JP2002502621A - 乳腫瘍を伴うムチンに対する特異性のある抗体、その生産方法及び使用方法 - Google Patents
乳腫瘍を伴うムチンに対する特異性のある抗体、その生産方法及び使用方法Info
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- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
Abstract
(57)【要約】
癌種細胞からのＭＵＣ１タンデムリピートの炭水化物構造に特異的に結合する免疫的に活性のあるポリペプチドで、a) 胸部癌患者の腫瘍細胞を含有する腹水からの200 から440 ｋＤａの糖蛋白フラクションへの前記ポリペプチドの親和力と、通常細胞からの未処理のＭＵＣ１抗原（400 から440 ｋＤａ）への前記ポリペプチドの親和力との商が100 ：１以上であり（分子量領域はＳＤＳゲル電気泳動により分析）、b) 前記ポリペプチドはグリコシル化されていないＭＵＣ１抗原には結合せず、c) 前記糖蛋白フラクションがノイラミニダーゼで処理されてＮ−末端ノイラミン酸が解裂するか、又はホルマリンで処理されたときに、前記200 から440 ｋＤａの糖蛋白フラクションへの前記ポリペプチドの結合が10％以下だけ変化し、かつＭＵＣ１に特異的で、胸部癌の診断及び治療に有用である。
Description
【０００１】 本発明は、乳腫瘍を伴うムチン抗原ＭＵＣ１に対する新規で特異性のある抗体
、その生産方法、及び診断的又は治療的な使用方法に関する。
、その生産方法、及び診断的又は治療的な使用方法に関する。
【０００２】 ＭＵＣ１腫瘍を伴う抗原（多型質の上皮ムチン、ＰＥＭ）は、Ｏ−結合でセリ
ンとスレオニン残基に接続する多オリゴ糖側鎖を有する高分子糖蛋白（＞200 ｋ
Ｄａ）である。これらは、染色体１の非常に広く変わり得る遺伝子座（領域21ｑ
）により解読される。ＭＵＣ１は、細胞表面から200 〜500 nm以上広がる管状上
皮細胞の発光表面の膜透過性の糖蛋白である。それは、主としてアミノ酸20個の
タンデムリピートから成る単一の細胞外ドメインを含む。ＭＵＣ１中のタンデム
リピート（領域20〜120 、平均60）の数（ＶＮＴＲ、タンデムリピートの可変数
）は、遺伝子の多型質の結果として大きく変化する。各タンデムリピートでは、
４個までのセリン／スレオニン残基がグリコシレーション用に使用される。短い
糖側鎖はＮ−アセチルガラクトサミン及びガラクトースで始まる（核１構造）。
通常の上皮細胞では、該核１構造はＮ−アセチルガラクトサミン、フコース及び
シアリン酸の追加で延びていく。
ンとスレオニン残基に接続する多オリゴ糖側鎖を有する高分子糖蛋白（＞200 ｋ
Ｄａ）である。これらは、染色体１の非常に広く変わり得る遺伝子座（領域21ｑ
）により解読される。ＭＵＣ１は、細胞表面から200 〜500 nm以上広がる管状上
皮細胞の発光表面の膜透過性の糖蛋白である。それは、主としてアミノ酸20個の
タンデムリピートから成る単一の細胞外ドメインを含む。ＭＵＣ１中のタンデム
リピート（領域20〜120 、平均60）の数（ＶＮＴＲ、タンデムリピートの可変数
）は、遺伝子の多型質の結果として大きく変化する。各タンデムリピートでは、
４個までのセリン／スレオニン残基がグリコシレーション用に使用される。短い
糖側鎖はＮ−アセチルガラクトサミン及びガラクトースで始まる（核１構造）。
通常の上皮細胞では、該核１構造はＮ−アセチルガラクトサミン、フコース及び
シアリン酸の追加で延びていく。
【０００３】 ムチン類の生理的機能は十分には解明されていない。多くの器官でムチン類は
ｐＨ変化に対し及び機械的及び微生物的ダメージから上皮細胞を保護している可
能性が高い。乳汁中の分化した胸上皮により、及び分泌上皮により他の器官中で
も、ムチン類は大量に分泌される。 腫瘍細胞中でＭＵＣ１の発現は多くの重要な変化を示す。これらは、a)分極し
かつ制限された発光発現のロス、b)アップ・レギュレーション及び分泌、c)変形
グリコシル化から生ずる新規な炭水化物エピトープの出現及び隠蔽ヘプチドエピ
トープのアンマスキング、を含む。
ｐＨ変化に対し及び機械的及び微生物的ダメージから上皮細胞を保護している可
能性が高い。乳汁中の分化した胸上皮により、及び分泌上皮により他の器官中で
も、ムチン類は大量に分泌される。 腫瘍細胞中でＭＵＣ１の発現は多くの重要な変化を示す。これらは、a)分極し
かつ制限された発光発現のロス、b)アップ・レギュレーション及び分泌、c)変形
グリコシル化から生ずる新規な炭水化物エピトープの出現及び隠蔽ヘプチドエピ
トープのアンマスキング、を含む。
【０００４】 従ってムチン類は診断的及び治療的アプローチ用のマーカーとして大きなイン
パクトを有する。アンダーグリコシル化のＭＵＣ１は、胸部、卵巣、膵臓及び他
の癌細胞で高度に発現し、非ＭＨＣ制限Ｔ細胞としてだけでなくＨＬＡ制限Ｔ細
胞として認識できる。多くのグループは、ＭＵＣ１・ＶＮＴＲのＡＰＤＴＲエピ
トープが胸部及び他の癌の患者から単離された細胞独Ｔリンパ球のターゲットで
あると説明している（フィンらの概説、1995年）。更にＢ細胞免疫応答の存在は
、卵巣癌種及び胸部癌の患者中で証明された（Ａ．ルゲッティら、Cancer Res.
53 (1993) 2457─2461) 。従って、ＭＵＣ１は細胞の免疫治療の、例えば高い投
与量の化学的治療やＰＢＳＣＴ（辺縁血ステム細胞治療）を受けている胸部癌患
者のＣＤ34富化辺縁血細胞からエキスビボで生成するＭＵＣ１−変換された樹枝
状細胞（ＤＣｓ）のワクチンによる、ターゲットである。他の可能性は、合成Ｍ
ＵＣ１ペプチド、アンダーグリコシル化のＭＵＣ１又はＭＵＣ１−ＤＮＡによる
活性免疫処置である。他の可能性は、ＭＵＣ１に対する特異性を有するネズミ、
ヒト化され又はヒトのマブ（mab)、好ましくは癌種細胞により生産されるアンダ
ーグリコシル化ムチンのグリコン又はペプチドエピトープと反応する抗体を使用
する受動的な免疫処置である。
パクトを有する。アンダーグリコシル化のＭＵＣ１は、胸部、卵巣、膵臓及び他
の癌細胞で高度に発現し、非ＭＨＣ制限Ｔ細胞としてだけでなくＨＬＡ制限Ｔ細
胞として認識できる。多くのグループは、ＭＵＣ１・ＶＮＴＲのＡＰＤＴＲエピ
トープが胸部及び他の癌の患者から単離された細胞独Ｔリンパ球のターゲットで
あると説明している（フィンらの概説、1995年）。更にＢ細胞免疫応答の存在は
、卵巣癌種及び胸部癌の患者中で証明された（Ａ．ルゲッティら、Cancer Res.
53 (1993) 2457─2461) 。従って、ＭＵＣ１は細胞の免疫治療の、例えば高い投
与量の化学的治療やＰＢＳＣＴ（辺縁血ステム細胞治療）を受けている胸部癌患
者のＣＤ34富化辺縁血細胞からエキスビボで生成するＭＵＣ１−変換された樹枝
状細胞（ＤＣｓ）のワクチンによる、ターゲットである。他の可能性は、合成Ｍ
ＵＣ１ペプチド、アンダーグリコシル化のＭＵＣ１又はＭＵＣ１−ＤＮＡによる
活性免疫処置である。他の可能性は、ＭＵＣ１に対する特異性を有するネズミ、
ヒト化され又はヒトのマブ（mab)、好ましくは癌種細胞により生産されるアンダ
ーグリコシル化ムチンのグリコン又はペプチドエピトープと反応する抗体を使用
する受動的な免疫処置である。
【０００５】 1996年11月17〜23日にサンディエゴで開催されたＩＳＯＢＭ ＴＤ−４研究集
会で、ＭＵＣ１ムチンに対する56の単クローン抗体が分析された（Ｍ．Ｒ．プラ
イスらのＩＳＯＢＭ ＴＤ−４研究集会の総括リポート、「ＭＵＣ１ムチンに対
する56の単クローン抗体の分析」、Tumor Biol. 19, suppl. 1(1998) 1-20 、ス
イス国バーゼルのＳ．カーガーＡＧ）。この研究集会には16の研究グループが参
加した。多くの抗体（34／56）はグリコシル化されていないＭＵＣ１ムチンの蛋
白質の核の20のアミノ酸タンデムリピートのシーケンス内に位置するエピトープ
を定めた。これらのマブの多くはＭＵＣ１蛋白質核の親水性のデターミナントと
反応した。
会で、ＭＵＣ１ムチンに対する56の単クローン抗体が分析された（Ｍ．Ｒ．プラ
イスらのＩＳＯＢＭ ＴＤ−４研究集会の総括リポート、「ＭＵＣ１ムチンに対
する56の単クローン抗体の分析」、Tumor Biol. 19, suppl. 1(1998) 1-20 、ス
イス国バーゼルのＳ．カーガーＡＧ）。この研究集会には16の研究グループが参
加した。多くの抗体（34／56）はグリコシル化されていないＭＵＣ１ムチンの蛋
白質の核の20のアミノ酸タンデムリピートのシーケンス内に位置するエピトープ
を定めた。これらのマブの多くはＭＵＣ１蛋白質核の親水性のデターミナントと
反応した。
【０００６】 残りの22の抗体の中で、16の抗体のエピトープ中に炭水化物の残基が含まれる
という証拠があった（表１）。免疫原のタイプと各抗体の間には明確な関係はな
かった。直接的な結合のアセッイ又は合成配位子の能力を決定して抗体結合相互
作用を抑制することのいずれかにより、合成ペプチド及び糖ペプチドは、各抗体
とのそれらの反応性を分析された。炭水化物エピトープの特性を明らかにするこ
とはペプチドエピトープの場合より難しかった（Ｏ．Ｅ．ガラニアら、Tumor Bi
ol. 19, suppl. 1(1998)79−87）。エピトープの接近性を制御することにより、
又はデターミナントをマスクすることにより、又はＭＵＣ１蛋白質核内でペプチ
ドエピトープの好ましい配座を安定化することにより、炭水化物残基は多くのエ
ピトープ中に含まれるようになる。従って炭水化物エピトープの特性化は蛋白質
核エピトープの場合より問題であった。
という証拠があった（表１）。免疫原のタイプと各抗体の間には明確な関係はな
かった。直接的な結合のアセッイ又は合成配位子の能力を決定して抗体結合相互
作用を抑制することのいずれかにより、合成ペプチド及び糖ペプチドは、各抗体
とのそれらの反応性を分析された。炭水化物エピトープの特性を明らかにするこ
とはペプチドエピトープの場合より難しかった（Ｏ．Ｅ．ガラニアら、Tumor Bi
ol. 19, suppl. 1(1998)79−87）。エピトープの接近性を制御することにより、
又はデターミナントをマスクすることにより、又はＭＵＣ１蛋白質核内でペプチ
ドエピトープの好ましい配座を安定化することにより、炭水化物残基は多くのエ
ピトープ中に含まれるようになる。従って炭水化物エピトープの特性化は蛋白質
核エピトープの場合より問題であった。
【０００７】 小さいオリゴ糖の直鎖状及び分枝状の異性体のための置換の可能性のある数は
1000のうちの10に達することがある（Ｒ．Ａ．ライン、Glycobiology, 4 (1994)
1-9) 。この研究集会からの発見は、ＭＵＣ１に対する抗体用炭水化物エピトー
プ類の割り当て及び定義の幾らかの複雑性において強調される（Ｋ．Ｏ．ロイド
、Tumor Biol. 19, suppl. 1(1998)118-121)。これらのマブのうちの８個は、溶
性で腫瘍を伴う、ＺＲ75胸部癌種細胞のＭＵＣ１と反応しなかった。４個のマブ
のみが、反復するＭＵＣ１タンデムリピートペプチドと非反応性であるが、乳汁
中に分泌される乳汁分泌を伴うＭＵＣ１に強い結合を有していた。非常に制限さ
れた反応性はクローンＦＨ６により行われるが、シアロシル−Ｌｅx 糖脂質特異
性を有するこのマブはＴ−47Ｄ細胞中の膜スポット及びゴルジ・コンプレックス
とのみ弱い反応性を有している（Ｊ．フクシら、J. Biol. Chem. 259 (1984) 10
511-10517)。ＦＨ６からＭＵＣ１への結合はノイラミニダーゼ処理により強く影
響される。
1000のうちの10に達することがある（Ｒ．Ａ．ライン、Glycobiology, 4 (1994)
1-9) 。この研究集会からの発見は、ＭＵＣ１に対する抗体用炭水化物エピトー
プ類の割り当て及び定義の幾らかの複雑性において強調される（Ｋ．Ｏ．ロイド
、Tumor Biol. 19, suppl. 1(1998)118-121)。これらのマブのうちの８個は、溶
性で腫瘍を伴う、ＺＲ75胸部癌種細胞のＭＵＣ１と反応しなかった。４個のマブ
のみが、反復するＭＵＣ１タンデムリピートペプチドと非反応性であるが、乳汁
中に分泌される乳汁分泌を伴うＭＵＣ１に強い結合を有していた。非常に制限さ
れた反応性はクローンＦＨ６により行われるが、シアロシル−Ｌｅx 糖脂質特異
性を有するこのマブはＴ−47Ｄ細胞中の膜スポット及びゴルジ・コンプレックス
とのみ弱い反応性を有している（Ｊ．フクシら、J. Biol. Chem. 259 (1984) 10
511-10517)。ＦＨ６からＭＵＣ１への結合はノイラミニダーゼ処理により強く影
響される。
【０００８】 抗−ＭＵＣ１−抗体12Ｈ12（Ｇ．バステルトら、リガード・ブリュナー・エデ
ィション中の生薬学的研究における免疫欠損動物、バーゼル・カーガー、1987、
224-227)は、全ての胸部癌の96％で発現するＴＡＧ12として知られる腫瘍を伴う
抗原と反応する。該抗原は胸部癌組織の細胞質及び細胞膜中及びメタスターゼ中
で高濃度で見出すことができ、腫瘍細胞中に分泌される。 この抗体は、Ｔ．Ｈ．ブリュメンドルフらにより記述されているように（Canc
er Research 54 (1994) 4162-4168)、ヒトの乳癌種の異種移植片の免疫シンチグ
ラフィー用として使用できた。しかしこれらの抗体の特性の程度も、ルーチンの
診断や治療の用途に適切なものにするためには、十分に高くない。
ィション中の生薬学的研究における免疫欠損動物、バーゼル・カーガー、1987、
224-227)は、全ての胸部癌の96％で発現するＴＡＧ12として知られる腫瘍を伴う
抗原と反応する。該抗原は胸部癌組織の細胞質及び細胞膜中及びメタスターゼ中
で高濃度で見出すことができ、腫瘍細胞中に分泌される。 この抗体は、Ｔ．Ｈ．ブリュメンドルフらにより記述されているように（Canc
er Research 54 (1994) 4162-4168)、ヒトの乳癌種の異種移植片の免疫シンチグ
ラフィー用として使用できた。しかしこれらの抗体の特性の程度も、ルーチンの
診断や治療の用途に適切なものにするためには、十分に高くない。
【０００９】 更に、12Ｈ12は、骨髄中のミクロ転移腫瘍細胞の分析用のＭＵＣ１ペプチド特
異的なＭａｂ２Ｅ11（Ｊ．Ｊ．ディール、Natl. Cancer Inst. 88 (1996) 1652-
1658) とともに使用された。骨転移は胸部癌では一般的で、多大な解剖の研究は
その頻度が47〜85％であるという結果を与えている（Ｌ．ワイス及びＨ．Ａ．ギ
ルバート、1981年のボストンのＧＫホールでの「骨転移」）。胸部癌の免疫的治
療の目的は、最小の半臨床的な腫瘍サイトの破壊であるが、依然としてこのよう
な「ミクロ転移」を検出できるルーチン的な診断法はない。胸部癌は特に骨に転
移する傾向があるため、骨髄中に悪性細胞を見出すための多数の試みが行われて
きた。転移の対象器官としての骨髄は容易に近づけて、比較的少ない危険と患者
の苦痛の下で実施できると期待されている。「悪い箇所の細胞」を検出すること
は、転移カスケードの初期段階に関する情報を提供でき、そして主要な腫瘍の転
移の潜在性を定めることも可能である。
異的なＭａｂ２Ｅ11（Ｊ．Ｊ．ディール、Natl. Cancer Inst. 88 (1996) 1652-
1658) とともに使用された。骨転移は胸部癌では一般的で、多大な解剖の研究は
その頻度が47〜85％であるという結果を与えている（Ｌ．ワイス及びＨ．Ａ．ギ
ルバート、1981年のボストンのＧＫホールでの「骨転移」）。胸部癌の免疫的治
療の目的は、最小の半臨床的な腫瘍サイトの破壊であるが、依然としてこのよう
な「ミクロ転移」を検出できるルーチン的な診断法はない。胸部癌は特に骨に転
移する傾向があるため、骨髄中に悪性細胞を見出すための多数の試みが行われて
きた。転移の対象器官としての骨髄は容易に近づけて、比較的少ない危険と患者
の苦痛の下で実施できると期待されている。「悪い箇所の細胞」を検出すること
は、転移カスケードの初期段階に関する情報を提供でき、そして主要な腫瘍の転
移の潜在性を定めることも可能である。
【００１０】 胸部癌の患者の骨髄中の腫瘍細胞の混入の分析が患者の成果の強力な予想とな
ることが知られている（Ｊ．Ｊ．ディール、Natl. Cancer Inst. 88 (1996) 165
2-1658) 。磁気ビーズ上に固定した抗−ＭＵＣ１抗体を有する珍しい腫瘍細胞を
富化することは、細胞化学的な腫瘍細胞検出の感度を劇的に改良する（Ｓ．カー
ルら、Abstract 51, Kongress der Deutschen Gesellscahft fur Gynakologie u
nd Geburtshilfe, Dresden, 1-5, 10.96) 。
ることが知られている（Ｊ．Ｊ．ディール、Natl. Cancer Inst. 88 (1996) 165
2-1658) 。磁気ビーズ上に固定した抗−ＭＵＣ１抗体を有する珍しい腫瘍細胞を
富化することは、細胞化学的な腫瘍細胞検出の感度を劇的に改良する（Ｓ．カー
ルら、Abstract 51, Kongress der Deutschen Gesellscahft fur Gynakologie u
nd Geburtshilfe, Dresden, 1-5, 10.96) 。
【００１１】 しかしこのような方法の価値は、使用する抗体の特異性により制限される。ヒ
トの新生胸部組織の異なったエピトープに対する多数の抗体が先行して研究され
ている。これらの多くは、癌治療抗原（Ｆ．Ｈ．デランドら、J. Nucl. Med. 20
(1979) 1243-1250)、ＴＡＧ72（Ｍ．ラムキら、J. Nucl. Med. 32 (1991) 1326
-1332)、ＭＡｂｓ Ｂ6.2 （コルヒャーら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1
981) 3199-3203) のような細胞表面抗原、抗−ＭＭＥ（Ｔ．ウィルバンクス、Ca
ncer 48 (1981) 1768-1775) 、又は他の種々のものに関している。胸部癌に使用
されるＭＡｂｓの多くは、ムチン分子上のエピトープを認識することが示されて
いる（Ｊ．テイラー−パパディミトリュー、Int. J. Cancer 49 (1991)1-5)。し
かし診断及び治療の目的の高度に特異的で感度の良い単クローン抗体は依然とし
て見出されていない（Ｍ．Ｊ．メリノら、Nucl. Med. Biol. 18 (1991) 437-443
) 。 しかし既知の抗−ＭＵＣ１抗体は十分高度に特異的でなく、診断及び治療で幅
広く使用するに適していない。
トの新生胸部組織の異なったエピトープに対する多数の抗体が先行して研究され
ている。これらの多くは、癌治療抗原（Ｆ．Ｈ．デランドら、J. Nucl. Med. 20
(1979) 1243-1250)、ＴＡＧ72（Ｍ．ラムキら、J. Nucl. Med. 32 (1991) 1326
-1332)、ＭＡｂｓ Ｂ6.2 （コルヒャーら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1
981) 3199-3203) のような細胞表面抗原、抗−ＭＭＥ（Ｔ．ウィルバンクス、Ca
ncer 48 (1981) 1768-1775) 、又は他の種々のものに関している。胸部癌に使用
されるＭＡｂｓの多くは、ムチン分子上のエピトープを認識することが示されて
いる（Ｊ．テイラー−パパディミトリュー、Int. J. Cancer 49 (1991)1-5)。し
かし診断及び治療の目的の高度に特異的で感度の良い単クローン抗体は依然とし
て見出されていない（Ｍ．Ｊ．メリノら、Nucl. Med. Biol. 18 (1991) 437-443
) 。 しかし既知の抗−ＭＵＣ１抗体は十分高度に特異的でなく、診断及び治療で幅
広く使用するに適していない。
【００１２】 本発明の目的は、新規で高度に特異的な抗体、それらの生産方法、及びそれら
の診断的及び治療的使用方法を提供することである。 従って本発明の対象は、腫瘍（癌種）細胞からＭＵＣ１の20のアミノ酸のタン
デムリピートの炭水化物構造に特異的に結合した免疫的に活性のあるポリペプチ
ドで、 a) 該ポリペプチドの胸部癌患者の腫瘍細胞を含む腹水からの200 から400 ｋ
Ｄａのアンダーグリコシル化された糖蛋白フラクション（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによ
り分析）及びヒトの乳汁からの天然のＭＵＣ１抗原（400 から440 ｋＤａ）の親
和力の間の商が100 ：１以上であり、 b) 前記ポリペプチドはグリコシル化されていないＭＵＣ１抗原には結合せず
、 c) 前記糖蛋白フラクションがノイラミニダーゼで処理されてＮ−末端ノイラ
ミン酸が解裂し、又は燐酸緩衝塩（ＰＢＳ）中でホルマリン、好ましくは3.5 ％
のホルマリンで15から30分処理されたときに、前記ポリペプチドの前記200 から
400 ｋＤａの糖蛋白フラクション（ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析）の結合が10％
以下だけ変化する、 ことを特徴とするポリペプチドである。
の診断的及び治療的使用方法を提供することである。 従って本発明の対象は、腫瘍（癌種）細胞からＭＵＣ１の20のアミノ酸のタン
デムリピートの炭水化物構造に特異的に結合した免疫的に活性のあるポリペプチ
ドで、 a) 該ポリペプチドの胸部癌患者の腫瘍細胞を含む腹水からの200 から400 ｋ
Ｄａのアンダーグリコシル化された糖蛋白フラクション（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによ
り分析）及びヒトの乳汁からの天然のＭＵＣ１抗原（400 から440 ｋＤａ）の親
和力の間の商が100 ：１以上であり、 b) 前記ポリペプチドはグリコシル化されていないＭＵＣ１抗原には結合せず
、 c) 前記糖蛋白フラクションがノイラミニダーゼで処理されてＮ−末端ノイラ
ミン酸が解裂し、又は燐酸緩衝塩（ＰＢＳ）中でホルマリン、好ましくは3.5 ％
のホルマリンで15から30分処理されたときに、前記ポリペプチドの前記200 から
400 ｋＤａの糖蛋白フラクション（ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析）の結合が10％
以下だけ変化する、 ことを特徴とするポリペプチドである。
【００１３】 このような抗体活性及び特性を有するポリペプチドは、驚くべきことに腫瘍細
胞により提示されるＭＵＣ１に対して高度の特異性を有することが見出されてい
る。従ってこのような抗体は、腫瘍の診断及び治療にとって有用な手段である。 このような抗体が、アンダーグリコシル化ＭＵＣ１が炭水化物エピトープとの
反応性を有し、かつ胸部癌種や他の癌種により過度に発現しかつ分泌されること
が見出されたのは驚くべきことである。このような抗体は新規な免疫処置のプロ
トコールにより選択できる。進行した胸部癌の患者からの腹水液を抗原の原料と
して使用した。これらの腹水液中のＭＵＣ１抗原フラクションを、レクチン親和
性クロマトグラフィー、及びサイズ排除クロマトグラフィーを使用する２段階操
作により富化した。本発明の本質的な態様は、分泌されたＭＵＣ１に対する強い
反応性を有するが、通常の乳汁ＭＵＣ１、脱グリコシル化された乳汁ムチン及び
／又は通常の尿中のムチンに対しては最小の反応性を有する様な抗体の選択に有
利な前述のような本発明に従う操作である。
胞により提示されるＭＵＣ１に対して高度の特異性を有することが見出されてい
る。従ってこのような抗体は、腫瘍の診断及び治療にとって有用な手段である。 このような抗体が、アンダーグリコシル化ＭＵＣ１が炭水化物エピトープとの
反応性を有し、かつ胸部癌種や他の癌種により過度に発現しかつ分泌されること
が見出されたのは驚くべきことである。このような抗体は新規な免疫処置のプロ
トコールにより選択できる。進行した胸部癌の患者からの腹水液を抗原の原料と
して使用した。これらの腹水液中のＭＵＣ１抗原フラクションを、レクチン親和
