JPH09238685A - Cerebral ischemia-related gene - Google Patents
Cerebral ischemia-related geneInfo
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- JPH09238685A JPH09238685A JP8049380A JP4938096A JPH09238685A JP H09238685 A JPH09238685 A JP H09238685A JP 8049380 A JP8049380 A JP 8049380A JP 4938096 A JP4938096 A JP 4938096A JP H09238685 A JPH09238685 A JP H09238685A
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は脳虚血に関与する遺
伝子とその遺伝子がコードするポリペプチドに関する。
より詳細には、アストロサイトが低酸素条件に曝された
後再酸素化された際に特異的に発現する遺伝子とその遺
伝子がコードするポリペプチドに関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a gene involved in cerebral ischemia and a polypeptide encoded by the gene.
More specifically, it relates to a gene specifically expressed when astrocytes are reoxygenated after being exposed to a hypoxic condition and a polypeptide encoded by the gene.
【０００２】[0002]
【従来の技術】脳梗塞などの脳虚血に起因する疾患は患
者に重篤な後遺症を残し、社会的損失と社会的負担を生
み出しており、その予防法と治療法の開発が強く求めら
れている。脳虚血に陥った場合、脳内のニューロン（神
経細胞）の機能が損なわれるが、それに伴う脳内の生体
反応、神経細胞の虚血に対する反応等についてはほとん
ど解明されておらず、その為にこれら疾患の予防法や治
療法の開発も進んでいない現状にある。これら疾患の予
防法や治療法を開発するには、脳虚血に伴う脳内の生体
反応、神経細胞の虚血に対する反応等について解明する
とともに、障害をもたらす反応と治癒に働く反応を区別
して、前者を抑制し後者を亢進させる方法を開発する必
要がある。一方、アストロサイト（神経膠星状細胞）
は、ニューロン（神経細胞）の機能と生存を修飾し、ニ
ューロンの生存を維持するために重要な働きをすること
が知られている。アストロサイトが虚血時にどのような
反応を示すか、具体的には、どのような遺伝子が発現誘
導され、どのようなポリペプチドが産生されるか、そし
てそのポリペプチドがニューロンの生存を維持する方向
に働くかどうかを調べることは、脳虚血に起因する疾患
の予防あるいは治療法開発に有効な知見と手段を与える
ものとして望まれていた。2. Description of the Related Art Diseases caused by cerebral ischemia such as cerebral infarction leave serious aftereffects on patients, causing social loss and burden, and the development of preventive and therapeutic methods is strongly required. ing. When cerebral ischemia is impaired, the functions of neurons (neurons) in the brain are impaired, but the biological reactions in the brain and the reaction of nerve cells to ischemia, etc., have not been clarified. In addition, the development of preventive and therapeutic methods for these diseases has not progressed. To develop preventive and therapeutic methods for these diseases, we will elucidate the biological reactions in the brain that accompany cerebral ischemia, the reaction of nerve cells to ischemia, etc., and distinguish between the reaction that causes damage and the reaction that works for healing. , It is necessary to develop a method that suppresses the former and enhances the latter. On the other hand, astrocytes (astrocytes)
Is known to modify the function and survival of neurons (neurons) and play an important role in maintaining the survival of neurons. How astrocytes respond during ischemia, specifically what genes are induced and what polypeptides are produced, and those polypeptides maintain neuronal survival It has been desired to investigate whether or not it works in the direction as it will provide effective knowledge and means for the development of a preventive or therapeutic method for diseases caused by cerebral ischemia.
【０００３】[0003]
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、脳虚
血−再灌流時、より詳しくは、低酸素条件に曝された後
再び酸素に曝されたときに、アストロサイトにおいて発
現誘導される新規遺伝子およびその遺伝子がコードする
新規ポリペプチドを提供することにある。また、本発明
の他の目的は、前記ポリペプチドをコードするＤＮＡ、
前記遺伝子もしくはＤＮＡに選択的にハイブリダイズす
る核酸、前記ポリペプチドに対する抗体を提供すること
にある。上記以外の目的については以下の記載より明ら
かである。The object of the present invention is to induce expression in astrocytes during cerebral ischemia-reperfusion, more specifically, when exposed to hypoxic conditions and then to oxygen again. A novel gene and a novel polypeptide encoded by the gene are provided. Another object of the present invention is DNA encoding the above-mentioned polypeptide,
It is to provide a nucleic acid that selectively hybridizes to the gene or DNA, and an antibody to the polypeptide. The purpose other than the above is apparent from the following description.
【０００４】[0004]
【課題を解決するための手段】本発明者らは、動物生体
内における脳虚血状態を試験管内で再現する系について
鋭意研究した結果、脳虚血−再灌流の優れたin vitroモ
デルとして、神経細胞の一種であるアストロサイトの初
代培養細胞を低酸素処理した後再び酸素に曝す系を確立
した。本発明者らはこの系を用いることにより、低酸素
条件に曝された後再酸素化されたアストロサイトにおい
て特異的に発現する脳虚血関連の新規遺伝子を見いだし
た。この遺伝子は、通常の酸素状態にあるアストロサイ
ト及び低酸素状態にあるアストロサイトではほとんど発
現が認められないが、アストロサイトが低酸素条件に曝
された後再酸素化された際（即ち、通常の酸素状態に戻
された際）に発現誘導される遺伝子として見いだされ
た。[Means for Solving the Problems] As a result of earnest studies on a system for reproducing a cerebral ischemic state in an animal body in vitro, the present inventors have found that as an excellent in vitro model of cerebral ischemia-reperfusion, We established a system in which primary cultured cells of astrocytes, a kind of nerve cells, were exposed to oxygen after hypoxia treatment. The present inventors have used this system to find a novel gene associated with cerebral ischemia that is specifically expressed in astrocytes reoxygenated after exposure to hypoxic conditions. This gene is rarely expressed in normoxic and hypoxic astrocytes, but when astrocytes are reoxygenated after exposure to hypoxic conditions (ie, normal Was found to be an expression-inducible gene when it was returned to the oxygen state).
【０００５】すなわち本発明は、配列番号３又は６で示
されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする
塩基配列を含む遺伝子、並びに該遺伝子がコードする脳
虚血関連ポリペプチド、そのフラグメントまたはそれら
のホモローグである。That is, the present invention provides a gene containing a nucleotide sequence encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 6, and a cerebral ischemia-related polypeptide encoded by the gene, a fragment thereof or a homologue thereof. Is.
【０００６】後記配列表の配列番号１は、ラット由来の
脳虚血関連遺伝子、すなわちラットアストロサイトを低
酸素条件に曝した後再酸素化した際に特異的に発現する
遺伝子（ラットＹＴ５２１遺伝子）のほぼ全長のｃＤＮ
Ａ塩基配列（約３．２ｋｂｐ）を表す。配列番号２は、
配列番号１のｃＤＮＡ塩基配列中のオープンリーディン
グフレーム（配列番号１の配列中第３１７番目から２４
５２番目の塩基に相当する部分）の塩基配列を表す。配
列番号３は、配列番号２の塩基配列を翻訳して得られる
アミノ酸配列、すなわちラットＹＴ５２１遺伝子がコー
ドするポリペプチドのアミノ酸配列を表す。このアミノ
酸配列から推定される分子量は約８３Ｋｄである。[0006] SEQ ID NO: 1 in the sequence listing shown below is a rat-derived cerebral ischemia-related gene, that is, a gene that is specifically expressed when rat astrocytes are reoxygenated after being exposed to hypoxic conditions (rat YT521 gene). Almost full length of cDN
This represents the A base sequence (about 3.2 kbp). SEQ ID NO: 2 is
Open reading frame in the cDNA base sequence of SEQ ID NO: 1 (from the 317th position to the 24th position in the sequence of SEQ ID NO: 1)
(The portion corresponding to the 52nd base). SEQ ID NO: 3 represents the amino acid sequence obtained by translating the base sequence of SEQ ID NO: 2, that is, the amino acid sequence of the polypeptide encoded by the rat YT521 gene. The molecular weight estimated from this amino acid sequence is about 83 Kd.
【０００７】また、後記配列表の配列番号４は、ヒト由
来の脳虚血関連遺伝子、すなわちＹＴ５２１遺伝子のヒ
トホモローグ（ヒトＹＴ５２１遺伝子）の部分ｃＤＮＡ
塩基配列（約１．４ｋｂｐ）を表す。配列番号５は、配
列番号４のｃＤＮＡ塩基配列中にある３’側コーディン
グ領域（配列番号４の配列中第１番目から５８４番目の
塩基に相当する部分）の塩基配列を表す。配列番号６
は、配列番号５の塩基配列を翻訳して得られるアミノ酸
配列、すなわちヒトＹＴ５２１遺伝子がコードするポリ
ペプチドのＣ末端側部分アミノ酸配列を表す。Further, SEQ ID NO: 4 in the sequence listing below is a partial cDNA of human ischemia-related gene, that is, human homolog of YT521 gene (human YT521 gene).
It represents a base sequence (about 1.4 kbp). SEQ ID NO: 5 represents the base sequence of the 3'side coding region (the portion corresponding to the 1st to 584th bases in the sequence of SEQ ID NO: 4) in the cDNA base sequence of SEQ ID NO: 4. Sequence number 6
Represents the amino acid sequence obtained by translating the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5, that is, the C-terminal partial amino acid sequence of the polypeptide encoded by the human YT521 gene.
【０００８】前記配列番号１、２、３、４、５及び６に
示される塩基配列もしくはアミノ酸配列ついて、既知Ｄ
ＮＡデータベース（ＧｅｎＢａｎｋおよびＥＭＢＬ）及
びプロテインデータベース（ＮＢＲＦ及びＳＷＩＳＳ−
ＰＲＯＴ）に含まれる全ての配列に対してホモロジー検
索を行った結果、一致するものはなく、これら配列は、
新規なものであると考えられる。また、ヒトＹＴ５２１
遺伝子がコードするポリペプチドの部分アミノ酸配列
（配列番号６、１９３アミノ酸）と、ラットＹＴ５２１
遺伝子がコードするポリペプチドのＣ末端側部分（配列
番号３のＣ末端側１９３アミノ酸）のアミノ酸配列を比
較すると、２残基の置換が認められるのみであり、両者
で高いホモロジーが保存されている。Known nucleotide sequences or amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5 and 6 are known D
NA database (GenBank and EMBL) and protein database (NBRF and SWISS-
As a result of homology search for all the sequences included in PROT, there is no match, and these sequences are
It is considered to be new. Also, human YT521
Partial amino acid sequence of the polypeptide encoded by the gene (SEQ ID NO: 6, 193 amino acids) and rat YT521
Comparing the amino acid sequences of the C-terminal portion of the polypeptide encoded by the gene (193 amino acids at the C-terminal side of SEQ ID NO: 3), only two residues were found to be substituted, and both have high homology. .
【０００９】[0009]
【発明の実施の形態】本発明の脳虚血関連遺伝子あるい
はそのｃＤＮＡは、例えば脳由来の神経系細胞などを遺
伝子源としてスクリーニングを行い、遺伝子を単離取得
できる。このような細胞としては、例えば哺乳動物（例
えばラット、マウス等）の中枢神経系の細胞（アストロ
サイト等）が挙げられる。またこの他、神経系細胞への
分化誘導が可能な細胞を用いることができ、このような
細胞として、例えばマウス胚性腫瘍細胞Ｐ１９［Jones-
Villineureら、journal of Cell Biology、第94巻、第2
53〜262頁］、神経芽細胞腫などが挙げられる。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION The cerebral ischemia-related gene of the present invention or its cDNA can be isolated and obtained by performing screening using, for example, brain-derived neural cells as a gene source. Examples of such cells include central nervous system cells (such as astrocytes) of mammals (such as rat and mouse). In addition to these, cells capable of inducing differentiation into neural cells can be used, and examples of such cells include mouse embryonal tumor cell P19 [Jones-
Villineure et al., Journal of Cell Biology, Vol. 94, Vol. 2.
53-262], neuroblastoma and the like.
【００１０】ｃＤＮＡもしくは遺伝子のスクリーニング
及び単離は、例えば、ディファレンシャル・ハイブリダ
イゼーション法［Cell、第16巻、第443〜452頁（1979
年）］、サブトラクション法［Nucleic Acids Researc
h、第16巻、第10937頁（1988年）及びProceedings of t
he National Academy of Sciences、第88巻、第11505〜
11509頁（1991年）］、ディファレンシャル・ディスプ
レイ法［Science、第257巻、第967〜971頁（1992年）及
びCancer Research、第52巻、第6966〜6968頁（1992
年）］など、発現量の変化する遺伝子を選択的にスクリ
ーニングできる遺伝子スクリーニング法を用いることに
より好適に実施できる。[0010] Screening and isolation of cDNA or gene can be carried out, for example, by the differential hybridization method [Cell, 16: 443-452 (1979).
Year)], subtraction method [Nucleic Acids Researc
h, Vol. 16, pp. 10937 (1988) and Proceedings of t
he National Academy of Sciences, Volume 88, Volume 11505-
11509 (1991)], differential display method [Science, 257, 967-971 (1992) and Cancer Research, 52, 6966-6968 (1992).
Year)] and the like, and can be preferably carried out by using a gene screening method capable of selectively screening a gene whose expression level changes.
【００１１】脳虚血−再灌流のin vitroモデルは、例え
ばアストロサイトの初代培養細胞を用い、これを低酸素
条件に曝した（すなわち低酸素処理した）後、通常の酸
素条件下に戻すかこれより高い酸素条件下に曝して（再
酸素化する）ことにより作成することができる。より具
体的には、通常の酸素条件下での培養（通常培養）は、
９５％空気、５％ＣＯ2という条件の培養機中で培養す
ることにより実施でき、低酸素条件での培養は、９５％
Ｎ2、５％ＣＯ2（Ｏ2濃度1％以下）という条件の培養機
中で培養することにより実施できる。低酸素処理は、前
記のように通常の酸素条件下で培養した細胞を、低酸素
条件の培養機中に移して約２４時間程度培養すればよ
い。再酸素化は、前記のように低酸素処理した細胞を、
再び、通常培養の条件下に戻して培養することにより実
施できる。An in vitro model of cerebral ischemia-reperfusion uses, for example, astrocyte primary culture cells, which are exposed to hypoxic conditions (that is, treated with hypoxia) and then returned to normal oxygen conditions. It can be prepared by exposing (reoxygenating) under higher oxygen conditions. More specifically, culture under normal oxygen conditions (normal culture) is
It can be carried out by culturing in an incubator under the conditions of 95% air and 5% CO 2.
