JPH08510240A - Ｃ型肝炎ウイルスｅ２／ｎｓ１領域の保存モチーフ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 推定Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）糖タンパク質E2/NS1のほぼアミノ酸384からほぼアミノ酸414の間の超可変領域（E2HV）は、HCVの急速に進化する領域であり、そして正の免疫選択下にあるようである。この超可変領域内に新規発見されたモチーフは、免疫原性であり、アミノ酸特性に関して保存されている。多くの分離株において、このモチーフは、アミノ酸401から406あるいは407の間に存在する。このモチーフの発見は、HCVを処置および診断するためのさらなる材料および方法を可能とする。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｃ型肝炎ウイルスE2/NS1領域の保存モチーフ 技術分野 本発明は、概してＣ型肝炎ウイルス（HCV）に関し、さらに詳細には、E2/NS1 領域内の免疫学的に重要なモチーフの発見に関する。発明の背景 Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）は、輸血後の非Ａ型、非Ｂ型肝炎（NANBH）の主要な 原因因子として同定された。ウイルスゲノム配列を得るための材料および方法は 公知である。PCT公開第WO89/04669号、第WO90/11089号、および第WO90/14436号 を参照のこと。HCVに関する全般的な情報は、Houghtonら、Heoatology（1991）1 4 ：381-388を参照のこと。 HCVゲノムの分子の特徴づけは、HCVゲノムが、枠内の最初のメチオニンコドン で始まる約3000アミノ酸（aa）の長いポリペプチドをコードし得る、長い翻訳読 み取り枠（ORF）を含有する約9,500のヌクレオチドを有する正極性のRNA分子で あることを示す。推定エンベロープ糖タンパク質E2/NS1（またはE2と呼ばれる） のアミノ末端に位置する超可変ドメインが存在しており、PCT公開第WO93/016126 号；Weinerら、Virology（1991）180：842-848；Weinerら、Proc．Natl．Acad． Sci．USA （1992）89：3468-3472；Weinerら、Vaccines 92：303-30 8，Cold Spring Harbor Laboratoryを参照のこと。 他のRNAウイルスについて観察されるように、誤りやすいレプリカーゼおよびD NA複製時に作動する修復機構の非存在による、HCVゲノムの実質的な流動性が存 在する。１つの感染個体においてさえも、HCVゲノムは同質種として存在しない 。むしろ、密接に関連するがやはり異質ゲノムである疑似種分布として存在する 。Martellら、J．Virol．（1992）66：3225-3229。さらに、宿主選択および急速 に変異するゲノムの適応のプロセスは、多様な（まだ流動性の）HCV遺伝子型の 進化を導く。少なくとも４つの異なるHCV遺伝子型が、全長配列のヌクレオチド およびアミノ酸の関連性の実際の程度に基づいて区別され得、さらに異なる遺伝 子型が、部分配列に基づいて同定された。Moriら、Biochem．Bioohys．Res．Com m． （1992）183：334-342；Chanら、J．Gen．Virol．（1992）73：1131；Chaら 、Proc．Natl．Acad．Sci．USA（1992）89：7144-7148。 発明の開示 本発明は、HCV感染を処置するための新規なワクチン戦略およびHCV診断のため のアッセイに向けられている。 アミノ酸約384位とアミノ酸約414位との間のE2/NS1（E2HV）の超可変領域は、 HCVの急速に進化する領域（rapidly evolving region）であり、正の免疫選択下 にあるようである。本発明は、免疫原性であって、アミノ酸特性に関して保存さ れる、モチーフのこのサブ領域内での存在に関する。E2HVアミ ノ酸配列はこのモチーフ内で同一である必要はないが、一定のパターンが存在す る。HCV1および他の多くの分離株において、このモチーフは、アミノ酸約401位 から407位で認められる。免疫原性ポリペプチド中のこのモチーフの存在は、抗 体結合によって検出可能である。 このモチーフのE2/NS1超可変領域内での発見は、直接免疫あるいは受動免疫に よって、HCV処置のために使用され得るポリペプチドおよび抗体を含む材料の生 産戦略を可能とする。さらに、イムノアッセイあるいは核酸アッセイを使用する 診断方法が、これに包含される。 従って、本発明の１つの局面では、Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）感染処置のため に個体を受動免疫する方法が提供され、この方法は、アミノ酸配列aa1-aa2-aa3- aa4-aa5-aa6を含むモチーフに結合し得る抗体を含有する抗体組成物を、個体に 投与することを包含する。ここで、aa1は、S、G、A、D、K、R、あるいはTであり ；aa2は、L、F、I、M、あるいはWであり；aa3は、FあるいはLであり；aa4は、任 意のアミノ酸であり；aa5は、任意のアミノ酸であり；そして、aa6は、Gあるい はAである。さらなる実施態様では、aa7が存在し、aa6に接続され、aa7は、A、P 、あるいはSである。 本発明のさらなる局面では、抗原決定基を認識し得る抗体が提供され、その抗 原決定基は、アミノ酸配列aa1-aa2-aa3-aa4-aa5-aa6を含み、ここで、aa1は、S 、G、A、D、K、R、あるいはTであり；aa2は、L、F、I、M、あるいはWであり；aa 3 は、FあるいはLであり；aa4は、任意のアミノ酸であり；aa5は、任意のアミノ酸 であり；そして、aa6は、GあるいはAである。さらなる実施態様では、aa7が存在 し、aa6に接続され、aa7は、A、P、あるいはSである。 本発明のさらなる局面では、aa1-aa2-aa3-aa4-aa5-aa6により特徴づけられる モチーフを有する免疫原性ポリペプチドが提供され、ここで、aa1は、S、G、A、 D、K、R、あるいはTであり；aa2は、L、F、I、M、あるいはWであり；aa3は、Fあ るいはLであり；aa4は、任意のアミノ酸であり；aa5は、任意のアミノ酸であり ；そして、aa6は、GあるいはAであり、但しこのモチーフは、1993年5月12日の既 知HCV分離株の天然に存在するE2HVドメインの31アミノ酸内に含まれない。さら なる実施態様では、aa7が存在し、aa6に接続され、aa7は、A、P、あるいはSであ る。 本発明のさらなる局面では、以下の（1）および（2）を含有するワクチンが提 供される：（1）aa1-aa2-aa3-aa4-aa5-aa6により特徴づけられるモチーフを含む 、少なくとも１つの免疫原性ポリペプチド（ここで、aa1は、S、G、A、D、K、R 、あるいはTであり；aa2は、L、F、I、M、あるいはWであり；aa3は、FあるいはL であり；aa4は、任意のアミノ酸であり；aa5は、任意のアミノ酸であり；そして 、aa6は、G、あるいはAである）；および、（2）薬学的に受容可能なキャリア。 本発明のさらなる局面では、HCV感染個体の処置方法が提供され、この方法は 、上記ワクチンを個体に投与することを包 含する。 本発明のさらなる局面では、生物学的試料中の抗Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）抗 体を検出するためのイムノアッセイ方法が提供され、この方法は、以下の（a） および（b）を包含する：（a）抗HCV抗体を含有することが予想される抗体含有 の生物学的試料と、上記のような免疫原性ポリペプチドを含有するプローブ抗原 とをインキュベートして、抗体-抗原複合体形成を行わせ得る；（b）プローブ抗 原を含有する抗体-抗原複合体の検出。図面の簡単な説明 図１は、HCVの遺伝子構成の図式である。 図２は、90HCV分離株のE2HV配列を示す。 図３は、HCV感染後に引き続いて起こる個体からのHCV E2HV配列データを示す 。 図４は、E2HVの384位から407位の各アミノ酸の保存割合（パーセント）を示す 。 図５は、HCV1 E2HV領域に広がるペプチドで免疫したヒツジ由来の血清の同じ 領域に広がる８量体重複ミモトープ（mimotope）への結合を示す、エピトープマ ッピングの棒グラフを示す。 図６は、モノクローナル抗チロキシン抗体のE2HV領域の重複ペプチドへの結合 を示す、エピトープマッピングの棒グラフを示す。 図７は、ヒト血清アルブミン、プレアルブミン、およびTBGの、E2HV領域の重 複ペプチドへの結合を示す、エピトープマ ッピングの棒グラフを示す。 発明を実施するための態様 Ａ．定義 本発明の実施は、他に示されていない限り、当該分野内の分子生物学、微生物 学、組換えDNA、および免疫学の従来技術を使用し、それは当業者の範囲内であ る。このような方法は、文献に十分説明されている。例えば、Sambrookら、MOLE CULAR CLONING；ALABORATORY MANUAL，第２版（1989）；DNA CLONING，VOLUMES I AND II（D.N．Glover編、1985）；OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS（M.J．Gait編 、1984）；NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION（B.D．HamesおよびS.J．Higgins編1984 ）；TRANSCRIPTION AND TRANSLATION（B.D．HamesおよびS.J．Higgins編 1984 ）；ANIMAL CELL CULTURE（R.I．Freshney編1986）；IMM0BILIZED CELLS AND EN ZYMES（IRL Press，1986）；B．Perbal，A PRACTICAL GUIDE TO MOLECULAR CLON ING（1984）；the series，METHODS IN ENZYMOLOGY（Academic Press，Inc.）； GENE TRANSFER VECTORS FOR MAMMALIAN CELLS（J．H．MillerおよびM.P．Calos 編 1987，Cold Spring Harbor Laboratory）；Methods in Enzymology Vol．15 4およびVol．155（それぞれに、WuおよびGrossman、ならびにWu編）；Mayerおよ びWalker編（1987），IMMUNOCHEMICAL METHODS IN CELL AND MOLECULAR BIOLOGY （Academic Press，London）；Scopes，（1987），PROTEIN PURIFICATION：PRIN CIPLES AND PRACTICE， 第二版（Springer-Verlag，N.Y.）