＥＲＭ ＢＰ−５１０２；寄託日：平成６年
５月２５日（ＦＥＲＭＰ−１４３３２から平成７年５月
１７日に国際寄託へ移管） ＪＭ１；ＦＥＲＭ ＢＰ−５３５２；寄託日：平成７
年１月１０日（ＦＥＲＭＰ−１４７２７から平成７年１
２月２２日に国際寄託へ移管） ＴＬ１；ＦＥＲＭ Ｐ−１４７２６；寄託日：平成７
年１月１０日 ＴＬ２；ＦＥＲＭ Ｐ−１４６４２；寄託日：平成６
年１１月１５日 ＪＭ１株は、芳香族化合物及び有機塩素化合物をオキシ
ゲナーゼで酸化するＪ１株を変異させて得たもので、誘
導物質なしでオキシゲナーゼを構成的に発現する変異株
であり、これらの菌学的性質は以下のとおりである。 Ｊ１株及びＪＭ１株の菌学的特性； グラム染色性及び形態：グラム陰性桿菌 各培地における生育 ＢＨＩＡ：生育良好 ＭａｃＣｏｎｋｅｙ：生育可能 コロニーの色：クリーム色 至適温度：２５℃＞３０℃＞３５℃ 運動性：陰性（半流動培地） ＴＳＩ（ｓｌａｎｔ／ｂｕｔｔ）：アルカリ／アルカ
リ、Ｈ₂Ｓ（−） オキシダーゼ：陽性（弱） カタラーゼ：陽性 糖の発酵 グルコース：陰性 シュクロース：陰性 ラフィノース：陰性 ガラクトース：陰性 マルトース：陰性 ウレアーゼ：陽性 エスクリン加水分解（β−グルコシダーゼ）：陽性 硝酸還元：陰性 インドール産生：陰性 グルコース酸性化：陰性 アルギニンジヒドロラーゼ：陰性 ゼラチン加水分解（プロテアーゼ）：陰性 β−ガラクトシダーゼ：陰性 各化合物の同化： グルコース：陰性 Ｌ−アラビノース：陰性 Ｄ−マンノース：陰性 Ｄ−マンニトール：陰性 Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン：陰性 マルトース：陰性 グルコン酸カリウム：陰性 ｎ−カプリン酸：陽性 アジピン酸：陰性 ｄｌ−リンゴ酸：陽性 クエン酸ナトリウム：陽性 酢酸フェニル：陰性 従って、寄託時にはこれらはコリネバクテリウム・スピ
ーシズ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）に
仮分類されたが、その後、寄託菌株の識別表示をＪ１及
びＪＭ１株に変更した。"FERM P" or "FERM"
The strain with the deposit number indicated by "BP" has been deposited at the Ministry of International Trade and Industry, the Agency of Industrial Science and Technology, and the Institute of Biotechnology and Industrial Technology (1-3 East, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture) and has the BP number. Is an international deposit under the Budapest Treaty. The dates of these deposits are as follows. J1; FERM BP-5102; Deposit Date: May 25, 1994 (transferred from FERMP-14332 to International Deposit on May 17, 1995) JM1; FERM BP-5352; Deposit Date: 1995
January 10, (from FERMP-14727 to 1995 January
Transferred to international deposit on February 22) TL1; FERM P-14726; Deposit date: 1995
January 10, TL2; FERM P-14642; Deposit date: Heisei 6
November 15, 2013 JM1 strain was obtained by mutating J1 strain that oxidizes aromatic compounds and organic chlorine compounds with oxygenase, and is a mutant strain that constitutively expresses oxygenase without inducer. The mycological properties are as follows. Bacteriological characteristics of J1 strain and JM1 strain; Gram stainability and morphology: Growth in each medium of Gram-negative bacilli BHIA: Good growth MacConkey: Viable Colony color: Cream Optimal temperature: 25 ° C> 30 ° C> 35 ° C motility: negative (semi-fluid medium) TSI (slant / butt): alkali / alkali, H ₂ S (-) oxidase: positive (weak) catalase: fermentation glucose positive sugar: negative sucrose: negative raffinose: negative galactose: Negative Maltose: Negative Urease: Positive Esculin hydrolysis (β-glucosidase): Positive Nitrate reduction: Negative Indole production: Negative Glucose acidification: Negative Arginine dihydrolase: Negative Gelatin hydrolysis (protease): Negative β-galactosidase: Negative Assimilation of: glucose Negative L-arabinose: Negative D-mannose: Negative D- Mannitol: Negative N-Acetyl-D-glucosamine: Negative Maltose: Negative Potassium gluconate: Negative n-Capric acid: Positive Adipic acid: Negative dl-Malic acid: Positive Quen Sodium acid: positive Phenyl acetate: negative Therefore, at the time of deposit, these were tentatively classified as Corynebacterium sp., But thereafter, the identification labels of the deposited strains were changed to J1 and JM1 strains.

【００２７】本発明に用いる微生物を培養するために用
いられる培地としては、ＬＢ培地、２×ＹＴ培地等通常
の微生物の生育に必要であつて該微生物が生育可能であ
ればいかなる培地でもよく、例えばＭ９培地に炭素源を
添加したもので培養することも可能である。The medium used for culturing the microorganism used in the present invention may be any medium as long as the microorganism can grow, such as LB medium and 2 × YT medium, as long as the microorganism can grow. For example, it is also possible to culture with M9 medium added with a carbon source.