It can be carried out by culturing in an incubator under the conditions of N 2 and 5% CO 2 (O 2 concentration is 1% or less). The hypoxic treatment may be carried out by culturing cells, which have been cultured under normal oxygen conditions as described above, in a culture machine under low oxygen conditions and culturing them for about 24 hours. Reoxygenation is performed by treating cells treated with hypoxia as described above.
It can be carried out by returning to the normal culture conditions and culturing again.
【００１２】本発明の遺伝子は、例えば上記のようなア
ストロサイトの脳虚血−再灌流in vitroモデルを用い、
ディファレンシャル・ディスプレイ法等により、遺伝子
のスクリーニングを行って取得することができる。具体
的には、初代培養アストロサイトを用い、これを低酸素
処理後再酸素化した細胞、およびこれに低酸素処理のみ
施した細胞の各々からｍＲＮＡ（もしくはこれを含む全
ＲＮＡ）を抽出し、逆転写酵素（reverse transcriptas
e）を用いてこれを一本鎖ｃＤＮＡに変換する。続い
て、得られた一本鎖ｃＤＮＡを鋳型とし、適当なプライ
マーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ；Polymera
se Chain Reaction）を行う。プライマーとしては、例
えば、ランダムプライマー［任意の配列からなる約１０
〜１２ｍｅｒのプライマー］を用いて実施できる。ある
いは、プライマーとして、アンカードプライマー（anch
oured primer）及びアービトラリープライマー（arbitr
aryprimer）各一種ずつを組み合わせてプライマーとし
て用いて実施してもよく、このようなアンカードプライ
マーとしては、オリゴｄ（Ｔ）nＶＸ［n＝１１〜１２；
Ｖ＝Ｇ，Ａ又はＣ； Ｘ＝Ｇ，Ａ，Ｔ又はＣ］からな
るプライマーを用い、アービトラリープライマーとして
は、任意の配列からなる約１０ｍｅｒのランダムプライ
マーを用いればよい。このようなＰＣＲ反応を、種々の
プライマーを組み合わせて行うことで、より広い範囲の
遺伝子群をスクリーニングすることが可能となる。続い
て、得られたＰＣＲ産物をゲル電気泳動し、ゲル上に展
開（ディスプレイ）されるｍＲＮＡの発現パターン（フ
ィンガープリント）を比較解析することにより、低酸素
処理した後再酸素化した細胞で特異的に発現している遺
伝子を選択し、常法によりそのｃＤＮＡ断片を単離する
ことができる。The gene of the present invention can be obtained by using, for example, the astrocyte cerebral ischemia-reperfusion in vitro model described above,
It can be obtained by screening a gene by a differential display method or the like. Specifically, using primary culture astrocytes, mRNA (or total RNA containing the same) is extracted from each of cells that have undergone hypoxia treatment and then reoxygenated, and cells that have undergone hypoxia treatment only, Reverse transcriptas
This is converted into single-stranded cDNA using e). Then, using the obtained single-stranded cDNA as a template and appropriate primers, polymerase chain reaction (PCR; Polymera
se Chain Reaction). Examples of the primer include a random primer [about 10 consisting of an arbitrary sequence].
~ 12 mer primer]. Alternatively, as a primer,
oured primer) and arbitrary primer (arbitr)
aryprimer) may be used in combination as a primer, and such an uncard primer may be an oligo d (T) nVX [n = 11-12;
V = G, A or C; X = G, A, T or C], and as the arbitrary primer, a random primer of about 10 mer having an arbitrary sequence may be used. By performing such PCR reaction in combination with various primers, it becomes possible to screen a wider range of gene groups. Subsequently, the obtained PCR product was subjected to gel electrophoresis, and the expression pattern (fingerprint) of the mRNA developed (displayed) on the gel was compared and analyzed to show specificity in cells re-oxygenated after hypoxia treatment. The gene that is expressed specifically can be selected, and its cDNA fragment can be isolated by a conventional method.
【００１３】さらに得られたｃＤＮＡをプローブとし、
低酸素処理後再酸素化した細胞及びこのような処理を行
わなかった対照細胞のｍＲＮＡに対して、ノーザンブロ
ッティングを行うことにより、選択した遺伝子のｍＲＮ
Ａが、再酸素化した細胞で特異的に発現していることを
確認することができる。Further, using the obtained cDNA as a probe,
By performing Northern blotting on mRNA of cells reoxygenated after hypoxia treatment and control cells not subjected to such treatment, mRN of the selected gene
It can be confirmed that A is specifically expressed in the reoxygenated cells.
【００１４】かくして、本発明の脳虚血関連遺伝子のｃ
ＤＮＡを単離・取得することができる。上記のようにし
て得られたｃＤＮＡをプローブとして用いて、ｃＤＮＡ
ライブラリーをスクリーニングすることにより、全長ｃ
ＤＮＡを取得できる。ｃＤＮＡライブラリーは、脳由来
のものを用いることが好ましい。また、得られたｃＤＮ
Ａの塩基配列を決定することにより、遺伝子産物のポリ
ペプチドをコードする翻訳領域を決定でき、このポリペ
プチドのアミノ酸配列を得ることができる。Thus, the cerebral ischemia-related gene c of the present invention is
DNA can be isolated / obtained. Using the cDNA obtained as described above as a probe,
By screening the library, the full length c
DNA can be obtained. It is preferable to use a cDNA library derived from the brain. Also, the obtained cDNA
By determining the base sequence of A, the translation region encoding the polypeptide of the gene product can be determined, and the amino acid sequence of this polypeptide can be obtained.
【００１５】また、得られたｃＤＮＡをプローブとし
て、ゲノミックＤＮＡライブラリーをスクリーニングす
ることにより、染色体遺伝子を単離することができる。
また、他の哺乳動物のＤＮＡライブラリーをスクリーニ
ングすることにより異種生物由来の相同遺伝子を単離す
ることができ、このような哺乳動物としては例えばラッ
ト、マウス、ウサギ、サル、ヒトなどが挙げられる。A chromosomal gene can be isolated by screening a genomic DNA library using the obtained cDNA as a probe.
Further, a homologous gene derived from a heterologous organism can be isolated by screening a DNA library of other mammals. Examples of such mammals include rat, mouse, rabbit, monkey and human. .
【００１６】ｃＤＮＡライブラリー及びゲノミックＤＮ
Ａライブラリー等のＤＮＡライブラリーは、例えば、
「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」［Sambrook,
J., Fritsch, E.F.及びManiatis, T. 著、Cold Spring
Harbor Laboratory Pressより1989年に発刊］に記載の
方法により調製することができる。あるいは、市販のラ
イブラリーがある場合はこれを用いてもよい。CDNA library and genomic DN
A DNA library such as A library is, for example,
"Molecular Cloning" [Sambrook,
J., Fritsch, EF and Maniatis, T., Cold Spring
Published by Harbor Laboratory Press in 1989]. Alternatively, if a commercially available library is available, this may be used.
【００１７】本発明の遺伝子もしくはＤＮＡは、その塩
基配列（或はその一部）がわかっている場合には、化学
合成法によるか、あるいはＰＣＲ（Polymerase Chain R
eaction）法によるか、あるいは、該塩基配列の断片や
化学合成した部分配列のＤＮＡ等をプローブとして、適
当なＤＮＡライブラリー（ｃＤＮＡもしくはゲノミック
ＤＮＡライブラリー等）をスクリーニングすることによ
り取得することもできる。When the nucleotide sequence (or part thereof) of the gene or DNA of the present invention is known, it may be obtained by a chemical synthesis method or by PCR (Polymerase Chain R).
eaction) method, or by screening an appropriate DNA library (cDNA or genomic DNA library, etc.) with a fragment of the nucleotide sequence or a chemically synthesized partial sequence DNA as a probe. .
【００１８】本発明の遺伝子（ｃＤＮＡあるいは染色体
遺伝子など）が、脳虚血に関連する遺伝子であること
は、例えば次のようにして検証することができる。すな
わち、検証する遺伝子もしくはその断片を適当なＲＮＡ
プローブ作製用ベクター、例えばｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐ
ｔＩＩＳＫ−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等に挿入
し、Ｔ３プロモータあるいはＴ７プロモーター等を利用
して本発明の遺伝子に相補的なＲＮＡを合成する。この
際、合成されるＲＮＡにジゴキシゲニン（ベーリンガー
マンハイム社製）やアイソトープ等の適当な標識を付け
ておく。このようなＲＮＡプローブを用いて、ラットの
正常脳、及び虚血を誘発した脳における本遺伝子のｍＲ
ＮＡの分布をin situハイブリダイゼーション法［遠山
正彌監修、1994年、神経化学研究の先端技術プロトコー
ル、厚生社より発刊、第23〜83頁］により調べ、虚血を
誘発した脳で特異的に発現誘導が観察されれば、脳虚血
に関連する遺伝子であることが検証される。The fact that the gene of the present invention (cDNA or chromosomal gene etc.) is a gene associated with cerebral ischemia can be verified, for example, as follows. That is, the gene to be verified or its fragment is converted into an
A vector for producing a probe, for example pBluescript
It is inserted into tIISK- (manufactured by Stratagene) or the like, and RNA complementary to the gene of the present invention is synthesized by using T3 promoter or T7 promoter. At this time, the RNA to be synthesized is labeled with an appropriate label such as digoxigenin (Boehringer Mannheim) or isotope. Using such an RNA probe, the mR of this gene in rat normal brain and ischemia-induced brain
The distribution of NA was examined by the in situ hybridization method [supervised by Masaya Toyama, 1994, advanced technology protocol for neurochemistry research, published by Koseisha, pp. 23-83], and specifically expressed in ischemia-induced brain. If induction is observed, it is verified that it is a gene associated with cerebral ischemia.
【００１９】本発明の遺伝子がコードする脳虚血関連ポ
リペプチド、すなわち、配列番号３又は６で示されるア
ミノ酸配列を有するポリペプチドは、例えば、前記のよ
うにして取得した本発明の遺伝子を用い、遺伝子組換え
技術により生産することができる。あるいは、ペプチド
合成により生産することもできる。あるいはまた、生体
もしくは培養細胞から精製単離し、実質的に純粋な形で
取得することができる。実質的に純粋な形であるポリペ
プチドとは、９０％以上の純度（きょう雑するポリペプ
チドの含量が１０％未満）のものを意味する。The cerebral ischemia-related polypeptide encoded by the gene of the present invention, that is, the polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 6, uses, for example, the gene of the present invention obtained as described above. , Can be produced by gene recombination technology. Alternatively, it can be produced by peptide synthesis. Alternatively, it can be purified and isolated from living cells or cultured cells and obtained in a substantially pure form. A polypeptide in a substantially pure form means a purity of 90% or more (content of contaminating polypeptide is less than 10%).
【００２０】遺伝子組換え技術を用いる場合は、脳虚血
関連ポリペプチドをコードするＤＮＡ、及びポリペプチ
ドを生産するための発現系（宿主−ベクター系）を用い
て公知の方法により実施できる。発現系（宿主−ベクタ
ー系）としては、例えば、細菌、酵母、昆虫細胞および
哺乳動物細胞の発現系等が挙げられる。このうち、機能
タンパクを得るためには、昆虫細胞および哺乳動物細胞
を用いることが好ましい。When the gene recombination technique is used, it can be carried out by a known method using a DNA encoding a cerebral ischemia-related polypeptide and an expression system (host-vector system) for producing the polypeptide. Examples of the expression system (host-vector system) include expression systems for bacteria, yeast, insect cells and mammalian cells. Among these, it is preferable to use insect cells and mammalian cells to obtain functional proteins.
【００２１】脳虚血関連ポリペプチドをコードするＤＮ
Ａとしては、例えば、前記のようにして取得できる脳虚
血関連遺伝子のｃＤＮＡ（例えば、配列番号１、配列番
号２、配列番号４及び配列番号５に示されるｃＤＮＡの
塩基配列）、あるいはその一部を用いることができる。
また、アミノ酸に対応するコドンは公知であるので、前
記のｃＤＮＡ配列に限定されることなく、アミノ酸配列
に対応するＤＮＡを設計し、ポリペプチドをコードする
ＤＮＡとして用いることができる。この場合、ひとつの
アミノ酸をコードするコドンは各々１〜６種類（例え
ば、Ｍｅｔは１種類、Ｌｅｕは６種類）知られており用
いるコドンの選択は任意でよいが、例えば発現に利用す
る宿主のコドン使用頻度を考慮して、より発現効率の高
い配列を設計することができる［Grantham, R. et a
l.、Nucleic Acids Research、第9巻、r43〜r74頁（198
1年）］。設計した塩基配列を持つＤＮＡは、ＤＮＡの
化学合成、前記ｃＤＮＡの断片化と結合、塩基配列の一
部改変等によって取得できる。人為的な塩基配列の一部
改変、変異導入は、所望の改変をコードする合成オリゴ
ヌクレオチドからなるプライマーを利用して部位特異的
変異導入法（site specific mutagenesis）［Mark, D.
F. et al.、Proceedings of National Academy ofScien
ces、第81巻、第5662〜5666頁（1984年）］ 等によって
実施できる。DN encoding a cerebral ischemia-related polypeptide
A is, for example, a cDNA of a cerebral ischemia-related gene that can be obtained as described above (for example, the nucleotide sequences of the cDNAs shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5), or one of them. Parts can be used.
Further, since the codon corresponding to the amino acid is known, the DNA corresponding to the amino acid sequence can be designed and used as the DNA encoding the polypeptide without being limited to the above-mentioned cDNA sequence. In this case, 1 to 6 types of codons encoding one amino acid (for example, 1 type for Met and 6 types for Leu) are known, and the selection of the codon to be used may be arbitrary. Sequences with higher expression efficiency can be designed by considering codon usage [Grantham, R. et a
L., Nucleic Acids Research, Vol. 9, r43-r74 (198
1 year)]. The DNA having the designed base sequence can be obtained by chemical synthesis of DNA, fragmentation and binding of the cDNA, partial modification of the base sequence, and the like. Partial modification of artificial nucleotide sequence, mutagenesis, site-specific mutagenesis method using a primer consisting of a synthetic oligonucleotide encoding the desired modification (site specific mutagenesis) [Mark, D.
F. et al., Proceedings of National Academy of Scien
ces, Vol. 81, pages 5662-5666 (1984)] and the like.
