JPH08502169A

JPH08502169A - 火傷病耐性を有するトランスジェニック・リンゴ類果実

Info

Publication number: JPH08502169A
Application number: JP6509301A
Authority: JP
Inventors: アルドウィンクル，ハーバート・エス; ノレリ，ジョン・エル
Original assignee: コーネル・リサーチ・ファウンデーション・インコーポレイテッド
Priority date: 1992-09-30
Filing date: 1993-09-29
Publication date: 1996-03-12
Also published as: CA2145653A1; AU5167493A; AU670638B2; EP0684759A1; NZ256788A; EP0684759A4; US6100453A; WO1994007356A1; US5824861A; ZA937220B

Abstract

(57)【要約】本発明はリンゴ類果実の接ぎ穂または根茎栽培品種を、溶菌蛋白をコードする遺伝子で形質転換するリンゴ類果実の接ぎ穂または根茎栽培品種に火傷病耐性を付与する方法に関する。そのような形質転換は、細菌の感染または粒子の細胞内への推進によって行うことができる。形質転換が起こったら、栽培品種をトランスジェニック・リンゴ類果樹に再生する。この技術はリンゴおよびナシ栽培品種の処理に特に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】火傷病耐性を有するトランスジェニック・リンゴ類果実本願は、１９９２年９月３０日付出願の米国特許出願第０７／９５４，３４７号の一部継続出願である。発明の分野本発明はリンゴ類果実の接ぎ穂および根茎栽培品種に対する火傷病（fire bli ght）耐性の付与に関する。発明の背景北米では、リンゴ、ナシ、マルメロおよびその他のバラ科の仲間のようなリンゴ類果実の果樹が火傷病として知られる疾病に広く悩まされている。北米に土着ではあるが、この疾病はごく最近、欧州に足がかりを得、現在、大西洋の両側でかなり関心が持たれている。火傷病は、エルウィニア・アミロボラ（Erwinia amylovora）細菌によるリンゴ類果樹の感染により起こる細菌性の疾病である。この細菌は、雨、風、昆虫、鳥および人間により、木から木へと播種されることができる。一般に、感染は木における自然の開口、特に花を介して起こる。これは、まず、花に、水に浸したような外観を生じさせ、ついで、萎縮を起こさせ、最後に黒または褐色に変える。この疾病は、ついで、枝、幹および根を包含する木の他の部分に広がる。この疾病は木の枝、幹および根に瘤（canker）として現れ、これから液体が浸出して疾病を広げる。果樹の若枝および地下匍匍茎の火傷病は芽、樹皮および葉を暗褐色または黒色に変色させる。これが焼け焦げたような外観を与え、それ故、火傷病と称される。火傷病は当面の収穫を破壊するのみならず、長期の打撃も与えうる。花の感染は果実を枯らし、当季の収穫を減少させる。また、若枝の火傷は、次季の果実短枝を有する果樹を破壊する。ナシおよびマルメロならびに多くのリンゴ栽培品種および根茎において、火傷は大きな枝や、木全体さえも破壊しうる。リンゴ類果実収穫に対する火傷病の潜在的に甚大な影響に鑑み、この疾病と戦うための要求が存在する。ナシ栽培品種および多くのリンゴ栽培品種が特に火傷病に感受性であることが判明した。にもかかわらず、両タイプの栽培品種は、火傷病により抵抗性のいくつかの品種を有している。結実接ぎ穂の感受性が変動するばかりでなく、リンゴやナシ果樹の根茎もそうである。その結果、火傷病と戦う１つのアプローチは、火傷病に耐性のリンゴ類果樹の栽培品種および根茎を育種することである。しかしながら、そのようなプログラムは、火傷病耐性を有する果樹を得るまでに試行錯誤と長時間を要する。また、非常に限られた数のリンゴおよびナシ栽培品種しか年間生産の大きな部分に関係していない。これらの品種は、消費者、スーパーマーケットおよび栽培家にその外観、品質、風味、貯蔵性および生産特性が評価されているものである。品種特性を保持しつつ、有性育種で疾病耐性遺伝子を導入することは、長い世代時間とリンゴおよびナシの自家不和合性が戻し交雑プログラムを天文学的長期に、かつ高価なものとするので、事実上、不可能である。火傷病と戦うもう１つのアプローチは、疾病の発生を最少限にする以下の園芸的な実施によるものである。土壌水分を減少させ、肥料栄養素のバランスを維持することにより火傷病の感染および蔓延が制御できることが判明した。このアプローチは有用であるが、疾病の発生を除去することはできない。また、感染した果樹から、瘤や火傷した枝を、好ましくは、疾病が休止中の冬季に除去することにより火傷病を治療することも可能である。しかし、このような操作を行う装置は注意して滅菌し、疾病の蔓延を防止しなければならない。さらに、このアプローチは、小さな瘤または内部感染域が検出しきれないので、疾病を完全に根絶できない。火傷病に感染した果樹は、銅化合物または抗生物質を定期的に散布することによっても火傷病を制御できる。しかし、銅化合物の適用は、しばしば有効ではなく、果実のサビ（russeting）を起こすので広くは受け入れられていない。抗生物質の使用、特に、ストレプトマイシンは銅化合物より有効で、果実に対しての害が少ない。しかし、エルウィニア・アミロボラは、カリフォルニア、オレゴン、ワシントン、ミズーリおよびミシガンを含むストレプトマイシンが使用されている多くの州で、ストレプトマイシンに対して耐性を生じている。さらに、抗生物質プログラムは高価で、欧州の多くの国ではその使用を禁じている。火傷病の生物学的制御が試みられている。そのような努力は、特に、エルウィニア・アミロボラに対する拮抗的生物の開発に向けられている。生物学的制御の研究は、そのような技術が火傷病の抑制に将来的に有用であることを示しているが、テストされた操作はいずれも、化学的治療に代わるほどには十分に有効で開発されたものではない。リンゴ類果実における火傷病と戦う技術の欠陥に鑑み、有効な処置方法に関する要求が残っている。発明の概略本発明は、リンゴ類果実の接ぎ穂または根茎栽培品種に火傷病に対する耐性を与える方法に関する。本発明によれば、リンゴ類接ぎ穂または根茎栽培品種が、溶菌蛋白をコードする遺伝子で形質転換される。かかる形質転換は、栽培品種の組織を、溶菌蛋白をコードする遺伝子を含むベクターで形質転換されたアグロバクテリウム（Agrobacterium）属の細菌接種物と接触させることにより行うことができる。別法として、栽培品種の形質転換は栽培品種組織において不活性または生物学的に活性な粒子を推進させること（propelling）によっても行うことができる。これは、溶菌蛋白をコードする遺伝子を含むベクターを、該粒子または組織の周辺細胞と共に細胞の内部へ導入させる。形質転換したら、栽培品種を再生させてトランスジェニック・リンゴ類果樹を形成させる。本発明は、リンゴおよびナシ果樹に関して利用するのが特に望ましい。各々の広範囲の根茎および接ぎ穂栽培品種が利用できる。また、本発明には、溶菌蛋白をコードする遺伝子で形質転換したトランスジェニック・リンゴ類果実、特に、リンゴまたはナシの接ぎ穂または根茎栽培品種を包含する。また、該遺伝子で形質転換されたトランスジェニック・リンゴ類果樹も開示する。該遺伝子の取り込みは火傷病耐性を付与する。リンゴおよびナシの現在商業化されている果実栽培品種（接ぎ穂）および根茎の火傷病耐性トランスジェニック品種は、それぞれの栽培品種の品種特性を保持しながら、火傷病のより完全な制御を可能にする。このような火傷病制御が、化学薬品および抗生物質の使用に起因する環境および食物汚染なしに行える。本発明によれば、公衆の健康、環境および果実栽培者の経済性についての関心の全てに利益を与える。図面の簡単な説明図１は、ニワトリ（卵白）リゾチームのヌクレオチド（配列番号３）およびアミノ酸（配列番号４）ならびに、プラスミド・ベクターｐｌｙｓ１０２３に挿入されたその制限酵素地図を示す。図２は、プラスミド。ベクターｐＢＩ１２１のトランスファーＤＮＡ（Ｔ−ＤＮＡ）の地図である。図３は、プラスミド・ベクターｐＭＯＮ５３０の地図である。