JPH08502169A - 火傷病耐性を有するトランスジェニック・リンゴ類果実 - Google Patents
火傷病耐性を有するトランスジェニック・リンゴ類果実Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明はリンゴ類果実の接ぎ穂または根茎栽培品種を、溶菌蛋白をコードする遺伝子で形質転換するリンゴ類果実の接ぎ穂または根茎栽培品種に火傷病耐性を付与する方法に関する。そのような形質転換は、細菌の感染または粒子の細胞内への推進によって行うことができる。形質転換が起こったら、栽培品種をトランスジェニック・リンゴ類果樹に再生する。この技術はリンゴおよびナシ栽培品種の処理に特に有用である。
Description
【発明の詳細な説明】
火傷病耐性を有するトランスジェニック・リンゴ類果実
本願は、1992年9月30日付出願の米国特許出願第07/954,347
号の一部継続出願である。
発明の分野
本発明はリンゴ類果実の接ぎ穂および根茎栽培品種に対する火傷病(fire bli
ght)耐性の付与に関する。
発明の背景
北米では、リンゴ、ナシ、マルメロおよびその他のバラ科の仲間のようなリン
ゴ類果実の果樹が火傷病として知られる疾病に広く悩まされている。北米に土着
ではあるが、この疾病はごく最近、欧州に足がかりを得、現在、大西洋の両側で
かなり関心が持たれている。
火傷病は、エルウィニア・アミロボラ(Erwinia amylovora)細菌によるリン
ゴ類果樹の感染により起こる細菌性の疾病である。この細菌は、雨、風、昆虫、
鳥および人間により、木から木へと播種されることができる。一般に、感染は木
における自然の開口、特に花を介して起こる。これは、まず、花に、水に浸した
ような外観を生じさせ、ついで、萎縮を起こさせ、最後に黒または褐色に変える
。この疾病は、ついで、枝、幹および根を包含する木の他の部分に広がる。この
疾病は木の枝、幹および根に瘤(canker)として現れ、これから液体が浸出して
疾病を広げる。果樹の若枝および地下匍匍茎の火傷病は芽、樹皮および葉を暗褐
色または黒色に変色させる。これが焼け焦げたような外観を与え、それ故、火傷
病と称される。
火傷病は当面の収穫を破壊するのみならず、長期の打撃も与えうる。花の感染
は果実を枯らし、当季の収穫を減少させる。また、若枝の火傷は、次季の果実短
枝を有する果樹を破壊する。ナシおよびマルメロならびに多くのリンゴ栽培品種
および根茎において、火傷は大きな枝や、木全体さえも破壊しうる。リンゴ類果
実収穫に対する火傷病の潜在的に甚大な影響に鑑み、この疾病と戦うための要求
が存在する。
ナシ栽培品種および多くのリンゴ栽培品種が特に火傷病に感受性であることが
判明した。にもかかわらず、両タイプの栽培品種は、火傷病により抵抗性のいく
つかの品種を有している。結実接ぎ穂の感受性が変動するばかりでなく、リンゴ
やナシ果樹の根茎もそうである。その結果、火傷病と戦う1つのアプローチは、
火傷病に耐性のリンゴ類果樹の栽培品種および根茎を育種することである。しか
しながら、そのようなプログラムは、火傷病耐性を有する果樹を得るまでに試行
錯誤と長時間を要する。また、非常に限られた数のリンゴおよびナシ栽培品種し
か年間生産の大きな部分に関係していない。これらの品種は、消費者、スーパー
マーケットおよび栽培家にその外観、品質、風味、貯蔵性および生産特性が評価
されているものである。品種特性を保持しつつ、有性育種で疾病耐性遺伝子を導
入することは、長い世代時間とリンゴおよびナシの自家不和合性が戻し交雑プロ
グラムを天文学的長期に、かつ高価なものとするので、事実上、不可能である。
火傷病と戦うもう1つのアプローチは、疾病の発生を最少限にする以下の園芸
的な実施によるものである。土壌水分を減少させ、肥料栄養素のバランスを維持
することにより火傷病の感染および蔓延が制御できることが判明した。このアプ
ローチは有用であるが、疾病の発生を除去することはできない。
また、感染した果樹から、瘤や火傷した枝を、好ましくは、疾病が休止中の冬
季に除去することにより火傷病を治療することも可能である。しかし、このよう
な操作を行う装置は注意して滅菌し、疾病の蔓延を防止しなければならない。さ
らに、このアプローチは、小さな瘤または内部感染域が検出しきれないので、疾
病を完全に根絶できない。
火傷病に感染した果樹は、銅化合物または抗生物質を定期的に散布することに
よっても火傷病を制御できる。しかし、銅化合物の適用は、しばしば有効ではな
く、果実のサビ(russeting)を起こすので広くは受け入れられていない。抗生
物質の使用、特に、ストレプトマイシンは銅化合物より有効で、果実に対しての
害が少ない。しかし、エルウィニア・アミロボラは、カリフォルニア、オレゴン
、ワシントン、ミズーリおよびミシガンを含むストレプトマイシンが使用されて
いる多くの州で、ストレプトマイシンに対して耐性を生じている。さらに、抗生
物質プログラムは高価で、欧州の多くの国ではその使用を禁じている。
火傷病の生物学的制御が試みられている。そのような努力は、特に、エルウィ
ニア・アミロボラに対する拮抗的生物の開発に向けられている。生物学的制御の
研究は、そのような技術が火傷病の抑制に将来的に有用であることを示している
が、テストされた操作はいずれも、化学的治療に代わるほどには十分に有効で開
発されたものではない。
リンゴ類果実における火傷病と戦う技術の欠陥に鑑み、有効な処置方法に関す
る要求が残っている。
発明の概略
本発明は、リンゴ類果実の接ぎ穂または根茎栽培品種に火傷病に対する耐性を
与える方法に関する。本発明によれば、リンゴ類接ぎ穂または根茎栽培品種が、
溶菌蛋白をコードする遺伝子で形質転換される。かかる形質転換は、栽培品種の
組織を、溶菌蛋白をコードする遺伝子を含むベクターで形質転換されたアグロバ
クテリウム(Agrobacterium)属の細菌接種物と接触させることにより行うこと
ができる。別法として、栽培品種の形質転換は栽培品種組織において不活性また
は生物学的に活性な粒子を推進させること(propelling)によっても行うことが
できる。これは、溶菌蛋白をコードする遺伝子を含むベクターを、該粒子または
組織の周辺細胞と共に細胞の内部へ導入させる。形質転換したら、栽培品種を再
生させてトランスジェニック・リンゴ類果樹を形成させる。本発明は、リンゴお
よびナシ果樹に関して利用するのが特に望ましい。各々の広範囲の根茎および接
ぎ穂栽培品種が利用できる。
また、本発明には、溶菌蛋白をコードする遺伝子で形質転換したトランスジェ
ニック・リンゴ類果実、特に、リンゴまたはナシの接ぎ穂または根茎栽培品種を
包含する。また、該遺伝子で形質転換されたトランスジェニック・リンゴ類果樹
も開示する。該遺伝子の取り込みは火傷病耐性を付与する。
リンゴおよびナシの現在商業化されている果実栽培品種(接ぎ穂)および根茎
の火傷病耐性トランスジェニック品種は、それぞれの栽培品種の品種特性を保持
しながら、火傷病のより完全な制御を可能にする。このような火傷病制御が、化
学薬品および抗生物質の使用に起因する環境および食物汚染なしに行える。本発
明によれば、公衆の健康、環境および果実栽培者の経済性についての関心の全て
に利益を与える。
図面の簡単な説明
図1は、ニワトリ(卵白)リゾチームのヌクレオチド(配列番号3)およびア
ミノ酸(配列番号4)ならびに、プラスミド・ベクターplys1023に挿入
されたその制限酵素地図を示す。
図2は、プラスミド。ベクターpBI121のトランスファーDNA(T−D
NA)の地図である。
図3は、プラスミド・ベクターpMON530の地図である。
図4は、プラスミド・ベクターpLDB2の地図である。
図5は、プラスミド・ベクターpLDB3の地図である。
図6は、プラスミド・ベクターpLDB8の地図である。
図7は、プラスミド・ベクターpLDB9の地図である。
図8は、プラスミド・ベクターpLDB11のT−DNAの地図である。
図9は、プラスミド・ベクターpLDB12のT−DNAの地図である。
図10は、プラスミド・ベクターpLDB7の形成工程を示す模式図である。
図11は、プラスミド・ベクターpLDB10の形成工程を示す模式図である
。
図12は、プラスミド・ベクターpLDB14の形成工程を示す模式図である
。
図13は、成熟アタシンE(Attacin E)のcDNA配列のヌクレオチド(配
列番号9)およびアミノ酸(配列番号10)(564bp)と3’−非コード領
域(159bp)ならびにアタシン・クローンpCP521に挿入されたその制
限酵素地図である。
図14は、プラスミド・ベクターpLDB2O2の形成工程を示す模式図であ
る。
図15は、プラスミド・ベクターpLDB15の形成工程を示す模式図である
。
図16A)16Bおよび16C)各々、アタシン遺伝子プローブ、β−グルク
ロニダーゼ(GUS)プローブおよびネオマイシン・ホスホトランスフェラーゼ
遺伝子(nptII)プローブとハイブリダイズした本発明のトランスジェニッ
ク・リンゴ(T1)についてのサザン分析を示す。各々において、ラムダはレー
ン1、pBI121はレーン2、pLDB15はレーン3、M.26ゲノムDN
Aはレーン4、T1ゲノムDNAはレーン5である。全5つのレーンのDNAは
HindIIIで消化した。T1はM.26から誘導されたアタシンE溶菌蛋白
トランスジェニックである。pLDB15は、バイナリー・ベクター(binary v
ector)pBI121のHindIIIサイトに挿入されたアタシンE蛋白遺伝
子を含有する約2400bpのHindIIIフラグメントを含有する。これら
