JPH08505764A - 腫瘍血管内皮細胞に特異的に結合するモノクローナル抗体とその利用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、腫瘍血管内皮細胞によって特徴付けられる細胞表面抗体に特異的に結合するモノクローナル抗体に関する。エンドシアリンと呼称さるこの抗体は、糖タンパク質であり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定される分子量が約１６５ｋＤａである。この分子のタンパク質部分の分子量は約９５ｋＤａである。前記モノクローナル抗体及び抗原の様々な利用方法についても記載される。

Description

【発明の詳細な説明】 腫瘍血管内皮細胞に特異的に結合するモノクローナル抗体とその利用方法発明の分野 本発明は、腫瘍学及び免疫学の分野、より詳しくは、腫瘍血管内皮細胞に特異 的に結合するモノクローナル抗体と、これらモノクローナル抗体の製造及び使用 方法に関する。背景及び従来技術 発癌現象には、腫瘍遺伝子及び腫瘍抑制遺伝子の構造及び／又は発現に影響を 与える一連の身体遺伝子的変化が関連している。更に、悪性腫瘍細胞の小さな集 合が、診断上明白な原発のそして転移した腫瘍を形成するには二次的な遺伝子変 化及び後成的メカニズムが必要とされることもある。例えば、固形の新生腫瘍の 場合、それが１〜２ｍｍの直径を越えて成長するためには、通常は反応性ストロ マ線維芽細胞、リンパ系食細胞浸潤物及び細胞外マトリクスタンパク質とともに 、新たに形成された血管の支持ストロマが形成される必要があることがよく知ら れている。反応性腫瘍ストロマの細胞は形質転換しないが、これらは、調節ペプ チド、タンパク質分解酵素、 ＥＣＭタンパク質及び細胞表面抗原の発現におけると同様に、その増殖活動にお いて対応する正常な細胞と異なっている可能性がある。従って、これらは、癌の 薬学的及び免疫学的研究及び阻害に於ける新たなターゲットを提供する可能性が ある。 このようなターゲットの一例は、Ｆ１９細胞表面糖タンパク質であり、これは 胸、結腸、肺、膀胱、すい臓等の一般的な上皮癌の９０％以上の反応性ストロマ 線維芽細胞において発現し、他方、正常な成人細胞においてはほとんど、あるい は全く発現しないものである。このＦ１９細胞表面糖タンパク質とそれに関する 様々な教示は、ギャリン−チェサ（Ｇａｒｉｎ−Ｃｈｅｓａ）他、Ｐｒｏｃ．Ｎ ａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ８７：７２３５〜７２３９（１９９０）；レティッヒ 他（Ｒｅｔｔｉｇ）他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５３ １１０〜３１１４（１９８８）及び米国特許第５，０５９，５２３号に記載され ており、これら３件の全部をここに参考文献として添付する。最近のフェーズＩ 研究に於て、Ｆ１９に対する¹³¹Ｉ標識化モノクローナル抗体が腫瘍部位におい て蓄積し、これによって、患者の結腸直腸癌から転移した肝臓癌の画像化を可能 にすることが判った。この画像化技術の研究に関しては、ウェルト （Ｗｅｌｔ）他、Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．３３：３ １９（１９９２）参照。 腫瘍血管内皮細胞の免疫学的ターゲット化はまだ達成されてはいないが、これ は次に述べるいくつかの理由によって魅力的な研究対象である。その第１の理由 は、内皮細胞表面抗原が、血液中に循環する抗体又は抗原に対して高いアクセス 性を有していることにある。第２の理由は、腫瘍に関係する血管の破壊又は損傷 によって、固体腫瘍の広範囲に渡る壊死、又はその成長の抑制が生じることが期 待されることにある。腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）、ガンマインターフェロン（ ＩＦＮ−γ）、及びメルファラン（melphalan）等のいくつかの抗ガン剤の活動 は、癌を直接的に殺傷するのではなく、むしろ血管上皮細胞を損傷させることに よるものである可能性がある。これらの研究に関する情報については、オールド （Ｏｌｄ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ２３０：６３０〜６３２（１９８５）；リーナルド （Ｌｉｅｎａｒｄ）他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１０：５２〜６０（１９９ ２）；レジョーヌ（Ｌｅｊｅｕｎｅ）、Ｅｕｒ．Ｃｙｔｏｋ．Ｎｅｔ．２：１２ ４（１９９２）を参照。 上述した腫瘍血管内皮細胞のターゲット化のためには、これらの細胞に対する 特異性を有するモノクローナル抗 体（”ｍＡｂ”）が入手可能であることが必要である。モノクローナル抗体の生 産に関する免疫学の分野はコーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）とミルスタイン（Ｍｉｌｓ ｔｅｉｎ）とがハイブリドーマの生成に初めて成功した時以来、大きな進展があ ったが、所望の細胞タイプに対する特異性を備えたモノクローナル抗体を作るこ とは容易でもルーチン的作業ではない。例えば、必要な特異性を備えた抗原が存 在するか、あるいは、ターゲットとする細胞中においてその抗原が発現するもの 仮定しなければならないが、現実には必ずしもそうとは限らない。これは特異性 一般において必須要件であり、血管細胞において不可欠のものである。というの は、腫瘍血管内皮細胞に対して特異的に結合するというよりもむしろ血管細胞一 般に結合するモノクローナル抗体はすべて、正常な血管細胞を標的としてしまい 、その結果、明らかな不都合が生じるからである。 