図４は、プラスミド・ベクターｐＬＤＢ２の地図である。図５は、プラスミド・ベクターｐＬＤＢ３の地図である。図６は、プラスミド・ベクターｐＬＤＢ８の地図である。図７は、プラスミド・ベクターｐＬＤＢ９の地図である。図８は、プラスミド・ベクターｐＬＤＢ１１のＴ−ＤＮＡの地図である。図９は、プラスミド・ベクターｐＬＤＢ１２のＴ−ＤＮＡの地図である。図１０は、プラスミド・ベクターｐＬＤＢ７の形成工程を示す模式図である。図１１は、プラスミド・ベクターｐＬＤＢ１０の形成工程を示す模式図である。図１２は、プラスミド・ベクターｐＬＤＢ１４の形成工程を示す模式図である。図１３は、成熟アタシンＥ（Attacin E）のｃＤＮＡ配列のヌクレオチド（配列番号９）およびアミノ酸（配列番号１０）（５６４ｂｐ）と３’−非コード領域（１５９ｂｐ）ならびにアタシン・クローンｐＣＰ５２１に挿入されたその制限酵素地図である。図１４は、プラスミド・ベクターｐＬＤＢ２Ｏ２の形成工程を示す模式図である。図１５は、プラスミド・ベクターｐＬＤＢ１５の形成工程を示す模式図である。図１６Ａ）１６Ｂおよび１６Ｃ）各々、アタシン遺伝子プローブ、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）プローブおよびネオマイシン・ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｐｔＩＩ）プローブとハイブリダイズした本発明のトランスジェニック・リンゴ（Ｔ１）についてのサザン分析を示す。各々において、ラムダはレーン１、ｐＢＩ１２１はレーン２、ｐＬＤＢ１５はレーン３、Ｍ．２６ゲノムＤＮＡはレーン４、Ｔ１ゲノムＤＮＡはレーン５である。全５つのレーンのＤＮＡはＨｉｎｄＩＩＩで消化した。Ｔ１はＭ．２６から誘導されたアタシンＥ溶菌蛋白トランスジェニックである。ｐＬＤＢ１５は、バイナリー・ベクター（binary v ector）ｐＢＩ１２１のＨｉｎｄＩＩＩサイトに挿入されたアタシンＥ蛋白遺伝子を含有する約２４００ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを含有する。これらの図面の左側の数字はラムダ・サイズ・マーカーのサイズをｋｂで示す。ラムダ・サイズ・マーカーの概略の位置を、図１６Ｂおよび１６Ｃのレーン１に引いある。図１７は、トランスジェニック・リンゴ栽培品種（Ｔ１）、Ｍ．２６親栽培品種およびリバティー（Liberty）栽培品種について評価したＩＤ５０火傷病耐性を示す。図１８は、トランスジェニック・リンゴ栽培品種（Ｔ１）およびＭ．２６親栽培品種についての火傷病の経時的進行を示す。図１９は、Ｔ１におけるアタシンＥの発現のノザン分析を示す。図２０は、プラスミド・ベクターｐＢＰＲＳ１、ｐＢＰＲＢ３７、ｐＢＣＣＳおよびｐＢＣＣＢ３７のＴ−ＤＮＡの地図である。発明および図面の詳細な記載本発明は、リンゴ類果実接ぎ穂または根茎栽培品種に火傷病耐性を付与する方法およびそのような耐性を有するリンゴ類果実接ぎ穂および根茎栽培品種自体に関する。火傷病耐性を付与する方法は、溶菌蛋白をコードする遺伝子を有するリンゴ類果実接ぎ穂または根茎栽培品種の形質転換を包含する。一旦、形質転換が起こったら、栽培品種を再生させてトランスジェニック・リンゴ類果樹を形成させる。形質転換に適した植物組織は、葉組織、根組織、***組織およびプロトプラストが包含される。特に、葉組織を利用するのが好ましい。リンゴ類果実接ぎ穂または根茎栽培評価を、溶菌蛋白をコードする遺伝子で形質転換する１つの技術は、そのような栽培評価の組織を、溶菌蛋白をコードする遺伝子を含むベクターで形質転換した細菌の接種物と接触させることによる。一般に、この操作は、リンゴまたはナシ組織に細菌懸濁液を接種し、抗生物質を含まない再生培地で該組織を、２５〜２８℃にて４８〜７２時間インキュベーションすることを含む。アグロバクテリウム属の細菌が植物細胞の形質転換に利用できる。このような細胞の適当な種には、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）およびアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizoge nes）が包含される。植物を形質転換するそのよく知られた能力故に、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（例えば、ＬＢＡ４４０４またはＥＨＡ１０５株）が特に有用である。リンゴ類果実接ぎ穂または根茎栽培品種にアグロバクテリウムを接種するには、該細菌は、溶菌蛋白をコードする遺伝子を含むベクターで形質転換されなければならない。適当な蛋白には、リソチーム、アタシン類、セクロピン（cecropin ）類およびこれらの同族体が包含される。種々の蚕の蛾の桶が、非病原性細菌または加熱破壊される病原で免疫され、これらの動物の血液リンパには正常には存在しないこれら一群の蛋白を生成する。そのような細菌または病原の注射は多数の異なる昆虫で行われているが、ジャイアント蚕蛾、ハヤロホラ・セクロピア（ Hyalophora cecropia）の休眠桶が特に有効であることが証明された。そのような免疫蛾によって生産される蛋白の幾つかが、広範なグラム陰性およびグラム陽性細菌に対して溶菌活性（すなわち、細胞の溶解を起こす）ことが判明した。リゾチームは１つの好適な溶菌蛋白である。これは広範な細菌の増殖を制限する。ここに参考として引用する、ジェイ・エム・ジャイネスら（J．M．Jaynes， et al.）の「昆虫からの抗菌遺伝子を利用する植物における細菌抵抗性の増加」（BioEssays，６：２６３−２７０（１９８７））に示されているように、ハヤロホラ・セクロピアからのリゾチームのヌクレオチド（配列番号１）およびアミノ酸（配列番号２）配列は以下のとおりである。太字のヌクレオチドおよびアミノ酸配列が、各々、部分リーダー・ペプチドをコードまたは構成する。ニワトリ（卵白）リゾチームのヌクレオチド（配列番号３）およびアミノ酸（配列番号４）ならびにプラスミド・ベクターｐｌｙｓ１０２３に挿入したその制限酵素地図を図１に示す。これらの配列のプラスミド・ベクターへのクローニングは、ここに参考として引用するエル・デステファノ・ベルトラン（L．Destefano Beltran）、「ハヤロホラ・セクロピアの体液性免疫応答の天然成分の幾つかをコードする遺伝子のタバコ植物への取り込み；ルイジアナ・ステーツ・ユニバーシィティーに提出された学位論文」（１９９１）（デステファノ・ベルトラン・テーゼ）に示されている。これらのヌクレオチド／アミノ酸配列の変種も知られている。免疫されたハヤロホラ・セクロピアにおいて抗菌活性を有することの判明している他の一群の溶菌蛋白はアタシン類である。アタシン類は約２０，０００ダルトンの分子量を有する、この源からの最大の溶菌蛋白である。アタシンは６つのわずかに異なった形、すなわち、アタシンＡ〜アタシンＦが存在する。２つの遺伝子がアタシン類の生成に関係し、６つの特異的なアタシン類が翻訳後の改編により生ずる。アタシンＥは２つのアタシン遺伝子の１つの非改編翻訳で生じるアタシンの中性−酸性形である。アタシン類の５つのＮ−末端アミノ酸配列を用いるテストは、相互にわずかに相違する３つの塩基性形および２つの酸性形の存在を示している。アタシンＥについての推定ヌクレオチド（配列番号５）およびアミノ酸（配列番号６）配列は、ここに参考として引用する、ジェイ・エム・ジャイネスら（J．M．Jaynes，et al．）の「昆虫からの抗菌遺伝子を利用する植物における細菌抵抗性の増加」（BioEssays，６：２６３−２７０（１９８７））に、つぎのとおり開示されている。他のアタシン類のｃＤＮＡヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、ここに参考として引用するエイ・エングストロームら（A．Engstrom et al．）、「昆虫免疫、抗菌蛋白アタシンＦの一次構造およびそのハヤロホラ・セクロピアからの２つの天然アタシン類に対する関係」（ＥＭＢＯ J.，vol．１，no．９，pp．２０６５−７０（１９８４））およびケイ・コクムら（K．Kockum et al．）「昆虫免疫、ハヤロホラ・セクロピアからの酸性および塩基性アタシン類に対応する２つのｃＤＮＡクローンの単離および配列」（ＥＭＢＯ J.