【００２２】遺伝子組換え技術を用いてポリペプチドを
哺乳動物細胞で発現させる場合には、例えば本発明のポ
リペプチドをコードするＤＮＡを適当なベクター（例え
ば、ＳＶ４０系ベクター、レトロウイルス系ベクター、
パピローマウイルスベクター、ワクシニアウイルスベク
ター等）中の適当なプロモーター（例えば、ＳＶ４０プ
ロモーター、ＬＴＲプロモーター、エロンゲーション１
αプロモーター等）の下流に挿入して発現ベクターを構
築する。次に、得られた発現ベクターで適当な哺乳動物
細胞（例えば、サルＣＯＳ−７細胞、チャイニーズハム
スターＣＨＯ細胞、中枢又は末梢神経系の初代培養細胞
等）を形質転換し、形質転換体を適当な培地で培養する
ことによって、その細胞中もしくは培地中に目的とする
ポリペプチドが生産される。When the polypeptide is expressed in mammalian cells by gene recombination technology, for example, DNA encoding the polypeptide of the present invention is used as a suitable vector (eg, SV40 type vector, retrovirus type vector,
Suitable promoters (eg, SV40 promoter, LTR promoter, elongation 1) in papillomavirus vector, vaccinia virus vector, etc.
An expression vector is constructed by inserting it downstream of the α promoter or the like). Next, an appropriate mammalian cell (for example, monkey COS-7 cell, Chinese hamster CHO cell, primary culture cell of central or peripheral nervous system, etc.) is transformed with the obtained expression vector, and the transformant is transformed into an appropriate one. By culturing in the medium, the desired polypeptide is produced in the cells or the medium.
【００２３】また、大腸菌で発現させる場合には、本発
明のポリペプチドをコードするＤＮＡを、適当なプロモ
ーター（例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモー
ター、λｐＬプロモーター、Ｔ７プロモーター等）の下
流に接続し、大腸菌内で機能するベクター（例えば、ｐ
ＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等）に挿入して発
現プラスミドを構築する。次に、この発現プラスミドで
形質転換した大腸菌（例えば、E.coli ＤＨ５、E.coli
ＪＭ１０９、E.coli ＨＢ１０１株等）を適当な培地で
培養して、その菌体より目的とするポリペプチドを得る
ことができる。また、バクテリアのシグナルペプチド
（例えば、ｐｅｌＢのシグナルペプチド）を利用すれ
ば、ペリプラズム中に目的とするポリペプチドを分泌さ
せることもできる。更に、他のポリペプチドとの融合蛋
白（fusion protein）を生産することもできる。For expression in Escherichia coli, the DNA encoding the polypeptide of the present invention is ligated downstream of an appropriate promoter (eg trp promoter, lac promoter, λpL promoter, T7 promoter, etc.), and Escherichia coli is obtained. A vector that functions in (eg, p
BR322, pUC18, pUC19, etc.) to construct an expression plasmid. Then, E. coli transformed with this expression plasmid (eg, E. coli DH5, E. coli
JM109, E. coli HB101 strain, etc.) can be cultured in an appropriate medium to obtain the desired polypeptide from the cells. Further, by using a bacterial signal peptide (for example, pelB signal peptide), the target polypeptide can be secreted into the periplasm. Furthermore, a fusion protein with another polypeptide can be produced.
【００２４】以上のようにして得られたポリペプチド
は、アミノ酸配列から推定される分子量などを指標に
し、一般的な生化学的方法によって単離精製することが
できる。すなわち、目的タンパク質を発現している細胞
の培養上清あるいは可溶化剤（例えば、ＳＤＳやTriton
-Xなど）で可溶化した細胞を陰イオンあるいは陽イオン
交換体などを充填したＨＰＬＣあるいはＦＰＬＣカラム
などにアプライし適当な溶出条件で溶出して目的タンパ
ク質を回収することができる。The polypeptide obtained as described above can be isolated and purified by a general biochemical method using the molecular weight estimated from the amino acid sequence as an index. That is, a culture supernatant of cells expressing the target protein or a solubilizing agent (for example, SDS or Triton
The target protein can be recovered by applying the cells solubilized with (-X, etc.) to an HPLC or FPLC column packed with an anion or cation exchanger and eluting under appropriate elution conditions.
【００２５】本発明の遺伝子もしくはＤＮＡとしては、
ｃＤＮＡ、染色体ＤＮＡ（イントロン及びエキソンを含
む）、イントロンを除きエキソンを連結した染色体ＤＮ
Ａ、人為的に合成したＤＮＡ等が含まれる。また、本発
明の遺伝子もしくはＤＮＡとしては、それらのフラグメ
ント（断片）やホモローグも含まれる。このようなホモ
ローグとしては、塩基配列において一又は複数個の塩基
の欠損、付加（挿入）、置換等が認められる変異型遺伝
子もしくはＤＮＡ等が挙げられ、例えば、自然界で発見
される変異型遺伝子、人為的に改変した変異型遺伝子、
異種生物由来の相同遺伝子等が含まれる。ＤＮＡのフラ
グメントとは、少なくとも１０塩基、好ましくは少なく
とも１５塩基、より好ましくは少なくとも３０塩基の連
続する部分を意味する。As the gene or DNA of the present invention,
cDNA, chromosomal DNA (including intron and exon), chromosomal DN in which exons are ligated excluding intron
A, artificially synthesized DNA and the like are included. The gene or DNA of the present invention also includes fragments and homologues thereof. Examples of such homologues include mutant genes or DNAs in which deletion, addition (insertion), substitution, etc. of one or more bases in the base sequence are recognized, and for example, mutant genes found in nature, Artificially modified mutant gene,
Homologous genes derived from heterologous organisms are included. By a fragment of DNA is meant a continuous portion of at least 10 bases, preferably at least 15 bases, more preferably at least 30 bases.
【００２６】本発明のポリペプチドとしては、その断片
もしくはそれらのホモローグも含まれる。このような断
片もしくはホモローグは、本ポリペプチドと同様（実質
的に同種・同効）の生物活性を有するものであるか、或
いは、本ポリペプチドに対する抗体と交差反応を生じる
というように本ポリペプチドと免疫学的同等性を有する
ものであればよい。このような断片もしくはホモローグ
としては、例えば、アミノ酸配列においてその一部が欠
損したもの（例えば、生物活性の発現に必須な部分だけ
から成るポリペプチド）、その一部が他のアミノ酸と置
換したもの（例えば、物性の類似したアミノ酸に置換し
たもの）、およびその一部に他のアミノ酸が付加または
挿入されたもの等が挙げられ、自然界で発見される変異
型ポリペプチドのほか、人為的に改変した変異ポリペプ
チド、異種生物由来で同様の生物活性を有する相同ポリ
ペプチド等が含まれる。ポリペプチドのホモローグと
は、一般に少なくとも２０個、好ましくは少なくとも３
０個の連続したアミノ酸領域で、少なくとも７０％、好
ましくは少なくとも８０％または９０％、より好ましく
は９５％以上、アミノ酸配列上の相同性を有するもので
ある。さらに、ポリペプチド（またはそれらのホモロー
グ）のフラグメントとは、ポリペプチド（またはそれら
のホモローグ）の少なくとも１０アミノ酸、好ましくは
少なくとも１５アミノ酸、例えば２０、２５、３０、４
０、５０または６０アミノ酸の連続した部分を意味す
る。The polypeptide of the present invention also includes a fragment thereof or a homologue thereof. Such a fragment or homologue has a biological activity similar to (substantially the same as, and has the same effect as) the present polypeptide, or has a cross-reactivity with an antibody against the present polypeptide. As long as it has immunological equivalence. Such fragments or homologues include, for example, those in which a part of the amino acid sequence is deleted (for example, a polypeptide consisting of only an essential part for expression of biological activity), and those in which a part thereof is replaced with other amino acids. (For example, those substituted with amino acids having similar physical properties) and those in which other amino acids are added or inserted in part thereof, etc., and in addition to mutant polypeptides found in nature, artificially modified Mutated polypeptides, homologous polypeptides derived from different organisms and having similar biological activity, and the like. A homolog of a polypeptide generally means at least 20, preferably at least 3.
A region of 0 consecutive amino acids has at least 70%, preferably at least 80% or 90%, more preferably 95% or more homology in amino acid sequence. Furthermore, a fragment of a polypeptide (or homologues thereof) means at least 10 amino acids, preferably at least 15 amino acids, such as 20, 25, 30, 4 of a polypeptide (or homologues thereof).
It means a contiguous portion of 0, 50 or 60 amino acids.
【００２７】本発明には、本発明の遺伝子（その翻訳領
域もしくはプロモータ領域などを含む）と選択的にハイ
ブリダイズし得る核酸（ＤＮＡもしくはＲＮＡ）、例え
ばアンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡもしくはリ
ボザイム等が含まれる。このようなＤＮＡ、ＲＮＡもし
くはリボザイムは例えば化学合成等により取得できる。
また、アンチセンスＲＮＡは、遺伝子（ｃＤＮＡ等）を
前記のような発現ベクターに、逆向きで（アンチセンス
方向に）挿入することにより取得できる。これらアンチ
センスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡもしくはリボザイム
は、細胞中の本発明の遺伝子及びポリペプチドの発現レ
ベルを制御することに用いることができる。選択的にハ
イブリダイズし得る核酸とは、一般に、少なくとも２０
個、好ましくは少なくとも３０個の連続した塩基配列領
域で、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０
％、より好ましくは９０％以上、塩基配列上の相同性を
有する核酸を意味する。The present invention includes a nucleic acid (DNA or RNA) capable of selectively hybridizing with the gene of the present invention (including its translation region or promoter region), such as antisense DNA, antisense RNA or ribozyme. included. Such DNA, RNA or ribozyme can be obtained by, for example, chemical synthesis.
In addition, antisense RNA can be obtained by inserting a gene (cDNA or the like) into the expression vector as described above in the reverse direction (in the antisense direction). These antisense DNA, antisense RNA or ribozyme can be used for controlling the expression level of the gene and polypeptide of the present invention in cells. Selectively hybridizable nucleic acids generally mean at least 20
At least 70%, preferably at least 80, in a continuous nucleotide sequence region of at least 30, preferably at least 30
%, And more preferably 90% or more means a nucleic acid having a homology in the nucleotide sequence.
【００２８】また、本発明には、本発明の遺伝子（もし
くはＤＮＡ）を含むベクター、及びこれらで形質転換さ
れた宿主細胞も含まれる。このようなベクターとして
は、複製起点（ｏｒｉ領域）を含む複製ベクター、プロ
モーター領域、プロモーターの制御因子、ＲＮＡのスプ
ライス部位、ポリアデニル化部位又は転写終結配列等を
含む発現ベクターが使用できる。またこれらベクター
は、ひとつまたは二以上の選択的マーカー遺伝子、例え
ばアンピシリン耐性遺伝子等を含んでいるのが好まし
い。このようなベクターの具体例としては、ｐＢＲ３２
２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＲＳ、ｐＭＡＭｎｅ
ｏ、ｐＣＤＭ８、ｐＥＦ−ＢＯＳ、ｐＹＥＳ２ｐＭＣ１
ｎｅｏ等のプラスミドベクター、ｐＢａｃＰＡＫ８、ｐ
ＢａｃＰＡＫ９、ｐＡｃＵＷ３１、バキュロウイルス
（ＡｃＮＰＶ等）等のウイルスベクター、もしくはλｇ
ｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰ等のファージベクターが
挙げられる。本発明のＤＮＡを含むベクターは、例えば
ＤＮＡに相当するＲＮＡを調製するために、または宿主
細胞を形質転換するために用いられる。宿主細胞として
は、例えば細菌、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞が挙げ
られ、用いるベクターに合わせて適当な宿主細胞を選択
するか、もしくは用いる宿主細胞に合わせて適当なベク
ターを選択すればよい。The present invention also includes a vector containing the gene (or DNA) of the present invention, and a host cell transformed with these. As such a vector, a replication vector containing an origin of replication (ori region), a promoter region, a promoter regulatory factor, an RNA splice site, a polyadenylation site, a transcription termination sequence, or the like can be used. In addition, these vectors preferably contain one or more selective marker genes such as ampicillin resistance gene. Specific examples of such a vector include pBR32
2, pUC18, pUC19, pRS, pMAMne
o, pCDM8, pEF-BOS, pYES2pMC1
plasmid vectors such as neo, pBacPAK8, p
Viral vectors such as BacPAK9, pAcUW31, baculovirus (AcNPV, etc.), or λg
Phage vectors such as t10, λgt11 and λZAP can be mentioned. The vector containing the DNA of the present invention is used, for example, to prepare RNA corresponding to DNA or to transform a host cell. Examples of the host cell include bacteria, yeast, insect cells, and mammalian cells, and an appropriate host cell may be selected according to the vector used, or an appropriate vector may be selected depending on the host cell used.
【００２９】また、本発明のポリペプチドを用いて、そ
のモノクローナルまたはポリクローナル抗体を取得する
ことができる。モノクローナル抗体は、本発明のポリペ
プチド、その断片、またはその部分配列を有する合成ペ
プチド等を抗原として用い、通常のハイブリドーマ法な
どの技術により製造できる。また、モノクローナル抗体
の遺伝子を改変してヒト化モノクローナル抗体等を作成
できる。ポリクローナル抗体は、宿主動物（例えば、ウ
サギやマウス等）に本発明のポリペプチド、その断片、
またはその部分配列を有する合成ペプチド等を接種し、
免疫血清を回収する、通常の方法により製造することが
できる。このようにして得られるモノクローナル抗体、
またはポリクローナル抗体を利用することにより、生体
または培養細胞から、本発明のポリペプチドもしくは類
似の構造、免疫原性を有するポリペプチドを検出し、精
製単離することができる。また生体における該ポリペプ
チドの定量ができ、該ポリペプチドと脳虚血の病態との
関係の研究あるいは疾患の診断などにも利用することが
できる。Further, using the polypeptide of the present invention, its monoclonal or polyclonal antibody can be obtained. A monoclonal antibody can be produced by a technique such as a usual hybridoma method using the polypeptide of the present invention, a fragment thereof, or a synthetic peptide having a partial sequence thereof as an antigen. In addition, a humanized monoclonal antibody or the like can be prepared by modifying the gene of the monoclonal antibody. The polyclonal antibody is a polypeptide of the present invention, a fragment thereof, or the like in a host animal (for example, rabbit or mouse).
Or inoculate with a synthetic peptide or the like having a partial sequence thereof,
It can be produced by a conventional method for collecting immune serum. A monoclonal antibody thus obtained,
Alternatively, by using a polyclonal antibody, the polypeptide of the present invention or a polypeptide having a similar structure or immunogenicity can be detected and purified and isolated from a living body or a cultured cell. Further, the polypeptide can be quantified in a living body, and can be used for research on the relationship between the polypeptide and the pathological condition of cerebral ischemia, diagnosis of diseases, and the like.
【００３０】以下、実施例をもって本発明をさらに詳し
く説明するが、これらの実施例は本発明を制限するもの
ではない。Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples, but these examples do not limit the present invention.
【００３１】なお、下記実施例において、各操作は特に
明示がない限り、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ」［Sambrook, J., Fritsch, E.F.及びManiatis, T.