内皮細胞及びこれらから発生する腫瘍に対するモノクローナル抗体は知られて いるが、他の非形質転換細胞を除外して腫瘍血管内皮細胞に対して特異的なモノ クローナル抗体はまだ知られていない。しかし、本発明によって、このようなモ ノクローナル抗体が作られ、これらの抗体が向けられる細胞表面抗原の同定、分 離及び特徴付 けが達成された。これらと、それらから派生する内容とが以下の開示の主題であ る。図面の簡単な説明 図１（Ａ），（Ｂ），（Ｃ）及び（Ｄ）は、様々な腫瘍血管内皮細胞中におい てＦＢ５抗原（エンドシアリン）を検出するための免疫組織化学的染色の研究を 示すものである。ここで、それぞれ、図１（Ａ）は平滑筋肉腫、図１（Ｂ）は腎 臓細胞癌、図１（Ｃ）は骨肉腫、図１（Ｄ）は結腸癌、に関する。これらの研究 は、アビジン−ビオチン免疫ペルオキシダーゼ染色に関するものであり、ヘマト キシリン対比染色剤を使用し、１０ｘ（１Ａ）又は２０ｘ（Ｂ〜Ｄ）の倍率を使 用した。 図２（Ａ）は、様々なタイプの細胞を使用した、ＦＢ５抗原（エンドシアリン ）の免疫化学的分析を示し、 図２（Ｂ）は、細胞ラインＬＡＩ−５ｓの抽出物の免疫ブロット分析を示し、 図２（Ｃ）は、ＦＢ抗原（エンドシアリン）のレクチン結合及び炭水化物分析 を示し、 図３は、特定の染色体フラグメントへのＦＢ５抗原（エンドシアリン）に対す る遺伝子の指定に結び付く研究結果を集約するものである。好適実施例の詳細説明 例１ モノクローナル抗体ＦＢ５を以下のようにして製造した。燐酸バッファ塩類液 中で培養したヒト胎児線維芽細胞を、２ｘ１０⁷細胞／ｍｌの濃度に結合させる ことによって免疫原を作成した。この免疫原を、腹膜内注射（１００ｍｌ）によ って複数のマウス（株（ＢＡＬＢ／ＣｘＡ）Ｆ１）に投与した。同じ免疫原を使 用して、２〜４週間の間隔で４回の追加抗原刺激注射を行った。最後の免疫処置 の３日後、これらのマウスを処理し、その脾臓を切除して、これらを標準的方法 によってＲＰＭＩ１６４０溶媒中の単細胞懸濁液中に分散させた。次に、再び標 準的方法に従って、これらの脾臓細胞を、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を 使用してＨＰＧＲＴ欠失Ｘ６３−Ａｇ８．６５３マウス骨髄腫細胞と融合させた 。 次に、これらの細胞を、ミクロ培養プレート中に分散させ、ＨＡＴ媒質の存在 下において成長させ、融合細胞を非融合細胞から選択した。 培養が得られた後、その上清を、周知の混合血球吸着（”ＭＨＡ”）ロゼット 化アセイを使用してスクリーニングし、免疫化細胞タイプ、即ち、培養ヒト胎児 線維芽細胞に対しては反応するが、上皮細胞（乳ガン、結腸ガ ン、腎臓ガン）群や、神経外胚葉細胞ライン（メラノマ、グリオマ）群に対して は反応しない抗体を得た。 所望の反応の上清を生成する細胞を、制限的希釈技術を利用してクローン化し た。各サブクローン化工程の後、その上清を、ＭＨＡを使用して再スクリーニン グした。これらを４回繰り返して、確実に単一のハイブリッドクローンが分離さ れるようにした。例２ 上述のプロトコルを使用して、ハイブリドーマ細胞ラインＦＢ５とそれによっ て生成されるモノクローナル抗体とを分離した。次に、このモノクローナル抗体 を、多数の細胞ライン、正常細胞、及び癌サンプルに対するスクリーリングに使 用した。ＦＢ５が結合した細胞表面抗原の発現の測定は、前記モノクローナル抗 体の５倍までの一連の希釈溶液（開始希釈度：２０μｇ／ｍｌ）を使用して混合 ＭＨＡロゼット化アセイによって行った。この使用したプロトコルは、レティッ ヒ（Ｒｅｔｔｉｇ）他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：４４８４〜４４８９（１ ９８７）及びレティッヒ（Ｒｅｔｔｉｇ）他、Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．４５：８１５ 〜８２１（１９８５）に記載されている。次の表１にこれらの結果を示す。 次にこれらのデータの解釈に関していくつかコメントする。先ず、線維芽細胞 は、胎児（Ｗ１−３８，ＧＭ０５３８７及びＦ１３５−３５−１８）、新生（Ｈ ｓ２７，Ｈｓ６８）、及び成人（ＦＡ５３７，２ＫＦ−ＡＨ）細胞からのもので あり、線維芽細胞上のターゲット抗原ユビキチーにあることを証明した。 神経芽腫細胞ラインＬＡＩ−５ｓに関しては、これらは、テスト済みで未処理 のものか、あるいは、ノイラミニダーゼによる処理（０．１Ｕ／ｍｌ、３７℃で １時間）、又は、レティッヒ（Ｒｅｔｔｉｇ）他、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃ ｙｔｏｃｈｅｍ．３７：１７７７〜１７８６（１９８９）に従って、沸騰燐酸バ ッファ塩類液中で５分間処理した後のものであった。 ”ＨＵＶＥＣ”細胞は、パッセージ２〜４を使用して様々な個体から得たもの であった。活性化ＨＵＶＥＣ細胞は、ＴＮＦα（５０ｎｇ／ｍｌ），ＩＬ−１β （０．５ｎｇ／ｍｌ），ＴＧＦ−β１（２ｎｇ／ｍｌ）、ＴＰＡ（５μｇ／ｍｌ ），フォルスコリン（５０ｍＭ）、ＩＦＮ−γ（２００Ｕ／ｍｌ）、ｂＦＧＦ（ ５〜２５ｎｇ／ｍｌ），ＩＬ−４（１ｎｇ／ｍｌ）又はＩＬ−６（２０ｎｇ／ｍ ｌ）のいずれか一つによって６又は２４時間、前処理しておいたものである。 これらの細胞に関して、更に、免疫ペルオキシダーゼ染色及び／又は免疫沈降 アセイを使用してＦＢ結合についてテストした。これらのアセイによって、細胞 表面及び細胞間抗原の検出が可能となる。使用したプロトコルの詳細を下記の例 ３において説明する。例３ 免疫沈降アセイを行うにあたって、細胞を、［³⁵Ｓ］−メチオニンと［³⁵Ｓ］ −システイン（Ｔｒａｎｓ³⁵Ｓ標識化ＩＣＮ；４０μＣｉ／ｍｌ）との混合物で 、１８〜２４時間で標識化し、その後、溶解バッファ（０．