の図面の左側の数字はラムダ・サイズ・マーカーのサイズをkbで示す。ラムダ
・サイズ・マーカーの概略の位置を、図16Bおよび16Cのレーン1に引いあ
る。
図17は、トランスジェニック・リンゴ栽培品種(T1)、M.26親栽培品
種およびリバティー(Liberty)栽培品種について評価したID50火傷病耐性
を示す。
図18は、トランスジェニック・リンゴ栽培品種(T1)およびM.26親栽
培品種についての火傷病の経時的進行を示す。
図19は、T1におけるアタシンEの発現のノザン分析を示す。
図20は、プラスミド・ベクターpBPRS1、pBPRB37、pBCCS
およびpBCCB37のT−DNAの地図である。
発明および図面の詳細な記載
本発明は、リンゴ類果実接ぎ穂または根茎栽培品種に火傷病耐性を付与する方
法およびそのような耐性を有するリンゴ類果実接ぎ穂および根茎栽培品種自体に
関する。火傷病耐性を付与する方法は、溶菌蛋白をコードする遺伝子を有するリ
ンゴ類果実接ぎ穂または根茎栽培品種の形質転換を包含する。一旦、形質転換が
起こったら、栽培品種を再生させてトランスジェニック・リンゴ類果樹を形成さ
せる。
形質転換に適した植物組織は、葉組織、根組織、***組織およびプロトプラス
トが包含される。特に、葉組織を利用するのが好ましい。
リンゴ類果実接ぎ穂または根茎栽培評価を、溶菌蛋白をコードする遺伝子で形
質転換する1つの技術は、そのような栽培評価の組織を、溶菌蛋白をコードする
遺伝子を含むベクターで形質転換した細菌の接種物と接触させることによる。一
般に、この操作は、リンゴまたはナシ組織に細菌懸濁液を接種し、抗生物質を含
まない再生培地で該組織を、25〜28℃にて48〜72時間インキュベーショ
ンすることを含む。
アグロバクテリウム属の細菌が植物細胞の形質転換に利用できる。このような
細胞の適当な種には、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium
tumefaciens)およびアグロバクテリウム・リゾゲネス(Agrobacterium rhizoge
nes)が包含される。植物を形質転換するそのよく知られた能力故に、アグロバ
クテリウム・ツメファシエンス(例えば、LBA4404またはEHA105株
)が特に有用である。
リンゴ類果実接ぎ穂または根茎栽培品種にアグロバクテリウムを接種するには
、該細菌は、溶菌蛋白をコードする遺伝子を含むベクターで形質転換されなけれ
ばならない。適当な蛋白には、リソチーム、アタシン類、セクロピン(cecropin
)類およびこれらの同族体が包含される。種々の蚕の蛾の桶が、非病原性細菌ま
たは加熱破壊される病原で免疫され、これらの動物の血液リンパには正常には存
在しないこれら一群の蛋白を生成する。そのような細菌または病原の注射は多数
の異なる昆虫で行われているが、ジャイアント蚕蛾、ハヤロホラ・セクロピア(
Hyalophora cecropia)の休眠桶が特に有効であることが証明された。そのよう
な免疫蛾によって生産される蛋白の幾つかが、広範なグラム陰性およびグラム陽
性細菌に対して溶菌活性(すなわち、細胞の溶解を起こす)ことが判明した。
リゾチームは1つの好適な溶菌蛋白である。これは広範な細菌の増殖を制限す
る。ここに参考として引用する、ジェイ・エム・ジャイネスら(J.M.Jaynes,
et al.)の「昆虫からの抗菌遺伝子を利用する植物における細菌抵抗性の増加」
(BioEssays,6:263−270(1987))に示されているように、ハヤ
ロホラ・セクロピアからのリゾチームのヌクレオチド(配列番号1)およびアミ
ノ酸(配列番号2)配列は以下のとおりである。
太字のヌクレオチドおよびアミノ酸配列が、各々、部分リーダー・ペプチドを
コードまたは構成する。ニワトリ(卵白)リゾチームのヌクレオチド(配列番号
3)およびアミノ酸(配列番号4)ならびにプラスミド・ベクターplys10
23に挿入したその制限酵素地図を図1に示す。これらの配列のプラスミド・ベ
クターへのクローニングは、ここに参考として引用するエル・デステファノ・ベ
ルトラン(L.Destefano Beltran)、「ハヤロホラ・セクロピアの体液性免疫応
答の天然成分の幾つかをコードする遺伝子のタバコ植物への取り込み;ルイジア
ナ・ステーツ・ユニバーシィティーに提出された学位論文」(1991)(デス
テファノ・ベルトラン・テーゼ)に示されている。これらのヌクレオチド/アミ
ノ酸配列の変種も知られている。
免疫されたハヤロホラ・セクロピアにおいて抗菌活性を有することの判明して
いる他の一群の溶菌蛋白はアタシン類である。アタシン類は約20,000ダル
トンの分子量を有する、この源からの最大の溶菌蛋白である。アタシンは6つの
わずかに異なった形、すなわち、アタシンA〜アタシンFが存在する。2つの遺
伝子がアタシン類の生成に関係し、6つの特異的なアタシン類が翻訳後の改編に
より生ずる。アタシンEは2つのアタシン遺伝子の1つの非改編翻訳で生じるア
タシンの中性−酸性形である。アタシン類の5つのN−末端アミノ酸配列を用い
るテストは、相互にわずかに相違する3つの塩基性形および2つの酸性形の存在
を示している。アタシンEについての推定ヌクレオチド(配列番号5)およびア
ミノ酸(配列番号6)配列は、ここに参考として引用する、ジェイ・エム・ジャ
イネスら(J.M.Jaynes,et al.)の「昆虫からの抗菌遺伝子を利用する植物
における細菌抵抗性の増加」(BioEssays,6:263−270(1987))
に、つぎのとおり開示されている。
他のアタシン類のcDNAヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、ここに参考と
して引用するエイ・エングストロームら(A.Engstrom et al.)、「昆虫免疫
、抗菌蛋白アタシンFの一次構造およびそのハヤロホラ・セクロピアからの2つ
の天然アタシン類に対する関係」(EMBO J.,vol.1,no.9,pp.20
65−70(1984))およびケイ・コクムら(K.Kockum et al.)「昆虫
免疫、ハヤロホラ・セクロピアからの酸性および塩基性アタシン類に対応する2
つのcDNAクローンの単離および配列」(EMBO J.,vol.3,no.9,p
p.2071−75(1984))に開示されている。
セクロピン類はグラム陰性およびグラム陽性細菌の両方に対して広い活性スペ
クトルを有する最も強力な抗菌ペプチドである。これらは小さく、3つの主な形
、すなわち、セクロピンANセクロピンBおよびセクロピンDに見いだされる。
こ
れら全ては、その分子の塩基性N−末端領域およびC−末端部分の疎水性領域に
おいて高度の相同性を有している。セクロピンAのアミノ酸配列(配列番号7)
は、ここに参考として引用するWO89/04371に開示されており、以下の
とおりである。
このアミノ酸配列から、当業者は適当なヌクレオチド配列を導きだせる。セク
ロピンBをコードするクローンのヌクレオチド配列(配列番号8)およびアミノ
酸配列(配列番号9)は、ここに参考として引用する、ジェイ・エム・ジャイネ
スら(J.M.Jaynes,et al.)の「昆虫からの抗菌遺伝子を利用する植物にお
ける細菌抵抗性の増加」(BioEssays,6:263−270(1987))に、
つぎのとおり開示されている。
太字のアミノ酸配列は、各々、リーダー・ペプチドをコードし、または構成す
る。セクロピンDのアミノ酸配列(配列番号10)は、ここに参考として引用す
るWO89/04371に、つぎのとおり開示されている。
このアミノ酸配列から、当業者は適当なヌクレオチド配列を導きだせる。
リゾチーム、アタシン類およびセクロピン類の合成同族体も開発されている。
そのような合成ペプチドの1つの例はシバI(Shiva I)であり、これは、天然
のセクロピンBの荷電分布、両親媒性および疎水性特性を維持しつつ、配列相同
性における非常に顕著な相違を有するよう設計されている。そのアミノ酸配列(
配列番号11)は、ここに参考として引用するエル・デステファノ・ベルトラン
ら(L.Destefano Beltran et al.、「植物における細菌および糸状菌疾病耐性
の増強:ジャガイモへの適用」(The Molecular and Cellular Biology of theP
otato,Vayda M.E.およびPark W.D.(編)、CAB International Wallingfor
d,UK,pp.205−221(1990))に、つぎのとおり記載されている。
このアミノ酸配列から、当業者は適当なヌクレオチド配列を導きだせる。
もう1つ別の公知の同族体は、親セクロピンB分子を少し変化させて、メチオ
ニン11をバリンで置換し、N−末端メチオニンにプロリンを付加した合成ペプ
チドSB−37である。このアミノ酸配列(配列番号12)は、ここに参考とし
て引用するエル・デステファノ・ベルトランら(L.Destefano Beltran et al.
)の、「植物における細菌および糸状菌疾病耐性の増強:ジャガイモへの適用」
(V
このアミノ酸配列から、当業者は適当なヌクレオチド配列を導きだせる。
もう1つ別の公知の同族体は、親セクロピンB分子を少し変化させて、メチオ
ニン11をバリンで置換し、N−末端メチオニンにプロリンを付加した合成ペプ
チドSB−37である。このアミノ酸配列(配列番号12)は、ここに参考とし
て引用するエル・デステファノ・ベルトランら(L.Destefano Beltran et al.
