JPH0899901A - 免疫抱合体ｉｉ - Google Patents
免疫抱合体ｉｉInfo
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 細胞毒性および走化能を誘導し、標的腫瘍治
療に適する新規の免疫抱合体を提供する。 【解決手段】 免疫抱合体は、ヒトＥＧＦレセプター分
子に特異的なモノクローナルまたはそのフラグメントお
よびケモカイン族の一つ、このましくはＣ−Ｘ−Ｃ族か
ら選択された例えばインターロイキン８（ＩＬ−８）か
らなる。
療に適する新規の免疫抱合体を提供する。 【解決手段】 免疫抱合体は、ヒトＥＧＦレセプター分
子に特異的なモノクローナルまたはそのフラグメントお
よびケモカイン族の一つ、このましくはＣ−Ｘ−Ｃ族か
ら選択された例えばインターロイキン８（ＩＬ−８）か
らなる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、腫瘍関連標的エレ
メント、最も好ましくは、ヒト上皮増殖因子レセプター
（ＥＧＦＲ）などのヒト腫瘍細胞上で優先的に発現され
る分子を優先的に認識するモノクローナル抗体またはそ
のフラグメントとケモカインタンパク質グループ、好ま
しくはＣ−Ｘ−Ｃ族から選択された生物活性を有するリ
ガンドからなる新規融合タンパク質に関する。得られる
融合タンパク質は、特異的標的細胞または組織に生物活
性を有するリガンドを運ぶために用いることができる。
新規の免疫抱合体(Immunoconjugate)は腫瘍の治療に使
用することができる。
メント、最も好ましくは、ヒト上皮増殖因子レセプター
（ＥＧＦＲ）などのヒト腫瘍細胞上で優先的に発現され
る分子を優先的に認識するモノクローナル抗体またはそ
のフラグメントとケモカインタンパク質グループ、好ま
しくはＣ−Ｘ−Ｃ族から選択された生物活性を有するリ
ガンドからなる新規融合タンパク質に関する。得られる
融合タンパク質は、特異的標的細胞または組織に生物活
性を有するリガンドを運ぶために用いることができる。
新規の免疫抱合体(Immunoconjugate)は腫瘍の治療に使
用することができる。
【０００２】
【従来の技術】多様な治療概念が癌患者の治療のために
用いられてきた。これまで、悪性細胞上で発現される細
胞表面分子を特異的にまたは選択的に認識するモノクロ
ーナル抗体を用いて臨床試験が行われてきた。このアプ
ローチのねらいは、癌細胞を排除するために抗体依存性
細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）または補体媒介細胞毒性を
誘導することである。第二のアプローチは、免疫応答の
サイトカイン媒介活性化である。サイトカイン誘導抗腫
瘍活性は次のようなもので媒介され得る。すなわち、 １）腫瘍増殖に対するサイトカインの直接的細胞毒性／
細胞制圧効果 ２）ＬＡＫ活性または単球／顆粒球媒介細胞毒性などの
腫瘍抗原非特異的メカニズム ３）ＣＤ４およびＣＤ８陽性Ｔ細胞によって媒介される
腫瘍抗原特異的免疫応答 この場合、腫瘍に対する全身的免疫は動物モデルにおい
て観察された。
用いられてきた。これまで、悪性細胞上で発現される細
胞表面分子を特異的にまたは選択的に認識するモノクロ
ーナル抗体を用いて臨床試験が行われてきた。このアプ
ローチのねらいは、癌細胞を排除するために抗体依存性
細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）または補体媒介細胞毒性を
誘導することである。第二のアプローチは、免疫応答の
サイトカイン媒介活性化である。サイトカイン誘導抗腫
瘍活性は次のようなもので媒介され得る。すなわち、 １）腫瘍増殖に対するサイトカインの直接的細胞毒性／
細胞制圧効果 ２）ＬＡＫ活性または単球／顆粒球媒介細胞毒性などの
腫瘍抗原非特異的メカニズム ３）ＣＤ４およびＣＤ８陽性Ｔ細胞によって媒介される
腫瘍抗原特異的免疫応答 この場合、腫瘍に対する全身的免疫は動物モデルにおい
て観察された。
【０００３】しかし、サイトカインの大量投与の細胞毒
性および腫瘍部位での存在の不充分さから、標的腫瘍療
法のコンセプトが導かれる。標的腫瘍療法の原理は、腫
瘍関連抗原に特異的なモノクローナル抗体のような標的
分子と生物学的に活性のエフェクター分子との物理的結
合に基づいている。標的分子によるエフェクター分子の
運搬によって、腫瘍中のサイトカインの濃度が上昇し、
最大要求量を減少させ得ることが期待される。動物モデ
ルにおいて、腫瘍内注射またはトランスフェクトさせた
腫瘍細胞の分泌のいずれかによってサイトカインを腫瘍
部位に存在させることによって腫瘍を退行させ得ること
が示された（総説としてColombo and Forni、 Immunolog
y Today、 15、 48-51、 1994を参照されたい）。これらの
系では、サイトカインは腫瘍の増殖は阻害しないが、迅
速で有効な抗腫瘍反応を活性化することができる。した
がって、エフェクター分子と標的エレメントとの物理的
組み合わせは、生物活性を有するリガンドの周辺部での
存在を減らして腫瘍内での利用を促進する手段を意味す
る。さらに、単一腫瘍細胞またはミクロ転移もまた、こ
れらの分子の標的となり得る。
性および腫瘍部位での存在の不充分さから、標的腫瘍療
法のコンセプトが導かれる。標的腫瘍療法の原理は、腫
瘍関連抗原に特異的なモノクローナル抗体のような標的
分子と生物学的に活性のエフェクター分子との物理的結
合に基づいている。標的分子によるエフェクター分子の
運搬によって、腫瘍中のサイトカインの濃度が上昇し、
最大要求量を減少させ得ることが期待される。動物モデ
ルにおいて、腫瘍内注射またはトランスフェクトさせた
腫瘍細胞の分泌のいずれかによってサイトカインを腫瘍
部位に存在させることによって腫瘍を退行させ得ること
が示された（総説としてColombo and Forni、 Immunolog
y Today、 15、 48-51、 1994を参照されたい）。これらの
系では、サイトカインは腫瘍の増殖は阻害しないが、迅
速で有効な抗腫瘍反応を活性化することができる。した
がって、エフェクター分子と標的エレメントとの物理的
組み合わせは、生物活性を有するリガンドの周辺部での
存在を減らして腫瘍内での利用を促進する手段を意味す
る。さらに、単一腫瘍細胞またはミクロ転移もまた、こ
れらの分子の標的となり得る。
【０００４】抗体特異性標的法のための生物活性リガン
ドは、直接にまたは標的細胞に対して致死的環境をつく
り出すことによって標的細胞の破壊を誘導しなければな
らない。これは、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ
−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＦＮ、Ｔ
ＮＦαまたはＣＳＦなどのサイトカインによって達成さ
れ得る。これらのサイトカインは、抗腫瘍効果を直接的
にあるいは宿主の防護機構を活性化することによって発
揮することが示された（Mire-Sluis、 TIBTECH、11、 74-7
7、 1993、Columbo et al.、 Cancer Res.、 52、 4853-485
7、 1992、Thomas and Balkwill、 Pharmac. Ther.、 52、
307-330、 1991）。
ドは、直接にまたは標的細胞に対して致死的環境をつく
り出すことによって標的細胞の破壊を誘導しなければな
らない。これは、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ
−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＦＮ、Ｔ
ＮＦαまたはＣＳＦなどのサイトカインによって達成さ
れ得る。これらのサイトカインは、抗腫瘍効果を直接的
にあるいは宿主の防護機構を活性化することによって発
揮することが示された（Mire-Sluis、 TIBTECH、11、 74-7
7、 1993、Columbo et al.、 Cancer Res.、 52、 4853-485
7、 1992、Thomas and Balkwill、 Pharmac. Ther.、 52、
307-330、 1991）。
【０００５】しかし、これらサイトカインのほとんどは
エフェクター細胞を活性化するが、皆無または微弱の走
化能しか示さない。そのため、腫瘍組織における適量の
エフェクター細胞が存在しなければ抗腫瘍活性は弱いと
考えられる。
エフェクター細胞を活性化するが、皆無または微弱の走
化能しか示さない。そのため、腫瘍組織における適量の
エフェクター細胞が存在しなければ抗腫瘍活性は弱いと
考えられる。
【０００６】しかし、ケモカインは多くのエフェクター
細胞に走化性であって、したがって腫瘍部位におけるこ
れらの存在を強めて、次に種々のエフェクター細胞機能
を誘導する（例えば、Miller and Krangel (1992)、 "Bi
ology and Biochemistry ofthe Chemokines: A Novel F
amily of Chemotactic and Inflammatory Cytokines"、
Critical Reviews in Immunology、 12、 17を参照された
い）。
細胞に走化性であって、したがって腫瘍部位におけるこ
れらの存在を強めて、次に種々のエフェクター細胞機能
を誘導する（例えば、Miller and Krangel (1992)、 "Bi
ology and Biochemistry ofthe Chemokines: A Novel F
amily of Chemotactic and Inflammatory Cytokines"、
Critical Reviews in Immunology、 12、 17を参照された
い）。
【０００７】ＩＬ−８、ＭＩＰ２α（ＧＲＯ−βとして
も知られる）およびＭＩＰ２β（ＧＲＯ−γ）は、Ｃ−
Ｘ−Ｃケモカイン超族（小サイトカイン超族またはイン
タークリンとしても知られる）に属する。これらは走化
因子として作用して、エフェクター細胞機能を活性化
し、したがって、最適エフェクター分子であることを示
している。このＣ−Ｘ−Ｃケモカイン族は、最近特徴づ
けされた小タンパク質（８〜１０ｋＤ）の一群で、２０
〜５０％のアミノ酸配列相同性を示し、走化性および炎
症促進活性を有する。
も知られる）およびＭＩＰ２β（ＧＲＯ−γ）は、Ｃ−
Ｘ−Ｃケモカイン超族（小サイトカイン超族またはイン
タークリンとしても知られる）に属する。これらは走化
因子として作用して、エフェクター細胞機能を活性化
し、したがって、最適エフェクター分子であることを示
している。このＣ−Ｘ−Ｃケモカイン族は、最近特徴づ
けされた小タンパク質（８〜１０ｋＤ）の一群で、２０
〜５０％のアミノ酸配列相同性を示し、走化性および炎
症促進活性を有する。
【０００８】ＩＬ−８は、確立された立体構造を有し
（Clore et al.、 Biochemistry、 29、1689-1696、 199
0）、いくつかのＣＸＣケモカインと Ｎ末端ＥＬＲ部分
を共有する。ＣＸＣケモカイン間の配列相同性から、立
体構造がきわめて類似することが予測される。これはＭ
ＣＡＦ／ＭＣＰ−１についてすでに示された（Gronenbo
rnand Clore、 Prot. Eng.、 4、 263-269、 1991）。
（Clore et al.、 Biochemistry、 29、1689-1696、 199
0）、いくつかのＣＸＣケモカインと Ｎ末端ＥＬＲ部分
を共有する。ＣＸＣケモカイン間の配列相同性から、立
体構造がきわめて類似することが予測される。これはＭ
ＣＡＦ／ＭＣＰ−１についてすでに示された（Gronenbo