，vol．３，no．９，p p．２０７１−７５（１９８４））に開示されている。セクロピン類はグラム陰性およびグラム陽性細菌の両方に対して広い活性スペクトルを有する最も強力な抗菌ペプチドである。これらは小さく、３つの主な形、すなわち、セクロピンＡＮセクロピンＢおよびセクロピンＤに見いだされる。これら全ては、その分子の塩基性Ｎ−末端領域およびＣ−末端部分の疎水性領域において高度の相同性を有している。セクロピンＡのアミノ酸配列（配列番号７）は、ここに参考として引用するＷＯ８９／０４３７１に開示されており、以下のとおりである。このアミノ酸配列から、当業者は適当なヌクレオチド配列を導きだせる。セクロピンＢをコードするクローンのヌクレオチド配列（配列番号８）およびアミノ酸配列（配列番号９）は、ここに参考として引用する、ジェイ・エム・ジャイネスら（J．M．Jaynes，et al．）の「昆虫からの抗菌遺伝子を利用する植物における細菌抵抗性の増加」（BioEssays，６：２６３−２７０（１９８７））に、つぎのとおり開示されている。太字のアミノ酸配列は、各々、リーダー・ペプチドをコードし、または構成する。セクロピンＤのアミノ酸配列（配列番号１０）は、ここに参考として引用するＷＯ８９／０４３７１に、つぎのとおり開示されている。このアミノ酸配列から、当業者は適当なヌクレオチド配列を導きだせる。リゾチーム、アタシン類およびセクロピン類の合成同族体も開発されている。そのような合成ペプチドの１つの例はシバＩ（Shiva I）であり、これは、天然のセクロピンＢの荷電分布、両親媒性および疎水性特性を維持しつつ、配列相同性における非常に顕著な相違を有するよう設計されている。そのアミノ酸配列（配列番号１１）は、ここに参考として引用するエル・デステファノ・ベルトランら（L．Destefano Beltran et al．、「植物における細菌および糸状菌疾病耐性の増強：ジャガイモへの適用」（The Molecular and Cellular Biology of theP otato，Vayda M．E．およびPark W．D．（編）、CAB International Wallingfor d，UK，pp．２０５−２２１（１９９０））に、つぎのとおり記載されている。このアミノ酸配列から、当業者は適当なヌクレオチド配列を導きだせる。もう１つ別の公知の同族体は、親セクロピンＢ分子を少し変化させて、メチオニン１１をバリンで置換し、Ｎ−末端メチオニンにプロリンを付加した合成ペプチドＳＢ−３７である。このアミノ酸配列（配列番号１２）は、ここに参考として引用するエル・デステファノ・ベルトランら（L．Destefano Beltran et al．）の、「植物における細菌および糸状菌疾病耐性の増強：ジャガイモへの適用」（V このアミノ酸配列から、当業者は適当なヌクレオチド配列を導きだせる。もう１つ別の公知の同族体は、親セクロピンＢ分子を少し変化させて、メチオニン１１をバリンで置換し、Ｎ−末端メチオニンにプロリンを付加した合成ペプチドＳＢ−３７である。このアミノ酸配列（配列番号１２）は、ここに参考として引用するエル・デステファノ・ベルトランら（L．Destefano Beltran et al．）の、「植物における細菌および糸状菌疾病耐性の増強：ジャガイモへの適用」（Vayda M．E．およびPark W．D．（編）、CAB International Walling Ford， UK，pp．２０３−２２１（１９９０））に、つぎのとおり記載されている。このアミノ酸配列から、当業者は適当なヌクレオチド配列を導きだせる。植物細胞からの溶菌蛋白の分泌を可能にするため、該蛋白をコードする遺伝子を、シグナル・ペプチドをコードする遺伝子に融合させる。その結果、溶菌蛋白に結合したシグナル・ペプチドを含有する融合蛋白が形成される。シグナル・ペプチドの存在は融合蛋白を、シグナル配列が切断されている細胞の小胞体に向けさせる。ついで小胞体ルーメン中またはゴルジ複合体中で溶菌蛋白が修飾され細胞外へ分泌される。上記で同定された溶菌蛋白のいずれかと組み合わせてこの概念を用いることが可能である。特に有用な融合蛋白は、シバ（Shiva）ＩまたはＳＢ−３７に融合したｓＰＲ１またはｓＣＥＣシグナル・ペプチドである（すなわち、ｓＰＲ１− シバＩ、ｓＰＲ１−ＳＢ３７、ｓＣＥＣ−シバＩおよびｓＣＥＣ−ＣＳＢ３７）。ここに参考として引用するジェイ・デネッケ（J．Denecke）、「植物細胞における蛋白分泌はデフォールトパスウェイにより生じ得る（Protein Secretion in Plant Cells Can Occur via a Default Pathway）」、ザ・プラント・セル（Th e Plant Cell）、Vol．２、pp．５１〜５９（１９９０）を参照されたし。ｓＣＥＣ−シバＩのヌクレオチド（配列番号１３）およびアミノ酸（配列番号１４）配列は以下のとおりである。太字のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれシグナル・ペプチドをコードまたは構成する。ｓＣＥＣ−ＳＢ３７のヌクレオチド（配列番号１５）およびアミノ酸（配列番号１６）配列は以下のとおりである。ここでもまた、太字のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれシグナル・ペプチドをコードまたは構成する。ｓＰＲ１−シバＩのヌクレオチド（配列番号１７）およびアミノ酸（配列番号１８）配列は以下のとおりである。太字のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれシグナル・ペプチドをコードまたは構成する。ｓＰＲ１−ＳＢ３７のヌクレオチド（配列番号１９）およびアミノ酸（配列番号２０）配列は以下のとおりである。太字のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれシグナル・ペプチドをコードまたは構成する。適当であり得る他の溶菌蛋白としては、メティティン（metittins）、マガイニン、ボンビニン（bombinin）、キセノプシン（xenopsins）、セルレイン、サルコトキシン（sarcotoxins）などが挙げられる。これらのおよび他の有用な溶菌蛋白のアミノ酸配列は、ここに参考として引用するＷＯ８９／０４３７１、特にその中の表Ｉに開示されている。溶菌蛋白をコードする遺伝子を含む、アグロバクテリウムでの導入に適切なベクターは、プラスミドの形態であってもよい。かかるプラスミドは、細菌エシェリキア・コリ（Escherichia coli）における複製の複製起点、細菌アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacteriumu tumefaciens）における複製の複製起点、遺伝子を植物に転移させるためのＴ−ＤＮＡ右縁配列、および形質転換植物細胞を選択するためのマーカー遺伝子を含有する。特に好ましいのは、低コピーＲＫ２複製起点、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）プロモーターおよびＮＯＳ３’ポリアデニル化シグナルの付いたネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ nptII）マーカー遺伝子、およびＣａＭＶ３５ＳプロモーターおよびＮＯＳ３’ポリアデニル化シグナルの付いたβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）マーカー遺伝子を含有するベクターｐＢＩ１２１である。図２は、Ｔ−ＤＮＡプラスミドベクターｐＢＩ１２１の地図であり、これはクローンテック・ラボラトリーズ・インコーポレーティッド（Clonetech Laboratories，Inc．）、カリフォルニア州９４３０３、パロ・アルト、ファビアン・ウェイ４０３０（4030 Fabian Way ，Palo Alto，California 94303）より入手可能である。他の適切なベクターとしては、ｐＭＯＮ５３０（図３）およびｐＭＯＮ２００（図１０参照）などが挙げられる。溶菌蛋白をコードする遺伝子は該ベクターに挿入される。