【００２８】以下にＭ９培地の組成（培地１リットル
中：ｐＨ７．０）を示す。The composition of the M9 medium (in 1 liter of medium: pH 7.0) is shown below.

【００２９】Ｎａ₂ＨＰＯ₄：６．２ｇ ＫＨ₂ＰＯ₄：３．０ｇ ＮａＣｌ：０．５ｇ ＮＨ₄Ｃｌ：１．０ｇ 培養は好気条件下で行なうことができ、液体培養でも固
体培養でもよい。Na ₂ HPO ₄ : 6.2 g KH ₂ PO ₄ : 3.0 g NaCl: 0.5 g NH ₄ Cl: 1.0 g The culture can be carried out under aerobic conditions and may be liquid culture or solid culture. .

【００３０】本発明における土壌中の芳香族化合物及び
／または有機塩素化合物の分解処理は、土壌中に存在す
る芳香族化合物及び／または有機塩素化合物と分解微生
物を接触させることによって行なうことができる。The decomposition treatment of the aromatic compound and / or the organic chlorine compound in the soil in the present invention can be carried out by bringing the decomposing microorganism into contact with the aromatic compound and / or the organic chlorine compound existing in the soil.

【００３１】以下に、分解微生物の土壌への適用方法の
代表例について述べる。例えば、最も簡便な方法として
は、芳香族化合物及び／または有機塩素化合物によって
汚染された土壌中に直接該分解微生物を導入するという
方法がある。導入の方法としては、土壌表面に散布する
方法はもとより、比較的深い地層中の処理の場合には、
地中に挿入した井戸より導入する方法がある。更に、空
気や水等によって圧力をかけると広範囲に該分解微生物
が拡がり、より効果的である。この場含、土壌中の諸条
件を該分解微生物に適するように調整することが好まし
く、分解微生物は土壌粒子等の担体の存在下でより増殖
が速められ、そういった意味で土壌中という条件は好都
合である。A typical example of the method of applying the degrading microorganisms to soil will be described below. For example, the simplest method is a method of directly introducing the degrading microorganism into soil contaminated with an aromatic compound and / or an organic chlorine compound. As a method of introduction, in addition to the method of spraying on the soil surface, in the case of treatment in a relatively deep formation,
There is a method of introducing from a well inserted in the ground. Furthermore, when pressure is applied by air, water, etc., the decomposing microorganisms spread over a wide area, which is more effective. In this case, it is preferable to adjust various conditions in the soil to be suitable for the degrading microorganisms, and the degrading microorganisms can be grown faster in the presence of a carrier such as soil particles. Is.

【００３２】更に、分解微生物を担体付着させ、これを
反応槽に充填し、この反応槽を芳香族化合物及び／また
は有機塩素化合物で汚染された土壌の、主に帯水層中に
導入し分解処理を行うこともできる。反応槽の形態はフ
ェンス状やフィルム状のような、土壌中の広範囲を網羅
できるものが望ましい。この場合使用する担体は、いか
なるものでも利用可能であるが、微生物の保持能力に優
れ、通気性を損なわないようなものがより望ましい。例
えば、微生物の棲息空間を与えるような材料として、従
来より医薬品工業、食品工業、廃水処理システム等で利
用されているバイオリアクタで汎用されているさまざま
な微生物担体が利用できる。より具体的には、多孔質ガ
ラス、セラミクス、金属酸化物、活性炭、カオリナイ
ト、ベントナイト、ゼオライト、シリカゲル、アルミ
ナ、アンスラサイト等の無機粒子状担体、デンプン、寒
天、キチン、キトサン、ポリビニルアルコール、アルギ
ン酸、ボリアクリルアミド、カラギ−ナン、アガロ−
ス、ゼラチン等のゲル状担体、イオン交換性セルロー
ス、イオン交換樹脂、セルロース誘導体、グルタルアル
デヒド、ポリアクリル酸、ポリウレタン、ポリエステル
等が挙げられる。また天然物として、綿、麻、紙類とい
つたセルロース系のもの、木粉、樹皮といったリグニン
系のものも利用可能である。Further, a degrading microorganism is attached to a carrier, which is filled in a reaction tank, and this reaction tank is introduced mainly into an aquifer of a soil contaminated with an aromatic compound and / or an organic chlorine compound to decompose it. Processing can also be performed. The form of the reaction tank is preferably fence-shaped or film-shaped so that it can cover a wide range in soil. In this case, any carrier can be used, but it is more preferable that the carrier has excellent ability to retain microorganisms and does not impair air permeability. For example, various materials commonly used in bioreactors conventionally used in the pharmaceutical industry, the food industry, the wastewater treatment system, and the like can be used as a material that provides a living space for microorganisms. More specifically, porous glass, ceramics, metal oxides, activated carbon, kaolinite, bentonite, zeolite, silica gel, alumina, inorganic particulate carriers such as anthracite, starch, agar, chitin, chitosan, polyvinyl alcohol, alginic acid. , Polyacrylamide, carrageenan, agaro
And gel-like carriers such as gelatin and gelatin, ion-exchangeable cellulose, ion-exchange resins, cellulose derivatives, glutaraldehyde, polyacrylic acid, polyurethane, polyester and the like. As natural products, cellulose, cotton, hemp, paper, and other cellulose-based products, and wood powder, bark, and lignin-based products can also be used.