性クロマトグラフィー、及びサイズ排除クロマトグラフィーを使用する２段階操
作により富化した。本発明の本質的な態様は、分泌されたＭＵＣ１に対する強い
反応性を有するが、通常の乳汁ＭＵＣ１、脱グリコシル化された乳汁ムチン及び
／又は通常の尿中のムチンに対しては最小の反応性を有する様な抗体の選択に有
利な前述のような本発明に従う操作である。
【００１４】 本発明による抗体の特性化のためには、分泌された蛋白質を含む異なった腫瘍
患者からの腹水の混合物からレクチン親和性クロマトグラフィー（好ましくはア
ガロースに結合されたＷＧＡ）により単離された、ＭＵＣ１を含む糖蛋白フラク
ションを使用することが必須である。第２のステップでは、1000ｋＤａの天然の
糖蛋白ピークフラクション（ＦＰＬＣにより測定、ＳＤＳゲル中で200 −440 ｋ
Ｄａに対応する）を単離し、これによりＦＰＬＣゲル濾過により免疫グロブリン
を他のものの中から除去する。従来技術による免疫処置は、精製された蛋白質フ
ラクションを使用して実行され、ハイブリドーマクローンがスクリーニングされ
、該ハイブリドーマクローンは次のような性質を有する。 −ヒトの乳汁及び／又は尿から単離した抗原と最小の反応を行う。 −ＷＧＡフラクションと最大の反応を行う。 −例えば国際出願第ＷＯ９０／０５１４２で述べられているように、グリコシ
ル化されていない（合成）ペプチドに結合しない。 −ノイラミニダーゼ又はホルマリンによりＮ−末端ノイラミン酸がＷＧＡフラ
クションから分離された後でも、ＷＧＡフラクションに結合する。 −腫瘍細胞からＭＵＣ１の20アミノ酸タンデムリピートの炭水化物構造に結合
する。
患者からの腹水の混合物からレクチン親和性クロマトグラフィー（好ましくはア
ガロースに結合されたＷＧＡ）により単離された、ＭＵＣ１を含む糖蛋白フラク
ションを使用することが必須である。第２のステップでは、1000ｋＤａの天然の
糖蛋白ピークフラクション（ＦＰＬＣにより測定、ＳＤＳゲル中で200 −440 ｋ
Ｄａに対応する）を単離し、これによりＦＰＬＣゲル濾過により免疫グロブリン
を他のものの中から除去する。従来技術による免疫処置は、精製された蛋白質フ
ラクションを使用して実行され、ハイブリドーマクローンがスクリーニングされ
、該ハイブリドーマクローンは次のような性質を有する。 −ヒトの乳汁及び／又は尿から単離した抗原と最小の反応を行う。 −ＷＧＡフラクションと最大の反応を行う。 −例えば国際出願第ＷＯ９０／０５１４２で述べられているように、グリコシ
ル化されていない（合成）ペプチドに結合しない。 −ノイラミニダーゼ又はホルマリンによりＮ−末端ノイラミン酸がＷＧＡフラ
クションから分離された後でも、ＷＧＡフラクションに結合する。 −腫瘍細胞からＭＵＣ１の20アミノ酸タンデムリピートの炭水化物構造に結合
する。
【００１５】 本発明の趣旨における「特異的な結合」とは、本発明による抗体がＭＵＣ１の
ペプチド構造に結合せず、ヒトの乳汁からのＭＵＣ１の炭水化物構造には僅かに
結合し、一方腫瘍細胞からのＭＵＣ１の炭水化物構造には強く結合することを意
味する。 腹水からのＷＧＡフラクション（アンダーグリコシル化されたＭＵＣ１）は、
それが非常に僅かな、天然の完全にグリコシル化された抗原（400 から440 ｋＤ
ａ）を含むが、ＳＤＳゲル中で200 から220 ｋＤａ間に強いバンドを示すことで
本質的に特徴付けられる。分子量におけるこの差異はハイポグリコシル化（アン
ダーグリコシル化）に起因する。分子ベースの「アンダーグリコシル化」は、１
又は２以上のタンデムリピートにおいて１又は２以上のグリコシル化サイトがグ
リコシル化されていないか、又は天然の分子の場合のように糖残基で占められて
いないことを意味する。
ペプチド構造に結合せず、ヒトの乳汁からのＭＵＣ１の炭水化物構造には僅かに
結合し、一方腫瘍細胞からのＭＵＣ１の炭水化物構造には強く結合することを意
味する。 腹水からのＷＧＡフラクション（アンダーグリコシル化されたＭＵＣ１）は、
それが非常に僅かな、天然の完全にグリコシル化された抗原（400 から440 ｋＤ
ａ）を含むが、ＳＤＳゲル中で200 から220 ｋＤａ間に強いバンドを示すことで
本質的に特徴付けられる。分子量におけるこの差異はハイポグリコシル化（アン
ダーグリコシル化）に起因する。分子ベースの「アンダーグリコシル化」は、１
又は２以上のタンデムリピートにおいて１又は２以上のグリコシル化サイトがグ
リコシル化されていないか、又は天然の分子の場合のように糖残基で占められて
いないことを意味する。
【００１６】 ＭＵＣ１中に含まれるリピートの平均数は約60であり最大で３個の糖鎖が各リ
ピートに位置することになるため、完全にグリコシル化されたＭＵＣ１は約150
から200 の糖側鎖を有する。側鎖当たりの糖残基の平均数は約10である。アンダ
ーグリコシル化されたＭＵＣ１では、各アンダーグリコシル化されたグリコシル
化サイトは本発明の抗体の潜在的な結合サイトである。糖側鎖のグリコシル化が
少なくなると、結合できる抗体の数が増加する。既に少なくとも10、好ましくは
少なくとも20の糖側鎖が失われ又はアンダーグリコシル化されている場合、本発
明による抗体のＭＵＣ１へのかなりの結合が観察されるはずである。
ピートに位置することになるため、完全にグリコシル化されたＭＵＣ１は約150
から200 の糖側鎖を有する。側鎖当たりの糖残基の平均数は約10である。アンダ
ーグリコシル化されたＭＵＣ１では、各アンダーグリコシル化されたグリコシル
化サイトは本発明の抗体の潜在的な結合サイトである。糖側鎖のグリコシル化が
少なくなると、結合できる抗体の数が増加する。既に少なくとも10、好ましくは
少なくとも20の糖側鎖が失われ又はアンダーグリコシル化されている場合、本発
明による抗体のＭＵＣ１へのかなりの結合が観察されるはずである。
【００１７】 本発明の他の対象は、200 から400 ｋＤａ、好ましくは200 から220 ｋＤａ（
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析）の分子量を有する腫瘍細胞からのハイパーグリコ
シル化されたＭＵＣ１フラクションに特異的に結合する免疫学的に活性なポリペ
プチドの生産方法であって、糖蛋白が、レクチン親和性クロマトグラフィーによ
り胸部癌患者の腫瘍細胞含有腹水から単離され、該糖蛋白が必要に応じてｌｇ蛋
白質から分離され、このようにして得られたフラクションが、動物の免疫処置に
使用され、抗血清が得られ、ポリペプチドがそこから単離される方法で、該ポリ
ペプチドが、 a) 該ポリペプチドの胸部癌患者の腫瘍細胞を含む腹水からの200 から400 ｋ
Ｄａのアンダーグリコシル化された糖蛋白フラクション（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによ
り分析）及びヒトの乳汁からの天然のＭＵＣ１抗原（400 から440 ｋＤａ）の親
和力の間の商が100 ：１以上であり、 b) 前記ポリペプチドはグリコシル化されていないＭＵＣ１抗原には結合せず
、 c) 前記糖蛋白フラクションがノイラミニダーゼで処理されてＮ−末端ノイラ
ミン酸が解裂し、又はホルマリンで処理されたときに、前記ポリペプチドの前記
200 から400 ｋＤａの糖蛋白フラクション（ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析）の結
合が10％以下だけ変化する、 という特徴を有している。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析）の分子量を有する腫瘍細胞からのハイパーグリコ
シル化されたＭＵＣ１フラクションに特異的に結合する免疫学的に活性なポリペ
プチドの生産方法であって、糖蛋白が、レクチン親和性クロマトグラフィーによ
り胸部癌患者の腫瘍細胞含有腹水から単離され、該糖蛋白が必要に応じてｌｇ蛋
白質から分離され、このようにして得られたフラクションが、動物の免疫処置に
使用され、抗血清が得られ、ポリペプチドがそこから単離される方法で、該ポリ
ペプチドが、 a) 該ポリペプチドの胸部癌患者の腫瘍細胞を含む腹水からの200 から400 ｋ
Ｄａのアンダーグリコシル化された糖蛋白フラクション（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによ
り分析）及びヒトの乳汁からの天然のＭＵＣ１抗原（400 から440 ｋＤａ）の親
和力の間の商が100 ：１以上であり、 b) 前記ポリペプチドはグリコシル化されていないＭＵＣ１抗原には結合せず
、 c) 前記糖蛋白フラクションがノイラミニダーゼで処理されてＮ−末端ノイラ
ミン酸が解裂し、又はホルマリンで処理されたときに、前記ポリペプチドの前記
200 から400 ｋＤａの糖蛋白フラクション（ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析）の結
合が10％以下だけ変化する、 という特徴を有している。
【００１８】 本明細書で使用する「免疫学的に活性なポリペプチド又は抗体」とは、抗体遺
伝子により実質的に解読される１又は２以上のポリペプチドから成る蛋白質を意
味する。認識された抗体遺伝子は、無数の抗体変化領域遺伝子に加えて、異なっ
た一定領域遺伝子を含む。抗体は種々の形態で、例えば単一鎖に加えて、Ｆｖ、
Ｆａｂ及びＦ（ａｂ）2 を含む形態で存在する（例えばヒューストンら、PNAS U
SA 85 (1988) 5879-5883及び、一般に、フードら、Immunology, ベンジャミン、
ニューヨーク、第２版（1984）及びフンカピラー及びフード、Nature 323 (1986
) 15-16)。本発明による好ましい抗体は単クローン抗体及びそのフラグメントで
ある。 抗ＭＵＣ１抗体の相対親和性は、Ｋ50値の分析で決定されたが、この値は最大
値の半分でＭＵＣ１への結合が達成される抗体濃度である（Ｖ．カラニカスら、
Tumor Biol. 19, suppl. 1(1998) 71-78) 。ＥＬＩＳＡ結合アッセイの親和性で
は、精製されたＭＵＣ１抗原がミクロタイターウェル中で被覆された。ＩｇＧに
ついて160000の分子量を使用すると、７Ｆ11のＫ50値は10-10 Ｍで、腹水及びＴ
−47Ｄ胸部癌細胞からの腫瘍を伴う抗原を有していた。
伝子により実質的に解読される１又は２以上のポリペプチドから成る蛋白質を意
味する。認識された抗体遺伝子は、無数の抗体変化領域遺伝子に加えて、異なっ
た一定領域遺伝子を含む。抗体は種々の形態で、例えば単一鎖に加えて、Ｆｖ、
Ｆａｂ及びＦ（ａｂ）2 を含む形態で存在する（例えばヒューストンら、PNAS U
SA 85 (1988) 5879-5883及び、一般に、フードら、Immunology, ベンジャミン、
ニューヨーク、第２版（1984）及びフンカピラー及びフード、Nature 323 (1986
) 15-16)。本発明による好ましい抗体は単クローン抗体及びそのフラグメントで
ある。 抗ＭＵＣ１抗体の相対親和性は、Ｋ50値の分析で決定されたが、この値は最大
値の半分でＭＵＣ１への結合が達成される抗体濃度である（Ｖ．カラニカスら、
Tumor Biol. 19, suppl. 1(1998) 71-78) 。ＥＬＩＳＡ結合アッセイの親和性で
は、精製されたＭＵＣ１抗原がミクロタイターウェル中で被覆された。ＩｇＧに
ついて160000の分子量を使用すると、７Ｆ11のＫ50値は10-10 Ｍで、腹水及びＴ
−47Ｄ胸部癌細胞からの腫瘍を伴う抗原を有していた。
【００１９】 進行した胸部癌を有する患者の腹水から精製されたＭＵＣ１抗原フラクション
による免疫処置の後に、ネズミ単クローン抗体１Ｅ４及び７Ｆ11が選択された。
該抗体は、胸部及び他の癌種により過度に発現し分泌されるアンダーグリコシル
化されたＭＵＣ１の炭水化物エピトープとの反応性を有する。該抗体は腫瘍の診
断と治療用として有用な手段である。 本発明による抗体、好ましくは抗体７Ｆ11及び１Ｅ４は、ＭＵＣ１に対する単
クローン抗体に関するＩＳＯＢＭ ＴＤ−４国際研究集会（1996年）で提示され
た全部で16個の炭水化物特異性マブから明確に区別される。両マブは、異なった
ソース（初期腫瘍、転移細胞、分泌抗原）からの腫瘍を伴うＭＵＣ１と高い親和
力（Ｋ50＝10-10 Ｍ）で反応する。ＴＤ−４マブ（表１）と対照的に、７Ｆ11及
び１Ｅ４は、通常の完全にグリコシル化された乳汁ＭＵＣ１と反応しない。それ
らは、クロ−ンＦＨ６と、完全に異なった着色パターンと、ＦＨ６免疫反応性が
ＭＵＣ１の脱シアリル化（ノイラミニダーゼ又はホルマリンによる処理）により
損なわれるという事実により区別される。
による免疫処置の後に、ネズミ単クローン抗体１Ｅ４及び７Ｆ11が選択された。
該抗体は、胸部及び他の癌種により過度に発現し分泌されるアンダーグリコシル
化されたＭＵＣ１の炭水化物エピトープとの反応性を有する。該抗体は腫瘍の診
断と治療用として有用な手段である。 本発明による抗体、好ましくは抗体７Ｆ11及び１Ｅ４は、ＭＵＣ１に対する単
クローン抗体に関するＩＳＯＢＭ ＴＤ−４国際研究集会（1996年）で提示され
た全部で16個の炭水化物特異性マブから明確に区別される。両マブは、異なった
ソース（初期腫瘍、転移細胞、分泌抗原）からの腫瘍を伴うＭＵＣ１と高い親和
力（Ｋ50＝10-10 Ｍ）で反応する。ＴＤ−４マブ（表１）と対照的に、７Ｆ11及
び１Ｅ４は、通常の完全にグリコシル化された乳汁ＭＵＣ１と反応しない。それ
らは、クロ−ンＦＨ６と、完全に異なった着色パターンと、ＦＨ６免疫反応性が
ＭＵＣ１の脱シアリル化（ノイラミニダーゼ又はホルマリンによる処理）により
損なわれるという事実により区別される。
【００２０】 適切な手法でＭＵＣ１に結合している限り、抗体は、全単クローン抗体、それ
らのフラグメント（例えばＦｖ、（Ｆｖ）2 、Ｆａｂ、Ｆａｂ′及びＦ（ａｂ） 2 ）、キメラの、ヒト化された又はヒトの抗体として使用できる。ＭＵＣ１への
特異的な結合を与えるＣＤＲ領域又はその部分のみを含む短鎖抗体フラグメント
も、特に抗体がラベルされたものであるときは、好適である。ｌｇＧ１アイソト
ープの抗体も好ましい。単クローン抗体の生産に関しては、例えばＥ．ハーロー
及びＤ．レインの「抗体：実験室マニュアル」（コールド・スプリング・ハーバ
ー・プレス（1988）、ベスラーら、Immunobiol. 170 (1985) 239-244、及びユン
クら、Angewandte Chemie 97 (1985)883又はシアンフリグリアら、Hybridoma Vo
l.2 (1993) 451-457を参照のこと。 本発明の抗体の診断用の使用は免疫学的決定プロセスによる既知方法として実
施する。このタイプのプロセスは周知で、これ以上の説明は不要である。本発明
による得られる抗体はラベルされない及び／又は固定された受容体として使用で
きる。
らのフラグメント（例えばＦｖ、（Ｆｖ）2 、Ｆａｂ、Ｆａｂ′及びＦ（ａｂ） 2 ）、キメラの、ヒト化された又はヒトの抗体として使用できる。ＭＵＣ１への
特異的な結合を与えるＣＤＲ領域又はその部分のみを含む短鎖抗体フラグメント
も、特に抗体がラベルされたものであるときは、好適である。ｌｇＧ１アイソト
ープの抗体も好ましい。単クローン抗体の生産に関しては、例えばＥ．ハーロー
及びＤ．レインの「抗体：実験室マニュアル」（コールド・スプリング・ハーバ
ー・プレス（1988）、ベスラーら、Immunobiol. 170 (1985) 239-244、及びユン
クら、Angewandte Chemie 97 (1985)883又はシアンフリグリアら、Hybridoma Vo
l.2 (1993) 451-457を参照のこと。 本発明の抗体の診断用の使用は免疫学的決定プロセスによる既知方法として実
施する。このタイプのプロセスは周知で、これ以上の説明は不要である。本発明
による得られる抗体はラベルされない及び／又は固定された受容体として使用で
きる。
【００２１】 固定された受容体は患者の体の組織からの腫瘍細胞又は分泌されたＭＵＣ１抗
原を除去するための方法用として使用でき、ここで請求項１又は２でクレームし
ているように、体の組織は固定された抗体と接触させられ、腫瘍細胞つまり前記
分泌されたＭＵＣ１抗原は固定された抗体に結合され、そしてこのように固相に
結合された腫瘍細胞つまり前記分泌されたＭＵＣ１は体の組織から、固相ととも
に分離される。 このような診断用免疫方法の各場合において、本発明による少なくとも１個の
抗体の結合後に、シグナルの変化を評価する。
原を除去するための方法用として使用でき、ここで請求項１又は２でクレームし
ているように、体の組織は固定された抗体と接触させられ、腫瘍細胞つまり前記
分泌されたＭＵＣ１抗原は固定された抗体に結合され、そしてこのように固相に
結合された腫瘍細胞つまり前記分泌されたＭＵＣ１は体の組織から、固相ととも
に分離される。 このような診断用免疫方法の各場合において、本発明による少なくとも１個の
抗体の結合後に、シグナルの変化を評価する。
【００２２】 本発明による方法で得られる単クローン抗体は腫瘍細胞の表面に結合するので
、ヒトの生体中で使用できる。従って本発明は、１又は２以上の本発明による抗
体を含んで成る薬学的組成物を提供することもでき、必要に応じて従来の薬学的
キャリア、補助薬、充填用又は付加的物質とともに使用することもできる。本発
明よぱる薬剤の投与は、ミクロ転移の処理、特に胸部癌の処理に有用である。 治療用処理のための本発明による抗体の投与量は、約２μｇから20mg、好まし
くは２μｇから20mg／kg−人体の重量であり、この投与は繰り返して行われるべ
きである。
、ヒトの生体中で使用できる。従って本発明は、１又は２以上の本発明による抗
体を含んで成る薬学的組成物を提供することもでき、必要に応じて従来の薬学的
キャリア、補助薬、充填用又は付加的物質とともに使用することもできる。本発
明よぱる薬剤の投与は、ミクロ転移の処理、特に胸部癌の処理に有用である。 治療用処理のための本発明による抗体の投与量は、約２μｇから20mg、好まし
くは２μｇから20mg／kg−人体の重量であり、この投与は繰り返して行われるべ
きである。
【００２３】 本発明による抗体で胸部癌種の患者を処理するためには、外科的処置の後に、
確立した補助薬による化学療法（月経閉止期前）又はホルモン療法（月経閉止期
後）をリンパ−ノードがポジティブな患者に行う（約45％）ことが好ましい。次
のステップでは、骨髄中の腫瘍細胞の存在を診断する。これは、本発明の抗体の
使用により好ましく行えるが、通常の腫瘍マーカー（シトケセラチン等）を識別
する他のテストでも達成できる。骨髄反応がプラスであると、好ましくは６から
８の免疫処置が、１から４週のインターバルで本発明の抗体を使用して行われる
。使用する抗体の量は１回の免疫処置当たり0.2 から50mgの範囲内である。この
抗体治療は補助約ホルモン治療中又は化学療法後に行われる。ホルモン治療の場
合、それは好ましくはパラレルな手法で行われる（後者の場合に免疫岳的抑制が
ない）。本発明による抗ＭＵＣ１抗体に対する抗体の展開は、本発明による抗体
での免疫処置フェーズ間に、又はヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）用の確立された
テストにより追跡されている。望ましい治療レベルは抗体滴定量が約３から４カ
月安定であることである。骨髄中の腫瘍細胞の他の測定は、最後の免疫処置の３
ヶ月後に行う。少なくとも６×106 個の骨髄細胞が腫瘍細胞への混入として分析
される。本発明の抗体を使用すると、18人のうち17人の患者が骨髄中の腫瘍細胞
のアッセイでネガティブな反応を示すことが見出され、これは本発明の抗体の治
療への適用の結果として骨髄中の腫瘍細胞が明らかに破壊されたことを示唆して
いる。驚くべきことに、本発明の抗体はエフェクター作用も示し、これは腫瘍細
胞に結合した後に、腫瘍細胞が外来性細胞として認識され、補体、抗痴呆抗体、
活性化されたＮＫ−細胞又はＴ−細胞、又はこれらの組合せによる活性化で恐ら
く除去される。
確立した補助薬による化学療法（月経閉止期前）又はホルモン療法（月経閉止期
後）をリンパ−ノードがポジティブな患者に行う（約45％）ことが好ましい。次
のステップでは、骨髄中の腫瘍細胞の存在を診断する。これは、本発明の抗体の
使用により好ましく行えるが、通常の腫瘍マーカー（シトケセラチン等）を識別
する他のテストでも達成できる。骨髄反応がプラスであると、好ましくは６から
８の免疫処置が、１から４週のインターバルで本発明の抗体を使用して行われる
。使用する抗体の量は１回の免疫処置当たり0.2 から50mgの範囲内である。この
抗体治療は補助約ホルモン治療中又は化学療法後に行われる。ホルモン治療の場
合、それは好ましくはパラレルな手法で行われる（後者の場合に免疫岳的抑制が
ない）。本発明による抗ＭＵＣ１抗体に対する抗体の展開は、本発明による抗体
での免疫処置フェーズ間に、又はヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）用の確立された
テストにより追跡されている。望ましい治療レベルは抗体滴定量が約３から４カ
月安定であることである。骨髄中の腫瘍細胞の他の測定は、最後の免疫処置の３
ヶ月後に行う。少なくとも６×106 個の骨髄細胞が腫瘍細胞への混入として分析
される。本発明の抗体を使用すると、18人のうち17人の患者が骨髄中の腫瘍細胞
のアッセイでネガティブな反応を示すことが見出され、これは本発明の抗体の治
療への適用の結果として骨髄中の腫瘍細胞が明らかに破壊されたことを示唆して
いる。驚くべきことに、本発明の抗体はエフェクター作用も示し、これは腫瘍細
胞に結合した後に、腫瘍細胞が外来性細胞として認識され、補体、抗痴呆抗体、
活性化されたＮＫ−細胞又はＴ−細胞、又はこれらの組合せによる活性化で恐ら
く除去される。
【００２４】 本発明の抗体はリンパ液等の体液中の分泌されたＭＵＣ１にも結合することが
示されており、これは、体液又は細胞による免疫認識による、ＭＵＣ１に起因す
る免疫岳的抑制が除去されるという治療的効果又は免疫岳的抑制薬としての効果
を有することである。これも治療に利用できる。 更にＭＵＣ１は、卵巣（＞80％）、肺（60％）、前立腺（50％）、膵臓（100
％）、腎臓及び結腸の腫瘍細胞中でも過度に発現することが見出された。本発明
の抗体はこのようなものの診断及び治療用にも利用できる。 治療の目的で、エフェクター機能を与える細胞毒の抗体（ＡＤＣＣ、ＣＤＣ）
（ブリュッゲマンら、J. Exp. Med. 166 (1987) 1357─1361) を使用することが
特に好ましい。
示されており、これは、体液又は細胞による免疫認識による、ＭＵＣ１に起因す
る免疫岳的抑制が除去されるという治療的効果又は免疫岳的抑制薬としての効果
を有することである。これも治療に利用できる。 更にＭＵＣ１は、卵巣（＞80％）、肺（60％）、前立腺（50％）、膵臓（100
％）、腎臓及び結腸の腫瘍細胞中でも過度に発現することが見出された。本発明
の抗体はこのようなものの診断及び治療用にも利用できる。 治療の目的で、エフェクター機能を与える細胞毒の抗体（ＡＤＣＣ、ＣＤＣ）
（ブリュッゲマンら、J. Exp. Med. 166 (1987) 1357─1361) を使用することが
特に好ましい。
【００２５】 他のアプローチでは、抗体又はその一部を毒素分子（免疫毒素）に接合し又は
移動し結合して腫瘍細胞を特異的に殺す効果を生じさせ（ブリンクマンら、Proc
. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991) 8616 ─8620, パスタンら、Cancer Res. 51
(1991) 3781─3787, フィッツジェラルド及びパスタン、J. Natl. Cancer 81 (
1989) 1455─1461) 、又抗体又はその一部はサイトカイン又はインターロイキン
に接合しても良い。本発明の他の好ましい態様では、腫瘍治療に２特異的抗体を
使用し（ボニノら、BFE 9 (1992) 719─723)、これは雑種ハイブリドーマ発生又
はディアボデーの構築によるペプチド鎖の生体外での再構成により行われる（ホ