溶菌蛋白生産のためには、以下のプラスミドが有用である：アタシン（Attacin）Ｅ蛋白（p rotein）をコードするｐＬＤＢ１５（図１５参照）；ＳＢ−３７溶菌ペプチド（ＳＢ−３７ lytic peptide）をコードするｐＬＤＢ１（図１０参照）；アタシンＥ蛋白をコードするｐＬＤＢ２（図４参照）；ニワトリ（chicken）リゾチーム（lysozyme）をコードするｐＬＤＢ３（図５参照）；Ｔ４ファージリゾチーム（Ｔ４ phage lysozyme）をコードするｐＬＤＢ４；Ｐ２２蛋白遺伝子１３（P2 2 protein gene 13）をコードするｐＬＤＢ５；Ｐ２２リゾチーム遺伝子１９（P 22 lysozyme gene 19）をコードするｐＬＤＢ６：ＳＢ−３７溶菌蛋白をコードするｐＬＤＢ７（図１０参照）；アタシンＥ蛋白をコードするｐＬＤＢ８（図６参照）；ニワトリリゾチームをコードするｐＬＤＢ９（図７参照）；ＳＢ−３７溶菌蛋白をコードするｐＬＤＢ１０（図１１参照）；アタシンＥ蛋白をコードするｐＬＤＢ１１（図８参照）；ニワトリリゾチームをコードするｐＬＤＢ１２（図９参照）；ＳＢ−３７溶菌蛋白をコードするｐＬＤＢ１４（図１２参照）；Ｔ４ファージリゾチームをコードするｐＬＤＢ１６；ゲノムセクロピンＢ（genomic cecropin B ）をコードするｐＬＤＢ１８；シバ−Ｉ溶菌ペプチド（Shiva-I lytic peptide ）をコードするｐＷＩシバ−１；Ｐ２２リゾチーム遺伝子１９をコードするｐＷＩＰ１９；およびＰ２２リゾチーム遺伝子１９をコードするｐＣａ２Ｐ１９。これらのプラスミドの特徴を以下の表Ｉに記載する。表Ｉおよび表Ｉのプラスミドベクターの調製に続く実施例から、特にここに参考慮すると当業者に明らかである。これらすべてのプラスミドは、ここに参考としおける細菌および糸状菌疾病耐性の増強：ジャガイモへの適用」（The molecula rand Cellular Biology of the Potato，Vayda M.E．and Park W.D.（編）、CAB International，Wallingford，UK，pp．205-221（1990））に開示されている。また、以下のプラスミドも溶菌ペプチドの生産に有用である：ｓＰＲ１−シバ− １融合蛋白をコードするｐＢＰＲＳ１、ｓＣＥＣ−シバ−１融合蛋白をコードするｐＢＣＣＳ１、ｓＰＲ１−ＳＢ３７融合蛋白をコードするｐＢＰＲＢ３７、およびｓＣＥＣ−ＳＢ３７融合蛋白をコードするｐＢＣＣＢ３７。図２０を参照されたし。典型的には、アグロバクテリウム・エスピー（Agrobacterium spp.）のプラスミドベクターによる形質転換は、エム・ホルスターズ（M．Holsters）ら、「アグロバクテリウム・ツメファシエンスのトランスフェクションおよび形質転換（Transfection and Transformation of Agrobacterium tumefaciens）」Mo l Gen Genet 163：181-187（1978）に記載の通りに化学的および熱処理後にプラスミドＤＮＡを直接取り込ませることにより、エス・ウェンージュン（S．Wen-j un）およびビー・フォーデ（B．Forde）、「高電圧エレクトロポレーションによるアグロバクテリウム・エスピーの効率的形質転換（Efficient Transformation of Agrobacterium spp．by High Voltage Electroporation）」、Nucleic Acid Res 17：8385（1989）に記載の通りにエレクトロポレーション後にプラスミドＤＮＡを直接取り込ませることにより、ジー・ディッタ（G．Ditta）ら、「グラム陰性細菌用の広宿主域ＤＮＡクローニング系：リゾビウム・メリロティの遺伝子バンクの構築（Broad Host Range DNA Cloning System for Gram-negative Ba cteria：Construction of a Gene Bank of Rhizobium meliloti）」Proc Natl A cad Sci USA 77：7347-7351（1981）に記載のとおりのTra⁺ヘルパー株により仲介されるエシェリキア・コリ（Escherichia coli）からアグロバクテリウム（Ag robacterium）へのプラスミドの三親接合転移により、またはアール・サイモン（R．Simon）ら、「インビボ遺伝子工学のための広宿主域動態化系：グラム陰性細菌におけるトランスポゾン突然変異誘発 (A Broad Host Range Mobilization System for in vivo Genetic Engineering ：Transposon Mutagenesis in Gram-negative Bacteria)」Biotechnology 1：78 4-791（1982）に記載のとおりのエシェリキア・コリからアグロバクテリウムへの直接接合転移により行う。これらの公開物のすべてはここに参考として引用する。リンゴ類果実の接ぎ穂または根茎栽培品種を溶菌蛋白をコードする遺伝子で形質転換するもう１つのアプローチは、不活性または生物学的に活性な粒子を栽培品種組織細胞にて推進させる（propelling）ことによるものである。この技術は、すべてサンフォード（Sanford）らに対するここに参考により引用する米国特許第４,９４５,０５０号、第５,０３６,００６号、および第５,１００,７９２号に開示されている。一般に、この手法は、細胞の外表面に浸透させその内部に取り込まれるのに有効な条件下で不活性または生物学的に活性な粒子を栽培品種組織の細胞にて推進させることを含む。不活性な粒子を用いる場合、溶菌蛋白の遺伝子をコードするベクターで粒子を被覆することにより、細胞内にベクターを導入する。あるいは、標的細胞を該ベクターで取り巻いて、粒子の通った跡から該ベクターが細胞内に運ばれるようにする。また、生物学的に活性な粒子（例、それぞれ導入しようとしているＤＮＡを含有する乾燥細菌またはバクテリオファージ）を栽培品種細胞組織中に推進させることもできる。本発明によりリンゴ類果実の接ぎ穂または根茎栽培品種を形質転換したなら、それを再生させてトランスジェニック・リンゴ類果樹を形成させる。一般に、再生は、シュート***組織の発芽を許容する適当な増殖調節剤および栄養素を含有する培地上で形質転換組織を培養することにより行う。アグロバクテリウムの増殖を抑制し形質転換細胞の発育を選択するために、再生培地に適当な抗生物質を加える。シュート開始後、組織培養中でシュートを発育させ、マーカー遺伝子活性についてスクリーニングする。リンゴ類果実に火傷病耐性を付与する技術は、バラ（Rosaceae）科のいずれかの群と組み合わせると有用である。これらのうち、リンゴ、西洋ナシ、およびマルメロが特に卓越している。火傷病耐性が付与され得るバラ科の他の種としては、本発明に従うと、シャリントウ、サンザシ、シドニア（cydonia）、ピラカンサ（pyracantha）、ナナカマドなどが挙げられる。リンゴについては、本発明に従い以下の栽培品種を処理して火傷病耐性を付与することができる：アディナ（Adina）、アカネ（Akane）、アンナ（Anna）、アントノブカ（Antonovka）、アーカンザス・ブラック（Arkansas Black）、バンクロフト（Bancroft）、ビーコン（Beacon）、ビュージャデ（Beaujade）、ベレ・デ・ボスクープ（Belle de Boskoop）、ビッグ・タイム（Big Time）、ブラッシング・ゴールデン（Blushing Golden）、ブラエバーン（Braeburn）、ブラムレイズ・シードリング（Bramley's Seedling）、ブライトゴールド（Britegold ）、チャンピオン（Champion）、チェンナンゴ（Chenango）、チエフタイン（Ch ieftain）、クレオパトラ（Cleopatra）、コネル・レッド（Connel Red）、コロマンデル・レッド（Coromandel Red）、コートランド（Cortland）、コックス・オレンジ・ピピン（Cox's Orange Pippin）、クリスピン（Crispin）、クリテリオン（Criterion）、デイトン（Dayton）、デリシャス（Delicious）（レッド・デリシャス（Red