【００３３】本発明の方法は、閉鎖系、開放系いずれの
土壌浄化にも適用できる。なお、微生物を担体等に固定
して用いたり、生育を促進する各種の方法を併用しても
よい。The method of the present invention can be applied to soil remediation in both closed and open systems. It should be noted that the microorganism may be immobilized on a carrier or the like, or various methods for promoting growth may be used in combination.

【００３４】[0034]

【実施例】【Example】

実施例１ （Ｊ１株の土壌中での増殖によるフェノール及びＴＣＥ
の分解処理）酵母エキス０．２重量％を含むＭ９寒天培
地上のＪ１株のコロ二−を、５００ｍｌ容の坂ロフラス
コ中に調製した同組成の液体培地２００ｍｌに接種し、
２５℃で２４間振盪培養を行った。得られた培養液（増
殖菌体を含む）の２００μｌを同組成の２つの液体培地
１００ｍｌに添加し、一方は２２℃で、もう一方は１５
℃で振盪培養を行い、菌数をプレートカウントでモニタ
−したところ、１０⁸ｃｅｌｌｓ／ｍｌに達するまでの
時間は２２℃の系では約１８時間、１５℃の系では約３
６時間であつた。そこで、同様の操作を繰り返し、２２
℃の系では約１８時間、１５℃の系では約３６時間培養
した時点での培養液（増殖菌体を含む）を次の操作に用
いた。Example 1 (Phenol and TCE by growth of J1 strain in soil)
Of J1 strain on M9 agar medium containing 0.2% by weight of yeast extract is inoculated into 200 ml of a liquid medium of the same composition prepared in a 500 ml Sakaro flask.
Shaking culture was carried out at 25 ° C. for 24 hours. 200 μl of the obtained culture solution (including proliferating cells) was added to 100 ml of two liquid media having the same composition, one at 22 ° C. and the other at 15 ° C.
When shaking culture was carried out at 0 ° C and the number of bacteria was monitored by plate count, the time required to reach 10 ⁸ cells / ml was about 18 hours in the system at 22 ° C and about 3 in the system at 15 ° C.
It was 6 hours. Then, repeat the same operation,
The culture solution (including the proliferating cells) at the time of culturing for about 18 hours in the system of ° C and about 36 hours in the system of 15 ° C was used for the next operation.

【００３５】酵母エキス０．２重量％、フエノ−ル４０
０ｐｐｍ、及びＴＣＥ１００ｐｐｍを含むＭ９培地１ｍ
ｌを１５ｍｌ容のテフロン内蓋付きスクリユ−バイアル
瓶に注入し、風乾した佐原通し砂を４ｇ加えたものを多
数用意した。次に、上記のようにして得たＪ１株の培養
液各１０μｌを個々のバイアル瓶内に接種した後、完全
密封し、実際の土壌中の温度と近い１５℃で静置培養
し、菌数、フェノール及びＴＣＥの濃度を経日的に測定
した。Yeast extract 0.2% by weight, phenol 40
1m of M9 medium containing 0ppm and 100ppm of TCE
1 was poured into a 15-mL Teflon inner vial equipped with an inner lid, and 4 g of air-dried Sahara passed sand was added to prepare a large number. Next, 10 μl each of the J1 strain culture solution obtained as described above was inoculated into individual vials, completely sealed, and then statically cultured at 15 ° C., which is close to the actual temperature in the soil, to determine the number of bacteria. , Phenol and TCE concentrations were measured daily.

【００３６】なお、菌数の測定はバイアル瓶内の土壌サ
ンプルに５ｍｌの滅菌水を加え、１分間撹拌抽出した上
澄みを順次希釈し、酵母エキス０．２重量％を含むＭ９
寒天培地に塗布してプレ−トカウント法によつて行っ
た。土着菌とＪ１株のコロニーの区別は、プレートを１
５℃で培養した場合Ｊ１株のコロニーが２日程度で識別
できるような大きさになったのに対し、土着菌は３日以
降要すること、Ｊ１株のコロニーはフェノールを分解し
て黄色の物質を出すことを利用して行った。また、予め
プレートカウントとＦＣＭによる菌数の対応も確認し
た。また、フェノールの定量方法としては、バイアル瓶
内の土壌サンプルに５ｍｌの滅菌水を加え、１分間撹拌
抽出した上澄み中のフェノールに対し、アミノアンチピ
リンを用いたＪＩＳ法による検出法（ＪＩＳ Ｋ０１０
２−１９９３，２８．１）で行った。そして、ＴＥＣ濃
度は５ｍｌのｎ−ヘキサンをバイアル瓶内の土壌サンプ
ルに添加して、３分間撹拌抽出したものを、場合によっ
ては１０倍希釈してガスクロマトグラフィ−（ＥＣＤ検
出器）によって定量した。For the measurement of the number of bacteria, 5 ml of sterilized water was added to the soil sample in the vial, and the supernatant obtained by stirring and extracting for 1 minute was serially diluted to obtain M9 containing 0.2% by weight of yeast extract.
It was applied to an agar medium and the plate count method was used. To distinguish between indigenous bacteria and J1 strain colonies,
When cultivated at 5 ° C, the colonies of the J1 strain became recognizable in about 2 days, whereas the indigenous bacteria required 3 days or more. The colonies of the J1 strain decomposed phenol to give a yellow substance. I went out by using. Also, the correspondence between the plate count and the number of bacteria by FCM was confirmed in advance. As a method for quantifying phenol, 5 ml of sterilized water was added to a soil sample in a vial, and phenol in a supernatant obtained by stirring and extracting for 1 minute was detected by a JIS method using aminoantipyrine (JIS K010).
2-1993, 28.1). Then, the TEC concentration was determined by adding 5 ml of n-hexane to the soil sample in the vial, stirring and extracting for 3 minutes, diluting 10 times depending on the case, and quantifying by gas chromatography (ECD detector).