；および、HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNO LOGY，VOLUMESI-IV（D.M．WeirおよびC.C．Blackwell編 1986）。 ヌクレオチドおよびアミノ酸についての標準的な略語が、この明細書で使用さ れる。本明細書に記載されている全ての刊行物、特許、および特許出願は、参考 として援用されている。 Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）は、ペストウイルス（ブタコレラウイルスおよびウ シ下痢ウイルス）およびフラビウイルス、例えば、デング熱および黄熱ウイルス 、を包含する、フラビウィルス科（Family Flaviviridae）の新しいメンバーで ある。HCVの遺伝子構成の図式を図１に示す。フラビウイルスおよびペストウイ ルスと同様に、HCVは、非構造遺伝子NS2からNS5の上流にある２つの糖タンパク 質ドメイン（「E1」、「E2/NS1」）が続くウイルスポリタンパク質のＮ末端で、 塩基性ポリペプチドドメイン(「C」）をコードするようである。推定タンパク質 ドメインのアミノ酸位置を表１に示す。 ゲノムのE1およびE2/NS1領域は、推定エンベロープ型糖タンパク質をコードす るので、これらの領域は、免疫原性およびHCV処置に関して、特に興味深いもの である。 １つの持続性感染個体内のHCVゲノムの平均変化速度は、１年あたり一部位に つき1-2×10^-3nt変化であると概算された。しかし、E2/NS1糖タンパク質のＮ末 端をコードする遺伝子の５'末端ではずっと高い変化速度が存在する。Weinerら 、FRONTIERS IN VIROLOGY：DIAGNOSIS OF HUMAN VIRUSES BY POLYMERASE CHAIN REACTION TECHNOLOGY（Springer Verlag，Heidelberg，1992）。約384-414位（ アミノ酸番号付けの基準としてHCV1を使用して）のアミノ酸に広がるこのE2超可 変領域（E2HV）（以前に、領域Ｖと呼ばれ、例えば、Ogataら、Proc．Natl．Aca d．Sci．USA （1991）88：3392-3396；Okamotoら、Virology（1992）188：331-34 1を参照のこと）は、HCVポリタ ンパク質の最も可変的な領域であるようで、今までに調査された実質的に全ての 分離株において異なる。Weinerら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA（1992）89：34 68-3472。多くの個別の抗体結合エピトープがこの領域にマッピングされており 、そして一人の慢性感染患者において、E2HV変異体の出現が立証されており、こ のことは、E2HV領域の逸出変異体が、慢性化の進展に重要な役割をなすことを示 唆する。 本明細書で使用されているように、ウイルスタンパク質の「可変ドメイン」は 、少なくとも２つのHCV分離株あるいは亜集団間で、一貫したアミノ酸変異のパ ターンを明示するドメインである。好ましくは、ドメインは、少なくとも１つの エピトープを含有する。可変ドメインは、１つのアミノ酸変化により、分離株と 分離株との間で変化し得る。これらの分離株は、同じまたは異なるHCVグループ またはサブグループ由来であり得る。可変ドメインは、分離株中の配列組成から 容易に同定され得、これらの方法の例は、以下に記載されている。本発明を記載 する目的のために、可変ドメインは、１位と示される開始メチオニンによって、 HCV1ゲノムによりコードされるポリタンパク質のアミノ酸番号に関して定義され る。別のHCV分離株中の対応する可変ドメインは、任意の可変ドメインの外側に 保存ドメインをもたらし、最大配列にする様式で、２つの分離株の配列を整列さ せることにより決定される。これは、University of Virginia，Department of Biochemistry（Attn：Dr．William R．Pearson）から入手可能なALIGN 1.0のような、任意の多くのコンピュータソフトパッケージで実施され得る。Pea rsonら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA（1988）85：2444-2448を参照のこと。特 定の可変ドメインに与えられたアミノ酸番号は、いくぶん主観的であり選択事物 であることが理解される。従って、可変ドメインの開始および終止は、およその ことであり、他に記載されていなければ、重複ドメインあるいはサブドメインを 含むと理解されるべきである。 「超可変ドメイン」（HV）は、分離株間で比較的高い程度の可変性を示す可変 ドメインである。特に、本明細書ではE2HVと呼ばれる、HCV E2/NS1の超可変領域 は、アミノ酸384-414に広がる。 本発明は、本明細書では401から406あるいは401から407のアミノ酸に対して「 SLF--G」モチーフと呼ばれるアミノ酸の保存モチーフを有する、E2/NS1のE2HV内 の領域を利用する。この領域は、少なくとも４つのHCV遺伝子型を包含する90の 分離株の配列分析により発見された。保存モチーフによりこの領域と結合する抗 体で構成される抗体調製物は、HCVに対する受動免疫に有用である。 アミノ酸は、免疫反応性に関するモチーフの特性をとどめている限り、他の分 子、例えば、これらのアミノ酸アナログと置換され得ることが、もちろん理解さ れる。SLF--Gモチーフで構成されるものに比較した抗原決定基の免疫反応性は、 規定の方法によって当業者により決定され得る。例えば、公 知の方法には、エピトープマッピングに使用される方法、およびこのモチーフを 含む抗原決定基と免疫学的に反応する（結合する）抗体への競合結合が包含され る。 本明細書に使用されているように、用語「ポリペプチド」とは、アミノ酸のポ リマーのことであり、生産物の特定の長さのことではない。従って、ペプチド、 オリゴペプチド、およびタンパク質が、ポリペプチドの定義内に包含される。さ らに、この用語は、ポリペプチドの発現後改変、例えば、グリコシル化、アセチ ル化、ホスホリル化などを指すわけではないが、排除しない。定義には、例えば 、１つ以上のアミノ酸アナログを含むポリペプチド（例えば、非天然アミノ酸な どを包含する）、置換結合を有するポリペプチド、および、天然に存在するおよ び存在しない、当業者に周知の他の改変が包含される。 本発明の組成物の製造に有用なポリペプチドは、組換え、合成、あるいは組織 培養で作製され得る。切断型HCV配列または全長HCVタンパク質で構成される組換 えポリペプチドは、HCV配列（１つ以上のエピトープ、連続あるいは非連続のい ずれか）で、あるいは融合タンパク質における配列で全体的に構成され得る。融 合タンパク質では、有用な異種配列は、組換え宿主からの分泌を与え、HCVエピ トープの免疫学的反応性を増大し、あるいは、ポリペプチドの支持体またはワク チンキャリアへの結合を促進する配列を含む。例えば、欧州特許公開第116,201 号、米国特許第4,722,840号、欧州特許公開第 259,149号、米国特許第4,629,783号を参照のこと。 天然材料源からのタンパク質の単離および精製によるのではなく、組換えDNA 法によりタンパク質を生産する重要な利点は、同量のタンパク質が、天然材料源 からタンパク質を単離するのに必要とされるより、より少量の開始材料を使用し て生産され得ることである。組換え方法によるタンパク質の生産はまた、タンパ ク質を、通常細胞内に存在するいくらかの分子を含まないで単離し得る。組換え 非ヒト宿主により産生されるヒトタンパク質のみが、組織での組換えタンパク質 であるので、実際に、極微量のヒトタンパク質夾雑物をも完全に含まないタンパ ク質組成物が、容易に生産され得る。天然材料源からの潜在的なウイルス因子、 およびヒトに対して病原性のウイルス成分もまた排除される。 SLF--Gモチーフで構成されるポリペプチドは、化学合成によって調製され得る 。化学合成によるポリペプチドの調製方法は、当該分野で公知である。タンパク 質は、抗体を生産するために使用され得る。「抗体」は、特異エピトープに結合 する抗体およびそれらのフラグメント（F(ab)、F(ab')2、およびFvを含む）を包 含する、任意の免疫グロブリンである。この用語には、特に、ポリクローナル抗 体、モノクローナル抗体、一本鎖抗体、およびキメラ抗体が包含される。キメラ 抗体の例は、米国特許第4,816,397号、および第4,816,567号に考察されている。 指摘の核酸配列「由来の」ポリペプチドあるいはアミノ酸 配列は、配列中にコードされるポリペプチドのアミノ酸と同じアミノ酸を有する ポリペプチド、あるいは、少なくとも3-5アミノ酸、および、より好ましくは少 なくとも8-10アミノ酸、および、さらに好ましくは少なくとも11-15アミノ酸か らなるそれらの部分、あるいは、配列中にコードされるポリペプチドで免疫学的 に同定され得るそれらの部分のことである。この用語はさらに、指摘の核酸配列 から発現されるポリペプチドも包含する。 本明細書に使用されているように、用語「組換えポリヌクレオチド」は、その 起源あるいは操作によって以下のような、ゲノム、cDNA、半合成、あるいは合成 起源のポリヌクレオチドを意図する：（1）天然で会合されるポリヌクレオチド の全体あるいは部分と会合しない：（2）天然で連結されるもの以外のポリヌク レオチドと連結される；あるいは、（3）天然には存在しない。 本明細書で使用されているような用語「ポリヌクレオチド」は、リボヌクレオ チドあるいはデオキシリボヌクレオチドのいずれかの任意の長さのヌクレオチド のポリマー形態のことである。この用語は、分子の一次構造のみを指す。従って 、この用語は、二本鎖および一本鎖のDNAおよびRNAを包含する。それはさらに、 既知のタイプの改変、例えば、当該分野で公知の標識、メチル化、「キャップ」 、１つ以上の天然に存在するヌクレオチドのアナログとの置換、例えば非電荷連 結（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホス ホアミデート、カルバメートなど）を有するものおよび電荷連結（例えば、ホス ホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を有するもの、例えばタンパク質 （例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリL-リジンなどを 包含する）のようなペンダント部分を含むもの、インターカレーター（例えば、 アクリジン、プソラレン（psoralen）など）を有するもの、キレーター（例えば 、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属など）を含むもの、アルキル化剤を含む もの、改変連結（例えば、αアノマー核酸など）を有するもののような、ヌクレ オチド間改変物、ならびに、ポリヌクレオチドの非改変形態を包含する。 