rnand Clore、 Prot. Eng.、 4、 263-269、 1991）。
【０００９】溶液では、ＩＬ−８は安定な二量体を形成
し（Clore et al.、 Biochemistry、29、 1689-1696、199
0）、Ｆ（ａｂ´）ＩＬ−８融合タンパク質を二つのＩ
Ｌ−８モノマーの相互作用によって二量体化して二価の
免疫抱合体を形成することが可能である。これは融合タ
ンパク質の抗原との相互作用を強めると考えられる。
し（Clore et al.、 Biochemistry、29、 1689-1696、199
0）、Ｆ（ａｂ´）ＩＬ−８融合タンパク質を二つのＩ
Ｌ−８モノマーの相互作用によって二量体化して二価の
免疫抱合体を形成することが可能である。これは融合タ
ンパク質の抗原との相互作用を強めると考えられる。
【００１０】これまでに記述されたＣ−Ｘ−Ｃ群はいず
れも、主に好中顆粒球上の作用する。遺伝子は染色体４
上に位置している。この群には、ＰＦ４、血小板塩基性
タンパク質、ｈＩＰ１０、ＩＬ−８、ＭＩＰ２αおよび
ＭＩＰ２βがある。これらタンパク質の好中球への影響
は、走化能、脱顆粒およびレスピラトリーバーストであ
る（Sherry and Cerami、 Current Opinion in Immunolo
gy、 3、 56-60、 1991、Oppenheim et al.、 Annu. Rev. I
mmunol.、 9、 617-648、 1991、Miller and Krangel、 Cri
tical Reviews in Immunology、 12、 17-46、 1992、Clar
k-Lewis et al.、 J. Biol. Chem.、 266、 23128-23134、
1991）。
れも、主に好中顆粒球上の作用する。遺伝子は染色体４
上に位置している。この群には、ＰＦ４、血小板塩基性
タンパク質、ｈＩＰ１０、ＩＬ−８、ＭＩＰ２αおよび
ＭＩＰ２βがある。これらタンパク質の好中球への影響
は、走化能、脱顆粒およびレスピラトリーバーストであ
る（Sherry and Cerami、 Current Opinion in Immunolo
gy、 3、 56-60、 1991、Oppenheim et al.、 Annu. Rev. I
mmunol.、 9、 617-648、 1991、Miller and Krangel、 Cri
tical Reviews in Immunology、 12、 17-46、 1992、Clar
k-Lewis et al.、 J. Biol. Chem.、 266、 23128-23134、
1991）。
【００１１】ケモカインのＣ−Ｃ族に密接に関連したも
のは主に単球に作用する。遺伝子は全て染色体１７に位
置している。これらタンパク質はＬＤ７８、Ａｃｔ−
２、ＭＣＡＦ、１３０９およびＲＡＮＴＥＳである。こ
れら分子は単球への強い走化能を示す（Matsushima et
al.、 Chem. Immunol.、 51、 236-265、 1992、Oppenheime
t al.、 Annu. Rev. Immunol.、 9、 617-648、 1991）。
のは主に単球に作用する。遺伝子は全て染色体１７に位
置している。これらタンパク質はＬＤ７８、Ａｃｔ−
２、ＭＣＡＦ、１３０９およびＲＡＮＴＥＳである。こ
れら分子は単球への強い走化能を示す（Matsushima et
al.、 Chem. Immunol.、 51、 236-265、 1992、Oppenheime
t al.、 Annu. Rev. Immunol.、 9、 617-648、 1991）。
【００１２】上皮増殖因子（ＥＧＦ）は、表皮および上
皮細胞のミトゲンであるポリペプチドホルモンである。
ＥＧＦが感受性細胞と相互作用するときには、これは膜
レセプター（ＥＧＦＲ）に結合する。ＥＧＦＲは、約１
７０ｋＤの貫膜糖タンパク質であって、ｃｅｒｂ−Ｂプ
ロトオンコジーン（癌原遺伝子）の遺伝子産物である。
皮細胞のミトゲンであるポリペプチドホルモンである。
ＥＧＦが感受性細胞と相互作用するときには、これは膜
レセプター（ＥＧＦＲ）に結合する。ＥＧＦＲは、約１
７０ｋＤの貫膜糖タンパク質であって、ｃｅｒｂ−Ｂプ
ロトオンコジーン（癌原遺伝子）の遺伝子産物である。
【００１３】ネズミモノクローナル抗体ＭＡｂ４２５は
ヒトＡ４３１癌腫細胞系（ＡＴＣＣＣＲＬ１５５５）に
対してつくられたもので、ＥＧＦＲの外側ドメイン上の
ポリペプチドエピトープに結合することが見出だされ
た。これはＥＧＦの結合を阻害し、インビトロで腫瘍細
胞毒性を媒介し、インビトロで上皮および結腸直腸癌腫
由来の細胞系の腫瘍細胞増殖を抑制することが見出ださ
れた（Rodeck et al.、Cancer Res.、 47、 3692、 198
7）。ＭＡｂ４２５のヒト化されたキメラは、ＷＯ９２
／１５６８３から公知である。
ヒトＡ４３１癌腫細胞系（ＡＴＣＣＣＲＬ１５５５）に
対してつくられたもので、ＥＧＦＲの外側ドメイン上の
ポリペプチドエピトープに結合することが見出だされ
た。これはＥＧＦの結合を阻害し、インビトロで腫瘍細
胞毒性を媒介し、インビトロで上皮および結腸直腸癌腫
由来の細胞系の腫瘍細胞増殖を抑制することが見出ださ
れた（Rodeck et al.、Cancer Res.、 47、 3692、 198
7）。ＭＡｂ４２５のヒト化されたキメラは、ＷＯ９２
／１５６８３から公知である。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】このように、本発明の
目的は、腫瘍細胞表面のＥＧＦＲ抗原特異性エピトープ
およびそれらのエフェクター細胞に対して高い走化能を
有する生物学的に活性のリガンドからなり、低毒性標的
腫瘍療法を可能にするような抗体またはそれらのフラグ
メントをつくり出すことであった。したがって、この免
疫抱合体は、同様のサイトカイン−抗体免疫抱合体の改
善を意味し、これは腫瘍溶解能に関しては同様に効果的
であるが、その走化的性質から特異的部位にエフェクタ
ー細胞を誘引する能力に関してはそうではない。
目的は、腫瘍細胞表面のＥＧＦＲ抗原特異性エピトープ
およびそれらのエフェクター細胞に対して高い走化能を
有する生物学的に活性のリガンドからなり、低毒性標的
腫瘍療法を可能にするような抗体またはそれらのフラグ
メントをつくり出すことであった。したがって、この免
疫抱合体は、同様のサイトカイン−抗体免疫抱合体の改
善を意味し、これは腫瘍溶解能に関しては同様に効果的
であるが、その走化的性質から特異的部位にエフェクタ
ー細胞を誘引する能力に関してはそうではない。
【００１５】
【課題を解決するための手段】本発明は、モノクローナ
ル抗体の部分、少なくとも抗原認識部位またはＥＧＦＲ
のエピトープを認識する完全なモノクローナル抗体を、
ケモカイン群、好ましくはＣ−Ｘ−Ｃ族から選択された
生物活性を有するリガンド、とくにＩＬ−８と組み合わ
せた融合タンパク質に関する。これらの融合タンパク質
をコードする構築体は、組み換えＤＮＡ技術によって作
出される。融合タンパク質は、抗体重鎖の可変部と定常
部のＣＨ１ドメイン（ＣＨ１抱合体、Ｆａｂフラグメン
ト）および適当な軽鎖、または抗体重鎖の可変部と定常
部のＣＨ１およびＣＨ２ドメイン、または抗体重鎖の可
変部と定常部のＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン
を、生物学的に活性のリガンドとそれぞれ融合して含ん
でいる。適当な軽鎖との共発現によって、抗原保有細胞
を標的として生体の特異的部位へ活性リガンドを運搬す
るような融合タンパク質を作出することができる。
ル抗体の部分、少なくとも抗原認識部位またはＥＧＦＲ
のエピトープを認識する完全なモノクローナル抗体を、
ケモカイン群、好ましくはＣ−Ｘ−Ｃ族から選択された
生物活性を有するリガンド、とくにＩＬ−８と組み合わ
せた融合タンパク質に関する。これらの融合タンパク質
をコードする構築体は、組み換えＤＮＡ技術によって作
出される。融合タンパク質は、抗体重鎖の可変部と定常
部のＣＨ１ドメイン（ＣＨ１抱合体、Ｆａｂフラグメン
ト）および適当な軽鎖、または抗体重鎖の可変部と定常
部のＣＨ１およびＣＨ２ドメイン、または抗体重鎖の可
変部と定常部のＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン
を、生物学的に活性のリガンドとそれぞれ融合して含ん
でいる。適当な軽鎖との共発現によって、抗原保有細胞
を標的として生体の特異的部位へ活性リガンドを運搬す
るような融合タンパク質を作出することができる。
【００１６】同様に、ケモカインを抗体のＦｖフラグメ
ントのＣ末端と融合させることによって別の免疫抱合体
を得ることができる。この場合、重鎖および軽鎖は、抗
原結合部位の正しい折り畳みを確実にするために両エレ
メントが適当なリンカー配列によって組み合わされた一
つのポリペプチド中に発現される。異なる構築体を図１
に示す。
ントのＣ末端と融合させることによって別の免疫抱合体
を得ることができる。この場合、重鎖および軽鎖は、抗
原結合部位の正しい折り畳みを確実にするために両エレ
メントが適当なリンカー配列によって組み合わされた一
つのポリペプチド中に発現される。異なる構築体を図１
に示す。
【００１７】免疫抱合体の発現の結果、二機能を合わせ
た新たな分子ができる。これらは、第一に抗原保有細胞
（ＥＧＦＲ）を標的とし、第二に活性リガンドを生体の
特異的部位に運搬する。これらリガンドは、強力な走化
性誘因物質であって、分子を活性化して、エフェクター
細胞の腫瘍部位浸潤および続いての腫瘍の破壊を起し得
る。
た新たな分子ができる。これらは、第一に抗原保有細胞
（ＥＧＦＲ）を標的とし、第二に活性リガンドを生体の
特異的部位に運搬する。これらリガンドは、強力な走化
性誘因物質であって、分子を活性化して、エフェクター
細胞の腫瘍部位浸潤および続いての腫瘍の破壊を起し得
る。
【００１８】本発明の免疫抱合体を用いることによっ
て、顕著な一般毒性を呈することなくメラノーマ、神経
膠腫および癌腫などの腫瘍を検出して治療することがで
きる。
て、顕著な一般毒性を呈することなくメラノーマ、神経
膠腫および癌腫などの腫瘍を検出して治療することがで
きる。
【００１９】このように、本発明の目的は、上皮増殖因
子レセプター（ＥＧＦＲ）の抗原エピトープを保有する
腫瘍細胞に対するモノクローナル抗体またはそのフラグ
メント、および該抗体または抗体フラグメントに融合し
たケモカインタンパク質リガンドからなる免疫抱合体を
提供することである。
子レセプター（ＥＧＦＲ）の抗原エピトープを保有する
腫瘍細胞に対するモノクローナル抗体またはそのフラグ
メント、および該抗体または抗体フラグメントに融合し
たケモカインタンパク質リガンドからなる免疫抱合体を
提供することである。
【００２０】Ｃ−Ｘ−ＣおよびＣ−Ｃなどの異なるグル
ープのケモカインがある。
ープのケモカインがある。
【００２１】したがって、本発明による好ましい実施態
様においては、ケモカインタンパク質はＣ−Ｘ−Ｃ族か
ら選択される。
様においては、ケモカインタンパク質はＣ−Ｘ−Ｃ族か
ら選択される。
【００２２】Ｃ−Ｘ−Ｃ族の中では、ＩＬ−８が本発明
の好ましい実施態様である。
の好ましい実施態様である。
【００２３】したがって、本発明の目的は、ケモカイン
タンパク質がＣ−Ｘ−Ｃ族から選択され、好ましくはイ
ンターロイキン８（ＩＬ−８）である免疫抱合体を提供
することである。
タンパク質がＣ−Ｘ−Ｃ族から選択され、好ましくはイ
ンターロイキン８（ＩＬ−８）である免疫抱合体を提供
することである。
【００２４】本発明に使用可能な抗体は、全抗体または
そのフラグメントである。適当なフラグメントは、Ｆ
ｖ、ＦａｂまたはＦ（ａｂ´）２（本発明においてはＣ
Ｈ１抗体フラグメントと称する）、ＣＨ３およびＣＨ２