)の、「植物における細菌および糸状菌疾病耐性の増強:ジャガイモへの適用」
(Vayda M.E.およびPark W.D.(編)、CAB International Walling Ford,
UK,pp.203−221(1990))に、つぎのとおり記載されている。
このアミノ酸配列から、当業者は適当なヌクレオチド配列を導きだせる。
植物細胞からの溶菌蛋白の分泌を可能にするため、該蛋白をコードする遺伝子
を、シグナル・ペプチドをコードする遺伝子に融合させる。その結果、溶菌蛋白
に結合したシグナル・ペプチドを含有する融合蛋白が形成される。シグナル・ペ
プチドの存在は融合蛋白を、シグナル配列が切断されている細胞の小胞体に向け
させる。ついで小胞体ルーメン中またはゴルジ複合体中で溶菌蛋白が修飾され細
胞外へ分泌される。
上記で同定された溶菌蛋白のいずれかと組み合わせてこの概念を用いることが
可能である。特に有用な融合蛋白は、シバ(Shiva)IまたはSB−37に融合
したsPR1またはsCECシグナル・ペプチドである(すなわち、sPR1−
シバI、sPR1−SB37、sCEC−シバIおよびsCEC−CSB37)
。ここに参考として引用するジェイ・デネッケ(J.Denecke)、「植物細胞にお
ける蛋白分泌はデフォールトパスウェイにより生じ得る(Protein Secretion in
Plant Cells Can Occur via a Default Pathway)」、ザ・プラント・セル(Th
e Plant Cell)、Vol.2、pp.51〜59(1990)を参照されたし。
sCEC−シバIのヌクレオチド(配列番号13)およびアミノ酸(配列番号
14)配列は以下のとおりである。
太字のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれシグナル・ペプチドをコード
または構成する。
sCEC−SB37のヌクレオチド(配列番号15)およびアミノ酸(配列番
号16)配列は以下のとおりである。
ここでもまた、太字のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれシグナル・ペ
プチドをコードまたは構成する。
sPR1−シバIのヌクレオチド(配列番号17)およびアミノ酸(配列番号
18)配列は以下のとおりである。
太字のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれシグナル・ペプチドをコード
または構成する。
sPR1−SB37のヌクレオチド(配列番号19)およびアミノ酸(配列番
号20)配列は以下のとおりである。
太字のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれシグナル・ペプチドをコード
または構成する。
適当であり得る他の溶菌蛋白としては、メティティン(metittins)、マガイ
ニン、ボンビニン(bombinin)、キセノプシン(xenopsins)、セルレイン、サ
ルコトキシン(sarcotoxins)などが挙げられる。これらのおよび他の有用な溶
菌蛋白のアミノ酸配列は、ここに参考として引用するWO89/04371、特
にその中の表Iに開示されている。
溶菌蛋白をコードする遺伝子を含む、アグロバクテリウムでの導入に適切なベ
クターは、プラスミドの形態であってもよい。かかるプラスミドは、細菌エシェ
リキア・コリ(Escherichia coli)における複製の複製起点、細菌アグロバクテ
リウム・ツメファシエンス(Agrobacteriumu tumefaciens)における複製の複製
起点、遺伝子を植物に転移させるためのT−DNA右縁配列、および形質転換植
物細胞を選択するためのマーカー遺伝子を含有する。特に好ましいのは、低コピ
ーRK2複製起点、ノパリンシンターゼ(NOS)プロモーターおよびNOS
3’ポリアデニル化シグナルの付いたネオマイシンホスホトランスフェラーゼ(
nptII)マーカー遺伝子、およびCaMV 35SプロモーターおよびNOS
3’ポリアデニル化シグナルの付いたβ−グルクロニダーゼ(GUS)マーカー
遺伝子を含有するベクターpBI121である。図2は、T−DNAプラスミド
ベクターpBI121の地図であり、これはクローンテック・ラボラトリーズ・
インコーポレーティッド(Clonetech Laboratories,Inc.)、カリフォルニア
州94303、パロ・アルト、ファビアン・ウェイ4030(4030 Fabian Way
,Palo Alto,California 94303)より入手可能である。他の適切なベクターと
しては、pMON530(図3)およびpMON200(図10参照)などが挙
げられる。溶菌蛋白をコードする遺伝子は該ベクターに挿入される。溶菌蛋白生
産のためには、以下のプラスミドが有用である:アタシン(Attacin)E蛋白(p
rotein)をコードするpLDB15(図15参照);SB−37溶菌ペプチド(
SB−37 lytic peptide)をコードするpLDB1(図10参照);アタシ
ンE蛋白をコードするpLDB2(図4参照);ニワトリ(chicken)リゾチー
ム(lysozyme)をコードするpLDB3(図5参照);T4ファージリゾチーム
(T4 phage lysozyme)をコードするpLDB4;P22蛋白遺伝子13(P2
2 protein gene 13)をコードするpLDB5;P22リゾチーム遺伝子19(P
22 lysozyme gene 19)をコードするpLDB6:SB−37溶菌蛋白をコード
するpLDB7(図10参照);アタシンE蛋白をコードするpLDB8(図6
参照);ニワトリリゾチームをコードするpLDB9(図7参照);SB−37
溶菌蛋白をコードするpLDB10(図11参照);アタシンE蛋白をコードす
るpLDB11(図8参照);ニワトリリゾチームをコードするpLDB12(
図9参照);
SB−37溶菌蛋白をコードするpLDB14(図12参照);T4ファージリ
ゾチームをコードするpLDB16;ゲノムセクロピンB(genomic cecropin B
)をコードするpLDB18;シバ−I溶菌ペプチド(Shiva-I lytic peptide
)をコードするpWIシバ−1;P22リゾチーム遺伝子19をコードするpW
IP19;およびP22リゾチーム遺伝子19をコードするpCa2P19。こ
れらのプラスミドの特徴を以下の表Iに記載する。
表Iおよび表Iのプラスミドベクターの調製に続く実施例から、特にここに参考
慮すると当業者に明らかである。これらすべてのプラスミドは、ここに参考とし
おける細菌および糸状菌疾病耐性の増強:ジャガイモへの適用」(The molecula
rand Cellular Biology of the Potato,Vayda M.E.and Park W.D.(編)、CAB
International,Wallingford,UK,pp.205-221(1990))に開示されている。
また、以下のプラスミドも溶菌ペプチドの生産に有用である:sPR1−シバ−
1融合蛋白をコードするpBPRS1、sCEC−シバ−1融合蛋白をコードす
るpBCCS1、sPR1−SB37融合蛋白をコードするpBPRB37、お
よびsCEC−SB37融合蛋白をコードするpBCCB37。図20を参照さ
れたし。典型的には、アグロバクテリウム・エスピー(Agrobacterium spp.)の
プラスミドベクターによる形質転換は、エム・ホルスターズ(M.Holsters)ら
、「アグロバクテリウム・ツメファシエンスのトランスフェクションおよび形質
転換(Transfection and Transformation of Agrobacterium tumefaciens)」Mo
l Gen Genet 163:181-187(1978)に記載の通りに化学的および熱処理後にプラ
スミドDNAを直接取り込ませることにより、エス・ウェンージュン(S.Wen-j
un)およびビー・フォーデ(B.Forde)、「高電圧エレクトロポレーションによ
るアグロバクテリウム・エスピーの効率的形質転換(Efficient Transformation
of Agrobacterium spp.by High Voltage Electroporation)」、Nucleic Acid
Res 17:8385(1989)に記載の通りにエレクトロポレーション後にプラスミド
DNAを直接取り込ませることにより、ジー・ディッタ(G.Ditta)ら、「グラ
ム陰性細菌用の広宿主域DNAクローニング系:リゾビウム・メリロティの遺伝
子バンクの構築(Broad Host Range DNA Cloning System for Gram-negative Ba
cteria:Construction of a Gene Bank of Rhizobium meliloti)」Proc Natl A
cad Sci USA 77:7347-7351(1981)に記載のとおりのTra+ヘルパー株により仲
介されるエシェリキア・コリ(Escherichia coli)からアグロバクテリウム(Ag
robacterium)へのプラスミドの三親接合転移により、またはアール・サイモン
(R.Simon)ら、「インビボ遺伝子工学の
ための広宿主域動態化系:グラム陰性細菌におけるトランスポゾン突然変異誘発
(A Broad Host Range Mobilization System for in vivo Genetic Engineering
:Transposon Mutagenesis in Gram-negative Bacteria)」Biotechnology 1:78
4-791(1982)に記載のとおりのエシェリキア・コリからアグロバクテリウムへ
の直接接合転移により行う。これらの公開物のすべてはここに参考として引用す
る。
リンゴ類果実の接ぎ穂または根茎栽培品種を溶菌蛋白をコードする遺伝子で形
質転換するもう1つのアプローチは、不活性または生物学的に活性な粒子を栽培
品種組織細胞にて推進させる(propelling)ことによるものである。この技術は
、すべてサンフォード(Sanford)らに対するここに参考により引用する米国特
許第4,945,050号、第5,036,006号、および第5,100,792号
に開示されている。一般に、この手法は、細胞の外表面に浸透させその内部に取
り込まれるのに有効な条件下で不活性または生物学的に活性な粒子を栽培品種組
織の細胞にて推進させることを含む。不活性な粒子を用いる場合、溶菌蛋白の遺
伝子をコードするベクターで粒子を被覆することにより、細胞内にベクターを導
入する。あるいは、標的細胞を該ベクターで取り巻いて、粒子の通った跡から該
ベクターが細胞内に運ばれるようにする。また、生物学的に活性な粒子(例、そ
れぞれ導入しようとしているDNAを含有する乾燥細菌またはバクテリオファー
ジ)を栽培品種細胞組織中に推進させることもできる。
本発明によりリンゴ類果実の接ぎ穂または根茎栽培品種を形質転換したなら、
それを再生させてトランスジェニック・リンゴ類果樹を形成させる。一般に、再
生は、シュート***組織の発芽を許容する適当な増殖調節剤および栄養素を含有
する培地上で形質転換組織を培養することにより行う。アグロバクテリウムの増
殖を抑制し形質転換細胞の発育を選択するために、再生培地に適当な抗生物質を
加える。シュート開始後、組織培養中でシュートを発育させ、マーカー遺伝子活
性についてスクリーニングする。
リンゴ類果実に火傷病耐性を付与する技術は、バラ(Rosaceae)科のいずれか
の群と組み合わせると有用である。これらのうち、リンゴ、西洋ナシ、およびマ
ルメロが特に卓越している。火傷病耐性が付与され得るバラ科の他の種としては
、
本発明に従うと、シャリントウ、サンザシ、シドニア(cydonia)、ピラカンサ
(pyracantha)、ナナカマドなどが挙げられる。
リンゴについては、本発明に従い以下の栽培品種を処理して火傷病耐性を付与
することができる:アディナ(Adina)、アカネ(Akane)、アンナ(Anna)、ア
ントノブカ(Antonovka)、アーカンザス・ブラック(Arkansas Black)、バン
クロフト(Bancroft)、ビーコン(Beacon)、ビュージャデ(Beaujade)、ベレ
・デ・ボスクープ(Belle de Boskoop)、ビッグ・タイム(Big Time)、ブラッ
シング・ゴールデン(Blushing Golden)、ブラエバーン(Braeburn)、ブラム
レイズ・シードリング(Bramley's Seedling)、ブライトゴールド(Britegold
)、チャンピオン(Champion)、チェンナンゴ(Chenango)、チエフタイン(Ch
ieftain)、クレオパトラ(Cleopatra)、コネル・レッド(Connel Red)、コロ
マンデル・レッド(Coromandel Red)、コートランド(Cortland)、コックス・
オレンジ・ピピン(Cox's Orange Pippin)、クリスピン(Crispin)、クリテリ
オン(Criterion)、デイトン(Dayton)、デリシャス(Delicious)(レッド・
デリシャス(Red Delicious)を含む)、デモクラト(Democrat)、デイスカバ
リー(Discovery)、ドーセット・ゴールデン(Dorsett Golden)、ダルセット
(Dulcet)、アーリブレイズ(Earliblaze)、アーリデル(Earlidel)、アーリ
ゴールド(Earligold)、アーリー・コ一トランド(Early Cortland)、アイン
・シェマー(Ein Shemer)、エルスター(Elstar)、エンパイアー(Empire)、