Delicious）を含む）、デモクラト（Democrat）、デイスカバリー（Discovery）、ドーセット・ゴールデン（Dorsett Golden）、ダルセット（Dulcet）、アーリブレイズ（Earliblaze）、アーリデル（Earlidel）、アーリゴールド（Earligold）、アーリー・コ一トランド（Early Cortland）、アイン・シェマー（Ein Shemer）、エルスター（Elstar）、エンパイアー（Empire）、エンプレス（Empress）、フアメウス（Fameuse）、フイエスタ（Fiesta）、フロリナ（Florina）、フリーダム（Freedom）、フジ（Fuji）、ガラ（Gala）、ギャラクシー（Galaxy）、ジュネーブ・アーリー（Geneva Early）、ジンジャーゴールド（Gingergold）、グロスター（Gloster）、ゴールデン・ラセット（Golden Russet）、ゴールデン・デリシャス（Golden Delicious）、ゴールデン・シュプリーム（Golden Supreme）、グラニー・スミス（Granny Smith）、グラベンシュタイン（Gravenstein）、グリーンスリーブス（Greensleeves）、グライムズ・ゴールデン（Grimes Golden）、ハラルソン（Haralson）、ホーグアン（Hauguan ）、ハウシュアイ（Haushuai）、ハニーゴールド（Honeygold）、ハツアキ（Hat suaki）、ヒメカミ（Himekami）、ホクト（Hokuto）、イダレッド（Idared）、イワカミ（Iwakami）、ジェームズ・グリーブ（James Grieve）、ジャーセイマック（Jerseymac）、ジョナフリー（Jonafree）、ジョナゴールド（Jonagold）、ジョナゴアード（Jonagored）、ジョナリシャス（Jonalicious）、ジョナマック（Jonamac）、ジョナレッド（Jonared）、ジョナスティ（Jonasty）、ジョナサン（Jonathan）、ジョニー（Jonnee）、ジョレッド（Jored）、カーミジン（Kar mijn）、キタカミ（Kitakami）、ラクストンズ・スパーブ（Laxton's Superb）、リバティー（Liberty）、ロディ（Lodi）、ルラレッド（Lurared）、リスゴールデン（Lysgolden）、マコウン（Macoun）、マイゴールド（Maigold）、マックシェイ(McShay）、マックイントシュ（McIntosh）、メルローズ（Melrose）、モリエス・デリシャス（Mollies Delicious）、モンロー（Monroe）、ノーザン・スパイ（Northern Spy）、ノースウエスタン・グリーニング（Northwestern Gre ening）、ノバ・エアシグロ（Nova Easygro）、ノバマック（Novamac）、オリン（Orin）、オザーク・ゴールド（Ozark Gold）、ポーラレッド（Paulared）、ピンク・レディー（Pink Lady）、プライマ（Prima）、プライム・ゴールド（Prim e Gold）、プリミシア（Primicia）、プリンセッサ（Princessa）、プリシラ（P riscilla）、ピュアゴールド（PureGold）、ラルス・ジャネット（Ralls Janet ）、ラリタン（Raritan）、レッド・バロン（Red Baron）、レッドシェフ(Redch ief）、レジェント（Regent）、レイネ・デス・レイネッテス（Reine des Reine ttes）、レイネッテ・ドウ・カナダ（Reinette du Canada）、アール・アイ・グリーニング（R．I．Greening）、ローム・ビューティー（Rome Beauty）、ルビネッテ（Rubinette）、サンサ（Sansa）、サヤカ（Sayaka）、セカイイチ（Seka i-ichi）、センシュウ（Senshu）、シャムロック（Shamrock）、シズカ（Shizuk a）、サー・プライズ（Sir Prize）、スムージー(Smoothee）、スパルタン（Spa rtan）、ステイマン（Stayman）、ワインサップ（Winesap）、スピゴールド（Sp igold）、スプレンダー（Splendor）、ステート・フェア（State Fair）、スターマー・ピピン（Sturmer Pippin）、サマーデル（Summerdel）、サマーレッド（SummerRed）、サマー・トリート（Summer Treat）、サンダウナー（Sundown er）、サンライズ（Sunrise）、スイート・シックスティーン（Sweet Sixteen）、タナカ（Takana）、トンプキンズ・キング（Tompkins King）、ツガル（Tsuga ru）、トウエンテイー・オンス（Twenty Ounce）、トールマン・スイート（Tolm an Sweet）、タイデマンズ・アーリー・ウォーセスター（Tydeman's Early Worc ester）、バイキング（Viki ng）、ビスタ・ベラ（Vista Bella）、ウェルシー（Wealthy）、ウイリアムス・プライド（Williams Pride）、ワインサップ（Winesap）、ウィンター・バナナ（Winter Banana）、ウォルフ・リバー（Wolf River）、ウォーセスター・パーメイン（Worcester Pearmain）、ヤタカ（Yataka）、イェロー．ニュータウン（Yellow Newtown）、ヨコ（Yoko）、ヨーク・インペリアル（York Imperial ）、２０８５、および他のガラＸスプレンダー（Gala X Splendor）クローンなど。適切なリンゴ根茎としては、Ｍ．７、Ｍ．９、Ｍ．２６、Ｍ．２７、ＭＭ．１０６、ＭＭ．１１１、メルトン（Merton）７９３、マルバ・カイド（Maruba kai do）、ブダゴフスキー（Budagovsky）９、マーク（Mark）、オタワ（Ottawa）３、および実生（すなわち、未知の親の種子から増殖した根茎）などが挙げられる。適切な欧州ナシ（ピルス・コミュニス（Pyrus communis））としては、コンファレンス（Conference）、ウィリアムズ・ボン・クレチエン（Williams Bon Cre tien）（バートレット（Bartlett））、ドクター・ジュレス・ガイオット（Dr ．Jules Guyot）（リモネラ（Limonera））、ブランクイラ（Blanquilla）（スパドナ・エスティバ（SpadonaEstiva））、コスシア（Coscia）（エーコリニ（E rcolini））、アベイト・フェテル（Abate Fetel）、ドゥアンジョウ（d'Anjou ）、ベウレ・ボスク（Beurre Bosc）、コミス（Comice）、パックハムズ・トライアンフ（Packham's Triumph）、パッセ・クラッサネ（Passe Crassane）などが挙げられる。適切なアジアナシ（ピー・ピリフォリア（P．pyrifolia））としては、シンセイキ（Shinseiki）、２０世紀（20th Century）、ホスイ（Hosui）、シンコ（Sh inko）、チョージューロー（Chojuro）、コスイ（Kosui）、ニイタカ（Niitaka ）などが挙げられる。適切なナシ根茎としては、ピルス・カレリアナ（Pyrus calleryana）、ピー・ベトゥラエフォリア（P．betulaefolia）（ライマーズ（Reimer's））、クインス（Quince）、オールド・ホームＸファーミングデイル（Old Home X Farmingda le）、オールド・ホーム（Old Home）および実生などが挙げられる。以下、実施例により本発明の具体例を例示するが、これらは決して本発明の範囲を限定するものではない。実施例実施例１-プラスミド・ベクターｐＬＤＢ１０の作製ＳＢ-３７溶菌蛋白をコードする遺伝子を有するプラスミド・ベクターｐＬＤ相補的オリゴヌクレオチドとプラスミドとの酵素的な連結を要する。該遺伝子配列は、６つのフラグメントに分割されている。アッパー・ストランド（コード/鎖）は、３つのオリゴヌクレオチド；配列番号２１（ヌクレオチド１-４２）；配列番号２２（ヌクレオチド４３-８２）；配列番号２３（ヌクレオチド８３-１２２）よりなり、ロウアー・ストランド（アンチセンス鎖）は３つのオリゴヌクレオチド；配列番号２４、配列番号２５、および配列番号２６により形成される。