著、Cold Spring Harbor Laboratory Pressより1989年
に発刊］に記載の方法により行うか、または、市販の試
薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って使
用した。In the following examples, each operation is "Molecular Clonin" unless otherwise specified.
g "[Sambrook, J., Fritsch, EF and Maniatis, T .;
Published by Cold Spring Harbor Laboratory Press in 1989], or when using commercially available reagents and kits, they were used according to the instructions for the commercially available products.
【００３２】[0032]
実施例１ ラット脳虚血関連遺伝子のクローニング １）アストロサイトの培養とこれを用いたin vitro 脳
虚血−再潅流モデル 生直後のＳＤ系ラットから大脳半球を摘出し、Ｄｉｓｐ
ａｓｅＩＩ（商品名、、ベーリンガーマンハイム社製）
で処理して細胞を単離する。得られた細胞を１０％牛胎
児血清含有のミニマム・エッセンシャル・メディウム
（ＭＥＭ）中で１０日間培養した後、線維芽細胞の増殖
を抑えるために１０μｇ／ｍｌのシトシンアラビノフラ
ノシド（cytosine arabinofuranoside)を添加した１０
％牛胎児血清含有ＭＥＭ中で４８時間培養し、さらにマ
イクログリアやオリゴデンドログリア細胞からアストロ
サイトを分離するために振とう培養する。培養皿に付着
した細胞についてその形態を顕微鏡にて観察するととも
に、アストロサイトのマーカーであるglial fibrillary
acidic protein（ＧＦＡＰ）に対するモノクローナル
抗体（ＩＳＡＮＢＩＯ ＢＶ社製）を用いて免疫染色す
ることによって、アストロサイトであることを確認す
る。これら細胞を５ｘ１０4 ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2の細胞
密度で１０％牛胎児血清含有ＭＥＭ中に接種し、これを
培養する。Example 1 Cloning of rat cerebral ischemia-related gene 1) Culture of astrocyte and in vitro cerebral ischemia-reperfusion model using the same Cerebral hemisphere was isolated from SD rat immediately after birth, and Disp
aseII (trade name, manufactured by Boehringer Mannheim)
Isolate cells by treating with. After culturing the obtained cells in a minimum essential medium (MEM) containing 10% fetal bovine serum for 10 days, 10 μg / ml cytosine arabinofuranoside was added to suppress the proliferation of fibroblasts. Added 10
The cells are cultured in MEM containing% fetal bovine serum for 48 hours, and further shake-cultured to separate astrocytes from microglia and oligodendroglial cells. The morphology of the cells attached to the culture dish was observed under a microscope and glial fibrillary, a marker for astrocytes, was observed.
By immunostaining with a monoclonal antibody against acidic protein (GFAP) (manufactured by ISANBIO BV), it is confirmed to be astrocytes. These cells are inoculated at a cell density of 5 × 10 4 cells / cm 2 into MEM containing 10% fetal bovine serum and cultured.
【００３３】in vitro 脳虚血−再潅流モデルは、上記
のように培養した細胞を低酸素処理後再酸素化すること
により作成する。細胞の低酸素処理は、コンフルエント
（約２ｘ１０5 ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2）に達した細胞を、
Ｏ2濃度が１％以下（９５％Ｎ2、５％ＣＯ2）の低酸素
培養機（Ｃｏｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｄｕｃ
ｔｓ社製のＨｙｐｏｘｉａ ｃｈａｍｂｅｒ）［Ogawa
ら、Journal of Clinical Investigation、第85巻、第1
090〜1098頁、1990年］内で24時間培養することにより
実施する。低酸素処理後の再酸素化は、前記のようにし
て低酸素処理した細胞を、低酸素培養機内から大気中に
移し１ないし２４時間放置することにより実施する。The in vitro cerebral ischemia-reperfusion model is prepared by hypoxic treatment and reoxygenation of cells cultured as described above. Hypoxic treatment of cells was performed by treating cells that reached confluence (about 2 × 10 5 cells / cm 2 ).
O 2 concentration of 1% or less (95% N 2, 5% CO 2) in hypoxic incubator (Coy Laboratory produc
Hypoxia chamber made by ts) [Ogawa
Et al., Journal of Clinical Investigation, Volume 85, Volume 1.
[0910 to 9898, 1990] for 24 hours. The reoxygenation after the hypoxia treatment is carried out by transferring the cells subjected to the hypoxia treatment as described above from the inside of the hypoxia incubator to the atmosphere and leaving them for 1 to 24 hours.
【００３４】２）低酸素処理−再酸素化において発現誘
導される遺伝子のクローニング 前記１）に従って低酸素処理後再酸素化したアストロサ
イト（再酸素化した後１時間放置した細胞）（約４ｘ１
０7ｃｅｌｌｓ）から、アシッドグアニジン−フェノー
ル−クロロホルム法（ＡＧＰＣ法）［豊島久真男、山本
雅 監修、1993年、細胞工学実験プロトコール、秀潤社
より発刊、第42〜47頁］により、トータルRNAを抽出す
る。また、対照細胞として、低酸素処理のみ行ったアス
トロサイトを用い、同様にしてトータルRNAを抽出す
る。得られたトータルＲＮＡをＤＮａｓｅＩ処理した
後、これを用いて、ディファレンシャル・ディスプレイ
法［Liangら、Science、第257巻、第967〜971頁（1992
年）］により、以下のように候補クローンの選択を行
う。2) Cloning of Gene Induced by Hypoxia Treatment-Reoxygenation Astrocytes reoxygenated after hypoxia treatment according to 1) above (cells left for 1 hour after reoxygenation) (about 4 × 1)
From 0 7 cells), Acid guanidine - phenol - chloroform method (AGPC) method [Toyoshima HisaMasao, Ya Yamamoto supervised, 1993, Cell Engineering Experiment Protocol, published from Shujunsha, pp 42-47], the total RNA Extract. In addition, as control cells, astrocytes treated only with hypoxia are used, and total RNA is similarly extracted. The obtained total RNA was treated with DNase I and then used for differential display method [Liang et al., Science, Vol. 257, pp. 967-971 (1992).
Year)], the candidate clones are selected as follows.
【００３５】ＭＭＬＶ（Moloney Murine Leukemia Viru
s）の逆転写酵素（３００単位）及び２．５μＭ オリ
ゴ（ｄＴ）プライマーを用いて、ＤＮａｓｅＩ処理済ト
ータルＲＮＡ（約３μｇ）から一本鎖ｃＤＮＡを合成す
る。得られた一本鎖ｃＤＮＡを用いて、ポリメラーゼ連
鎖反応（ＰＣＲ；polymerase chain reaction）を、１
μＭのランダムプライマー［任意の配列からなる約１０
〜１２ｍｅｒのプライマー］及び１００μＭのｄＮＴＰ
ｍｉｘｔｕｒｅの存在下で行う。ＰＣＲは、９５℃で１
分間、４０℃で１分間、７２℃で３０秒間の条件で４０
サイクル、及び最終サイクルとして７２℃で５分間の条
件で１サイクルを行って反応を終了し、このようなＰＣ
Ｒを約１００種類のプライマーについて行う。MMLV (Moloney Murine Leukemia Viru
Single-stranded cDNA is synthesized from DNase I-treated total RNA (about 3 μg) using reverse transcriptase (300 units) of s) and 2.5 μM oligo (dT) primer. Using the obtained single-stranded cDNA, polymerase chain reaction (PCR)
μM random primer [about 10 consisting of any sequence]
~ 12mer primer] and 100 μM dNTP
Perform in the presence of mixture. PCR 1 at 95 ° C
40 minutes under conditions of 40 ° C for 1 minute and 72 ° C for 30 seconds
Cycle, and as the final cycle, one cycle is performed at 72 ° C. for 5 minutes to complete the reaction.
R is performed for about 100 kinds of primers.
【００３６】これらＰＣＲ産物を、５％ポリアクリルア
ミドゲルにて電気泳動した後、エチジウムブロマイドで
染色する。ゲル上に展開されたバンドを観察し、低酸素
処理後再酸素化した細胞由来のサンプルでは認められる
が、対照細胞（低酸素処理のみ行なった細胞）由来のサ
ンプルでは観察されないバンドを、候補クローンとして
選択する。候補クローンのバンドに対応するゲル部分か
ら、ｃＤＮＡ断片を溶出して回収し、前記と同様の条件
でＰＣＲを行って（前記ＰＣＲと同じプライマーを使
用）ＤＮＡを増幅させた後、これを用いてベクタープラ
スミドｐＧＥＭ−Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に候補クロ
ーンのｃＤＮＡ断片をサブクローニングする。These PCR products are electrophoresed on a 5% polyacrylamide gel and then stained with ethidium bromide. Bands developed on the gel were observed, and bands that were observed in samples derived from cells that had been reoxygenated after hypoxia treatment but were not observed in samples derived from control cells (cells that had undergone hypoxia treatment) were selected as candidate clones. To choose as. From the gel portion corresponding to the band of the candidate clone, the cDNA fragment was eluted and recovered, PCR was performed under the same conditions as above (using the same primers as the PCR) to amplify the DNA, and then this was used. The cDNA fragment of the candidate clone is subcloned into the vector plasmid pGEM-T (manufactured by Promega).
【００３７】３）低酸素処理−再酸素化アストロサイト
における遺伝子発現のノーザンブロッティングによる解
析 候補クローン由来のｃＤＮＡ断片を、Ｒａｎｄｏｍ Ｐ
ｒｉｍｅｒ ＤＮＡＬａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ Ｖｅ
ｒ．２（商品名、宝酒造社製）を用いてα−32Ｐ−ｄＣ
ＴＰでラベルする。これをプローブとして用い、前記
１）２）記載の方法で得られる低酸素処理後再酸素化ア
ストロサイト及び対照細胞の各々より抽出した全ＲＮＡ
に対してノーザンブロッティングを行う。ノーザンブロ
ッティングの結果、低酸素処理のみ行なった細胞では発
現が認められないが、低酸素処理後再酸素化した細胞で
特異的に発現していることを確認することにより、候補
クローンが脳虚血関連遺伝子であることを確認できる。3) Analysis of Gene Expression in Hypoxia Treatment-Reoxygenated Astrocytes by Northern Blotting A cDNA fragment derived from a candidate clone was subjected to Random P
rimer DNA Labeling Kit Ve
r. 2 (trade name, manufactured by Takara Shuzo) using α- 32 P-dC
Label with TP. Using this as a probe, total RNA extracted from each of reoxygenated astrocytes after hypoxia treatment and control cells obtained by the method described in 1) or 2) above
Northern blotting against. As a result of Northern blotting, no expression was observed in cells treated only with hypoxia, but by confirming that it was specifically expressed in cells reoxygenated after hypoxia treatment, the candidate clone was confirmed to have cerebral ischemia. It can be confirmed that it is a related gene.
【００３８】４）全長ｃＤＮＡのクローニングと塩基配
列決定 前記３）で得られる候補クローンのｃＤＮＡ断片を、Ｒ
ａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｅｒ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ
Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（商品名、宝酒造社製）を用いて
α−32Ｐ−ｄＣＴＰでラベルし、これをプローブとし
て、成熟ラット脳ｃＤＮＡライブラリー（Ｓｔｒａｔａ
ｇｅｎｅ社製）をスクリーニングし、得られる陽性クロ
ーンのうち挿入断片が長いクローンを選択する。これら
クローン由来のプラスミド（ベクター部分はＳｔｒａｔ
ａｇｅｎｅ社製ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ−）につ
いて、常法により制限酵素切断地図を作製する。また、
Ｋｉｌｏ−Ｓｅｑｕｅｎｃｅ用Ｄｅｌｅｔｉｏｎ Ｋｉ
ｔ（商品名、宝酒造社製）を用いて種々の欠失プラスミ
ドを作成し、これを用いてダイデオキシ法により挿入ｃ
ＤＮＡの塩基配列を決定し、塩基配列を決定したｃＤＮ
Ａ部分を適宜つなぎ合わせて本発明の脳虚血関連遺伝子
の全長ｃＤＮＡ断片を取得する。また、ｃＤＮＡの塩基
配列を解析して、オープンリーディングフレームを同定
し、さらにコーディング領域の配列をアミノ酸配列に翻
訳して、本発明の脳虚血関連遺伝子がコードするポリペ
プチドのアミノ配列を得る。4) Cloning of full-length cDNA and determination of nucleotide sequence The cDNA fragment of the candidate clone obtained in 3) above was converted into R
anddom Primer DNA Labeling
Kit Ver. 2 (trade name, manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) was used to label with α-32P-dCTP, and this was used as a probe to prepare a mature rat brain cDNA library (Strata).
(manufactured by Gene Co., Ltd.) and a clone having a long insertion fragment is selected from the obtained positive clones. Plasmids derived from these clones (the vector part is Strat
For pBluescript SK-) manufactured by agene, a restriction enzyme cleavage map is prepared by a conventional method. Also,
Deletion Ki for Kilo-Sequence
Various deletion plasmids were prepared using t (trade name, manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) and inserted by the dideoxy method using this.
CDN whose base sequence was determined by determining the base sequence of DNA
The A portion is appropriately connected to obtain a full-length cDNA fragment of the cerebral ischemia-related gene of the present invention. In addition, the nucleotide sequence of the cDNA is analyzed to identify the open reading frame, and the sequence of the coding region is translated into an amino acid sequence to obtain the amino sequence of the polypeptide encoded by the cerebral ischemia-related gene of the present invention.
【００３９】実施例２ 脳虚血関連遺伝子のヒトホモロ
ーグのクローニング 実施例１の４）項で得られるラット脳虚血関連遺伝子ｃ
ＤＮＡの翻訳領域を含む断片を、実施例１の３）項記載
の方法と同様にして、α−32Ｐ−ｄＣＴＰでラベルし、
これをプローブとして、ヒト脳ｃＤＮＡライブラリー
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を、前記実施例１の４）
項記載の方法に準じてスクリーニングする。得られる陽
性クローンのうち、挿入断片の長いクローンを選択し、
これらクローン由来のプラスミド（ベクター部分はＳｔ
ｒａｔａｇｅｎｅ社製ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ
−）について、前記実施例１の４）項記載の方法に準じ
て、挿入断片ｃＤＮＡの塩基配列を決定する。かくして
得られるヒト由来の脳虚血関連遺伝子ｃＤＮＡの塩基配
列について、ラット遺伝子とのホモロジーを含めて解析
し、コーディング領域を同定する。さらにコーディング
領域の配列をアミノ酸配列に翻訳して、ヒト由来の脳虚
血関連遺伝子がコードするポリペプチドのアミノ配列を
得る。Example 2 Cloning of human homologue of cerebral ischemia-related gene Rat cerebral ischemia-related gene c obtained in 4) of Example 1
A fragment containing the translation region of DNA was labeled with α- 32 P-dCTP in the same manner as in the method described in 3) of Example 1,
Using this as a probe, a human brain cDNA library (manufactured by Stratagene) was prepared as described in 4 of Example 1).