抗体フラグメントである（図１）。好ましい実施態様
は、Ｆｖ、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３抗体フラグメン
トである。
そのフラグメントである。適当なフラグメントは、Ｆ
ｖ、ＦａｂまたはＦ（ａｂ´）２（本発明においてはＣ
Ｈ１抗体フラグメントと称する）、ＣＨ３およびＣＨ２
抗体フラグメントである（図１）。好ましい実施態様
は、Ｆｖ、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３抗体フラグメン
トである。
【００２５】したがって、本発明の目的は、抗体が本質
的に抗体重鎖の可変部、定常部のＣＨ１ドメインおよび
適当な軽鎖からなるＦａｂフラグメントまたはＦ（ａｂ
´）２フラグメントである免疫抱合体（抗体−ＣＨ１抱
合体）、抗体が本質的に抗体重鎖の可変部、定常部のＣ
Ｈ１およびＣＨ２ドメインおよび適当な軽鎖からなる抗
体フラグメントである別の免疫抱合体（抗体−ＣＨ２抱
合体）、抗体が抗体重鎖の可変部、定常部のＣＨ１、Ｃ
Ｈ２およびＣＨ３ドメインおよび適当な軽鎖からなる完
全な抗体である別の免疫抱合体（抗体−ＣＨ３抱合
体）、最後に、抗体が本質的に抗体重鎖の可変部、適当
な軽鎖および軽鎖と重鎖をつなぐポリペプチド配列物か
らなるさらなる免疫抱合体（抗体−Ｆｖ抱合体）を提供
することである。
的に抗体重鎖の可変部、定常部のＣＨ１ドメインおよび
適当な軽鎖からなるＦａｂフラグメントまたはＦ（ａｂ
´）２フラグメントである免疫抱合体（抗体−ＣＨ１抱
合体）、抗体が本質的に抗体重鎖の可変部、定常部のＣ
Ｈ１およびＣＨ２ドメインおよび適当な軽鎖からなる抗
体フラグメントである別の免疫抱合体（抗体−ＣＨ２抱
合体）、抗体が抗体重鎖の可変部、定常部のＣＨ１、Ｃ
Ｈ２およびＣＨ３ドメインおよび適当な軽鎖からなる完
全な抗体である別の免疫抱合体（抗体−ＣＨ３抱合
体）、最後に、抗体が本質的に抗体重鎖の可変部、適当
な軽鎖および軽鎖と重鎖をつなぐポリペプチド配列物か
らなるさらなる免疫抱合体（抗体−Ｆｖ抱合体）を提供
することである。
【００２６】本発明による免疫抱合体は、適宜、抱合体
の標的エピトープへの最適結合を確実にするために例え
ば特異的リンカーペプチドの導入を可能にするような制
限部位を、抗体（フラグメント）とケモカインタンパク
質との間に包含していてもよい。適当なリンカーペプチ
ドおよびそれらの導入法は、当業者に広く公知であり、
以下に記述される。本発明において、制限部位は特定Ｄ
ＮＡ構築体において単一特異となるように選択される。
好ましい制限部位はＮｃｏＩおよびＢｃｌＩである。
の標的エピトープへの最適結合を確実にするために例え
ば特異的リンカーペプチドの導入を可能にするような制
限部位を、抗体（フラグメント）とケモカインタンパク
質との間に包含していてもよい。適当なリンカーペプチ
ドおよびそれらの導入法は、当業者に広く公知であり、
以下に記述される。本発明において、制限部位は特定Ｄ
ＮＡ構築体において単一特異となるように選択される。
好ましい制限部位はＮｃｏＩおよびＢｃｌＩである。
【００２７】したがって、本発明のさらなる目的は、抗
体／抗体フラグメントと生物学的に活性のリガンドとの
間にＤＮＡ制限部位を推定し得るアミノ酸（配列物）を
含んでなる免疫抱合体を提供することである。該制限部
位は完全融合構築体内で単一特異である。
体／抗体フラグメントと生物学的に活性のリガンドとの
間にＤＮＡ制限部位を推定し得るアミノ酸（配列物）を
含んでなる免疫抱合体を提供することである。該制限部
位は完全融合構築体内で単一特異である。
【００２８】本発明のさらなる目的は、抗体／抗体フラ
グメントと生物学的に活性のリガンドとの間にリンカー
ペプチドを含んでなる免疫抱合体を提供することであ
る。
グメントと生物学的に活性のリガンドとの間にリンカー
ペプチドを含んでなる免疫抱合体を提供することであ
る。
【００２９】一般に、腫瘍細胞表面のＥＧＦレセプター
に対する全ての抗体が適している。しかし、モノクロー
ナル抗体４２５が好ましい実施態様である。
に対する全ての抗体が適している。しかし、モノクロー
ナル抗体４２５が好ましい実施態様である。
【００３０】さらに本発明の目的は、抗体または抗体フ
ラグメントがネズミ、ヒト化またはキメラＭＡｂ４２５
に由来し、好ましくはＭＡｂ４２５−ＣＨ１−ＩＬ８、
ＭＡｂ４２５−ＣＨ２−（ＮｃｏＩ）−ＩＬ８、ＭＡｂ
４２５−ＣＨ２−（ＢｃｌＩ）−ＩＬ８、ＭＡｂ２５−
Ｆｖ−ＩＬ８、ＭＡｂ４２５−ＣＨ３−ＩＬ−８からな
る群から選択されることを特徴とする免疫抱合体を提供
することである。
ラグメントがネズミ、ヒト化またはキメラＭＡｂ４２５
に由来し、好ましくはＭＡｂ４２５−ＣＨ１−ＩＬ８、
ＭＡｂ４２５−ＣＨ２−（ＮｃｏＩ）−ＩＬ８、ＭＡｂ
４２５−ＣＨ２−（ＢｃｌＩ）−ＩＬ８、ＭＡｂ２５−
Ｆｖ−ＩＬ８、ＭＡｂ４２５−ＣＨ３−ＩＬ−８からな
る群から選択されることを特徴とする免疫抱合体を提供
することである。
【００３１】さらに、本発明の目的は上記、下記および
請求の範囲に定義した免疫抱合体の製造法を提供するこ
とであって、抗体または抗体フラグメントと生物活性を
有するリガンドをコードするＤＮＡ配列物とを所望の融
合ＤＮＡ配列に相補的なオリゴヌクレオチドを用いて一
本鎖ＤＮＡ上で互いに融合させて、得られる構築体を発
現ベクターに導入して、これで宿主生物を形質転換させ
て、この宿主細胞を栄養溶液中で培養して、融合タンパ
ク質を発現させることによって行われる。
請求の範囲に定義した免疫抱合体の製造法を提供するこ
とであって、抗体または抗体フラグメントと生物活性を
有するリガンドをコードするＤＮＡ配列物とを所望の融
合ＤＮＡ配列に相補的なオリゴヌクレオチドを用いて一
本鎖ＤＮＡ上で互いに融合させて、得られる構築体を発
現ベクターに導入して、これで宿主生物を形質転換させ
て、この宿主細胞を栄養溶液中で培養して、融合タンパ
ク質を発現させることによって行われる。
【００３２】本発明の免疫抱合体は治療的使用に適して
いる。
いる。
【００３３】したがって、本発明の目的は、上記、下記
および請求の範囲に定義した少なくとも一つの免疫抱合
体および生物学的に容認し得る担体を含んでなる薬剤組
成物を提供することである。
および請求の範囲に定義した少なくとも一つの免疫抱合
体および生物学的に容認し得る担体を含んでなる薬剤組
成物を提供することである。
【００３４】本発明のねらいは標的エレメントとしての
モノクローナル抗体および走化性および活性化の性質を
有するエフェクター分子としてのケモカインＩＬ−８か
らなる融合タンパク質を作出することである。
モノクローナル抗体および走化性および活性化の性質を
有するエフェクター分子としてのケモカインＩＬ−８か
らなる融合タンパク質を作出することである。
【００３５】ＩＬ−８および他のケモカイン（ＭＩＰな
ど）がＮ末端を抗体部分などの追加のアミノ酸によって
ブロックされた場合にその生物活性が保持されることを
初めて示すことができた。したがって、この分子は、エ
フェクター細胞がＥＧＦレセプター陽性腫瘍細胞であっ
てその場で活性化されるような標的腫瘍療法において有
用であると考えられる。
ど）がＮ末端を抗体部分などの追加のアミノ酸によって
ブロックされた場合にその生物活性が保持されることを
初めて示すことができた。したがって、この分子は、エ
フェクター細胞がＥＧＦレセプター陽性腫瘍細胞であっ
てその場で活性化されるような標的腫瘍療法において有
用であると考えられる。
【００３６】ＭＡｂ４２５重鎖およびＩＬ−８タンパク
質をコードするｃＤＮＡを分子生物学的方法および適当
な発現系において発現されたタンパク質によって融合さ
れ得ること、およびＥＧＦレセプター結合能が融合タン
パク質において保存されることを示すことができた（図
２）。
質をコードするｃＤＮＡを分子生物学的方法および適当
な発現系において発現されたタンパク質によって融合さ
れ得ること、およびＥＧＦレセプター結合能が融合タン
パク質において保存されることを示すことができた（図
２）。
【００３７】ＩＬ−８の主標的細胞は好中顆粒球であっ
て、次の三つの生物学的機能を有する。
て、次の三つの生物学的機能を有する。
【００３８】走化性勾配に沿った走化性移動 予め産生されたタンパク分解酵素を伴う貯蔵顆粒の放出 スーパーオキシドアニオンの即時産生（レスピラトリー
バースト） したがって、ＭＡｂ４２５／ＮｃｏＩ／ＩＬ−８および
ＭＡｂ４２５／ＢｃｌＩ／ＩＬ−８融合タンパク質の走
化能、ＭＰＯ放出の誘導およびスーパーオキシド放出に
ついて調べた。
バースト） したがって、ＭＡｂ４２５／ＮｃｏＩ／ＩＬ−８および
ＭＡｂ４２５／ＢｃｌＩ／ＩＬ−８融合タンパク質の走
化能、ＭＰＯ放出の誘導およびスーパーオキシド放出に
ついて調べた。
【００３９】さらに、本発明の融合タンパク質（例えば
ＭＡｂ４２５／ＮｃｏＩ／ＩＬ−８およびＭＡｂ４２５
／ＢｃｌＩ／ＩＬ−８）は、走化能、ＭＰＯ放出の誘導
およびスーパーオキシド放出を起こすことを示すことが
できた。図３の結果は、両融合タンパク質が組み換えＩ
Ｌ−８の範囲でヒト好中球に対して走化性であることを
示している（図４）。二価のかたちに組み立てなければ
ならないＭＡｂ４２５／ＮｃｏＩ／ＩＬ−８およびＭＡ
ｂ４２５／ＢｃｌＩ／ＩＬ−８融合タンパク質に加え
て、一価のＦ（ａｂ´）−ＩＬ−８融合タンパク質が作
出され、これは大腸菌中で発現されて精製された。図５
は、Ｆ（ａｂ´）−ＩＬ−８融合タンパク質がＭＡｂ４
２５Ｆ（ａｂ´）と比較した場合にヒト好中球に対して
走化性であって、したがって大腸菌中で発現されて精製
されることを示す。
ＭＡｂ４２５／ＮｃｏＩ／ＩＬ−８およびＭＡｂ４２５
／ＢｃｌＩ／ＩＬ−８）は、走化能、ＭＰＯ放出の誘導
およびスーパーオキシド放出を起こすことを示すことが
できた。図３の結果は、両融合タンパク質が組み換えＩ
Ｌ−８の範囲でヒト好中球に対して走化性であることを
示している（図４）。二価のかたちに組み立てなければ
ならないＭＡｂ４２５／ＮｃｏＩ／ＩＬ−８およびＭＡ
ｂ４２５／ＢｃｌＩ／ＩＬ−８融合タンパク質に加え
て、一価のＦ（ａｂ´）−ＩＬ−８融合タンパク質が作
出され、これは大腸菌中で発現されて精製された。図５
は、Ｆ（ａｂ´）−ＩＬ−８融合タンパク質がＭＡｂ４
２５Ｆ（ａｂ´）と比較した場合にヒト好中球に対して
走化性であって、したがって大腸菌中で発現されて精製
されることを示す。
【００４０】ＭＡｂ４２５／ＢｃｌＩ／ＩＬ−８融合タ
ンパク質は、遊離のＩＬ−８と比較してかなり強いスー
パーオキシド放出能を有する（図６）。ＭＡｂ４２５／
ＮｃｏＩ／ＩＬ−８融合タンパク質の活性はより低い
が、その値は対照値よりは有意に高い（図６）。ＭＡｂ
４２５単独では活性を示さない。全試験は、単一では無
活性のシトカラシンＢをエンハンサー物質として用いて
行った（データ表示なし）。
ンパク質は、遊離のＩＬ−８と比較してかなり強いスー
パーオキシド放出能を有する（図６）。ＭＡｂ４２５／
ＮｃｏＩ／ＩＬ−８融合タンパク質の活性はより低い
が、その値は対照値よりは有意に高い（図６）。ＭＡｂ
４２５単独では活性を示さない。全試験は、単一では無
活性のシトカラシンＢをエンハンサー物質として用いて
行った（データ表示なし）。
【００４１】両融合タンパク質はミエロペルオキシダー
ゼ（ＭＰＯ）放出を誘導するが、ＭＡｂ４２５／Ｎｃｏ
Ｉ／ＩＬ−８融合タンパク質はＭＡｂ４２５／ＢｃｌＩ
／ＩＬ−８融合タンパク質よりも活性である（図７）。
全データは、トリトン溶解細胞のデータに従って計算
し、これを１００％酵素含量とする。全データはシトカ
ラシンＢをエンハンサー物質として用いて得られた。
ゼ（ＭＰＯ）放出を誘導するが、ＭＡｂ４２５／Ｎｃｏ
Ｉ／ＩＬ−８融合タンパク質はＭＡｂ４２５／ＢｃｌＩ
／ＩＬ−８融合タンパク質よりも活性である（図７）。
全データは、トリトン溶解細胞のデータに従って計算