各フラグメントの配列を以下に示す。中間ベクターの第１の選択は、ＢｇｌＩＩ粘着末端で開始しＥｃｏＲＩ粘着末端で終了するよう設計した合成遺伝子ｐＭＯＮ５３０である。２つの制限部位は、太字で示す：配列番号２１-２６さる名称を有する６つのフラグメントを、Ｔ４・ＤＮＡリガーゼで連結し１２０ｂｐのＳＢ-３７フラグメントを作製する。ｐＬＤＢ７を作製する工程を図１０に示し、以下に記載する。プラスミド・ベクターｐＭＯＮ５３０を、ＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化した後に、子ウシ腸アルカリ・ホスファターゼ（「ＣＡＰ」）で処理し、ＳＢ-３７遺伝子をコードする６つの重複オリゴヌクレオチドをそのフラグメントに連結してプラスミド・ベクターｐＬＤＢ１を作製する。次いで、プラスミド・ベクターｐＬＤＢ１をＢＳｔＥＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、得られた３．７ｋｂのフラグメントを回収する。プラスミド・ベクターｐＭＯＮ２００をＢＳｔＥＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した後に、得られた６．５ｋｂのフラグメントを回収し、該フラグメントをプラスミド・ベクターｐＬＤＢ１由来の３．７ｋｂフラグメントに連結してプラスミド・ベクターｐＬＤＢ７を作製する。プラスミド・ベクターｐＬＤＢ１０は、図１１に示す工程系列によりプラスミド・ベクターｐＬＤＢ７から作製する。することにより、この工程を行うと、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの変異型を有するキメラＳＢ-３７遺伝子の構築によって１０倍高い発現レベルが保証される。この工程において、プラスミド・ベクターｐＬＤＢ７をＥｃｏＲＶおよびＳａｃｌで消化して、切断（-９０）ＣａＭＶ３５Ｓ-ＳＢ３７-ＮＯＳ３’フラグメントを取り出し、それをプラスミド・ベクターｐＬＤＢ１０２にサブクローン化する。プラスミド・ベクターｐＬＤＢ１０２をＥｃｏＲＶおよびＳａｃＩで消化した後に、該ＥｃｏＲＶ/Ｓａｃｌフラグメントをプラスミド・ベクタ−ｐＣａ２に連結してプラスミド・ベクターｐＬＤＢ１０３を作製する。次いで、プラスミド・ベクターｐＬＤＢ１０３からのＨｉｎｄＩＩＩフラグメントをプラスミド・べクターｐＢＩ１２１にサブクローン化してプラスミド・ベクターｐＬＤＢ１０を作製する。実施例２-プラスミド・ベクターｐＬＤＢ１４の作製図１２に示すごとく、（出典明示して本明細書の一部とみなす）デスティファノ・ベルトラン理論より、プラスミド・ベクターｐＬＤＢ１（実施例１で作製）をＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、ＨｉｎｃＩＩで消化しＣＡＰで処理した後のプラスミド・ベクターｐＵＣ１９に連結する。次いで、得られたプラスミド・ベクターｐＬＤＢ１０１をＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで処理してＳＢ-３７をコードする遺伝子を切り出し、次いで、これをプラスミド・ベクターｐＩＧ１のＢａｍＨＩ/ＰｓｔＩサイトにクローニングしてプラスミド・ベクターｐＬＤＢ１４１を作製する。次いで、２つのＨｉｎｄＩＩＩサイトを用いて、プラスミド・ベクターｐＬＤＢ１４１からキメラＰｉＩＩ５’-ＰｉＩＩ３’カセットを切り出し、これをプラスミド・ベクターｐＢＩ１２１の対応サイトに挿入してプラスミド・ベクターｐＬＤＢ１４を得る。実施例３-プラスミド・ベクターｐＬＤＢ１５の作製（出典明示して本明細書の一部とみなす）デスティファノ・ベルトラン理論に記載したごとく、該アタカシンＥ遺伝子は、プラスミド・ベクターｐＢＲ３２２のＰｓｔＩサイト中に、５６４塩基対のコード配列および１５９塩基対の３’- 非コード領域（すなわち、７２３塩基対）を有する完全なｃＤＮＡ配列として、プラスミド・ベクターｐＣＰ５２１中に存在する。このｃＤＮＡのヌクレオチド（配列番号２７）配列および番号付けアミノ酸（配列番号２８）配列を、アタシン・クローンｐＣＰ５２１のインサートの制限地図と共に図１３に示す。この図においては、推定ポリアデニル化シグナルにアンダーラインを付す。図１４は、プラスミド・ベクターｐＬＤＢ２０２を作製するのに用いた工程の模式図である。示すごとく、ｐＵＣ１９のＢａｎＩＩサイトがｃＤＮＡ中のポジション１１にあるＢａｎＩＩサイトに隣接して位置するように、プラスミド・ベクターｐＣＰ５２１からのＰｓｔＩ-７２３塩基対フラグメントをｐＵＣ１９にサブクローン化する（図１２参照）。次いで、得られたプラスミド・ベクターｐＬＤＢ２０１を、ＢａｎＩＩで消化し、ＢｇｌＩＩの後に開始コドンを取り囲む植物共通のＡＡＣＡＡＴＧ配列を含有する２９-ｍｅｒのオリゴヌクレオチドおよびＢａｎＩＩ突出を有するＡｓｐ１-Ａｌａ２-ｈＩＳ３-Ｇｌｙ４-Ａｌａ５に連結してプラスミド・ベクターｐＬＤＢ２０２を作製する。図１５の模式工程図により、プラスミド・ベクターｐＬＤＢ２０２を用いてプラスミド・ベクターｐＬＤＢ１５を作製する。工程のこの段階において、プラスミド・ベクターｐＬＤＢ２０２中の該アタシンＥコード配列が、ＢｇｌＩＩ/ＥｃｏＲＶフラグメントとしてプラスミド・ベクターｐＬＤＢ２０２から切り出され、ｐＩＧ１のＢａｍＨＩ/ＨｉｎｃＩＩサイトにクローン化されて、プラスミド・ベクターｐＬＤＢ１５１が作製される。プラスミド・ベクターｐＬＤＢ１５１のＨｉｎｄＩＩＩサイトの間に位置するキメラ遺伝子フラグメントを切り出し、プラスミド・ベクターｐＢＩ１２１に挿入してプラスミド・ベクターｐＬＤＢ１５を作製する。実施例４-植物組織培養ならびにプラスミド・ベクターｐＬＤＢ１０、ｐＬＤＢ１４およびｐＬＤＢ１５での形質転換形質転換に用いたリンゴ栽培品種は、根茎Ｍ．２６であった。シュート片増殖に用いた方法および培地、ならびに発根(rooted)-植物栽培品種は、増殖培地が１．０ｍｇ/Ｌのベンジルアデニン、０．３ｍｇ/Ｌのインドール酪酸、および０．２ｍｇ/Ｌのジベレリン酸（全ジベレリンのＡ₃９０％）を含有する以外は、（参照して一部とみなす）ジェイ・エル・ノレリら、（J．L．Norelli et al．）「イン・ビトロおよびグリーンハウスで生育させたズミ・リンゴ種ノボル植物に対するエルウィニア・アミロボラ株の病原性」（Phytopathology；７８：１２９２-９７（１９８８年））に記載されている。実施例１-３のバイナリー・ベクターｐＢＩ１２１（（ここに参照して引用する）アール・エイ・ジェファーソンら、（Ｒ．Ａ．Ｊefferson et al．）「ＧＵＳ融合：高等植物における感受性および多用途遺伝子融合マーカーとしてのβ- グルクロニダーゼ」（ＥＭＢＯＪ；６：３９０１-０７（１９８７））、ｐＬＤＢ１０、ｐＬＤＢ１４またはｐＬＤＢ１５を含有する無毒化アグロバクテリウム・ツメファシエンス株ＬＢＡ４４０４（（ここに参考として引用する）エイ・ホケマら、（Ａ．Ｈoekemaet al．）「アグロバクテリウム・ツメファシエンスのティイ・アイープラスミドのビルおよびティ-領域の分離に基づくバイナリー植物ベクター・ストラテジー」（Ｎature；３０３：１７９-８０（１９８３））を、植物形質転換に用いた（（ここに national；２０５−２１（１９９０））。該細菌は、カド５２３ブロス（Ｋado ５２３broth）（（参照して一部とみなす）シイ・アイ・カドら、（Ｃ．Ｉ．Ｋado et al．）「アグロバクテリウム、コッリネバクテリウム、エルウィニア、シュードモーナスおよびザンソモーナス単離用の選択培地」（Ｐhytopatholog y：６０：９６９- ７６（１９７０））中で、２８℃にて一晩増殖させ、１００μＭのアセトシリンゴンを含有するｐＨ５．４、０．５×ムラシゲースクーグの微量および主要成分（Ｍurashige-Ｓkoog micro- and macro-element）（（参照して一部とみなす）ティ・ムラシゲら、（Ｔ．Murashige et al．）「高速増殖用の改変培地およびタバコ組織培養でのバイオアッセイ」（Ｐhysiol。