０１ Ｍ Ｔｒｉｓ −ＨＣｌ，０．１５ Ｍ ＮａＣｌ，０．０１Ｍ ＭｇＣｌ₂，０．５％ Ｎｏ ｎｉｄｅｔ Ｐ−４０，アプロチニン２０μｇ／ｍｌ及び２ｍＭのフェニールメ チルスルフォニルフルオリド）中にて抽出を行った。次に、これらの溶解分離物 を使用して免疫沈降アセイを行い、その後、レティッヒ（Ｒｅｔｔｉｇ）他、Ｐ ｒｏｃＮａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：３１１０〜３１１４（１９ ８８）に従って、ＮａＤｏｄＳＯ₄／ポリアクリルアミドゲル電気泳動及び蛍光 間接撮影を行った。所望の場合には、精製抗原／細胞抽出物を、ノイラミニダー ゼ、エンドグリコシダーゼ Ｈ， （２５ｍＩＵ／ｍｌ），Ｎ−グリカナーゼ（１０Ｕ／ＭＬ）、又はＯ−グリカナ ーゼ（０．１Ｕ／ｍｌ）で消化した。タンパク質グリコシレート化インヒビタ、 即ち、フェニールＮ−アセチル−α−ガラクトースアミニド（５ｍＭ）、モネン シン（１０μｇ／ｍｌ）及びツニカマイシン（５μｇ／ｍｌ）をも使用した。 免疫ペルオキシダーゼを固定、透過細胞に使用した時には、ギャリン−チェサ （Ｇａｒｉｎ−Ｃｈｅｓａ）他、ＰＮＡＳ ８７：７２３５〜７２３９（１９９ ０）及びレティッヒ（Ｒｅｔｔｉｇ）他、ＰＮＡＳ ８５３１１０〜３１１４（ １９８８）に従って、１０〜２０μｇ／ｍｌの濃度のモノクローナル抗体を使用 した。例４ 上述の免疫ペルオキシダーゼ法を使用して、一群の正常な成人組織をテストし た。これらの組織は、イソペンタン中にて冷凍し、液体窒素中にて予備冷却し、 −７０℃にて保存しておいた検死又は外科標本から得たものであった。５ミクロ ン厚の部分を切取り、ポリ−Ｌ−リジン被覆スライド上に配置し、風乾し、アセ トン中（４℃、１０分間）にて固定した。 骨髄サンプルは、異なった方法によってテストした。 即ち、細胞をガラススライド上において広げ、ストレプタビジン−アルカリフォ スファターゼ法を使用してアセイを行った。 その結果を表２に示す。これは、テストされたすべての正常な組織が陰性であ ることを示している。 例５ 細胞ライン及び正常組織に関して得られた結果に鑑みて、正常細胞のテストに 使用したものと同じ方法を使用して一群のヒト腫瘍をテストした。腫瘍血管の内 皮細胞において抗原が検出された。これらの結果を表３に示す。ここで、”Ａ／ Ｂ”という表示に関して、”Ａ”は管末端細胞の陽性表現型を示すサンプルの数 を示し、”Ｂ”はテストされた異なるサンプルの数を示す。ここに使用した略称 は次の通りである。ＡＳＰＳ−歯槽軟質部肉腫；ＰＮＥＴ−初生神経外胚葉腫瘍 ；ＭＰＮＴ−悪性末梢神経鞘腫瘍。 血管が抗原に対して陰性であった正常組織に対して、腫瘍の太部分において、 血管内皮細胞に於けるターゲット抗原の発現が見られた。腫瘍血管構造に関して 、発現は、小血管、主として毛細血管、に限られ、大きな腫瘍 管の内皮細胞には発現はなかった。抗原を示す管の数は、小さなサブセットから 、特定の腫瘍に於けるすべての毛細血管床にまで様々であった。高発現と低発現 を区別する識別可能なパラメータは無かった。例６ 神経芽細胞腫ラインと生体外培養線維芽細胞に対する抗原の発現は、容易に生 化学分析が可能な材料を提供するものである。前述の例２において記載した免疫 沈降プロトコルを、細胞タイプＬＡ１−５ｓ（神経芽細胞腫）、Ｆ１３５−３５ −１８，Ｗ１−３８，ＦＡ−３３４及びＧＭ０１３９８（線維芽細胞）、”ＨＵ ＶＥＣ”（ヒトへそ帯内皮細胞）、平滑筋腫細胞ライン（ＳＷ８７２）、骨肉腫 （ＴＥ８５）、メラノマ（ＳＫ−ＭＥＬ−１９８）及びグリオマ（ＳＸ−ＭＧ− ２８）に対して行った。図２Ａは、免疫沈降研究において、抗原がＮａＤｏｄＳ Ｏ₄ＰＡＧＥに結合した１６５ｋｄのバンドとしてマイグレーションしたことを 示している。 更に、細胞ラインＬＡ１−５ｓ抽出物を使用して免疫ブロット研究も行った。 これには、フェリンガー（Ｆｅｌｌｉｎｇｅｒ）他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５ １：３３６〜３４０（１９９１）のアルカリフォスフ ァターゼ検出システムを使用した。この結果は図２Ｂに示され、ここにも１６５ ｋｄのターゲット抗原が示されている。例７ 上述の諸研究の後、前述の酵素群を使用して、酵素消化、代謝抑制研究を行っ た。図２Ｃはこれらの研究の結果を示している。これらの結果から、前記１６５ ｋｄ抗原が、高度にシアル酸結合Ｏリンクされたオリゴサッカライドを多量に含 む、９５ｋｄ核ポリペプチドから構成されたものであると結論付けられる。これ は、ノイラミニダーゼ（脱シアル酸結合１２０ｋｄタンパク質）及びノイラミニ ダーゼとＯグリカナーゼとの組合せでの処理後の９５ｋｄタンパクの生成から得 られた結果において見られる。酵素エンドグリコシダーゼＨ及びＮ−グリカナー ゼは抗原に対してなんの影響も及ぼさなかった。Ｎ−リンクグリコシレート化を 阻止するツニカマイシンと、ゴルジ装置タンパク質処理を妨害するモネンシンと も、又、前記分子には影響を与えなかった。同様に、５ｍＭのフェニール−α− ＧａｌＮＡｃを細胞に添加した時にも、１２０ｋｄのタンパク質種の分子が得ら れた。この添加分子は、Ｏグリコシレート化のインヒビタと推定さ れるが、そしの正確な活動態様は未知である（クアン（Ｋｕａｎ）他、Ｊ．Ｂｉ ｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４１９２７１〜１９２７７（１９８９））。例８ 前記分子のレクチン結合パターンを調べるために更に研究を行った。これらの 実験において、原始及び非グリコシレート化分子が、麦菌アグルチニンに結合す るか否かを調べるためのテストを行った。というのは、そのような結合によって 、分子のグリコシレート化に於けるシアル酸の存在を確認できるからである。