し、これを１００％酵素含量とする。全データはシトカ
ラシンＢをエンハンサー物質として用いて得られた。
【００４２】高度に保存されたＥ−Ｌ−Ｒ部分を有する
ＩＬ−８分子のＮ末端部分がレセプター結合およびシグ
ナルトランスダクションに要求されることが以前に明ら
かにされた。ＩＬ−８の立体構造は、両Ｎ末端が露出構
造中にあるホモ二量体である。Ｎ末端が追加のアミノ酸
によってブロックされる場合に、ＩＬ−８の生物活性が
阻害される可能性があった。したがって、制限部位（Ｎ
ｃｏＩ／ＢｃｌＩ）を二つのｃＤＮＡ間に導入してリン
カーペプチドを導入し、それによってＮ末端のアクセス
能を修復した。
ＩＬ−８分子のＮ末端部分がレセプター結合およびシグ
ナルトランスダクションに要求されることが以前に明ら
かにされた。ＩＬ−８の立体構造は、両Ｎ末端が露出構
造中にあるホモ二量体である。Ｎ末端が追加のアミノ酸
によってブロックされる場合に、ＩＬ−８の生物活性が
阻害される可能性があった。したがって、制限部位（Ｎ
ｃｏＩ／ＢｃｌＩ）を二つのｃＤＮＡ間に導入してリン
カーペプチドを導入し、それによってＮ末端のアクセス
能を修復した。
【００４３】両エレメントの化学的カップリングのよう
な融合タンパク質作出のための他のアプローチでは、バ
ッチ間で変動するおそれのある不確かな構築体が得られ
た。加えて、化学的カップリングではリガンドの二次構
造が破壊されるとかアクセス不能のためにレセプター結
合に関してほとんどのタンパク質が不活性であるという
状態を生じ得る。これに対して、本発明のアプローチで
は、ほとんど無制限で再現可能な質で発現され得る確定
した構造の融合タンパク質を作出することができる。
な融合タンパク質作出のための他のアプローチでは、バ
ッチ間で変動するおそれのある不確かな構築体が得られ
た。加えて、化学的カップリングではリガンドの二次構
造が破壊されるとかアクセス不能のためにレセプター結
合に関してほとんどのタンパク質が不活性であるという
状態を生じ得る。これに対して、本発明のアプローチで
は、ほとんど無制限で再現可能な質で発現され得る確定
した構造の融合タンパク質を作出することができる。
【００４４】要約すると、本発明による融合タンパク質
は次のような性質を有する。
は次のような性質を有する。
【００４５】ＥＧＦＲ陽性細胞に結合する。
【００４６】走化能を誘起する。
【００４７】ＭＰＯおよびスーパーオキシド放出を誘導
する。
する。
【００４８】その場での腫瘍溶解を誘導する。
【００４９】したがって、本発明の免疫抱合体は、腫瘍
の治療に適している。
の治療に適している。
【００５０】
一般的注記 本出願に記述の全ての微生物、細胞系、プラスミド、プ
ロモーター、耐性マーカー、複製開始点、制限部位また
はベクターの他のフラグメントは、市販されているかあ
るいは一般に入手可能である。とくに記載がない限り、
これらは例として使用されるのみであって、本発明に必
須ではなく、それぞれ他の適当な手段および生物学的材
料によって置き換えることができる。
ロモーター、耐性マーカー、複製開始点、制限部位また
はベクターの他のフラグメントは、市販されているかあ
るいは一般に入手可能である。とくに記載がない限り、
これらは例として使用されるのみであって、本発明に必
須ではなく、それぞれ他の適当な手段および生物学的材
料によって置き換えることができる。
【００５１】本発明に必須の方法技術を以下に詳細に記
述する。詳記されない他の方法技術は、当業者によく知
られた公知の標準法または引用参考文献および特許出願
明細書および標準的文献に記載のある方法技術である
（例えば、"Antibodies、 A Laboratory Manual"、 Harlo
w、 Lane、 Cold Spring Harbor、 1988）。 モノクローナル抗体 ＭＡｂ４２５は、ヒトＡ４３１癌腫細胞系（ＡＴＣＣ
ＣＲＬ１５５５）に対するＩｇＧ１ネズミモノクローナ
ル抗体である。ＭＡｂ４２５は、ヒトＥＧＦレセプター
の外側ドメインのポリペプチドエピトープと結合し、Ｅ
ＧＦの結合と競合する。ＭＡｂ４２５は、インビトロで
腫瘍細胞毒性を媒介することおよびインビトロで類表皮
腫および結腸直腸癌腫由来細胞系の腫瘍細胞増殖を抑制
することが見出だされた（Rodeck et al.、 Cancer Res、
47、 3692、1987）。ヒト化およびキメラ型ＭＡｂ４２５
はＷＯ９２／１５６８３に開示されている。 ケモカイン ケモカインをコードするｃＤＮＡは、British Biotechn
ology Limited (ヒトＩＬ−８ ＢＢＧ４４、Herrmann B
iermann GmbH、 Bad Nauheim、独国）から購入するか、
またはサイトカイン産生ヒト細胞系Ｕ９３７（ＡＴＣＣ
ＣＲＬ１５９３）から分離されるｍＲＮＡから作出す
る。ケモカイン産生細胞からの全ＲＮＡを、ＲＮＡｚｏ
ｌ（WAK-Chemie、独国）を製造者の指示にしたがって用
いて分離した。次いでＲＮＡをｃＤＮＡに転写して、公
表されたＤＮＡ配列から推定した適当なプライマーを用
いてＰＣＲ増幅した。 ベクター ｐＵＣ１９は一連の多重コピー数大腸菌プラスミドクロ
ーニングベクターのひとつであって、ｐＢＲ３２２およ
びＭ１３ｍｐ１９の部分を含む。ｐＵＣ１９は、誘導性
細菌性ｌａｃプロモーター−オペレーターおよびそれに
続く多クローニング部位を含む（Yanisch-Perron et a
l.、 Gene、 33、 103-109、 1985）。ｐＵＣベクターは、
市販されている（例えばNew England Biolabsなど）。
述する。詳記されない他の方法技術は、当業者によく知
られた公知の標準法または引用参考文献および特許出願
明細書および標準的文献に記載のある方法技術である
（例えば、"Antibodies、 A Laboratory Manual"、 Harlo
w、 Lane、 Cold Spring Harbor、 1988）。 モノクローナル抗体 ＭＡｂ４２５は、ヒトＡ４３１癌腫細胞系（ＡＴＣＣ
ＣＲＬ１５５５）に対するＩｇＧ１ネズミモノクローナ
ル抗体である。ＭＡｂ４２５は、ヒトＥＧＦレセプター
の外側ドメインのポリペプチドエピトープと結合し、Ｅ
ＧＦの結合と競合する。ＭＡｂ４２５は、インビトロで
腫瘍細胞毒性を媒介することおよびインビトロで類表皮
腫および結腸直腸癌腫由来細胞系の腫瘍細胞増殖を抑制
することが見出だされた（Rodeck et al.、 Cancer Res、
47、 3692、1987）。ヒト化およびキメラ型ＭＡｂ４２５
はＷＯ９２／１５６８３に開示されている。 ケモカイン ケモカインをコードするｃＤＮＡは、British Biotechn
ology Limited (ヒトＩＬ−８ ＢＢＧ４４、Herrmann B
iermann GmbH、 Bad Nauheim、独国）から購入するか、
またはサイトカイン産生ヒト細胞系Ｕ９３７（ＡＴＣＣ
ＣＲＬ１５９３）から分離されるｍＲＮＡから作出す
る。ケモカイン産生細胞からの全ＲＮＡを、ＲＮＡｚｏ
ｌ（WAK-Chemie、独国）を製造者の指示にしたがって用
いて分離した。次いでＲＮＡをｃＤＮＡに転写して、公
表されたＤＮＡ配列から推定した適当なプライマーを用
いてＰＣＲ増幅した。 ベクター ｐＵＣ１９は一連の多重コピー数大腸菌プラスミドクロ
ーニングベクターのひとつであって、ｐＢＲ３２２およ
びＭ１３ｍｐ１９の部分を含む。ｐＵＣ１９は、誘導性
細菌性ｌａｃプロモーター−オペレーターおよびそれに
続く多クローニング部位を含む（Yanisch-Perron et a
l.、 Gene、 33、 103-109、 1985）。ｐＵＣベクターは、
市販されている（例えばNew England Biolabsなど）。
【００５２】ｐBluescriptＫＳ／ＳＫ＋およびＫＳ／Ｓ
Ｋ−ファージミドベクターはｐＵＣ１９に由来する。ベ
クターは市販されている（Stratagene、ハイデルベル
グ）。原核細胞発現ベクターはｐＳＷ１ベクター（Ward
et al.、 Nature、 341、544-546、 1989）に基づき、これ
はｐＵＣ１９ベクターに由来する。ｐＳＷ１は、Erwini
a carotovoraからの細菌性ｐｅｌＢ遺伝子のリーダーペ
プチドをコードする配列を含む（Lei et al.、 J.Bact.、
169、 4379-4383、 1987）。外来性ＤＮＡをｐｅｌＢリ
ーダー配列の後に枠内に導入して、ペリプラズム中への
タンパク質発現を指示することができる。
Ｋ−ファージミドベクターはｐＵＣ１９に由来する。ベ
クターは市販されている（Stratagene、ハイデルベル
グ）。原核細胞発現ベクターはｐＳＷ１ベクター（Ward
et al.、 Nature、 341、544-546、 1989）に基づき、これ
はｐＵＣ１９ベクターに由来する。ｐＳＷ１は、Erwini
a carotovoraからの細菌性ｐｅｌＢ遺伝子のリーダーペ
プチドをコードする配列を含む（Lei et al.、 J.Bact.、
169、 4379-4383、 1987）。外来性ＤＮＡをｐｅｌＢリ
ーダー配列の後に枠内に導入して、ペリプラズム中への
タンパク質発現を指示することができる。
【００５３】真核細胞発現ベクターｐＨＣＭＶ（Gillie
s et al., Cell、 33、 717、 1983）は、シミアン（アカ
ゲザル）ウイルス４０（ＳＶ４０）の複製開始点および
ヒトサイトメガウイルスのプロモーターおよびエンハン
サー領域を含む。プロモーター／エンハンサー領域の後
には、発現されるべき遺伝子導入のための多クローニン
グ部位が続く。このベクターにおいて、ＭＡｂ４２５重
鎖可変部のキメラ型およびＣＨ２ドメインの末端でケモ
カインと融合したｃγ１ＣＨ２領域とを組合わせてＭＡ
ｂ４２５重鎖融合タンパク質がつくり出された。この融
合Ｉｇ鎖を適当な軽鎖と組み合わせることによって一価
の抗原結合領域を形成してこれを免疫抱合体に組み立て
ることができ、これを会合させて標的抗原に特異的な二
価の免疫抱合体を産生するができる。重鎖および軽鎖構
築体は、ひとつのまたは別々のベクターに導入すること
ができる。
s et al., Cell、 33、 717、 1983）は、シミアン（アカ
ゲザル）ウイルス４０（ＳＶ４０）の複製開始点および
ヒトサイトメガウイルスのプロモーターおよびエンハン
サー領域を含む。プロモーター／エンハンサー領域の後
には、発現されるべき遺伝子導入のための多クローニン
グ部位が続く。このベクターにおいて、ＭＡｂ４２５重
鎖可変部のキメラ型およびＣＨ２ドメインの末端でケモ
カインと融合したｃγ１ＣＨ２領域とを組合わせてＭＡ
ｂ４２５重鎖融合タンパク質がつくり出された。この融
合Ｉｇ鎖を適当な軽鎖と組み合わせることによって一価
の抗原結合領域を形成してこれを免疫抱合体に組み立て
ることができ、これを会合させて標的抗原に特異的な二
価の免疫抱合体を産生するができる。重鎖および軽鎖構
築体は、ひとつのまたは別々のベクターに導入すること
ができる。
【００５４】
融合タンパク質の真核細胞における発現 Ｆａｂ４２５−ケモカイン融合タンパク質発現のための
真核細胞発現ベクターの構築 ＭＡｂ４２５およびケモカインのＰＣＲ手法による融
合：ヒトｃγ１定常部を、ｐＵＣ１９にＢａｍＨＩ／Ｂ
ａｍＨＩフラグメントとして挿入した。ｃγ１定常部は
二つのＳａｃＩＩ部位を含む。一つは５´ＢａｍＨＩ部
位の４０ｂｐ下流の５´イントロンに位置し、もう一つ
は５´ＢａｍＨＩ部位の５８０ｂｐ下流でＣＨ３ドメイ
ン開始部の１４０ｂｐ上流に位置している。二番目のＳ
ａｃＩＩ部位は、さらなるサブクローニングに適してお
り、したがって最初のＳａｃＩＩ部位をアダプターを用
いてＳｎａＢＩ部位を導入することによって破壊した。
この構築物（ΔＳａｃＩＩｃγ１）において、ＳａｃＩ
Ｉ部位の下流のフラグメントは容易に交換され得る。