Screen according to the method described in section. From the positive clones obtained, select a clone with a long insert fragment,
Plasmids derived from these clones (the vector part is St
pBluescript SK manufactured by ratagene
Regarding-), the nucleotide sequence of the insert fragment cDNA is determined according to the method described in 4) of Example 1 above. The nucleotide sequence of the human-derived cerebral ischemia-related gene cDNA thus obtained is analyzed, including the homology with the rat gene, to identify the coding region. Further, the sequence of the coding region is translated into an amino acid sequence to obtain the amino sequence of the polypeptide encoded by the human ischemia-related gene.
【００４０】実験例１ 低酸素処理−再酸素化アストロ
サイトにおける脳虚血関連遺伝子ＹＴ５２１の発現（ノ
ーザンブロッティングによる解析） ラットＹＴ５２１遺伝子由来のｃＤＮＡ断片（配列番号
１の１２４６番目から３２２４番目の塩基に相当する断
片）をプローブとし、実施例１の３）記載の方法に準じ
て、低酸素処理後再酸素化したラットアストロサイト、
及び対照細胞の各全ＲＮＡに対してノーザンブロッティ
ングを行った。ノーザンブロッティングの結果を図１に
示した。図１から明らかなように、ＹＴ５２１ｍＲＮＡ
は、通常の培養方法により培養した細胞（レーン１）及
び低酸素処理のみ行なった細胞（レーン２）では、発現
が認められないが、低酸素処理後再酸素化した細胞（レ
ーン３〜７）で特異的に発現していることがわかった。
このことから、ＹＴ５２１遺伝子は、アストロサイトが
低酸素条件に曝された後再酸素化された際に特異的に発
現する脳虚血関連遺伝子であると考えられた。Experimental Example 1 Expression of cerebral ischemia-related gene YT521 in hypoxia-reoxygenated astrocytes (analysis by Northern blotting) Rat YT521 gene-derived cDNA fragment (bases 1246 to 3224 of SEQ ID NO: 1) Rat astrocytes re-oxygenated after hypoxia treatment according to the method described in 3) of Example 1, using the corresponding fragment) as a probe,
Northern blotting was performed on each total RNA of the control cells. The result of Northern blotting is shown in FIG. As is clear from FIG. 1, YT521 mRNA
Is not expressed in cells cultured by a normal culture method (lane 1) and cells treated only with hypoxia (lane 2), but cells reoxygenated after hypoxia treatment (lanes 3 to 7) Was found to be specifically expressed in.
From this, it was considered that the YT521 gene is a cerebral ischemia-related gene that is specifically expressed when astrocytes are reoxygenated after being exposed to hypoxic conditions.
【００４１】[0041]
【発明の効果】本発明の遺伝子およびそれがコードする
ポリペプチドは、アストロサイトを用いたin vitro脳虚
血−再灌流モデルにおいて特異的に発現するものであ
り、脳虚血に関与することが明らかである。従って、本
発明の新規遺伝子およびそれがコードするポリペプチド
は、脳虚血の機構解明に有用である。また、脳虚血に伴
う病変のモデル動物作成や予防もしくは治療薬などの開
発のために用いることができる。また、該ポリペプチド
に対する抗体は虚血による病変の程度を測定することに
役立つ。INDUSTRIAL APPLICABILITY The gene of the present invention and the polypeptide encoded by it are specifically expressed in an in vitro cerebral ischemia-reperfusion model using astrocytes and may be involved in cerebral ischemia. it is obvious. Therefore, the novel gene of the present invention and the polypeptide encoded by it are useful for elucidating the mechanism of cerebral ischemia. In addition, it can be used for preparing a model animal of a lesion associated with cerebral ischemia and for developing a preventive or therapeutic drug. In addition, an antibody against the polypeptide is useful for measuring the extent of ischemic lesions.
【００４２】[0042]
配列番号：１ 配列の長さ：３２２４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 起源 生物名：ラット 配列： GTTTCGCGCA GGAAGCAGGC TCCATTTTAG CGCCGCCCGC CGTCGCCATC TGTTTCTCTC 60 TCCTCCCCCT TGTCTCTGGT GTGGCCGAAT CCCCAACAGA AAGATTGAAG CCCGCGCTGT 120 CCGAGGTCAG GCGGGAAGAG AACCAGAGGA CGGGAGGAAG GGTGCTCGTA GGAGCTGAGT 180 GGAGCAGGTC AGGTCGAAGC GCGCGGCCCG CCGGACGGAC TGACGGACGG ACTCGTGCGC 240 CTGCGGCCGC GGCTGCGGCG CGCCGCGCGA CTCGCTTCCC GGCGGCGGTG GCGGCGGCGG 300 AAGCCGGAGG GCAGCCATGG CGGCCGACAG CCGGGAGGAG AAAGATGGGG AACTTAATGT 360 TTTAGATGAT ATTTTGACTG AAGTACCAGA ACAGGATGAT GAACTGTATA ATCCAGAGAG 420 TGAACAAGAT AAAAATGAGA AAAAAGGATC AAAAAGAAAA AGTGAAAGAA TGGAATCTAT 480 TGACACCAAG CGACAGAAGC CTTCTATCCA TTCAAGACAA CTGATTTCTA AGCCACTAAG 540 CTCATCTGTT AGCAATAATA AAAGAATAGT TAGTACAAAA GGAAAGTCGG TTACAGAATA 600 TAAAAATGAG GAATATCAAA GATCTGAAAG GAACAAGCGT CTAGATGCTG ATCGAAAAAT 660 TCGTCTGTCA AGCAGTTCCT CTAGAGAACC TTACAAGAGT CAACCAGAAA AACCTTGTCT 720 ACGGAAAAGG GATTCTGAAA GAAGGGCCAA GTCTCCTACA CCAGATGGTT CTGAGAGAAT 780 TGGGCTTGAA GTTGATAGAC GTGCAAGCAG ATCCAGCCAG TCTTCAAAGG AAGAGGGGAA 840 CTCTGAGGAG TATGGCTCTG ACCACGAGAC AGGAAGCAGT GCTTCTTCTG AACAGGGCAA 900 CAACACTGAG AATGAGGAGG AAGGAGGGGA AGAAGATGTA GAGGAAGATG AAGAGGTAGA 960 TGAAGATGGA GATGATGATG AGGAAGTGGA TGAAGATGCG GAGGAGGAGG AGGACGAGGA 1020 AGAAGATGAG GAGGAGGAGG ATGAGGAAGA AGAAGAGGAA GAGGAAGAAG AATATGAACA 1080 GGATGAGAGA GATCAGAAGG AAGAAGGGAA TGATTATGAC ACCCGTAGTG AGGCCAGTGA 1140 TTCTGGTTCT GAGTCTGTTT CCTTCACAGA TGGATCTGTC AGGTCTGGTT CAGGAACAGA 1200 TGGATCAGAT GAGAAAAAGA AGGAAAGGAA GAGAGCTCGA GGCATATCAC CCATTGTCTT 1260 TGATAGAAGT GGCAGTTCTG CATCAGAGTC ATATGCAGAT CAAACCAGTA AACTCAAATA 1320 TGTCCTTCAG GATGCAAGAT TTTTCCTCAT AAAGAGTAAC AACCATGAGA ATGTGTCTCT 1380 TGCCAAAGCA AAGGGTGTAT GGTCCACATT ACCTGTAAAT GAGAAGAAAT TAAATCTTGC 1440 GTTTAGATCT GCAAGGAGTG TTATATTAAT ATTTTCTGTC AGGGAAAGTG GAAAGTTTCA 1500 AGGTTTTGCC AGATTGTCAT CAGAATCGCA TCATGGTGGC TCTCCTATAC ATTGGGTGCT 1560 TCCAGCAGGA ATGAGTGCTA AAATGCTTGG AGGTGTTTTT AAAATTGACT GGATTTGCAG 1620 GCGTGAATTA CCCTTTACTA AGTCAGCTCA TCTCACCAAT CCCTGGAATG AACATAAGCC 1680 AGTAAAGATT GGACGTGATG GACAGGAAAT TGAACTTGAA TGTGGAACCC AGCTTTGTCT 1740 TCTGTTTCCC CCTGATGAAA GTATTGACTT GTATCAGCTC ATTCATAAAA TGCGTCACAA 1800 GAGAAGAATG CATTCTCAGC CTCGATCAAG AGGACGTCCA TCCCGTCGAG AACCAGTCCG 1860 GGATGTGGGA AGGCGTCGAC CAGAAGATTA TGATATTCAT AACAGCAGAA AGAAACCAAG 1920 GATTGACTAT CCCCCTGAGT TTCACCAGAG ACCAGGGTAT TTAAAGGATC CCCGATACCA 1980 GGAAGTTGAC AGACGATTTT CAGGAGTTCG CCGAGATGTG TTTTTAAATG GGTCCTACAA 2040 TGATTATGTG AGGGAATTTC ATAACATGGG ACCACCGCCT CCTTGGCAAG GAATGCCTCC 2100 TTACCCGGGA ATAGAACAGC CTCCACACCA TCCCTACTAC CAGCACCATG CCCCGCCTCC 2160 TCAAGCCCAC CCCCCTTACT CAGGACACCA TCCGGTACCA CATGAAGCAA GATACAGAGA 2220 TAAACGAGTA CATGACTATG ATATGAGGGT TGATGATTTC CTTCGCCGCA CACAAGCCGT 2280 TGTCAGTGGT CGGAGAAGTA GACCCCGAGA AAGAGATCGG GAGCGAGAGC GAGACCGCCC 2340 TAGAGATAAC AGAAGAGATA GAGAGCGAGA CAGAGGTCGT GATCGAGAAA GAGAGAGAGA 2400 AAGAATATGT GATCGGGACA GAGACCGAGG GGAAAGAGGT CGTTATCGAA GATAATGTGC 2460 TTTTTGGAAG CACTGACTGA AGATAAAAAA TATTGTATTT TTTTTGTGTG TGTTTACAAG 2520 TAGTAAATTT ATTTTCAGCT GTCTACTTAA AGCTCATTGT GTAGAAGGAT TTATTATCTT 2580 CTTTGTTCCA AGCATGCAGT AGAATAAGAA CTGGAAAACT CAGATCCGCC AAAAAATGCA 2640 CAGTTGACAG TTGAGTTGAC ACTTTTATTG GGGCAGAATG GAACAGTCCA AGAATGTAGA 2700 TATTGATTCA TTCTCCATAA ATGTTCTTTT TACAGTGTAT TCATCCTAGA GTTATTTTGT 2760 TTGTTTGTTT TCCTTCTTTT GGACCTTGGT CAATACTGCC ATAGTATTTT GCTTTGTGTT 2820 TCTATAGGTA GCTGCACACG GTTCAGTAAA AATAATGCTG CTATCAAGTA TGCAGATATT 2880 GAGTATGATG GTTTGACTAT ATGGCAGTGT TGTAGCAGCC TCTCGGTTTC TCCTCTTCCC 2940 TCCTTTTTTT TAAACCTATA AATCCACTTT TTTTTTAAGT CTTCAATGAT GAGAGCAATA 3000 TTAAGAAGAC ATTGCTATCT AATTTTTAAT CTTTTTAAAT AAAACGTTCC TATGTTCAGT 3060 AGCATGGTCG ATGCTATTGT TTAGCCTTCC TTCCAAACTG TACATTGGCT TGGAATGTTC 3120 AGTTTTGCGT GTGTGGCAGC AGAAGATAAC CCCACATTCT ACATTGCTAC TGTTTTGTAT 3180 GAAATAAATT GGTAAAGATT GACACTAAAA AAAAAAAAAA AAAA 3224 。 