「レプリコン」は、任意の遺伝子エレメント、例えば、プラスミド、染色体、 ウイルス、コスミドなどであり、細胞内のポリヌクレオチド複製の自律ユニット として挙動し、すなわち、自身の制御下で複製し得る。これは、選択マーカーを 含み得る。 「ベクター」は、接続セグメントの複製および／または発現を引き起こすよう に、他のポリヌクレオチドセグメントが接続されているレプリコンである。 「制御配列」とは、連結されているコーディング配列の発現に影響を及ぼすの に必要なポリヌクレオチド配列のことである。このような制御配列の特性は、宿 主生物に依存して異なる。原核生物では、このような制御配列は一般的に、プロ モーター、リボソーム結合部位、および転写終止配列を含み、 真核生物では、一般的にはこのような制御配列は、プロモーターおよび転写終止 配列を含む。用語「制御配列」は、最少限には、その存在が発現に必要とされる 全ての成分を包含することを意図し、そして、その存在が有利であるさらなる成 分、例えば、リーダー配列および融合パートナー配列も包含し得る。「プロモー ター」は、mRNA生産が近接の構造遺伝子について通常の転写開始部位で開始する ような様式でRNAポリメラーゼのDNA鋳型への結合をなし得る共通配列で構成され る、ヌクレオチド配列である。 「作動可能に連結された」とは、記載の成分が、それらの意図される様式で機 能される関係に存在する、並列位置のことである。コーディング配列に「作動可 能に連結された」制御配列は、コーディング配列の発現が制御配列に適した条件 下で達成されるように、連結される。 「読み取り枠」（ORF）は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列 の領域であり、この領域は、部分コーディング配列あるいは全コーディング配列 を示し得る。 「コーディング配列」は、適切な制御配列の制御下におかれると、通常mRNAを 介してポリペプチドに翻訳されるポリヌクレオチド配列である。コーディング配 列の境界は、５'末端の翻訳開始コドンおよび３'末端の翻訳終止コドンにより決 定される。コーディング配列は、cDNA、および組換えポリヌクレオチド配列を含 み得るが、これらに限定されない。 「PCR」とは、Saikiら、Nature（1986）324：163；Scharfら、Science （1986）233：1076-1078；米国特許第4,683,195号；および米国特許第4, 683,202号に記載のような、ポリメラーゼ連鎖反応技術のことである。 本明細書に使用されているように、ｘは、ｘが同一の様式でｙと自然に会合さ れないとき、ｙに関して「異種」である。すなわち、Ｘは、天然ではｙと会合さ れないか、あるいは、天然に認められるのと同様の様式ではｙとは会合されない 。 「相同性」とは、ｘとｙとの間の類似性の程度のことである。２つのポリヌク レオチド配列間の相同性は、当該分野で公知の方法によって決定され得る。例え ば、ポリヌクレオチドの配列情報の直接比較により決定され得る。あるいは、相 同性は、相同領域間で安定な二本鎖を形成する条件下でポリヌクレオチドをハブ イリダイズさせ（例えば、S₁消化の前に使用されるもの）、その後、１つまたは 複数の一本鎖特異的ヌクレアーゼで消化し、消化されたフラグメントの大きさを 測定することによって、決定され得る。 「組換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」、「細胞培養物」、および他の そのような用語は、組換えベクターあるいは他の転移DNAの受容体として使用さ れ得るか、あるいは使用されてきた、例えば、微生物、昆虫細胞、および哺乳類 細胞のことであり、形質転換されたもとの細胞の子孫を包含する。１つの親細胞 の子孫は、自然変異、偶発変異、あるいは意図的変異により、もとの親と、形態 においてあるいはゲノムあるいは全DNA相補体において完全に同じである必要は ない ことが理解される。哺乳類宿主細胞の例には、チャイニーズハムスター卵巣（CH O）細胞およびサル腎（COS）細胞が包含される。 特に、本明細書に使用されているように、「細胞系」とは、インビトロにおい て継続的にあるいは長期にわたり増殖および***し得る細胞群のことである。し ばしば、細胞系は、１つの前駆細胞に由来するクローン群である。さらに、自発 的あるいは誘導された変化が、このようなクローン群の貯蔵あるいは転移中に核 型に生じ得ることが当該分野で公知である。従って、言及される細胞系由来の細 胞は、祖先細胞あるいは培養物と正確に同じでなくてよく、その言及される細胞 系には、このような変異体も包含される。用語「細胞系」にはまた、不死化細胞 が包含される。好ましくは、細胞系は、非ハイブリッド細胞系、あるいは２つの 細胞型のみに対するハイブリドーマを含む。 本明細書に使用されているように、用語「微生物」には、細菌および真菌のよ うな、原核および真核微生物種が包含され、後者には酵母および糸状菌が包含さ れる。 「形質転換」とは、挿入に用いられる方法、例えば、直接取り込み、形質導入 、f-交配、あるいはエレクトロポレーションに関係なく、外生ポリヌクレオチド の宿主細胞への挿入のことである。外生ポリヌクレオチドは、非組み込みベクタ ー、例えば、プラスミドとして維持され得るか、あるいは、宿主ゲノム中に組み 込まれ得る。 「ゲノムの」によって、ベクターにクローン化された制限フラグメントに由来 するDNA分子のコレクションあるいはライブラリーが意味される。これには、生 物の遺伝物質の全てあるいは一部が包含され得る。 「cDNA」によって、mRNAの相補鎖にハイブリダイズする相補的mRNA配列が意味 される。 「精製された」および「単離された」によって、ポリペプチドあるいはヌクレ オチド配列について言及するときには、指摘された分子が、同じ型の他の生物学 的高分子が実質的に存在しない状態で存在することが意味される。本明細書に使 用されているように、用語「精製された」は、好ましくは少なくとも75重量％、 より好ましくは少なくとも85重量％、さらに好ましくは少なくとも95重量％、そ して最も好ましくは少なくとも98重量％で、同じ型の生物学的高分子が存在する ことを意味する（しかし、水、緩衝液、および他の低分子、特に1,000未満の分 子量を有する分子は存在し得る）。 本明細書に使用されているように、「エピトープ」は、リンパ球レセプターあ るいは抗体の認識部位に相補的な構造を有する、１つの抗原決定基である。機能 的に、それは、標準的なアッセイで抗原が抗体に結合する能力により決定される 。一般的には、１つのエピトープは、少なくとも３から５のアミノ酸を含む。と きには、エピトープはより多くの、例えば、6、7、8、9、あるいは10アミノ酸で あり得る。 エピトープあるいは抗原決定基は、それが、指摘のポリペ プチド中のエピトープあるいは抗原決定基に免疫学的に結合する抗体と交差反応 するときは、その指摘のポリペプチド中の別のエピトープあるいは抗原決定基の 等価物である。しばしば、エピトープ内に、抗体結合にとって重要ではない１つ 以上のアミノ酸が存在し、従って、置換あるいは欠失さえされ得る。直鎖状エピ トープは通常短い連続配列であるが（なんらかの変化を受ける）、構造的エピト ープは、直鎖状アミノ酸配列内では広く間隔をあけて存在するが、タンパク質の 折り畳みあるいは二次または三次構造特性によって近接させられた、数個のアミ ノ酸から構成され得る。 「抗原」は、１つ以上の抗原決定基を含むポリペプチドである。 「免疫原性の」は、細胞性および／または体液性の免疫応答を惹起する能力を 意味する。免疫原性応答は、免疫原性ポリペプチドのみにより惹起され得るか、 あるいはアジュバントの存在あるいは非存在下でキャリアの存在を必要とし得る 。 「免疫反応性の」とは、（1）抗体および／またはリンパ球抗原レセプターに 免疫学的に結合する能力あるいは（2）免疫原性である能力のことである。 HCVエピトープを含むアミノ酸配列は、共有結合、あるいは融合されたポリヌ クレオチドを発現させて融合タンパク質を形成することのいずれかにより、別の ポリペプチド（例えば、キャリアタンパク質）と連結され得る。所望であれば、 エピトープの複数繰り返しを挿入あるいは接続し得、そして／ま たは、種々のエピトープを取り込み得る。キャリアタンパク質は、任意の材料源 由来であり得るが、一般的には、BSA、KLHなどのような、比較的大きな免疫原性 タンパク質である。所望であれば、キャリアとして実質的に全長のHCVタンパク 質を使用し得、免疫原性エピトープ数を増大する。あるいは、HCVエピトープ由 来のアミノ酸配列は、アミノ末端および／またはカルボキシ末端で、非HCVアミ ノ酸配列に連結され得、よって、ポリペプチドは融合ポリペプチドである。ポリ ペプチドのアナログ型は、他の指摘されるウイルスタンパク質由来のエピトープ を用いて構築され得る。 「個体」は、脊椎動物、特に哺乳類種のメンバーのことであり、げっし類（例 えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット）、ウサギ、ヤギ、ブタ、ウシ 、ヒツジ、および霊長類（例えば、チンパンジー、アフリカミドリザル、ヒヒ、 オランウータン、およびヒト）を包含するが、これらに限定されない。 本明細書に使用されているように、「処置」とは、任意の（i）従来のワクチ ンとしての、感染あるいは再感染の予防、（ii）HCV感染状態に関連する１つ以 上の症候の軽減あるいは除去、および（iii）ウイルスの実質的あるいは完全な 除去のいずれかのことである。処置は、予防的（感染前）あるいは治療的（感染 後）に有効であり得る。 本明細書に使用されているように、「生物学的試料」とは、個体から単離した 組織試料あるいは液体試料のことであり、 例えば、血漿、血清、脊髄液、リンパ液；皮膚、気道、腸管、生殖管の外部切片 ；涙、唾液、乳汁、血液細胞、腫瘍、器官、生検、およびインビトロ細胞培養構 成要素の試料（細胞培養培地における細胞、例えば、Mab産生ミエローマ細胞、 組換え細胞、および細胞成分、の増殖から得られる馴化培地を包含するがこれら に限定されない）を包含するが、これらに限定されない。 組成物あるいはワクチンに対する「免疫応答」は、標的抗原をコードする細胞 内感染因子に対する、細胞性および／または抗体仲介免疫応答の宿主中での進展 である。通常、このような応答は、個々の産生細胞傷害性Ｔ細胞および／または Ｂ細胞、および／または標的抗原を発現する抗原提示細胞に対して特異的な種々 のクラスのＴ細胞を含む。