エンプレス(Empress)、フアメウス(Fameuse)、フイエスタ(Fiesta)、フロ
リナ(Florina)、フリーダム(Freedom)、フジ(Fuji)、ガラ(Gala)、ギャ
ラクシー(Galaxy)、ジュネーブ・アーリー(Geneva Early)、ジンジャーゴー
ルド(Gingergold)、グロスター(Gloster)、ゴールデン・ラセット(Golden
Russet)、ゴールデン・デリシャス(Golden Delicious)、ゴールデン・シュプ
リーム(Golden Supreme)、グラニー・スミス(Granny Smith)、グラベンシュ
タイン(Gravenstein)、グリーンスリーブス(Greensleeves)、グライムズ・
ゴールデン(Grimes Golden)、ハラルソン(Haralson)、ホーグアン(Hauguan
)、ハウシュアイ(Haushuai)、ハニーゴールド(Honeygold)、ハツアキ(Hat
suaki)、ヒメカミ(Himekami)、ホクト(Hokuto)、イダレッド(Idared)、
イワカミ(Iwakami)、ジェームズ・グリーブ(James Grieve)、ジャーセイマ
ッ
ク(Jerseymac)、ジョナフリー(Jonafree)、ジョナゴールド(Jonagold)、
ジョナゴアード(Jonagored)、ジョナリシャス(Jonalicious)、ジョナマック
(Jonamac)、ジョナレッド(Jonared)、ジョナスティ(Jonasty)、ジョナサ
ン(Jonathan)、ジョニー(Jonnee)、ジョレッド(Jored)、カーミジン(Kar
mijn)、キタカミ(Kitakami)、ラクストンズ・スパーブ(Laxton's Superb)
、リバティー(Liberty)、ロディ(Lodi)、ルラレッド(Lurared)、リスゴー
ルデン(Lysgolden)、マコウン(Macoun)、マイゴールド(Maigold)、マック
シェイ(McShay)、マックイントシュ(McIntosh)、メルローズ(Melrose)、モ
リエス・デリシャス(Mollies Delicious)、モンロー(Monroe)、ノーザン・
スパイ(Northern Spy)、ノースウエスタン・グリーニング(Northwestern Gre
ening)、ノバ・エアシグロ(Nova Easygro)、ノバマック(Novamac)、オリン
(Orin)、オザーク・ゴールド(Ozark Gold)、ポーラレッド(Paulared)、ピ
ンク・レディー(Pink Lady)、プライマ(Prima)、プライム・ゴールド(Prim
e Gold)、プリミシア(Primicia)、プリンセッサ(Princessa)、プリシラ(P
riscilla)、ピュアゴールド(PureGold)、ラルス・ジャネット(Ralls Janet
)、ラリタン(Raritan)、レッド・バロン(Red Baron)、レッドシェフ(Redch
ief)、レジェント(Regent)、レイネ・デス・レイネッテス(Reine des Reine
ttes)、レイネッテ・ドウ・カナダ(Reinette du Canada)、アール・アイ・グ
リーニング(R.I.Greening)、ローム・ビューティー(Rome Beauty)、ルビ
ネッテ(Rubinette)、サンサ(Sansa)、サヤカ(Sayaka)、セカイイチ(Seka
i-ichi)、センシュウ(Senshu)、シャムロック(Shamrock)、シズカ(Shizuk
a)、サー・プライズ(Sir Prize)、スムージー(Smoothee)、スパルタン(Spa
rtan)、ステイマン(Stayman)、ワインサップ(Winesap)、スピゴールド(Sp
igold)、スプレンダー(Splendor)、ステート・フェア(State Fair)、スタ
ーマー ・ピピン(Sturmer Pippin)、サマーデル(Summerdel)、サマーレッ
ド(SummerRed)、サマー・トリート(Summer Treat)、サンダウナー(Sundown
er)、サンライズ(Sunrise)、スイート・シックスティーン(Sweet Sixteen)
、タナカ(Takana)、トンプキンズ・キング(Tompkins King)、ツガル(Tsuga
ru)、トウエンテイー・オンス(Twenty Ounce)、トールマン・スイート(Tolm
an Sweet)、タイデマンズ・アーリー・ウォーセスター(Tydeman's Early Worc
ester)、バイキング(Viki
ng)、ビスタ・ベラ(Vista Bella)、ウェルシー(Wealthy)、ウイリアムス・
プライド(Williams Pride)、ワインサップ(Winesap)、ウィンター ・バナ
ナ(Winter Banana)、ウォルフ・リバー(Wolf River)、ウォーセスター・パ
ーメイン(Worcester Pearmain)、ヤタカ(Yataka)、イェロー .ニュータウ
ン(Yellow Newtown)、ヨコ(Yoko)、ヨーク・インペリアル(York Imperial
)、2085、および他のガラXスプレンダー(Gala X Splendor)クローンな
ど。
適切なリンゴ根茎としては、M.7、M.9、M.26、M.27、MM.1
06、MM.111、メルトン(Merton)793、マルバ・カイド(Maruba kai
do)、ブダゴフスキー(Budagovsky)9、マーク(Mark)、オタワ(Ottawa)3
、および実生(すなわち、未知の親の種子から増殖した根茎)などが挙げられる
。
適切な欧州ナシ(ピルス・コミュニス(Pyrus communis))としては、コンフ
ァレンス(Conference)、ウィリアムズ・ボン・クレチエン(Williams Bon Cre
tien)(バートレット(Bartlett))、ドクター ・ジュレス・ガイオット(Dr
.Jules Guyot)(リモネラ(Limonera))、ブランクイラ(Blanquilla)(ス
パドナ・エスティバ(SpadonaEstiva))、コスシア(Coscia)(エーコリニ(E
rcolini))、アベイト・フェテル(Abate Fetel)、ドゥアンジョウ(d'Anjou
)、ベウレ・ボスク(Beurre Bosc)、コミス(Comice)、パックハムズ・トラ
イアンフ(Packham's Triumph)、パッセ・クラッサネ(Passe Crassane)など
が挙げられる。
適切なアジアナシ(ピー・ピリフォリア(P.pyrifolia))としては、シンセ
イキ(Shinseiki)、20世紀(20th Century)、ホスイ(Hosui)、シンコ(Sh
inko)、チョージューロー(Chojuro)、コスイ(Kosui)、ニイタカ(Niitaka
)などが挙げられる。
適切なナシ根茎としては、ピルス・カレリアナ(Pyrus calleryana)、ピー・
ベトゥラエフォリア(P.betulaefolia)(ライマーズ(Reimer's))、クイン
ス(Quince)、オールド・ホームXファーミングデイル(Old Home X Farmingda
le)、オールド・ホーム(Old Home)および実生などが挙げられる。
以下、実施例により本発明の具体例を例示するが、これらは決して本発明の範
囲を限定するものではない。
実施例実施例1-プラスミド・ベクターpLDB10の作製
SB-37溶菌蛋白をコードする遺伝子を有するプラスミド・ベクターpLD
相補的オリゴヌクレオチドとプラスミドとの酵素的な連結を要する。
該遺伝子配列は、6つのフラグメントに分割されている。アッパー・ストラン
ド(コード/鎖)は、3つのオリゴヌクレオチド;配列番号21(ヌクレオチド
1-42);配列番号22(ヌクレオチド43-82);配列番号23(ヌクレオ
チド83-122)よりなり、ロウアー・ストランド(アンチセンス鎖)は3つ
のオリゴヌクレオチド;配列番号24、配列番号25、および配列番号26によ
り形成される。各フラグメントの配列を以下に示す。中間ベクターの第1の選択
は、BglII粘着末端で開始しEcoRI粘着末端で終了するよう設計した合
成遺伝子pMON530である。2つの制限部位は、太字で示す:
配列番号21-26さる名称を有する6つのフラグメントを、T4・DNAリ
ガーゼで連結し120bpのSB-37フラグメントを作製する。
pLDB7を作製する工程を図10に示し、以下に記載する。プラスミド・ベ
クターpMON530を、BglIIおよびEcoRIで消化した後に、子ウシ
腸アルカリ・ホスファターゼ(「CAP」)で処理し、SB-37遺伝子をコー
ドする6つの重複オリゴヌクレオチドをそのフラグメントに連結してプラスミド
・ベクターpLDB1を作製する。次いで、プラスミド・ベクターpLDB1を
BStEIIおよびHindIIIで消化し、得られた3.7kbのフラグメン
トを回収する。プラスミド・ベクターpMON200をBStEIIおよびHi
ndIIIで消化した後に、得られた6.5kbのフラグメントを回収し、該フ
ラグメントをプラスミド・ベクターpLDB1由来の3.7kbフラグメントに
連結してプラスミド・ベクターpLDB7を作製する。
プラスミド・ベクターpLDB10は、図11に示す工程系列によりプラスミ
ド・ベクターpLDB7から作製する。することにより、この工程を行うと、C
aMV35Sプロモーターの変異型を有するキメラSB-37遺伝子の構築によ
って10倍高い発現レベルが保証される。この工程において、プラスミド・ベク
ターpLDB7をEcoRVおよびSaclで消化して、切断(-90)CaM
V35S-SB37-NOS3’フラグメントを取り出し、それをプラスミド・ベ
クターpLDB102にサブクローン化する。プラスミド・ベクターpLDB1
02をEcoRVおよびSacIで消化した後に、該EcoRV/Saclフラ
グメントをプラスミド・ベクタ−pCa2に連結してプラスミド・ベクターpL
DB103を作製する。次いで、プラスミド・ベクターpLDB103からのH
indIIIフラグメントをプラスミド・べクターpBI121にサブクローン
化してプラスミド・ベクターpLDB10を作製する。実施例2-プラスミド・ベクターpLDB14の作製
図12に示すごとく、(出典明示して本明細書の一部とみなす)デスティファ
ノ・ベルトラン理論より、プラスミド・ベクターpLDB1(実施例1で作製)
をBglIIおよびEcoRIで消化し、HincIIで消化しCAPで処理し
た後のプラスミド・ベクターpUC19に連結する。次いで、得られたプラスミ
ド・ベクターpLDB101をBamHIおよびPstIで処理してSB-37
をコードする遺伝子を切り出し、次いで、これをプラスミド・ベクターpIG1
のBamHI/PstIサイトにクローニングしてプラスミド・ベクターpLD
B
141を作製する。次いで、2つのHindIIIサイトを用いて、プラスミド
・ベクターpLDB141からキメラPiII5’-PiII3’カセットを切
り出し、これをプラスミド・ベクターpBI121の対応サイトに挿入してプラ
スミド・ベクターpLDB14を得る。実施例3-プラスミド・ベクターpLDB15の作製
(出典明示して本明細書の一部とみなす)デスティファノ・ベルトラン理論に
記載したごとく、該アタカシンE遺伝子は、プラスミド・ベクターpBR322
のPstIサイト中に、564塩基対のコード配列および159塩基対の3’-
非コード領域(すなわち、723塩基対)を有する完全なcDNA配列として、
プラスミド・ベクターpCP521中に存在する。このcDNAのヌクレオチド
(配列番号27)配列および番号付けアミノ酸(配列番号28)配列を、アタシ
ン・クローンpCP521のインサートの制限地図と共に図13に示す。この図
においては、推定ポリアデニル化シグナルにアンダーラインを付す。
図14は、プラスミド・ベクターpLDB202を作製するのに用いた工程の
模式図である。示すごとく、pUC19のBanIIサイトがcDNA中のポジ
ション11にあるBanIIサイトに隣接して位置するように、プラスミド・ベ
クターpCP521からのPstI-723塩基対フラグメントをpUC19に
サブクローン化する(図12参照)。次いで、得られたプラスミド・ベクターp
LDB201を、BanIIで消化し、BglIIの後に開始コドンを取り囲む
植物共通のAACAATG配列を含有する29-merのオリゴヌクレオチドお
よびBanII突出を有するAsp1-Ala2-hIS3-Gly4-Ala5に
連結してプラスミド・ベクターpLDB202を作製する。
図15の模式工程図により、プラスミド・ベクターpLDB202を用いてプ
ラスミド・ベクターpLDB15を作製する。工程のこの段階において、プラス
ミド・ベクターpLDB202中の該アタシンEコード配列が、BglII/E
coRVフラグメントとしてプラスミド・ベクターpLDB202から切り出さ
れ、pIG1のBamHI/HincIIサイトにクローン化されて、プラスミ
ド・ベクターpLDB151が作製される。プラスミド・ベクターpLDB
151のHindIIIサイトの間に位置するキメラ遺伝子フラグメントを切り
出し、プラスミド・ベクターpBI121に挿入してプラスミド・ベクターpL
DB15を作製する。実施例4-植物組織培養ならびにプラスミド・ベクターpLDB10、
pLDB14およびpLDB15での形質転換
形質転換に用いたリンゴ栽培品種は、根茎M.26であった。シュート片増殖
に用いた方法および培地、ならびに発根(rooted)-植物栽培品種は、増殖培地が
1.0mg/Lのベンジルアデニン、0.3mg/Lのインドール酪酸、および0
.2mg/Lのジベレリン酸(全ジベレリンのA390%)を含有する以外は、(
参照して一部とみなす)ジェイ・エル・ノレリら、(J.L.Norelli et al.)