リガーら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444 ─6448, ホリガー及び
ウィンター、Current Opin. Biotechnol. (1993) 446─449)。
移動し結合して腫瘍細胞を特異的に殺す効果を生じさせ（ブリンクマンら、Proc
. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991) 8616 ─8620, パスタンら、Cancer Res. 51
(1991) 3781─3787, フィッツジェラルド及びパスタン、J. Natl. Cancer 81 (
1989) 1455─1461) 、又抗体又はその一部はサイトカイン又はインターロイキン
に接合しても良い。本発明の他の好ましい態様では、腫瘍治療に２特異的抗体を
使用し（ボニノら、BFE 9 (1992) 719─723)、これは雑種ハイブリドーマ発生又
はディアボデーの構築によるペプチド鎖の生体外での再構成により行われる（ホ
リガーら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444 ─6448, ホリガー及び
ウィンター、Current Opin. Biotechnol. (1993) 446─449)。
【００２６】 イムノトキシンに関しては、本発明の抗体を、例えばシュードモナス属菌体外
毒素、ジフテリア毒素又は他の毒素のような毒素と結合させることが好ましい（
フィッツジェラルド及びパスタン、J. Natl. Cancer 81 (1989) 1455-1461)。抗
体を、例えば細胞毒の効果を有するドクソルビシン、又は放射能でラベルした物
質のような化学療法剤に結合させることも好ましい。 本発明の抗体、特に生体内でイメージするためで例えば放射活性又は蛍光物質
を使用するヒト抗体の複合物も好ましい。 イムノトキシンは２種類の原理的に異なった方法のいずれかで好ましく生産で
きる。
毒素、ジフテリア毒素又は他の毒素のような毒素と結合させることが好ましい（
フィッツジェラルド及びパスタン、J. Natl. Cancer 81 (1989) 1455-1461)。抗
体を、例えば細胞毒の効果を有するドクソルビシン、又は放射能でラベルした物
質のような化学療法剤に結合させることも好ましい。 本発明の抗体、特に生体内でイメージするためで例えば放射活性又は蛍光物質
を使用するヒト抗体の複合物も好ましい。 イムノトキシンは２種類の原理的に異なった方法のいずれかで好ましく生産で
きる。
【００２７】 第１の方法は、抗体又はそのフラグメント（蛋白質分解により通常生成する、
例えばFab フラグメント) を生体外で毒素又は毒素のフラグメントに化学的に結
合させる。実際上の理由で、このタイプのイムノトキシンはの抗体部分は、完全
な抗体（２本の軽い及び２本の重い鎖から成る）、又はより好ましいFab フラグ
メント（１本の軽い鎖と重い鎖のＶＨ−及びＣＨ１領域から成る）のいずれかで
ある。 他の方法では、イムノトキシンは、どのような場合にも定義された均一な分子
が得られる組換えＤＮＡ技術により生成する。抗体部分のサイズは可能な限り小
さくして良好な組織透過性を有する小さいイムノトキシンを得る。この方法では
、実際に入手できる最小の抗体フラグメントはFab フラグメントではなく、重い
鎖のＶＨ−領域及び軽い鎖のＶＬ−領域のみから成る抗体の機能変化可能なドメ
インである。ＶＨ及びＶＬ−領域（各々約100 個のアミノ酸のポリペプチド鎖）
は、機能的なアセンブリあるいは抗原結合を与える変化可能なドメインを形成し
なければならない。抗体に残りの部分が存在しないと、ＶＨ及びＶＬ領域は非常
に不安定な錯体のみを形成する。従ってこれらの錯体は共有結合で安定化させる
ことが好ましい。
例えばFab フラグメント) を生体外で毒素又は毒素のフラグメントに化学的に結
合させる。実際上の理由で、このタイプのイムノトキシンはの抗体部分は、完全
な抗体（２本の軽い及び２本の重い鎖から成る）、又はより好ましいFab フラグ
メント（１本の軽い鎖と重い鎖のＶＨ−及びＣＨ１領域から成る）のいずれかで
ある。 他の方法では、イムノトキシンは、どのような場合にも定義された均一な分子
が得られる組換えＤＮＡ技術により生成する。抗体部分のサイズは可能な限り小
さくして良好な組織透過性を有する小さいイムノトキシンを得る。この方法では
、実際に入手できる最小の抗体フラグメントはFab フラグメントではなく、重い
鎖のＶＨ−領域及び軽い鎖のＶＬ−領域のみから成る抗体の機能変化可能なドメ
インである。ＶＨ及びＶＬ−領域（各々約100 個のアミノ酸のポリペプチド鎖）
は、機能的なアセンブリあるいは抗原結合を与える変化可能なドメインを形成し
なければならない。抗体に残りの部分が存在しないと、ＶＨ及びＶＬ領域は非常
に不安定な錯体のみを形成する。従ってこれらの錯体は共有結合で安定化させる
ことが好ましい。
【００２８】 １つの可能性はＶＨ−領域及びＶＬ−領域をＤＮＡレベルに（又はその逆に）
縮合させることで、毒素について同様にする。発現後に、単一のポリペプチド鎖
が形成され、ここではペプチドリンカーで接続されたＶＨ−及びＶＬ−領域が安
定で変化可能なドメイン中に組み込まれ、一方毒素は、第２のペプチドリンカー
を介して例えばＶＬに縮合している（ブリンクマンら、Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 89 (1992) 3075-3079参照）。両ペプチドリンカーの長さは可変で、場合に
よっては単一のペプチド結合にまで減少しても良い。このタイプの分子は、「単
一鎖抗体」という用語あるいはscFVと類縁にある「単一鎖イムノトキシン」の用
語で示され、この用語はペプチドリンカー又は結合により接続されたＶＨ及びＶ
Ｌの両者を含む単一ポリペプチド鎖用として使用される。
縮合させることで、毒素について同様にする。発現後に、単一のポリペプチド鎖
が形成され、ここではペプチドリンカーで接続されたＶＨ−及びＶＬ−領域が安
定で変化可能なドメイン中に組み込まれ、一方毒素は、第２のペプチドリンカー
を介して例えばＶＬに縮合している（ブリンクマンら、Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 89 (1992) 3075-3079参照）。両ペプチドリンカーの長さは可変で、場合に
よっては単一のペプチド結合にまで減少しても良い。このタイプの分子は、「単
一鎖抗体」という用語あるいはscFVと類縁にある「単一鎖イムノトキシン」の用
語で示され、この用語はペプチドリンカー又は結合により接続されたＶＨ及びＶ
Ｌの両者を含む単一ポリペプチド鎖用として使用される。
【００２９】 ＶＨ及びＶＬアセンブリーを安定化させる他の可能性がブリンクマンらにより
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 7538-7542に記載されている。この技術
では、ＶＨ及びＶＬのアミノ酸がコンピューターによるモデリングにより定義さ
れ、それらはＶＨ−ＶＬ錯体中で互いに隣接していた。次いでこれらのポジショ
ンで天然に産出するアミノ酸は各々システインによりＤＮＡレベルで置換された
。この場合に機能的なイムノトキシンを得るためには、２本の分離されたポリペ
プチド鎖が現れ、（分離した細胞中、例えば原核細胞、例えばE.Coli) 、一方は
ＶＨ−領域のみで、他方は毒素部分にペプチドリンカーで結合したＶＬ−領域で
ある。これら２本のポリペプチド鎖は、適切な条件下で混合され、これにより機
能的なイムノトキシンに組み入れられ、ここでは可変抗体ドメイン中のＶＨ及び
ＶＬは遺伝子工学により導入された２個のシステイン間のジスルフィド結合によ
り接続されている。このタイプのイムノトキシンの抗体部分はdsFVと表記され、
従って全体の分子は「dsFV−イムノトキシン」と表記される。
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 7538-7542に記載されている。この技術
では、ＶＨ及びＶＬのアミノ酸がコンピューターによるモデリングにより定義さ
れ、それらはＶＨ−ＶＬ錯体中で互いに隣接していた。次いでこれらのポジショ
ンで天然に産出するアミノ酸は各々システインによりＤＮＡレベルで置換された
。この場合に機能的なイムノトキシンを得るためには、２本の分離されたポリペ
プチド鎖が現れ、（分離した細胞中、例えば原核細胞、例えばE.Coli) 、一方は
ＶＨ−領域のみで、他方は毒素部分にペプチドリンカーで結合したＶＬ−領域で
ある。これら２本のポリペプチド鎖は、適切な条件下で混合され、これにより機
能的なイムノトキシンに組み入れられ、ここでは可変抗体ドメイン中のＶＨ及び
ＶＬは遺伝子工学により導入された２個のシステイン間のジスルフィド結合によ
り接続されている。このタイプのイムノトキシンの抗体部分はdsFVと表記され、
従って全体の分子は「dsFV−イムノトキシン」と表記される。
【００３０】 勿論イムノトキシンを組換えＤＮＡ技術により、例えば大きなFab-フラグメン
ト（ＶＬ−ＣＬに非共有結合的に組み入れられたＶＨ−ＣＨ１、又それらの一方
はペプチドリンカーにより毒素に結合している）を使用して生産する他の可能性
は存在する。しかしブリンクマンらによりProc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (199
2) 3075-3079及びブリンクマンらによりProc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993)
7538-7542に記載された可能性が好ましい。 イムノトキシンの毒素部分に関しては、シュードモナス属菌体外毒素（ＰＥ）
の好ましいフラグメントは、ＰＥ３８及びＰＥ４０及びゆれらの誘導体である（
Ｉ．パスタンら、ＷＯ９２／０７２７１及びＷＯ９０／１２５９２）。 単一鎖Ｆｖ−鎖イムノトキシンは、Ｔ７ＲＮＡホリメラーゼ発現システムを使
用するE.Coli中の単一ポリペプチド鎖として好ましく生産できる。該ポリペプチ
ドは不活性な形態で得られ、生体外再生により活性化されなければならない。
ト（ＶＬ−ＣＬに非共有結合的に組み入れられたＶＨ−ＣＨ１、又それらの一方
はペプチドリンカーにより毒素に結合している）を使用して生産する他の可能性
は存在する。しかしブリンクマンらによりProc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (199
2) 3075-3079及びブリンクマンらによりProc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993)
7538-7542に記載された可能性が好ましい。 イムノトキシンの毒素部分に関しては、シュードモナス属菌体外毒素（ＰＥ）
の好ましいフラグメントは、ＰＥ３８及びＰＥ４０及びゆれらの誘導体である（
Ｉ．パスタンら、ＷＯ９２／０７２７１及びＷＯ９０／１２５９２）。 単一鎖Ｆｖ−鎖イムノトキシンは、Ｔ７ＲＮＡホリメラーゼ発現システムを使
用するE.Coli中の単一ポリペプチド鎖として好ましく生産できる。該ポリペプチ
ドは不活性な形態で得られ、生体外再生により活性化されなければならない。
【００３１】 ペプチド結合の単一鎖イムノトキシン類の生産のための他の方法が、ＷＯ８８
／０９３４４に記載されている。軽い鎖及び重い鎖間のペプチドリンカーを有す
る単一鎖抗体がＷＯ８８／０１６４９に記載されている。重い又は軽い鎖の可変
領域を少なくとも含んで成りこれによりこれらの鎖の一方がペプチド結合により
非ｌｇ分子にリンクしているキメラ抗体の生産がＥＰ−Ｂ０１９３２７６に記載
されている。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ発現システムが米国特許第７，６４８，９
７１号、４，９５２，４９６号及び６，５９５，０１６号に記載されている。 本発明のポリヌクレオチド及び本発明の組換え的に生産される抗体は、既知の
方法によりかつサンブロックらの「分子クローニング、実験室マニュアル第２版
」（ニューヨークのコールド・スプリング・ハーバー・プレス（1989）、及びベ
ルガー及びキンメルの「酵素学の方法、152 巻、分子クローニング技術(1987 年
) 」カリフォルニア州サンディエゴのアカデミック・プレス・インコーポレーテ
ッドに記載されたシーケンスデータに基づいて調製され、これらの文献は参考文
献としてここに組み入れられる。好ましくは本発明のポリヌクレオチドは、合成
オリゴヌクレオチドから形成される。
／０９３４４に記載されている。軽い鎖及び重い鎖間のペプチドリンカーを有す
る単一鎖抗体がＷＯ８８／０１６４９に記載されている。重い又は軽い鎖の可変
領域を少なくとも含んで成りこれによりこれらの鎖の一方がペプチド結合により
非ｌｇ分子にリンクしているキメラ抗体の生産がＥＰ−Ｂ０１９３２７６に記載
されている。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ発現システムが米国特許第７，６４８，９
７１号、４，９５２，４９６号及び６，５９５，０１６号に記載されている。 本発明のポリヌクレオチド及び本発明の組換え的に生産される抗体は、既知の
方法によりかつサンブロックらの「分子クローニング、実験室マニュアル第２版
」（ニューヨークのコールド・スプリング・ハーバー・プレス（1989）、及びベ
ルガー及びキンメルの「酵素学の方法、152 巻、分子クローニング技術(1987 年
) 」カリフォルニア州サンディエゴのアカデミック・プレス・インコーポレーテ
ッドに記載されたシーケンスデータに基づいて調製され、これらの文献は参考文
献としてここに組み入れられる。好ましくは本発明のポリヌクレオチドは、合成
オリゴヌクレオチドから形成される。
【００３２】 このような組換えポリペプチドは、公知の標準方法により真核又は原核ホスト
細胞中で発現でき、好ましくはリンパ球細胞ラインのような哺乳類の細胞がホス
ト細胞として使用できる。典型的にはこのようなポリヌクレオチド構造は、本発
明による抗体のアミノ酸シーケンス、重い及び／又は軽い鎖の可変領域をそれぞ
れに少なくとも有する完全なヒト抗体の重い鎖及び／又は完全なヒト抗体の軽い
鎖を解読する。前記抗体鎖と天然に存在するシーケンス以外の、ヒトの一定な領
域アイソトープを含む代替のヒトの一定領域シーケンスは置換でき、このような
代替のヒトの一定の領域シーケンスは種々の文献源から当業者により選択される
ことができ、該文献はＥ．Ａ．カバトらの「免疫学的興味のある蛋白質のシーケ
ンス（1987）」（メリーランド州のベセスタのナショナル・インスティチュート
・オブ・ヘルス）に挙げられたものを含むがこれらの限定されない。本発明の一
態様では、本発明による抗体の軽い鎖の可変領域へのアミノ末端ペプチド結合（
つまりフレーム内結合）を有するヒトの軽い鎖、及び対応する重い鎖が現れ、軽
い／重い鎖ダイマー及び他のタイプの抗体を形成する。
細胞中で発現でき、好ましくはリンパ球細胞ラインのような哺乳類の細胞がホス
ト細胞として使用できる。典型的にはこのようなポリヌクレオチド構造は、本発
明による抗体のアミノ酸シーケンス、重い及び／又は軽い鎖の可変領域をそれぞ
れに少なくとも有する完全なヒト抗体の重い鎖及び／又は完全なヒト抗体の軽い
鎖を解読する。前記抗体鎖と天然に存在するシーケンス以外の、ヒトの一定な領
域アイソトープを含む代替のヒトの一定領域シーケンスは置換でき、このような
代替のヒトの一定の領域シーケンスは種々の文献源から当業者により選択される
ことができ、該文献はＥ．Ａ．カバトらの「免疫学的興味のある蛋白質のシーケ
ンス（1987）」（メリーランド州のベセスタのナショナル・インスティチュート
・オブ・ヘルス）に挙げられたものを含むがこれらの限定されない。本発明の一
態様では、本発明による抗体の軽い鎖の可変領域へのアミノ末端ペプチド結合（
つまりフレーム内結合）を有するヒトの軽い鎖、及び対応する重い鎖が現れ、軽
い／重い鎖ダイマー及び他のタイプの抗体を形成する。
【００３３】 一般に原核細胞は本発明による抗体鎖を海賊するＤＮＡシーケンスのクローニ
ングに使用できる。E.Coliは本発明のＤＮＡシーケンスをクローニングするため
に特に有用な原核ホスト細胞である。その代わりに、ホスホロアミダイト合成を
含む種々の方法でオリゴヌクレオチドを化学的に合成しても良い。 ポリヌクレオチド構造は、天然に存在する又は異種組織プロモーター領域を含
むコーディングシーケンスに機能するように結合した発現制御シーケンスを典型
的に含んでいる。好ましくは該発現制御シーケンスは、真核ホスト細胞を変換し
又はトランスフェクトできるベクトル中の真核プロモーターシステムである。一
旦ベクトルが好適なホスト中に組み入れられると、該ホストは、ヌクレオチドシ
ーケンスの高レベル発現と本発明による抗体の収集及び精製に適した条件下に維
持される。真核ホスト細胞として、哺乳類の組織細胞の培養液も本発明のポリペ
プチドの生産に使用できる。哺乳類の細胞は実際に好ましく、これは天然の異種
組織蛋白質を分泌できる好適な多数のホスト細胞ラインが従来から開発されたか
らであり、、これらはＣＨＯ細胞ライン、種々のＣＯＳ細胞ライン、ＨｅＬａ細
胞、骨髄腫細胞ライン等を含む。
ングに使用できる。E.Coliは本発明のＤＮＡシーケンスをクローニングするため
に特に有用な原核ホスト細胞である。その代わりに、ホスホロアミダイト合成を
含む種々の方法でオリゴヌクレオチドを化学的に合成しても良い。 ポリヌクレオチド構造は、天然に存在する又は異種組織プロモーター領域を含
むコーディングシーケンスに機能するように結合した発現制御シーケンスを典型
的に含んでいる。好ましくは該発現制御シーケンスは、真核ホスト細胞を変換し
又はトランスフェクトできるベクトル中の真核プロモーターシステムである。一
旦ベクトルが好適なホスト中に組み入れられると、該ホストは、ヌクレオチドシ
ーケンスの高レベル発現と本発明による抗体の収集及び精製に適した条件下に維
持される。真核ホスト細胞として、哺乳類の組織細胞の培養液も本発明のポリペ
プチドの生産に使用できる。哺乳類の細胞は実際に好ましく、これは天然の異種
組織蛋白質を分泌できる好適な多数のホスト細胞ラインが従来から開発されたか
らであり、、これらはＣＨＯ細胞ライン、種々のＣＯＳ細胞ライン、ＨｅＬａ細
胞、骨髄腫細胞ライン等を含む。
【００３４】 典型的には本発明による抗体の重い及び／又は軽い鎖を解読するポリヌクレオ
チドシーケンスは抗体をグリコシル化するグリコシル化細胞中に導入されかつ発
現される。ここで使用される「グリコシル化細胞」とは蛋白質をグリコシル化で
きる細胞であり、特に細胞中で発現される少なくとも１個のポリペプチド，特に
分泌された蛋白質中の少なくとも１個のグリコシル化サイトシーケンスに、少な
くとも１個のマンノース残基を含むＮ−結合の「核オリゴ糖」を追加でき及び／
又はＯ−結合糖を追加できる真核細胞である。従ってグリコシル化細胞は、蛋白
質又はポリペプチド中でグリコシル化サイトシーケンスに糖残基を付けることを
触媒する少なくとも１個の酵素的活性体を含み、前記細胞は少なくとも１個の発
現したポリペプチドを実際にグリコシル化する。例えば限定されるものではない
が、哺乳類の細胞は典型的にはグリコシル化細胞である。昆虫の細胞や酵母もグ
リコシル化細胞である。
チドシーケンスは抗体をグリコシル化するグリコシル化細胞中に導入されかつ発
現される。ここで使用される「グリコシル化細胞」とは蛋白質をグリコシル化で
きる細胞であり、特に細胞中で発現される少なくとも１個のポリペプチド，特に
分泌された蛋白質中の少なくとも１個のグリコシル化サイトシーケンスに、少な
くとも１個のマンノース残基を含むＮ−結合の「核オリゴ糖」を追加でき及び／
又はＯ−結合糖を追加できる真核細胞である。従ってグリコシル化細胞は、蛋白
質又はポリペプチド中でグリコシル化サイトシーケンスに糖残基を付けることを
触媒する少なくとも１個の酵素的活性体を含み、前記細胞は少なくとも１個の発
現したポリペプチドを実際にグリコシル化する。例えば限定されるものではない
が、哺乳類の細胞は典型的にはグリコシル化細胞である。昆虫の細胞や酵母もグ
リコシル化細胞である。
【００３５】 一旦発現すると本発明による抗体は、ＨＰＬＣ精製、分別カラムクロマトグラ
フィー、ゲル電気泳動等を含む従来技術の標準的な手法により精製できる〔Ｒ．
スコープスの「蛋白質精製（1982年）」（ニューヨークのスプリンガー・フェア
ラーク）参照〕。 本発明の治療化合物は、薬学技術で知られている形態を使用して、血管内へ、
腹膜内へ、皮下注射で、筋肉内へ、のような非経口的方法で投与できる。本発明
の活性な薬成分は液体、粉末又は親液性の形態で使用でき、かつ水、塩水、右旋
糖水、緩衝液等の好適な希釈剤やキャリアと組み合わせても良い。保存剤を添加
しても良い。
フィー、ゲル電気泳動等を含む従来技術の標準的な手法により精製できる〔Ｒ．
スコープスの「蛋白質精製（1982年）」（ニューヨークのスプリンガー・フェア
ラーク）参照〕。 本発明の治療化合物は、薬学技術で知られている形態を使用して、血管内へ、
腹膜内へ、皮下注射で、筋肉内へ、のような非経口的方法で投与できる。本発明
の活性な薬成分は液体、粉末又は親液性の形態で使用でき、かつ水、塩水、右旋
糖水、緩衝液等の好適な希釈剤やキャリアと組み合わせても良い。保存剤を添加
しても良い。
【００３６】 選択された投与経路にかかわらず、本発明の化合物は当業者に既知の従来法に
より薬学的に受け入れられる投与形態に配合される。該化合物は薬学的に受け入
れられる酸又は塩基添加塩を使用して配合しても良い。更に該化合物又はそれら
の塩を好適な加水形態で使用しても良い。 選択された投与経路にかかわらず、毒性はないが治療上有効な量の１又は２以
上の本発明の化合物を任意の処理に使用する。処理のための投与方法は、患者の
タイプ、年令、体重、性別及び医学的な状態、腫瘍のタイプ、投与経路及び処理
で使用される特殊な化合物を含む種々の因子により選択する。通常の技能を有す
る医者は、既知の抗体治療のアプローチに関して要求される薬品の効果的な量を
容易に決定し処方できる。そのような過程において、医者はまず比較的低い投与
量を使用し、続いて最大の応答が得られるまで、投与量を増加することができた
。
より薬学的に受け入れられる投与形態に配合される。該化合物は薬学的に受け入
れられる酸又は塩基添加塩を使用して配合しても良い。更に該化合物又はそれら
の塩を好適な加水形態で使用しても良い。 選択された投与経路にかかわらず、毒性はないが治療上有効な量の１又は２以
上の本発明の化合物を任意の処理に使用する。処理のための投与方法は、患者の
タイプ、年令、体重、性別及び医学的な状態、腫瘍のタイプ、投与経路及び処理
で使用される特殊な化合物を含む種々の因子により選択する。通常の技能を有す
る医者は、既知の抗体治療のアプローチに関して要求される薬品の効果的な量を
容易に決定し処方できる。そのような過程において、医者はまず比較的低い投与
量を使用し、続いて最大の応答が得られるまで、投与量を増加することができた
。
【００３７】 本発明による抗体を含んで成る薬学的組成物を局所的又は非経口的投与、つま
り、皮下へ、筋肉内へ、静脈内へ、又は皮膚を通しての投与に有用である。非経
口投与のための組成物は、一般に受け入れられるキャリア、好ましくは水性キャ
リア中に溶解した前記抗体の溶液を含んで成る。種々の水性キャリア、例えば水
、緩衝水、0.4 ％の塩水、0.3 ％のグリシン等が使用できる。該溶液は無菌状態
で一般に粒子状物体が存在しない。前記組成物は従来の周知の技術により無菌状
態にする。該組成物は、例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム
、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム等のｐＨ調整及び緩衝剤、毒性調整剤のよう
なほぼ適切な生理学的状態にするために要求され、薬学的に受け入れられる補助