Ｂ．発現系 本発明のポリペプチドをコードするDNA配列の利用性により、これらのポリペ プチドをコードする発現ベクターの構築が可能になる。融合型であっても成熟型 であっても、そして分泌を行わせるシグナル配列を含んでも含まなくても、所望 のポリペプチドをコードするDNAが、任意の好都合な宿主に適した発現ベクター に連結され得る。真核および原核宿主系の両方が、組換えポリペプチドを形成す るために現在使用されており、そしてより一般的な制御系および宿主細胞系のい くつかの概要が下記に記載されている。次いで、ポリペプチドが、溶解細胞ある いは培地から単離され、そして意図される用途 のために必要な程度にまで精製される。精製は、当該分野で公知の技術、例えば 、分離抽出、塩分画、イオン交換樹脂でのクロマトグラフィー、アフィニティー クロマトグラフィー、遠心分離などによって行われ得る。例えば、タンパク質精 製のための種々の方法については、Methods in Enzymology（Academic Press） を参照のこと。このようなポリペプチドは診断薬として使用され得、あるいは、 中和抗体を生じさせるポリペプチドがワクチンに処方され得る。これらのポリペ プチドに対して誘起された抗体は診断薬として、あるいは受動免疫療法に使用さ れ得る。 原核および真核宿主細胞の両方が、指摘宿主に適合した適切な制御配列が使用 されるとき、所望のコーディング配列の発現のために使用され得る。このような 発現のための方法は、当該分野で公知である。原核宿主中では、E．coliが最も 頻繁に使用される。原核生物用の発現制御配列は、プロモーター、必要に応じて オペレーター部分、およびリボソーム結合部位を含有する。原核宿主に適した転 移ベクターは、一般的に、例えば、pBR332、アンピシリンおよびテトラサイクリ ン耐性を付与するオペロンを含有するプラスミド、および種々のpUCベクター（ これもまた抗生物質耐性マーカーを与える配列を含有する）由来である。これら のマーカーは、選択によって成功した形質転換体を得るために使用され得る。通 常使用される原核制御配列は、B-ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクト ースプロモーター系（Changら、Nature（1977）1 98 ：1056）、トリプトファン（trp）プロモーター系（Goeddelら、Nuc1eic Acid s Res． （1980）8：4057）、およびλ由来P_LプロモーターおよびＮ遺伝子リボソ ーム結合部位（Shimatakeら、Nature（1981）292：128）、および、trpおよびla c UV5プロモーター配列由来のハイブリッドtacプロモーター（DeBoerら、Proc． Natl．Acad．Sci．USA （1983）292：128）を含む。前記の系は特にE．coliに適 し、所望であれば、バチルスあるいはシュードモナス株のような他の原核宿主が 、対応の制御配列とともに使用され得る。 真核宿主は、培養系中の酵母および哺乳類細胞を包含する。Saccharomyces ce revisiae およびSaccharomyces carlsbergensisは最も一般的に使用される酵母宿 主であり、好都合な真菌宿主である。酵母適合性ベクターは、栄養要求株に原栄 養性を付与するかあるいは野生型株に重金属耐性を付与することによって、成功 した形質転換体の選択を可能にするマーカーを有する。酵母適合性ベクターは、 ２μ複製起点（Broachら、Meth．Enz．（1983）101：307）、CEN3およびARS1の 組み合わせ、あるいは、適切なフラグメントが宿主細胞ゲノムへ取り込まれる結 果となる配列のような、複製を確実にする他の手段を使用し得る。酵母ベクター に対する制御配列は、当該分野で公知であり、解糖酵素の合成のためのプロモー ターを含む（Hessら、J．Adv．Enzyme Reg（1968）7：149；Hollandら、Biochem istry （1978）17：4900）。このプロモーターは、3-ホスホグリセリン酸キナー ゼのためのプロモーターを含む（Hi tzeman，J．Biol．Chem．（1980）255：2073）。エノラーゼ遺伝子由来もののよ うなターミネーターもまた含まれ得る（Holland，J．Biol．Chem．（1981）256 ：1385）。特に有用な制御系は、グリセルアルデヒド-3リン酸デヒドロゲナーゼ （GAPDH）プロモーターあるいはアルコールデヒドロゲナーゼ（ADH）制御プロモ ーター、さらにGAPDH由来のターミネーター、および分泌が所望されれば酵母α 因子からのリーダー配列を含む制御系である。さらに、作動可能に連結される転 写制御領域および転写開始領域は、野生型生物では天然には会合されないような ものであり得る。これらの系は、1984年10月3日に公開された欧州特許公開（EPO ）第120,551号、1984年8月22日に公開された欧州特許公開（EPO）第116,201号、 および1985年12月18日に公開された欧州特許公開（EPO）第164,556号に詳細に記 載されていて、これらは全て譲渡人に譲渡されており、本明細書に参考として援 用されている。 発現用宿主として入手可能な哺乳類細胞系は当該分野で公知であり、HeLa細胞 、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、新生仔ハムスター腎（BHK）細胞、 および他多くの細胞系を含む、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC ）から入手可能な多くの不死化細胞系を包含する。哺乳類細胞用の適切なプロモ ーターもまた当該分野で公知であり、サルウイルス40（SV40）（Fiers，Nature （1978）273：113）、ラウス肉腫ウイルス（RSV）、アデノウイルス（ADV）、お よびウシパピローマウイルス（BPV）に由来のプロモーターのよう な、ウイルスプロモーターを包含する。哺乳類細胞はまた終止配列およびポリＡ 付加配列を必要とし得る。発現を増加するエンハンサー配列もまた含まれ得、遺 伝子増幅を引き起こす配列もまた望ましいとされ得る。これらの配列は当該分野 で公知である。 哺乳類細胞での複製に適したベクターは当該分野で公知であり、ウイルスレプ リコン、あるいはNANBVエピトープをコードする適切な配列を宿主ゲノム中に確 実に組み込ませる配列を含み得る。 外来DNAを発現するために使用され、ワクチン調製に使用され得るベクターは 、ワクシニアウイルスである。この場合、異種DNAがワクシニアゲノム中に挿入 される。ワクシニアウイルスゲノムに外来DNAを挿入するための技術は当該分野 で公知であり、例えば、相同的組換えを利用する。異種DNAの挿入は、一般的に 天然では必要でない遺伝子、例えば、チミジンキナーゼ遺伝子（tk）中であり、 これはまた選択マーカーを提供する。組換えウイルスの構築を多大に促進するプ ラスミドベクターが記載されている（例えば、Mackettら、J．Virol.（1984）49 ：857：Chakrabartiら、Mol．Cell Biol．（1985）5：3403；Moss（1987）GENE TRANSFER VECTORS FOR MAMMALIAN CELLS（MillerおよびCalos編、Cold Spring H arbor Labratory，Cold Spring Harbor，N.Y.），p.10を参照のこと）。次に、H CVポリペプチド発現が、細胞、あるいは生組換えワクシニアウイルスで免疫され る個体で起こる。 真核あるいはウイルスゲノム発現のための他の系は、昆虫細胞およびこれらの 細胞での使用に適したベクターを包含する。これらの系は当該分野で公知であり 、例えば、バキュロウイルスAutographa californica核多角体病ウイルス（AcNP V）由来の昆虫発現転移ベクターを含み、これは、例えば、培養におけるSpodopt era frugiperda 細胞での使用のための、ヘルパー非依存性のウイルス発現ベクタ ーである。この系由来の発現ベクターは、異種遺伝子の発現を操作するために、 強ウイルスポリヘドリン遺伝子プロモーターを通常使用する。外来遺伝子をAcNP Vに導入するために、最近最も一般的に使用される転移ベクターはpAc373である （図７０）。当業者に公知の他の多くのベクターもまた、改良発現用に設計され た。これらには、例えば、pVL985（ポリヘドリン開始コドンをATGからATTに変え 、ATTから下流にBam HIクローニング部位32塩基対を導入する；LuckowおよびSum mers，Virology（1989）17：31を参照のこと）が含まれる。 異種DNAのバキュロウイルス中の所望の部位への導入方法は、当該分野で公知 である。（SummerおよびSmith，Texas Agric ultural Experiment Station Bull etin No．1555；Smithら、Mol．＆ Cell Biol．（1983）3：2156-2165.；およ び、LuckowおよびSummers（1989）を参照のこと。）例えば、挿入は、相同的組 換えにより、ポリヘドリン遺伝子のような遺伝子へなされ得る。挿入はまた、所 望のバキュロウイルス遺伝子に施された制限酵素部位へなされ得る。Ｃ．HCVのワクチン処置 本発明の１つの実施態様では、SLF--Gモチーフを含有する抗原決定基に対して 特異的な抗体を結合する領域を有するポリペプチドで構成される免疫原性組成物 が、そのモチーフを含有する１つまたは複数のHCV抗原決定基に対する免疫応答 性を刺激するためのワクチン適用に使用される。好ましくは、ポリペプチドは、 PCT公開第WO93/016126号；Weinerら、Virology（1991）180：842-48；Weinerら 、Proc．Natl．Acad．Sci．USA（1992）89：3468-72；Weinerら、（1992），Vac cines 92 ：303-08，Cold Spring Harbor Laboratoryに開示されている特異的E2H V配列を含有しない。 予備的な証拠は、E2/NS1の１つまたは複数の超可変ドメインが逸出変異体に起 因し得、それが慢性HCV感染に導くことを示唆する。しかし、超可変領域中の保 存領域は、その保存領域が重要な機能を有し、ウイルス結合および／または宿主 細胞への侵入および／または宿主細胞での複製に必須の役割をなすことを示唆す る。ウイルス結合では、その結合が、細胞、および／または、ウイルスの結合お よび／または侵入および／または複製を促進する別の分子と行われ得ることが予 想される。以下に示す実施例は、トランスチレチンおよび／または甲状腺結合グ ロブリン（TBG）へのウイルス結合が、感染過程に関与することを示唆する。