【００３７】フェノール及びＴＣＥに関しては、対照と
して、同様の実験系において滅菌した砂を用い、Ｊ１株
を加えない系での定量も併せて行い、対照の濃度に対す
る残存率を求めた。結果を図１（２２℃で前培養した場
合の菌数の変化）、図２（１５℃で前培養した場合の菌
数の変化）、図３（フェノ−ル濃度の変化）及び図４
（ＴＣＥ濃度の変化）にそれぞれ示す。Regarding phenol and TCE, sand that had been sterilized in the same experimental system was used as a control, and quantitative determination was also performed in a system in which the J1 strain was not added to determine the residual ratio with respect to the concentration of the control. The results are shown in FIG. 1 (change in bacterial count when precultured at 22 ° C.), FIG. 2 (change in bacterial count when precultured at 15 ° C.), FIG. 3 (change in phenol concentration) and FIG.
(Change of TCE concentration) is shown respectively.

【００３８】Ｊ１株の至適温度である２２℃で前培養し
た系に比ベ、土壌温度と同じ１５℃で前培養を行った方
がＪ１株の増殖が速やかになされ、土着微生物の増殖が
抑制された。またそれに伴い、フエノ−ルの分解、ＴＣ
Ｅの分解とも１５℃で前培養を行った方が良好であっ
た。Compared with the system pre-cultured at 22 ° C., which is the optimum temperature of J1 strain, pre-culture at 15 ° C. which is the same as the soil temperature allows the J1 strain to grow more rapidly and the growth of indigenous microorganisms. Suppressed In addition, along with it, decomposition of phenol, TC
For the decomposition of E, it was better to carry out pre-culture at 15 ° C.

【００３９】実施例２ （Ｊ１株でのクレゾール分解処理）分解対象物としての
フェノール及びＴＣＥの代わりにｏ−クレゾ−ル、ｍ−
クレゾ−ル（共に３００ｐｐｍ）とした他は実施例１と
同様の実験を行い、Ｊ１株の土壌中でのクレゾール分解
に対する前培養温度と土壌温度とのギャップの影響を調
べた。各クレゾールの定量はフェノールと同様の抽出法
でｐ−ヒドラジノベンゼンスルホン酸を用いたＪＩＳ法
による検出法（ＪＩＳ Ｋ０１０２−１９９３，２８．
２）により行った。各クレゾールの培養６日目の残存率
を表１に示す。Example 2 (Cresol Degradation Treatment with J1 Strain) O-cresol, m-instead of phenol and TCE as decomposition targets
The same experiment as in Example 1 was performed except that cresol (both was 300 ppm) was used to examine the effect of the gap between the preculture temperature and the soil temperature on the cresol decomposition of the J1 strain in the soil. The quantification of each cresol was carried out by the same extraction method as for phenol, and the detection method by the JIS method using p-hydrazinobenzenesulfonic acid (JIS K0102-1993, 28.
2). Table 1 shows the survival rate of each cresol on the 6th day of culture.

【００４０】[0040]

【表１】 土壌温度と同じ１５℃で前培養を行った方が各クレゾー
ルの分解が良好であった。[Table 1] Degradation of each cresol was better when pre-cultured at 15 ° C., which is the same as the soil temperature.

【００４１】実施例３ （ＴＬ１株の土壌中での増殖によるフェノール及びＴＣ
Ｅ分解処理）酵母エキス０．２重量％を含むＭ９寒天培
地上のＴＬ１株のコロ二−を、５００ｍｌ容の坂ロフラ
スコ中の同組成培地２００ｍｌに接種し、２５℃で２４
時間振盪培養を行った。Example 3 (Phenol and TC by growth of TL1 strain in soil)
E-degradation treatment) Colony of TL1 strain on M9 agar medium containing 0.2% by weight of yeast extract was inoculated into 200 ml of the same composition medium in a 500 ml Sakaro flask, and at 24 ° C at 24 ° C.
Shaking culture was performed for hours.

【００４２】得られた培養液（増殖菌体を含む）の２０
０μｌを同組成の２つの液体培地１００ｍにそれぞれ添
加し、一方は２５℃で、もう一方は１５℃で振盪培養を
行い、菌数をプレートカウントでモニタ−したところ、
１５℃では増殖の速度が非常に遅いことが示されたの
で、改めて１８℃で振盪培養を行った。その結果、１０
⁸ｃｅｌｌｓ／ｍｌに達するまでの時間は２５℃の系で
は約２２時間、１８℃の系では約４０時間てあった。20 of the obtained culture solution (including proliferating cells)
0 μl was added to each 100 m of two liquid media of the same composition.
Shake culture at 25 ° C for one and 15 ° C for the other.
Performed and monitored the number of bacteria by plate count,
It showed that the growth rate was very slow at 15 ° C.
Then, shaking culture was performed again at 18 ° C. As a result, 10
⁸Time to reach cells / ml is 25 ° C
It took about 22 hours and about 40 hours for the system at 18 ° C.