Ｐlant；１５：４７３-９７（１９６２））に再懸濁し、６００ｎｍの吸光度測定で２×１０⁹ｃｆｕ/ｍｌの密度に調整した。形質転換に用いる葉は、発根３週齢または８週齢のイン・ビトロ培養植物から収穫した。該葉は、葉が拡がる活性段階でさえまだ十分に葉を広げていた。葉は、外科用メスで３-５ｍｍ幅の断片に横向きにスライスし、アグロバクテリウム・ツメファシエンス接種源に５分間置き、乾燥ブロットし、抗生物質を含まない再生培地上に背軸側を上にして置いた。再生培地は、（ここに参考として引用する）エム・ウェランダー（Ｍ．Ｗelander）「成熟リンゴ樹からイン・ビトロで生育させたシュートの葉および茎断片からの植物再生」（Ｊ．Ｐ lant Ｐhysiology；１３２：７３８-７４４（１９８８）により記載されている５ｍｇ/Ｌベンジルアデニンおよび０．１ｍｇ/Ｌの１-ナフタレン酢酸を含有する修飾Ｎ₆培地であった。植物を暗所下、室温にて４８時間インキュベートして、アグロバクテリウム・ツメファシエンスにより感染させ形質転換させた。次いで、２５０μｇ/ｍｌのセフォタキシムまたは１０μｇ/ｍｌのパロモマイシンおよび２５０μｇ/ｍｌのセフォタキシムを含有する再生培地に葉を移した。さらなる処理において、４０μｇ/ｍｌのパロモマイシンおよび２５０μｇ/ｍｌのセフォタキシムを含有する再生培地に４日間、次いで、セフォタキシムのみを含有する再生培地に葉片を移した。再生培地上の葉片を、最初に暗所下、室温（２１ −３０℃）にて２週間置き、次いで、４０μｍｏｌ・ｍ²・ｓｅｃ^-1、室温（２１-３０℃）にて１６時間置いた。すべての処理において、葉断片は４週後に新たな培地に移した。アグロバクテリウム・ツメファシエンスで接種した９週間後に、全ての再生葉片を、それらを以前に培養したのと同一の再生培地（５０ｍｌ）を含有するベビー・フード・ジャーに移した。４週間後に、．再生培養物を、１または幾つかの ***組織を含む片に分割し、５０μｇ/ｍｌカナマイシンを含油する増殖培地に置いた。６週間後にカナマイシン培地上で緑色を維持しているシュー卜片を、ＧＵＳ活性につきスクリーニングした。推定されるトランスジェニック植物におけるＧＵＳの存在は、（引用して一部とみなす）アール・エイ・ジェファーソンら、（Ｒ．Ａ．Ｊefferson et al．）「ＧＵＳ融合：高等植物における感受性および多用途遺伝子融合マーカーとしてのβ-グルクロニダーゼ」（ＥＭＢＯＪ；６：３９０１-０７（１９８７）により記載されるごとき、４-メチルウンベリフェリル-β-Ｄ-グルクロニド（「ＭＵＧ」）の４-メチルウンベリフェロン（「ＭＵ」）への分解に基づく蛍光アッセイを用いて測定した。予備アッセイにおいて、５０〜１５０ｍｇ新鮮重量の葉組織を５００μｌの抽出緩衝液中にて摩砕した（前掲）。１００μｌアリコートの葉抽出液を、マルチウェル・マイクロタイター・ディッシュ中にて２ｍＭのＭＵＧ１００μｌと混合した。該混合液を３７℃にて一晩インキュベートし、蛍光用紫外線照明下で観察した。試料時間、４試料時間に取り出した２０μｌのアリコートを用いて活性速度を算出し、アッセイを２００分まで行う以外の定量ＧＵＳアッセイは、アール・エイ・ジェファーソン（Ｒ．Ａ．Ｊefferson）により記載されるごとく行った。定量ＧＵＳのデータは、対数換算によりノーマライズした。アッセイ時間にわたるＭＵの蓄積は線状であって、該アッセイ時間の間に漸近線に近付いたり線状から離れることはなかった。５-ブロモ-４-クロロ-３-インドリル-β-Ｄ-グルクロン酸（「Ｘ-gluc」）で処理する前にハンド断片（hand section）をホルムアルデヒド中で固定しない以外は、（ここに参考として引用する）アール・エイ・ジェファーソンら、（Ｒ。Ａ。Ｊeffersonet al．）「ＧＵＳ融合：高等植物における感受性および多発現遺伝子融合マーカーとしてのβ-グルクロニダーゼ」（ＥＭＢＯＪ；６：３９０１−０７（１９８７）に記載されるごとく、ＧＵＳ活性の局在性につき細胞化学的アッセイを行った。ｎｐｔＩＩ活性は、２５または５０μｇ/ｍｌのカナマイシン存在下で、シュート片が根にイン・ビトロ（in vitro）生育する能力により評価した。５つのシュート片を含む単独のベビー・フード・ジャーの発根培地を反復単位とした。処理当たり５〜２５個のジャーとなった。サザン分析を行うために、（ここに参考として引用する）エヌ/ジェイ・ガウエル（Ｎ．Ｊ．Ｇawel）、「MusaおよびＩpomoea用の修飾ＣＴＡＢ・ＤＮＡ抽出法」（Ｐlant Ｍol．Ｂiol．Ｒep．；９：２６２-６６（１９９１）の修飾方法を用いて新鮮葉組織から植物ＤＮＡを単離した。修飾方法は、１）該葉組織-抽出緩衝混合液を３７℃にて４５分間インキュベートし、２）ＤＮＡをＲＮＡｓｅで処理した後に、該ＤＮＡをプロテイナーゼＫ（１．５ｍｇ/ｍｌ）で５５℃にて９０分間処理した。１０μｇのゲノムＤＮＡをＨindＩＩＩで消化し、１．１Ｖ/ｃｍにて１６時間、トリス-酢酸-ＥＤＴＡ緩衝液中の１％アガロースゲルを通してサイズ分画した後に、アルカリ条件下にてジーンスクリーンプラス（Ｇen eＳcreenＰlus）（デュポン社（ＤuＰont Ｃo．）マサチューセッツ州、ボストン（Ｂoston,ＭＡ））に移し、水性溶液中で＞１０⁹ｃｐｍ/μｇの比活性を有する２００ｎｇの³²Ｐ標識ＤＮＡプローブと６５℃にてハイブリイズさせた後、極めて厳密に洗浄した（（ここに参考として引用する）ジェイ・サムブルックら、（Ｊ。Ｓambrook et al．）「モレキュラー・クローニング：研究室マニュアル」（Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory Ｐress；第２版、１９８９）。アタシン・プローブは、ｐＬＤＢ１５の２．２ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩフラグメントであって、ジャガイモからのプロテイナーゼ・インヒビターＩＩ遺伝子の５’および３’領域ならびに該アタシン遺伝子よりなる。該ＧＵＳプローブは、ｐＢＩ１２１の約２．１ｋｂのＢａｍＨＩ-ＥｃｏＲＩフラグメントであって、アグロバクテリウム・ツメファシエンスからのＧＵＳ遺伝子およびノパリン・シンテース・ターミネーターよりなる。該ｎｐｔＩＩプローブは、ｐＢＩ１２１の約１．９ｋｂのＰｓｔいフラグメントであって、ほぼ全体のｎｐｔＩＩ遺伝子およびノパリン・シンテース・ターミネーターよりなる。実施例５-トランスジェニック植物の回収アタシンＥ蛋白をコードする遺伝子を含む、Ｔ１と命名したＭ．２６トランスジェニック系を得た。ＬＢＡ４４０４（ｐＬＤＢ１５）で接種し、１０μｇ/ｍｌのパロモマイシンおよび２５０μｇ/ｍｌのセフォタキシムを含有する培地上で選抜した８週齢の発根したイン・ビトロ培養植物から収穫したＭ．２６葉片からＴ１を得た。Ｔ１は８週齢の植物から収穫した葉から得たとはいえ、３週齢の発根植物からの葉片（０．２２）は、８週齢植物のもの（０．１１）よりも有意に高率で再生した（Ｆ＝７．９８、ｄｆ＝１、６３）。２５０μｇ/ｍｌのセフォタキシム（０．２３）、１０μｇ/ｍｌのパロモマイシンおよび２５０μｇ/ｍｌのセフォタキシム（０．１６）あるいは、４０μｇ/ｍｌのパロモマイシンおよび２５０ μｇ/ｍｌのセフォタキシムで４日間、次いで、２５０μｇ/ｍｌのセフォタキシムを含有する培地で培養した場合には、再生した葉片の比率に有意な差はなかった（Ｆ＝２．６３、ｄｆ＝２、６２）。３週齢（０．０）または８週齢の植物（０．００３３）から葉を収穫した場合にも（Ｆ＝１．１７、ｄｆ＝１、６３）；葉断片をセフォタキシムのみ（０．０）、１０μｇ/ｍｌのパロモマイシン＋セフォタキシム（０．００８３）、または４０μｇ/ｍｌのパロモマイシン＋セフォタキシムで４日間、次いで、セホタキシムのみ（０．０）を含む培地上で培養して得られた、トランスジェニック植物を供する葉片の比率にも有意な差はなかった。ｎｐｔＩＩトランスジェニック植物につき選抜するためのパロモマイシンを含有する培地上で再生できない多数の非-トランスジェニック植物があった。１０ μｇ/ｍｌのパロモマイシンを含有する培地からの３６再生体のうち１体のみがトランスジェニックであり（２．２％）、４０μｇ/ｍｌのパロモマ，イシンを含む培地上で４日間培養した２５再生体では全くトランスジェニックがなかった。