「イン・ビトロおよびグリーンハウスで生育させたズミ・リンゴ種ノボル植物に
対するエルウィニア・アミロボラ株の病原性」(Phytopathology;78:129
2-97(1988年))に記載されている。
実施例1-3のバイナリー・ベクターpBI121((ここに参照して引用す
る)アール・エイ・ジェファーソンら、(R.A.Jefferson et al.)「GU
S融合:高等植物における感受性および多用途遺伝子融合マーカーとしてのβ-
グルクロニダーゼ」(EMBO J;6:3901-07(1987))、pL
DB10、pLDB14またはpLDB15を含有する無毒化アグロバクテリウ
ム・ツメファシエンス株LBA4404((ここに参考として引用する)エイ・
ホケマら、(A.Hoekemaet al.)「アグロバクテリウム・ツメファシエンス
のティイ・アイープラスミドのビルおよびティ-領域の分離に基づくバイナリー
植物ベクター・ストラテジー」(Nature;303:179-80(1983))
を、植物形質転換に用いた((ここに
national;205−21(1990))。該細菌は、カド523ブロス(Kado
523broth)((参照して一部とみなす)シイ・アイ・カドら、(C.I.
Kado et al.)「アグロバクテリウム、コッリネバクテリウム、エルウィニア
、シュードモーナスおよびザンソモーナス単離用の選択培地」(Phytopatholog
y:60:969-
76(1970))中で、28℃にて一晩増殖させ、100μMのアセトシリン
ゴンを含有するpH5.4、0.5×ムラシゲースクーグの微量および主要成分
(Murashige-Skoog micro- and macro-element)((参照して一部とみなす)
ティ・ムラシゲら、(T.Murashige et al.)「高速増殖用の改変培地および
タバコ組織培養でのバイオアッセイ」(Physiol。Plant;15:473-97
(1962))に再懸濁し、600nmの吸光度測定で2×109cfu/mlの
密度に調整した。形質転換に用いる葉は、発根3週齢または8週齢のイン・ビト
ロ培養植物から収穫した。該葉は、葉が拡がる活性段階でさえまだ十分に葉を広
げていた。葉は、外科用メスで3-5mm幅の断片に横向きにスライスし、アグ
ロバクテリウム・ツメファシエンス接種源に5分間置き、乾燥ブロットし、抗生
物質を含まない再生培地上に背軸側を上にして置いた。再生培地は、(ここに参
考として引用する)エム・ウェランダー(M.Welander)「成熟リンゴ樹から
イン・ビトロで生育させたシュートの葉および茎断片からの植物再生」(J.P
lant Physiology;132:738-744(1988)により記載されている
5mg/Lベンジルアデニンおよび0.1mg/Lの1-ナフタレン酢酸を含有す
る修飾N6培地であった。植物を暗所下、室温にて48時間インキュベートして
、アグロバクテリウム・ツメファシエンスにより感染させ形質転換させた。次い
で、250μg/mlのセフォタキシムまたは10μg/mlのパロモマイシンお
よび250μg/mlのセフォタキシムを含有する再生培地に葉を移した。さら
なる処理において、40μg/mlのパロモマイシンおよび250μg/mlのセ
フォタキシムを含有する再生培地に4日間、次いで、セフォタキシムのみを含有
する再生培地に葉片を移した。再生培地上の葉片を、最初に暗所下、室温(21
−30℃)にて2週間置き、次いで、40μmol・m2・sec-1、室温(2
1-30℃)にて16時間置いた。すべての処理において、葉断片は4週後に新
たな培地に移した。
アグロバクテリウム・ツメファシエンスで接種した9週間後に、全ての再生葉
片を、それらを以前に培養したのと同一の再生培地(50ml)を含有するベビ
ー・フード・ジャーに移した。4週間後に、.再生培養物を、1または幾つかの
***組織を含む片に分割し、50μg/mlカナマイシンを含油する増殖培地に
置いた。
6週間後にカナマイシン培地上で緑色を維持しているシュー卜片を、GUS活性
につきスクリーニングした。
推定されるトランスジェニック植物におけるGUSの存在は、(引用して一部
とみなす)アール・エイ・ジェファーソンら、(R.A.Jefferson et al.)
「GUS融合:高等植物における感受性および多用途遺伝子融合マーカーとして
のβ-グルクロニダーゼ」(EMBO J;6:3901-07(1987)によ
り記載されるごとき、4-メチルウンベリフェリル-β-D-グルクロニド(「MU
G」)の4-メチルウンベリフェロン(「MU」)への分解に基づく蛍光アッセ
イを用いて測定した。予備アッセイにおいて、50〜150mg新鮮重量の葉組
織を500μlの抽出緩衝液中にて摩砕した(前掲)。100μlアリコートの
葉抽出液を、マルチウェル・マイクロタイター・ディッシュ中にて2mMのMU
G100μlと混合した。該混合液を37℃にて一晩インキュベートし、蛍光用
紫外線照明下で観察した。試料時間、4試料時間に取り出した20μlのアリコ
ートを用いて活性速度を算出し、アッセイを200分まで行う以外の定量GUS
アッセイは、アール・エイ・ジェファーソン(R.A.Jefferson)により記載
されるごとく行った。定量GUSのデータは、対数換算によりノーマライズした
。アッセイ時間にわたるMUの蓄積は線状であって、該アッセイ時間の間に漸近
線に近付いたり線状から離れることはなかった。
5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-グルクロン酸(「X-gluc」)で
処理する前にハンド断片(hand section)をホルムアルデヒド中で固定しない以
外は、(ここに参考として引用する)アール・エイ・ジェファーソンら、(R。
A。Jeffersonet al.)「GUS融合:高等植物における感受性および多発現
遺伝子融合マーカーとしてのβ-グルクロニダーゼ」(EMBO J;6:39
01−07(1987)に記載されるごとく、GUS活性の局在性につき細胞化
学的アッセイを行った。
nptII活性は、25または50μg/mlのカナマイシン存在下で、シュ
ート片が根にイン・ビトロ(in vitro)生育する能力により評価した。5つのシ
ュート片を含む単独のベビー・フード・ジャーの発根培地を反復単位とした。処
理当たり5〜25個のジャーとなった。
サザン分析を行うために、(ここに参考として引用する)エヌ/ジェイ・ガウ
エル(N.J.Gawel)、「MusaおよびIpomoea用の修飾CTAB・DNA抽出
法」(Plant Mol.Biol.Rep.;9:262-66(1991)の修飾方法
を用いて新鮮葉組織から植物DNAを単離した。修飾方法は、1)該葉組織-抽
出緩衝混合液を37℃にて45分間インキュベートし、2)DNAをRNAse
で処理した後に、該DNAをプロテイナーゼK(1.5mg/ml)で55℃に
て90分間処理した。10μgのゲノムDNAをHindIIIで消化し、1.1
V/cmにて16時間、トリス-酢酸-EDTA緩衝液中の1%アガロースゲルを
通してサイズ分画した後に、アルカリ条件下にてジーンスクリーンプラス(Gen
eScreenPlus)(デュポン社(DuPont Co.)マサチューセッツ州、ボスト
ン(Boston,MA))に移し、水性溶液中で>109cpm/μgの比活性を有す
る200ngの32P標識DNAプローブと65℃にてハイブリイズさせた後、極
めて厳密に洗浄した((ここに参考として引用する)ジェイ・サムブルックら、
(J。Sambrook et al.)「モレキュラー ・クローニング:研究室マニュア
ル」(Cold Spring Harbor Laboratory Press;第2版、1989)。アタ
シン・プローブは、pLDB15の2.2kbのHindIIIフラグメントで
あって、ジャガイモからのプロテイナーゼ・インヒビターII遺伝子の5’およ
び3’領域ならびに該アタシン遺伝子よりなる。該GUSプローブは、pBI1
21の約2.1kbのBamHI-EcoRIフラグメントであって、アグロバ
クテリウム・ツメファシエンスからのGUS遺伝子およびノパリン・シンテース
・ターミネーターよりなる。
該nptIIプローブは、pBI121の約1.9kbのPstいフラグメント
であって、ほぼ全体のnptII遺伝子およびノパリン・シンテース・ターミネ
ーターよりなる。実施例5-トランスジェニック植物の回収
アタシンE蛋白をコードする遺伝子を含む、T1と命名したM.26トランスジ
ェニック系を得た。LBA4404(pLDB15)で接種し、10μg/ml
のパロモマイシンおよび250μg/mlのセフォタキシムを含有する培地上で
選抜した8週齢の発根したイン・ビトロ培養植物から収穫したM.26葉片から
T1を得
た。T1は8週齢の植物から収穫した葉から得たとはいえ、3週齢の発根植物か
らの葉片(0.22)は、8週齢植物のもの(0.11)よりも有意に高率で再
生した(F=7.98、df=1、63)。250μg/mlのセフォタキシム
(0.23)、10μg/mlのパロモマイシンおよび250μg/mlのセフォ
タキシム(0.16)あるいは、40μg/mlのパロモマイシンおよび250
μg/mlのセフォタキシムで4日間、次いで、250μg/mlのセフォタキシ
ムを含有する培地で培養した場合には、再生した葉片の比率に有意な差はなかっ
た(F=2.63、df=2、62)。3週齢(0.0)または8週齢の植物(
0.0033)から葉を収穫した場合にも(F=1.17、df=1、63);
葉断片をセフォタキシムのみ(0.0)、10μg/mlのパロモマイシン+セ
フォタキシム(0.0083)、または40μg/mlのパロモマイシン+セフ
ォタキシムで4日間、次いで、セホタキシムのみ(0.0)を含む培地上で培養
して得られた、トランスジェニック植物を供する葉片の比率にも有意な差はなか
った。
nptIIトランスジェニック植物につき選抜するためのパロモマイシンを含
有する培地上で再生できない多数の非-トランスジェニック植物があった。10
μg/mlのパロモマイシンを含有する培地からの36再生体のうち1体のみが
トランスジェニックであり(2.2%)、40μg/mlのパロモマ,イシンを
含む培地上で4日間培養した25再生体では全くトランスジェニックがなかった
。非-パロモマイシンを含む培地-対-パロモマイシンを含む培地上で培養した場
合に再生する葉片において有意な差が得られなかったことは、この実験で用いた
選抜圧(selection pressure)が低過ぎたことを示している。最近の研究により