こ れをテストするために、トラン（Ｔｒａｎ）³⁵Ｓ標識化ＬＡ１−５ｓ細胞抽出物 と無細胞培養上清とを、ＣｏｎＡの研究においては溶出剤として２５０ｍＭのα −Ｄ−メチルマンノピラノサイドを、又、ＷＧＡの場合には２５０ｍＭのガラク トースアミンを使用して、麦菌アグルチニン（ＷＧＡセファローズ、及びコンカ ナバリンＡセファローズ（”Ｃｏｎ Ａ”）に添加した。図２Ｃにこれらの実験 の結果を示す。原始抗原は、ＷＧＡ−セファローズに結合するが、他方、上述の 脱シアル酸された抗原は結合しない。原始抗原においては、ＣｏｎＡセファーロ ーズに対する部分的結合が観察された。例９ ＦＢ５によって結合される抗原をコード化する遺伝子の染色***置を特定する 研究を行った。一群のげっ歯類−ヒトハイブリッドの血清分析を、レティッヒ（ Ｒｅｔｔｉｇ）他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８４４８４〜４４８９（１９８７ ）；レティッヒ（Ｒｅｔｔｉｇ）他、ＰＮＡＳ ８１：６４３７〜６４４１（１ ９８４）；レティッヒ（Ｒｅｔｔｉｇ）他、Ｇｅｎｏｍｌｃｓ ６：１７６−１ ８３（１９９１）に従って行った。分析用に選択した細胞は、ＦＢ５⁺ヒト神経 芽腫細胞とマウスＦＢ５−神経芽腫細胞からのハイブリッドであった。このハイ ブリッドは、ヒト染色体補体の異なった部分を有していた。これらの結果を、レ ティッヒ（Ｒｅｔｔｉｇ）他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６４３７〜６４４１（１９８４）に従って分析し、図３に示したように、 該抗原がヒト染色体領域１１ｑ１３−ｑｔｅｒによってコード化されるものであ ると結論される。このような分析は当該技術において周知であるので、ここでは これ以上の説明を省略する。 以上は、他の正常細胞を除外して、癌組織の血管 内皮細胞に特異的に結合するモノクローナル抗体の生成を説明するものである。 これらのモノクロ ーナル抗体は、更に、肉腫組織のサンプルにも結合するので、これらのモノクロ ーナル抗体を肉腫に関しても様々な方法で使用することが可能である。以下の記 載において、腫瘍血管内皮細胞が強調されてはいるが、肉腫の診断、モニタリン グ、治療も本発明に含まれる。従って、本発明の一態様は、腫瘍の血管内皮細胞 に特異的に結合するモノクローナル抗体と、これらのモノクローナル抗体を生成 するハイブリドーマとに関する。一好適実施例において、前記ハイブリドーマ細 胞ラインは、細胞ラインＦＢ５であり、モノクローナル抗体はこの細胞ラインに よって生成される。この細胞ラインは、ブタペスト条約に基づいて既に寄託され 、受け入れ番号−−−−を付与されている。一好適実施例において、前記モノク ローナル抗体は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ測定による分子量が１６５キロダルトンのシ アル酸結合糖タンパク質であり、前記抗原は、腫瘍に関連する血管内皮細胞にお いて存在する。尚、前述のように、以下「エンドシアリン」と呼称する分子は、 それに結合する本発明のモノクローナル抗体によって改変可能である。このよう な改変としては、例えば、部分又は全シアル酸化がある。 ここでいう「モノクローナル抗体」とは、ハイブリドーマによって直接的に作 り出されるモノクローナル抗体 に限られない。この用語は、例えば、Ｆａｂ，Ｆ（ａｂ）₂やその他の結合フラ グメント等の周知の結合フラグメント、互いに複合した複数のモノクローナルを 含むオリゴメリック又はポリメリック構造物、２又はそれ以上のスピーシーズ（ 例えば、ヒトとマウス）からの免疫グロブリンを含有するキメラモノクローナル 抗体、再結合モノクローナル抗体、人体に適応化させた物質、等をも含むもので ある。更に、この用語には、まだ骨髄腫には融合したものではないが、他の方法 、例えばヒトＢ細胞のエプステイン バール（Ｅｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒ）ビー ルス（”ＥＢＶ”）による形質転換、又はその他の形質転換手段により培養可能 とされたヒトＢ細胞によって作られたモノクローナル抗体も含まれる。 本発明の抗体は、腫瘍に関係する血管内皮細胞の位置を同定する診断方法に使 用可能であり、これによって、モノクローナル抗体をアセイ対象サンプルに接触 させ、その結合をモニタする。この結合は、放射化免疫アセイ、酵素リンク免疫 吸着剤アセイ、サンドイッチアセイ、競合アセイ等の当業者に知られた標準的な 免疫アセイプロトコルを使用して検出することが出来るが、その具体的方法はこ れらに限られるものではない。これらのアセイの多くにおいて、抗体に付着され る検出可能な標識の使 用が必要であるが、ここで、放射性、発色性、蛍光性、酵素的、磁気的及び金属 粒子の公知の標識のいずれも使用可能である。これらのアセイを行うに当たって 、対象となるサンプルとしては、例えば、組織サンプルや体液サンプル等がある 。更に、そのモノクローナル抗体の特異性によって、当業者は、これを、ウェル ト（Ｗｅｌｔ）他の上記に記載のものと類似の方法で生体内診断に使用すること ができる。使用可能な種々の生体内診断方法の内、放射化画像化法が特に好適で ある。 本発明のモノクローナル抗体は、例えは、腫瘍関連血管内皮細胞をターゲット とすることが出来るので、これらの抗体は治療において特に有用である。あらゆ る血管床と同様に、腫瘍の血管床がそれに関連する組織に栄養を提供する。従っ て、抗腫瘍治療方法も、本発明の一部をなすものである。この治療方法は、本発 明のモノクローナル抗体を、腫瘍の増殖を抑止する、又は腫瘍を実際に壊死させ るのに十分な量で投与する工程を有する。モノクローナル抗体を、腫瘍に対する 抑止的又は壊死的効果を有する薬剤と組み合わせることによって、抑止又は壊死 を引き起こすことができる。