物質を含んでいても良い。これらの配合物中の本発明による抗体の濃度は、広く
変化することができ、例えば約0.01％未満通常は少なくとも約0.1 ％から５重量
％まで高くした範囲で、主として液体量、粘度等に基づいて、又は選択された投
与の特別なモードに従って変化する。
り、皮下へ、筋肉内へ、静脈内へ、又は皮膚を通しての投与に有用である。非経
口投与のための組成物は、一般に受け入れられるキャリア、好ましくは水性キャ
リア中に溶解した前記抗体の溶液を含んで成る。種々の水性キャリア、例えば水
、緩衝水、0.4 ％の塩水、0.3 ％のグリシン等が使用できる。該溶液は無菌状態
で一般に粒子状物体が存在しない。前記組成物は従来の周知の技術により無菌状
態にする。該組成物は、例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム
、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム等のｐＨ調整及び緩衝剤、毒性調整剤のよう
なほぼ適切な生理学的状態にするために要求され、薬学的に受け入れられる補助
物質を含んでいても良い。これらの配合物中の本発明による抗体の濃度は、広く
変化することができ、例えば約0.01％未満通常は少なくとも約0.1 ％から５重量
％まで高くした範囲で、主として液体量、粘度等に基づいて、又は選択された投
与の特別なモードに従って変化する。
【００３８】 従って筋肉注射用の典型的な薬学的組成は１mlまでの無菌緩衝水と約１から50
mgの本発明による抗体から成るものとすることができた。 本発明による抗体は貯蔵のために親液性とし、使用に先立って適切なキャリア
中で再構成しても良い。従来の親液化及び再構成技術を使用できる。親液化及び
再構成は生物的活性のロスの程度を変化させられること及び使用レベルは補償の
ために調節されなければならないことは当業者により理解できる。
mgの本発明による抗体から成るものとすることができた。 本発明による抗体は貯蔵のために親液性とし、使用に先立って適切なキャリア
中で再構成しても良い。従来の親液化及び再構成技術を使用できる。親液化及び
再構成は生物的活性のロスの程度を変化させられること及び使用レベルは補償の
ために調節されなければならないことは当業者により理解できる。
【００３９】 本発明による抗ＭＵＣ１抗体の安全性、投与量及び治療上の能力を55人の胸部
癌患者に対する臨床的なケーススタディで評価した。最小の残留疾患（ｎ＝47）
及び転移疾患（ｎ＝８）の患者がスタディーに参加した。標準的な補助薬による
治療及び抗体７Ｆ11による治療の前に、全ての患者は初期の操作時に骨髄の腫瘍
細胞による汚染を証明した。18人の患者は、４週間ごとに50mgの天然の７Ｆ11の
多数の点滴を受けた。進行した転移胸部癌種を有する１人の患者は１週間のイン
ターバルで４回の50mg投与を受けた。14人の患者の第２のグループは、７Ｆ11の
20mg投与で処置され、他方22人の患者の第３のグループは2.5 mg処置を受けた。
一般に抗体点滴は良好に耐えられた。６人の患者のみが迅速な（２時間）７Ｆ11
の50mg点滴を受け、直ちに軽いアレルギー反応を見せた。これらの副作用は50mg
投与の点滴時間を８時間に延ばすことにより、回避できた。システム的な副作用
には遭遇しなかった。点滴時間がそれぞれ４及び１時間である20mg及び2.5 mg処
置グループでは悪い副作用は観察されなかった。ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）
が１〜100 μｇ／mlの範囲で安定した滴定量になり、抗７Ｆ11抗体（ａｂ2 ）ゅ
安定した滴定量となるまで、免疫処置を繰り返した。３ヶ月後に、骨髄を分析し
てミクロ転移細胞の検出と検定を行った。ここまでで、24人の患者の骨髄を７Ｆ
11治療中及びその後に再検査し、他の患者は依然として治療中である。Ｍ０グル
ープの18人の患者は骨髄中に汚染した腫瘍細胞が存在しないことが見出され、１
人の患者では106 の骨髄細胞中、３から７への腫瘍細胞の増加が記録された。追
跡調査の間、全ての免疫された患者は腫瘍のないまま維持された。ところで、こ
れらの患者のうちの７人は維持処置として予防の増強免疫処置を受け、結果とし
てＨＡＭＡ及び７Ｆ11滴定量の劇的な増加を示した。これらの増強免疫処置は不
利な出来事を生じさせることなく耐えられ、そしてネズミ７Ｆ11による維持処置
はＨＡＭＡ及び７Ｆ11滴定量の増加にもかかわらず実施可能であることを示して
いる。
癌患者に対する臨床的なケーススタディで評価した。最小の残留疾患（ｎ＝47）
及び転移疾患（ｎ＝８）の患者がスタディーに参加した。標準的な補助薬による
治療及び抗体７Ｆ11による治療の前に、全ての患者は初期の操作時に骨髄の腫瘍
細胞による汚染を証明した。18人の患者は、４週間ごとに50mgの天然の７Ｆ11の
多数の点滴を受けた。進行した転移胸部癌種を有する１人の患者は１週間のイン
ターバルで４回の50mg投与を受けた。14人の患者の第２のグループは、７Ｆ11の
20mg投与で処置され、他方22人の患者の第３のグループは2.5 mg処置を受けた。
一般に抗体点滴は良好に耐えられた。６人の患者のみが迅速な（２時間）７Ｆ11
の50mg点滴を受け、直ちに軽いアレルギー反応を見せた。これらの副作用は50mg
投与の点滴時間を８時間に延ばすことにより、回避できた。システム的な副作用
には遭遇しなかった。点滴時間がそれぞれ４及び１時間である20mg及び2.5 mg処
置グループでは悪い副作用は観察されなかった。ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）
が１〜100 μｇ／mlの範囲で安定した滴定量になり、抗７Ｆ11抗体（ａｂ2 ）ゅ
安定した滴定量となるまで、免疫処置を繰り返した。３ヶ月後に、骨髄を分析し
てミクロ転移細胞の検出と検定を行った。ここまでで、24人の患者の骨髄を７Ｆ
11治療中及びその後に再検査し、他の患者は依然として治療中である。Ｍ０グル
ープの18人の患者は骨髄中に汚染した腫瘍細胞が存在しないことが見出され、１
人の患者では106 の骨髄細胞中、３から７への腫瘍細胞の増加が記録された。追
跡調査の間、全ての免疫された患者は腫瘍のないまま維持された。ところで、こ
れらの患者のうちの７人は維持処置として予防の増強免疫処置を受け、結果とし
てＨＡＭＡ及び７Ｆ11滴定量の劇的な増加を示した。これらの増強免疫処置は不
利な出来事を生じさせることなく耐えられ、そしてネズミ７Ｆ11による維持処置
はＨＡＭＡ及び７Ｆ11滴定量の増加にもかかわらず実施可能であることを示して
いる。
【００４０】 臨床的に証明された７Ｆ11治療前の局部疾患又は転移を有する患者のグループ
では、２種類のケースで骨髄の腫瘍細胞の除去が見られ、減少が２人の患者で記
録され、腫瘍細胞の増加は他の１人の患者で見られた。３人の患者は依然として
治療中である。 進行した胸部癌種を有する１人の患者は週間的インターバルで７Ｆ11の50mg点
滴を受けた。第１処置のリンパ球の２４時間後に、骨髄及び腹水液を７Ｆ11の生
物的分布を分析した。10μｇ／mlのリンパ球７Ｆ11レベルが、それぞれ骨髄中の
８μｇ／ml及び腹水中の６μｇ／mlを生じさせた。これらの条件下で、骨髄中の
腫瘍細胞（＞100 ／106 通常の骨髄細胞）及び腹水中の腫瘍細胞（10細胞／ml）
は細胞膜及び細胞質の均一で強い７Ｆ11ラベリングを証明した。
では、２種類のケースで骨髄の腫瘍細胞の除去が見られ、減少が２人の患者で記
録され、腫瘍細胞の増加は他の１人の患者で見られた。３人の患者は依然として
治療中である。 進行した胸部癌種を有する１人の患者は週間的インターバルで７Ｆ11の50mg点
滴を受けた。第１処置のリンパ球の２４時間後に、骨髄及び腹水液を７Ｆ11の生
物的分布を分析した。10μｇ／mlのリンパ球７Ｆ11レベルが、それぞれ骨髄中の
８μｇ／ml及び腹水中の６μｇ／mlを生じさせた。これらの条件下で、骨髄中の
腫瘍細胞（＞100 ／106 通常の骨髄細胞）及び腹水中の腫瘍細胞（10細胞／ml）
は細胞膜及び細胞質の均一で強い７Ｆ11ラベリングを証明した。
【００４１】 全体として臨床的研究は、最小の残留疾患を有する胸部癌患者に本発明による
抗ＭＵＣ１骨髄の多数回投与にする差異の安全性、耐性、薬学的動力学を示す。
骨髄中のミクロ転移腫瘍細胞はＭ０グループの18人の患者及びロコ領域的疾患を
有する２人の患者で除去された。前記研究は、本発明による接合していない骨髄
を有する胸部癌癌の処置は、直接的な細胞毒の受動的なエフェクター機構又は精
神疾患ネットワーク応答のいずれかにより、骨髄中の腫瘍細胞を除去できること
を示している。更に骨髄中のミクロ転移細胞の追跡は、補助薬腫瘍治療の効能を
ついせきするためお極度に感度の良い代用マーカーとして提示される。
抗ＭＵＣ１骨髄の多数回投与にする差異の安全性、耐性、薬学的動力学を示す。
骨髄中のミクロ転移腫瘍細胞はＭ０グループの18人の患者及びロコ領域的疾患を
有する２人の患者で除去された。前記研究は、本発明による接合していない骨髄
を有する胸部癌癌の処置は、直接的な細胞毒の受動的なエフェクター機構又は精
神疾患ネットワーク応答のいずれかにより、骨髄中の腫瘍細胞を除去できること
を示している。更に骨髄中のミクロ転移細胞の追跡は、補助薬腫瘍治療の効能を
ついせきするためお極度に感度の良い代用マーカーとして提示される。
【００４２】 腫瘍を伴うＧＡ７３３−２（ＣＯ１７−１Ａ）のような抗原（ＴＡＡ）に対す
る免疫性の導入は、腫瘍細胞を除去し、又は疾患の再発生を遅らせる。高投与量
（500 mg）で繰り返し浸される天然のｍＡｂ17−１Ａを使用する結腸癌の患者に
関する研究は、死亡率を30％まで減少させた（Ｇ．リートミュラー、Lancet 343
(1994) 1177-1183)。17−１Ａで処置した進行した結腸癌の患者のグループ中の
Ｊ．ファゲルベルクらのCancer Immunol. Immunother. 38 (1994) 149-159 から
の最近の結果は、a)重要なａｂ２応答を有する患者は長い生存時間を有したこと
、b)短いインターバルで投与された２ｇのレンジの天然のｍＡｂの高い全投与量
はヒトａｂ２の低い濃度を導いたこと、及びc)組換えヒト化１７−１Ａは抗精神
疾患抗体の滴定量を大きく減少させた、ことを示している。
る免疫性の導入は、腫瘍細胞を除去し、又は疾患の再発生を遅らせる。高投与量
（500 mg）で繰り返し浸される天然のｍＡｂ17−１Ａを使用する結腸癌の患者に
関する研究は、死亡率を30％まで減少させた（Ｇ．リートミュラー、Lancet 343
(1994) 1177-1183)。17−１Ａで処置した進行した結腸癌の患者のグループ中の
Ｊ．ファゲルベルクらのCancer Immunol. Immunother. 38 (1994) 149-159 から
の最近の結果は、a)重要なａｂ２応答を有する患者は長い生存時間を有したこと
、b)短いインターバルで投与された２ｇのレンジの天然のｍＡｂの高い全投与量
はヒトａｂ２の低い濃度を導いたこと、及びc)組換えヒト化１７−１Ａは抗精神
疾患抗体の滴定量を大きく減少させた、ことを示している。
【００４３】 胸部ムチンは、染色体１ｑ上の遺伝子ＭＵＣ１によりコード化された高度にグ
リコシル化された蛋白質である。抗原は、胸部及び卵巣癌種中で過度に発現し、
変型してグリコシル化されている。腫瘍を伴うムチンは、細胞質、細胞膜及び分
泌成分中で見出される。 これらの細胞膜及び分泌されたＴＡＡは、胸部癌患者に体液性（Ａ．ルゲッテ
ィら、Cancer Res. 53 (1993) 2457─2461) 及び細胞性免疫（Ｈ．Ｒ．ジェロー
ム、J. Immunol. 151 (1993) 1654-1662) を導入する。従ってＭＵＣ１特異性を
有するマブは免疫治療への介入の選択の候補である（概説はＶ．アポストロボウ
ロス及びＦ．Ｃ．マッケンジーのCritical Rev. Immunology 14 (1994) 293-309
) 。
リコシル化された蛋白質である。抗原は、胸部及び卵巣癌種中で過度に発現し、
変型してグリコシル化されている。腫瘍を伴うムチンは、細胞質、細胞膜及び分
泌成分中で見出される。 これらの細胞膜及び分泌されたＴＡＡは、胸部癌患者に体液性（Ａ．ルゲッテ
ィら、Cancer Res. 53 (1993) 2457─2461) 及び細胞性免疫（Ｈ．Ｒ．ジェロー
ム、J. Immunol. 151 (1993) 1654-1662) を導入する。従ってＭＵＣ１特異性を
有するマブは免疫治療への介入の選択の候補である（概説はＶ．アポストロボウ
ロス及びＦ．Ｃ．マッケンジーのCritical Rev. Immunology 14 (1994) 293-309
) 。
【００４４】 我々の研究グループは、ヒトの胸部ムチン（ＢＭ）の異なったエピトープに対
する多数の単クローン抗体（ｍＡｂｓ）を開発した。ヒト胸部ムチンＭＵＣ１の
タンデムリピート領域の炭水化物／ペプチド結合サイトに特異的なＭＡｂ７Ｆ11
は胸部癌種の96％を越えるものと反応性を有する。 固体腫瘍及び転移中の７Ｆ11着色パターンは着色した腫瘍細胞の通常80％以上
と均質である。従って７Ｆ11は骨髄中の腫瘍細胞の分析用及び免疫シンチグラフ
用として使用できる。
する多数の単クローン抗体（ｍＡｂｓ）を開発した。ヒト胸部ムチンＭＵＣ１の
タンデムリピート領域の炭水化物／ペプチド結合サイトに特異的なＭＡｂ７Ｆ11
は胸部癌種の96％を越えるものと反応性を有する。 固体腫瘍及び転移中の７Ｆ11着色パターンは着色した腫瘍細胞の通常80％以上
と均質である。従って７Ｆ11は骨髄中の腫瘍細胞の分析用及び免疫シンチグラフ
用として使用できる。
【００４５】 流れ細胞学分析及び組織学的分析は高い腫瘍選択性とＭａｂ７Ｆ11用の異なっ
た組織の通常細胞との最小の交差反応性を証明した。この理由から、最小の残留
疾患を有する胸部癌患者の免疫治療処置用としてｍＡｂが選択された。本免疫処
置プロトコールは、 a) 精神疾患ネットワーク活性化、 b) Ｂ−細胞活性化、 c) Ｔ−細胞活性化、又は d) 抗体依存細胞毒性（ＡＤＣＣ） 用に設計された。 従って７Ｆ11は４週間のインターバルで比較的低い投与量である2.5 、20及び
50mgで投与された。アレルギー反応以外の毒性のある副作用は55人の患者グルー
プ中で遭遇しなかった。特にアナフラキシー反応は見られなかった。３人の患者
が全部で450 mgの７Ｆ11を投与された。
た組織の通常細胞との最小の交差反応性を証明した。この理由から、最小の残留
疾患を有する胸部癌患者の免疫治療処置用としてｍＡｂが選択された。本免疫処
置プロトコールは、 a) 精神疾患ネットワーク活性化、 b) Ｂ−細胞活性化、 c) Ｔ−細胞活性化、又は d) 抗体依存細胞毒性（ＡＤＣＣ） 用に設計された。 従って７Ｆ11は４週間のインターバルで比較的低い投与量である2.5 、20及び
50mgで投与された。アレルギー反応以外の毒性のある副作用は55人の患者グルー
プ中で遭遇しなかった。特にアナフラキシー反応は見られなかった。３人の患者
が全部で450 mgの７Ｆ11を投与された。
【００４６】 研究グループの全ての患者が３から10回の免疫処置の後に、ＨＡＭＡ及び抗７
Ｆ11抗体の安定で長く続く滴定量を得て、１人の患者は１回の免疫処置後に安定
な滴定量を得た（平均5.6 回）。従って免疫処置の数は、個々の患者及び安定で
長く続く抗体の滴定量を得るための患者の能力に依存して、適切には１〜10、好
ましくは８〜９、最も好ましくは６〜８である。最大のＨＡＭＡ滴定量は、最後
の免疫処置の後で５ヶ月の平均リンパ球半減期を有する、10から100 μｍ／mlの
範囲内である。４人の患者では（表１の患者１、２、４及び５）25〜40％の抗精
神疾患応答は抗原結合サイトに従ってａｂ２β−タイプに関している。
Ｆ11抗体の安定で長く続く滴定量を得て、１人の患者は１回の免疫処置後に安定
な滴定量を得た（平均5.6 回）。従って免疫処置の数は、個々の患者及び安定で
長く続く抗体の滴定量を得るための患者の能力に依存して、適切には１〜10、好
ましくは８〜９、最も好ましくは６〜８である。最大のＨＡＭＡ滴定量は、最後
の免疫処置の後で５ヶ月の平均リンパ球半減期を有する、10から100 μｍ／mlの
範囲内である。４人の患者では（表１の患者１、２、４及び５）25〜40％の抗精
神疾患応答は抗原結合サイトに従ってａｂ２β−タイプに関している。
【００４７】 最後の免疫処置の３ヶ月後に、患者は骨髄中の腫瘍細胞汚染のための再検査を
受けた。各患者の骨髄細胞を免疫細胞学的に及び自動画分析により、少なくとも
６個の細胞スピンで分析した。Ｍ０グループの18人の患者及び局部疾患の２人の
患者はミクロ転移腫瘍細胞に関してネガティブであった。Ｍ０グループの１人患
者のみが骨髄中の腫瘍細胞を増加させていた。これらの結果は、７Ｆ11により受
動的な免疫治療が、補助薬を使用する状況の大部分の胸部癌患者の骨髄中の個々
のミクロ転移腫瘍細胞を除去できることを明瞭に示している。接合していないネ
ズミｍＡｂｓ７Ｆ11は異なった手法でヒトの免疫システムに影響を与える。直接
的な機構は腫瘍細胞のラベリングに依存し、抗体依存の細胞毒性、相補−依存細
胞毒性及びアポトシスにより引き起こされる。間接的機構は免疫ネットワークを
通して起こる。治療用マウス抗体の超可変領域に結合する抗精神疾患抗体（ａｂ
２β）は、Ｔ−細胞（Ｔ２）を導き、抗抗精神疾患抗体（ａｂ３）及びＴ−細胞
（Ｔ３）クローンの発展を誘発する。ａｂ２βを識別するヒトａｂ３抗体及び治
療マウス抗体により定義されるヒトの胸部ムチンの通常の抗原エピトープは免疫
された患者の有利な結果用に応答する。
受けた。各患者の骨髄細胞を免疫細胞学的に及び自動画分析により、少なくとも
６個の細胞スピンで分析した。Ｍ０グループの18人の患者及び局部疾患の２人の
患者はミクロ転移腫瘍細胞に関してネガティブであった。Ｍ０グループの１人患
者のみが骨髄中の腫瘍細胞を増加させていた。これらの結果は、７Ｆ11により受
動的な免疫治療が、補助薬を使用する状況の大部分の胸部癌患者の骨髄中の個々
のミクロ転移腫瘍細胞を除去できることを明瞭に示している。接合していないネ
ズミｍＡｂｓ７Ｆ11は異なった手法でヒトの免疫システムに影響を与える。直接
的な機構は腫瘍細胞のラベリングに依存し、抗体依存の細胞毒性、相補−依存細
胞毒性及びアポトシスにより引き起こされる。間接的機構は免疫ネットワークを
通して起こる。治療用マウス抗体の超可変領域に結合する抗精神疾患抗体（ａｂ
２β）は、Ｔ−細胞（Ｔ２）を導き、抗抗精神疾患抗体（ａｂ３）及びＴ−細胞
（Ｔ３）クローンの発展を誘発する。ａｂ２βを識別するヒトａｂ３抗体及び治
療マウス抗体により定義されるヒトの胸部ムチンの通常の抗原エピトープは免疫
された患者の有利な結果用に応答する。
【００４８】 結論として、７Ｆ11治療は補助薬状況での胸部癌患者の骨髄中のミクロ転移胸
部腫瘍細胞の劇的な減少又は根絶を生じさせた。 抗体７Ｆ11（1)及び１Ｅ４（2)を分泌する本発明で述べた細胞ラインＤＳＭ
ＡＣＣ2329（1)及びＤＳＭ ＡＣＣ2328（2)は、1997年10月31日に、ドイツ国ブ
ラウンシュバイク、Ｄー３８１２４、マシェローダー・ベク１ｂのドイッチェ・
サムルンク・フォン・ミクロオルガニスメン・ウント・ツェルクルツーレン・ゲ
ーエムベーハー（ＤＳＭ）とベーリンガー・マンハイム・ゲーエムベーハーによ
り市場に出された。 以下の表、実施例、参考文献、シーケンスリスト及び図面は本発明の理解を助
けるために提供されるもので、本発明の真の範囲は添付した特許請求の範囲に記
載されている。本発明の精神から離れることなく、記載された操作において修正
が可能であることは理解すべきである。
部腫瘍細胞の劇的な減少又は根絶を生じさせた。 抗体７Ｆ11（1)及び１Ｅ４（2)を分泌する本発明で述べた細胞ラインＤＳＭ
ＡＣＣ2329（1)及びＤＳＭ ＡＣＣ2328（2)は、1997年10月31日に、ドイツ国ブ
ラウンシュバイク、Ｄー３８１２４、マシェローダー・ベク１ｂのドイッチェ・
サムルンク・フォン・ミクロオルガニスメン・ウント・ツェルクルツーレン・ゲ
ーエムベーハー（ＤＳＭ）とベーリンガー・マンハイム・ゲーエムベーハーによ
り市場に出された。 以下の表、実施例、参考文献、シーケンスリスト及び図面は本発明の理解を助
けるために提供されるもので、本発明の真の範囲は添付した特許請求の範囲に記
載されている。本発明の精神から離れることなく、記載された操作において修正
が可能であることは理解すべきである。
【００４９】省略のリスト ＨＡＭＡ ＝ヒト抗マウス抗体 ＰＢＳ ＝燐酸塩緩衝塩水 ＡＰＡＡＰ技術 ＝アルカリホスファターゼ抗アルカリホスファターゼ錯体 ＴＣＤ ＝腫瘍細胞の数 ＴＡＡ ＝腫瘍を伴う抗原 ＰＵＭ ＝多形尿ムチン状糖蛋白 ＥＩＡ ＝酵素免疫アッセイ ＰＭＳＦ ＝フッ化フェニルメチルスルホニル ＷＧＡ ＝コムギ麦芽凝集素 ＢＳＡ ＝ウシ血清アルブミン ＰＰ ＝燐酸緩衝液 ＴＦＭＳＡ ＝トリフルオロメタンスルホン酸 ＭＡＰＳ ＝単クローン抗体結合溶液（ＢｉｏＲａｄ） ＰＥ ＝フィコエリトリン ＰＥＣｙ５ ＝タンデム接合フィコエリトリン及びシアニン５
【００５０】
【表１】
【００５１】 実施例１ 抗体の同定と精製 単クローン抗体１Ｅ４ クローン１Ｅ４（ｌｇＧ１、ｋ）を、３人の患者からのＭＵＣ１フラクション
で順に８回４〜６週間ごとに免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスから選択した。スプリ
ーノサイトを、ＰＥＧ6000を使用する確立された方法（1)によってＸ６３−Ｐ３
Ｘ 63Ａｇ8.653 （ＡＴＣＣ ＣＲＬ1580）マウス骨髄腫細胞に接合した。マ
ウス大食細胞をフィーダー細胞として使用して、10個の96−ウェル・プレート中
でハイブリドーマを選択した。上澄みをＥＬＩＳＡ及び免疫細胞学的手法により
スクリーニングした。強いＭＵＣ１反応性を有する19個のハイブリドーマクロー
ン同定しかつクリオ保存した。クローン１Ｅ４のための主たる選択基準は、種々
の腫瘍を伴う抗原フラクションと強い反応性を有し、免疫的優越性のＭＵＣ１−
ＶＮＴＲペプチドシーケンスＡＰＤＴＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）との反応性
を有せず、かつ通常の乳汁ＭＵＣ１、脱グリコシル化ＭＵＣ１及び通常の尿のム
チン（多形質の尿のムチン状の糖蛋白ＰＵＭ）と最小の反応性を有することとし
た。
で順に８回４〜６週間ごとに免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスから選択した。スプリ
ーノサイトを、ＰＥＧ6000を使用する確立された方法（1)によってＸ６３−Ｐ３
Ｘ 63Ａｇ8.653 （ＡＴＣＣ ＣＲＬ1580）マウス骨髄腫細胞に接合した。マ
ウス大食細胞をフィーダー細胞として使用して、10個の96−ウェル・プレート中
でハイブリドーマを選択した。上澄みをＥＬＩＳＡ及び免疫細胞学的手法により
スクリーニングした。強いＭＵＣ１反応性を有する19個のハイブリドーマクロー
ン同定しかつクリオ保存した。クローン１Ｅ４のための主たる選択基準は、種々
の腫瘍を伴う抗原フラクションと強い反応性を有し、免疫的優越性のＭＵＣ１−
ＶＮＴＲペプチドシーケンスＡＰＤＴＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）との反応性
を有せず、かつ通常の乳汁ＭＵＣ１、脱グリコシル化ＭＵＣ１及び通常の尿のム
チン（多形質の尿のムチン状の糖蛋白ＰＵＭ）と最小の反応性を有することとし
た。
【００５２】単クローン抗体７Ｆ11 クローン７Ｆ11（ｌｇＧ１、ｋ）を、２人の患者からの腹水と胸部癌細胞ライ
ンＴ47−Ｄから精製したＭＵＣ１フラクションで、ＢＡＬＢ／ｃマウスを８回免
疫処置して誘導した。スプリーノサイトのＰ３Ｘ６３Ａｇ8.653 骨髄腫細胞との
接合の後に、ＭＵＣ１特異性を有する９個のハイブリドーマを同定した。選択基
準は１Ｅ４と同じで、つまり分泌したＭＵＣ１と強い反応性を有するが通常の乳
汁ＭＵＣ１、脱グリコシル化ＭＵＣ１及びＰＵＭとは最小の反応性を有すること