従 って、保存SLF--G配列を含有する抗原決定基に対する免疫応答を増大することは 、HCV感染の予防および／または軽減だけではなく、HCV感染の慢性化 の減少を導き得る。さらに、保存領域はまた、SLF--Gモチーフを有する領域を有 する免疫反応性ポリペプチドで構成されるワクチンが交差反応性であり得ること を示唆する。 ワクチンの好ましい適用では、本明細書に記載のポリペプチド組成物は、他の HCVサブユニット抗原、例えば、PCT公開第WO92/08734号に記載の抗原と組み合わ せられる。組成物がHCV処置のために使用される場合には、この組成物は免疫原 性であることが望ましい。合成ポリペプチドが、適切なエピトープを提供するよ うに正確に配置されているが、免疫原性であるには小さすぎる場合には、そのポ リペプチドは、適切なキャリアに連結され得る。このような連結を得るための多 くの技術が当該分野で公知であり、N-スクシンイミジル-3-（2-ピリジル-チオ） プロピオネート（SPDP）およびスクシンイミジル4-（N-マレイミドメチル）シク ロヘキサン-1-カルボキシレート（SMCC）を用いるジスルフィド結合の形成が包 含される（ペプチドがスルフヒドリル基を有さない場合は、これはシステイン残 基を付加することにより提供され得る）。これらの試薬は、それ自身と１つのタ ンパク質上のペプチドシステイン残基との間にジスルフィド結合、およびリジン 上のε-アミノ基、あるいは他のアミノ酸中の他の遊離アミノ基を介したアミド 結合を生成する。このような種々のジスルフィド／アミド形成試薬は公知である 。例えば、Immun．Rev．（1982）62：185を参照のこと。ジスルフィド結合では なくチオエーテル用の他の二官能性カップリング試薬。これらのチオエーテ ル形成試薬の多くは商業的に入手可能であり、6-マレイミドカプロン酸、2-ブロ モ酢酸、2-ヨード酢酸、4-（N-マレイミド-メチル）シクロヘキサン-1-カルボン 酸などの反応性エステルを包含する。カルボキシル基は、それ自身と、スクシン イミドあるいは1-ヒドロキシル-2-ニトロ-4-スルホン酸、ナトリウム塩と組み合 わせて活性化され得る。カップリング抗原のさらなる方法は、欧州特許公開（EP O）第259,149号に記載されているロタウイルス／「結合ペプチド」系を使用する 。前述の一覧表は網羅されていることを意味せず、命名された化合物の修飾物も 明らかに使用され得る。 宿主に対して有害である抗体の産生をそれ自身誘導しない、任意のキャリアが 使用され得る。適切なキャリアは、典型的には大きくて徐々に代謝される高分子 ；例えば、タンパク質、ラテックス機能化セファロース、アガロース、セルロー ス、セルロースビースなどのような多糖類；ポリグルタミン酸、ポリリジンなど のようなポリマーアミノ酸；アミノ酸コポリマー；および不活性ウイルス粒子で ある（以下を参照のこと）。特に有用なタンパク質基質は、血清アルブミン、キ ーホールリンペットヘモシアニン、免疫グロブリン分子、チログロブリン、オボ アルブミン、破傷風トキソイド、および当業者に周知の他のタンパク質である。 SLF--Gモチーフで構成される抗原の免疫原性は、例えば、Ｂ型肝炎表面抗原と 会合されたもののような、粒子形成タンパク質と融合あるいは会合されて、真核 系でそれらを調製する ことにより増大され得る。米国特許第4,722,840号を参照のこと。これらの構築 物はまた、SV40-ジヒドロ葉酸レダクターゼベクターを用いて、CHO細胞のような 哺乳類細胞で発現され得る（Michelleら（1984），INTERNATIONAL SYMPOSIUM ON VIRAL HEPATITIS）。 さらに、粒子形成タンパク質コーディング配列の一部は、HCV超可変ドメイン 由来のSLF--Gエピトープをコードするコドンと置換され得る。この置換で、酵母 あるいは哺乳類中で免疫原性粒子を形成するユニットの凝集を仲介するのに必要 とされない領域が欠失され得る。従って、さらなるHBV抗原性部位を、１つまた は複数のHCVエピトープとの競合から除去する。 これらのワクチンは予防的（感染を予防するため）あるいは治療的（感染後の 疾患を処置するため）のいずれかであり得る。 このようなワクチンは、通常は、組成物を受容する個体に対して有害な抗体の 産生をそれ自身が誘導しない任意のキャリアを包含する「薬学的に受容可能なキ ャリア」と組み合わせて、単数の抗原あるいは複数の抗原を含有する。適切なキ ャリアは、典型的には大きくて徐々に代謝される高分子、例えば、タンパク質、 多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー 、脂質凝集物（例えば、油滴あるいはリポソーム）、および不溶性ウイルス粒子 である。このようなキャリアは当業者に周知である。さらに、これらのキャリア は、免疫刺激因子（「アジュバント」）と して機能し得る。さらに、抗原は、ジフテリア、破傷風、コレラ、H．pyloriな どの病原体からのトキソイドのような、細菌トキソイドと複合体化され得る。 組成物の効果を増強するための好ましいアジュバントは、（1）水酸化アルミ ニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなどのようなアルミニウム塩（ ミョウバン）；（2）油中水エマルジョン処方物（ムラミルペプチド（下記を参 照のこと）あるいは細菌細胞壁成分のような他の特異的免疫刺激剤を含有するあ るいは含有しない）、例えば、（a）モデルllOYマイクロフルイダイザー（Micro fluidics，Newton，MA）のようなマイクロフルイダイザーを使用してサブミクロ ン粒子に処方された、5% Squalene、0.5% Tween 80、および0.5% Span 85（要求 されないが、必要に応じて、種々の量のMTP-PE（下記を参照のこと））を含有す る、MF59（PCT公開第WO90/14837号）、（b）マイクロフルイダイザーによりサブ ミクロンエマルジョンにするか、あるいはボルテックスして大きな粒子のエマル ジョンにされるかいずれかの、10% Squalane、0.4% Tween 80、5% プルロニック ブロックポリマーL121、およびthr-MDP（下記を参照のこと）を含有する、SAF、 および（c）2% Squalene、0.2% Tween 80、および、モノホスホリピッドA（MPL ）、トレハロースジミコレート（TDM）、および細胞壁骨格（CWS）、好ましくは MPL＋CWS（Detox^TM）よりなる群からの１つ以上の細菌細胞壁成分を含有する、R ibi^TMアジュバント系（RAS）（Ribi Immunochem，Hamilton，MT）；（3）Stimul on^TM（Camb ridge Bioscience，Worcester，MA）のようなサポニンアジュバントが使用され 得るか、あるいはISCOM（免疫刺激複合体）のような、それらから生成された粒 子；（4）完全フロイントアジュバント（CFA）および不完全フロイントアジュバ ント（ＩFA）；（5）インターロイキン（IL-1、IL-2など）、マクロファージコ ロニー刺激因子（M-CSF）、腫瘍壊死因子（TNF）などのようなサイトカイン；お よび（6）組成物の効果を促進するための免疫刺激因子として作用する他の物質 を包含するが、それらに限定されない。ミョウバンおよびMF59が好ましい。 上記のように、ムラミルペプチドは、N-アセチル-ムラミル-L-トレオニル-D- イソグルタミン（thr-MDP）、N-アセチル-ノルムラミル-L-アラニル-D-イソグル タミン（nor-MDP）、N-アセチルムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミニル-L-ア ラニン-2-（1'-2'-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ヒドロキシホスホリルオキシ ）-エチルアミン（MTP-PE）などを包含するが、これらに限定されない。 免疫原性組成物（例えば、抗原、薬学的に受容可能なキャリア、およびアジュ バント）は典型的に、水、生理食塩水、グリセロール、エタノールなどのような 希釈剤を含有する。さらに、湿潤あるいは乳化剤、pH緩衝物質などのような補助 物質が、このような媒体（vehicle）に存在し得る。 典型的には、免疫原性組成物は、液体溶液あるいは懸濁液のいずれかとして、 注射可能に調整され得る。注射の前に液体媒体に入れて溶液あるいは懸濁液とす るのに適切な固形形 態もまた、調製され得る。調製物はまた、薬学的に受容可能なキャリアについて 上記で考察したように、アジュバント効果を増強するために、乳化され得るかあ るいはリポソーム中にカプセル化され得る。 ワクチンとして使用される免疫原性組成物は、免疫学的に有効な量の抗原性ポ リペプチド、および上記のいずれもの他の成分を必要であれば含有する。「免疫 学的に有効な量」は、単回あるいは連続投与の一部として個体に投与される量が 、治療に有効であることを意味する。この量は、処置される個体の健康あるいは 生理的状況、処置される個体の分類群（例えば、ヒト以外の霊長類、霊長類など ）、抗体を合成する個体の免疫系の能力、所望の防御程度、ワクチンの処方、処 置医の医学的な状況の評価、および他の関連因子に依存して変化する。その量は 、規定の試験により決定され得、比較的広範囲に及ぶことが予想される。 免疫原性組成物は、例えば、皮下あるいは筋肉内注射により、都合よく非経口 投与される。投与の他の様式に適したさらなる処方剤は、経口および肺処方剤、 坐薬、および経皮塗布剤を包含する。投与処置は単回投与スケジュールあるいは 複数回投与スケジュールであり得る。ワクチンは、他の免疫調節剤と合わせて投 与され得る。 上記に加えて、SLF--Gモチーフを有する領域で構成される組換えポリペプチド を発現する弱毒微生物の生ワクチンを調製することもまた可能である。適切な弱 毒微生物は当該分野 で公知であり、例えば、ウイルス（例えば、ワクシニアウイルス）および細菌を 包含する。 さらに、保存モチーフSLF--Gで構成される抗原決定基を有するポリペプチドを 含有するワクチンは、他の免疫調節剤、例えば、免疫グロブリンと合わせて投与 され得る。Ｄ．抗体 本発明のさらなる実施態様では、上記のように調製された免疫原性ポリペプチ ドは、ポリクローナルおよびモノクローナルを含む、抗体を産生させるために使 用される。ポリクローナル抗体が所望であれば、選択された哨乳動物（例えば、 マウス、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ウマなど）を、１つまたは複数のHCVエピトー プを有する免疫原性ポリペプチドで免疫する。免疫された動物からの血清を採集 し、公知の手順に従って処理する。SLF--Gモチーフで構成される１つまたは複数 の抗原決定基に対するポリクローナル抗体を含有する血清が、他の抗原に対する 抗体を含有するときは、ポリクローナル抗体はイムノアフィニティークロマトグ ラフィーによって精製され得る。