このような薬剤としては、例えば、周知の凝血カス ケードの血塊形成酵素等の血塊形成剤等、腫瘍部位への血液循環を抑止する薬剤 が ある。細胞を破壊し、従って、腫瘍に関連する血管上皮細胞を破壊する他の薬剤 としては、マイトマイシンＣ、金属含有化合物、酵素、リシン鎖、放射性同位元 素等のすべての細胞毒性剤が含まれる。そして、これらの薬剤のいずれかを周知 の方法によって前記モノクローナル抗体と複合させることができる。従って、こ れらのモノクローナル抗体は、ターゲット細胞の破壊のためのキャリアとして作 用する。更に、これらモノクローナル抗体は、リポソーム配送システムと組み合 わせて使用できる。この場合、リポソームに抑止又は壊死性剤を含ませ、モノク ローナル抗体がこれらを血管新生部位を標的とする。更に、これらのモノクロー ナル抗体を、その特異性を維持しつつ、かつ、補体結合性、又は炎症誘発性を有 するように改造すれば、これらのモノクローナル抗体を、第２薬剤無しで、単独 で使用することが可能となる。このような補体結合性又は炎症誘発性を有するモ ノクローナル抗体は、患者において生体内反応を引き起こし、この反応によって ターゲット細胞が破壊される。 前記モノクローナル抗体を、単独で、あるいは上述の種々の物質との組合せで 、種々の試薬として調合することができる。例えば、前記モノクローナル抗体を そのままの状態、あるいは、補体結合／炎症誘発性にしたもの を、薬剤として許容できるキャリアと組み合わせることができる。ここに記載し た様々な物質と組み合わせて使用する場合は、これらをモノクローナル抗体に付 着させて接合体を形成し、次に、この接合体を、薬剤的に許容可能なキャリアと 組み合わせることができる。更に、キットタイプの試薬を作ることも可能であり 、この場合、モノクローナル抗体と第２物質とをそれぞれ別の部分（Portion） として提供し、これらの両方を一つの容器手段に収納する。 本発明の特に好適な実施例において、ここに記載した新規なモノクローナル抗 体は、第２のモノクローナル抗体と組み合わされる。好ましくは、この第２モノ クローナル抗体は、腫瘍細胞、あるいは、腫瘍の反応性ストローマ線維芽細胞に 直接的に結合するものであり、その一例は前述したモノクローナル抗体Ｆ１９で ある。この第２モノクローナル抗体も、更に、前述した新規なモノクローナル抗 体のすべての調製方法によって処方することが可能である（例えば、接合化、補 体結合／炎症誘発性化への処理、等）。 ここでいう「モノクローナル抗体」とは、全体としての前記モノクローナル抗 体だけでなく、ここに記載した結合特異性を保持可能なこれらモノクローナル抗 体のフ ラグメント、非限定的に一例を挙げればＦａｂフラグメン等、をも含むものであ る。又、これらモノクローナル抗体のキメラ及び二機能型も含まれ、ターゲット 抗原に対する特異性を備えた前記モノクローナル抗体のいずれの部分でも他のモ ノクローナル抗体分子の一部と組み合わせることが可能であることが判っている 。これらの他の分子としては、例えば、他のスピーシーズ（ヒト又は他の霊長類 や、げっ歯類）から得られる抗体がある。これらのキメラモノクローナル抗体は 、好ましくは、生成するハイブリッド又は二機能抗体に対して細胞毒活性を付与 するように製造される。 そのような構造物の一例は、ＦＢ５に特有の結合ドメインと、Ｔ細胞又はマク ロファージに対する付着部位との両方を備えた形状改造モノクローナル抗体であ る。その結果、このモノクローナル抗体は、二つの結合特性を有し、Ｔ細胞に関 係する活動のカスケード、あるいはモノクローナル抗体が結合する細胞に対する マクロファージ反応と、更に、隣接する細胞に対する二次的免疫反応との両方を 引き起こすことができる。 前述したように、上述の種々の処方は、いずれも、ターゲット療法においての みならず、肉腫に対する平行したアプローチにおいても腫瘍血管内皮細胞の同定 に有効 である。 本発明は、更に、腫瘍関連血管内皮細胞に特徴的な分離糖タンパク質分子にも 関する。この分子は、原始状態であるグリコシル化状態において、ＳＤＳ−ＰＡ ＧＥ測定で約１６５キロダルトンの分子量を有し、その９５キロダルトンの部分 が該分子のタンパク質「核」として作用する。ここでエンドシアリンと呼称され るこの分子は、それ自身で、前述した特異性を備えたモノクローナル抗体を得る ための免疫原として有効であり、更に、保護モノクローナル抗体を生成するワク チンとしても有効である。このワクチンは、有効量の前記表面抗原エンドシアリ ンと、更に、当該技術分野において公知でワクチンの処方において使用される薬 剤的に許容可能なアジュバントとを含む。 上述したようにエンドシアリンのタンパク質部分のための遺伝子をヒト染色体 の特定のアーム部に局在化することによって、それをコード化する核酸配列の同 定と分離が容易になる。本発明のその他の態様は、当業者にとって明らかである のでここは詳述しない。 使用した用語及び表現は記載のためのものであり限定的なものではなく、これ らの用語及び表現の使用は図示及び記載した特徴構成の均等物を除外するもので はなく、 本発明の範囲内においてその他の様々な改変が可能であると理解される。