真核細胞発現ベクターの構築 ＭＡｂ４２５およびケモカインのＰＣＲ手法による融
合：ヒトｃγ１定常部を、ｐＵＣ１９にＢａｍＨＩ／Ｂ
ａｍＨＩフラグメントとして挿入した。ｃγ１定常部は
二つのＳａｃＩＩ部位を含む。一つは５´ＢａｍＨＩ部
位の４０ｂｐ下流の５´イントロンに位置し、もう一つ
は５´ＢａｍＨＩ部位の５８０ｂｐ下流でＣＨ３ドメイ
ン開始部の１４０ｂｐ上流に位置している。二番目のＳ
ａｃＩＩ部位は、さらなるサブクローニングに適してお
り、したがって最初のＳａｃＩＩ部位をアダプターを用
いてＳｎａＢＩ部位を導入することによって破壊した。
この構築物（ΔＳａｃＩＩｃγ１）において、ＳａｃＩ
Ｉ部位の下流のフラグメントは容易に交換され得る。
【００５５】ヒトＩＬ−８をｐＵＣ１８ベクター（Ｂｇ
ｌＩＩ／ＥｃｏＲＩ）から切り出して、ｐBluescriptＳ
Ｋ＋（Stratagene GmbH、ハイデルベルグ）（ＳｍａＩ
／ＥｃｏＲＩ）にＢｇｌＩＩおよびＳｍａＩ部位が除去
されるように挿入した。ΔＳａｃＩＩｃγ１クローンの
ＳａｃＩＩ／ＸｂａＩフラグメントをｐBluescriptＳＫ
＋に挿入した。両遺伝子を適当なプライマーを用いてＰ
ＣＲ手法で増幅した。 ΔＳａｃＩＩｃγ１用 ３´プライマー：ＣＨ２ドメインの末端配列およびＮｃ
ｏＩ部位 ５´プライマー：逆配列決定プライマー ＩＬ−８用 ３´プライマー：汎用配列決定プライマー ５´プライマー：Ｎｃｏｌ部位およびＩＬ−８の開始配
列 生成物を切断して、ＳＫ＋ＳａｃＩＩ／ＥｃｏＲＩと結
合させる。得られたペプチド配列において、ＣＨ２ドメ
インのＣ末端リジンをメチオニンに変え、ＩＬ−８部分
のＮ末端セリンをグリシンに変える。
ｌＩＩ／ＥｃｏＲＩ）から切り出して、ｐBluescriptＳ
Ｋ＋（Stratagene GmbH、ハイデルベルグ）（ＳｍａＩ
／ＥｃｏＲＩ）にＢｇｌＩＩおよびＳｍａＩ部位が除去
されるように挿入した。ΔＳａｃＩＩｃγ１クローンの
ＳａｃＩＩ／ＸｂａＩフラグメントをｐBluescriptＳＫ
＋に挿入した。両遺伝子を適当なプライマーを用いてＰ
ＣＲ手法で増幅した。 ΔＳａｃＩＩｃγ１用 ３´プライマー：ＣＨ２ドメインの末端配列およびＮｃ
ｏＩ部位 ５´プライマー：逆配列決定プライマー ＩＬ−８用 ３´プライマー：汎用配列決定プライマー ５´プライマー：Ｎｃｏｌ部位およびＩＬ−８の開始配
列 生成物を切断して、ＳＫ＋ＳａｃＩＩ／ＥｃｏＲＩと結
合させる。得られたペプチド配列において、ＣＨ２ドメ
インのＣ末端リジンをメチオニンに変え、ＩＬ−８部分
のＮ末端セリンをグリシンに変える。
【００５６】二つのポリペプチド間の接合部に新たにつ
くられる配列は以下の通りである。 ５’ＡＡＡ ＧＣＣ ＡＴＧ ＧＧＴ ＧＣＴ３’ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ａｌａ ｃγ１ＣＨ２ ＜＝ ＝＞ＩＬー８（２ー７２） 同様の操作をプライマー（表１）を用いて行い、二つの
遺伝子間にＢｃｌＩ部位を導入した。得られる融合遺伝
子は、ＢｃｌＩ部位をｃγ１定常部遺伝子とＩＬ−８遺
伝子間に有し、ＣＨ２ドメインの全配列、二つの追加の
アミノ酸（バリン、イソロイシン）をコードしそして最
初の二つのアミノ酸（セリン、アラニン）を含まないＩ
Ｌ−８配列をコードする。
くられる配列は以下の通りである。 ５’ＡＡＡ ＧＣＣ ＡＴＧ ＧＧＴ ＧＣＴ３’ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ａｌａ ｃγ１ＣＨ２ ＜＝ ＝＞ＩＬー８（２ー７２） 同様の操作をプライマー（表１）を用いて行い、二つの
遺伝子間にＢｃｌＩ部位を導入した。得られる融合遺伝
子は、ＢｃｌＩ部位をｃγ１定常部遺伝子とＩＬ−８遺
伝子間に有し、ＣＨ２ドメインの全配列、二つの追加の
アミノ酸（バリン、イソロイシン）をコードしそして最
初の二つのアミノ酸（セリン、アラニン）を含まないＩ
Ｌ−８配列をコードする。
【００５７】二つのポリペプチド間の接合部に新たにつ
くられる配列は以下の通りである。 ５’ＧＣＣ ＡＡＡ ＧＴＧ ＡＴＣ ＡＡＡ ＧＡＡ３’ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｇｌｕ ｃγ１ＣＨ２ ＜＝ ＝＞ＩＬー８（３ー７２） ＰＣＲによる生成物を、ＳａｃＩＩおよびＥｃｏＲＩ制
限部位を用いてＳＫ＋にサブクローニングした。真核細
胞発現のために、これら融合遺伝子をｐＨＣＭＶベクタ
ーにクローニングした。
くられる配列は以下の通りである。 ５’ＧＣＣ ＡＡＡ ＧＴＧ ＡＴＣ ＡＡＡ ＧＡＡ３’ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｇｌｕ ｃγ１ＣＨ２ ＜＝ ＝＞ＩＬー８（３ー７２） ＰＣＲによる生成物を、ＳａｃＩＩおよびＥｃｏＲＩ制
限部位を用いてＳＫ＋にサブクローニングした。真核細
胞発現のために、これら融合遺伝子をｐＨＣＭＶベクタ
ーにクローニングした。
【００５８】
【表１】 免疫抱合体の真核細胞における発現 真核細胞における免疫抱合体の発現には、重鎖および軽
鎖を含むベクターＤＮＡの宿主細胞への導入が要求され
る。種々の異なる方法、例えば電気穿孔法、ＤＥＡＥデ
キストラン、燐酸カルシウム、リポフェクチンまたはプ
ロトプラスト融合などが記述されている。免疫抱合体を
コードする組み換えＤＮＡ配列がその細胞型においてｍ
ＲＮＡに正しく転写される限り、いかなる宿主細胞型を
用いてもよい。宿主細胞としては、免疫グロブリンを産
生しないマウスミエローマ細胞、例えばＳｐ２／０−Ａ
Ｇ１４（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８１）、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ
８．６５３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８０）またはハムス
ター細胞、例えばＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ６
１）、またはＣＨＯ／ＤＨＦＲ−（ＡＴＣＣ ＣＲＬ９
０９６）、またはＢＨＫ−２１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ１
０）が用いられる。過渡的発現には、ＣＯＳ−１（ＡＴ
ＣＣ ＣＲＬ１６５０）またはＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ
ＣＲＬ１６５１）を用いてもよい。 免疫抱合体の過渡的発現 発現ベクターｐＨＣＭＶは、アカゲザルウイルス４０
（ＳＶ４０）の複製開始点を含む。細胞系ＣＯＳ−７
は、開始点欠失ＳＶ４０ウイルスで形質転換されたアカ
ゲザル細胞系ＣＶ−１から誘導されたものである。した
がって、ＳＶ４０複製開始点を含むプラスミドは増幅さ
れて、免疫抱合体の産生が向上すると考えられる。上清
を７２時間後に集めて、ＥＧＦ−レセプター結合および
ケモカイン濃度についてＥＬＩＳＡによって調べた。 免疫抱合体の恒常的発現 免疫抱合体の発現のための組み換え構築体を含むベクタ
ーを、適当な宿主細胞に導入する。重鎖および軽鎖構築
体を同一または別々のベクターに入れることができる。
後者の場合は、両ベクターはネオマイシン耐性またはデ
ヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）などの同一の選択
マーカーまたは二つの異なる選択マーカーを両ベクター
の選択検出のために含ませればよい。ＤＨＦＲマーカー
の選択は、ＣＨＯ／ＤＨＦＲ−などのＤＨＦＲ陰性細胞
系においてのみ可能である。混合細胞集団を、ＥＧＦ−
レセプター特異性ＥＬＩＳＡを用いて免疫抱合体の発現
について分析する。陽性モノクローナルについてのさら
なる選択を限定希釈クローニングによって行う。 ＭＡｂ４２５ケモカイン免疫抱合体の精製 宿主細胞によって産生されたＭＡｂ４２５免疫抱合体を
集めて、例えば標的抗原、抗サイトカイン抗体または抗
イディオタイプ抗体などを用いるアフィニティークロマ
トグラフィーなどの適当な方法によって精製することが
できる（例えばHarlow、 Lane、前出）。
鎖を含むベクターＤＮＡの宿主細胞への導入が要求され
る。種々の異なる方法、例えば電気穿孔法、ＤＥＡＥデ
キストラン、燐酸カルシウム、リポフェクチンまたはプ
ロトプラスト融合などが記述されている。免疫抱合体を
コードする組み換えＤＮＡ配列がその細胞型においてｍ
ＲＮＡに正しく転写される限り、いかなる宿主細胞型を
用いてもよい。宿主細胞としては、免疫グロブリンを産
生しないマウスミエローマ細胞、例えばＳｐ２／０−Ａ
Ｇ１４（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８１）、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ
８．６５３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８０）またはハムス
ター細胞、例えばＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ６
１）、またはＣＨＯ／ＤＨＦＲ−（ＡＴＣＣ ＣＲＬ９
０９６）、またはＢＨＫ−２１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ１
０）が用いられる。過渡的発現には、ＣＯＳ−１（ＡＴ
ＣＣ ＣＲＬ１６５０）またはＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ
ＣＲＬ１６５１）を用いてもよい。 免疫抱合体の過渡的発現 発現ベクターｐＨＣＭＶは、アカゲザルウイルス４０
（ＳＶ４０）の複製開始点を含む。細胞系ＣＯＳ−７
は、開始点欠失ＳＶ４０ウイルスで形質転換されたアカ
ゲザル細胞系ＣＶ−１から誘導されたものである。した
がって、ＳＶ４０複製開始点を含むプラスミドは増幅さ
れて、免疫抱合体の産生が向上すると考えられる。上清
を７２時間後に集めて、ＥＧＦ−レセプター結合および
ケモカイン濃度についてＥＬＩＳＡによって調べた。 免疫抱合体の恒常的発現 免疫抱合体の発現のための組み換え構築体を含むベクタ
ーを、適当な宿主細胞に導入する。重鎖および軽鎖構築
体を同一または別々のベクターに入れることができる。
後者の場合は、両ベクターはネオマイシン耐性またはデ
ヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）などの同一の選択
マーカーまたは二つの異なる選択マーカーを両ベクター
の選択検出のために含ませればよい。ＤＨＦＲマーカー
の選択は、ＣＨＯ／ＤＨＦＲ−などのＤＨＦＲ陰性細胞
系においてのみ可能である。混合細胞集団を、ＥＧＦ−
レセプター特異性ＥＬＩＳＡを用いて免疫抱合体の発現
について分析する。陽性モノクローナルについてのさら
なる選択を限定希釈クローニングによって行う。 ＭＡｂ４２５ケモカイン免疫抱合体の精製 宿主細胞によって産生されたＭＡｂ４２５免疫抱合体を
集めて、例えば標的抗原、抗サイトカイン抗体または抗
イディオタイプ抗体などを用いるアフィニティークロマ
トグラフィーなどの適当な方法によって精製することが
できる（例えばHarlow、 Lane、前出）。
【００５９】本発明では、精製は、標準法（例えば、Ko
stelny et al.、 J. Immunol.、 148、1547、 1992）によっ
てＭＡｂ４２５から生成された抗イディオタイプ抗体に
よって達成された。
stelny et al.、 J. Immunol.、 148、1547、 1992）によっ
てＭＡｂ４２５から生成された抗イディオタイプ抗体に
よって達成された。