ポリクローナル抗血清の産生およびプロセッシ ングの方法は当該分野で公知であり、例えば、MayerおよびWalker（1987）を参 照のこと。 あるいは、ポリクローナル抗体は、HCVで予め感染された哺乳動物から単離さ れ得、そして、SLF-G-モチーフで構成される１つまたは複数の抗原決定基に対し て特異的な抗体が単離され得る。HCVエピトープに対して特異的なモノクローナ ル抗 体もまた当業者により容易に生産され得る。ハイブリドーマによるモノクローナ ル抗体作成の一般的な方法は周知である。不死化抗体産生細胞系は細胞融合によ り創製され、また、Ｂリンパ球の癌遺伝子DNAでの直接形質転換、あるいはエプ スタイン・バールウイルスでのトランスフェクションのような他の方法によって も創製される。例えば、M．Schreierら（1980），HYBRIDOMA TECHNIQUES；Hamme rlingら（1981）MONOCLONAL ANTIBODEIS AND T-CELL HYBRIDOMAS：Kennettら（1 980）MONOCLONAL ANTIBODIESを参照のこと；また、米国特許第4,341,761号、第4 ,399,121号、第4,427,783号、第4,444,887号、第4,466,917号、第4,472,500号、 第4,491,632号、および第4,493,890号を参照のこと。SLF--Gモチーフで構成され る１つまたは複数のHCVエピトープに対して産生されたモノクローナル抗体のパ ネルは、種々の特性について、すなわち、イソタイプ、エピトープ親和性などに ついてスクリーニングされ得る。 SLF--Gモチーフで構成される１つまたは複数のHCVエピトープに対して特異的 な抗体（モノクローナルおよびポリクローナルの両方）は、特に診断に有用であ り、そして中和する抗体は受動免疫療法に有用である。特に、モノクローナル抗 体は、抗イディオタイプ抗体を誘起するために使用され得る。 抗イディオタイプ抗体は、防御が所望される感染因子の抗原の「内部イメージ 」を有する免疫グロブリンである。例えば、Nisonoff，A.ら、Clin．Immunol．I mmunopathol． （1981）21：397-406；およびDreesmanら、J．Infect．Disease（ 1985）151 ：761を参照のこと。抗イディオタイプ抗体を誘起する方法は当該分野で公知 である。例えば、Grzych，Nature（1985）316：74、MacNamaraら、Science（198 4）226：1325、およびUytdehaagら、J．Immunol．（1985）134：1225を参照のこ と。これらの抗イディオタイプ抗体はまた、HCV感染の処置、ワクチン接種、お よび／または診断に、および、SLF--Gモチーフで構成されるHCV抗原の１つまた は複数の免疫原性領域の解明に有用である。Ｅ．受動免疫 本発明のさらなる実施態様では、SLF--Gモチーフで構成される１つまたは複数 の抗原決定基に特異的な中和抗体で構成される組成物が、HCV感染の予防および ／または処置のための個体の受動免疫に使用される。抗体がポリクローナルのと きは、活性画分、例えば、特にIgGおよびIgMを分離および濃縮するために、投与 の前に抗体調製物を分画するのが好ましい。抗体の種々の画分を分離する技術は 当業者に周知であり、規定の方法のみを必要とする。モノクローナル抗体が受動 免疫に使用されるときには、１つ以上のHCV抗原決定基に特異的な種々のモノク ローナル、およびSLF--Gモチーフで構成される１つまたは複数の抗原決定基に特 異的な抗体を含むことが好ましいとされ得る。 受動免疫の方法およびプロトコールは当該分野で公知であり、上記に記載のい くつかの参考文献で考察されている。一般的には、抗体は適切な賦形剤と混合さ れる。抗体は、単回 あるいは複数回投与、および有効な量で与えられ得る。一般的には、抗体が投与 される個体間で異なるので、投与量およびレジメは、投与を管理する者により決 定される。Ｄ．診断アッセイ 診断適用には、抗原として本発明の組成物を使用するのが有用であり得、それ により、種々のHCV分離株に対する抗体を検出する能力を改良する。典型的には 、ポリペプチドは均一あるいは不均一イムノアッセイフォーマットに直接使用さ れ得、後者は、好ましくは、固体基質（例えば、マクロタイタープレートウエル 、プラスチックビーズ、ニトロセルロースなど）上にポリペプチドを固定するこ とを包含する。例えば、PCT公開第WO90/11089号、欧州特許公開（EPO）第360,08 8号；IMMUNOASSAY：A PRACTICAL GUIDE（前出）を参照のこと。これらのSLF--G モチーフを有する領域を含むポリペプチドで構成される免疫原性組成物は、生物 学的試料（例えば、血液あるいは血清試料を含む）中の抗HCV抗体を検出するた めに使用される。イムノアッセイは、SLF--Gモチーフで構成される抗原決定基を 有する少なくとも１つの抗原を使用する。SLF--Gモチーフをで構成される抗原決 定基に特異的な抗体が、生物学的試料中で、このモチーフを有する抗原を検出す るために使用され得ることもまた予想される。イムノアッセイの設計には多数の 変形があり、これらの多様性は当該分野で公知である。イムノアッセイのプロト コールは、例えば、競合、あるいは直接反応、あるいはサンドイッチ型アッセイ に基づき 得る。プロトコールはまた、例えば、固体支持体を使用し得るか、あるいは免疫 沈降法によるものであり得る。ほとんどのアッセイは、標識抗体あるいはポリペ プチドの使用を包含する。その標識は、例えば、蛍光、化学発光、放射性、ある いは染料分子であり得る。プローブからシグナルを増幅するアッセイもまた公知 である。その例は、ビオチンおよびアビジンを利用するアッセイ、および、ELIS Aアッセイのような、酵素標識および仲介イムノアッセイである。 免疫診断に適した適切な標識試薬を含有するキットが、適切な容器に入れられ た本発明の組成物を含む適当な材料、アッセイを実施するために必要な残りの試 薬および材料（例えば、適切な緩衝液、塩類溶液など）、およびアッセイの適切 な使用説明書一式を包装することにより、組まれている。Ｅ．遺伝子療法 本発明の別の実施態様では、SLF--Gモチーフで構成される免疫原性ポリペプチ ドをコードするポリヌクレオチドが、HCV感染を予防および／または軽減するた めの個体の遺伝子療法の目的に使用される。SLF--Gモチーフで構成される領域を 含む免疫原性ポリペプチドをコードする配列が、転写制御領域に作動可能に連結 される。転写制御領域は当該分野で公知である。 本発明のある実施態様では、転写制御領域はハイブリッドであり得、エンハン サー領域、多量体転写因子結合部位（multimeric transcription factor bindin g sites）（例えば、 NF-ATおよび／またはNFKB）、分泌シグナル、あるいは組換えポリヌクレオチド を有する細胞の選択を可能にする正のマーカー（marthers）を含む。 複製のための原核あるいは真核宿主細胞への導入用に調製されたポリヌクレオ チド構築物は、宿主により認識される複製系を含み、所望のポリペプチドをコー ドする意図された組換えポリヌクレオチドフラグメントを含む。このようなベク ターは、当該分野で公知であって、例えば、Sambrookら（1989）あるいはAusube lら（1987）で考察されている標準的な組換え技術により調製され得る。 本発明のポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドは、いくつかの方 法で個体に導入され得る。例えば、ポリヌクレオチドは、宿主細胞、例えば、樹 状細胞あるいは皮膚生検からの細胞に、エキソビボ導入され得る。組換えポリヌ クレオチドを含有する細胞は、個体に免疫を与えるために使用され得る。細胞は 通常、注入によって投与され、各注入は、少なくとも10⁶〜10¹⁰細胞／m²の範囲 、好ましくは少なくとも10⁷〜10⁹細胞／m²の範囲である。クローンは、単回注入 にって投与され得るか、ある期間にわたる複数回注入によって投与され得る。し かし、個々の個体は応答性において変化が予想されるので、注入される細胞のタ イプおよび量、ならびに注入回数および複数回注入が与えられる期間範囲は、診 察している医師または獣医により決定され、そして規定通りの試験により決定さ れ得る。 SLF--Gモチーフで構成される免疫原性ポリペプチドをコードするポリヌクレオ チドは、例えば、形質転換、エレクトロポレーション、リポフェクション、およ びアデノ関連ウイルス（AAV）ベクターの使用を含む形質導入を包含する当該分 野で公知の方法によって、そして特に当該分野で公知のレトロウイルス遺伝子転 移方法を用いて、所望の細胞にエキソビボ導入され得る。 遺伝子送達のために組換え感染ウイルス粒子を利用する、当該分野で公知の種 々の感染技術が開発されてきた。レトロウイルスベクターは、真核細胞への遺伝 子転移に非常に有効な方法を提供する。多くのレトロウイルベクター構築物が、 多くの外来遺伝子を発現させるために首尾よく使用されてきた（例えば、Cofin ，in Weissら（編）、RNA Tumor Viruses，第二版、vol.2（Cold Spring Harbor Laboratory，New York，1985，pp.17-71）を参照のこと）。 本発明の他の実施態様では、SLF--Gモチーフを含む免疫原性ポリペプチドをコ ードする組換えポリヌクレオチドは、処置および／または免疫されるべき個体に 直接導入される。これらの実施態様では、ポリヌクレオチドは発現ベクター形態 、およびより好ましくは環状プラスミド形態であることが好ましい。ポリヌクレ オチドは適切な賦形剤と混合され、そして例えば、非経口（例えば、静脈内、腹 腔内、筋肉内、および皮下を含む）摂取、リポフェクション、および経皮を包含 する当該分野で公知の任意の適切な手法により投与される。Ｆ．実施例 例示目的のみで提供されており、そして本発明の範囲を限定しない実施例を、 以下に記載する。本発明の開示を考慮すると、請求の範囲の範囲内にある多くの 実施態様が当業者には明白である。 実施例１ E2HV中の保存モチーフの同定 E2HVドメイン内の１つまたは複数の保存モチーフは、保存特性について世界中 からの分離株由来の90のE2HV配列を調査することにより同定された。調査された HCV配列を図２に示す。調査は、E2HV配列の有意な可変性を示した。 HCV感染後に引続く患者からのE2HV配列データは、変異が、アミノ酸395から40 7の間で高頻度に、そして時間とともに、E2HVドメインの残りの部分を通して現 れることを示している。