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９４年１月１１日 【補正内容】 【図１Ａ】 【図１Ｂ】 【図１Ｃ】 【図１Ｄ】 【図２Ａ】 【図２Ｂ】 【図２Ｃ】 【図３】 【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９４年９月１４日 【補正内容】 ーナル抗体は、更に、肉腫組織のサンプルにも結合するので、これらのモノクロ ーナル抗体を肉腫に関しても様々な方法で使用することが可能である。以下の記 載において、腫瘍血管内皮細胞が強調されてはいるが、肉腫の診断、モニタリン グ、治療も本発明に含まれる。従って、本発明の一態様は、腫瘍の血管内皮細胞 に特異的に結合するモノクローナル抗体と、これらのモノクローナル抗体を生成 するハイブリドーマとに関する。一好適実施例において、前記ハイブリドーマ細 胞ラインは、細胞ラインＦＢ５であり、モノクローナル抗体はこの細胞ラインに よって生成される。この細胞ラインは、ブタペスト条約に基づいて既に寄託され 、１９９２年１１月１２日にメリーランド州、ロックビル、パークローンドライ ブ１２３０１のＡＴＣＣで受け入れ番号ＡＴＣＣ ＨＢ１１１９０を付与されて いる。一好適実施例において、前記モノクローナル抗体は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ測 定による分子量が１６５キロダルトンのシアル酸結合糖タンパク質であり、前記 抗原は、腫瘍に関連する血管内皮細胞において存在する。尚、前述のように、以 下「エンドシアリン」と呼称する分子は、それに結合する本発明のモノクローナ ル抗体によって改変可能である。このような改変としては、例えば、部分又は全 シアル酸化がある。 ここでいう「モノクローナル抗体」とは、ハイブリドーマによって直接的に作り 出されるモノクローナル抗体 に限られない。この用語は、例えば、Ｆａｂ，Ｆ（ａｂ）₂やその他の結合フラ グメント等の周知の結合フラグメント、互いに複合した複数のモノクローナルを 含むオリゴメリック又はポリメリック構造物、２又はそれ以上のスピーシーズ（ 例えば、ヒトとマウス）からの免疫グロブリンを含有するキメラモノクローナル 抗体、再結合モノクローナル抗体、人体に適応化させた物質、等をも含むもので ある。更に、この用語には、まだ骨髄腫には融合したものではないが、他の方法 、例えはヒトＢ細胞のエプステイン バール（Ｅｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒ）ビー ルス（”ＥＢＶ”）による形質転換、又はその他の形質転換手段により培養可能 とされたヒトＢ細胞によって作られたモノクローナル抗体も含まれる。 本発明の抗体は、腫瘍に関係する血管内皮細胞の位置を同定する診断方法に使 用可能であり、これによって、モノクローナル抗体をアセイ対象サンプルに接触 させ、その結合をモニタする。この結合は、放射化免疫アセイ、酵素リンク免疫 吸着剤アセイ、サンドイッチアセイ、競合アセイ等の当業者に知られた標準的な 免疫アセイプロトコルを使用して検出することが出来るが、その具体的方法はこ れらに限られるものではない。これらのアセイの多くにおいて、抗体に付着され る検出可能な標識の使 用が必要であるが、ここで、放射性、発色性、蛍光性、酵素的、磁気的及び金属 粒子の公知の標識のいずれも使用可能である。これらのアセイを行うに当たって 、対象となるサンプルとしては、例えば、組織サンプルや体液サンプル等がある 。更に、そのモノクローナル抗体の特異性によって、当業者は、これを、ウェル ト（Ｗｅｌｔ）他の上記に記載のものと類似の方法で生体内診断に使用すること ができる。使用可能な種々の生体内診断方法の内、放射化画像化法が特に好適で ある。 本発明のモノクローナル抗体は、例えば、腫瘍関連血管内皮細胞をターゲット とすることが出来るので、これらの抗体は治療において特に有用である。あらゆ る血管床と同様に、腫瘍の血管床がそれに関連する組織に栄養を提供する。従っ て、抗腫瘍治療方法も、本発明の一部をなすものである。この治療方法は、本発 明のモノクローナル抗体を、腫瘍の増殖を抑止する、又は腫瘍を実際に壊死させ るのに十分な量で投与する工程を有する。モノクローナル抗体を、腫瘍に対する 抑止的又は壊死的効果を有する薬剤と組み合わせることによって、抑止又は壊死 を引き起こすことができる。このような薬剤としては、例えば、周知の凝血カス ケードの血塊形成酵素等の血塊形成剤等、腫瘍部位への血液循環を抑止する薬剤 が ある。細胞を破壊し、従って、腫瘍に関連する血管上皮細胞を破壊する他の薬剤 としては、マイトマイシンＣ、金属含有化合物、酵素、リシン鎖、放射性同位元 素等のすべての細胞毒性剤が含まれる。そして、これらの薬剤のいずれかを周知 の方法によって前記モノクローナル抗体と複合させることができる。従って、こ れらのモノクローナル抗体は、ターゲット細胞の破壊のためのキャリアとして作 用する。更に、これらモノクローナル抗体は、リポソーム配送システムと組み合 わせて使用できる。この場合、リポソームに抑止又は壊死性剤を含ませ、モノク ローナル抗体がこれらを血管新生部位を標的とする。更に、これらのモノクロー ナル抗体を、その特異性を維持しつつ、かつ、補体結合性、又は炎症誘発性を有 するように改造すれば、これらのモノクローナル抗体を、第２薬剤無しで、単独 で使用することが可能となる。このような補体結合性又は炎症誘発性を有するモ ノクローナル抗体は、患者において生体内反応を引き起こし、この反応によって ターゲット細胞が破壊される。 前記モノクローナル抗体を、単体で、あるいは上述の種々の物質との組合せで 、種々の試薬として調合することができる。例えば、前記モノクローナル抗体を そのままの状態、あるいは、補体結合／炎症誘発性にしたもの を、薬剤として許容できるキャリアと組み合わせることができる。ここに記載し た様々な物質と組み合わせて使用する場合は、これらをモノクローナル抗体に付 着させて接合体を形成し、次に、この接合体を、薬剤的に許容可能なキャリアと 組み合わせることができる。更に、キットタイプの試薬を作ることも可能であり 、この場合、モノクローナル抗体と第２物質とをそれぞれ別の部分（portion） として提供し、これらの両方を一つの容器手段に収納する。 本発明の特に好適な実施例において、ここに記載した新規なモノクローナル抗 体は、第２のモノクローナル抗体と組み合わさせる。