SEQ ID NO: 1 Sequence length: 3224 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Double-stranded topology: Linear Sequence type: cDNA to mRNA Origin organism name: Rat sequence: GTTTCGCGCA GGAAGCAGGC TCCATTTTAG CGCCGCCCGC CGTCGCCATC TGTTTCTCTC 60 TCCTCCCCCT TGTCTCTGGT GTGGCCGAAT CCCCAACAGA AAGATTGAAG CCCGCGCTGT 120 CCGAGGTCAG GCGGGAAGAG AACCAGAGGA CGGGAGGAAG GGTGCTCGTA GGAGCTGAGT 180 GGAGCAGGTC AGGTCGAAGC GCGCGGCCCG CCGGACGGAC TGACGGACGG ACTCGTGCGC 240 CTGCGGCCGC GGCTGCGGCG CGCCGCGCGA CTCGCTTCCC GGCGGCGGTG GCGGCGGCGG 300 AAGCCGGAGG GCAGCCATGG CGGCCGACAG CCGGGAGGAG AAAGATGGGG AACTTAATGT 360 TTTAGATGAT ATTTTGACTG AAGTACCAGA ACAGGATGAT GAACTGTATA ATCCAGAGAG 420 TGAACAAGAT AAAAATGAGA AAAAAGGATC AAAAAGAAAA AGTGAAAGAA TGGAATCTAT 480 TGACACCAAG CGACAGAAGC CTTCTATCCA TTCAAGACAA CTGATTTCTA AGCCACTAAG 540 CTCATCTGTT AGCAATAATA AAAGAATAGT TAGTACAAAA GGAAAGTCGG TTACAGAATA 600 TAAAAATGAG GAATATCAAA GATCTGAAAG GAACAAGCGT CTAGATGCTG ATCGAAAAAT 660 TCGTCTGTCA AGCAGTTC CT CTAGAGAACC TTACAAGAGT CAACCAGAAA AACCTTGTCT 720 ACGGAAAAGG GATTCTGAAA GAAGGGCCAA GTCTCCTACA CCAGATGGTT CTGAGAGAAT 780 TGGGCTTGAA GTTGATAGAC GTGCAAGCAG ATCCAGCCAG TCTTCAAAGG AAGAGGGGAA 840 CTCTGAGGAG TATGGCTCTG ACCACGAGAC AGGAAGCAGT GCTTCTTCTG AACAGGGCAA 900 CAACACTGAG AATGAGGAGG AAGGAGGGGA AGAAGATGTA GAGGAAGATG AAGAGGTAGA 960 TGAAGATGGA GATGATGATG AGGAAGTGGA TGAAGATGCG GAGGAGGAGG AGGACGAGGA 1020 AGAAGATGAG GAGGAGGAGG ATGAGGAAGA AGAAGAGGAA GAGGAAGAAG AATATGAACA 1080 GGATGAGAGA GATCAGAAGG AAGAAGGGAA TGATTATGAC ACCCGTAGTG AGGCCAGTGA 1140 TTCTGGTTCT GAGTCTGTTT CCTTCACAGA TGGATCTGTC AGGTCTGGTT CAGGAACAGA 1200 TGGATCAGAT GAGAAAAAGA AGGAAAGGAA GAGAGCTCGA GGCATATCAC CCATTGTCTT 1260 TGATAGAAGT GGCAGTTCTG CATCAGAGTC ATATGCAGAT CAAACCAGTA AACTCAAATA 1320 TGTCCTTCAG GATGCAAGAT TTTTCCTCAT AAAGAGTAAC AACCATGAGA ATGTGTCTCT 1380 TGCCAAAGCA AAGGGTGTAT GGTCCACATT ACCTGTAAAT GAGAAGAAAT TAAATCTTGC 1440 GTTTAGATCT GCAAGGAGTG TTATATTAAT ATTTTCTGTC AGGGAAAGTG GAAAGTTTCA 1500 AGGTTTTGCC AGATTGTCAT CAGAATCG CA TCATGGTGGC TCTCCTATAC ATTGGGTGCT 1560 TCCAGCAGGA ATGAGTGCTA AAATGCTTGG AGGTGTTTTT AAAATTGACT GGATTTGCAG 1620 GCGTGAATTA CCCTTTACTA AGTCAGCTCA TCTCACCAAT CCCTGGAATG AACATAAGCC 1680 AGTAAAGATT GGACGTGATG GACAGGAAAT TGAACTTGAA TGTGGAACCC AGCTTTGTCT 1740 TCTGTTTCCC CCTGATGAAA GTATTGACTT GTATCAGCTC ATTCATAAAA TGCGTCACAA 1800 GAGAAGAATG CATTCTCAGC CTCGATCAAG AGGACGTCCA TCCCGTCGAG AACCAGTCCG 1860 GGATGTGGGA AGGCGTCGAC CAGAAGATTA TGATATTCAT AACAGCAGAA AGAAACCAAG 1920 GATTGACTAT CCCCCTGAGT TTCACCAGAG ACCAGGGTAT TTAAAGGATC CCCGATACCA 1980 GGAAGTTGAC AGACGATTTT CAGGAGTTCG CCGAGATGTG TTTTTAAATG GGTCCTACAA 2040 TGATTATGTG AGGGAATTTC ATAACATGGG ACCACCGCCT CCTTGGCAAG GAATGCCTCC 2100 TTACCCGGGA ATAGAACAGC CTCCACACCA TCCCTACTAC CAGCACCATG CCCCGCCTCC 2160 TCAAGCCCAC CCCCCTTACT CAGGACACCA TCCGGTACCA CATGAAGCAA GATACAGAGA 2220 TAAACGAGTA CATGACTATG ATATGAGGGT TGATGATTTC CTTCGCCGCA CACAAGCCGT 2280 TGTCAGTGGT CGGAGAAGTA GACCCCGAGA AAGAGATCGG GAGCGAGAGC GAGACCGCCC 2340 TAGAGATAAC AGAAGAGATA GAGAGCGAGA CAG AGGTCGT GATCGAGAAA GAGAGAGAGA 2400 AAGAATATGT GATCGGGACA GAGACCGAGG GGAAAGAGGT CGTTATCGAA GATAATGTGC 2460 TTTTTGGAAG CACTGACTGA AGATAAAAAA TATTGTATTT TTTTTGTGTG TGTTTACAAG 2520 TAGTAAATTT ATTTTCAGCT GTCTACTTAA AGCTCATTGT GTAGAAGGAT TTATTATCTT 2580 CTTTGTTCCA AGCATGCAGT AGAATAAGAA CTGGAAAACT CAGATCCGCC AAAAAATGCA 2640 CAGTTGACAG TTGAGTTGAC ACTTTTATTG GGGCAGAATG GAACAGTCCA AGAATGTAGA 2700 TATTGATTCA TTCTCCATAA ATGTTCTTTT TACAGTGTAT TCATCCTAGA GTTATTTTGT 2760 TTGTTTGTTT TCCTTCTTTT GGACCTTGGT CAATACTGCC ATAGTATTTT GCTTTGTGTT 2820 TCTATAGGTA GCTGCACACG GTTCAGTAAA AATAATGCTG CTATCAAGTA TGCAGATATT 2880 GAGTATGATG GTTTGACTAT ATGGCAGTGT TGTAGCAGCC TCTCGGTTTC TCCTCTTCCC 2940 TCCTTTTTTT TAAACCTATA AATCCACTTT TTTTTTAAGT CTTCAATGAT GAGAGCAATA 3000 TTAAGAAGAC ATTGCTATCT AATTTTTAAT CTTTTTAAAT AAAACGTTCC TATGTTCAGT 3060 AGCATGGTCG ATGCTATTGT TTAGCCTTCC TTCCAAACTG TACATTGGCT TGGAATGTTC 3120 AGTTTTGCGT GTGTGGCAGC AGAAGATAAC CCCACATTCT ACATTGCTAC TGTTTTGTAT 3180 GAAATAAATT GGTAAAGATT GACACTAAAA AAAAAAAAA A AAAA 3224.
【００４３】配列番号：２ 配列の長さ：２１３９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 起源 生物名：ラット 配列： ATGGCGGCCG ACAGCCGGGA GGAGAAAGAT GGGGAACTTA ATGTTTTAGA TGATATTTTG 60 ACTGAAGTAC CAGAACAGGA TGATGAACTG TATAATCCAG AGAGTGAACA AGATAAAAAT 120 GAGAAAAAAG GATCAAAAAG AAAAAGTGAA AGAATGGAAT CTATTGACAC CAAGCGACAG 180 AAGCCTTCTA TCCATTCAAG ACAACTGATT TCTAAGCCAC TAAGCTCATC TGTTAGCAAT 240 AATAAAAGAA TAGTTAGTAC AAAAGGAAAG TCGGTTACAG AATATAAAAA TGAGGAATAT 300 CAAAGATCTG AAAGGAACAA GCGTCTAGAT GCTGATCGAA AAATTCGTCT GTCAAGCAGT 360 TCCTCTAGAG AACCTTACAA GAGTCAACCA GAAAAACCTT GTCTACGGAA AAGGGATTCT 420 GAAAGAAGGG CCAAGTCTCC TACACCAGAT GGTTCTGAGA GAATTGGGCT TGAAGTTGAT 480 AGACGTGCAA GCAGATCCAG CCAGTCTTCA AAGGAAGAGG GGAACTCTGA GGAGTATGGC 540 TCTGACCACG AGACAGGAAG CAGTGCTTCT TCTGAACAGG GCAACAACAC TGAGAATGAG 600 GAGGAAGGAG GGGAAGAAGA TGTAGAGGAA GATGAAGAGG TAGATGAAGA TGGAGATGAT 660 GATGAGGAAG TGGATGAAGA TGCGGAGGAG GAGGAGGACG AGGAAGAAGA TGAGGAGGAG 720 GAGGATGAGG AAGAAGAAGA GGAAGAGGAA GAAGAATATG AACAGGATGA GAGAGATCAG 780 AAGGAAGAAG GGAATGATTA TGACACCCGT AGTGAGGCCA GTGATTCTGG TTCTGAGTCT 840 GTTTCCTTCA CAGATGGATC TGTCAGGTCT GGTTCAGGA ACAGATGGATC AGATGAGAAA 900 AAGAAGGAAA GGAAGAGAGC TCGAGGCATA TCACCCATTG TCTTTGATAG AAGTGGCAGT 960 TCTGCATCAG AGTCATATGC AGATCAAACC AGTAAACTCA AATATGTCCT TCAGGATGCA 1020 AGATTTTTCC TCATAAAGAG TAACAACCAT GAGAATGTGT CTCTTGCCAA AGCAAAGGGT 1080 GTATGGTCCA CATTACCTGT AAATGAGAAG AAATTAAATC TTGCGTTTAG ATCTGCAAGG 1140 AGTGTTATAT TAATATTTTC TGTCAGGGAA AGTGGAAAGT TTCAAGGTTT TGCCAGATTG 1200 TCATCAGAAT CGCATCATGG TGGCTCTCCT ATACATTGGG TGCTTCCAGC AGGAATGAGT 1260 GCTAAAATGC TTGGAGGTGT TTTTAAAATT GACTGGATTT GCAGGCGTGA ATTACCCTTT 1320 ACTAAGTCAG CTCATCTCAC CAATCCCTGG AATGAACATA AGCCAGTAAA GATTGGACGT 1380 GATGGACAGG AAATTGAACT TGAATGTGGA ACCCAGCTTT GTCTTCTGTT TCCCCCTGAT 1440 GAAAGTATTG ACTTGTATCA GCTCATTCAT AAAATGCGTC ACAAGAGAAG AATGCATTCT 1500 CAGCCTCGAT CAAGAGGACG TCCATCCCGT CGAGAACCAG TCCGGGATGT GGGAAGGCGT 1560 CGACCAGAAG ATTATGATAT TCATAACAGC AGAAAGAAAC CAAGGATTGA CTATCCCCCT 1620 GAGTTTCACC AGAGACCAGG GTATTTAAAG GATCCCCGAT ACCAGGAAGT TGACAGACGA 1680 TTTTCAGGAG TTCGCCGAGA TGTGTTTTTA AATGGGTCCT ACAATGATTA TGTGAGGGAA 1740 TTTCATAACA TGGGACCACC GCCTCCTTGG CAAGGAATGC CTCCTTACCC GGGAATAGAA 1800 CAGCCTCCAC ACCATCCCTA CTACCAGCAC CATGCCCCGC CTCCTCAAGC CCACCCCCCT 1860 TACTCAGGAC ACCATCCGGT ACCACATGAA GCAAGATACA GAGATAAACG AGTACATGAC 1920 TATGATATGA GGGTTGATGA TTTCCTTCGC CGCACACAAG CCGTTGTCAG TGGTCGGAGA 1980 AGTAGACCCC GAGAAAGAGA TCGGGAGCGA GAGCGAGACC GCCCTAGAGA TAACAGAAGA 2040 GATAGAGAGC GAGACAGAGG TCGTGATCGA GAAAGAGAGA GAGAAAGAAT ATGTGATCGG 2100 GACAGAGACC GAGGGGAAAG AGGTCGTTAT CGAAGATAA 2139 。SEQ ID NO: 2 Sequence length: 2139 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Double-stranded topology: Linear Sequence type: cDNA to mRNA Origin organism name: Rat sequence: ATGGCGGCCG ACAGCCGGGA GGAGAAAGAT GGGGAACTTA ATGTTTTAGA TGATATTTTG 60 ACTGAAGTAC CAGAACAGGA TGATGAACTG TATAATCCAG AGAGTGAACA AGATAAAAAT 120 GAGAAAAAAG GATCAAAAAG AAAAAGTGAA AGAATGGAAT CTATTGACAC CAAGCGACAG 180 AAGCCTTCTA TCCATTCAAG ACAACTGATT TCTAAGCCAC TAAGCTCATC TGTTAGCAAT 240 AATAAAAGAA TAGTTAGTAC AAAAGGAAAG TCGGTTACAG AATATAAAAA TGAGGAATAT 300 CAAAGATCTG AAAGGAACAA GCGTCTAGAT GCTGATCGAA AAATTCGTCT GTCAAGCAGT 360 TCCTCTAGAG AACCTTACAA GAGTCAACCA GAAAAACCTT GTCTACGGAA AAGGGATTCT 420 GAAAGAAGGG CCAAGTCTCC TACACCAGAT GGTTCTGAGA GAATTGGGCT TGAAGTTGAT 480 AGACGTGCAA GCAGATCCAG CCAGTCTTCA AAGGAAGAGG GGAACTCTGA GGAGTATGGC 540 TCTGACCACG AGACAGGAAG CAGTGCTTCT TCTGAACAGG GCAACAACAC TGAGAATGAG 600 GAGGAAGGAG GGGAAGAAGA TGTAGAGGAA GATGAAGAGG TAGATGAAGA TGGAA ATGAGGAAG TGGATGAAGA TGCGGAGGAG GAGGAGGACG AGGAAGAAGA TGAGGAGGAG 720 GAGGATGAGG AAGAAGAAGA GGAAGAGGAA GAAGAATATG AACAGGATGA GAGAGATCAG 780 AAGGAAGAAG GGAATGATTA TGACACCCGT AGTGAGGCCA GTGATTCTGG TTCTGAGTCT 840 GTTTCCTTCA CAGATGGATC TGTCAGGTCT GGTTCAGGA ACAGATGGATC AGATGAGAAA 900 AAGAAGGAAA GGAAGAGAGC TCGAGGCATA TCACCCATTG TCTTTGATAG AAGTGGCAGT 960 TCTGCATCAG AGTCATATGC AGATCAAACC AGTAAACTCA AATATGTCCT TCAGGATGCA 1020 AGATTTTTCC TCATAAAGAG TAACAACCAT GAGAATGTGT CTCTTGCCAA AGCAAAGGGT 1080 GTATGGTCCA CATTACCTGT AAATGAGAAG AAATTAAATC TTGCGTTTAG ATCTGCAAGG 1140 AGTGTTATAT TAATATTTTC TGTCAGGGAA AGTGGAAAGT TTCAAGGTTT TGCCAGATTG 1200 TCATCAGAAT CGCATCATGG TGGCTCTCCT ATACATTGGG TGCTTCCAGC AGGAATGAGT 1260 GCTAAAATGC TTGGAGGTGT TTTTAAAATT GACTGGATTT GCAGGCGTGA ATTACCCTTT 1320 ACTAAGTCAG CTCATCTCAC CAATCCCTGG AATGAACATA AGCCAGTAAA GATTGGACGT 1380 GATGGACAGG AAATTGAACT TGAATGTGGA ACCCAGCTTT GTCTTCTGTT TCCCCCTGAT 1440 GAAAGTATTG ACTTGTATCA GCTCATTCAT AAAATGCGTC ACAAGAGAAG AATGCATTCT 1500 CAGCCTCGAT C AAGAGGACG TCCATCCCGT CGAGAACCAG TCCGGGATGT GGGAAGGCGT 1560 CGACCAGAAG ATTATGATAT TCATAACAGC AGAAAGAAAC CAAGGATTGA CTATCCCCCT 1620 GAGTTTCACC AGAGACCAGG GTATTTAAAG GATCCCCGAT ACCAGGAAGT TGACAGACGA 1680 TTTTCAGGAG TTCGCCGAGA TGTGTTTTTA AATGGGTCCT ACAATGATTA TGTGAGGGAA 1740 TTTCATAACA TGGGACCACC GCCTCCTTGG CAAGGAATGC CTCCTTACCC GGGAATAGAA 1800 CAGCCTCCAC ACCATCCCTA CTACCAGCAC CATGCCCCGC CTCCTCAAGC CCACCCCCCT 1860 TACTCAGGAC ACCATCCGGT ACCACATGAA GCAAGATACA GAGATAAACG AGTACATGAC 1920 TATGATATGA GGGTTGATGA TTTCCTTCGC CGCACACAAG CCGTTGTCAG TGGTCGGAGA 1980 AGTAGACCCC GAGAAAGAGA TCGGGAGCGA GAGCGAGACC GCCCTAGAGA TAACAGAAGA 2040 GATAGAGAGC GAGACAGAGG TCGTGATCGA GAAAGAGAGA GAGAAAGAAT ATGTGATCGG 2100 GACAGAGAAGAGGATT