図３を参照のこと（この図は、３人の患者についての配 列データを示す：Hutchinson（H）（Ogataら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA（19 91）88：3392-3396）；HC-J4（Okamotoら、Virology（1992）188：331-341）； およびNY/RS（Katoら、Biochem．Biophvs．Res．Commun．（1992）181：279-285 ））。 患者RSは、異なるパターンの時間経過に伴って集積される点突然変異のより少 ない無作為な分布を有するようであることもまた、図３より観察される。アミノ 酸置換のRSパターンは、HCV感染患者の一部、および慢性感染チンパンジーで観 察 された（例えば、Weinerら、Vaccines 92（前出）を参照のこと）。例えば、患 者RSおよびNYにおける時間に伴って集積される変異パターンの差違については、 RSのような個体は１つまたは複数のE2HVエピトープに対して抗体を生じないこと によって説明される。正の免疫選択が起こらない場合、配列は、HCV変異体進化 の類似種分布として無作為に変異する。HCV抗原に対して免疫応答が乏しい慢性 感染チンパンジーは、患者RSと類似するE2HV変異パターンを示した。 配列調査の結果を図４に示し、それは、アミノ酸384から407の特性の保存の程 度を示す。２つのE2HV配列は同一ではないが、アミノ酸401から403および406か ら407は、それらの位置のアミノ酸の特性について強く保存されている。アミノ 酸401は、S、G、A、D、K、R、あるいはTであり；アミノ酸402は、L、F、I、M、 あるいはWであり；アミノ酸403は、FあるいはLであり；アミノ酸406は、Gあるい はAであり；アミノ酸407は、A、P、あるいはSである。調査された90配列中のこ れらの位置のアミノ酸の相対分布を、表２に示す。 実施例２ HCV1 E2HVエピトープのマッピング E2/NS1のE2HV領域のエピトープマッピングについては、次の改変を伴って、PC T公開第WO93/00365号を参照のこと。ピンに接続されたHCV1の384から413のアミ ノ酸位にわたる配列由来の重複ペプチドを調製した。そのペプチドは、同じ領域 由来の複合体化30量体ペプチドで免疫したヒツジからのIgG調製物と反応した。 抗HV E2抗体を含有するヒツジIgG調製物は、ジフテリアトキソイドに結合され たペプチドで免疫したヒツジから調製した。そのペプチドは、HCV1 E2HV領域に わたり、次の配列を有した： ここで、Bはブチルアラニンである。 複合体化30量体で免疫したヒツジからのヒツジ血清IgG s1634-2およびs1635-2 を用いるスクリーニングの結果を図５に示す。結果は、ヒツジ1634-2 IgGが最小 （minumum）エピトープ⁴⁰⁰VSLLA⁴⁰⁴と反応することを示す。ヒツジ1635-2からの IgGは、より広範囲の反応性プロフィールを有し、血清は、最小⁴⁰⁰VSLLA⁴⁰⁴エピ トープを含むペプチドと反応し、さらに、最小エピトープ⁴⁰¹SLLAPGA⁴⁰⁷および^{4 03} LAPGA⁴⁰⁷を含むペプチドと反応する。従って、E2HVの30量体ペプチドで免疫し たヒツジからのIgG調製物は、アミノ酸400から407の間の１つまたは複数の直鎖 状エピトープと反応する。 E2HVの保存領域内では、HCV1の保存モチーフ配列は、S-L-L-aa4-aa5-G-（A/P/ S）である。S-L-F-aa4-aa5-G-（A/P/S）モチーフ中でのLのFへの置換は、アミノ 酸特性に関して保存性である。 この実施例で使用される方法を以下に記載する。重複ペプチドの合成 重複ペプチドの合成は以下のようであった。１つのブロッ ク上に８×12配列で並べた特別に調製され誘導体化されたポリエチレンピン（Co selco Mimotopes，Victoria，Australia）は、室温で30分間、そのピンを浴中（ ジメチルホルムアミド（DMF）中の20% v/vピペリジン）に入れることによって調 製した。次に、そのピンを取り出し、DMF中で５分間洗浄し、次に、メタノール 中で４回洗浄した（１回の洗浄あたり２分間）。ピンを少なくとも10分間風乾し 、次に、DMF中で最後の洗浄を行った（５分間）。1-ヒドロキシベンゾトリアゾ ール（HOBt、367mg）を、Fmoc-保護アミノ酸の結合での使用のために、DMF（80m l）中に溶解した：Fmoc-L-Ala-OPfp、Fmoc-L-Cys（Trt）-Opfp、Fmoc-L-Asp（O- tBu）-OPfp、Fmoc-L-Glu（O-tBu）-OPfp、Fmoc-L-Phe-OPfp、Fmoc-Gly-OPfp、Fm oc-L-His（Boc）-OPfp、Fmoc-L-Ile-OPfp、Fmoc-L-Lys（Boc）-OPfp、Fmoc-L-Le u-OPfp、Fmoc-L-Met-OPfp、Fmoc-L-Asn-OPfp、Fmoc-L-Pro-OPfp、Fmoc-L-Gln-OP fp、Fmoc-L-Arg（Mtr）-OPfp、Fmoc-L-Ser（t-Bu）-ODhbt、Fmoc-L-Thr（t-Bu） -ODhbt、Fmoc-L-Val-OPfp、およびFmoc-L-Tyr-OPfp。 保護アミノ酸を、HOBtとともにマイクロタイターウエルに移し、ピンブロック をプレートの上にのせ、ウエル中にピンを浸した。その組み立てたものを、次に プラスチック袋中に封入し、25℃で18時間反応させて第一アミノ酸をピンに結合 させた。次に、ブロックを取り出し、ピンを、DMF（２分）、MeOH（４×２分） で洗浄し、そして再度DMF（２分）で洗浄して清澄化し、結合アミノ酸を脱保護 した。全８量体が調製さ れるまで、結合される各付加アミノ酸についてこの手順を繰り返した。次に、ほ とんどのエピトープがＮ末端に認められず、従って会合正電荷を有さないので、 遊離アミドを補償するために、遊離Ｎ末端をアセチル化した。アセチル化は、マ イクロタイタープレートのウエルを、DMF／無水酢酸／トリエチルアミン（5：2 ：1 ｖ/v/v）で満たし、ピンを20℃で90分間ウエル中で反応させることにより完 了した。次に、そのピンをDMF（２分）およびMeOH（４×２分）で洗浄し、少な くとも10分間風乾した。 ピンを、室温で４時間、ポリプロピレン袋中でトリフルオロ酢酸／フェノール ／ジチオエタン（95：2.5：2.5，v/v/v）で処理して、側鎖保護基を除去した。 次に、ピンをジクロロメタン（２×２分）、5% ジ-イソプロピルエチルアミン／ ジクロロメタン（２×５分）、ジクロロメタン（５分）中で洗浄し、そして少な くとも10分間風乾した。次に、ピンを水（２分）、MeOH（18時間）で洗浄し、真 空乾燥し、シリカゲルを入れた密封プラスチック袋に保存した。結合アッセイ ペプチドへの結合をアッセイするために、上記記載のように調製した８量体保 有ピンをまず、60℃において破砕緩衝液（1% ドデシル硫酸ナトリウム、0.1% 2- メルカプトエタノール、0.1 M NaH₂PO₄）中で30分間音波処理することにより処 理した。次に、ピンを水（60℃）に数回浸し、その後MeOHを煮沸し（２分）、そ して風乾させた。 次に、ピンを、25℃にて１時間、200μLのブロック緩衝液 び0.05% NaN₃）を含むマイクロタイターウエル中で撹拌しながら、プレコートし た。次に、ピンを、E2HVペプチドで免疫したヒツジから得た２つのIgG調製物を 含むマイクロタイターウエルに浸した。抗HCV HV E2抗体含有IgGの調製 ヒツジIgGおよび複合体化ペプチドの調製は以下のようであった。ヒツジを、 完全フロイントアジュバント（CFA）中の50〜100 nmolの複合体化ペプチドで免 疫した。14日後にそのヒツジに２回目の免疫を施したが、しかし複合体化ペプチ ドは不完全フロイントアジュバント中であった。３〜４週間後にそのヒツジから 採血して、そして血清中のIgGを50％硫酸アンモニウムで沈降させた。沈澱を集 めて、1% Triton X-100および0.3% トリ-N-ブチルホスフェート（TNBP）を含有 する溶液で処理した。処理後に、界面活性剤を、50%硫酸アンモニウムでIgG画分 を沈澱させて回収し、その沈澱物を50%硫酸アンモニウム含有溶液で２回洗浄し 、その後、可溶化し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）に対して２日間透析するこ とにより、除去した。得られたIgG調製物を、免疫に使用する前にフィルターに 通過させて滅菌した。ジフテリアトキソイドキャリアタンパク質のMCSへの結合 ペプチド-ジフテリアトキソイド複合体を、以下のプロトコールによって調製 した。 材料： エチレンジアミン四酢酸（EDTA Na₂.2H₂O）（MW 372） 6-マレイミド-カプロン酸 N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（MCS）（Sigma ）-95％純度 オルトリン酸二水素ナトリウム（NaH₂PO₄） 窒素 ジメチルホルムアミド（DMF） Milli Q水 ５mM EDTA含有の0.1 M リン酸緩衝液、pH 6.66 0.1 M リン酸緩衝液、pH 8.0 0.1 M リン酸緩衝液、pH 7.0 コハク酸ナトリウム［（CH₂COONa）₂.6H₂O］ システイン 塩酸（2%溶液） 0.1 M コハク酸ナトリウム／0.1 EDTA、pH 5.6 精製ジフテリアトキソイド（Commonwealth Serum Laboratories，Victoria，A ustralia）を、Leeら、Mol．Immunol．（1980）17：749；Partisら、Prot．Chem ． （1983）2：263；Peetersら、J．Immunol．Methods（1989）120：133；Jones ら、J．Immunol．Methods（1989）123：211に記載されている方法に従って、MCS に結合させた。ジフテリアトキソイド100mlを、G25セファデックスカラム（17cm ×４cm）に通してチオメルサール（thiomersal）を除去した。トキソイドを0.1 M リン酸緩衝液（pH 7.0）で溶出し、溶出物のタンパク質含有量 をBCAタンパク質測定法（Pierce）を用いてアッセイした。得られた溶液を、Ami con限外濾過ユニットで、最終濃度10mg/mlに濃縮した。 トキソイド溶液１mlを、0.1 M リン酸緩衝液（pH 8.0）で透析し、次に200μ ｌ DMF中の1.5mg MCS溶液と混合した。得られた溶液を暗所にて、適宜撹拌しな がら室温で１時間インキュベートした。MCS-トキソイドから非結合MCSを分離す るために、溶液を0.1 M リン酸緩衝液（pH 6.66）で平衡化したセファデックスP D10カラムに通し、タンパク質画分を集めた。 キャリア分子あたり結合されるマレイミド基数は、それにHCVペプチドを結合 する前に測定した。30mlのコハク酸／EDTA緩衝液を窒素で２分間スパージングし た。