とした。
ンＴ47−Ｄから精製したＭＵＣ１フラクションで、ＢＡＬＢ／ｃマウスを８回免
疫処置して誘導した。スプリーノサイトのＰ３Ｘ６３Ａｇ8.653 骨髄腫細胞との
接合の後に、ＭＵＣ１特異性を有する９個のハイブリドーマを同定した。選択基
準は１Ｅ４と同じで、つまり分泌したＭＵＣ１と強い反応性を有するが通常の乳
汁ＭＵＣ１、脱グリコシル化ＭＵＣ１及びＰＵＭとは最小の反応性を有すること
とした。
【００５３】方法 １．細胞 マイコプラスムを有しない骨髄腫Ｐ３Ｘ６３Ａｇ8.653 を使用した。ネズミｌ
ｇを生産しない細胞ラインを、4.5 ｇ／ｌの（Ｄ＋）グルコース、0.7 ｇ／ｌの
ＮａＨＣＯ3 、10％の救命用ウシ血清（ＦＣＳ）、15ｍＭのＨＥＰＥＳ、0.5 ％
のペリシリン−ストレプトマイシン及び２ｍＭのグルタミン（ＤＭＥＭ、全てド
イツのエッゲンシュタインのギブコ社）を有するドゥルベコス修正したイーグル
ス媒体の中で成長させた。
ｇを生産しない細胞ラインを、4.5 ｇ／ｌの（Ｄ＋）グルコース、0.7 ｇ／ｌの
ＮａＨＣＯ3 、10％の救命用ウシ血清（ＦＣＳ）、15ｍＭのＨＥＰＥＳ、0.5 ％
のペリシリン−ストレプトマイシン及び２ｍＭのグルタミン（ＤＭＥＭ、全てド
イツのエッゲンシュタインのギブコ社）を有するドゥルベコス修正したイーグル
ス媒体の中で成長させた。
【００５４】 胸部癌ラインＴ47Ｄ（ＨＴＢ133 ）、ＳＫＢＲ３（ＨＴＢ３０）、ＭＣＦ７（
ＨＴＢ２２）及びＺＲ７５（ＣＲＬ１５００）をＡＴＣＣから受け取った。ＫＳ
、ＷＡ、ＡＲ、ＫＭ２２及びＨＧ１５の胸部癌ラインは腹水（ＫＳ）、初期癌種
（ＷＡ、ＡＲ）及び骨髄（胸部癌患者のＫＭ２２及びＨＧ15）を使用して確立さ
せた。ムチンのネガティブな制御細胞ラインＳＷ１１１６（ＣＣＬ２３３）及び
ＬＳ１７４Ｔ（ＣＣＬ１８８）は前記ＡＴＣＣからのものである。ヒトの繊維芽
細胞は胸部癌患者の結合組織から単離した。卵巣癌種細胞ラインＨＩ及びＯＣは
腹水液を使用して確立した。
ＨＴＢ２２）及びＺＲ７５（ＣＲＬ１５００）をＡＴＣＣから受け取った。ＫＳ
、ＷＡ、ＡＲ、ＫＭ２２及びＨＧ１５の胸部癌ラインは腹水（ＫＳ）、初期癌種
（ＷＡ、ＡＲ）及び骨髄（胸部癌患者のＫＭ２２及びＨＧ15）を使用して確立さ
せた。ムチンのネガティブな制御細胞ラインＳＷ１１１６（ＣＣＬ２３３）及び
ＬＳ１７４Ｔ（ＣＣＬ１８８）は前記ＡＴＣＣからのものである。ヒトの繊維芽
細胞は胸部癌患者の結合組織から単離した。卵巣癌種細胞ラインＨＩ及びＯＣは
腹水液を使用して確立した。
【００５５】 ２．腹水液及び胸膜の浸出液からのＭＵＣ１糖蛋白フラクションの精製 進行している胸部癌の26人の患者から腹水及び胸膜浸出液を集め、膜濾過で清
澄化し、ＥＩＡでＭＵＣ１含有量を分析した。個々の患者からの２〜３リットル
の高度にポジティブをサンプルを−20℃で凍結させ、抗原精製に使用した。
澄化し、ＥＩＡでＭＵＣ１含有量を分析した。個々の患者からの２〜３リットル
の高度にポジティブをサンプルを−20℃で凍結させ、抗原精製に使用した。
【００５６】 ３．胸部癌ラインＫＳ及びＴ４７−Ｄからの標準抗原（ＢＭＡ）の生産 Ｔ４７−Ｄ細胞（悪性の胸膜浸出液、胸部癌種、ＡＴＣＣ ＨＴＢ１３３）及
び細胞ラインＫＳをヌンク工場（ドイツのビースバーデンのヌンク）で成長させ
た。２×109 個の細胞のバッチをトリプシネーションで集めＰＢＳで２回洗浄し
た。細胞は一定の攪拌下、４℃で１時間、500 mlの溶解用緩衝液（10ｍＭのＴＲ
ＩＳ／ＨＣｌ、ｐＨ7.6 、２ｍＭのＥＤＴＡ、１％のトリトン（登録商標）Ｘ−
100 、１％のアプロチニン、及び１ｍＭのＰＭＳＦ）中で均一化した。10000 ｇ
で15分間遠心分離して核は除去し、上澄み（細胞質ゾル）は−70℃で保存するか
抗原精製に使用した。
び細胞ラインＫＳをヌンク工場（ドイツのビースバーデンのヌンク）で成長させ
た。２×109 個の細胞のバッチをトリプシネーションで集めＰＢＳで２回洗浄し
た。細胞は一定の攪拌下、４℃で１時間、500 mlの溶解用緩衝液（10ｍＭのＴＲ
ＩＳ／ＨＣｌ、ｐＨ7.6 、２ｍＭのＥＤＴＡ、１％のトリトン（登録商標）Ｘ−
100 、１％のアプロチニン、及び１ｍＭのＰＭＳＦ）中で均一化した。10000 ｇ
で15分間遠心分離して核は除去し、上澄み（細胞質ゾル）は−70℃で保存するか
抗原精製に使用した。
【００５７】 ４．ＭＵＣ１の精製 4.1 ハイブリドーマ生産のための抗原精製 4.1.2 レクチン親和性クロマトグラフィー 細胞質ゾル、腹水マブ胸膜浸出液を、流速２〜５ml／分の２×30cmカラム中の
コムギ麦芽凝集素（ＷＧＡ）セファロース（ドイツのフライブルクのファーマシ
ア社）上でのレクチン親和性クロマトグラフィーにより精製した。カラムは低濃
度及び高濃度の塩（２Ｍ塩化ナトリウム）ＰＢＳで洗浄し、糖蛋白を１ml／分の
流速のＮ−アセチルグルコサミン（125 mg／ml）で溶出させ、ＰＢＳに対して透
析させ、ＹＭ100 膜（ドイツのバイデンのアミコン社）で超遠心で10回濃縮した
。蛋白質含有量はローリー（ドイツのミュンヘンのビオラッド社）によるミクロ
アッセイを使用して分析した。
コムギ麦芽凝集素（ＷＧＡ）セファロース（ドイツのフライブルクのファーマシ
ア社）上でのレクチン親和性クロマトグラフィーにより精製した。カラムは低濃
度及び高濃度の塩（２Ｍ塩化ナトリウム）ＰＢＳで洗浄し、糖蛋白を１ml／分の
流速のＮ−アセチルグルコサミン（125 mg／ml）で溶出させ、ＰＢＳに対して透
析させ、ＹＭ100 膜（ドイツのバイデンのアミコン社）で超遠心で10回濃縮した
。蛋白質含有量はローリー（ドイツのミュンヘンのビオラッド社）によるミクロ
アッセイを使用して分析した。
【００５８】 4.1.3 ゲル排除クロマトグラフィー 腹水及び細胞質ゾル蛋白質のレクチン親和性フラクションを、2.5 ×100 cmの
絡む中でスペロース６迅速蛋白質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ、ファーマ
シア社）により精製した。 200 から1000ｋＤａの分子量領域中のＭＵＣ１ポジティブフラクションをＥＩ
Ａで分析し、２〜10μｇ／mlに調節し、ＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫処置及びハイ
ブリドーマ上澄みの特異性テストに使用した。抗原は−20℃で貯蔵した。
絡む中でスペロース６迅速蛋白質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ、ファーマ
シア社）により精製した。 200 から1000ｋＤａの分子量領域中のＭＵＣ１ポジティブフラクションをＥＩ
Ａで分析し、２〜10μｇ／mlに調節し、ＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫処置及びハイ
ブリドーマ上澄みの特異性テストに使用した。抗原は−20℃で貯蔵した。
【００５９】 4.2 免疫親和性クロマトグラフィー 天然の及びグリコシル化ＭＵＣ１との反応性を有するマブ２Ｅ11を、ゲル１ml
当たり抗体10mgの濃度になるようにアフィ−ゲル10（ビオラッド社）に結合させ
た。細胞質ゾルを250 mlのバッチとして、１ml／分の流速で抗体カラムに供給し
、次いでＰＢＳ及びＰＢＳ−２Ｍ塩化ナトリウムで十分に洗浄した。結合した抗
原は流速0.5 ml／分でｐＨ６の７Ｍの尿素で溶出させ、５ＩＰＢＳに対して１晩
透析した。次いで精製した抗原は５mlのヤギ抗マウスｌｇＧ−アガロース（ドイ
ツのダイゼンホーフェンのジクマ社）カラムを通し痕跡量の２Ｅ11を除去した。
蛋白質をローリー（ビオラッド社）により分析し、200 μｇ蛋白質／mlに調節し
た。この胸部ムチン抗原（ＢＭＡ）は、500 Ｕ標準値のための１：35〜１：100
の希釈におけるＭＵＣ１アッセイの標準として使用できる。
当たり抗体10mgの濃度になるようにアフィ−ゲル10（ビオラッド社）に結合させ
た。細胞質ゾルを250 mlのバッチとして、１ml／分の流速で抗体カラムに供給し
、次いでＰＢＳ及びＰＢＳ−２Ｍ塩化ナトリウムで十分に洗浄した。結合した抗
原は流速0.5 ml／分でｐＨ６の７Ｍの尿素で溶出させ、５ＩＰＢＳに対して１晩
透析した。次いで精製した抗原は５mlのヤギ抗マウスｌｇＧ−アガロース（ドイ
ツのダイゼンホーフェンのジクマ社）カラムを通し痕跡量の２Ｅ11を除去した。
蛋白質をローリー（ビオラッド社）により分析し、200 μｇ蛋白質／mlに調節し
た。この胸部ムチン抗原（ＢＭＡ）は、500 Ｕ標準値のための１：35〜１：100
の希釈におけるＭＵＣ１アッセイの標準として使用できる。
【００６０】 ５．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタン免疫ブロッティング 蛋白質を7.5 ％のアクリルアミドゲル（16×16cm、ビオラッド社のプロテアン
）中の還元条件下でレムリに従って分離し、クリシン／メタノール緩衝液中、30
0 mAで４時間、ニトロセルロースに変換した。ニトロセルロースはＰＢＳ、0.1
％のトゥウィーン（Tween)20及び２％のドライミルク粉末で１時間、ブロッキン
グを行った。精製した抗原フラクション及び異なったソースの脱グリコシル化抗
原はビオチン化されたマブ（１μｇ／mlのＰＢＳ、及び１％のＢＳＡ）で１時間
検査し、ストレパビディン・パーオキシダーゼ及び４−クロロ−１−ナフトール
を基質として使用して検出した。
）中の還元条件下でレムリに従って分離し、クリシン／メタノール緩衝液中、30
0 mAで４時間、ニトロセルロースに変換した。ニトロセルロースはＰＢＳ、0.1
％のトゥウィーン（Tween)20及び２％のドライミルク粉末で１時間、ブロッキン
グを行った。精製した抗原フラクション及び異なったソースの脱グリコシル化抗
原はビオチン化されたマブ（１μｇ／mlのＰＢＳ、及び１％のＢＳＡ）で１時間
検査し、ストレパビディン・パーオキシダーゼ及び４−クロロ−１−ナフトール
を基質として使用して検出した。
【００６１】 ６．ＭＵＣ１の酵素的及び化学的脱グリコシル化 親和性で精製したＭＵＣ１のサンプルを0.1 ＭのＰＰ、ｐＨ5.5 （ノイラミニ
ダーゼ）又は0.1 ＭのＰＰ、ｐＨ6.0 （Ｏ−グリカナーゼ）に対して透析し、ノ
イラミニダーゼ（２、５、10、20ｍＵ、ドイツのマンハイムのベーリンガー−マ
ンハイム・ゲーエムベーハーのビブリオ・コレレ）又はＯ−グリカナーゼ（２、
20及び200 ｍＵ、ベアリンガー社のディピオコクス・ニューモニー）を使用して
37℃で24時間、培養した。消化はサンプルを100 ℃に５分間加熱することにより
停止させた。 ＴＦＭＳＡによる化学的脱グリコシル化は、Ａ．Ｓ．Ｂ．エッジらによるAnal
. Biochem. 118 (1981) 131-137 の記載に従って行った。精製した抗原（0.1 mg
）を親液性とし、200 μｌのＴＦＭＳＡＤ １〜３時間４℃で培養し、−80℃に
冷却し、50％の水性ピリジンで中和し、0.1 ％の重炭酸アンモニウムに対して透
析した。
ダーゼ）又は0.1 ＭのＰＰ、ｐＨ6.0 （Ｏ−グリカナーゼ）に対して透析し、ノ
イラミニダーゼ（２、５、10、20ｍＵ、ドイツのマンハイムのベーリンガー−マ
ンハイム・ゲーエムベーハーのビブリオ・コレレ）又はＯ−グリカナーゼ（２、
20及び200 ｍＵ、ベアリンガー社のディピオコクス・ニューモニー）を使用して
37℃で24時間、培養した。消化はサンプルを100 ℃に５分間加熱することにより
停止させた。 ＴＦＭＳＡによる化学的脱グリコシル化は、Ａ．Ｓ．Ｂ．エッジらによるAnal
. Biochem. 118 (1981) 131-137 の記載に従って行った。精製した抗原（0.1 mg
）を親液性とし、200 μｌのＴＦＭＳＡＤ １〜３時間４℃で培養し、−80℃に
冷却し、50％の水性ピリジンで中和し、0.1 ％の重炭酸アンモニウムに対して透
析した。
【００６２】 ７．ＭＵＣ１ペプチド特異的なマブ２Ｅ11の展開 スペロース６ゲル排除クロマトグラフィーにより、Ｔ47−Ｄ細胞質ゾル蛋白質
を部分的に精製した。確立された方法に従って、１〜２×106 Ｄａの高分子量フ
ラクションを使用してＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫処置を行った。最後の免疫処置
はノイラミニダーゼ及びＯ−グリカナーゼで処置した抗原で行った。スプリーノ
サイトをＸ６３Ａｇ８５３抗原腫細胞と接合した。ハイブリドーマ２Ｅ11をＥＬ
ＩＳＡ、細胞学的及び組織学的に選択した。マブ（ｌｇＧ３、ｋ）は胸部及び他
の癌種のホルマリン耐性エピトープと強くかつ幅広い反応性を示した。抗体は、
リンパＭＵＣ１レベルの定量的決定のために単独で、又は７Ｆ11及び１Ｅ４との
組合せで使用できた。被覆として７Ｆ11を有しパーオキシダーゼでラベルされた
２Ｅ11を有する２サイトサンドイッチ型ＥＩＡテストを、ＭＵＣ１定量のために
展開した。マブ２Ｅ11は制限希釈を11回行ってクローン化した。
を部分的に精製した。確立された方法に従って、１〜２×106 Ｄａの高分子量フ
ラクションを使用してＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫処置を行った。最後の免疫処置
はノイラミニダーゼ及びＯ−グリカナーゼで処置した抗原で行った。スプリーノ
サイトをＸ６３Ａｇ８５３抗原腫細胞と接合した。ハイブリドーマ２Ｅ11をＥＬ
ＩＳＡ、細胞学的及び組織学的に選択した。マブ（ｌｇＧ３、ｋ）は胸部及び他
の癌種のホルマリン耐性エピトープと強くかつ幅広い反応性を示した。抗体は、
リンパＭＵＣ１レベルの定量的決定のために単独で、又は７Ｆ11及び１Ｅ４との
組合せで使用できた。被覆として７Ｆ11を有しパーオキシダーゼでラベルされた
２Ｅ11を有する２サイトサンドイッチ型ＥＩＡテストを、ＭＵＣ１定量のために
展開した。マブ２Ｅ11は制限希釈を11回行ってクローン化した。
【００６３】 ８．クローン１Ｅ４の免疫処置及び選択 ＭＵＣ１を、患者ＦＯ、ＯＣ及びＳＴの腹水から、ＷＧＡ−クロマトグラフィ
ー及びスペロース６ゲル濾過により精製した。雌のＢＡＬＢ／ｃマウスに、異な
った患者からの抗原を使用して、順に８回４〜６週間ごとに免疫処置を行った。
スプリーノサイトを増強免疫処置の後の４日で除去し、ＰＥＧ6000を使用する確
立された方法（Ｓ．カウル、「哺乳類細胞に対する特異性を有する単クローン抗
体の発展」、フランクフルト大学生物化学センターの視覚取得論文、1983年）を
使用してＸ６３−Ａｇ８５３マウス骨髄腫細胞に接合した。マウスのマクロファ
ージ（ＰＭ）をフィーダー細胞として使用し、10個の96−ウェルプレート中でハ
イブリドーマを選択した。２週間後に、ＥＬＩＳＡ及び細胞学的手法を使用して
上澄みをスクリーニングした。強いＭＵＣ１反応性を有する19個のハイブリドー
マクローンを同定しクリオ保存した。クローン１Ｅ４のための主とする選択基準
は、通常の乳汁ＭＵＣ１、脱グリコシル化ＭＵＣ１及び通常の尿のムチン（多形
質の尿のムチン状の糖蛋白ＰＵＭ）と最小の反応性を有し、胸部癌細胞ラインＹ
４７Ｄ及びＫＳと強い細胞学的反応性を有し、ヒトの繊維芽細胞と最小の交差反
応性を有することであった。１Ｅ４は制限希釈８回でクローン化した。
ー及びスペロース６ゲル濾過により精製した。雌のＢＡＬＢ／ｃマウスに、異な
った患者からの抗原を使用して、順に８回４〜６週間ごとに免疫処置を行った。
スプリーノサイトを増強免疫処置の後の４日で除去し、ＰＥＧ6000を使用する確
立された方法（Ｓ．カウル、「哺乳類細胞に対する特異性を有する単クローン抗
体の発展」、フランクフルト大学生物化学センターの視覚取得論文、1983年）を
使用してＸ６３−Ａｇ８５３マウス骨髄腫細胞に接合した。マウスのマクロファ
ージ（ＰＭ）をフィーダー細胞として使用し、10個の96−ウェルプレート中でハ
イブリドーマを選択した。２週間後に、ＥＬＩＳＡ及び細胞学的手法を使用して
上澄みをスクリーニングした。強いＭＵＣ１反応性を有する19個のハイブリドー
マクローンを同定しクリオ保存した。クローン１Ｅ４のための主とする選択基準
は、通常の乳汁ＭＵＣ１、脱グリコシル化ＭＵＣ１及び通常の尿のムチン（多形
質の尿のムチン状の糖蛋白ＰＵＭ）と最小の反応性を有し、胸部癌細胞ラインＹ
４７Ｄ及びＫＳと強い細胞学的反応性を有し、ヒトの繊維芽細胞と最小の交差反
応性を有することであった。１Ｅ４は制限希釈８回でクローン化した。
【００６４】 ９．クローン７Ｆ11の免疫処置及び選択 ＭＵＣ１を、患者ＳＴ及びＺＥびＳＴの腹水から及び胸部癌細胞ラインＴ４７
−Ｄから、ＷＧＡ−クロマトグラフィー及びスペロース６ゲル濾過により精製し
た。ＢＡＬＢ／ｃマウスに、異なった抗体フラクションで順に８回免疫処置を行
った。スプリーノサイトをＸ６３−Ａｇ８５３骨髄腫細胞に接合した後、ＭＵＣ
１特異性を有する９このハイブリドーマを同定した。クローン７Ｆ11（ｌｇＧ１
、ｋ）はＥＬＩＳＡ及び細胞学的手法を使用して選択され、通常の乳汁ＭＵＣ１
、脱グリコシル化ＭＵＣ１及びＰＵＭと最小の反応性を有し、リンパからのＭＵ
Ｃ１、腹水及び腫瘍細胞と強い反応性を有していることにより特徴付けられた。
マブ７Ｆ11は制限希釈12回でクローン化した。
−Ｄから、ＷＧＡ−クロマトグラフィー及びスペロース６ゲル濾過により精製し
た。ＢＡＬＢ／ｃマウスに、異なった抗体フラクションで順に８回免疫処置を行
った。スプリーノサイトをＸ６３−Ａｇ８５３骨髄腫細胞に接合した後、ＭＵＣ
１特異性を有する９このハイブリドーマを同定した。クローン７Ｆ11（ｌｇＧ１
、ｋ）はＥＬＩＳＡ及び細胞学的手法を使用して選択され、通常の乳汁ＭＵＣ１
、脱グリコシル化ＭＵＣ１及びＰＵＭと最小の反応性を有し、リンパからのＭＵ
Ｃ１、腹水及び腫瘍細胞と強い反応性を有していることにより特徴付けられた。
マブ７Ｆ11は制限希釈12回でクローン化した。
【００６５】 10．クローン５Ａ６の免疫処置及び選択 ＭＵＣ１を、患者ＺＩのリンパから及びＴ４７−Ｄ細胞の分泌されたＭＵＣ１
（組織培養上澄み）から、ＷＧＡ−クロマトグラフィー及びスペロース６ゲル濾
過により精製した。両抗原フラクションは混合し、ＢＡＬＢ／ｃマウスの３回の
免疫治療用に使用した。スプリーノサイトをＸ６３−Ａｇ８５３骨髄腫細胞に接
合した（1990年２月）後、ＭＵＣ１特異性を有する24個のハイブリドーマを同定
した。クローン５Ａ６（ｌｇＧ１、ｋ）はリンパ、腹水、腫瘍細胞及び通常細胞
からの天然及び脱グリコシル化した抗原フラクションを使用するＥＬＩＳＡ及び
細胞学的手法により選択された。５Ａ６は制限希釈10回でクローン化した。
（組織培養上澄み）から、ＷＧＡ−クロマトグラフィー及びスペロース６ゲル濾
過により精製した。両抗原フラクションは混合し、ＢＡＬＢ／ｃマウスの３回の
免疫治療用に使用した。スプリーノサイトをＸ６３−Ａｇ８５３骨髄腫細胞に接
合した（1990年２月）後、ＭＵＣ１特異性を有する24個のハイブリドーマを同定
した。クローン５Ａ６（ｌｇＧ１、ｋ）はリンパ、腹水、腫瘍細胞及び通常細胞
からの天然及び脱グリコシル化した抗原フラクションを使用するＥＬＩＳＡ及び
細胞学的手法により選択された。５Ａ６は制限希釈10回でクローン化した。
【００６６】 11. ハイブリドーマのクローニング 安定な高生産能力のクローンを選択するために、フィーダー細胞として１×10 4 ＰＭを含む96のウェルプレート中に10％のＦＣＳ、50Ｕのペニシリン／ml、50
μｇのストレプトマイシン／mlを有するＤＭＥＭ中に0.5 、１、２及び５細胞ウ
ェルの密度で種を形成した。６日後に前記プレートを顕微鏡で検査して単一のハ
イブリドーマクローンを同定した。抗原被覆プレート中、ＥＩＡにより特定の抗
体生産についてテストした。各クローニングステップから６〜８個の高生産性ク
ローンが嵩高い培養地として成長し、液体窒素中に凍結した。全てのクローンは
、トランスフェリン、インシュリン、ゼレン（ベーリンガー・マンハイム・ゲー
エムベーハーの商品）及び0.5 ％ウシ血清アルブミン（ギプコ社のアルブマック
ス）（完全なＤ／Ｈ媒体）を補填した、15ｍＭのＨＥＰＥＳ、0.8 ｇのＮａＨＣ
Ｏ3 ／リットル、4.5 ｇ／リットルノグルコース、2.5 ％のＦＣＳ（ギプコ社、
原産はアメリカ合衆国）を有する、抗生物質のないＤＭＥＭ／栄養剤ミックスＦ
12（ギプコ社）中で最終的に成長させた。Ｄ／Ｈ媒体中の２Ｅ11、１Ｅ４：７Ｆ
11及び５Ａ６のｌｇ生産は静止培養地で15〜25μｇ／mlの範囲であった。
μｇのストレプトマイシン／mlを有するＤＭＥＭ中に0.5 、１、２及び５細胞ウ
ェルの密度で種を形成した。６日後に前記プレートを顕微鏡で検査して単一のハ
イブリドーマクローンを同定した。抗原被覆プレート中、ＥＩＡにより特定の抗
体生産についてテストした。各クローニングステップから６〜８個の高生産性ク
ローンが嵩高い培養地として成長し、液体窒素中に凍結した。全てのクローンは
、トランスフェリン、インシュリン、ゼレン（ベーリンガー・マンハイム・ゲー
エムベーハーの商品）及び0.5 ％ウシ血清アルブミン（ギプコ社のアルブマック
ス）（完全なＤ／Ｈ媒体）を補填した、15ｍＭのＨＥＰＥＳ、0.8 ｇのＮａＨＣ
Ｏ3 ／リットル、4.5 ｇ／リットルノグルコース、2.5 ％のＦＣＳ（ギプコ社、
原産はアメリカ合衆国）を有する、抗生物質のないＤＭＥＭ／栄養剤ミックスＦ
12（ギプコ社）中で最終的に成長させた。Ｄ／Ｈ媒体中の２Ｅ11、１Ｅ４：７Ｆ
11及び５Ａ６のｌｇ生産は静止培養地で15〜25μｇ／mlの範囲であった。
【００６７】 12．抗体の生産 中空繊維を有するタイプ3570のバイオリアクター（70ｋＤａ膜）を使用して、
抗体をセルファームル・ユニット（ドイツのヘラウスのウニジン社）中で生産し
た。２×109 個のハイブリドーマ細胞が2.5 ％のＦＣＳを有する完全なＤ／Ｈ媒
体中で接種した。リンパは３週間で１％まで減少した。生産の間、ハイブリドー
マは媒体供給速度４リットル／日で成長した。毎日100 〜200 mlの上澄みを採取
し、ｌｇ含有量を分析し、膜ろ過で清澄化し、−20℃で貯蔵した。２から３カ月
の生産サイクルの間にｌｇ合成率に低下はなかった。
抗体をセルファームル・ユニット（ドイツのヘラウスのウニジン社）中で生産し
た。２×109 個のハイブリドーマ細胞が2.5 ％のＦＣＳを有する完全なＤ／Ｈ媒
体中で接種した。リンパは３週間で１％まで減少した。生産の間、ハイブリドー
マは媒体供給速度４リットル／日で成長した。毎日100 〜200 mlの上澄みを採取
し、ｌｇ含有量を分析し、膜ろ過で清澄化し、−20℃で貯蔵した。２から３カ月
の生産サイクルの間にｌｇ合成率に低下はなかった。
【００６８】 13．抗体の精製 マブは「プロテインＡ−セファロース４−ファースト−フロー（ファーマシア
社）により精製した。バイオリアクターの上澄みは、ｐＨ8.9 の同量の結合緩衝
液（ビオラド社のＭＡＰＳ）と混合し、250 mgのマウスｌｇを含むバッチを１ml
／時の流速で20mlの蛋白質Ａゲルに加えた（ファーマシア社のＦＰＬＣシステム
）。ｌＧをｐＨ3.9 の0.1 Ｍのクエン酸緩衝液で溶出し、ｐＨ9.0 の２ＭのＨＥ
ＰＥＳで中和し、ＰＢＳ又はｐＨ8.4 の0.1 ＭのＮａＨＣＯ3 のいずれかに対し
て透析した。スーパーデックス200 （ファーマシア社）にぱるゲル濾過、及び15
％のアクリルアミドゲル（ビオラド社のレディゲル）及び銀着色（ビオラド社）
を使用するＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、純度を分析した。単クローン抗体が膜濾過
で無菌化され１、２及び５mg／mlの濃度で−20℃にのいて貯蔵された。
社）により精製した。バイオリアクターの上澄みは、ｐＨ8.9 の同量の結合緩衝
液（ビオラド社のＭＡＰＳ）と混合し、250 mgのマウスｌｇを含むバッチを１ml
／時の流速で20mlの蛋白質Ａゲルに加えた（ファーマシア社のＦＰＬＣシステム
）。ｌＧをｐＨ3.9 の0.1 Ｍのクエン酸緩衝液で溶出し、ｐＨ9.0 の２ＭのＨＥ
ＰＥＳで中和し、ＰＢＳ又はｐＨ8.4 の0.1 ＭのＮａＨＣＯ3 のいずれかに対し