好ましくは、この第２モノ クローナル抗体は、腫瘍細胞、あるいは、腫瘍の反応性ストローマ線維芽細胞に 直接的に結合するものであり、その一例は前述したモノクローナル抗体Ｆ１９で ある。この第２モノクローナル抗体も、更に、前述した新規なモノクローナル抗 体のすべての調製方法によって処方することが可能である（例えば、接合化、補 体結合／炎症誘発性化への処理、等）。 ここでいう「モノクローナル抗体」とは、全体としての前記モノクローナル抗 体だけでなく、ここに記載した結合特異性を保持可能なこれらモノクローナル抗 体のフ ラグメント、非限定的に一例を挙げればＦａｂフラグメン等、をも含むものであ る。又、これらモノクローナル抗体のキメラ及び二機能型も含まれ、ターゲット 抗原に対する特異性を備えた前記モノクローナル抗体のいずれの部分でも他のモ ノクローナル抗体分子の一部と組み合わせることが可能であることが判っている 。これらの他の分子としては、例えば、他のスピーシーズ（ヒト又は他の霊長類 や、げっ歯類）から得られる抗体がある。これらのキメラモノクローナル抗体は 、好ましくは、生成するハイブリッド又は二機能抗体に対して細胞毒性活性を付 与するように製造される。 そのような構造物の一例は、ＦＢ５に特有の結合ドメインと、Ｔ細胞又はマク ロファージに対する付着部位との両方を備えた形状改造モノクローナル抗体であ る。その結果、このモノクローナル抗体は、二つの結合特性を有し、Ｔ細胞に関 係する活動のカスケード、あるいはモノクローナル抗体が結合する細胞に対する マクロファージ反応と、更に、隣接する細胞に対する二次的免疫反応との両方を 引き起こすことができる。 前述したように、上述の種々の処方は、いずれも、ターゲット療法においての みならず、肉腫に対する平行したアプローチにおいても腫瘍血管内皮細胞の同定 に有効 である。 本発明は、更に、腫瘍関連血管内皮細胞の特徴的な分離糖タンパク質分子にも 関する。この分子は、原始状態であるグリコシル化状態において、ＳＤＳ−ＰＡ ＧＥ測定で約１６５キロダルトンの分子量を有し、その９５キロダルトンの部分 が該分子のタンパク質「核」として作用する。ここでエンドシアリンと呼称され るこの分子は、それ自身で、前述した特異性を備えたモノクローナル抗体を得る ための免疫原として有効であり、更に、保護モノクローナル抗体を生成するワク チンとしても有効である。このワクチンは、有効量の前記表面抗原エンドシアリ ンと、更に、当該技術分野において公知でワクチンの処方において使用される薬 剤的に許容可能なアジュバントとを含む。 上述したようにエンドシアリンのタンパク質部分のための遺伝子をヒト染色体 の特定のアーム部に局在化することによって、それをコード化する核酸配列の同 定と分離が容易になる。本発明のその他の態様は、当業者にとって明らかである のでここは詳述しない。 使用した用語及び表現は記載のためのものであり限定的なものではなく、これ らの用語及び表現の使用は図示及び記載した特徴構成の均等物を除外するもので はなく、 本発明の範囲内においてその他の様々な改変が可能であると理解される。請求の範囲： １． 腫瘍に関連する血管内皮細胞によって発現される抗原に対して特異的に結 合し、正常な血管内皮細胞には結合しないモノクローナル抗体であって、前記抗 原が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ測定で約１６５キロダルトンの分子量を有するシアル酸 結合糖タンパク質であり、そのタンパク質部分が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ測定で約９ ５キロダルトンの分子量を有するモノクローナル抗体。 ２． 請求項１のモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマ細胞ライン。 ３． 請求項１のモノクローナル抗体の抗原結合フラグメント。 ４． 請求項１のモノクローナル抗体であって、該モノクローナル抗体の少なく とも一部はキメラ化されている。 ５． 腫瘍を同定する方法であって、患者から採取されたサンプルを、腫瘍関連 血管内皮細胞の結合に有利な条件下において、請求項１のモノクローナル抗体と 接触させる工程と、前記結合を検出して前記腫瘍を同定する工程とを有する方法 。 ６． 請求項５の方法であって、前記モノクローナル抗体は、検出可能な標識で 標識化される。 ７． 請求項６の方法であって、前記検出可能標識は、放射性、発色性、蛍光性 、酵素又は金属性粒子、あるいは磁性粒子である。 ８． 請求項５の方法であって、前記サンプルは組織サンプルである。 ９． 請求項５の方法であって、前記サンプルは体液サンプルである。 １０．腫瘍を有する患者を治療する方法であって、前記腫瘍の発育を抑止するか 、もしくは、該腫瘍の細胞壊死を引き起こすのに十分な量の治療剤を投与する工 程を有し、前記治療剤が請求項１のモノクローナル抗体を含む。 １１．請求項１０の方法であって、前記モノクローナル抗体が、血塊形成剤と複 合される。 １２．請求項１０の方法であって、前記モノクローナル抗体が、金属含有化合物 と複合される。 １３．請求項１０の方法であって、前記モノクローナル抗体が、リポソーム配送 システムと複合される。 １４．請求項１０の方法であって、前記モノクローナル抗体が、細胞毒剤と複合 される。 １５．請求項１０の方法であって、前記モノクローナル抗体が、炎症誘発又は補 体結合形態で投与される。 １６．請求項１０の方法であって、前記モノクローナル抗体が、酵素と複合され る。 １７．腫瘍の治療に有効な試薬であって、該試薬は、（ｉ）請求項１のモノクロ ーナル抗体と、（ｉｉ）腫瘍の細胞に特異的に結合する第２のモノクローナル抗 体、との混合物を含む。 １８．