【００４３】そこで、同様の操作を繰り返し、２５℃の
系では約２２時間、１８℃の系では約４０時間の時点で
の培養液を用い、フェノール濃度を２００ｐｐｍ、ＴＣ
Ｅ濃度を４０ｐｐｍとした以外は実施例１と同様にし
て、前培養と土壌との温度差の影響を調べた。得られた
結果を図５（２５℃で前培養した場合の菌数の変化）、
図６（１８℃で前培養した場合の菌数の変化）、図７
（フェノールの変化）及び図８（ＴＣＥの変化）にそれ
ぞれ示す。Then, the same operation was repeated, using the culture solution at the time of about 22 hours in the system of 25 ° C. and about 40 hours in the system of 18 ° C., the phenol concentration was 200 ppm, TC
The effect of the temperature difference between the preculture and the soil was examined in the same manner as in Example 1 except that the E concentration was 40 ppm. The obtained results are shown in FIG. 5 (change in the number of bacteria when precultured at 25 ° C.),
Fig. 6 (change in the number of bacteria when precultured at 18 ° C), Fig. 7
(Change of phenol) and FIG. 8 (Change of TCE) are shown respectively.

【００４４】ＴＬ１株の至適温度である２５℃で前培養
した系に比ベ、土壌温度に近い１８℃で前培養を行った
方がＴＬ１株の増殖が速やかになされ、土着微生物の増
殖が抑制された。また、それに伴い、土壌温度と近い１
８℃で前培養を行った方がＴＬ１株のフェノールの分
解、ＴＣＥの分解とも良好であった。Compared to the system in which the TL1 strain was pre-cultured at 25 ° C. which is the optimum temperature, the pre-culture at 18 ° C. which is close to the soil temperature allows the TL1 strain to grow more rapidly and the growth of indigenous microorganisms. Suppressed Also, along with it, the soil temperature is close to 1
The pre-culture at 8 ° C. was better in the degradation of phenol and TCE of the TL1 strain.

【００４５】実施例４ （ＴＬ１株でのクレゾール分解処理）分解対象物として
フェノール及びＴＣＥの代わりにｐ−クレゾ−ル（２０
０ｐｐｍ）とした他は実施例３と同様の実験を行い、Ｔ
Ｌ１株での土壌中のクレゾール分解に対する前培養と土
壌との温度差の影響を調べた。クレゾールの定量はフェ
ノールと同様の抽出法でｐ−ヒドラジノベンゼンスルホ
ン酸を用いたＪＩＳ法による検出法（ＪＩＳ Ｋ０１０
２−１９９３，２８．２）により行った。培養６日目の
残存率を表２に示す。Example 4 (Cresol Degradation Treatment with TL1 Strain) p-cresol (20
0 ppm), except that the same experiment as in Example 3 was performed.
The effect of temperature difference between pre-culture and soil on cresol degradation in soil with L1 strain was investigated. The quantification of cresol was carried out by the same extraction method as for phenol, and the detection method by JIS method using p-hydrazinobenzenesulfonic acid (JIS K010
2-1993, 28.2). Table 2 shows the survival rate on day 6 of culture.

【００４６】[0046]

【表２】 クレゾールの分解においても土壌温度と近い１８℃で前
培養を行った方が良好であつた。[Table 2] Regarding the decomposition of cresol, it was better to carry out the pre-culture at 18 ° C which is close to the soil temperature.

【００４７】実施例５ （ＴＬ２株の土壌中でのフェノール及びＴＣＥ分解処
理）酵母エキス０．２重量％を含むＭ９寒天培地上のＴ
Ｌ２株のコロニーを、５００ｍｌ容の坂ロフラスコ中に
用意した同組成培地２００ｍｌに接種し、２５℃で２４
時間振盪培養を行った。得られた培養液（増殖菌体を含
む）の２００μｌを同組成の２つの液体培地１００ｍｌ
に添加し、一方は２５℃で、もう−方は１８℃で振盪培
養を行い、菌数をプレートカウントでモニターしたとこ
ろ、１８℃では増殖の速度が非常に遅いことが示された
ので、改めて２０℃で振盪培養を行ったところ、１０⁸
ｃｅｌｌｓ／ｍｌに達するまでの時間は２５℃の系では
約３６時間、２０℃の系では約４８時間であった。Example 5 (Phenol and TCE decomposition treatment of soil of TL2 strain) T on M9 agar medium containing 0.2% by weight of yeast extract.
A L2 strain colony was inoculated into 200 ml of the same composition medium prepared in a 500 ml Sakaro flask, and the inoculum was kept at 25 ° C. for 24 hours.
Shaking culture was performed for hours. 200 μl of the obtained culture solution (including proliferating cells) was added to 100 ml of two liquid media of the same composition.
When one was shake-cultured at 25 ° C. and the other at 18 ° C., and the number of bacteria was monitored by plate count, it was shown that the growth rate was extremely slow at 18 ° C. When shaking culture was performed at 20 ° C., 10 ⁸
The time required to reach cells / ml was about 36 hours in the system at 25 ° C and about 48 hours in the system at 20 ° C.