て透析した。スーパーデックス200 （ファーマシア社）にぱるゲル濾過、及び15
％のアクリルアミドゲル（ビオラド社のレディゲル）及び銀着色（ビオラド社）
を使用するＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、純度を分析した。単クローン抗体が膜濾過
で無菌化され１、２及び５mg／mlの濃度で−20℃にのいて貯蔵された。
【００６９】 14．マブのラベリング 細胞学的手法、組織学的手法及びＥＩＡのために、抗体をビオチン（長腕ＮＨ
Ｓ−ビオチン、アメリカ合衆国バーリンゲームのベクトル社）及びバーオキシダ
ーゼ（ドイツのベーリンガー・マンハイム・ゲーエムベーハー）を使用し生産者
の指示に従ってラベルした（５mg、0.1 ＭのＮａＨＣＯ3 中、ｐＨ8.4 ）。ＦＡ
ＣＳ分析用のＦＩＴＣ、ＰＥ（影付き）及びＰＥＣｙ５によるマブのラベリング
をシムバス（ドイツのハンブルクのディアノバ社）により行った。
Ｓ−ビオチン、アメリカ合衆国バーリンゲームのベクトル社）及びバーオキシダ
ーゼ（ドイツのベーリンガー・マンハイム・ゲーエムベーハー）を使用し生産者
の指示に従ってラベルした（５mg、0.1 ＭのＮａＨＣＯ3 中、ｐＨ8.4 ）。ＦＡ
ＣＳ分析用のＦＩＴＣ、ＰＥ（影付き）及びＰＥＣｙ５によるマブのラベリング
をシムバス（ドイツのハンブルクのディアノバ社）により行った。
【００７０】 15．２サイト酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）によるＭＵＣ１の定量化 最大吸着免疫プレート（Ｎｕｎｃ）を、燐酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ7.6 ）
を使用して、ムチン−グリコン特異的マブ７Ｆ11（500 ng／ウェル）により37℃
で１時間で被覆した。プレートはＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ及び１％のウシ血清ア
ルブミン（ＢＳＡ）で１時間ブロックし、緩衝水（ＷＢ、150 ｍＭの塩化ナトリ
ウム、ｐ7.6 の50ｍＭのトリス、及び0.05％のトゥウィーン20）で３回洗浄した
。テストサンプル及び標準抗体（100 yl) を、37℃で１時間、ＰＢＳ、0.5 ％の
ＢＳＡ、0.5 ％のトリトンＸ100 （ＡＤ、抗体希釈剤）中に適切な希釈率で加え
た。プレートをＷＢで４回洗浄し、パーオキシダーゼ（２Ｅ11−ＰＯ、ＡＤ中、
２mg／ml、１：40000 、30分、37℃）でラベルしたペプチド（ＡＰＤＴＲ）特異
的なマブ２Ｅ11を使用してＭＵＣ１を決定した。100 μｇの基質ＢＭ−ブルー（
ベーリンガー社）を37℃で30分間で加えた。標準抗原（ＢＭＡ、胸部ムチン抗原
）は胸部癌ラインＫＳ及びＴ４７−Ｄから精製された免疫親和性がある物質であ
った。
を使用して、ムチン−グリコン特異的マブ７Ｆ11（500 ng／ウェル）により37℃
で１時間で被覆した。プレートはＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ及び１％のウシ血清ア
ルブミン（ＢＳＡ）で１時間ブロックし、緩衝水（ＷＢ、150 ｍＭの塩化ナトリ
ウム、ｐ7.6 の50ｍＭのトリス、及び0.05％のトゥウィーン20）で３回洗浄した
。テストサンプル及び標準抗体（100 yl) を、37℃で１時間、ＰＢＳ、0.5 ％の
ＢＳＡ、0.5 ％のトリトンＸ100 （ＡＤ、抗体希釈剤）中に適切な希釈率で加え
た。プレートをＷＢで４回洗浄し、パーオキシダーゼ（２Ｅ11−ＰＯ、ＡＤ中、
２mg／ml、１：40000 、30分、37℃）でラベルしたペプチド（ＡＰＤＴＲ）特異
的なマブ２Ｅ11を使用してＭＵＣ１を決定した。100 μｇの基質ＢＭ−ブルー（
ベーリンガー社）を37℃で30分間で加えた。標準抗原（ＢＭＡ、胸部ムチン抗原
）は胸部癌ラインＫＳ及びＴ４７−Ｄから精製された免疫親和性がある物質であ
った。
【００７１】 16．合成ＭＵＣ１−ＶＮＴＲペプチド ＭＵＣ１タンデムリピート構造の合成ペプチドを、固体ペプチド合成体（ハン
ブルク／ザール大学のナスタインジク博士）上で合成し、ｐＨ9.4 の0.1 Ｍ炭酸
塩緩衝液を使用し、100 ng／ウェルの濃度のＥＩＡプレート（ヌンクのマキシソ
ーブ）に被覆した。 ペプチドＭ20（ＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰＡＨＧＶＴＳ） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１ Ｐ24（ＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰＡＨＧＶＴＳＰＤＲＴ） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２， Ｍ５−１５（ＰＡＰＧＳＴＡＰＰＡ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、及び Ｍ６−１７（ＡＰＧＳＴＡＰＰＡＨＧ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４をエピトープ
分析のために使用した。
ブルク／ザール大学のナスタインジク博士）上で合成し、ｐＨ9.4 の0.1 Ｍ炭酸
塩緩衝液を使用し、100 ng／ウェルの濃度のＥＩＡプレート（ヌンクのマキシソ
ーブ）に被覆した。 ペプチドＭ20（ＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰＡＨＧＶＴＳ） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１ Ｐ24（ＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰＡＨＧＶＴＳＰＤＲＴ） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２， Ｍ５−１５（ＰＡＰＧＳＴＡＰＰＡ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、及び Ｍ６−１７（ＡＰＧＳＴＡＰＰＡＨＧ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４をエピトープ
分析のために使用した。
【００７２】 17．フローサイトメトリー及び競争的ＥＬＩＳＡによるエピトープの特性化 ＫＳ及びＴ47−Ｄ細胞（胸部癌種、ＭＵＣ１ポジティブ）、ＬＳ１７４Ｔ（結
腸癌種、ＭＵＣ１ネガティブ）への結合を、天然、又は直接ＦＩＴＣ、ＰＥ（影
付き）又はＰＥ−Ｃｙ５に接合した７Ｆ11及び１Ｅ４でメタノール固定細胞でラ
ベルした後、フローサイトメトリーで分析した。エピトープの特性化のために、
本発明の抗体を、市販の抗ＭＵＣ１抗体であるＨＭＦＧ１、ＨＭＦＧ２、Ｍａ５
５２、Ｍａ６９５、ｂ１２、ＤＦ３、１１５Ｄ８、ＢＣ２、ＢＣ３、ＳＭ３、Ｖ
Ｕ１１Ｅ２、ＶＵ１２Ｅ１、ＫＣ４及びＭＦ０６と競争させた。
腸癌種、ＭＵＣ１ネガティブ）への結合を、天然、又は直接ＦＩＴＣ、ＰＥ（影
付き）又はＰＥ−Ｃｙ５に接合した７Ｆ11及び１Ｅ４でメタノール固定細胞でラ
ベルした後、フローサイトメトリーで分析した。エピトープの特性化のために、
本発明の抗体を、市販の抗ＭＵＣ１抗体であるＨＭＦＧ１、ＨＭＦＧ２、Ｍａ５
５２、Ｍａ６９５、ｂ１２、ＤＦ３、１１５Ｄ８、ＢＣ２、ＢＣ３、ＳＭ３、Ｖ
Ｕ１１Ｅ２、ＶＵ１２Ｅ１、ＫＣ４及びＭＦ０６と競争させた。
【００７３】 本発明の抗ＭＵＣ１抗体により同定されるエピトープに関する一般的な情報は
、異なった抗原のソースを使用するＥＬＩＳＡにより得られた。胸部及び卵巣癌
患者の腹水、胸部癌患者からのリンパ、ヒト乳汁、ヒトの尿、ＫＳ、Ｔ４７−Ｄ
及びＬＳ１７４Ｔからの細胞質ゾルは、4.1.2 及び4.1.3 により精製された。最
大吸着免疫プレート（ヌンク）をｐＨ9.6 の炭酸塩緩衝液中、室温で18時間、ウ
ェル当たり0.1 μｇの抗原で被覆した。ＰＢＳで洗浄した後、特定されない結合
をＰＢＳ及び１％のＢＳＡで培養することによりブロックした。本発明の抗体を
、５、10及び20ng／ウェルの濃度のビオチン化試薬として使用した。競争反応の
ため、ラベルしていない抗ＭＵＣ１抗体を１〜100 ng／ウェルの濃度領域で添加
した。プレートを37℃で２時間培養した。洗浄後、ストレパビディン・パーオキ
シダーゼ（1.20000 、ドイツのハンブルクのディアノバ社）を20分間室温で添加
した。洗浄後、ＢＭブルーＰＯＤ（ドイツのベーリンガー−マンハイム社）基質
を有するＯＤを20分の培養後に450 nmで決定した。
、異なった抗原のソースを使用するＥＬＩＳＡにより得られた。胸部及び卵巣癌
患者の腹水、胸部癌患者からのリンパ、ヒト乳汁、ヒトの尿、ＫＳ、Ｔ４７−Ｄ
及びＬＳ１７４Ｔからの細胞質ゾルは、4.1.2 及び4.1.3 により精製された。最
大吸着免疫プレート（ヌンク）をｐＨ9.6 の炭酸塩緩衝液中、室温で18時間、ウ
ェル当たり0.1 μｇの抗原で被覆した。ＰＢＳで洗浄した後、特定されない結合
をＰＢＳ及び１％のＢＳＡで培養することによりブロックした。本発明の抗体を
、５、10及び20ng／ウェルの濃度のビオチン化試薬として使用した。競争反応の
ため、ラベルしていない抗ＭＵＣ１抗体を１〜100 ng／ウェルの濃度領域で添加
した。プレートを37℃で２時間培養した。洗浄後、ストレパビディン・パーオキ
シダーゼ（1.20000 、ドイツのハンブルクのディアノバ社）を20分間室温で添加
した。洗浄後、ＢＭブルーＰＯＤ（ドイツのベーリンガー−マンハイム社）基質
を有するＯＤを20分の培養後に450 nmで決定した。
【００７４】結果 １．１Ｅ４及び７Ｆ11のエピトープ特異性 １Ｅ４及び７Ｆ11のエピトープ特異性を、異なった通常の及び腫瘍ソースから
単離したＭＵＣ１フラクションの大きなパネル上で分析した（表２）。免疫優越
性のＭＵＣ１ペプチドエピトープＦＤＴＲ（ＨＭＦＧ１、ＨＭＦＧ２、ｂ１２、
ＤＦ３）に特異性を有する２Ｅ11及び他の良好に特性化されたマブとは対照的に
、マブ１Ｅ４及び７Ｆ11はＰＤＴＲシーケンスを含むいくつかのオーバーラップ
するペプチドに完全にネガティブである。該抗体は通常のヒトの尿（ＰＵＭ）及
びヒト乳汁からの糖蛋白とは反応しない。両抗体のエピトープは、マイルドな蛋
白質分解処理（トリプシン）及びノイラミニダーゼによる過度の脱グリコシル化
に対する感度が低いが、精製されたＭＵＣ１をノイラミニダーゼ及びＯ−グリカ
ナーゼで処理することにより、抗体の反応性は完全に消滅する。ＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動及びウェスタン免疫ブロッティングにより分離される
ＭＵＣ１の分析は、高（400 〜440 ｋＤａ）及び低（180 、200 〜220 ｋＤａ）
分子量フラクションを有する両マブの反応性を示している。更に、１Ｅ４及び７
Ｆ11は、進行した疾患の胸部癌患者のリンパ及び腹水からの未精製ＭＵＣ１とは
完全に異なった着色プロフィールを示した。一般に180 〜440 ｋＤａの分子量領
域では抗原との幅広い反応性がある。これらのデータは、１Ｅ４及び７Ｆ11は、
癌種中に過度に発現し及び分泌され、通常（上皮）細胞のＭＵＣ１中には存在し
ないか偶然でのみ発現するアンダーグリコシル化ＭＵＣ１フラクション中に存在
するエピトープと反応することを示唆している。両マブは、リンパ、腹水及び胸
膜浸出液中に分泌される抗原と強い反応性を有することにより特徴付けられる。
単離したＭＵＣ１フラクションの大きなパネル上で分析した（表２）。免疫優越
性のＭＵＣ１ペプチドエピトープＦＤＴＲ（ＨＭＦＧ１、ＨＭＦＧ２、ｂ１２、
ＤＦ３）に特異性を有する２Ｅ11及び他の良好に特性化されたマブとは対照的に
、マブ１Ｅ４及び７Ｆ11はＰＤＴＲシーケンスを含むいくつかのオーバーラップ
するペプチドに完全にネガティブである。該抗体は通常のヒトの尿（ＰＵＭ）及
びヒト乳汁からの糖蛋白とは反応しない。両抗体のエピトープは、マイルドな蛋
白質分解処理（トリプシン）及びノイラミニダーゼによる過度の脱グリコシル化
に対する感度が低いが、精製されたＭＵＣ１をノイラミニダーゼ及びＯ−グリカ
ナーゼで処理することにより、抗体の反応性は完全に消滅する。ＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動及びウェスタン免疫ブロッティングにより分離される
ＭＵＣ１の分析は、高（400 〜440 ｋＤａ）及び低（180 、200 〜220 ｋＤａ）
分子量フラクションを有する両マブの反応性を示している。更に、１Ｅ４及び７
Ｆ11は、進行した疾患の胸部癌患者のリンパ及び腹水からの未精製ＭＵＣ１とは
完全に異なった着色プロフィールを示した。一般に180 〜440 ｋＤａの分子量領
域では抗原との幅広い反応性がある。これらのデータは、１Ｅ４及び７Ｆ11は、
癌種中に過度に発現し及び分泌され、通常（上皮）細胞のＭＵＣ１中には存在し
ないか偶然でのみ発現するアンダーグリコシル化ＭＵＣ１フラクション中に存在
するエピトープと反応することを示唆している。両マブは、リンパ、腹水及び胸
膜浸出液中に分泌される抗原と強い反応性を有することにより特徴付けられる。
【００７５】 ２．マブ２Ｅ11、１Ｅ４、７Ｆ11及び５Ａ６の比較上の組織学的分析 2.1 通常組織 抗体１Ａ６及び１Ｅ11に加えて、ＭＵＣ１特異的マブ７Ｆ11及び１Ｅ４も、通
常組織及び異なった器官の癌種の大きなパネル上で特異性のためにスクリーニン
グを行った。人間、又は自動化した免疫着色装置（ダコ・テクメート）のいずれ
かにより、ビオチン化されたマブ（0.5 μｇ／ml）及び新規なフクシンを気質と
して有するストレパビディン−アルカリ性のパーオキシダーゼで着色が行われた
。
常組織及び異なった器官の癌種の大きなパネル上で特異性のためにスクリーニン
グを行った。人間、又は自動化した免疫着色装置（ダコ・テクメート）のいずれ
かにより、ビオチン化されたマブ（0.5 μｇ／ml）及び新規なフクシンを気質と
して有するストレパビディン−アルカリ性のパーオキシダーゼで着色が行われた
。
【００７６】 表３から分かるように、通常の細胞及び皮膚の組織、辺縁血、結合及び脂肪組
織、平滑及び横紋筋、血管、軟骨、骨、心臓、肝臓、舌、脾臓、腎臓及び脳は全
ての場合に全ての抗体に対しネガティブである。胸部（アシーニ、管）、結腸（
エンテロシット）、子宮内膜、脾臓（アシーニ、管）、前立腺、胎盤、胃（壁細
胞）、腎臓（遠位の管、集合管）及び肺（繊毛上皮）では、分泌細胞の頂きの境
界で及び分泌された生成物中でＭＵＣ１はペプチド特異性のマブ２Ｅ11とともに
検出される。ＰＤＴＲペプチド特異性の殆ど全てのマブ（ＨＭＦＧ１、ＨＭＦＧ
２、１１５Ｄ８、ＤＦ３、Ｆ３６／２２、Ｍ２６、ｂ１２、概説は、Ｍ．Ｒ．プ
ライスらのＩＳＯＢＭ ＴＤ−４研究集会の総括リポート、「ＭＵＣ１ムチンに
対する56の単クローン抗体の分析」、Tumor Biol. 19, suppl. 1(1998) 1-20 ）
は、この着色パターンにより特徴付けられる。ＭＵＣ１発現も、赤芽細胞及び骨
髄のプラズマ細胞の小さいフラクション中でマブ２Ｅ11について証明された。 これとは対照的に、７Ｆ11及び１Ｅ４では通常の上皮細胞とはより限定された
反応性を示した。通常の胸部では、７Ｆ11は、個々の場合に不均一着色の４から
12の場合にアシーニ及び管とポジティブであった。１Ｅ４はアシーニ、単一上皮
細胞及び分泌生成物と偶然にのみ反応した。結腸、子宮内膜、肺、脾臓及び胎盤
では、７Ｆ11は上皮細胞の頂きの膜と弱く反応するのみで、他方１Ｅ４は完全に
ネガティブであった。２Ｅ11及び７Ｆ11と首尾一貫して強い反応性を有する器官
は腎臓のみで、１Ｅ４は３種の場合に管状の膜について弱くポジティブであった
。
織、平滑及び横紋筋、血管、軟骨、骨、心臓、肝臓、舌、脾臓、腎臓及び脳は全
ての場合に全ての抗体に対しネガティブである。胸部（アシーニ、管）、結腸（
エンテロシット）、子宮内膜、脾臓（アシーニ、管）、前立腺、胎盤、胃（壁細
胞）、腎臓（遠位の管、集合管）及び肺（繊毛上皮）では、分泌細胞の頂きの境
界で及び分泌された生成物中でＭＵＣ１はペプチド特異性のマブ２Ｅ11とともに
検出される。ＰＤＴＲペプチド特異性の殆ど全てのマブ（ＨＭＦＧ１、ＨＭＦＧ
２、１１５Ｄ８、ＤＦ３、Ｆ３６／２２、Ｍ２６、ｂ１２、概説は、Ｍ．Ｒ．プ
ライスらのＩＳＯＢＭ ＴＤ−４研究集会の総括リポート、「ＭＵＣ１ムチンに
対する56の単クローン抗体の分析」、Tumor Biol. 19, suppl. 1(1998) 1-20 ）
は、この着色パターンにより特徴付けられる。ＭＵＣ１発現も、赤芽細胞及び骨
髄のプラズマ細胞の小さいフラクション中でマブ２Ｅ11について証明された。 これとは対照的に、７Ｆ11及び１Ｅ４では通常の上皮細胞とはより限定された
反応性を示した。通常の胸部では、７Ｆ11は、個々の場合に不均一着色の４から
12の場合にアシーニ及び管とポジティブであった。１Ｅ４はアシーニ、単一上皮
細胞及び分泌生成物と偶然にのみ反応した。結腸、子宮内膜、肺、脾臓及び胎盤
では、７Ｆ11は上皮細胞の頂きの膜と弱く反応するのみで、他方１Ｅ４は完全に
ネガティブであった。２Ｅ11及び７Ｆ11と首尾一貫して強い反応性を有する器官
は腎臓のみで、１Ｅ４は３種の場合に管状の膜について弱くポジティブであった
。
【００７７】2.2 腫瘍組織 マブ２Ｅ11、５Ａ６、１Ｅ４及び７Ｆ11の腫瘍反応性を表４に示す。ホルマリ
ンで固定され、パラフィンが埋設された組織へのルーティン的な免疫組織学的着
色は、２Ｅ11及び７Ｆ11は初期胸部癌種と96％を越える反応性を有し、他方１Ｅ
４は初期胸部癌種と90％を越える反応性を有することを示している。胸部及び他
の種々の癌種を有するＭＵＣ１−ペプチド特異的なマブ（２Ｅ11、ＨＭＦＧ１）
の均一な着色パターンと対照的に、マブ７Ｆ11、１Ｅ４及び５Ｆ２は個々の組織
でのより不均一な着色パターンにより特徴付けられる。典型的には50％の場合に
、同じ腫瘍中でそれぞれのエピトープの比較的弱い発現エリアと非常に強い発現
エリアが存在する。約40％の１Ｅ４ポジティブな腫瘍は、ゴルジ錯体の中心の細
胞質の着色を示し、他方強い反応性は小さい腫瘍エリア、単一の細胞及び分泌生
成物のみで見られる。
ンで固定され、パラフィンが埋設された組織へのルーティン的な免疫組織学的着
色は、２Ｅ11及び７Ｆ11は初期胸部癌種と96％を越える反応性を有し、他方１Ｅ
４は初期胸部癌種と90％を越える反応性を有することを示している。胸部及び他
の種々の癌種を有するＭＵＣ１−ペプチド特異的なマブ（２Ｅ11、ＨＭＦＧ１）
の均一な着色パターンと対照的に、マブ７Ｆ11、１Ｅ４及び５Ｆ２は個々の組織
でのより不均一な着色パターンにより特徴付けられる。典型的には50％の場合に
、同じ腫瘍中でそれぞれのエピトープの比較的弱い発現エリアと非常に強い発現
エリアが存在する。約40％の１Ｅ４ポジティブな腫瘍は、ゴルジ錯体の中心の細
胞質の着色を示し、他方強い反応性は小さい腫瘍エリア、単一の細胞及び分泌生
成物のみで見られる。
【００７８】2.3 骨髄中のミクロ転移腫瘍細胞の分析 骨髄中のミクロ転移腫瘍細胞の比較分析が、ＡＰＡＡＰ技術（ダコ・テクメー
ト）により２Ｅ11、７Ｆ11及び１Ｅ４（0.5 μｇ／ml）を使用してホルマリン／
メタノールで固定された細胞スピン（１×106 細胞／スライド）で行われた。画
像発見分析（ベクトン・ディキソン）によりすふべてのスライドを評価した。腫
瘍細胞分析用のコントロール抗体は、ＣＡＭ5.2 （シトケラチン8/18）及び５Ｄ
３（シトケラチン8/18/19 ）であった。２Ｅ11、１Ｅ４及び７Ｆ11は腫瘍細胞の
強いラベリングを示した。２Ｅ11の適用は、赤芽細胞及びプラズマ細胞との大き
な交差反応性により妨害され、７Ｆ11は赤芽細胞とさほど強くない反応性のみを
有し、１Ｅ４は、通常の骨髄細胞（ｎ＝12）及び通常の辺縁血のリンパ球（ｎ＝
48）との交差反応性を示さず、他に血液の疾患を有する非腫瘍性の42人の患者が
いた。マブ７Ｆ11及び１Ｅ４による標準的な細胞の感度は106 個の骨髄細胞又は
ＰＢＬ中に１個の腫瘍細胞の領域であった。初期胸部癌の416 人の患者の骨髄中
のミクロ転移腫瘍細胞の比較分析が表５に示されている。２個の細胞スピン（２
×106 ＢＭ細胞）が各々のマブで着色された。画像分析によるスライドの評価は
、ミクロ転移細胞の検出及び定量用として、ムチン特異的な７Ｆ11、１Ｅ４、及
びシトケラチン特異的な５Ｄ３を比較できる感度と特異性を示した。 両ムチン特異的なマブは、免疫細胞学式手法、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメト
リー、免疫磁気学的に腫瘍細胞を富化することによる希な細胞の検出の改良のた
めの、及び辺縁血のステム細胞中の希な腫瘍細胞を効果的に清澄化する開発のた
めの新規な見通しを提供する。
ト）により２Ｅ11、７Ｆ11及び１Ｅ４（0.5 μｇ／ml）を使用してホルマリン／
メタノールで固定された細胞スピン（１×106 細胞／スライド）で行われた。画
像発見分析（ベクトン・ディキソン）によりすふべてのスライドを評価した。腫
瘍細胞分析用のコントロール抗体は、ＣＡＭ5.2 （シトケラチン8/18）及び５Ｄ
３（シトケラチン8/18/19 ）であった。２Ｅ11、１Ｅ４及び７Ｆ11は腫瘍細胞の
強いラベリングを示した。２Ｅ11の適用は、赤芽細胞及びプラズマ細胞との大き
な交差反応性により妨害され、７Ｆ11は赤芽細胞とさほど強くない反応性のみを
有し、１Ｅ４は、通常の骨髄細胞（ｎ＝12）及び通常の辺縁血のリンパ球（ｎ＝
48）との交差反応性を示さず、他に血液の疾患を有する非腫瘍性の42人の患者が
いた。マブ７Ｆ11及び１Ｅ４による標準的な細胞の感度は106 個の骨髄細胞又は
ＰＢＬ中に１個の腫瘍細胞の領域であった。初期胸部癌の416 人の患者の骨髄中
のミクロ転移腫瘍細胞の比較分析が表５に示されている。２個の細胞スピン（２
×106 ＢＭ細胞）が各々のマブで着色された。画像分析によるスライドの評価は
、ミクロ転移細胞の検出及び定量用として、ムチン特異的な７Ｆ11、１Ｅ４、及
びシトケラチン特異的な５Ｄ３を比較できる感度と特異性を示した。 両ムチン特異的なマブは、免疫細胞学式手法、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメト
リー、免疫磁気学的に腫瘍細胞を富化することによる希な細胞の検出の改良のた
めの、及び辺縁血のステム細胞中の希な腫瘍細胞を効果的に清澄化する開発のた
めの新規な見通しを提供する。
【００７９】
【表２】
【００８０】
【表３】
【００８１】
【表４】
【００８２】
【表５】
【００８３】実施例２ 最小の残留疾患を有する胸部癌患者の免疫治療の臨床研究 患者 標準的な治療の後の最小の残留疾患を有する胸部癌患者（表６）を含めた。49
人の患者には臨床的転移（ＭＯ）の証拠はなかった。患者に含めた基準は、初期
診断又は／及び標準的な補助薬治療後に、骨髄に腫瘍細胞の汚染が証明されたこ
とであった。
人の患者には臨床的転移（ＭＯ）の証拠はなかった。患者に含めた基準は、初期
診断又は／及び標準的な補助薬治療後に、骨髄に腫瘍細胞の汚染が証明されたこ
とであった。
【００８４】 臨床的プロトコール インフォームド・コンセントの後、患者は婦人科で処置され、医学的な監視の
下に置かれた（50mgと20mgの処置グループ）。予備処置は、２mgのクレマスチン
ハイドロジェンフマラト（タベギル）の点滴及び500 mgのカルシウムの経口投与
とした。次いで患者は、等張力のＮａＣｌに希釈された50mgの７Ｆ11（１mg／ml
）を８時間掛けて投与された。20mgの投与分は500 mlのＮａＣｌに希釈され４時
間掛けて点滴された。これらの患者は１時間後に病院を後にすることができた。
2.5 mgの患者は予備的な薬物治療を受けず、250 mlのＮａＣｌ中の抗体を１時間
掛けて点滴で投与され、１時間後に病院を後にすることができた。
下に置かれた（50mgと20mgの処置グループ）。予備処置は、２mgのクレマスチン