請求項１７の試薬であって、更に、薬剤的に許容可能なキャリアを有する 。 １９．請求項１７の試薬であって、前記第２モノクローナル抗体はＦ１９である 。 ２０．請求項１７の試薬であって、前記第１及び第２モノクローナル抗体は、キ ットの形態として、別々の容器に分離収納されている。 ２１．腫瘍関連血管内皮細胞に見いだされ、正常な血管内皮細胞には見いだされ ない分離シアル酸結合糖タンパク質であって、該分離シアル酸結合糖タンパク質 は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ測定で約１６５キロダルトンの分子量を有し、そのタンパ ク質部分は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ測定で約９５キロダルトンの分子量を有する。 ２２．請求項２１の糖タンパク質の免疫原部分と、薬剤的に許容可能なアジュバ ントとを有するワクチン。 ２３．請求項１のモノクローナル抗体であって、ハイブ リドーマ細胞ラインＡＴＣＣ ＨＢ１１１９０によって生成される。 ２４．寄託受け入れ番号ＡＴＣＣ ＨＢ１１１９０を付与された請求項２のハイ ブリドーマ細胞ライン。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 39/395 ＡＤＵ Ｔ 9284−4Ｃ 45/00 8415−4Ｃ Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｂ 8615−4Ｃ Ｃ０７Ｋ 14/47 8318−4Ｈ 16/30 8318−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 5/10 15/02 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｖ 8310−2Ｊ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ギャリン‐チェサ，ピラー アメリカ合衆国 ニューヨーク 10021 ニューヨーク シックスティサード・スト リート・イースト 504 (72)発明者 レティッヒ，ヴォルフガング，ジェイ アメリカ合衆国 ニューヨーク 10021 ニューヨーク シックスティサード・スト リート・イースト 504 (72)発明者 オールド，ロイド，ジェイ アメリカ合衆国 ニューヨーク 10021 ニューヨーク ウェスト・エンド・アベニ ュー 600

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 腫瘍に関連する血管内皮細胞に特異的に結合し、正常な血管内皮細胞には 結合しないモノクローナル抗体。 ２． 約１６５キロダルトンの分子量を有するシアル酸結合糖タンパク質に特異 的に結合する請求項１に記載のモノクローナル抗体。 ３． 請求項１のモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマ細胞ライン。 ４． 請求項１のモノクローナル抗体の結合フラグメント。 ５． 請求項１のモノクローナル抗体であって、該モノクローナル抗体の少なく とも一部はキメラ化されている。 ６． 腫瘍を同定する方法であって、患者から採取されたサンプルを、腫瘍関連 血管内皮細胞の結合に有利な条件下において、請求項１のモノクローナル抗体と 接触させる工程と、前記結合を検出して前記腫瘍を同定する工程とを有する方法 。 ７． 請求項６の方法であって、前記モノクローナル抗体は、検出可能な標識で 標識化される。 ８． 請求項７の方法であって、前記検出可能ラベルは、 放射性、発色性、蛍光性、酵素又は金属性粒子、あるいは磁性粒子である。 ９． 請求項６の方法であって、前記サンプルは組織サンプルである。 １０．請求項６の方法であって、前記サンプルは体液サンプルである。 １１．腫瘍を有する患者を治療する方法であって、前記腫瘍の発育を抑止するか 、もしくは、該腫瘍の細胞壊死を引き起こすのに十分な量の治療剤を投与する工 程を有し、前記治療剤が請求項１のモノクローナル抗体を含む。 １２．請求項１１の方法であって、前記モノクローナル抗体が、血塊形成剤と復 合される。 １３．請求項１１の方法であって、前記モノクローナル抗体が、金属含有化合物 と複合される。 １４．請求項１１の方法であって、前記モノクローナル抗体が、リポソーム配送 システムと複合される。 １５．請求項１１の方法であって、前記モノクローナル抗体が、細胞毒剤と複合 される。 １６．請求項１１の方法であって、前記モノクローナル抗体が、炎症誘発又は補 体結合形態で投与される。 １７．請求項１１の方法であって、前記モノクローナル 抗体が、酵素と複合される。 １８．腫瘍の治療に有効な試薬であって、（ｉ）腫瘍に関連する血管内皮細胞に 特異的に結合する第１モノクローナル抗体と、（ｉｉ）腫瘍の細胞に特異的に結 合する第２モノクローナル抗体、とを有する。 １９．請求項１８の試薬であって、更に、薬剤的に許容可能なキャリアを有する 。 ２０．請求項１８の試薬であって、前記第１モノクローナル抗体は、分子量が約 １６５キロダルトンのシアル酸結合糖タンパク質に特異的に結合し、前記第２モ ノクローナル抗体はＦ１９である。 ２１．請求項１のモノクローナル抗体の復数の分子を有するオリゴメリック抗体 複合物。 ２２．請求項１８の試薬であって、前記第１及び第２モノクローナル抗体は、キ ットの形態として、別々の容器に分離収納されている。 ２３．１５０キロダルトンの分子量を有し、腫瘍関連血管内皮細胞に特異的に存 在する分離シアル酸結合糖タンパク質。 ２４．請求項２３の糖タンパク質のタンパク質部分をコード化する分離アミノ酸 配列。 ２５．請求項２３の糖タンパク質の免疫原部分と、薬剤 的に許容可能なアジュバントとを有するワクチン。