【００４８】そこで、同様の操作を繰り返し、２５℃の
系では約３６時間、２０℃の系では約４８時間培養した
時点での培養液を用い、培地のフェノール濃度を７００
ｐｐｍとした以外は実施例１と同様にして、前培養と土
壌との温度差の影響を調べた。結果を図９（２５℃で前
培養した場合の菌数の変化）、図１０（２０℃で前培養
した場合の菌数の変化）、図１１（フェノールの変化）
及び図１２（ＴＥＣの変化）にそれぞれ示す。Then, the same operation was repeated, and the culture solution at the time of culturing for about 36 hours in the system at 25 ° C. and about 48 hours in the system at 20 ° C. was used, and the phenol concentration of the medium was adjusted to 700.
The effect of the temperature difference between the preculture and the soil was examined in the same manner as in Example 1 except that the ppm was used. The results are shown in FIG. 9 (change in bacterial count when pre-cultured at 25 ° C.), FIG. 10 (change in bacterial count when pre-cultured at 20 ° C.), and FIG. 11 (change in phenol).
12 and FIG. 12 (change of TEC).

【００４９】ＴＬ２株の至適温度である２５℃で前培養
した系に比ベ、より土壌温度に近い２０℃で前培養を行
った方がＴＬ２株の増殖が速やかになされ、土着微生物
の増殖が抑制された。またそれに伴い、土壌温度と近い
２０℃で前培養を行った方がＴＬ２株のフェノールの分
解、ＴＣＥの分解とも良好であった。Compared with the system pre-cultured at 25 ° C., which is the optimum temperature of the TL2 strain, pre-culture at 20 ° C. which is closer to the soil temperature allows the TL2 strain to grow more rapidly and the growth of indigenous microorganisms. Was suppressed. Along with this, pre-culturing at 20 ° C., which is close to the soil temperature, was better in the degradation of phenol and TCE of the TL2 strain.

【００５０】実施例６ （ＪＭ１株の土壌中での増殖及びＴＣＥ分解処理）酵母
エキス０．２重量％を含むＭ９寒天培地上のＪＭ１株の
コロニーを、５００ｍｌ容の坂ロフラスコ中の同組成培
地２００ｍｌに接種し、２２℃で２４時間振盪培養を行
った。得られた培養液（増殖菌体を含む）の２００μｌ
を同組成の２つの液体培地１００ｍに添加し、一方は２
２℃で、もう一方は１５℃で振盪培養を行い、菌数をプ
レートカウントでモニターしたところ、１０⁸ｃｅｌｌ
ｓ／ｍｌに達するまての時間は２２℃の系では約１８時
間、１５℃の系では約３６時間であつた。ＪＭ１株はＪ
１株の変異株であり、フェノ−ル等の誘導物質が存在し
ない条件下でＴＣＥの分解能を有するものであり、この
温度による増殖の変化は親株と同じであった。Example 6 (Growth of JM1 Strain in Soil and TCE Degradation Treatment) Colonies of the JM1 strain on an M9 agar medium containing 0.2% by weight of yeast extract were mixed with the same composition medium in a 500 ml Sakaro flask. 200 ml was inoculated and shaking culture was performed at 22 ° C. for 24 hours. 200 μl of the obtained culture solution (including proliferating cells)
Was added to 100 m of two liquid media of the same composition, one of which was 2
At 2 ℃ where, the other performs a shaking culture at 15 ° C., and monitored the number of bacteria in plate count, 10 ⁸ cell
The time required to reach s / ml was about 18 hours in the 22 ° C. system and about 36 hours in the 15 ° C. system. JM1 strain is J
It was a mutant strain of 1 strain and had a TCE decomposing ability under the condition that an inducer such as phenol was not present, and the change in growth due to this temperature was the same as that of the parent strain.

【００５１】更に、上記と同様の操作を繰り返し、２２
℃の系では約１８時間、１５℃の系では約３６時間培養
した時点での培養液を用い、フェノールを用いない以外
は実施例１と同様の方法で前培養と土壌との温度差の影
響を調べた。得られた結果を図１３（２２℃で前培養し
た場合の菌数の変化）、図１４（１５℃で前培養した場
合の菌数の変化）、及び図１５（ＴＣＥの変化）にそれ
ぞれ示す。Further, by repeating the same operation as described above,
In the same manner as in Example 1, except that the culture solution at the time of culturing for about 18 hours in the system of 15 ° C. and for about 36 hours in the system of 15 ° C. was used and phenol was not used, the influence of the temperature difference between the pre-culture and the soil was used. I checked. The obtained results are shown in FIG. 13 (change in bacterial count when pre-cultured at 22 ° C.), FIG. 14 (change in bacterial count when pre-cultured at 15 ° C.), and FIG. 15 (change in TCE), respectively. .