、25〜63μg/mβのパロモマイシンで連続選抜することがnptIIトラ
ンスジェニックM.26細胞を選抜するのに最適であることが示された。
表IIに示すごとく、トランスジェニック系T1がnptIIおよびGUS活
性を有する一方、非ットランスジェニックM.26は有しなかった。
aカナマイシン存在下で発根する組織培養シュートの能力。発根は、発根培地
上の4週栽培後に観察し、抗生物質の不在下で起きた発根のパーセントとして表
す(M.26およびT1に関しては、各々、76%および48%)。
b蛍光アッセイにより測定したMUGからMUへの転換速度(ナノモル/分/m
g新鮮重)。
nptII活性の変動分析は、M.26およびT1のnptII活性の間の有意
な差(F−51.56、df=1、146)ならびにカナマイシン濃度相互作用
による有意な品種(F=57.72、df=2、1452)があることを示し、
発根培地中のカナマイシンの存在に対してM.26およびT1が異なって反応し
ていることを示した。GUS活性の変動分析は、M.26およびT1のGUS活
性の間に有意な差があることを示した(F=13.35、df=1、14)。
T1の形質転換に用いたアグロバクテリウムのバイナリー・ベクターであるp
LDB15((ここに参考として引用する)エル・デステファノーベルトランら
、
(CAB International;205-21(1990)は、pBI121((こ
こに参考として引用する)アール・エイ・ジェファーソンら、(R.A.Jeffe
rson et al.)「GUS融合:高等植物における感受性および多用途遺伝子融合
マーカーとしてのβ-グルクロニダーゼ」(EMBO J;6:2091-07(
1987)のHindIIIサイト中に挿入された約2400塩基対のフラグメ
ントを含有する。このインサートは、ジャガイモからのプロテイナーゼ・インヒ
ビターII遺伝子の5’領域の1.3kbおよび該プロテイナーゼ・インヒビタ
ーII遺伝子の
3’領域の約300bpを含有する。pLDB15のT-DNAの規則的な配列
順序は右側のT-DNAボーダー、nptII遺伝子、2400bpのアタシン
EのHindIIフラグメント、GUS遺伝子および左側のT-DNAボーダー
である(図15)。該アタシンE遺伝子は、アグロバクテリウムにより媒介され
る形質転換の間に植物に移行するT-DNA上のHindIIIサイト側面に並
んでいるため、プラスミドDNAまたはトランスジェニックゲノム植物DNAを
消化すればアタシンE遺伝子プローブとハイブリダイズする2400bpのフラ
グメントが得られるにちがいない。T1のサザン・ハイブリダイゼーション分析
は、pLDB15(図16A、レーン3)およびT1(レーン5)からの約24
00bpのアタシン遺伝子プローブにハイブリダイズするが、pBI121(レ
ーン2)またはM.26(レーン4)からのものはハイブリダイズしなかった(
図16A)。
該GUS遺伝子はT−DNAの左側ボーダーおよびHindIIIサイト側面
に並んでいるため、プラスミドDNAへのGUSのハイブリッド形成およびトラ
ンスジェニックゲノムDNAをHindIIIで消化すれば、異なったサイズの
ハイブリダイズ・フラグメントが得られるにちがいない。GUS遺伝子プローブ
とハイブリダイズする該pLDB15のDNAのフラグメントは、pBI121
ハイブリダイズ・フラグメントと同一サイズにちがいない(図16A)。トラン
スジェニックゲノムDNA中のハイブリダイズ・フラグメントのサイズは、未知
のサイズであろう。というのは、それはT-DNA(HindIIIサイトない
しT-DNAの左側ボーダー)および植物DNA(導入サイトないし植物の次ぎ
のHindIIIサイト)の両方を含有するであろうからである。同様にして、
nptIIはT-DNA右側ボーダーおよびHindIIIサイトに並んでおり
、トランスジェニックゲノムDNAのnptIIのハイブリッド形成をHind
IIIで消化すれば、プラスミドDNAまたはGUSにハイブリダイズするもの
のいずれかから異なったサイズのハイブリダイズフラグメントが得られるにちが
いない。
HindIIIで消化したpBI121とpLDB15のDNAのハイブリダ
イゼーションは、pBI121のほぼ全長サイズのフラグメントが、GUS遺伝
子プローブおよびnptIIプローブ(図16B)レーン2および3)とハイブ
リダイズすることを示した。T1ゲノムDNAのハイブリダイゼーションは、G
USプローブとハイブリダイズする特異なサイズ(約7.5kb)のフラグメン
トを示した。pBI121のサイズのフラグメントも、M.26およびT1ゲノ
ムDNA試料においてGUS遺伝子プローブとハイブリダイズした。このバンド
は、恐らく、pBI121とゲノムDNA試料の汚染のためであった。ゲノムD
NAの汚染は、pbI121を含有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス
での植物組織のコロニー形成、DNA単離中の汚染、またはゲル電気泳動の間の
DNA試料の移動により起こり得た。しかしながら、植物ゲノムDNA試料中に
汚染pBI121が存在するにも拘わらず、GUSとハイブリダイズする特異な
フラグメントのT1ゲノムDNAの存在(図16B、レーン5;7.5kb)は
T1形質転換の証拠である。
T1の形質転換は、nptIIプローブとのハイブリダイゼーションにより支
持される(図16C)。T1ゲノムDNAとnptIIプローブとのハイブリダ
イゼーションの結果、特異なサイズの2つの断片(約5.9および3.4kb)
がハイブリダイズした(図16C、レーン5)。このことは、形質転換工程の間
にnptII遺伝子が複製したことを示しているのかもしれない。影の7.5k
bフラグメントは、GUS遺伝子およびnptIIプローブの両方に共通のノパ
リン・シンテース・ターミネーターとハイブリダイズするGUSフラグメントで
ある(図16C、レーン5)。GUSプローブに関するごとく、M.26および
T1ゲノムDNA試料のnptIIプローブとのハイブリダイゼーションはpB
I121での汚染を示す。実施例6-トランスジェニックの遺伝子型の安定性
リンゴは、栄養繁殖され有***雑により栽培品種特性が失われているため、ト
ランスジェニック植物のR0代は、ほとんど改良栽培品種の選抜に用いられるで
あろう。従って、R0トランスジェニック遺伝子型の安定性は重要である。
T1’形質転換体のゲノタイプの安定性を試験するために、いずれのnptI
Iに対するアミノグルコシド選抜もなしにT1葉片から植物を再生させ、次いで
GUSおよびnptIIマーカー遺伝子の存在につき評価した。T1再生体にお
けるGUS活性は、MUGのMUへの転換についての定性蛍光アッセイを用いて
評価し、nptII活性は、25μg/mlのカナマイシンを含有する培地中で
再生体が発根する能力を試験することによって評価した。評価した40体のT1
再生体のうち、40体全てが陽性GUSおよびnptII活性の両方を有してい
た。
T1葉組織の細胞化学的観察はキメラのいずれの事実も示さなかった。GUS
活性は、横方向で切断した葉の全ての細胞層で検出された。同様にして、茎上の
5つの連なった葉をアッセイした場合、全ての葉序的部位からの葉が全体的にG
US活性を有していた。
加えて、アミノグリコシド選抜をかけていないシュート片増殖培地上の25体
を超えるT1の継代栄養繁殖イン・ビトロ繁殖体においては、GUSまたはnp
tII活性の明らかな欠失はなかった。
選抜なしに繁殖および増殖後のT1トランスジェニック遺伝子型の再生試験、
細胞化学的観察、および観察された安定性は、T1はキメラではなく遺伝的に安
定であることを示している。実施例7-イン・ビトロで検出されたトランスジェニック・リンゴ
の火傷病耐性
トランスジェニックT1のイン・ビトロ生育植物を、それらの火傷病耐性につ
き評価した。接種源を1×104〜1×107cfu/mlの範囲の5またはそれ
を超える種々の濃度で調整した以外は、ノレリら、(Norelli et al.)ら、((
ここに参考として引用する)「イン・ビトロおよびグリーンハウスで生育させた
ズミ・リンゴ種のノボラ植物に対するエルウィニア・アミロボラ株の病原性」(
Phytopathology:78:1292-97(1988年))により記載されている
ごとく、火傷病の主な原因であるエルウィニア・アミロボラで組織培養植物を接
種した。50%の植物をエルウィニア・アミロボラに感染させるのに要する接種
源用量(対数10cfu/mf単位の平均ID50)をプロビット方法(SAS
、SAS研究所(SAS Institute Inc.)、ノースカロライナ州、キャリ
ー(Cary,NC))により算出し、植物耐性を測定するのに用いた。50%の植
物が感染するのに要
する接種源用量が大きい程、火傷病に対する品種の耐性も高くなる。栽培品種M
.26およびリバティーが、各々、感受性および耐性の標準栽培品種として含ま
れていた。エルウィニア・アミロボラ株Ea273を接種源に用いた。評価は3
回反復し、ID50値は3評価を平均した。
図17に示されるごとく、T1、M.26(親栽培品種)およびライブラリー
(火傷病耐性栽培品種)が、各々、5.4、4.4および5.6のID50レー
トを有していたことは、アタシンE蛋白をコードする遺伝子を含むT1トランス
ジェニックの火傷病耐性が感受性親栽培品種M.26に比して上昇したことを示
している。実施例8-トランスジェニック・リンゴ植物の火傷病耐性
T1のイン・ビトロ繁殖植物をグリーンハウスでの生育に適応させ、一本のシ
ュート植物として生育させた。エルウィニア・アミロボラで接種した後に進行し
たシュート長のパーセントを測定することにより植物体の火傷病耐性を評価した
。接種は、接種源濃度が5×106cfu/mlである以外は、(ここに参考とし
て引用する)エイチ・エス・アルドウィンクル(H.S.Aldwinckle)およびジェ
イ・エル・プレクゼウスキー(J.L.Preczewski)「エルウィニア・アミロ
ボラによる侵入に対するリンゴ栽培品種の末端シュートの反応」(Phytopathol
ogy;66:1439-44(1976))により以前に記載されている。栽培品
種M.26が感受性標準栽培品種として含まれていた。エルウィニア・アミロボ
ラ株Ea273を接種源に用いた。図18は、トランスジェニックT1および親
栽培品種M.26の経時的な疾病の進行を示している。
T1は、M.26より遅い速度で疾病が進行した。M.26およびT1につい
ての疾病進行曲線の傾きに、3日目〜16日目で有意な差があった(T=-2.