【００６０】純正のＦｖ免疫抱合体を得るために、タン
パク質発現に適する大腸菌株を発現プラスミドによって
形質転換させた（以下を参照されたい）。細胞をＯＤ
578＝０．５になるまで増殖させて、イソプロピル−β
−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）（１ｍＭ）
で誘導した。細胞を一晩増殖させて、上清および細胞を
回収した。上清を標準法で調製した抗ＭＡｂ４２５抗イ
ディオタイプカラムに供する。カラムを０．５Ｍ Ｎａ
Ｃｌ−燐酸塩緩衝溶液で洗浄して、結合したタンパク質
を１００ｍＭグリシン−０．５Ｍ ＮａＣｌを用いてｐ
Ｈ２．５で溶出した。溶出された液を２．５Ｍトリス
（ｐＨ８．０）で直ちに中和した。ＭＡｂ４２５−ＣＨ
１−ＩＬ−８を含むフラクションを集めて、濃縮して、
ＰＢＳに対して透析した。 Ｆａｂ４２５−ケモカインおよびＦｖ−ケモカイン融合
タンパク質発現のための原核細胞発現ベクターの構築 ＦｖフラグメントをGlockshuberら（Biochemistry 29、
1362-1367、 1990）の記述にしたがって作出した。軽鎖
および重鎖ＦｄフラグメントまたはＦｖフラグメントを
コードするＤＮＡ配列物を、ｐＳＷ１ベクターの多クロ
ーニング部位に導入した。成熟軽鎖コード配列、および
重鎖成熟コード配列およびＦｖコード配列は、細菌性ｐ
ｅｌＢ遺伝子のリーダーペプチドの後に位置する。重鎖
コード配列は、ＮｃｏＩ（３´末端）部位を含む。ケモ
カインをコードするｃＤＮＡをＰＣＲによって修飾し
て、ＮｃｏＩ（５′末端）およびＮｏｔＩ（３′末端）
またはＥｃｏＲＩ（Ｆｖ融合のため）制限部位を導入し
た。ケモカイン遺伝子を枠内で重鎖のＣＨ１ドメインま
たはＦｖフラグメントに直接に融合させた。別法とし
て、（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｘ
（ｘは１〜４の数値）などのリンカーペプチドをＣＨ１
ドメインとケモカイン遺伝子との間に導入することがで
きる。これらのリンカーおよびそれらの調製法について
は文献で公知である（例えば、Curtis et al.、 Proc. N
atl. Acad. Sci. U.S.A.、 88、 5809、 1991）。
パク質発現に適する大腸菌株を発現プラスミドによって
形質転換させた（以下を参照されたい）。細胞をＯＤ
578＝０．５になるまで増殖させて、イソプロピル−β
−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）（１ｍＭ）
で誘導した。細胞を一晩増殖させて、上清および細胞を
回収した。上清を標準法で調製した抗ＭＡｂ４２５抗イ
ディオタイプカラムに供する。カラムを０．５Ｍ Ｎａ
Ｃｌ−燐酸塩緩衝溶液で洗浄して、結合したタンパク質
を１００ｍＭグリシン−０．５Ｍ ＮａＣｌを用いてｐ
Ｈ２．５で溶出した。溶出された液を２．５Ｍトリス
（ｐＨ８．０）で直ちに中和した。ＭＡｂ４２５−ＣＨ
１−ＩＬ−８を含むフラクションを集めて、濃縮して、
ＰＢＳに対して透析した。 Ｆａｂ４２５−ケモカインおよびＦｖ−ケモカイン融合
タンパク質発現のための原核細胞発現ベクターの構築 ＦｖフラグメントをGlockshuberら（Biochemistry 29、
1362-1367、 1990）の記述にしたがって作出した。軽鎖
および重鎖ＦｄフラグメントまたはＦｖフラグメントを
コードするＤＮＡ配列物を、ｐＳＷ１ベクターの多クロ
ーニング部位に導入した。成熟軽鎖コード配列、および
重鎖成熟コード配列およびＦｖコード配列は、細菌性ｐ
ｅｌＢ遺伝子のリーダーペプチドの後に位置する。重鎖
コード配列は、ＮｃｏＩ（３´末端）部位を含む。ケモ
カインをコードするｃＤＮＡをＰＣＲによって修飾し
て、ＮｃｏＩ（５′末端）およびＮｏｔＩ（３′末端）
またはＥｃｏＲＩ（Ｆｖ融合のため）制限部位を導入し
た。ケモカイン遺伝子を枠内で重鎖のＣＨ１ドメインま
たはＦｖフラグメントに直接に融合させた。別法とし
て、（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｘ
（ｘは１〜４の数値）などのリンカーペプチドをＣＨ１
ドメインとケモカイン遺伝子との間に導入することがで
きる。これらのリンカーおよびそれらの調製法について
は文献で公知である（例えば、Curtis et al.、 Proc. N
atl. Acad. Sci. U.S.A.、 88、 5809、 1991）。
【００６１】これらのベクターによって、機能的Ｆ（ａ
ｂ´）（＝ＣＨ１）およびＦｖケモカイン融合タンパク
質の大腸菌における効率的な発現が可能になる。軽鎖お
よび重鎖−ケモカイン融合タンパク質は、誘導性ｌａｃ
プロモーターのコントロール下にある単一のジシストロ
ンメッセンジャーＲＮＡ（Skerra and Plueckthun、 Sci
ence、 242、 1038-1040、 1988）上に位置する。したがっ
て、Ｆａｂ／Ｆｖ−融合タンパク質の発現は、培養条件
の要求に従って誘導することができる。両タンパク質の
ジシストロンメッセンジャーＲＮＡからの翻訳は等量の
Ｆｄ−ケモカイン融合タンパク質および軽鎖の合成にく
みするので、その結果、機能性Ｆａｂ／Ｆｖ−融合タン
パク質への正しい組立の確率が大きくなる。二つのポリ
ペプチドは大腸菌のペリプラズム中に分泌され、ここで
折り畳み、ジスルフィド結合の形成および機能性Ｆａｂ
４２５−ＣＨ１／Ｆｖ融合タンパク質への組立がなされ
る。細菌培養の延長によって、大腸菌の外膜が部分的に
透過性となり、タンパク質は培養培地中に分泌される。 ＭＡｂ４２５免疫抱合体の結合特性 ＭＡｂ４２５免疫抱合体の結合特性を、ＥＧＦレセプタ
ー特異性ＥＬＩＳＡによって決定した。すなわち、マイ
クロタイタープレートを精製ＥＧＦレセプターを用いて
４℃で一晩被覆した。プレートを、融合タンパク質を含
む上清または非抱合ＭＡｂフラグメントを含む上清とも
にインキュベートした。プレートを洗浄して非結合物質
を除去してから、ペルオキシダーゼと抱合させたヤギ抗
ヒトＩｇＧおよびＩｇＭ（重鎖および軽鎖）、次いで基
質とともにインキュベートすることによって、ＥＧＦレ
セプターに結合した抗体を検出した。結合したＥＧＦレ
セプター特異性タンパク質の量を４９０ｎｍで測定して
決定した。 ＭＡｂ４２５−ＩＬ−８免疫抱合体の生物学的活性 エフェクター細胞の分離 生物学的活性を決定するために、新鮮ヒト末梢血好中顆
粒球を健康な供血者からの全血からHaslettら（Am. J.
Pathol.、 119、 101-110、 1985）が既述した方法で分離
した。血漿を遠心分離して、赤血球をデキストラン沈殿
によって分離して、最後にリンパ球および白血球をパー
コール勾配遠心分離によって分離した。分離した好中球
を直ちに使用した。 走化能の決定 走化性の決定はFalkら（J. Immunol. Methods、 33、 239
-247、 1980）の記述に従って行った。すなわち、４８ウ
ェルボイデンチャンバーおよび５μｍ膜を用いた。精製
した好中球を、ＤＭＥＭ培地（ＤＭＥＭ、１％ペニシリ
ン、１％ストレプトマイシン、１０％ＦＣＳ、２ｍＭ
Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリ ウム、１０
ｍＭ ＨＥＰＥＳ）に１×１０6細胞／ｍｌの濃度で再
懸濁した。下方のウェルに上清または対照上清を含む融
合タンパク質を入れて、膜で被覆して、最後に上方のウ
ェルに細胞懸濁液を加える。３７℃で３０分間インキュ
ベーションした後、膜を除去して、２％グルタルジアル
デヒド中で１０分間固定した。次いで、膜に付着した細
胞をウェイゲルトの鉄ヘマトキシリン（シグマ診断薬）
中で３分間染色した。膜に結合した細胞数を顕微鏡下で
決定した。 好中球における酵素放出誘導能の決定 免疫抱合体の好中球での顆粒放出誘導能を評価するため
に、上清中のミエロペルオキシダーゼ活性をモニターし
た（Henson et al.、 J. Immunol.、 121、 851、1978）。
アッセイは、９６ウェルマイクロタイタープレート中で
５×１０5細胞／ウェルを用いて行った。刺激剤ととも
にインキュベート（３７℃）した後、プレートを遠心分
離して、無細胞上清を別の９６ウェルマイクロタイター
プレートに移した。無細胞上清をジアニシジン（基質と
して）とともにインキュベートして、吸光度を４９２ｎ
ｍで測定した。陽性の対照として、ＦＭＬＰを１０ー7Ｍ
濃度で用いた。全酵素含量を決定するために、刺激剤な
しの細胞をトリトンを用いて溶解した。活性を全酵素含
量に対するパーセントとして算出した（溶解）。 スーパーオキシド放出能の決定 チトクロムＣをＯ2ーで還元して、その吸光度を変化させ
る。吸光度の変化は、スパーオキシド活性の推定のため
の有用なマーカーとなる。アッセイはGuthrieら（J. Ex
p. Med.、 160、 1656-1671、 1984）の記述に従って５×
１０5細胞／ウェルを用いて９６ウェルマイクロタイタ
ープレート中で行った。刺激剤およびチトクロームＣと
ともにインキュベートした後、プレートを遠心分離し
て、上清の吸光度を５５０ｎｍで決定した。 さらなる免疫抱合体 上記のようにして、ケモカイン成分としてＭＩＰ−２α
およびＭＩＰ−２βを含んでなる抗ＥＧＦＲ−ＣＨ１、
−ＣＨ２、−ＣＨ３および−Ｆｖ免疫抱合体（制限部位
およびリンカーを有するもの／有しないもの）を調製し
て試験した。これらの構築体は、ＩＬ−８誘導体と同様
の性質を示す。 免疫抱合体の治療的使用 本発明の免疫抱合体は、治療のためにヒト患者に投与す
ることができる。したがって、本発明の目的は、上記お
よび請求項に記載の少なくとも一つの融合タンパク質を
活性組成分として、一つまたはそれ以上の薬剤学的に容
認し得る担体、賦形剤または希釈剤とともに含んでなる
薬剤調製物を提供することにある。
ｂ´）（＝ＣＨ１）およびＦｖケモカイン融合タンパク
質の大腸菌における効率的な発現が可能になる。軽鎖お
よび重鎖−ケモカイン融合タンパク質は、誘導性ｌａｃ
プロモーターのコントロール下にある単一のジシストロ
ンメッセンジャーＲＮＡ（Skerra and Plueckthun、 Sci
ence、 242、 1038-1040、 1988）上に位置する。したがっ
て、Ｆａｂ／Ｆｖ−融合タンパク質の発現は、培養条件
の要求に従って誘導することができる。両タンパク質の
ジシストロンメッセンジャーＲＮＡからの翻訳は等量の
Ｆｄ−ケモカイン融合タンパク質および軽鎖の合成にく
みするので、その結果、機能性Ｆａｂ／Ｆｖ−融合タン
パク質への正しい組立の確率が大きくなる。二つのポリ
ペプチドは大腸菌のペリプラズム中に分泌され、ここで
折り畳み、ジスルフィド結合の形成および機能性Ｆａｂ
４２５−ＣＨ１／Ｆｖ融合タンパク質への組立がなされ
る。細菌培養の延長によって、大腸菌の外膜が部分的に
透過性となり、タンパク質は培養培地中に分泌される。 ＭＡｂ４２５免疫抱合体の結合特性 ＭＡｂ４２５免疫抱合体の結合特性を、ＥＧＦレセプタ
ー特異性ＥＬＩＳＡによって決定した。すなわち、マイ
クロタイタープレートを精製ＥＧＦレセプターを用いて
４℃で一晩被覆した。プレートを、融合タンパク質を含
む上清または非抱合ＭＡｂフラグメントを含む上清とも
にインキュベートした。プレートを洗浄して非結合物質
を除去してから、ペルオキシダーゼと抱合させたヤギ抗
ヒトＩｇＧおよびＩｇＭ（重鎖および軽鎖）、次いで基
質とともにインキュベートすることによって、ＥＧＦレ
セプターに結合した抗体を検出した。結合したＥＧＦレ
セプター特異性タンパク質の量を４９０ｎｍで測定して
決定した。 ＭＡｂ４２５−ＩＬ−８免疫抱合体の生物学的活性 エフェクター細胞の分離 生物学的活性を決定するために、新鮮ヒト末梢血好中顆
粒球を健康な供血者からの全血からHaslettら（Am. J.