【００５２】ＪＭ１株の至適温度である２２℃で前培養
した系に比べ、土壌温度と同じ１５℃で前培養を行った
方がＪ１株の増殖が速やかになされ、土壌微生物の増殖
が抑制された。またそれに伴い、土壌温度と同じ１５℃
で前培養を行った方がＪＭ１株のＴＣＥ分解は良好であ
つた。Compared to the system pre-cultured at 22 ° C., which is the optimum temperature of JM1 strain, the pre-culture at 15 ° C. which is the same as the soil temperature allows the J1 strain to grow faster and suppresses the growth of soil microorganisms. Was done. Also, along with it, the same as the soil temperature, 15 ℃
The JM1 strain showed better TCE degradation when pre-cultured in (1).

【００５３】実施例７ （ＪＭ１株でのＤＣＥ分解処理）土壌中の分解対象物質
をｃｉｓ−１，２−ジクロロエチレン（ｃｉｓ−１，２
−ＤＣＥ）、ｔｒａｎｓ−１，２−ジクロロ工チレン
（ｔｒａｎｓ−１，２−ＤＣＥ）及び１，１−ジクロロ
エチレン（１，１−ＤＣＥ）（各５０ｐｐｍ）とした他
は実施例６と同様の方法でＤＣＥの減少を測定した。各
ＤＣＥの培養６日目の残存率を表３に示す。Example 7 (DCE decomposition treatment with JM1 strain) The substance to be decomposed in soil was cis-1,2-dichloroethylene (cis-1,2).
-DCE), trans-1,2-dichloroengineered ethylene (trans-1,2-DCE) and 1,1-dichloroethylene (1,1-DCE) (50 ppm each), the same method as in Example 6. The decrease in DCE was measured by. Table 3 shows the survival rate of each DCE on the 6th day of culture.

【００５４】[0054]

【表３】 各ＤＣＥとも１５℃前培養系において分解が進むことが
示された。[Table 3] It was shown that decomposition of each DCE proceeded in the pre-culture system at 15 ° C.

【００５５】[0055]

【発明の効果】本発明の方法によれば、前培養と修復浄
化対象としての汚染土壌との温度差を５℃以内としたこ
とで、これらの温度差による分解微生物の増殖や分解活
性への影響を排除して、芳香族化合物及び／または有機
塩素化合物により汚染された土壌の分解効率のみならず
経済的にも効率良い生物的分解修復処理が可能となる。According to the method of the present invention, the temperature difference between the pre-culture and the contaminated soil to be repaired and purified is kept within 5 ° C., so that the growth of degrading microorganisms and the degrading activity due to these temperature differences can be prevented. By eliminating the influence, it becomes possible not only to decompose the soil contaminated with the aromatic compound and / or the organic chlorine compound but also to perform the biological decomposition / restoration treatment with good economical efficiency.

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】実施例１における２２℃で前培養した場合の菌
数の変化を示す図である。FIG. 1 is a diagram showing changes in the number of bacteria when precultured at 22 ° C. in Example 1.

【図２】実施例１における１５℃で前培養した場合の菌
数の変化を示す図である。FIG. 2 shows changes in the number of bacteria when precultured at 15 ° C. in Example 1.

【図３】実施例１におけるフェノール濃度の変化を示す
図である。FIG. 3 is a diagram showing changes in phenol concentration in Example 1.

【図４】実施例１におけるＴＣＥ濃度の変化を示す図で
ある。FIG. 4 is a diagram showing changes in TCE concentration in Example 1.

【図５】実施例３における２５℃で前培養した場合の菌
数の変化を示す図である。FIG. 5 is a view showing changes in the number of bacteria when precultured at 25 ° C. in Example 3.

【図６】実施例３における１８℃で前培養した場合の菌
数の変化を示す図である。FIG. 6 shows changes in the number of bacteria when precultured at 18 ° C. in Example 3.

【図７】実施例３におけるフェノールの変化を示す図で
ある。7 is a diagram showing changes in phenol in Example 3. FIG.

【図８】実施例３におけるＴＣＥの変化を示す図であ
る。FIG. 8 is a diagram showing changes in TCE in Example 3.

【図９】実施例５における２５℃で前培養した場合の菌
数の変化を示す図である。FIG. 9 shows changes in the number of bacteria when precultured at 25 ° C. in Example 5.

【図１０】実施例５における２０℃で前培養した場合の
菌数の変化を示す図である。FIG. 10 shows changes in the number of bacteria when precultured at 20 ° C. in Example 5.

【図１１】実施例５におけるフェノールの変化を示す図
である。FIG. 11 is a diagram showing changes in phenol in Example 5.

【図１２】実施例５におけるＴＥＣの変化を示す図であ
る。FIG. 12 is a diagram showing changes in TEC in Example 5.

【図１３】実施例６における２２℃で前培養した場合の
菌数の変化を示す図である。FIG. 13 shows changes in the number of bacteria when precultured at 22 ° C. in Example 6.

【図１４】実施例６における１５℃で前培養した場合の
菌数の変化を示す図である。FIG. 14 shows changes in the number of bacteria when precultured at 15 ° C. in Example 6.