【００４４】配列番号：３ 配列の長さ：７１２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源 生物名：ラット 配列： Met Ala Ala Asp Ser Arg Glu Glu Lys Asp Gly Glu Leu Asn Val 1 5 10 15 Leu Asp Asp Ile Leu Thr Glu Val Pro Glu Gln Asp Asp Glu Leu 20 25 30 Tyr Asn Pro Glu Ser Glu Gln Asp Lys Asn Glu Lys Lys Gly Ser 35 40 45 Lys Arg Lys Ser Glu Arg Met Glu Ser Ile Asp Thr Lys Arg Gln 50 55 60 Lys Pro Ser Ile His Ser Arg Gln Leu Ile Ser Lys Pro Leu Ser 65 70 75 Ser Ser Val Ser Asn Asn Lys Arg Ile Val Ser Thr Lys Gly Lys 80 85 90 Ser Val Thr Glu Tyr Lys Asn Glu Glu Tyr Gln Arg Ser Glu Arg 95 100 105 Asn Lys Arg Leu Asp Ala Asp Arg Lys Ile Arg Leu Ser Ser Ser 110 115 120 Ser Ser Arg Glu Pro Tyr Lys Ser Gln Pro Glu Lys Pro Cys Leu 125 130 135 Arg Lys Arg Asp Ser Glu Arg Arg Ala Lys Ser Pro Thr Pro Asp 140 145 150 Gly Ser Glu Arg Ile Gly Leu Glu Val Asp Arg Arg Ala Ser Arg 155 160 165 Ser Ser Gln Ser Ser Lys Glu Glu Gly Asn Ser Glu Glu Tyr Gly 170 175 180 Ser Asp His Glu Thr Gly Ser Ser Ala Ser Ser Glu Gln Gly Asn 185 190 195 Asn Thr Glu Asn Glu Glu Glu Gly Gly Glu Glu Asp Val Glu Glu 200 205 210 Asp Glu Glu Val Asp Glu Asp Gly Asp Asp Asp Glu Glu Val Asp 215 220 225 Glu Asp Ala Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu Glu Asp Glu Glu Glu 230 235 240 Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Tyr Glu Gln 245 250 255 Asp Glu Arg Asp Gln Lys Glu Glu Gly Asn Asp Tyr Asp Thr Arg 260 265 270 Ser Glu Ala Ser Asp Ser Gly Ser Glu Ser Val Ser Phe Thr Asp 275 280 285 Gly Ser Val Arg Ser Gly Ser Gly Thr Asp Gly Ser Asp Glu Lys 290 295 300 Lys Lys Glu Arg Lys Arg Ala Arg Gly Ile Ser Pro Ile Val Phe 305 310 315 Asp Arg Ser Gly Ser Ser Ala Ser Glu Ser Tyr Ala Asp Gln Thr 320 325 330 Ser Lys Leu Lys Tyr Val Leu Gln Asp Ala Arg Phe Phe Leu Ile 335 340 345 Lys Ser Asn Asn His Glu Asn Val Ser Leu Ala Lys Ala Lys Gly 350 355 360 Val Trp Ser Thr Leu Pro Val Asn Glu Lys Lys Leu Asn Leu Ala 365 370 375 Phe Arg Ser Ala Arg Ser Val Ile Leu Ile Phe Ser Val Arg Glu 380 385 390 Ser Gly Lys Phe Gln Gly Phe Ala Arg Leu Ser Ser Glu Ser His 395 400 405 His Gly Gly Ser Pro Ile His Trp Val Leu Pro Ala Gly Met Ser 410 415 420 Ala Lys Met Leu Gly Gly Val Phe Lys Ile Asp Trp Ile Cys Arg 425 430 435 Arg Glu Leu Pro Phe Thr Lys Ser Ala His Leu Thr Asn Pro Trp 440 445 450 Asn Glu His Lys Pro Val Lys Ile Gly Arg Asp Gly Gln Glu Ile 455 460 465 Glu Leu Glu Cys Gly Thr Gln Leu Cys Leu Leu Phe Pro Pro Asp 470 475 480 Glu Ser Ile Asp Leu Tyr Gln Leu Ile His Lys Met Arg His Lys 485 490 495 Arg Arg Met His Ser Gln Pro Arg Ser Arg Gly Arg Pro Ser Arg 500 505 510 Arg Glu Pro Val Arg Asp Val Gly Arg Arg Arg Pro Glu Asp Tyr 515 520 525 Asp Ile His Asn Ser Arg Lys Lys Pro Arg Ile Asp Tyr Pro Pro 530 535 540 Glu Phe His Gln Arg Pro Gly Tyr Leu Lys Asp Pro Arg Tyr Gln 545 550 555 Glu Val Asp Arg Arg Phe Ser Gly Val Arg Arg Asp Val Phe Leu 560 565 570 Asn Gly Ser Tyr Asn Asp Tyr Val Arg Glu Phe His Asn Met Gly 575 580 585 Pro Pro Pro Pro Trp Gln Gly Met Pro Pro Tyr Pro Gly Ile Glu 590 595 600 Gln Pro Pro His His Pro Tyr Tyr Gln His His Ala Pro Pro Pro 605 610 615 Gln Ala His Pro Pro Tyr Ser Gly His His Pro Val Pro His Glu 620 625 630 Ala Arg Tyr Arg Asp Lys Arg Val His Asp Tyr Asp Met Arg Val 635 640 645 Asp Asp Phe Leu Arg Arg Thr Gln Ala Val Val Ser Gly Arg Arg 650 655 660 Ser Arg Pro Arg Glu Arg Asp Arg Glu Arg Glu Arg Asp Arg Pro 665 670 675 Arg Asp Asn Arg Arg Asp Arg Glu Arg Asp Arg Gly Arg Asp Arg 680 685 690 Glu Arg Glu Arg Glu Arg Ile Cys Asp Arg Asp Arg Asp Arg Gly 695 700 705 Glu Arg Gly Arg Tyr Arg Arg 710 712 。SEQ ID NO: 3 Sequence length: 712 Sequence type: Amino acid Topology: Linear Sequence type: Protein Origin organism name: Rat Sequence: Met Ala Ala Asp Ser Arg Glu Glu Lys Asp Gly Glu Leu Asn Val 1 5 10 15 Leu Asp Asp Ile Leu Thr Glu Val Pro Glu Gln Asp Asp Glu Leu 20 25 30 Tyr Asn Pro Glu Ser Glu Gln Asp Lys Asn Glu Lys Lys Gly Ser 35 40 45 Lys Arg Lys Ser Glu Arg Met Glu Ser Ile Asp Thr Lys Arg Gln 50 55 60 Lys Pro Ser Ile His Ser Arg Gln Leu Ile Ser Lys Pro Leu Ser 65 70 75 Ser Ser Val Ser Asn Asn Lys Arg Ile Val Ser Thr Lys Gly Lys 80 85 90 Ser Val Thr Glu Tyr Lys Asn Glu Glu Tyr Gln Arg Ser Glu Arg 95 100 105 Asn Lys Arg Leu Asp Ala Asp Arg Lys Ile Arg Leu Ser Ser Ser 110 115 120 Ser Ser Arg Glu Pro Tyr Lys Ser Gln Pro Glu Lys Pro Cys Leu 125 130 135 Arg Lys Arg Asp Ser Glu Arg Arg Ala Lys Ser Pro Thr Pro Asp 140 145 150 Gly Ser Glu Arg Ile Gly Leu Glu Val Asp Arg Arg Ala Ser Arg 155 160 165 Ser Ser Gln Ser Ser Lys Glu Glu Gly Asn Ser Glu Glu Tyr Gly 170 175 180 Ser Asp His Glu Thr Gly Ser Ser Ala Ser Ser Glu Gln Gly Asn 185 190 195 Asn Thr Glu Asn Glu Glu Glu Gly Gly Glu Glu Asp Val Glu Glu 200 205 210 Asp Glu Glu Val Asp Glu Asp Gly Asp Asp Asp Glu Glu Val Asp 215 220 225 Glu Asp Ala Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu Glu Asp Glu Glu Glu 230 235 240 Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Tyr Glu Gln 245 250 255 Asp Glu Arg Asp Gln Lys Glu Glu Gly Asn Asp Tyr Asp Thr Arg 260 265 270 Ser Glu Ala Ser Asp Ser Gly Ser Glu Ser Val Ser Phe Thr Asp 275 280 285 Gly Ser Val Arg Ser Gly Ser Gly Thr Asp Gly Ser Asp Glu Lys 290 295 300 Lys Lys Glu Arg Lys Arg Ala Arg Gly Ile Ser Pro Ile Val Phe 305 310 315 Asp Arg Ser Gly Ser Ser Ala Ser Glu Ser Tyr Ala Asp Gln Thr 320 325 330 Ser Lys Leu Lys Tyr Val Leu Gln Asp Ala Arg Phe Phe Leu Ile 335 340 345 Lys Ser Asn Asn His Glu Asn Val Ser Leu Ala Lys Ala Lys Gly 350 355 360 Val Trp Ser Thr Leu Pro Val Asn Glu Lys Lys Leu Asn Leu Ala 365 370 375 Phe Arg Ser Ala Arg SerVal Ile Leu Ile Phe Ser Val Arg Glu 380 385 390 Ser Gly Lys Phe Gln Gly Phe Ala Arg Leu Ser Ser Glu Ser His 395 400 405 His Gly Gly Ser Pro Ile His Trp Val Leu Pro Ala Gly Met Ser 410 415 420 Ala Lys Met Leu Gly Gly Val Phe Lys Ile Asp Trp Ile Cys Arg 425 430 435 Arg Glu Leu Pro Phe Thr Lys Ser Ala His Leu Thr Asn Pro Trp 440 445 450 Asn Glu His Lys Pro Val Lys Ile Gly Arg Asp Gly Gln Glu Ile 455 460 465 Glu Leu Glu Cys Gly Thr Gln Leu Cys Leu Leu Phe Pro Pro Asp 470 475 480 Glu Ser Ile Asp Leu Tyr Gln Leu Ile His Lys Met Arg His Lys 485 490 495 Arg Arg Met His Ser Gln Pro Arg Ser Arg Gly Arg Pro Ser Arg 500 505 510 Arg Glu Pro Val Arg Asp Val Gly Arg Arg Arg Pro Glu Asp Tyr 515 520 525 Asp Ile His Asn Ser Arg Lys Lys Pro Arg Ile Asp Tyr Pro Pro 530 535 540 Glu Phe His Gln Arg Pro Gly Tyr Leu Lys Asp Pro Arg Tyr Gln 545 550 555 Glu Val Asp Arg Arg Phe Ser Gly Val Arg Arg Asp Val Phe Leu 560 565 570 Asn Gly Ser Tyr Asn Asp Tyr Val Arg Glu Phe His Asn Met Gly 575 580 585 Pro Pro Pro ProTrp Gln Gly Met Pro Pro Tyr Pro Gly Ile Glu 590 595 600 Gln Pro Pro His His Pro Tyr Tyr Gln His His Ala Pro Pro Pro 605 610 615 Gln Ala His Pro Pro Tyr Ser Gly His His Pro Val Pro His Glu 620 625 630 Ala Arg Tyr Arg Asp Lys Arg Val His Asp Tyr Asp Met Arg Val 635 640 645 Asp Asp Phe Leu Arg Arg Thr Gln Ala Val Val Ser Gly Arg Arg 650 655 660 Ser Arg Pro Arg Glu Arg Asp Arg Glu Arg Glu Arg Asp Arg Pro 665 670 675 Arg Asp Asn Arg Arg Asp Arg Glu Arg Asp Arg Gly Arg Asp Arg 680 685 690 Glu Arg Glu Arg Glu Arg Ile Cys Asp Arg Asp Arg Asp Arg Gly 695 700 705 Glu Arg Gly Arg Tyr Arg Arg 710 712.