ハイドロジェンフマラト（タベギル）の点滴及び500 mgのカルシウムの経口投与
とした。次いで患者は、等張力のＮａＣｌに希釈された50mgの７Ｆ11（１mg／ml
）を８時間掛けて投与された。20mgの投与分は500 mlのＮａＣｌに希釈され４時
間掛けて点滴された。これらの患者は１時間後に病院を後にすることができた。
2.5 mgの患者は予備的な薬物治療を受けず、250 mlのＮａＣｌ中の抗体を１時間
掛けて点滴で投与され、１時間後に病院を後にすることができた。
【００８５】 処置に先立って、静脈血のサンプルを集め、a)免疫状態、腫瘍マーカー（ＣＡ
１５３ ＣＥＡ ＢＭ２７）、ＨＡＭＡ及び抗７Ｆ11のための分析を行った。選
択された患者中で７Ｆ11の薬剤動力学を、薬剤投与の４、12、48及び72時間後に
リンパ中で分析した。点滴の間、血圧を１時間ごとに測定した。 静脈血のサンプルを、ＨＡＭＡ、ａｂ２ ａｂ２β及びａｂ３用の各免疫処置
の２及び４週間後に分析した。 辺縁血からの単核細胞を免疫処置に先立って調製し、その時点は重要なａｂ２
滴定量が減少し、増強免疫処置の前、及び７日後であった。細胞は、将来の表現
型実現、Ｂ−細胞及びＴ−細胞培養及びＦＡＣＳ分析のために液体窒素中で凍結
させた。
１５３ ＣＥＡ ＢＭ２７）、ＨＡＭＡ及び抗７Ｆ11のための分析を行った。選
択された患者中で７Ｆ11の薬剤動力学を、薬剤投与の４、12、48及び72時間後に
リンパ中で分析した。点滴の間、血圧を１時間ごとに測定した。 静脈血のサンプルを、ＨＡＭＡ、ａｂ２ ａｂ２β及びａｂ３用の各免疫処置
の２及び４週間後に分析した。 辺縁血からの単核細胞を免疫処置に先立って調製し、その時点は重要なａｂ２
滴定量が減少し、増強免疫処置の前、及び７日後であった。細胞は、将来の表現
型実現、Ｂ−細胞及びＴ−細胞培養及びＦＡＣＳ分析のために液体窒素中で凍結
させた。
【００８６】 骨髄中のミクロ転移腫瘍細胞の検出 骨髄のサンプルをフィコール密度遠心分離で分離し、単核細胞をスライド当た
り１×106 個の骨髄細胞を有するような細胞スピンスライドを調製するために使
用した。細胞を空気乾燥し、3.5 ％の中性緩衝ホルマリンで15分間固定し、ＰＢ
Ｓで洗浄し、次いで更に５分間、冷却した（−20℃）100 ％メタノールで固定し
た。スライドをＰＢＳで洗浄し、貯蔵用緩衝液（60ｇ／リットルのサッカロース
を含むＰＢＳ、0.4 ｇ／リットルの塩化マグネシウム、43％のグリセリン）に移
し、−20℃で貯蔵した。ビオチン化された７Ｆ11（0.5 μｇ／ml）、５Ｄ３−ビ
オチン（ノボカストラ、１：100 ）及びＭＯＣ31（ビオジェネックスの抗上皮特
異性抗原、１：300 ）を使用する免疫細胞学的手法により、アルカリ性のホスフ
ァターゼ（20％の酢酸で10分、2.3 ％のＮａＪＯ4 で10分）及び通常のリンパ（
ビオチン化された初期の抗体用の５％の通常のマウスリンパ、ＡＰＡＡＰ技術の
ための５％のヒトリンパ）をブロックするステップの後、上皮腫瘍細胞を着色し
た。ステレプタビディン−アルカリ性ホスファターゼ、ヤギ抗マウスｌｇＧアル
カリ性ホスファターゼＦ（ａｂ）2 （クルター、１：250 ）又はＡＰＡＡＰシス
テム（ダコ）のいずれか、及び新規なフクチンを基質として有するダコ・テクノ
メート500 免疫着色剤を使用して、スライドを処理した。腫瘍細胞は、画像発見
分析システム（ベクトン・ディキンソン）により評価しかつ定量した。７Ｆ11で
免疫した患者の腫瘍細胞は、Ｂ−細胞及びアイソトープ（マウスｌｇＧ１及び７
Ｆ11）特異性を有するプラズマ細胞を排除するために、ベクター・レッド（ビオ
チン化された初期抗体）及びベクター・ブルー（ＡＰＡＡＰ技術）（アメリカ合
衆国のバーリンゲームのベクター）を有するアルカリ性ホスファターゼキットを
使用する付加的な二重着色技術によりコントロールした。
り１×106 個の骨髄細胞を有するような細胞スピンスライドを調製するために使
用した。細胞を空気乾燥し、3.5 ％の中性緩衝ホルマリンで15分間固定し、ＰＢ
Ｓで洗浄し、次いで更に５分間、冷却した（−20℃）100 ％メタノールで固定し
た。スライドをＰＢＳで洗浄し、貯蔵用緩衝液（60ｇ／リットルのサッカロース
を含むＰＢＳ、0.4 ｇ／リットルの塩化マグネシウム、43％のグリセリン）に移
し、−20℃で貯蔵した。ビオチン化された７Ｆ11（0.5 μｇ／ml）、５Ｄ３−ビ
オチン（ノボカストラ、１：100 ）及びＭＯＣ31（ビオジェネックスの抗上皮特
異性抗原、１：300 ）を使用する免疫細胞学的手法により、アルカリ性のホスフ
ァターゼ（20％の酢酸で10分、2.3 ％のＮａＪＯ4 で10分）及び通常のリンパ（
ビオチン化された初期の抗体用の５％の通常のマウスリンパ、ＡＰＡＡＰ技術の
ための５％のヒトリンパ）をブロックするステップの後、上皮腫瘍細胞を着色し
た。ステレプタビディン−アルカリ性ホスファターゼ、ヤギ抗マウスｌｇＧアル
カリ性ホスファターゼＦ（ａｂ）2 （クルター、１：250 ）又はＡＰＡＡＰシス
テム（ダコ）のいずれか、及び新規なフクチンを基質として有するダコ・テクノ
メート500 免疫着色剤を使用して、スライドを処理した。腫瘍細胞は、画像発見
分析システム（ベクトン・ディキンソン）により評価しかつ定量した。７Ｆ11で
免疫した患者の腫瘍細胞は、Ｂ−細胞及びアイソトープ（マウスｌｇＧ１及び７
Ｆ11）特異性を有するプラズマ細胞を排除するために、ベクター・レッド（ビオ
チン化された初期抗体）及びベクター・ブルー（ＡＰＡＡＰ技術）（アメリカ合
衆国のバーリンゲームのベクター）を有するアルカリ性ホスファターゼキットを
使用する付加的な二重着色技術によりコントロールした。
【００８７】 少なくとも６個のスライドからの結果を106 個の骨髄細胞当たりの腫瘍細胞（ ＴＣＤ）として表した 体液免疫応答の分析 ＨＡＭＡを、マウスｌｇＧで被覆したＥＬＩＳＡによりアッセイした。リンパ
を１：20から１：1000へ二重に希釈し、生産者（ドイツのハンブルクのメダック
社）の指示に従って、結合をパーオキシダーゼでラベルしたマウスｌｇＧにより
アッセイした。
を１：20から１：1000へ二重に希釈し、生産者（ドイツのハンブルクのメダック
社）の指示に従って、結合をパーオキシダーゼでラベルしたマウスｌｇＧにより
アッセイした。
【００８８】 抗−７Ｆ11抗体 患者のリンパをマウスｌｇＧ−アガラーゼに18時間掛けて吸着させ、予備吸着
されたリンパを７Ｆ11−Ｆ（ａｂ）2 フラグメントで被覆したＥＬＩＳＡプレー
トに添加した。ヒトａｂ２抗体をパーオキシダーゼでラベルした７Ｆ11で決定し
た。低ＨＡＭＡであるが高い７Ｆ11滴定量を示す患者のリンパを集めたものから
標準抗原を調製した。生産者の指示に従って、５mg／mlの濃度で、７Ｆ11をアフ
ィゲル10（ビオラッド社）に結合させた。高抗−７Ｆ11滴定量のヒトリンパをｐ
Ｈ8.9 の結合緩衝液で１：２に希釈し、0.2 ml／分の流速で７Ｆ11のゲルに加え
た。ヒト抗−７Ｆ11ｌｇをｐＨ3.0 の0.1 Ｍクエン酸緩衝液で溶出し、ＰＢＳに
対して透析し、かつ500 から2.5 ng／mlの濃度範囲で標準抗原として使用した。
ａｂ２β分析のために、ｌｇＧフラクションはマウスｌｇＧアガローゼを使用し
て親和精製した。
されたリンパを７Ｆ11−Ｆ（ａｂ）2 フラグメントで被覆したＥＬＩＳＡプレー
トに添加した。ヒトａｂ２抗体をパーオキシダーゼでラベルした７Ｆ11で決定し
た。低ＨＡＭＡであるが高い７Ｆ11滴定量を示す患者のリンパを集めたものから
標準抗原を調製した。生産者の指示に従って、５mg／mlの濃度で、７Ｆ11をアフ
ィゲル10（ビオラッド社）に結合させた。高抗−７Ｆ11滴定量のヒトリンパをｐ
Ｈ8.9 の結合緩衝液で１：２に希釈し、0.2 ml／分の流速で７Ｆ11のゲルに加え
た。ヒト抗−７Ｆ11ｌｇをｐＨ3.0 の0.1 Ｍクエン酸緩衝液で溶出し、ＰＢＳに
対して透析し、かつ500 から2.5 ng／mlの濃度範囲で標準抗原として使用した。
ａｂ２β分析のために、ｌｇＧフラクションはマウスｌｇＧアガローゼを使用し
て親和精製した。
【００８９】 ａｂ２β決定のための競争ＥＬＩＳＡ マウスｌｇＧ予備吸着したリンパを、0.1 から10μｇ／mlの濃度の７Ｆ11−Ｆ
（ａｂ）2 被覆されたミクロ滴定プレート中で培養した。競争のために、濃度領
域500 ユニット／ml中で精製したＭＵＣ１抗原で18時間培養した。ヒトａｂ２β
を、パーオキシダーゼでラベルしたヤギ抗−ヒトｌｇＧを使用して決定した。
（ａｂ）2 被覆されたミクロ滴定プレート中で培養した。競争のために、濃度領
域500 ユニット／ml中で精製したＭＵＣ１抗原で18時間培養した。ヒトａｂ２β
を、パーオキシダーゼでラベルしたヤギ抗−ヒトｌｇＧを使用して決定した。
【００９０】 ヒト抗−ＭＵＣ１の反応性 胸部癌細胞ラインＫＳ及びＴ47─ＤからＷＧＡ−セファローゼ−クロマトグラ
フィーで精製した天然のＭＵＣ１で、ＥＬＩＳＡプレートを被覆した。コントロ
ール抗原は、ＭＵＣ１天然ＳＷ1116結腸癌種細胞からの細胞質ゾルであった。Ｖ
ＮＴＲ（ｐ24）の合成ＭＵＣ１ペプチドは、１μｇ／mlの濃度で被覆した。各免
疫処置の前、及び２週間後に集めたリンパは、抗−ＭＵＣ１反応性用のスクリー
ニングを行った。リンパを、37℃で１時間、１：25の希釈で追加した。ヒトｌｇ
Ｇ及びｌｇＭは、パーオキシダーゼ（ドイツのハンブルクのディアノバ社）でラ
ベルした球特異性のヤギ抗−ヒト抗原、及び基質としてのＢＭ−ブルーで同定し
た。
フィーで精製した天然のＭＵＣ１で、ＥＬＩＳＡプレートを被覆した。コントロ
ール抗原は、ＭＵＣ１天然ＳＷ1116結腸癌種細胞からの細胞質ゾルであった。Ｖ
ＮＴＲ（ｐ24）の合成ＭＵＣ１ペプチドは、１μｇ／mlの濃度で被覆した。各免
疫処置の前、及び２週間後に集めたリンパは、抗−ＭＵＣ１反応性用のスクリー
ニングを行った。リンパを、37℃で１時間、１：25の希釈で追加した。ヒトｌｇ
Ｇ及びｌｇＭは、パーオキシダーゼ（ドイツのハンブルクのディアノバ社）でラ
ベルした球特異性のヤギ抗−ヒト抗原、及び基質としてのＢＭ−ブルーで同定し
た。
【００９１】 免疫表現型 治療の間のリンパ球の活性化は、４色フローサイトメトリー（クルター・エピ
ックス社）によるＣＤマーカーのパネルを使用して分析した。
ックス社）によるＣＤマーカーのパネルを使用して分析した。
【００９２】臨床的態様 患者 55人の胸部癌患者をネズミｍＡｂ７Ｆ11で繰り返し免疫した。治療前後の骨髄
腫瘍細胞（ＴＣＤ）の数及び７Ｆ11の免疫処置及び投与の回数を表６に示す。全
ての患者の平均ＴＣＤは、治療前の106 個の単核骨髄細胞当たり3.2 腫瘍細胞で
ある。腫瘍の段階、タイプ及び研究グループの予備処置の臨床データを表２に示
す。腫瘍の段階化はＴＮＭ分級に従って行った。27人の患者はリンパのノードが
ネガティブで、28人の患者はポジティブであった。32の場合に補助薬を使用する
化学治療を、７Ｆ11治療より優先し、18人の患者は７Ｆ11処置の間に標準的なホ
ルモン治療を続けた。
腫瘍細胞（ＴＣＤ）の数及び７Ｆ11の免疫処置及び投与の回数を表６に示す。全
ての患者の平均ＴＣＤは、治療前の106 個の単核骨髄細胞当たり3.2 腫瘍細胞で
ある。腫瘍の段階、タイプ及び研究グループの予備処置の臨床データを表２に示
す。腫瘍の段階化はＴＮＭ分級に従って行った。27人の患者はリンパのノードが
ネガティブで、28人の患者はポジティブであった。32の場合に補助薬を使用する
化学治療を、７Ｆ11治療より優先し、18人の患者は７Ｆ11処置の間に標準的なホ
ルモン治療を続けた。
【００９３】 ７Ｆ11免疫処置 最初に50mgの処置投与量を120 分掛けて点滴した。この50mg処置グループの５
陳の患者は直ちに緩やかなアレルギー反応を起こした（発疹、低血圧症、熱）。
全ての徴候は＜24時間続き、特別な治療を行うことなく、自然に解決した。患者
番号８は、発疹、低熱、低血圧及びブロコスパスムの徴候が進行した。副作用は
、８mgのみのデキサメタソン（フォーテコルチン）の点滴により完全に逆にでき
た。次いで500 mgの処置投与量を８時間以上掛けて点滴した。このような条件下
では、第１の免疫処置の間にアレルギーの徴候を示した患者でも、アレルギー性
の副作用は回避できた。長く続く毒性のある副作用はどの患者も示さなかった。
現在までのところ、７人の患者が、副作用を生じさせることなく、50mgの７Ｆ11
の強い維持免疫処置を受けている。20mg投与（点滴時間４時間）グループの全て
の12人の患者及び2.5 mgの処置グループ（点滴時間１時間）の全ての21人の患者
は逆の薬効を示さなかった。
陳の患者は直ちに緩やかなアレルギー反応を起こした（発疹、低血圧症、熱）。
全ての徴候は＜24時間続き、特別な治療を行うことなく、自然に解決した。患者
番号８は、発疹、低熱、低血圧及びブロコスパスムの徴候が進行した。副作用は
、８mgのみのデキサメタソン（フォーテコルチン）の点滴により完全に逆にでき
た。次いで500 mgの処置投与量を８時間以上掛けて点滴した。このような条件下
では、第１の免疫処置の間にアレルギーの徴候を示した患者でも、アレルギー性
の副作用は回避できた。長く続く毒性のある副作用はどの患者も示さなかった。
現在までのところ、７人の患者が、副作用を生じさせることなく、50mgの７Ｆ11
の強い維持免疫処置を受けている。20mg投与（点滴時間４時間）グループの全て
の12人の患者及び2.5 mgの処置グループ（点滴時間１時間）の全ての21人の患者
は逆の薬効を示さなかった。
【００９４】 ７Ｆ11の薬学的動力学 リンパ中の天然のネズミｍＡｂ７Ｆ11の薬学的動力学を表７に示す。50mgの７
Ｆ11を受けた患者は、点滴後の４時間に６〜18μｇ／mlの領域の領域ピーク濃度
を有した。12時間後に８μｇ／ml及び48時間後に６μｇ／mlというむしろ遅い減
少があった。７Ｆ11のピークのリンパ濃度は上昇するＨＡＭＡ及びヒト抗−７Ｆ
11滴定量と平行に減少した。
Ｆ11を受けた患者は、点滴後の４時間に６〜18μｇ／mlの領域の領域ピーク濃度
を有した。12時間後に８μｇ／ml及び48時間後に６μｇ／mlというむしろ遅い減
少があった。７Ｆ11のピークのリンパ濃度は上昇するＨＡＭＡ及びヒト抗−７Ｆ
11滴定量と平行に減少した。
【００９５】 ＨＡＭＡ及びａｂ２抗体 現状では、50mgグループの18人の患者及び50／20mgグループの６人の患者が、
免疫処置を終えている。これらの処置グループ中のＨＡＭＡは、時間及び滴定量
で大きな変化を示した。３人の患者で、処置前に僅かに上昇したレベルが記録さ
れた。処置中に、患者の１つのグループ（患者３、６、11、13、14及び20）は、
１μｇ／mlを越えない非常に遅い増加と非常に安定したＨＡＭＡの滴定により特
徴付けられた。しかし４から６回の免疫処置の後に、多くの患者は連続するＨＡ
ＭＡの上昇を示し、10μｇ／mlより大きい滴定量を生じさせた。 これと対照的に、抗７Ｆ11の滴定量は第２回の免疫処置で大きく上昇した。治
療の間、Ｍ０グループの全ての患者は、引き続く免疫処置の間に２〜８μｇ／ml
の領域で安定した滴定量を示した。７Ｆ11治療の間の個々の患者の典型的なＨＡ
ＭＡと抗−７Ｆ11滴定離農を図２及び３図３に示す。20mg及び2.5 mg抗体の処置
グループ中のＨＡＭＡ及び抗−７Ｆ11滴定量は50mgのグループのものから大きく
異なってはいなかった。
免疫処置を終えている。これらの処置グループ中のＨＡＭＡは、時間及び滴定量
で大きな変化を示した。３人の患者で、処置前に僅かに上昇したレベルが記録さ
れた。処置中に、患者の１つのグループ（患者３、６、11、13、14及び20）は、
１μｇ／mlを越えない非常に遅い増加と非常に安定したＨＡＭＡの滴定により特
徴付けられた。しかし４から６回の免疫処置の後に、多くの患者は連続するＨＡ
ＭＡの上昇を示し、10μｇ／mlより大きい滴定量を生じさせた。 これと対照的に、抗７Ｆ11の滴定量は第２回の免疫処置で大きく上昇した。治
療の間、Ｍ０グループの全ての患者は、引き続く免疫処置の間に２〜８μｇ／ml
の領域で安定した滴定量を示した。７Ｆ11治療の間の個々の患者の典型的なＨＡ
ＭＡと抗−７Ｆ11滴定離農を図２及び３図３に示す。20mg及び2.5 mg抗体の処置
グループ中のＨＡＭＡ及び抗−７Ｆ11滴定量は50mgのグループのものから大きく
異なってはいなかった。
【００９６】 一般に、患者の殆どに関して、ＨＡＭＡ及び７Ｆ11は免疫治療中に同じ経路を
示した。治療後に、リンパ滴定量は、半減期が４から６カ月の遅い減少を示した
。１年後の増強免疫処置（７人の患者）は劇的な増加と保持されたＨＡＭＡ及び
７Ｆ11滴定量を示した。 選択された患者（番号１、２、４及び５）中の競争用としての精製ムチン７Ｆ
11を使用する抑制アッセイは、ａｂ２抗体のかなりのフラクションが、治療ｍＡ
ｂ７Ｆ11（ａｂ１）従ってａｂ２β抗体の可変領域に特異的であったことを明瞭
に示した。
示した。治療後に、リンパ滴定量は、半減期が４から６カ月の遅い減少を示した
。１年後の増強免疫処置（７人の患者）は劇的な増加と保持されたＨＡＭＡ及び
７Ｆ11滴定量を示した。 選択された患者（番号１、２、４及び５）中の競争用としての精製ムチン７Ｆ
11を使用する抑制アッセイは、ａｂ２抗体のかなりのフラクションが、治療ｍＡ
ｂ７Ｆ11（ａｂ１）従ってａｂ２β抗体の可変領域に特異的であったことを明瞭
に示した。
【００９７】 骨髄中のミクロ転移の腫瘍細胞（ＴＣＤ）の代用マーカーの分析及び追跡 Ｍ０グループの19人の患者が免疫治療の試みを完了した。治療前（平均値は3.
3 腫瘍細胞）と治療後のＴＣＤの比較を表６に示す。２人の患者（番号１及び３
）は治療後に２度分析した。他の患者は表に示した時点で分析した。各場合に、
６×106 骨髄細胞を有する少なくとも６個のサイトプシン調製物を、サイトケラ
チン（５Ｄ３）及びＭＵＣ１（７Ｆ11、１Ｅ４）及びヒト上皮−特異性抗原（Ｍ
ＯＣ31）に対する抗体で着色した。アイソトープ反応性を示した場合を付加的な
二重着色により分析した。Ｍ０グループの18人の患者の骨髄吸引は７Ｆ11治療の
後にネガティブと記録され、他方かなりの抗−マウス反応性を有する１人の患者
はポジティブ（71×106 ）と記録され、将来再分析される。
3 腫瘍細胞）と治療後のＴＣＤの比較を表６に示す。２人の患者（番号１及び３
）は治療後に２度分析した。他の患者は表に示した時点で分析した。各場合に、
６×106 骨髄細胞を有する少なくとも６個のサイトプシン調製物を、サイトケラ
チン（５Ｄ３）及びＭＵＣ１（７Ｆ11、１Ｅ４）及びヒト上皮−特異性抗原（Ｍ
ＯＣ31）に対する抗体で着色した。アイソトープ反応性を示した場合を付加的な
二重着色により分析した。Ｍ０グループの18人の患者の骨髄吸引は７Ｆ11治療の
後にネガティブと記録され、他方かなりの抗−マウス反応性を有する１人の患者
はポジティブ（71×106 ）と記録され、将来再分析される。
【００９８】 証明された転移を有する患者は７Ｆ11免疫処置のプロトコールに含められた。
治療前に、腫瘍マーカーＣＡ153 （患者番号34）、ＣＥＡ（患者番号27）及びＣ
ａ125 （患者番号16）の増加したリンパレベルを有する３人の患者は顕著な遅く
かつ遅れたＨＡＭＡ及び抗−７Ｆ11滴定量の展開（表７）を示した。 現在までのところ、このグループの６人の患者が免疫治療の間及び後にＴＣＤ
用分析ができた。骨髄中の腫瘍細胞の除去が、２つの場合（番号12、局部疾患、
及び番号17）に見られ、他の患者（番号10、局部疾患）では変化が記録されなか
った。治療前に証明された骨転移及びＣＡ125 の増加した腫瘍マーカーレベルを
有する第３の患者（番号16）では、ＴＣＤの堅実な増加が記録された。
治療前に、腫瘍マーカーＣＡ153 （患者番号34）、ＣＥＡ（患者番号27）及びＣ
ａ125 （患者番号16）の増加したリンパレベルを有する３人の患者は顕著な遅く
かつ遅れたＨＡＭＡ及び抗−７Ｆ11滴定量の展開（表７）を示した。 現在までのところ、このグループの６人の患者が免疫治療の間及び後にＴＣＤ
用分析ができた。骨髄中の腫瘍細胞の除去が、２つの場合（番号12、局部疾患、
及び番号17）に見られ、他の患者（番号10、局部疾患）では変化が記録されなか
った。治療前に証明された骨転移及びＣＡ125 の増加した腫瘍マーカーレベルを
有する第３の患者（番号16）では、ＴＣＤの堅実な増加が記録された。
【００９９】 実施例３ 3.1 2.5 mg投与用の処置スキーム ポジティブな骨髄発見を有する患者は４週間のインターバルで６〜８回免疫さ
れた。目的は安定したＨＡＭＡの滴定量。
れた。目的は安定したＨＡＭＡの滴定量。
【０１００】実験室テスト用の血の回収 各７Ｆ11処置の前に 1) 血のカウント 2) 患者を伴う腫瘍マーカーのための１個の白いモノベット 3) ＨＡＭＡ、抗７Ｆ11を決定するための１個の白いモノベット 4) 免疫状態を決定するための１個の青いモノベット
【０１０１】予備処置 なし
【０１０２】７Ｆ11の用途 抗体７Ｆ11は、１mg／mlの濃度の生理食塩水中に存在する。静脈の用途のため
に、2.5 mlの抗体溶液を250 ml中の生理食塩水中で希釈する。１時間以上掛けて
点滴を行う。血圧を１時間後にチェックする。１時間の追跡時間の後に、患者を
病院を去ることができる。
に、2.5 mlの抗体溶液を250 ml中の生理食塩水中で希釈する。１時間以上掛けて
点滴を行う。血圧を１時間後にチェックする。１時間の追跡時間の後に、患者を
病院を去ることができる。
【０１０３】最後の免疫処置 各患者は免疫処置の４週間後の最後の免疫処置の日に、更なる血の回収のため
のモノベット（白）を含む封筒を受け取る。臨床コントロール試験のための日時
の調節。最後の免疫処置の３ヶ月後に骨髄コントロール試験の日を固定。
のモノベット（白）を含む封筒を受け取る。臨床コントロール試験のための日時
の調節。最後の免疫処置の３ヶ月後に骨髄コントロール試験の日を固定。
【０１０４】3.2 20mg投与のための処置スキーム ポジティブな骨髄を発見された患者は４週間のインターバルで６〜８回免疫処
置を行う。目的は安定したＨＡＭＡ滴定量。 実験室テスト用の血の回収 各７Ｆ11処置の前に 1) 血のカウント 2) 患者を伴う腫瘍マーカーのための１個の白いモノベット 3) ＨＡＭＡ、抗７Ｆ11を決定するための１個の白いモノベット 4) 免疫状態を決定するための１個の青いモノベット
置を行う。目的は安定したＨＡＭＡ滴定量。 実験室テスト用の血の回収 各７Ｆ11処置の前に 1) 血のカウント 2) 患者を伴う腫瘍マーカーのための１個の白いモノベット 3) ＨＡＭＡ、抗７Ｆ11を決定するための１個の白いモノベット 4) 免疫状態を決定するための１個の青いモノベット
【０１０５】予備処置 1) ２タブレットのカルシウム 2) タベギルによる短い点滴。100 mlのＮａＣｌ中の５mlの２mgの１アンプル
。
。
【０１０６】７Ｆ11の用途 抗体７Ｆ11は、１mg／mlの濃度の生理食塩水中に存在する。静脈の用途のため
に、20mlの抗体溶液を500 ml中の生理食塩水中で希釈する。１時間以上掛けて点
滴を行う。血圧を１時間後にチェックする。１時間の追跡時間の後に、患者を病
院を去ることができる。
に、20mlの抗体溶液を500 ml中の生理食塩水中で希釈する。１時間以上掛けて点
滴を行う。血圧を１時間後にチェックする。１時間の追跡時間の後に、患者を病
院を去ることができる。
【０１０７】最後の免疫処置 各患者は免疫処置の４週間後の最後の免疫処置の日に、更なる血の回収のため
のモノベット（白）を含む封筒を受け取る。臨床コントロール試験のための日時
の調節。最後の免疫処置の３ヶ月後に骨髄コントロール試験の日を固定。
のモノベット（白）を含む封筒を受け取る。臨床コントロール試験のための日時
の調節。最後の免疫処置の３ヶ月後に骨髄コントロール試験の日を固定。
【０１０８】 実施例４ 鋭い効果の評価 ＭＵＣ１抗体の鋭い毒性効果の試験のために、9.5 mg／kgに対応する1.2 mlの
ＰＢＳ中の2.28mgの抗体を12匹のメスのスプラーグ・ダウリー・ラット（チャー
ルズ・リバー・ウィガより入手、年令：８〜９週間、体重：231 ±９ｇ）中に静
脈注射した。この投与量は女性患者用に意図した投与量の薬25杯に対応する（0.