Pathol.、 119、 101-110、 1985）が既述した方法で分離
した。血漿を遠心分離して、赤血球をデキストラン沈殿
によって分離して、最後にリンパ球および白血球をパー
コール勾配遠心分離によって分離した。分離した好中球
を直ちに使用した。 走化能の決定 走化性の決定はFalkら（J. Immunol. Methods、 33、 239
-247、 1980）の記述に従って行った。すなわち、４８ウ
ェルボイデンチャンバーおよび５μｍ膜を用いた。精製
した好中球を、ＤＭＥＭ培地（ＤＭＥＭ、１％ペニシリ
ン、１％ストレプトマイシン、１０％ＦＣＳ、２ｍＭ
Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリ ウム、１０
ｍＭ ＨＥＰＥＳ）に１×１０6細胞／ｍｌの濃度で再
懸濁した。下方のウェルに上清または対照上清を含む融
合タンパク質を入れて、膜で被覆して、最後に上方のウ
ェルに細胞懸濁液を加える。３７℃で３０分間インキュ
ベーションした後、膜を除去して、２％グルタルジアル
デヒド中で１０分間固定した。次いで、膜に付着した細
胞をウェイゲルトの鉄ヘマトキシリン（シグマ診断薬）
中で３分間染色した。膜に結合した細胞数を顕微鏡下で
決定した。 好中球における酵素放出誘導能の決定 免疫抱合体の好中球での顆粒放出誘導能を評価するため
に、上清中のミエロペルオキシダーゼ活性をモニターし
た（Henson et al.、 J. Immunol.、 121、 851、1978）。
アッセイは、９６ウェルマイクロタイタープレート中で
５×１０5細胞／ウェルを用いて行った。刺激剤ととも
にインキュベート（３７℃）した後、プレートを遠心分
離して、無細胞上清を別の９６ウェルマイクロタイター
プレートに移した。無細胞上清をジアニシジン（基質と
して）とともにインキュベートして、吸光度を４９２ｎ
ｍで測定した。陽性の対照として、ＦＭＬＰを１０ー7Ｍ
濃度で用いた。全酵素含量を決定するために、刺激剤な
しの細胞をトリトンを用いて溶解した。活性を全酵素含
量に対するパーセントとして算出した（溶解）。 スーパーオキシド放出能の決定 チトクロムＣをＯ2ーで還元して、その吸光度を変化させ
る。吸光度の変化は、スパーオキシド活性の推定のため
の有用なマーカーとなる。アッセイはGuthrieら（J. Ex
p. Med.、 160、 1656-1671、 1984）の記述に従って５×
１０5細胞／ウェルを用いて９６ウェルマイクロタイタ
ープレート中で行った。刺激剤およびチトクロームＣと
ともにインキュベートした後、プレートを遠心分離し
て、上清の吸光度を５５０ｎｍで決定した。 さらなる免疫抱合体 上記のようにして、ケモカイン成分としてＭＩＰ−２α
およびＭＩＰ−２βを含んでなる抗ＥＧＦＲ−ＣＨ１、
−ＣＨ２、−ＣＨ３および−Ｆｖ免疫抱合体（制限部位
およびリンカーを有するもの／有しないもの）を調製し
て試験した。これらの構築体は、ＩＬ−８誘導体と同様
の性質を示す。 免疫抱合体の治療的使用 本発明の免疫抱合体は、治療のためにヒト患者に投与す
ることができる。したがって、本発明の目的は、上記お
よび請求項に記載の少なくとも一つの融合タンパク質を
活性組成分として、一つまたはそれ以上の薬剤学的に容
認し得る担体、賦形剤または希釈剤とともに含んでなる
薬剤調製物を提供することにある。
【００６２】通常、本発明の免疫抱合体は静脈注射によ
ってまたは非経口的に投与される。一般に、免疫抱合体
の投与量範囲は、所望の腫瘍抑制および腫瘍溶解効果が
得られるに十分の量である。投与量は、患者の年齢、状
態、性別、病気の程度によって異なり、０．１ｍｇ／ｋ
ｇ〜２００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ〜
１００ｍｇ／ｋｇ／用量の範囲で１日１回またはそれ以
上を１日または数日間投与することができる。
ってまたは非経口的に投与される。一般に、免疫抱合体
の投与量範囲は、所望の腫瘍抑制および腫瘍溶解効果が
得られるに十分の量である。投与量は、患者の年齢、状
態、性別、病気の程度によって異なり、０．１ｍｇ／ｋ
ｇ〜２００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ〜
１００ｍｇ／ｋｇ／用量の範囲で１日１回またはそれ以
上を１日または数日間投与することができる。
【００６３】非経口的投与のための調製物には、滅菌水
性溶液または非水性溶液、懸濁液および乳濁液が含まれ
る。非水性溶媒の例としては、プロピレングリコール、
ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、オ
レイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルおよび当
業者に公知のこれらの目的に適した他の溶媒があげられ
る。本発明の免疫抱合体は、生理学的に容認し得る担体
からなる組成物において使用することができる。それら
適当な担体の例としては、生理食塩水、ＰＢＳ、リンゲ
ル溶液または乳酸リンゲル溶液があげられる。保存剤お
よび他の添加剤、例えば抗生物質、抗酸化剤およびキレ
ート剤などを薬剤調製物に加えることも可能である。
性溶液または非水性溶液、懸濁液および乳濁液が含まれ
る。非水性溶媒の例としては、プロピレングリコール、
ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、オ
レイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルおよび当
業者に公知のこれらの目的に適した他の溶媒があげられ
る。本発明の免疫抱合体は、生理学的に容認し得る担体
からなる組成物において使用することができる。それら
適当な担体の例としては、生理食塩水、ＰＢＳ、リンゲ
ル溶液または乳酸リンゲル溶液があげられる。保存剤お
よび他の添加剤、例えば抗生物質、抗酸化剤およびキレ
ート剤などを薬剤調製物に加えることも可能である。
【００６４】本発明の薬剤調製物は、メラノーマ、神経
膠腫および癌腫、さらに血液腫瘍および固形腫瘍を含む
あらゆる種類の腫瘍の治療に適している。 （図面および表についての説明） 表１ 真核細胞発現のための融合タンパク質を作出する
ための、ＮｃｏＩまたはＢｃｌＩ部位をつくるためのＰ
ＣＲに使用するプライマーの配列を示す。
膠腫および癌腫、さらに血液腫瘍および固形腫瘍を含む
あらゆる種類の腫瘍の治療に適している。 （図面および表についての説明） 表１ 真核細胞発現のための融合タンパク質を作出する
ための、ＮｃｏＩまたはＢｃｌＩ部位をつくるためのＰ
ＣＲに使用するプライマーの配列を示す。
【００６５】図１ 抗体−サイトカイン免疫抱合体のモ
デルを示す説明図である。
デルを示す説明図である。
【００６６】Ｃ＝サイトカイン、ＶＨ＝重鎖可変部、Ｖ
Ｌ＝軽鎖可変部、ＣＨ＝重鎖定常部、ＣＬ＝軽鎖定常部 図２ ＣＯＳ−７トランスフェクション上清におけるＭ
Ａｂ４２５を抗ＥＧＦ−Ｒ ＥＬＩＳＡによって示した
説明図である。
Ｌ＝軽鎖可変部、ＣＨ＝重鎖定常部、ＣＬ＝軽鎖定常部 図２ ＣＯＳ−７トランスフェクション上清におけるＭ
Ａｂ４２５を抗ＥＧＦ−Ｒ ＥＬＩＳＡによって示した
説明図である。
【００６７】四角：ＭＡｂ４２５−ＣＨ３上清 三角：ＭＡｂ４２５−ＣＨ２−（ＮｃｏＩ）−ＩＬ−８
上清 逆三角：ＭＡｂ４２５−ＣＨ２−（ＢｃｌＩ）−ＩＬ−
８上清 丸：ｐＨＣＭＶ上清 横軸：希釈は上清 縦軸：４９０ｎｍにおける吸光度 図３ ＣＯＳ−７トランスフェクション上清による走化
性の誘導を示す説明図である。
上清 逆三角：ＭＡｂ４２５−ＣＨ２−（ＢｃｌＩ）−ＩＬ−
８上清 丸：ｐＨＣＭＶ上清 横軸：希釈は上清 縦軸：４９０ｎｍにおける吸光度 図３ ＣＯＳ−７トランスフェクション上清による走化
性の誘導を示す説明図である。
【００６８】カラム１：対照ＤＭＥＭ／ＰＳ カラム２：非希釈ｐＨＣＭＶ上清 カラム３：ＭＡｂ４２５−ＣＨ３上清１：１４希釈（Ｅ
ＧＦ−ｒ−ＥＬＩＳＡの結果による） カラム４：ＭＡｂ４２５−ＣＨ３上清１：２８希釈（Ｅ
ＧＦ−ｒ−ＥＬＩＳＡの結果による） カラム５：非希釈ＭＡｂ４２５−ＣＨ２−（ＢｃｌＩ）
−ＩＬ−８上清（１．７６×１０ー10モル／Ｌ*） カラム６：ＭＡｂ４２５−ＣＨ２−（ＢｃｌＩ）−ＩＬ
−８上清１：２希釈 カラム７：非希釈ＭＡｂ４２５−ＣＨ２−（ＮｃｏＩ）
−ＩＬ−８上清（２．０×１０ー10モル／Ｌ*） カラム８：ＭＡｂ４２５−ＣＨ２−（ＮｃｏＩ）−ＩＬ
−８上清１：２希釈*ＩＬ−８濃度をＥＬＩＳＡ（アメ
ルシャム）によって決定 縦軸：計数フィールド当たりの細胞数 図４ 精製ＩＬ−８による走化性の誘導を示す説明図で
ある。
ＧＦ−ｒ−ＥＬＩＳＡの結果による） カラム４：ＭＡｂ４２５−ＣＨ３上清１：２８希釈（Ｅ
ＧＦ−ｒ−ＥＬＩＳＡの結果による） カラム５：非希釈ＭＡｂ４２５−ＣＨ２−（ＢｃｌＩ）
−ＩＬ−８上清（１．７６×１０ー10モル／Ｌ*） カラム６：ＭＡｂ４２５−ＣＨ２−（ＢｃｌＩ）−ＩＬ
−８上清１：２希釈 カラム７：非希釈ＭＡｂ４２５−ＣＨ２−（ＮｃｏＩ）
−ＩＬ−８上清（２．０×１０ー10モル／Ｌ*） カラム８：ＭＡｂ４２５−ＣＨ２−（ＮｃｏＩ）−ＩＬ
−８上清１：２希釈*ＩＬ−８濃度をＥＬＩＳＡ（アメ
ルシャム）によって決定 縦軸：計数フィールド当たりの細胞数 図４ 精製ＩＬ−８による走化性の誘導を示す説明図で
ある。
【００６９】縦軸：計数フィールド当たりの細胞数 横軸：ＩＬ−８濃度（モル／Ｌ） 図５ ＭＡｂ４２５−ＣＨ１−ＩＬ−８（大腸菌）によ
る走化性の誘導を示す説明図である。
る走化性の誘導を示す説明図である。
【００７０】丸：大腸菌中で発現されたＭＡｂ４２５−
ＣＨ１−ＩＬ−８ 四角：大腸菌中で発現されたＭＡｂ４２５−Ｆ（ａｂ
´） 三角：対照デュルベッコ培地／ＢＳＡ 縦軸：計数フィールド当たりの細胞数 横軸：濃度（モル／Ｌ） 図６ ＣＯＳ−７トランスフェクション上清によるスー
パーオキシド放出の誘導を示す説明図である。
ＣＨ１−ＩＬ−８ 四角：大腸菌中で発現されたＭＡｂ４２５−Ｆ（ａｂ
´） 三角：対照デュルベッコ培地／ＢＳＡ 縦軸：計数フィールド当たりの細胞数 横軸：濃度（モル／Ｌ） 図６ ＣＯＳ−７トランスフェクション上清によるスー
パーオキシド放出の誘導を示す説明図である。
【００７１】カラム１：非刺激細胞 カラム２：ＩＬ−８ １０ー7Ｍ カラム３：非希釈ＭＡｂ４２５−ＣＨ２−（ＮｃｏＩ）
−ＩＬ−８上清（２．０×１０ー10モル／Ｌ*） カラム４：非希釈ＭＡｂ４２５−ＣＨ２−（ＢｃｌＩ）
−ＩＬ−８上清（１．７６×１０ー10モル／Ｌ*） カラム５：非希釈ＭＡｂ４２５−ＣＨ３上清（０モル／
Ｌ*） * ＩＬ−８濃度はＥＬＩＳＡ（アメルシャム）によっ
て決定した。
−ＩＬ−８上清（２．０×１０ー10モル／Ｌ*） カラム４：非希釈ＭＡｂ４２５−ＣＨ２−（ＢｃｌＩ）
−ＩＬ−８上清（１．７６×１０ー10モル／Ｌ*） カラム５：非希釈ＭＡｂ４２５−ＣＨ３上清（０モル／
Ｌ*） * ＩＬ−８濃度はＥＬＩＳＡ（アメルシャム）によっ
て決定した。
【００７２】縦軸：５５０ｎｍにおける吸光度 図７ ＣＯＳ−７トランスフェクション上清によるＭＰ
Ｏ放出の誘導を示す説明図である。
Ｏ放出の誘導を示す説明図である。
【００７３】カラム１：非刺激細胞 カラム２：シトカラシンＢ刺激細胞 カラム３：ＩＬ−８ １０ー7Ｍ カラム４：非希釈ＭＡｂ４２５−ＣＨ３上清 カラム５：ＭＡｂ４２５−ＣＨ３上清１：２希釈 カラム６：非希釈ＭＡｂ４２５−ＣＨ２−（ＮｃｏＩ）
−ＩＬ−８上清 カラム７：ＭＡｂ４２５−ＣＨ２−（ＮｃｏＩ）−ＩＬ
−８上清１：２希釈 カラム８：非希釈ＭＡｂ４２５−ＣＨ２−（ＢｃｌＩ）
−ＩＬ−８上清 カラム９：ＭＡｂ４２５−ＣＨ２−（ＢｃｌＩ）−ＩＬ
−８上清１：２希釈 縦軸：全ＭＰＯ量（１００％）と比較した％ＭＰＯ活性 ［配列表］ （１）一般的情報 （ｉ）出願者 （Ａ）名称：メルク・パテントＧｍｂＨ （Ｂ）町名：フランクフルター・ストリート２５０ （Ｃ）都市：ダルムシュタット （Ｅ）国名：ドイツ （Ｆ）郵便番号（ＺＩＰ）：６４２７１ （Ｇ）電話：４９−６１５１−７２７０２２ （Ｉ）テレファックス：４９−６１５１−７２７１９１ （ｉｉ）発明の名称：免疫抱合体ＩＩ （ｉｉｉ）配列の数：８ （ｉｖ）コンピュータ解読型 （Ａ）媒体：フロッピーディスク （Ｂ）コンピュータ：ＩＢＭ・ＰＣ互換機 （Ｃ）オペレーティング・システム：ＰＣ−ＤＯＳ／Ｍ
Ｓ−ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウェア：ＰｅｔｅｎｔＩｎ Ｒｅｌｅａｓ
ｅ ＃１．０、バージョン＃１．３０（ＥＰＯ） （２）配列ＩＤ番号１に関する情報： （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：１７塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の種類：ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）仮定：無 （ｉｖ）アンチセンス：無 （ｖ）フラグメント型：Ｎ末端 （ｖｉ）起源： （Ａ）生物：ｃ−ガンマ１ ５´プライマー （Ｂ）菌株：大腸菌 （ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号１： ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧ ＣＴＡＴＧＡＣ １７ （２）配列ＩＤ番号２に関する情報： （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：３０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の種類：ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）仮定：無 （ｉｖ）アンチセンス：無 （ｖ）フラグメント型：Ｎ末端 （ｖｉ）起源： （Ａ）生物：ｃ−ガンマ１ ３´プライマー （Ｂ）菌株：大腸菌 （ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号２： ＴＧＡＴＣＣＡＴＧＧ ＣＴＴＴＧＧＡＧＡＴ ＧＧＴＴＴＴＣＴＣＧ ３０ （２）配列ＩＤ番号３に関する情報： （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：２７塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の種類：ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）仮定：無 （ｉｖ）アンチセンス：無 （ｖ）フラグメント型：Ｎ末端 （ｖｉ）起源： （Ａ）生物：ＩＬ−８ ５´プライマー （Ｂ）菌株：大腸菌 （ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号３： ＧＡＴＣＴＡＣＣＴＧ ＣＣＡＴＧＧＧＴＧＣ ＴＡＡＡＧＡＡ ２７ （２）配列ＩＤ番号４に関する情報： （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：１７塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の種類：ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）仮定：無 （ｉｖ）アンチセンス：無 （ｖ）フラグメント型：Ｎ末端 （ｖｉ）起源： （Ａ）生物：ＩＬ−８ ３´プライマー （Ｂ）菌株：大腸菌 （ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号４： ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣ ＧＧＣＣＡＧＴ １７ （２）配列ＩＤ番号５に関する情報： （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：１７塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の種類：ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）仮定：無 （ｉｖ）アンチセンス：無 （ｖ）フラグメント型：Ｎ末端 （ｖｉ）起源： （Ａ）生物：ｃ−ガンマ１ ５´プライマー （Ｂ）菌株：大腸菌 （ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号５： ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧ ＣＴＡＴＧＡＣ １７ （２）配列ＩＤ番号６に関する情報： （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：３０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の種類：ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）仮定：無 （ｉｖ）アンチセンス：無 （ｖ）フラグメント型：Ｎ末端 （ｖｉ）起源： （Ａ）生物：ｃ−ガンマ１ ３´プライマー （Ｂ）菌株：大腸菌 （ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号６： ＣＧＣＧＴＧＡＴＣＡ ＣＴＴＴＧＧＣＴＴＴ ＧＧＡＧＡＴＧＧＴＴ ３０ （２）配列ＩＤ番号７に関する情報： （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：３０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の種類：ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）仮定：無 （ｉｖ）アンチセンス：無 （ｖ）フラグメント型：Ｎ末端 （ｖｉ）起源： （Ａ）生物：ＩＬ−８ ５´プライマー （Ｂ）菌株：大腸菌 （ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号７： ＣＴＣＧＴＧＡＴＣＡ ＡＡＧＡＡＣＴＴＡＧ ＡＴＧＴＣＡＡＴＧＣ ３０ （２）配列ＩＤ番号８に関する情報： （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：１７塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の種類：ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）仮定：無 （ｉｖ）アンチセンス：無 （ｖ）フラグメント型：Ｎ末端 （ｖｉ）起源： （Ａ）生物：ＩＬ−８ ３´プライマー （Ｂ）菌株：大腸菌 （ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号８： ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣ ＧＧＣＣＡＧＴ １７
−ＩＬ−８上清 カラム７：ＭＡｂ４２５−ＣＨ２−（ＮｃｏＩ）−ＩＬ
−８上清１：２希釈 カラム８：非希釈ＭＡｂ４２５−ＣＨ２−（ＢｃｌＩ）
−ＩＬ−８上清 カラム９：ＭＡｂ４２５−ＣＨ２−（ＢｃｌＩ）−ＩＬ
−８上清１：２希釈 縦軸：全ＭＰＯ量（１００％）と比較した％ＭＰＯ活性 ［配列表］ （１）一般的情報 （ｉ）出願者 （Ａ）名称：メルク・パテントＧｍｂＨ （Ｂ）町名：フランクフルター・ストリート２５０ （Ｃ）都市：ダルムシュタット （Ｅ）国名：ドイツ （Ｆ）郵便番号（ＺＩＰ）：６４２７１ （Ｇ）電話：４９−６１５１−７２７０２２ （Ｉ）テレファックス：４９−６１５１−７２７１９１ （ｉｉ）発明の名称：免疫抱合体ＩＩ （ｉｉｉ）配列の数：８ （ｉｖ）コンピュータ解読型 （Ａ）媒体：フロッピーディスク （Ｂ）コンピュータ：ＩＢＭ・ＰＣ互換機 （Ｃ）オペレーティング・システム：ＰＣ−ＤＯＳ／Ｍ
Ｓ−ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウェア：ＰｅｔｅｎｔＩｎ Ｒｅｌｅａｓ
ｅ ＃１．０、バージョン＃１．３０（ＥＰＯ） （２）配列ＩＤ番号１に関する情報： （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：１７塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の種類：ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）仮定：無 （ｉｖ）アンチセンス：無 （ｖ）フラグメント型：Ｎ末端 （ｖｉ）起源： （Ａ）生物：ｃ−ガンマ１ ５´プライマー （Ｂ）菌株：大腸菌 （ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号１： ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧ ＣＴＡＴＧＡＣ １７ （２）配列ＩＤ番号２に関する情報： （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：３０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の種類：ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）仮定：無 （ｉｖ）アンチセンス：無 （ｖ）フラグメント型：Ｎ末端 （ｖｉ）起源： （Ａ）生物：ｃ−ガンマ１ ３´プライマー （Ｂ）菌株：大腸菌 （ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号２： ＴＧＡＴＣＣＡＴＧＧ ＣＴＴＴＧＧＡＧＡＴ ＧＧＴＴＴＴＣＴＣＧ ３０ （２）配列ＩＤ番号３に関する情報： （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：２７塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の種類：ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）仮定：無 （ｉｖ）アンチセンス：無 （ｖ）フラグメント型：Ｎ末端 （ｖｉ）起源： （Ａ）生物：ＩＬ−８ ５´プライマー （Ｂ）菌株：大腸菌 （ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号３： ＧＡＴＣＴＡＣＣＴＧ ＣＣＡＴＧＧＧＴＧＣ ＴＡＡＡＧＡＡ ２７ （２）配列ＩＤ番号４に関する情報： （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：１７塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の種類：ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）仮定：無 （ｉｖ）アンチセンス：無 （ｖ）フラグメント型：Ｎ末端 （ｖｉ）起源： （Ａ）生物：ＩＬ−８ ３´プライマー （Ｂ）菌株：大腸菌 （ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号４： ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣ ＧＧＣＣＡＧＴ １７ （２）配列ＩＤ番号５に関する情報： （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：１７塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の種類：ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）仮定：無 （ｉｖ）アンチセンス：無 （ｖ）フラグメント型：Ｎ末端 （ｖｉ）起源： （Ａ）生物：ｃ−ガンマ１ ５´プライマー （Ｂ）菌株：大腸菌 （ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号５： ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧ ＣＴＡＴＧＡＣ １７ （２）配列ＩＤ番号６に関する情報： （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：３０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の種類：ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）仮定：無 （ｉｖ）アンチセンス：無 （ｖ）フラグメント型：Ｎ末端 （ｖｉ）起源： （Ａ）生物：ｃ−ガンマ１ ３´プライマー （Ｂ）菌株：大腸菌 （ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号６： ＣＧＣＧＴＧＡＴＣＡ ＣＴＴＴＧＧＣＴＴＴ ＧＧＡＧＡＴＧＧＴＴ ３０ （２）配列ＩＤ番号７に関する情報： （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：３０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の種類：ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）仮定：無 （ｉｖ）アンチセンス：無 （ｖ）フラグメント型：Ｎ末端 （ｖｉ）起源： （Ａ）生物：ＩＬ−８ ５´プライマー （Ｂ）菌株：大腸菌 （ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号７： ＣＴＣＧＴＧＡＴＣＡ ＡＡＧＡＡＣＴＴＡＧ ＡＴＧＴＣＡＡＴＧＣ ３０ （２）配列ＩＤ番号８に関する情報： （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：１７塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の種類：ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）仮定：無 （ｉｖ）アンチセンス：無 （ｖ）フラグメント型：Ｎ末端 （ｖｉ）起源： （Ａ）生物：ＩＬ−８ ３´プライマー （Ｂ）菌株：大腸菌 （ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号８： ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣ ＧＧＣＣＡＧＴ １７
【図１】抗体−サイトカイン免疫抱合体のモデルを示す
説明図である。
説明図である。
【図２】ＣＯＳ−７トランスフェクション上清における
ＭＡｂ４２５を抗ＥＧＦ−ＲＥＬＩＳＡによって示した
説明図である。
ＭＡｂ４２５を抗ＥＧＦ−ＲＥＬＩＳＡによって示した
説明図である。
【図３】ＣＯＳ−７トランスフェクション上清による走
化性の誘導を示す説明図である。
化性の誘導を示す説明図である。
【図４】精製ＩＬ−８による走化性の誘導を示す説明図
である。
である。
【図５】ＭＡｂ４２５−ＣＨ１−ＩＬ−８（大腸菌）に
よる走化性の誘導を示す説明図である。
よる走化性の誘導を示す説明図である。
【図６】ＣＯＳ−７トランスフェクション上清によるス
ーパーオキシド放出の誘導を示す説明図である。
ーパーオキシド放出の誘導を示す説明図である。
【図７】ＣＯＳ−７トランスフェクション上清によるＭ
ＰＯ放出の誘導を示す説明図である。
ＰＯ放出の誘導を示す説明図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 39/44 Ｃ０７Ｋ 16/46 8318−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 9358−4Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ヴォルフガング ヘルツァー ドイツ連邦共和国 64293 ダルムシュタ ット フランクフルター シュトラーセ 250 エー．メルク内 (72)発明者 イルカ フォン ヘーゲン ドイツ連邦共和国 64293 ダルムシュタ ット フランクフルター シュトラーセ 250 エー．メルク内 (72)発明者 ヴォルフガング シュトリットマッター ドイツ連邦共和国 64293 ダルムシュタ ット フランクフルター シュトラーセ 250 エー．メルク内 (72)発明者 ジークフリート マック ドイツ連邦共和国 64293 ダルムシュタ ット フランクフルター シュトラーセ 250 エー．メルク内
Claims (14)
- 【請求項１】 上皮増殖因子レセプター（ＥＧＦＲ）の
抗原エピトープを有する腫瘍細胞に対するモノクローナ
ル抗体またはそのフラグメントおよび該抗体または抗体
フラグメントと融合するケモカインタンパク質からなる
免疫抱合体。 - 【請求項２】 ケモカインがＣ−Ｘ−Ｃ族から選択され
ることを特徴とする請求項１に記載の免疫抱合体。 - 【請求項３】 ケモカインがＩＬ−８である請求項２に
記載の免疫抱合体。 - 【請求項４】 抗体が抗体重鎖の可変部、定常部のＣＨ
１ドメインおよび適当な軽鎖から本質的になるＦａｂフ
ラグメントまたはＦ（ａｂ′）２フラグメントである請
求項１から３のいずれかに記載の免疫抱合体（抗体−Ｃ
Ｈ１抱合体）。 - 【請求項５】 抗体が抗体重鎖の可変部、定常部のＣＨ
１およびＣＨ２ドメインおよび適当な軽鎖から本質的に
なる抗体フラグメントである請求項１から３のいずれか
に記載の免疫抱合体（抗体−ＣＨ２抱合体）。 - 【請求項６】 抗体が抗体重鎖の可変部、定常部のＣＨ
１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインおよび適当な軽鎖から
本質的になる抗体フラグメントである請求項１から３の
いずれかに記載の免疫抱合体（抗体−ＣＨ３抱合体）。 - 【請求項７】 抗体が抗体重鎖の可変部、適当な軽鎖な
らびに重鎖および軽鎖に結合するポリペプチド配列から
本質的になる請求項１から３のいずれかに記載の免疫抱
合体（抗体−Ｆｖ抱合体）。 - 【請求項８】 抗体／抗体フラグメントと生物学的に活
性のリガンドとの間のＤＮＡ制限部位を推定できるアミ
ノ酸（配列）を含んでなり、該制限部位が完全な融合構
築体中で唯一特異であることを特徴とする請求項１から
６のいずれか１項に記載の免疫抱合体。 - 【請求項９】 抗体／抗体フラグメントと生物学的に活
性のリガンドとの間のリンカーペプチドを含んでなる請
求項１から７のいずれか１項に記載の免疫抱合体。 - 【請求項１０】 抗体または抗体フラグメントがネズ
ミ、ヒト化またはキメラＭＡｂ４２５に由来する請求項
１から８のいずれか１項に記載の免疫抱合体。 - 【請求項１１】 ＭＡｂ４２５−ＣＨ１−ＩＬ−８、Ｍ
Ａｂ４２５−ＣＨ２−（ＮｃｏＩ）−ＩＬ−８、ＭＡｂ
４２５−ＣＨ２−（ＢｃｌＩ）−ＩＬ−８、ＭＡｂ４２
５−Ｆｖ−ＩＬ−８およびＭＡｂ４２５−ＣＨ３−ＩＬ
−８からなる群から選択される免疫抱合体。 - 【請求項１２】 請求項１から１０のいずれか１項に記
載の免疫抱合体の調製法であって、抗体または抗体フラ
グメントおよび生物活性を有するリガンドをそれぞれコ
ードするＤＮＡ配列を所望融合ＤＮＡ配列と相補的なオ
リゴヌクレオチドを用いて一本鎖ＤＮＡ上に融合させ
て、得られる構築体を発現ベクターに導入してそれで宿
主細胞を形質転換して、その宿主細胞を栄養溶液中で培
養して、融合タンパク質を発現することからなる調製
法。 - 【請求項１３】 請求項１から１０のいずれか１項に記
載の少なくとも一つの免疫抱合体および生物学的に容認
し得る担体を含んでなる薬剤組成物。 - 【請求項１４】 腫瘍を標的とした薬物の調製のための
請求項１から１０項のいずれか１項に記載の免疫抱合体
の使用。
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