【００４５】配列番号：４ 配列の長さ：１３６２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 起源 生物名：ヒト 配列： CGCGTCGACC AGAAGATTAT GATATTCATA ACAGCAGAAA GAAACCAAGG ATTGACTATC 60 CCCCTGAGTT TCACCAGAGA CCAGGGTATT TAAAGGATCC ACGATACCAG GAAGTGGACA 120 GACGATTTTC AGGAGTTCGC CGAGATGTGT TTTTAAATGG GTCCTACAAT GATTATGTGA 180 GGGAATTTCA TAACATGGGA CCACCACCAC CTTGGCAAGG AATGCCCCCT TACCCAGGAA 240 TGGAACAACC TCCACACCAT CCTTACTATC AGCACCATGC TCCACCTCCT CAAGCTCATC 300 CCCCTTACTC AGGACATCAT CCAGTACCAC ATGAAGCAAG ATACAGAGAT AAACGAGTAC 360 ATGATTATGA TATGAGGGTG GATGATTTCC TTCGTCGCAC ACAAGCTGTT GTCAGTGGCC 420 GGAGAAGTAG ACCCCGTGAA AGAGACCGGG AACGAGAGCG AGACCGCCCT AGAGATAACA 480 GACGAGACAG AGAGCGAGAT AGAGGACGTG ATAGAGAAAG AGAAAGAGAG CGATTATGTG 540 ATCGAGACAG AGACCGAGGG GAGAGAGGTC GATATAGAAG ATAATGGGCT TTTGGAAGCA 600 CTGATTGTTT AAAGATACAA AAAATCTTGT ATTTTTTTTT TGTGTGTGTT TACAAGTAGT 660 AAATTTATTT TCAGCTGTCT GCCTATGAAG TTCATTGTGT AGAAGGATTT ATTATGACCC 720 CCTTTGTTCC AAGCATGCAG TATCATAAGA ACTGGAAAAA CTCAAAATCC GCCAAAAATC 780 CACAGCTGAC AGTTGAATTG ACACTTTTAT TGGGGCAGAA TGGAACAGTC CAAGAATGTA 840 GATACTGATT CTTTCTCCAT AAATGTTCTT ATAGTGTGTT CATCCTAGAG TTATTTTTTT 900 GTTTGTTTTT TTCCTTTTTG GATCTTGATT GATAACTGCC ATGATATTTT GCTTTGATGT 960 GTTTCTACAT GTAGTTGCAC ACGGTTCAGT AAAAATAATG CTGCTATCGA GTATGCAAAT 1020 ATTGAAGTAT GATGGTTTGA CTGTATGGCA GTGTTGTAGC AGCCTCTTGT TTTTTTCCCC 1080 ATTGCCTCTT TTTTTAAAAA ACTTATAAAG TCACTTTTTA TTTTTCCTCA GTCTTCAATG 1140 ACGAGAGCAA TATTAAGAAG ACATTGCTAT CTAATTTTTA ATCTTTTTAA ATGAAAAATT 1200 CCTATGTTCA GTAGCGTGGT TGATGCTATT GTTTAGCCTT CCCCTCCAAA TTGTATACAT 1260 TGGCTTGGAA TGTTCACAAC TTGCGTGCGT GGCAGCGGAA GACGATTCCC ATATTCTACA 1320 TTGCTACTGT TTTGTATAAA ATAAATTGGT AAAGATTAAA GG 1362 。SEQ ID NO: 4 Sequence length: 1362 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Double strand Topology: Linear Sequence type: cDNA to mRNA Origin organism name: Human sequence: CGCGTCGACC AGAAGATTAT GATATTCATA ACAGCAGAAA GAAACCAAGG ATTGACTATC 60 CCCCTGAGTT TCACCAGAGA CCAGGGTATT TAAAGGATCC ACGATACCAG GAAGTGGACA 120 GACGATTTTC AGGAGTTCGC CGAGATGTGT TTTTAAATGG GTCCTACAAT GATTATGTGA 180 GGGAATTTCA TAACATGGGA CCACCACCAC CTTGGCAAGG AATGCCCCCT TACCCAGGAA 240 TGGAACAACC TCCACACCAT CCTTACTATC AGCACCATGC TCCACCTCCT CAAGCTCATC 300 CCCCTTACTC AGGACATCAT CCAGTACCAC ATGAAGCAAG ATACAGAGAT AAACGAGTAC 360 ATGATTATGA TATGAGGGTG GATGATTTCC TTCGTCGCAC ACAAGCTGTT GTCAGTGGCC 420 GGAGAAGTAG ACCCCGTGAA AGAGACCGGG AACGAGAGCG AGACCGCCCT AGAGATAACA 480 GACGAGACAG AGAGCGAGAT AGAGGACGTG ATAGAGAAAG AGAAAGAGAG CGATTATGTG 540 ATCGAGACAG AGACCGAGGG GAGAGAGGTC GATATAGAAG ATAATGGGCT TTTGGAAGCA 600 CTGATTGTTT AAAGATACAA AAAATCTTGT ATTTTTTTTT TGTGTGTGTT AAACAAGTAGT TTATTT TCAGCTGTCT GCCTATGAAG TTCATTGTGT AGAAGGATTT ATTATGACCC 720 CCTTTGTTCC AAGCATGCAG TATCATAAGA ACTGGAAAAA CTCAAAATCC GCCAAAAATC 780 CACAGCTGAC AGTTGAATTG ACACTTTTAT TGGGGCAGAA TGGAACAGTC CAAGAATGTA 840 GATACTGATT CTTTCTCCAT AAATGTTCTT ATAGTGTGTT CATCCTAGAG TTATTTTTTT 900 GTTTGTTTTT TTCCTTTTTG GATCTTGATT GATAACTGCC ATGATATTTT GCTTTGATGT 960 GTTTCTACAT GTAGTTGCAC ACGGTTCAGT AAAAATAATG CTGCTATCGA GTATGCAAAT 1020 ATTGAAGTAT GATGGTTTGA CTGTATGGCA GTGTTGTAGC AGCCTCTTGT TTTTTTCCCC 1080 ATTGCCTCTT TTTTTAAAAA ACTTATAAAG TCACTTTTTA TTTTTCCTCA GTCTTCAATG 1140 ACGAGAGCAA TATTAAGAAG ACATTGCTAT CTAATTTTTA ATCTTTTTAA ATGAAAAATT 1200 CCTATGTTCA GTAGCGTGGT TGATGCTATT GTTTAGCCTT CCCCTCCAAA TTGTATACAT 1260 TGGCTTGGAA TGTTCACAAC TTGCGTGCGT GGCAGCGGAA GACGATTCCC ATATTCTACA 1320 TTGCTACTGT TTTGTATAAA ATAAATTGGT AAAGATTAAA GG 1362.
【００４６】配列番号：５ 配列の長さ：５８４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 起源 生物名：ヒト 配列： CGCGTCGACC AGAAGATTAT GATATTCATA ACAGCAGAAA GAAACCAAGG ATTGACTATC 60 CCCCTGAGTT TCACCAGAGA CCAGGGTATT TAAAGGATCC ACGATACCAG GAAGTGGACA 120 GACGATTTTC AGGAGTTCGC CGAGATGTGT TTTTAAATGG GTCCTACAAT GATTATGTGA 180 GGGAATTTCA TAACATGGGA CCACCACCAC CTTGGCAAGG AATGCCCCCT TACCCAGGAA 240 TGGAACAACC TCCACACCAT CCTTACTATC AGCACCATGC TCCACCTCCT CAAGCTCATC 300 CCCCTTACTC AGGACATCAT CCAGTACCAC ATGAAGCAAG ATACAGAGAT AAACGAGTAC 360 ATGATTATGA TATGAGGGTG GATGATTTCC TTCGTCGCAC ACAAGCTGTT GTCAGTGGCC 420 GGAGAAGTAG ACCCCGTGAA AGAGACCGGG AACGAGAGCG AGACCGCCCT AGAGATAACA 480 GACGAGACAG AGAGCGAGAT AGAGGACGTG ATAGAGAAAG AGAAAGAGAG CGATTATGTG 540 ATCGAGACAG AGACCGAGGG GAGAGAGGTC GATATAGAAG ATAA 584 。SEQ ID NO: 5 Sequence length: 584 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Double-stranded topology: Linear Sequence type: cDNA to mRNA Origin organism name: Human sequence: CGCGTCGACC AGAAGATTAT GATATTCATA ACAGCAGAAA GAAACCAAGG ATTGACTATC 60 CCCCTGAGTT TCACCAGAGA CCAGGGTATT TAAAGGATCC ACGATACCAG GAAGTGGACA 120 GACGATTTTC AGGAGTTCGC CGAGATGTGT TTTTAAATGG GTCCTACAAT GATTATGTGA 180 GGGAATTTCA TAACATGGGA CCACCACCAC CTTGGCAAGG AATGCCCCCT TACCCAGGAA 240 TGGAACAACC TCCACACCAT CCTTACTATC AGCACCATGC TCCACCTCCT CAAGCTCATC 300 CCCCTTACTC AGGACATCAT CCAGTACCAC ATGAAGCAAG ATACAGAGAT AAACGAGTAC 360 ATGATTATGA TATGAGGGTG GATGATTTCC TTCGTCGCAC ACAAGCTGTT GTCAGTGGCC 420 GGAGAAGTAG ACCCCGTGAA AGAGACCGGG AACGAGAGCG AGACCGCCCT AGAGATAACA 480 GACGAGACAG AGAGCGAGAT AGAGGACGTG ATAGAGAAAG AGAAAGAGAG CGATTATGTG 540 ATCGAGACAG AGACCGAGGG GAGAGAGGTC GATATAGAAG ATAA 584.
【００４７】配列番号：６ 配列の長さ：１９３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源 生物名：ヒト 配列： Arg Arg Pro Glu Asp Tyr Asp Ile His Asn Ser Arg Lys Lys Pro 1 5 10 15 Arg Ile Asp Tyr Pro Pro Glu Phe His Gln Arg Pro Gly Tyr Leu 20 25 30 Lys Asp Pro Arg Tyr Gln Glu Val Asp Arg Arg Phe Ser Gly Val 35 40 45 Arg Arg Asp Val Phe Leu Asn Gly Ser Tyr Asn Asp Tyr Val Arg 50 55 60 Glu Phe His Asn Met Gly Pro Pro Pro Pro Trp Gln Gly Met Pro 65 70 75 Pro Tyr Pro Gly Met Glu Gln Pro Pro His His Pro Tyr Tyr Gln 80 85 90 His His Ala Pro Pro Pro Gln Ala His Pro Pro Tyr Ser Gly His 95 100 105 His Pro Val Pro His Glu Ala Arg Tyr Arg Asp Lys Arg Val His 110 115 120 Asp Tyr Asp Met Arg Val Asp Asp Phe Leu Arg Arg Thr Gln Ala 125 130 135 Val Val Ser Gly Arg Arg Ser Arg Pro Arg Glu Arg Asp Arg Glu 140 145 150 Arg Glu Arg Asp Arg Pro Arg Asp Asn Arg Arg Asp Arg Glu Arg 155 160 165 Asp Arg Gly Arg Asp Arg Glu Arg Glu Arg Glu Arg Leu Cys Asp 170 175 180 Arg Asp Arg Asp Arg Gly Glu Arg Gly Arg Tyr Arg Arg 185 190 193SEQ ID NO: 6 Sequence length: 193 Sequence type: Amino acid Topology: Linear Sequence type: Protein Origin organism name: Human Sequence: Arg Arg Pro Glu Asp Tyr Asp Ile His Asn Ser Arg Lys Lys Pro 1 5 10 15 Arg Ile Asp Tyr Pro Pro Glu Phe His Gln Arg Pro Gly Tyr Leu 20 25 30 Lys Asp Pro Arg Tyr Gln Glu Val Asp Arg Arg Phe Ser Gly Val 35 40 45 Arg Arg Asp Val Phe Leu Asn Gly Ser Tyr Asn Asp Tyr Val Arg 50 55 60 Glu Phe His Asn Met Gly Pro Pro Pro Pro Trp Gln Gly Met Pro 65 70 75 Pro Tyr Pro Gly Met Glu Gln Pro Pro His His Pro Tyr Tyr Gln 80 85 90 His His Ala Pro Pro Pro Gln Ala His Pro Pro Tyr Ser Gly His 95 100 105 His Pro Val Pro His Glu Ala Arg Tyr Arg Asp Lys Arg Val His 110 115 120 Asp Tyr Asp Met Arg Val Asp Asp Phe Leu Arg Arg Thr Gln Ala 125 130 135 Val Val Ser Gly Arg Arg Ser Arg Pro Arg Glu Arg Asp Arg Glu 140 145 150 Arg Glu Arg Asp Arg Pro Arg Asp Asn Arg Arg Asp Arg Glu Arg 155 160 165 Asp Arg Gly Arg Asp Arg Glu Arg Glu Arg Glu Arg Leu Cys Asp 170 175 180 Arg Asp Arg Asp Arg Gly Glu Arg Gly Arg Tyr Arg Arg 185 190 193
【図１】 低酸素処理後再酸素化した初代培養ラットア
ストロサイト（invitro 脳虚血−再灌流モデル）におけ
るＹＴ５２１遺伝子の発現をノーザンブロッティングに
より解析した結果を示す写真。FIG. 1 is a photograph showing the results of Northern blotting analysis of YT521 gene expression in primary cultured rat astrocytes (in vitro cerebral ischemia-reperfusion model) reoxygenated after hypoxia treatment.
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/08 9282−4Ｂ 15/00 Ｃ (72)発明者 今泉 和則 兵庫県三田市武庫が丘５丁目２ Ｇ−305Continuation of the front page (51) Int.Cl. 6 Identification number Reference number in the office FI Technical display location C12N 15/02 C12N 5/00 B C12P 21/08 9282-4B 15/00 C (72) Inventor Kazunori Imaizumi Hyogo 5-2 Mukogaoka, Mita City, Japan G-305
Claims (10)
なるポリペプチドをコードする塩基配列を含む遺伝子。1. A gene comprising a nucleotide sequence encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 3.
なるポリペプチドをコードする塩基配列を含む遺伝子。2. A gene containing a nucleotide sequence encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 6.
び配列番号５からなる群より選ばれる塩基配列を含む遺
伝子。3. A gene containing a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5.
後再酸素化された際に特異的に発現する請求項１、２又
は３のいずれかの項に記載の遺伝子。4. The gene according to claim 1, 2 or 3, which is specifically expressed when astrocytes are reoxygenated after being exposed to a hypoxic condition.
り選ばれるアミノ酸配列を有するポリペプチド、そのフ
ラグメントまたはそれらのホモローグ。5. A polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 6, a fragment thereof, or a homologue thereof.
ラグメントまたはそれらのホモローグをコードするＤＮ
Ａ。6. A DN encoding the polypeptide according to claim 5, a fragment thereof or a homologue thereof.
A.
び配列番号５からなる群より選ばれる塩基配列を有する
ＤＮＡまたはそのフラグメントまたはそれらに選択的に
ハイブリダイズする核酸。7. A DNA having a base sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5, a fragment thereof, or a nucleic acid that selectively hybridizes to them.
記載の遺伝子もしくはそのフラグメントを含む複製又は
発現プラスミド。8. A replication or expression plasmid comprising the gene according to any one of claims 1, 2 or 3 or a fragment thereof.
で形質転換された宿主細胞。9. A host cell transformed with the replication or expression plasmid of claim 8.
フラグメントまたはそれらのホモローグに対するモノク
ローナル抗体またはポリクローナル抗体。10. A monoclonal or polyclonal antibody against the polypeptide according to claim 5, a fragment thereof or a homologue thereof.
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP8049380A JPH09238685A (en) | 1996-03-07 | 1996-03-07 | Cerebral ischemia-related gene |
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| JP8049380A JPH09238685A (en) | 1996-03-07 | 1996-03-07 | Cerebral ischemia-related gene |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09238685A true JPH09238685A (en) | 1997-09-16 |
Family
ID=12829424
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8049380A Pending JPH09238685A (en) | 1996-03-07 | 1996-03-07 | Cerebral ischemia-related gene |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH09238685A (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005032535A1 (en) | 2003-10-03 | 2005-04-14 | Ono Pharmaceutical Co., Ltd. | Nerve regeneration promoters |
-
1996
- 1996-03-07 JP JP8049380A patent/JPH09238685A/en active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005032535A1 (en) | 2003-10-03 | 2005-04-14 | Ono Pharmaceutical Co., Ltd. | Nerve regeneration promoters |
| JPWO2005032535A1 (en) * | 2003-10-03 | 2006-12-14 | 小野薬品工業株式会社 | Nerve regeneration promoter |
| JP4715514B2 (en) * | 2003-10-03 | 2011-07-06 | 小野薬品工業株式会社 | Nerve regeneration promoter |
| US8569058B2 (en) | 2003-10-03 | 2013-10-29 | Ono Pharmaceutical Co., Ltd. | Nerve regeneration promoters |
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