37、df=124、p=0.019;×値の非正常に基づく1/Xに対する傾
きに基づいている)ことは、T1が火傷病に対してさらに耐性であることを示し
ている。
かかる速度-低下耐性は、(ここに参考として引用する)ダブリュ・フライ(
W.Fry)「植物疾病管理の原理」203-04、219-34(1982)に記
録されているごとく。伝染進行速度を抑制する植物能力のよく知られた指標であ
る。この型の耐性は、疾病進行に好都合な環境条件または多数の病原菌集合によ
って
圧倒され得るが、それは、しばしば疾病管理に用いられており、他の管理技術と
効率的に組合せることができる(前掲、228-231)。このことは、ファイ
トフトーラ・インフェスタンス(Phytophthora infestans)により引き起こさ
れるジャガイモ疫病の制御において実証された。これおいては、速度-低下耐性
を化学的な制御実践と効率的に組み合わせて、用いた速度-低下耐性の効果は0
.5〜0.7Kg殺菌剤/ヘクタールに相当すると定量された((出典明示して
本明細書の一部とみなす)ダブリュ・イー・フライ(W.E.Fry)「ジャガイモ
疫病の進行に対する多遺伝子耐性および保護殺菌剤の組み合わせ効果」(Phyto
pathology;65:908-911(1975年)および(ここに参考として引用
する)ダブリュ・イー・フライ(W.E.Fry)「ジャガイモ疫病の組合せ制御
に対するジャガイモ栽培品種の一般的な抵抗性および殺菌剤効果の定量」(Phy
topathology;68:1650-1655(1978))。リンゴ根茎の火傷病感
染の場合においては、速度-低下耐性により、植物が生存して感染するのに十分
な疾病進行に速度低下することができた。感染が始まった後は、秋および冬にお
ける不都合な条件により病害の進行が阻害されるであろう。速度-低下耐性によ
り、根茎癌腫の形成からの病害を防ぐのに十分に病害進行を阻害できる。次いで
、樹木の損失が回避されよう。このことは、M.26および他の感受性のリンゴ
根茎に対して重要な利点となるであろう。実施例9-T1中のアタシンE遺伝子発現のノザン分析
T1中のアタシンEをコードする遺伝子の発現は、T1におけるアタシンEメ
ッセンジャーRNA(mRNA)の存在を示すノザン分析によって証明した。
葉を収穫する72時間前に火傷病病原菌であるエルウィニア・アミロボラを接
種したT1植物から葉を収穫し、葉組織から全RNAを単離した。膨大な数の真
核生物mRNAはその3’末端でポリアデニル化されているため、オリゴ(dT
)-セルロース上のアフィニティー・クロマトグラフィーによってバルクの細胞
性RNAからmRNAを精製した。アガロースゲルはホルムアルデヒドを含有す
るが、次いで、電気泳動によりポリ(A)RNAを変性条件下にて分画した。次
いで、分画したRNAをニトロセルロース膜上に真空ブロットし、放射線的に標
識した
アタシンE・DNAプローブとハイブリダイズさせた。該アタシンEプローブは
、pLDB15の2400bpのアタシンE・HindIIIフラグメントであ
る。
アタシンEの発現は、M.26mRNAには存在しないT1mRNA中に存在
するフラグメントに対する該アタシンEプローブのハイブリダイゼーションによ
り支持されている(図19参照)。実施例10-プラスミドベクターpBPRS1の作製
セクロピン(cecropin9B様ペプチドであるシバ-1(Shiva-1)をコードす
る遺伝子が膜通過シグナルペプチド(transit signal peptide)であるsPR1
に融合して、植物細胞からのセクロピンの輸送が可能なようにプラスミドベクタ
ーpBPRS1(図20参照)を構築し、該遺伝子をCaMV(Ca235S)
の増強35Sプロモーターの制御下に設置した。簡単には、ベクタープラスミド
にクローン化した重複合成オリゴマーからシバ-1をコードする遺伝子を合成し
た。次いで、タバコ由来のPR蛋白1bのsPR1膜通過シグナルペプチドをコ
ードする重複合成オリゴマー((ここに参考として引用する)デネッケ・ジェイ
(Denecke,J.)、ボターマン・ジェイ(Botterman,J.)およびデブラエア
・アール(Deblaere,R.)、「植物細胞における蛋白分泌は欠失経路を介して
起こり得る」(The Plant Cell;2:51−59(1990))を、シバ-1
遺伝子の5’末端に融合した。次いで、融合ペプチドをコードするDNAフラグ
メント(配列番号17)をpCA2((ここに参考として引用する)ケイ・アー
ル(Kay,R.)、チャン・エイ(Chan,A.)、ダーリー・エム(Daly,M
.)およびマクファーソン・ジェイアール(McPherson,Jr.)「CaMV3
5Sプロモーター配列の複製は植物遺伝子の増強エンハンサーを生成する」(S
cience;236:1299-1302(1987))にサブクローン化し、アグ
ロバクテリウム・ツメファシエンスの5’ないし3’の増強Ca235Sプロモ
ーター、融合ペプチドコード領域およびノパリン・シンテース・ターミネーター
を含有するHindIIIカセットを作製する。次いで、該カセットをアグロバ
クテリウム・ツメファシエンス・バイナリー・プラスミドベクター・pBI12
1のHindIIIサイトにサブクローン化してpBPRS1(sPR1/シバ-
1融合)を作製する。実施例11-セクロピンB様ペプチドをコードする遺伝子を含有する
トランスジェニック・リンゴ植物の単離
セクロピンB様溶菌ペプチドを含有するトランスジェニック・リンゴ根茎は、
アグロバクテリウム・ツメファシエンス媒介の遺伝子トランスファーによるリン
ゴ根茎メイリング26(M.26)由来のものである。トランスジェニックT2
は、増強CaMV 35Sプロモーターの制御下のSB-37ペプチドをコード
する遺伝子を含有し、実施例1で作製したバイナリー・プラスミド・ベクターp
LDB10を用いて選抜した。トランスジェニックT3、T4、T5、T6およ
びT7は、タバコ由来のPR蛋白のsPR1膜通過シグナルペプチドに融合させ
たシバ-1ペプチドをコードする遺伝子を含有する。該融合ペプチドをコードす
る遺伝子は、増強CaMV35Sプロモーターの制御下にある。トランスジェニ
ックT2〜T7は、実施例10により作製したバイナリー・プラスミド・ベクタ
ーpBPRS1を用いて選抜した。
アグロバクテリウム・ツメファシエンス媒介の遺伝子トランスファーに用いた
方法および培地は以下の例外を伴って、実施例4に記載されている。
例外1:T2、T5およびT7用の再生培地は、(出典明示して本明細書の一
部とみなす)ティ・ムラシゲ(T.Murashige)およびエフ・スクーグ(F.S
koog)、「タバコ組織培養の高速増殖用の修飾培地およびバイオアッセイ」(P
hysiol Plant;15:473-497(1962)により記載されている主要お
よび微量要素塩混合物、100mg/Lのミオーイノシトール、0.4mg/Lの
チアミン−HCl、30g/Lのスクロース、1mg/Lのチジアズロン、0.5
mg/Lのインドール酢酸および7g/Lの寒天よりなる。T3、T4およびT6
用の再生培地は、寒天を2.5g/Lのゲルライトで置き換える以外は、T2に
ついて記載したごときであった。
例外2:T3の形質転換に用いたアグロバクテリウム・ツメファシエンス株は
EHA105であった。
例外3:アグロバクテリウム・ツメファシエンス接種源は、10g/Lのバク
ト-トリプトン、5g/Lの酵母抽出物、5g/Lの塩化ナトリウムおよび50
mg/Lのカナマイシンを含有する培地上で生育っせた48時間培養よりなる。
接種源は、実施例4に記載したごとく懸濁した。T3を形質転換するのに用いた
接種源を、(ここに参考として引用する)ジェイ・アルト-モルベ(J.Alt-M
orbe)、エイチ・クールマン(H.Kuhlmann)およびジェイ・シュローダー(
J.Schroder)「Tiプラスミドの病原性遺伝子virGおよびvirDの違い、な
らびに4つの外部因子によるvirD発現の持続的制御」(Molecular Plant-Mi
crobe Interactions;2:301−308により記載されている単純誘導培地
中に懸濁した。
例外4:共培養培地は、再生培地+100μMのアセトシリンゴンおよび1m
Mのリン酸ベタインよりなる。
例外5:T3の共培養の間に、接種した葉片を暗所下、室温にて、48時間で
はなく、72時間インキュベートして、アグロバクテリウム・ツメファシエンス
を感染させ形質転換させた。
例外6:共培養させた後に、処理した葉片を:T2に関しては、250μg/
mlのセフォタキシムおよび20μg/mlのパロモマイシン;T3に関しては
、350μg/mlのセフォタキシムおよび100μg/mlのカナマイシン;T
4およびT6に関しては、250μg/mlのセフォタキシムおよび40μg/m
lのパロモマイシン;ならびに、T5およびT7に関しては、250μg/ml
のセフォタキシムおよび10μg/mlのカナマイシンを含有する再生培地に移
した。
処理した葉片から***組織が再生した後に、マルシゲおよびスクーグの主要お
よび微量要素塩混合物、100mg/Lのミオーイノシトール、0.4mg/Lの
チアミン-HCl)30g/Lのスクロース、1mg/Lのベンジルアデニン、0
.5mg/Lのナフタレン酢酸、および7g/Lの寒天を含有する修飾再生培地に
***組織を移し、高照明下(40〜6μmol/m2/秒)、22℃にて1ヶ月インキ
ュベートした。次いで、100μg/mlのパロモマイシンを含有する(ここに
参考として引用する)ジェイ・エル・ノレリら、(J.L.Norelli et al.)
「イン・ビトロおよびグリーンハウスで生育させたリンゴ類過日に対するエルウ
ィニア・アミロボラの病原性」(Phytopathology;78:1292-97(19
88)により記載されている増殖培地に***組織を移した。この培地で生育した
シュートを収穫し、
β-ブルクロニダーゼ(GUS)活性につきスクリーニングした。
GUSの存在は、4-メチルウンベルリフェール-β-D-グルクロニド(MUG
)の4-メチルウンベルリフェロンへの分解に基づく蛍光アッセイを用いて検出
した。50〜150mg新鮮重の葉組織を、(ここに参考として引用する)アー
ル・エイ・ジェファーソンら、(R.A.Jefferson et al.)「GUS融合:
高等植物における感受性および多用途遺伝子融合マーカーとしてのβ-グルクロ
ニダーゼ」(EMBO J;6:3901により記載されている抽出緩衝液50
0μl中で摩砕した。50μlアリコートの葉抽出液を、マルチウェル・マイク
ロタイター・デッシュ中の2mMのMUG50μlと混合した。該混合液を37
℃にて一晩インキュベートし、蛍光用の紫外線下で観察した。シュート片から陽
性GUS活性のトランスジェニック体を同定し増殖させた。1つのトランスジェ
ニックだけは、単一処理葉片から選抜した。
説明の目的において本発明を詳細に記載したが、かかる詳細はその目的のため
の1例に過ぎず、当業者なら、以下の請求の範囲により定義される本発明の趣旨
および視野から離れることなく、ここに変形を作り出せることは理解されよう。
配列表
(1)一般的情報:
(i)出願人:アルドウィンクル,ハーバート・エス(Aldwinckle,Herbert S
.)ノレリ,ジョン・エル(Norelli,John L.)
(ii)発明の名称:火傷病耐性を有するトランスジェニック・リンゴ類果実
(iii)配列数:28
(iv)通信住所:
(A)受信人:マイケル、エル・ゴールドマン(Michael L.Goldman)
(B)通り:クリントン・スクウェア,ピィ・オウ、ボックス1051(Cli
nton Square,P.O.Box 1051))
(C)都市:ロチェスター(Rochester)
(D)州:ニュー・ヨーク州(New York)
(E)国籍:合衆国(U.S.A.)
(F)郵便番号:14603
(v)コンピューター判読形態:
(A)媒体形態:フロッピー・デイスク
(B)コンピューター:IBM・PC・コンパチブル
(C)オペレーティング・システム:PC-DOS/MS-DOS
(D)ソフトウェア:パテントイン・リリース(PatentIn Release)#1
.0,バージョン#1.25
(vi)最新出願データ:
(A)出願番号:
(B)出願日:
(C)分類:
(vii)先行出願データ:
(A)出願番号.US 07/954,347
(B)出願日:1992年9月30日
(vii)代理人/代理事務所情報:
(A)氏名:ゴールドマン・ミスター,マイケル・エル(Goldman Mr.,Mich
ael L.)