５mgのシステインを25ml容フラスコに移し、最終容量25mlのスパージングさ れた緩衝液に溶解した。表３に示す溶液のアリコートを、25mlのねじぶた式のビ ンに２組で移した。分離ピペットを用いて、各々のアリコートに窒素をバブリン グした。次に各ビンを密閉し、暗所で40分間、適宜撹拌しながら室温にてインキ ュベートした。 スルフヒドリル定量測定のためのエルマン試験 必要な材料： リン酸緩衝液、pH 8.0 15.6g NaH₂PO₄あるいは12.0gの無水NaH₂PO₄を約700mlのMilli Q水に溶解する 。50% NaOHを用いてpH 8.0に調整する。Milli Qウォーターを加えて最終容量を1 000mlにし、次に必要であればpHを調整する。 エルマン試薬 10.0mgの5,5'-ジチオビス-2-ニトロ安息香酸（DTNB）を、2.5mlのリン酸緩衝 液（pH 8.0）に溶解する。 0.1mlのエルマン試薬を、上記のように調製した、すなわち、試料溶液、標準 溶液、およびブランク（bland）溶液の各0.1mlアリコートに加えた。次に、５ml のリン酸緩衝液（pH 8.0）を各アリコートに加え、よく混合して15分間静置した 。各アリコートの吸光度を、１cm光路長セル中で412nmで測定した。 キャリアタンパク質上に存在するマレイミド基数を次の方法に従って測定した 。溶液１mlあたり0.01μmolの-SHは、１cm光路長セル中で412nmで吸光度0.136を 示す。標準あるいは試料（A）の吸光度は、活性化キャリアタンパク質上の結合 マレイミド基と反応したシステインの量に等しい。１molの有効-SHが１molのマ レイミドと反応するので、試験されるアリコート中に存在するマレイミド基μmo l濃度は、A（0.01）／0.136μmol/mlに等しい。溶液の総容量は5.2mlであった。 従って、存在するμmol総数は、A（0.01）（5.2）/0.136に等しかった。試料溶 液は総容量1.3mlで、そのうち0.3mlは活性化キャリアタンパク質からなるもので あった。試料溶液に存在するマレイミド基数は、A（0.01）（5.2）（1.3）/（0. 136）（0.1）（0.3）=A（16.57）μmol/mlとして計算された。MCS-活性化キャリ アタンパク質は-20℃で貯蔵した。HCVペプチドの還元 HCVペプチドをMCS-活性化キャリアタンパク質に結合する前に、ペプチドに存 在するチオール基が完全還元-SH型であるのを確実にするように、ペプチドを還 元した。 必要な材料： ジチオトレイトール（DTT） 炭酸水素アンモニウム（NH₄HCO₃）、メタノール SEP-PAK（C18カートリッジ、水）、各８mgペプチドにつき１カートリッジ 0.1 M 炭酸水素アンモニウム緩衝液 １ L Milli Q水に7.9g NH₄HCO₃を溶解する。 緩衝液Ａ；Milli Q水中の0.1% v/vトリフルオロ酢酸（TFA） 緩衝液Ｂ；60% v/vアセトニトリル、Milli Q水中の 0.1% v/vTFA 15mgのHCVペプチドを、10倍モル過剰のDTTを含有する0.1 M 炭酸水素アンモニ ウム2.5mlに加えた。得られた溶液をペプチドが溶解するまで混合し、次に室温 で１時間静置した。１組のSEP-PAKを一並びに接続し、この１組のSEP-PAKに約20 mlのメタノールそして20mlの緩衝液Ａを通すことにより活性化した。ペプチド／ DTT試料を１組のSEP-PAKにゆっくり通過させた。DTTを約20mlの緩衝液Ａで溶出 した。還元ペプチドを７mlの緩衝液Ｂで、予め秤量したビンに溶出し、次に一晩 凍結乾燥した。そのビンを秤量して回収ペプチド量を測定した。そして直ちに、 還元ペプチドをMCS活性化キャリアタンパク質に結合させた。HCVペプチドのMCS活性化キャリアタンパク質への結合 ５mM EDTAを含む約100mlの0.1 M リン酸緩衝液（pH 6.66）を真空下で脱気し 、10分間窒素でスパージングした。10mg/mlのMCS活性化キャリアタンパク質溶液 20mlを、過剰に泡立たないように注意深く窒素でスパージングした。５mgの還元 ペプチドを、約0.2mlの脱気スパージングされたリン酸／EDTA緩衝液（pH 6.66） に溶解し、次いでMCS活性化キャリアタンパク質溶液と混合した。得られた混合 物をねじぶた式ビンに移し、次いでその中に窒素を満たし密閉した。ビンをBran 脱気した。そのビンをアルミ箔で覆い、振盪台上でおだやかに撹拌しながら、一 晩室温でインキュベートした。 得られた複合体は可溶性であり、そして非結合ペプチドを、リン酸／EDTA緩衝 液（pH6.66）で平衡化したセファデックスPD 10カラムにその混合物を通すこと により除去した。タンパク質画分を集めた。キャリアタンパク質に複合体化され たペプチド量をアミノ酸分析により決定した。 複合体およびキャリアタンパク質の両方の150μlアリコートのアミノ酸分析を 実施した。キャリアタンパク質によって単独に与えられたアミノ酸レベルの平均 率を測定して、生成された複合体化ペプチド量を算出した。セリン、トレオニン 、トリプトファン、メチオニン、チロシン、およびシステインのレベルは、これ らのアミノ酸は標準的な加水分解条件下で改変されるので、測定しなかった。 実施例３ 抗チロキシンモノクローナル抗体の HCV E2HVドメインペプチドへの結合 チロキシン（T4）に結合するモノクローナル抗体は、Dr．Mario Geysen，Chir on Mimitopes Ltd，Australiaにより調製された。これらの抗体のE2HV領域に広 がる重複ペプチドへの結合を評価した。ピン上のペプチドは、HCV E2HV配列がHC V1のアミノ酸383から413にわたること以外は、本質的に実施例 ２において上述されたように調製した。抗T4モノクローナル抗体のHCV E2HVミミ トープ（mimitope）への結合を２回実施した。結合結果を図６に棒グラフで示し 、無地の棒および陰をつけた棒は２回の各回の試料の結合を示す。図に見られる ように、抗T4抗体は、aa395からaa407にわたるHCV1配列内に含まれるエピトープ と、免疫学的に反応した。 実施例４ 血清タンパク質のHCVへの結合 三種の血清タンパク質、ヒトプレアルブミン、ヒト血清アルブミン、および甲 状腺結合グロブリン（TBG）の、E2HVにわたる重複ペプチドへの結合を実施した 。８量体保有ピンを、実施例１に記載されているように調製した。指摘される血 清タンパク質の８量体への結合は、特定のタンパク質に対して特異的な抗体を使 用した、ELISAアッセイによって測定した。コントロールは、血清タンパク質な しに、各抗体の存在下に行った。結果は、差異プロットとして、図７に示す。結 果に基づくと、トランスチレチンは、超可変領域の少なくとも１つの最小エピト ープに結合するようである。さらに、この結果は、TBGが２つの最小エピトープ に結合し、その１つがSLF--Gモチーフを含むことを示唆する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ 9358−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/02 9453−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/70 21/08 8310−2Ｊ Ｇ０１Ｎ 33/576 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/70 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｇ０１Ｎ 33/576 9162−4Ｂ Ｃ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）感染の処置のために個体に受動免疫する方法で あって、アミノ酸配列aa1-aa2-aa3-aa4-aa5-aa6を含むモチーフに結合し得る抗 体を含む抗体組成物を該個体に投与することを包含し、ここで、 aa1は、S、G、A、D、K、R、あるいはTであり； aa2は、L、F、I、M、あるいはWであり； aa3は、FあるいはLであり； aa4は、任意のアミノ酸であり； aa5は、任意のアミノ酸であり；そして、 aa6は、GあるいはAである、 方法。 ２．前記アミノ酸配列が、aa6に接続された付加アミノ酸aa7をさらに含み、こ こで、aa7は、A、P、あるいはSである、請求項１に記載の方法。 ３．前記抗体組成物が、前記モチーフを含むキャリア複合体化ペプチドで別の 個体を免疫することによって得られる、請求項１あるいは２に記載の方法。 ４．アミノ酸配列aa1-aa2-aa3-aa4-aa5-aa6を有する抗原決定基を認識し得る 抗体： ここで、 aa1は、S、G、A、D、K、R、あるいはTであり； aa2は、L、F、I、M、あるいはWであり； aa3は、FあるいはLであり； aa4は、任意のアミノ酸であり； aa5は、任意のアミノ酸であり；そして、 aa6は、GあるいはAである。 ５．前記アミノ酸配列が、aa6に接続されたもう１つのアミノ酸aa7をさらに含 み、ここで、aa7は、A、P、あるいはSである、請求項４に記載の抗体。 ６．前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項４あるいは５に記載の抗体 。 ７．aa1-aa2-aa3-aa4-aa5-aa6により特徴づけられるモチーフを含む、免疫原 性ポリペプチド： ここで、 aa1は、S、G、A、D、K、R、あるいはTであり； aa2は、L、F、I、M、あるいはWであり： aa3は、FあるいはLであり； aa4は、任意のアミノ酸であり； aa5は、任意のアミノ酸であり；そして、 aa6は、GあるいはAであり、 但し、該モチーフは、1993年5月12日のものとして公知であ るHCV分離株の天然に存在するE2HVドメインの31アミノ酸配列内に含まれていな い。 ８．前記アミノ酸配列が、aa6に接続された付加アミノ酸aa7をさらに含み、こ こで、aa7は、A、P、あるいはSである、請求項７に記載の免疫原性ポリペプチド 。 ９．請求項７あるいは８に記載の少なくとも１つの免疫原性ポリペプチド、お よび薬学的に受容可能なキャリアを含有する、ワクチン。 １０．請求項９に記載のワクチンを個体に投与することを包含する、HCV感染 個体を処置する方法。 １１．生物学的試料中の抗Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）抗体を検出するためのイ ムノアッセイ方法であって、該方法が、 （a）抗HCV抗体を含有する疑いのある抗体含有生物学的試料を、請求項 ７に記載の免疫原性ポリペプチドを含むプローブ抗原とインキュベートし、抗体 -抗原複合体を形成させる工程；および （b）該プローブ抗原を含有する該抗体-抗原複合体を検出する工程； を包含する、方法。