【図１５】実施例６におけるＴＣＥの変化を示す図であ
る。FIG. 15 is a diagram showing changes in TCE in Example 6.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:05） (72)発明者 古崎 眞也 東京都大田区下丸子３丁目30番２号 キヤ ノン株式会社内─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification number Internal reference number FI technical display location C12R 1:05) (72) Inventor Shinya Kozaki 3-30-2 Shimomaruko, Ota-ku, Tokyo Canon Within the corporation

Claims (11)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 芳香族化合物及び有機塩素化合物の少な
くとも１種で汚染された汚染土壌に、該化合物を分解し
得る分解微生物を接触させて該化合物を分解することに
より前記汚染土壌を修復浄化する方法において、前記汚
染土壌に接触させる分解微生物が、予めモニターした汚
染土壌との温度差が５℃以内の範囲で前培養した分解微
生物であることを特徴とする汚染土壌の生物的修復浄化
方法。1. A contaminated soil contaminated with at least one of an aromatic compound and an organic chlorine compound is contacted with a degrading microorganism capable of decomposing the compound to decompose the compound, thereby repairing and purifying the contaminated soil. In the method, the decomposing microorganism that is brought into contact with the contaminated soil is a decomposing microorganism that has been pre-cultured in a temperature range of 5 ° C. or less with respect to the previously monitored contaminated soil. 【請求項２】 該分解微生物が、酸化酵素であるオキシ
ゲナーゼを発現する微生物である請求項１に記載の汚染
土壌の生物的修復浄化方法。2. The method for biological remediation and purification of contaminated soil according to claim 1, wherein the degrading microorganism is a microorganism expressing an oxygenase, which is an oxidase. 【請求項３】 前記オキシゲナーゼを発現する微生物
が、コリネバクテリウム属、シュードモナス属、アシネ
トバクター属、アルカリゲネス属、ビブリオ属、ノカル
ジア属、バチルス属、ラクトバチルス属、アクロモバク
ター属、アルスロバクター属、ミクロコッカス属、マイ
コバクテリウム属、メチロシナス属、メチロモナス属、
ベルキア属、メチロシスチス属、二トロゾモナス属、サ
ッカロミセス属、カンジダ属、トルロプシス属に属する
微生物のうち少なくとも一種類である請求項２に記載の
汚染土壌の生物的修復浄化方法。3. The microorganism expressing the oxygenase is Corynebacterium, Pseudomonas, Acinetobacter, Alcaligenes, Vibrio, Nocardia, Bacillus, Lactobacillus, Achromobacter, Arthrobacter, Micrococcus, Mycobacterium, Methylosynas, Methylomonas,
The biological remediation and purification method for contaminated soil according to claim 2, which is at least one kind of microorganisms belonging to the genus Berchia, the genus Methylocistis, the genus Nitrozomonas, the genus Saccharomyces, the genus Candida, and the genus Tollopsis. 【請求項４】 前記微生物が、Ｊ１株（ＦＥＲＭ ＢＰ
−５１０２）である請求項２に記載の汚染土壌の生物的
修復浄化方法。4. The J1 strain (FERM BP) is used as the microorganism.
-5102), The method for biological remediation and purification of contaminated soil according to claim 2. 【請求項５】 前記微生物が、ＪＭ１株（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−５３５２）である請求項２に記載の汚染土壌の生物
的修復浄化方法。5. The JM1 strain (FERM B)
P-5352), The method for biological remediation and purification of contaminated soil according to claim 2. 【請求項６】 前記微生物が、シュードモナス・スピー
シズ ＴＬ１株（ＦＥＲＭ Ｐ−１４７２６）である請
求項３に記載の汚染土壌の生物的修復浄化方法。6. The method for biological remediation and purification of contaminated soil according to claim 3, wherein the microorganism is Pseudomonas species TL1 strain (FERM P-14726). 【請求項７】 前記微生物がアルカリゲネス・スピーシ
ズ ＴＬ２株（ＦＥＲＭ Ｐ−１４６４２）である請求
項３に記載の汚染土壌の生物的修復浄化方法。7. The method for biological remediation and purification of contaminated soil according to claim 3, wherein the microorganism is Alcaligenes sp. TL2 strain (FERM P-14642). 【請求項８】 前記分解微生物を含む水性媒体を汚染土
壌中に導入し、該分解微生物を該土壌中で増殖させるこ
とにより行う請求項１〜７のいずれかに記載の汚染土壌
の生物的修復浄化方法。8. The biological remediation of the contaminated soil according to claim 1, which is carried out by introducing an aqueous medium containing the decomposing microorganism into the contaminated soil and allowing the decomposing microorganism to grow in the soil. Purification method. 【請求項９】 該微生物の土壌中ヘの導入は土壌に設け
た注入井より圧カによつて行う請求項８に記載の汚染土
壌の生物的修復浄化方法。9. The method for biologically remediating and purifying contaminated soil according to claim 8, wherein the introduction of the microorganism into the soil is performed by pressure from an injection well provided in the soil. 【請求項１０】 前記芳香族化合物が、フェノール及び
クレゾ−ルの少なくとも１つである請求項１〜９のいず
れかに記載の汚染土壌の生物的修復浄化方法。10. The method for biological remediation and purification of contaminated soil according to claim 1, wherein the aromatic compound is at least one of phenol and cresol. 【請求項１１】 前記有機塩素化合物が、トリクロロエ
チレン及びジクロロエチレンの少なくとも１つである請
求項１〜９のいずれかに記載の汚染土壌の生物的修復浄
化方法。11. The method for biological remediation and purification of contaminated soil according to claim 1, wherein the organic chlorine compound is at least one of trichlorethylene and dichloroethylene.