(B)登録番号:30,727
(C)参照/ファイル番号:19603/00140
(ix)電信電話情報:
(A)電話番号:(716)263-1304
(B)ファックス番号:(716)-263-1600
(2)配列番号1に関する情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:396塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)配列の数:二本鎖
(D)トポロジー:未知
(ii)分子の型:DNA(ゲノム)
(xi)配列:配列番号1
(2)配列番号2に関する情報
(ii)配列の特徴:
(A)配列の長さ・131アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(C)配列の数:一本鎖
(D)トポロジー:未知
(ii)分子の型:ペプチド
(xi)配列:配列番号2:
(2)配列番号3に関する情報
(i)配列の特徴
(A)配列の長さ:583塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)配列の数:二本鎖
(D)トポロジー:未知
(ii)分子の型:DNA(ゲノム)
(xi)配列:配列番号3:
(2)配列番号4に関する情報:
(i)配列の特徴
(A)配列の長さ:147アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(C)配列の数:一本鎖
(D)トポロジー:未知
(ii)分子の型:ペプチド
(xi)配列:配列番号4:
(2)配列番号5に関する情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:570塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)配列の数:二本鎖
(D)トポロジー:未知
(ii)分子の型:DNA(ゲノム)
(xi)配列 配列番号5:
(2)配列番号6に関する情報:
(i)配列の特徴
(A)配列の長さ:188アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(C)配列の数:一本鎖
(D)トポロジー:未知
(ii)分子の型:ペプチド
(xi)配列:配列番号6:
(2)配列番号7に関する情報:
(i)配列の特徴
(A)配列の長さ:37アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(C)配列の数:一本鎖
(D)トポロジー:未知
(ii)分子の型:ペプチド
(xi)配列:配列番号7
(2)配列番号8に関する情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:186塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)配列の数:二本鎖
(D)トポロジー:未知
(ii)分子の型:DNA(ゲノム)
(xi)配列:配列番号8:
(2)配列番号9に関する情報:
(i)配列の特徴
(A)配列の長さ:61アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(C)配列の数:一本鎖
(D)トポロジー:未知
(ii)分子の型:ペプチド
(xi)配列:配列番号9:
(2)配列番号10に関する情報:
(i)配列の特徴
(A)配列の長さ 36アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(C)配列の数:一本鎖
(D)トポロジー:未知
(ii)分子の型:ペプチド
(xi)配列:配列番号10:
(2)配列番号11に関する情報:
(i)配列の特徴
(A)配列の長さ:37アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(C)配列の数:一本鎖
(D)トポロジー:未知
(ii)分子の型:ペプチド
(xi)配列:配列番号11
(2)配列番号12に関する情報:
(i)配列の特徴
(A)配列の長さ:38アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(C)配列の数:一本鎖
(D)トポロジー:未知
(ii)分子の型:ペプチド
(xi)配列:配列番号12:
(2)配列番号13に関する情報
(i)配列の特徴
(A)配列の長さ:210塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)配列の数:二本鎖
(D)トポロジー:未知
(ii)分子の型:DNA(ゲノム)
(xi)配列:配列番号13:
(2)配列番号14に関する情報
(i)配列の特徴
(A)配列の長さ:63アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(C)配列の数:一本鎖
(D)トポロジー:未知
(ii)分子の型:ペプチド
(xi)配列:配列番号14:
(2)配列番号15に関する情報:
(i)配列の特徴
(A)配列の長さ:207塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)配列の数:二本鎖
(D)トポロジー:未知
(ii)分子の型:DNA(ゲノム)
(xi)配列:配列番号15:
(2)配列番号16に関する情報:
(i)配列の特徴
(A)配列の長さ:62アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(C)配列の数:一本鎖
(D)トポロジー:未知
(ii)分子の型:ペプチド
(xi)配列:配列番号16:
(2)配列番号17に関する情報:
(i)配列の特徴
(A)配列の長さ:216塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)配列の数:二本鎖
(D)トポロジー:未知
(ii)分子の型:DNA(ゲノム)
(xi)配列 配列番号17:
(2)配列番号18に関する情報:
(i)配列の特徴
(A)配列の長さ:69アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(C)配列の数:一本鎖
(D)トポロジー:未知
(ii)分子の型:ペプチド
(xi)配列:配列番号18:
(2)配列番号19に関する情報:
(i)配列の特徴
(A)配列の長さ:213塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)配列の数:二本鎖
(D)トポロジー:未知
(ii)分子の型:DNA(ゲノム)
(xi)配列:配列番号19:
(2)配列番号20に関する情報:
(i)配列の特徴
(A)配列の長さ:68アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(C)配列の数:一本鎖
(D)トポロジー:未知
(ii)分子の型:ペプチド
(xi)配列:配列番号20:
(2)配列番号21に関する情報:
(i)配列の特徴
(A)配列の長さ:42塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)配列の数:一本鎖
(D)トポロジー:未知
((i)分子の型:DNA(ゲノム)
(xi)配列 配列番号21:
(2)配列番号22に関する情報:
(i)配列の特徴
(A)配列の長さ:40塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)配列の数:一本鎖
(D)トポロジー:未知
(ii)分子の型:DNA(ゲノム)
(xi)配列:配列番号22:
(2)配列番号23に関する情報:
(i)配列の特徴
(A)配列の長さ:40塩基対
(B)配列の型:核酸
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(D)トポロジー:未知
(ii)分子の型:DNA(ゲノム)
(xi)配列:配列番号23:
(2)配列番号24に関する情報:
(i)配列の特徴
(A)配列の長さ:52塩基対
(B)配列の型:核酸
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(ii)分子の型:DNA(ゲノム)
(xi)配列:配列番号24:
(2)配列番号25に関する情報:
(i)配列の特徴
(A)配列の長さ:41塩基対
(B)配列の型:核酸
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(D)トポロジー:未知
(ii)分子の型:DNA(ゲノム)
(xi)配列:配列番号25:
(2)配列番号26に関する情報:
(i)配列の特徴
(A)配列の長さ:30塩基対
(B)配列の型:核酸
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(D)トポロジー:未知
(ii)分子の型:DNA(ゲノム)
(xi)配列 配列番号26:
(2)配列番号27に関する情報:
(i)配列の特徴
(A)配列の長さ:723塩基対
(B)配列の型:核酸
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(ii)分子の型:DNA(ゲノム)
(xi)配列:配列番号27:
(2)配列番号28に関する情報:
(i)配列の特徴
(A)配列の長さ:188アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
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(D)トポロジー:未知
(ii)分子の型:ペプチド
(xi)配列:配列番号28:
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE,
DK,ES,FR,GB,GR,IE,IT,LU,M
C,NL,PT,SE),AU,CA,JP,NZ
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.リンゴ類果実の接ぎ穂または根茎栽培品種を、溶菌蛋白をコードする遺伝 子で形質転換することを特徴とするリンゴ類果実の接ぎ穂または根茎栽培品種に 火傷病耐性を付与する方法。 2.該形質転換が、リンゴ類果実の接ぎ穂または根茎栽培品種の組織を、溶菌 蛋白をコードする遺伝子を含むベクターで形質転換されたアグロバクテリウム( Agrobacterium)属の細菌の接種物と接触させることからなる請求項1記載の方 法。 3.アグロバクテリウム属の細菌が、アグロバクテリウム・ツメファシエンス (Agrobacterium tumefaciens)である請求項2記載の方法。 4.アグロバクテリウム・ツメファシエンスがLBA4404株である請求項 3記載の方法。 5.組織が、葉組織、根組織、***組織およびプロトプラストからなる群から 選ばれる請求項1記載の方法。 6.該形質転換が、粒子が細胞内部に浸透し、溶菌蛋白をコードする遺伝子を 含むベクターを細胞内部に導入するに有効な条件下、リンゴ類果実の接ぎ穂また は根茎栽培品種の細胞組織に粒子を推進させることからなる請求項1記載の方法 。 7.ベクターが粒子に付随し、それによりベクターが粒子と共に細胞内部に運 びこまれる請求項6記載の方法。 8.ベクターが細胞を囲み、粒子の覚醒によって細胞内部に導入される請求項 6記載の方法。 9.さらに、溶菌蛋白をコードする遺伝子で形質転換された栽培品種を再生さ せてトランスジェニック・リンゴ類果樹を形成することからなる請求項1記載の 方法。 10.溶菌蛋白がリゾチーム、セクロピン類、アタシン類およびそれらの同族 体からなる群から選択される請求項1記載の方法。 11 溶菌蛋白がアタシンEである請求項10記載の方法。 12.リンゴ根茎がM.7、M.9、M.26、M.27、MM.106、M M.111、メルトン792、マルバ・カイド、ブダゴフスキ−9、マーク、オ タワ3および苗からなる群から選ばれる請求項1記載の方法。 13.根茎がM.26である請求項12記載の方法。 14.ベクターが、pLDB10、pLDB15、pBPRS1、pBCCS 1、pBPRB37およびpBCCB37からなる群から選択される請求項2記 載の方法。 15.アグロバクテリウム属の細菌がアグロバクテリウム・ツメファシエンス 株LBA4404であり、根茎がM.26である請求項2記載の方法。 16.リンゴ類果実の接ぎ穂または根茎栽培品種が、リンゴ接ぎ穂または根茎 栽培品種である請求項1記載の方法。 17.リンゴ類果実の接ぎ穂または根茎栽培品種が、ナシ接ぎ穂または根茎栽 培品種である請求項1記載の方法。 18.栽培品種に火傷病耐性を付与する菌蛋白をコードする遺伝子で形質転換 されたトランスジェニック・リンゴ類果実の接ぎ穂または根茎栽培品種。 19.溶菌蛋白がリゾチーム、セクロピン類、アタシン類およびそれらの同族 体からなる群から選択される請求項18記載のトランスジェニック栽培品種。 20.溶菌蛋白がアタシンEである請求項19記載のトランスジェニック栽培 品種。 21.リンゴ根茎がM.7、M.9、M.26、M.27、MM.106、M M.111、メルトン792、マルバ・カイド、ブダゴフスキー9、マーク、オ タワ3および苗からなる群から選ばれる請求項18記載のトランスジェニック栽 培品種。 22.根茎がM.26である請求項21記載のトランスジェニック栽培品種。 23.リンゴ類果実がリンゴである請求項18記載のトランスジェニック栽培 品種。 24.リンゴ類果実がナシである請求項18記載のトランスジェニック栽培品 種。 25.木に火傷病耐性を付与する菌蛋白をコードする遺伝子で形質転換された トランスジェニック・リンゴ類果樹。 26.溶菌蛋白がリゾチーム、セクロピン類、アタシン類およびそれらの同族 体からなる群から選択される請求項25記載のトランスジェニック果樹。 27.溶菌蛋白がアタシンEである請求項26記載のトランスジェニック果樹 。 28.リンゴ類果実がリンゴである請求項25記載のトランスジェニック果樹 。 29.リンゴ類果実がナシである請求項25記載のトランスジェニック果樹。
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