38mg／kg＝65kgの体重当たり25mg）。
ＰＢＳ中の2.28mgの抗体を12匹のメスのスプラーグ・ダウリー・ラット（チャー
ルズ・リバー・ウィガより入手、年令：８〜９週間、体重：231 ±９ｇ）中に静
脈注射した。この投与量は女性患者用に意図した投与量の薬25杯に対応する（0.
38mg／kg＝65kgの体重当たり25mg）。
【０１０９】 この外部からの使用にもがかわらず、このマウス抗体の静脈注射の間、挙動の
変化、耐性の臨床的サイン及び特にアレルギー反応の徴候（ショック、呼吸数の
変化は見られなかった。麻酔から目覚めた後の動物の挙動（注射の３〜４分後、
麻酔剤：Ｎ2 Ｏ、Ｏ2 、ハロタン）は例外なく完全に注意を引くものではなかっ
た。このことから、上述のように特定した投与量で投与したときのマウス抗体Ｂ
Ｍ−７はラットの心血管系システムに鋭い効果を与えないことを示している。
変化、耐性の臨床的サイン及び特にアレルギー反応の徴候（ショック、呼吸数の
変化は見られなかった。麻酔から目覚めた後の動物の挙動（注射の３〜４分後、
麻酔剤：Ｎ2 Ｏ、Ｏ2 、ハロタン）は例外なく完全に注意を引くものではなかっ
た。このことから、上述のように特定した投与量で投与したときのマウス抗体Ｂ
Ｍ−７はラットの心血管系システムに鋭い効果を与えないことを示している。
【０１１０】
【表６】
【表６の続き】
【表７】
【０１１１】 参考文献のリスト Ｖ．アポストロボウロス及びＦ．Ｃ．マッケンジー、Critical Rev. Immunolo
gy 14 (1994) 293-309) 。 Ｇ．バステルトら、リガード・ブリュナー・エディション中の生薬学的研究に
おける免疫欠損動物、バーゼル・カーガー、1987、224-227) ベルガー及びキンメルの「酵素学の方法、152 巻、分子クローニング技術(198
7 年) 」カリフォルニア州サンディエゴのアカデミック・プレス・インコーポレ
ーテッド ベスラーら、Immunobiol. 170 (1985) 239-244 ブリンクマンら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991) 8616 ─8620 ブリンクマンら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 3075 ─3079 ブリンクマンら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 7538 ─7542 ブリュッゲマンら、J. Exp. Med. 166 (1987) 1357─1361 Ｔ．Ｈ．ブリュメンドルフら、Cancer Research 54 (1994) 4162-4168 Ｔ．Ｈ．ブリュメンドルフら、Nucl. Med. 34 (1995) 197-202
gy 14 (1994) 293-309) 。 Ｇ．バステルトら、リガード・ブリュナー・エディション中の生薬学的研究に
おける免疫欠損動物、バーゼル・カーガー、1987、224-227) ベルガー及びキンメルの「酵素学の方法、152 巻、分子クローニング技術(198
7 年) 」カリフォルニア州サンディエゴのアカデミック・プレス・インコーポレ
ーテッド ベスラーら、Immunobiol. 170 (1985) 239-244 ブリンクマンら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991) 8616 ─8620 ブリンクマンら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 3075 ─3079 ブリンクマンら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 7538 ─7542 ブリュッゲマンら、J. Exp. Med. 166 (1987) 1357─1361 Ｔ．Ｈ．ブリュメンドルフら、Cancer Research 54 (1994) 4162-4168 Ｔ．Ｈ．ブリュメンドルフら、Nucl. Med. 34 (1995) 197-202
【０１１２】 シアンフリグリアら、Hybridoma Vol.2 (1993) 451-457 コルヒャーら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981) 3199-3203 Ｆ．Ｈ．デランドら、J. NUcl. Med. 20 (1979) 1243-1250 Ｊ．Ｊ．ディールら、Natl. Cancer Inst. 88 (1996) 1652-2658 Ｅ．ハーロー及びＤ．レインの「抗体：実験室マニュアル」（コールド・スプ
リング・ハーバー・プレス（1988） Ａ．Ｓ．Ｂ．エッジら、Anal. Biochem. 118 (1981) 131-137 ＥＰ−Ｂ ０１９３２７６ Ｊ．ファゲルベルクら、Cancer Immunol. Immunother. 38 (1994) 149-159 フィンら、1997年 フィッツジェラルド及びパスタン、J. Natl. Cancer 81 (1989) 1455─1461 Ｊ．フクシら、J. Biol. Chem. 259 (1984) 10511-10517
リング・ハーバー・プレス（1988） Ａ．Ｓ．Ｂ．エッジら、Anal. Biochem. 118 (1981) 131-137 ＥＰ−Ｂ ０１９３２７６ Ｊ．ファゲルベルクら、Cancer Immunol. Immunother. 38 (1994) 149-159 フィンら、1997年 フィッツジェラルド及びパスタン、J. Natl. Cancer 81 (1989) 1455─1461 Ｊ．フクシら、J. Biol. Chem. 259 (1984) 10511-10517
【０１１３】 Ｏ．Ｅ．ガラニアら、Tumor Biol. 19, suppl.1 (1998)79-87 ホリガー及びウィンター、Current Opin. Biotechnol. (1993) 446─449 ホリガーら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444 ─6448 フードら、Immunology, ベンジャミン、ニューヨーク、第２版（1984 ヒューストンら、PNAS USA 85 (1988) 5879-5883 フンカピラー及びフード、Nature 323 (1986) 15-16) Ｍ．Ｒ．プライスらのＩＳＯＢＭ ＴＤ−４研究集会の総括リポート、「ＭＵ
Ｃ１ムチンに対する56の単クローン抗体の分析」、Tumor Biol. 19, suppl. 1(1
998) 1-20 、スイス国バーゼルのＳ．カーガーＡＧ Ｈ．Ｒ．ジェローム、J. Immunol. 151 (1993) 1654-1662 ユンクら、Angewandte Chemie 97 (1985)883 Ｅ．Ａ．カバトらの「免疫学的興味のある蛋白質のシーケンス（1987）」（メ
リーランド州のベセスタのナショナル・インスティチュート・オブ・ヘルス
Ｃ１ムチンに対する56の単クローン抗体の分析」、Tumor Biol. 19, suppl. 1(1
998) 1-20 、スイス国バーゼルのＳ．カーガーＡＧ Ｈ．Ｒ．ジェローム、J. Immunol. 151 (1993) 1654-1662 ユンクら、Angewandte Chemie 97 (1985)883 Ｅ．Ａ．カバトらの「免疫学的興味のある蛋白質のシーケンス（1987）」（メ
リーランド州のベセスタのナショナル・インスティチュート・オブ・ヘルス
【０１１４】 Ｖ．カラニカスら、Tumor Biol. 19, suppl. 1(1998) 71-78 Ｓ．カウル、「哺乳類細胞に対する特異性を有する単クローン抗体の発展」、
フランクフルト大学生物化学センターの視覚取得論文、1983年 Ｓ．カウルら、アブストラクト51、婦人科及び産科用のためのドイツ社会の専
門会議、ドレスデン、1196年10月１−５日 Ｒ．Ａ．ライン、Glycobiology 4 (1994) 1-9 Ｍ．ラミキら、J. Nucl. Med. 32 (1991) 1326-1332 Ｋ．Ｏ．ロイド、Tumor Biol. 19, suppl.1 (1998) 118-121 Ｍ．Ｊ．メリノら、Nucl. Med. Biol. 18 (1991) 437-443 パスタンら、Cancer Res. 51 (1991) 3781-3787 Ｍ．Ｒ．プライスらのＩＳＯＢＭ ＴＤ−４研究集会の総括リポート、「ＭＵ
Ｃ１ムチンに対する56の単クローン抗体の分析」、Tumor Biol. 19, suppl. 1(1
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フランクフルト大学生物化学センターの視覚取得論文、1983年 Ｓ．カウルら、アブストラクト51、婦人科及び産科用のためのドイツ社会の専
門会議、ドレスデン、1196年10月１−５日 Ｒ．Ａ．ライン、Glycobiology 4 (1994) 1-9 Ｍ．ラミキら、J. Nucl. Med. 32 (1991) 1326-1332 Ｋ．Ｏ．ロイド、Tumor Biol. 19, suppl.1 (1998) 118-121 Ｍ．Ｊ．メリノら、Nucl. Med. Biol. 18 (1991) 437-443 パスタンら、Cancer Res. 51 (1991) 3781-3787 Ｍ．Ｒ．プライスらのＩＳＯＢＭ ＴＤ−４研究集会の総括リポート、「ＭＵ
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【０１１５】 Ｇ．リートミュラー、Lancet 343 (1994) 1177-1183 Ａ. ルゲッティら、Cancer Res. 53 (1993) 2457-2461 サンブロックらの「分子クローニング、実験室マニュアル第２版」（ニューヨ
ークのコールド・スプリング・ハーバー・プレス（1989） Ｒ．スコープス、蛋白質精製、1982年、ニューヨークのスプリンガー・フェア
ラーク Ｊ．テーラー−パパディミトリュウ、Int. J, Cancer 49 (1991) 1-5 米国特許明細書第4,952,496 号 米国特許明細書第6,595,016 号 米国特許明細書第7,648,971 号 Ｌ．ワイス及びＨ．Ａ．ギルバート、1981年のボストンのＧＫホールでの「骨
転移」 Ｔ．ウィルバンクス、 Cancer 48 (1981) 1768-1775 ＷＯ ９０／１２５９２ ＷＯ ８８／０１６４９ ＷＯ ８８／０９３４４ ＷＯ ９０／０５１４２ ＷＯ ９２／０７２７１
ークのコールド・スプリング・ハーバー・プレス（1989） Ｒ．スコープス、蛋白質精製、1982年、ニューヨークのスプリンガー・フェア
ラーク Ｊ．テーラー−パパディミトリュウ、Int. J, Cancer 49 (1991) 1-5 米国特許明細書第4,952,496 号 米国特許明細書第6,595,016 号 米国特許明細書第7,648,971 号 Ｌ．ワイス及びＨ．Ａ．ギルバート、1981年のボストンのＧＫホールでの「骨
転移」 Ｔ．ウィルバンクス、 Cancer 48 (1981) 1768-1775 ＷＯ ９０／１２５９２ ＷＯ ８８／０１６４９ ＷＯ ８８／０９３４４ ＷＯ ９０／０５１４２ ＷＯ ９２／０７２７１
【０１１６】シーケンスのリスト （1)一般的な情報 （ｉ）出願人 （Ａ）氏名：バステルト・ギュンター、医学部教授、博士 （Ｂ）通り名：フォスシュトラーセ ９ （Ｃ）都市名：ハキデルベルク （Ｅ）国名：ドイツ国 （Ｆ）郵便番号（ジップ）：Ｄ−６９１１５
【０１１７】 （ii) 発明の名称：乳腫瘍を伴うムチンに対する特異性のある抗体、その生産
方法及び使用方法 （iii) シーケンスの数：５ （iv) コンピューターで読み取れる形態 （Ａ）媒体タイプ：フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ ＰＣ コンパティブル （Ｃ）操作システム：ＷＩＮＤＯＷ ＮＴ ４０ （Ｄ）ソフトウェア：ＭＩＣＲＯＳＯＦＴ ＷＯＲＤ７
方法及び使用方法 （iii) シーケンスの数：５ （iv) コンピューターで読み取れる形態 （Ａ）媒体タイプ：フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ ＰＣ コンパティブル （Ｃ）操作システム：ＷＩＮＤＯＷ ＮＴ ４０ （Ｄ）ソフトウェア：ＭＩＣＲＯＳＯＦＴ ＷＯＲＤ７
【０１１８】 （2) シーケンスＩＤ番号１の情報 （ｉ）シーケンス特性 （Ａ）長さ：20アミノ酸 （Ｂ）タイプ：アミノ酸 （Ｃ）ストランド：シングル （Ｄ）トポロジー：直線状 （ii) 分子タイプ：ペプチド （iii) シーケンスの説明：シーケンスＩＤ番号１
【化１】
【０１１９】 （3) シーケンスＩＤ番号２の情報 （ｉ）シーケンス特性 （Ａ）長さ：24アミノ酸 （Ｂ）タイプ：アミノ酸 （Ｃ）ストランド：シングル （Ｄ）トポロジー：直線状 （ii) 分子タイプ：ペプチド （iii) シーケンスの説明：シーケンスＩＤ番号２
【化２】
【０１２０】 （4) シーケンスＩＤ番号３の情報 （ｉ）シーケンス特性 （Ａ）長さ：10アミノ酸 （Ｂ）タイプ：アミノ酸 （Ｃ）ストランド：シングル （Ｄ）トポロジー：直線状 （ii) 分子タイプ：ペプチド （iii) シーケンスの説明：シーケンスＩＤ番号３
【化３】
【０１２１】 （5) シーケンスＩＤ番号４の情報 （ｉ）シーケンス特性 （Ａ）長さ：11アミノ酸 （Ｂ）タイプ：アミノ酸 （Ｃ）ストランド：シングル （Ｄ）トポロジー：直線状 （ii) 分子タイプ：ペプチド （iii) シーケンスの説明：シーケンスＩＤ番号４
【化４】
【０１２２】 （6) シーケンスＩＤ番号５の情報 （ｉ）シーケンス特性 （Ａ）長さ：５アミノ酸 （Ｂ）タイプ：アミノ酸 （Ｃ）ストランド：シングル （Ｄ）トポロジー：直線状 （ii) 分子タイプ：ペプチド （iii) シーケンスの説明：シーケンスＩＤ番号４
【化５】
【図１】 異なったＷＧＡ精製ＭＵＣ１ムチンとのｍａｂ７Ｆ11の反応性。抗原は実施例
１で述べたようにＷＧＡ−セファロースクロマトグラフィーで精製し、7.5 ％Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロッティングを受けさせた（20μｌ中の50Ｕ）
。Ｔ47−Ｄ上澄み（トラック１）、Ｔ47−Ｄ細胞質ゾル（トラック２）、Ｐ1.1
腹水（トラック３）、Ｐ1.2 胸膜流出分（トラック４）、Ｐ1.3 腹水（トラック
５）、Ｐ1.4 腹水（トラック６）、Ｐ1.5 腹水（トラック７）、Ｐ1.6 腹水（ト
ラック８）、Ｐ1.6 腹水（トラック９）、Ｐ1.7 腹水（トラック10）、Ｐ1.8 腹
水（トラック11）、（Ｐは患者）。 ＳＴ、キロダルトン中の標準分子量。高度にグリコシル化され又はアンダーグ
リコシル化されたＭＵＣ１フラグメントの検出。レーン１、２、５及び７の400
〜440 ｋＤの二重バンド。レーン２、５、６、８、９、10及び11の200 〜220 ｋ
Ｄａ領域のアンダーグリコシル化されたＭＵＣ１フラグメント。
１で述べたようにＷＧＡ−セファロースクロマトグラフィーで精製し、7.5 ％Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロッティングを受けさせた（20μｌ中の50Ｕ）
。Ｔ47−Ｄ上澄み（トラック１）、Ｔ47−Ｄ細胞質ゾル（トラック２）、Ｐ1.1
腹水（トラック３）、Ｐ1.2 胸膜流出分（トラック４）、Ｐ1.3 腹水（トラック
５）、Ｐ1.4 腹水（トラック６）、Ｐ1.5 腹水（トラック７）、Ｐ1.6 腹水（ト
ラック８）、Ｐ1.6 腹水（トラック９）、Ｐ1.7 腹水（トラック10）、Ｐ1.8 腹
水（トラック11）、（Ｐは患者）。 ＳＴ、キロダルトン中の標準分子量。高度にグリコシル化され又はアンダーグ
リコシル化されたＭＵＣ１フラグメントの検出。レーン１、２、５及び７の400
〜440 ｋＤの二重バンド。レーン２、５、６、８、９、10及び11の200 〜220 ｋ
Ｄａ領域のアンダーグリコシル化されたＭＵＣ１フラグメント。
【図２】 患者No.１：７Ｆ11薬学的動力学及び体液性免疫、胸部癌Ｔ１ｂ、Ｎ０、Ｍ０ 。
【図３】 患者No.２：７Ｆ11薬学的動力学及び体液性免疫、胸部癌Ｔ１ｂ、Ｎ１ｂ、Ｍ ０。
【図４】 ７Ｆ11薬学的動力学。第１、第２及び第３の免疫処置。
【図５】 50、20及び2.5 ｇの７Ｆ11で免疫された患者中で成長したＨＡＭＡ。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/574 Ａ Ｇ０１Ｎ 33/574 33/577 Ａ 33/577 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＵ ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA12 BA36 BA45 GA03 GA18 GA23 HA15 4B064 AG27 CA10 CA20 CC24 CE06 CE07 CE12 DA05 DA14 4C085 AA13 BB01 BB12 CC03 DD21 DD32 DD62 EE01 EE03 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA53 BA72 CA41 DA76 DA86 EA28 EA50 FA71 FA74 GA22 GA26
Claims (17)
- 【請求項１】 癌種細胞からのＭＵＣ１タンデムリピートの炭水化物構造に
特異的に結合する免疫的に活性のあるポリペプチドで、 a) 胸部癌患者の腫瘍細胞を含有する腹水からの200 から440 ｋＤａの糖蛋白
フラクションへの前記ポリペプチドの親和力と、通常細胞からの天然のＭＵＣ１
抗原（400 から440 ｋＤａ）への前記ポリペプチドの親和力との商が100 ：１以
上であり（分子量領域はＳＤＳゲル電気泳動により分析）、 b) 前記ポリペプチドはグリコシル化されていないＭＵＣ１抗原には結合せず
、 c) 前記糖蛋白フラクションがノイラミニダーゼで処理されてＮ−末端ノイラ
ミン酸が解裂するか、又はホルマリンで処理されたときに、前記200 から440 ｋ
Ｄａの糖蛋白フラクションへの前記ポリペプチドの結合が10％以下だけ変化する
、 ことを特徴とする免疫的に活性のあるポリペプチド。 - 【請求項２】 細胞系統ＤＳＭ ＡＴＣＣ２３２８又はＤＳＭ ＡＴＣＣ２
３２９から得ることができる請求項１に記載の免疫的に活性のあるポリペプチド
。 - 【請求項３】 ハイポグリコシル化ＭＵＣ１に特異的に結合した抗体、特に
200 から440 ｋＤａの分子量を有し腫瘍細胞からの癌種細胞フラクションの生産
方法であり、糖蛋白を、腫瘍細胞を含有する体液、特に癌種細胞を含有する体液
、特に胸部癌患者の癌種細胞を含有する腹水から、レクチン親和性クロマトグラ
フィーにより単離し、前記糖蛋白がｌｇ蛋白質から単離されても良く、かつその
ようにして得られるフラクションが動物の免疫処置に使用され、抗血清が得られ
、抗体がそこから単離されることを特徴とする抗体の生産方法。 - 【請求項４】 前記抗体が、 a) 腫瘍細胞を含有する、特に癌種患者の癌種細胞の腹水からの200 から440
ｋＤａの糖蛋白フラクションへのポリペプチドの親和力と、通常細胞からの天然
のＭＵＣ１抗原（420 から440 ｋＤａ）への前記ポリペプチドの親和力との商が
100 ：１以上であり、 b) 前記ポリペプチドはグリコシル化されていないＭＵＣ１抗原には結合せず
、 c) 前記糖蛋白フラクションがノイラミニダーゼで処理されてＮ−末端ノイラ
ミン酸が解裂するか、又はホルマリンで処理されたときに、前記200 から440 ｋ
Ｄａの糖蛋白フラクションへの前記ポリペプチドの結合が10％以下だけ変化する
、 ことを特徴とする請求項３に記載の方法。 - 【請求項５】 胸部癌患者用として使用される請求項３又は４に記載の方法
。 - 【請求項６】 前記ポリペプチドが、原核又は真核ホスト細胞中の前記ポリ
ペプチド用の組換え核酸コード化の発現、そして引き続くホスト細胞又は上澄み
から所望のポリペプチドの単離により生産される、請求項１から５までのいずれ
かに記載の免疫学的に活性なポリペプチドの生産方法。 - 【請求項７】 腫瘍細胞特に患者の癌種細胞の増殖抑制抗体であって、薬学
的に効果的な量の請求項１から６までのいずれかに記載の抗体を患者に使用する
ことを特徴とする抗体。 - 【請求項８】 腫瘍細胞特に患者の癌種細胞の増殖を抑制するための薬学的
組成物の生産方法であって、該薬学的組成物が、薬学的に効果的な量の請求項１
から７までのいずれかに記載した抗体を必須成分として含むことを特徴とする薬
学的組成物の生産方法。 - 【請求項９】 抗体が週インターバル又は月インターバルで１回から10回使
用される請求項７又は８に記載の抗体。 - 【請求項１０】 ２μｇから20mg／kg−体重の量の抗体を使用する請求項７
から９のいずれかに記載の抗体。 - 【請求項１１】 患者の体液中の前記抗体の滴定量が３ヶ月を越える期間に
亘って安定したレベルに保持されるように、抗体が使用される請求項７から１０
のいずれかに記載の抗体。 - 【請求項１２】 腫瘍細胞、特に患者の体物質からの癌種細胞又は分泌され
たＭＵＣ１抗原の除去用である先行する請求項のいずれかに記載された抗体であ
って、前記体物質が前記請求項の固定された抗体に接触され、前記腫瘍細胞又は
前記分泌されたＭＵＣ１抗原が前記固定された抗体に結合され、固体相に結合さ
れた前記腫瘍細胞又は前記分泌されたＭＵＣ１抗原が体物質から前記固体相とと
もに分離されることを特徴とする抗体。 - 【請求項１３】 先行する請求項のいずれかの抗体を患者に使用して、腫瘍
患者のＴ−細胞の活性に影響を与えることを特徴とする方法。 - 【請求項１４】 毒素又は細胞毒素物質に共有結合した請求項１又は２に記
載のポリペプチドから成る接合体。 - 【請求項１５】 請求項１又は２に記載のポリペプチドを有する患者からの
サンプルを培養することにより腫瘍細胞特に癌種細胞を決定する方法であって、
抗体のＭＵＣ１への結合を測定することを特徴とする方法。 - 【請求項１６】 請求項１又は２に記載のポリペプチドを含む、体液中のＭ
ＵＣ１を決定するための組成物。 - 【請求項１７】 通常細胞と腫瘍細胞、特に癌種細胞とを組織的に区別する
方法であって、請求項１又は２に記載のポリペプチドの細胞への結合を調査する
ことを特徴とする方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP98102529 | 1998-02-13 | ||
| EP98102529.9 | 1998-02-13 | ||
| PCT/EP1999/000941 WO1999040881A2 (en) | 1998-02-13 | 1999-02-12 | Specific antibodies against mammary tumor-associated mucin, method for production and use |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002502621A true JP2002502621A (ja) | 2002-01-29 |
Family
ID=8231405
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000531139A Pending JP2002502621A (ja) | 1998-02-13 | 1999-02-12 | 乳腫瘍を伴うムチンに対する特異性のある抗体、その生産方法及び使用方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
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| JP (1) | JP2002502621A (ja) |
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| CA (1) | CA2319688A1 (ja) |
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010050528A1 (ja) * | 2008-10-28 | 2010-05-06 | 塩野義製薬株式会社 | 抗ｍｕｃ１抗体 |
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| EP1578345A2 (en) | 2001-03-29 | 2005-09-28 | RAMOT UNIVERSITY AUTHORITY FOR APPLIED RESEARCH & INDUSTRIAL DEVELOPMENT LTD. | Peptides and antibodies to muc 1 proteins |
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| US7101371B2 (en) | 2001-04-06 | 2006-09-05 | Dycus Sean T | Vessel sealer and divider |
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| US10918407B2 (en) | 2016-11-08 | 2021-02-16 | Covidien Lp | Surgical instrument for grasping, treating, and/or dividing tissue |
-
1999
- 1999-02-12 AU AU35966/99A patent/AU3596699A/en not_active Abandoned
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- 1999-02-12 JP JP2000531139A patent/JP2002502621A/ja active Pending
- 1999-02-12 EP EP99917815A patent/EP1056472A2/en not_active Withdrawn
- 1999-02-12 CA CA002319688A patent/CA2319688A1/en not_active Abandoned
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| KR20170002500A (ko) | 2014-04-28 | 2017-01-06 | 이카가쿠 소우야쿠 가부시키가이샤 | 항muc1 항체 또는 그의 항원 결합성 단편 및 그 용도 |
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