非-パロモマイシンを含む培地-対-パロモマイシンを含む培地上で培養した場合に再生する葉片において有意な差が得られなかったことは、この実験で用いた選抜圧（selection pressure）が低過ぎたことを示している。最近の研究により、２５〜６３μｇ/ｍβのパロモマイシンで連続選抜することがｎｐｔＩＩトランスジェニックＭ．２６細胞を選抜するのに最適であることが示された。表ＩＩに示すごとく、トランスジェニック系Ｔ１がｎｐｔＩＩおよびＧＵＳ活性を有する一方、非ットランスジェニックＭ．２６は有しなかった。 ^aカナマイシン存在下で発根する組織培養シュートの能力。発根は、発根培地上の４週栽培後に観察し、抗生物質の不在下で起きた発根のパーセントとして表す（Ｍ．２６およびＴ１に関しては、各々、７６％および４８％）。 ^b蛍光アッセイにより測定したＭＵＧからＭＵへの転換速度（ナノモル/分/ｍｇ新鮮重）。ｎｐｔＩＩ活性の変動分析は、Ｍ．２６およびＴ１のｎｐｔＩＩ活性の間の有意な差（Ｆ−５１．５６、ｄｆ＝１、１４６）ならびにカナマイシン濃度相互作用による有意な品種（Ｆ＝５７．７２、ｄｆ＝２、１４５２）があることを示し、発根培地中のカナマイシンの存在に対してＭ．２６およびＴ１が異なって反応していることを示した。ＧＵＳ活性の変動分析は、Ｍ．２６およびＴ１のＧＵＳ活性の間に有意な差があることを示した（Ｆ＝１３．３５、ｄｆ＝１、１４）。Ｔ１の形質転換に用いたアグロバクテリウムのバイナリー・ベクターであるｐＬＤＢ１５（（ここに参考として引用する）エル・デステファノーベルトランら、（ＣＡＢＩnternational；２０５-２１（１９９０）は、ｐＢＩ１２１（（ここに参考として引用する）アール・エイ・ジェファーソンら、（Ｒ．Ａ．Ｊeffe rson et al．）「ＧＵＳ融合：高等植物における感受性および多用途遺伝子融合マーカーとしてのβ-グルクロニダーゼ」（ＥＭＢＯＪ；６：２０９１-０７（１９８７）のＨｉｎｄＩＩＩサイト中に挿入された約２４００塩基対のフラグメントを含有する。このインサートは、ジャガイモからのプロテイナーゼ・インヒビターＩＩ遺伝子の５’領域の１．３ｋｂおよび該プロテイナーゼ・インヒビターＩＩ遺伝子の３’領域の約３００ｂｐを含有する。ｐＬＤＢ１５のＴ-ＤＮＡの規則的な配列順序は右側のＴ-ＤＮＡボーダー、ｎｐｔＩＩ遺伝子、２４００ｂｐのアタシンＥのＨｉｎｄＩＩフラグメント、ＧＵＳ遺伝子および左側のＴ-ＤＮＡボーダーである（図１５）。該アタシンＥ遺伝子は、アグロバクテリウムにより媒介される形質転換の間に植物に移行するＴ-ＤＮＡ上のＨｉｎｄＩＩＩサイト側面に並んでいるため、プラスミドＤＮＡまたはトランスジェニックゲノム植物ＤＮＡを消化すればアタシンＥ遺伝子プローブとハイブリダイズする２４００ｂｐのフラグメントが得られるにちがいない。Ｔ１のサザン・ハイブリダイゼーション分析は、ｐＬＤＢ１５（図１６Ａ、レーン３）およびＴ１（レーン５）からの約２４００ｂｐのアタシン遺伝子プローブにハイブリダイズするが、ｐＢＩ１２１（レーン２）またはＭ．２６（レーン４）からのものはハイブリダイズしなかった（図１６Ａ）。該ＧＵＳ遺伝子はＴ−ＤＮＡの左側ボーダーおよびＨｉｎｄＩＩＩサイト側面に並んでいるため、プラスミドＤＮＡへのＧＵＳのハイブリッド形成およびトランスジェニックゲノムＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化すれば、異なったサイズのハイブリダイズ・フラグメントが得られるにちがいない。ＧＵＳ遺伝子プローブとハイブリダイズする該ｐＬＤＢ１５のＤＮＡのフラグメントは、ｐＢＩ１２１ハイブリダイズ・フラグメントと同一サイズにちがいない（図１６Ａ）。トランスジェニックゲノムＤＮＡ中のハイブリダイズ・フラグメントのサイズは、未知のサイズであろう。というのは、それはＴ-ＤＮＡ（ＨｉｎｄＩＩＩサイトないしＴ-ＤＮＡの左側ボーダー）および植物ＤＮＡ（導入サイトないし植物の次ぎのＨｉｎｄＩＩＩサイト）の両方を含有するであろうからである。同様にして、ｎｐｔＩＩはＴ-ＤＮＡ右側ボーダーおよびＨｉｎｄＩＩＩサイトに並んでおり、トランスジェニックゲノムＤＮＡのｎｐｔＩＩのハイブリッド形成をＨｉｎｄＩＩＩで消化すれば、プラスミドＤＮＡまたはＧＵＳにハイブリダイズするもののいずれかから異なったサイズのハイブリダイズフラグメントが得られるにちがいない。ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＢＩ１２１とｐＬＤＢ１５のＤＮＡのハイブリダイゼーションは、ｐＢＩ１２１のほぼ全長サイズのフラグメントが、ＧＵＳ遺伝子プローブおよびｎｐｔＩＩプローブ（図１６Ｂ）レーン２および３）とハイブリダイズすることを示した。Ｔ１ゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーションは、ＧＵＳプローブとハイブリダイズする特異なサイズ（約７．５ｋｂ）のフラグメントを示した。ｐＢＩ１２１のサイズのフラグメントも、Ｍ．２６およびＴ１ゲノムＤＮＡ試料においてＧＵＳ遺伝子プローブとハイブリダイズした。このバンドは、恐らく、ｐＢＩ１２１とゲノムＤＮＡ試料の汚染のためであった。ゲノムＤＮＡの汚染は、ｐｂＩ１２１を含有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスでの植物組織のコロニー形成、ＤＮＡ単離中の汚染、またはゲル電気泳動の間のＤＮＡ試料の移動により起こり得た。しかしながら、植物ゲノムＤＮＡ試料中に汚染ｐＢＩ１２１が存在するにも拘わらず、ＧＵＳとハイブリダイズする特異なフラグメントのＴ１ゲノムＤＮＡの存在（図１６Ｂ、レーン５；７．５ｋｂ）はＴ１形質転換の証拠である。Ｔ１の形質転換は、ｎｐｔＩＩプローブとのハイブリダイゼーションにより支持される（図１６Ｃ）。Ｔ１ゲノムＤＮＡとｎｐｔＩＩプローブとのハイブリダイゼーションの結果、特異なサイズの２つの断片（約５．９および３．４ｋｂ）がハイブリダイズした（図１６Ｃ、レーン５）。このことは、形質転換工程の間にｎｐｔＩＩ遺伝子が複製したことを示しているのかもしれない。影の７．５ｋｂフラグメントは、ＧＵＳ遺伝子およびｎｐｔＩＩプローブの両方に共通のノパリン・シンテース・ターミネーターとハイブリダイズするＧＵＳフラグメントである（図１６Ｃ、レーン５）。ＧＵＳプローブに関するごとく、Ｍ．２６およびＴ１ゲノムＤＮＡ試料のｎｐｔＩＩプローブとのハイブリダイゼーションはｐＢＩ１２１での汚染を示す。実施例６-トランスジェニックの遺伝子型の安定性リンゴは、栄養繁殖され有***雑により栽培品種特性が失われているため、トランスジェニック植物のＲ０代は、ほとんど改良栽培品種の選抜に用いられるであろう。従って、Ｒ０トランスジェニック遺伝子型の安定性は重要である。Ｔ１’形質転換体のゲノタイプの安定性を試験するために、いずれのｎｐｔＩＩに対するアミノグルコシド選抜もなしにＴ１葉片から植物を再生させ、次いでＧＵＳおよびｎｐｔＩＩマーカー遺伝子の存在につき評価した。Ｔ１再生体におけるＧＵＳ活性は、ＭＵＧのＭＵへの転換についての定性蛍光アッセイを用いて評価し、ｎｐｔＩＩ活性は、２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する培地中で再生体が発根する能力を試験することによって評価した。評価した４０体のＴ１再生体のうち、４０体全てが陽性ＧＵＳおよびｎｐｔＩＩ活性の両方を有していた。Ｔ１葉組織の細胞化学的観察はキメラのいずれの事実も示さなかった。ＧＵＳ活性は、横方向で切断した葉の全ての細胞層で検出された。同様にして、茎上の５つの連なった葉をアッセイした場合、全ての葉序的部位からの葉が全体的にＧＵＳ活性を有していた。加えて、アミノグリコシド選抜をかけていないシュート片増殖培地上の２５体を超えるＴ１の継代栄養繁殖イン・ビトロ繁殖体においては、ＧＵＳまたはｎｐｔＩＩ活性の明らかな欠失はなかった。選抜なしに繁殖および増殖後のＴ１トランスジェニック遺伝子型の再生試験、細胞化学的観察、および観察された安定性は、Ｔ１はキメラではなく遺伝的に安定であることを示している。実施例７-イン・ビトロで検出されたトランスジェニック・リンゴの火傷病耐性トランスジェニックＴ１のイン・ビトロ生育植物を、それらの火傷病耐性につき評価した。接種源を１×１０⁴〜１×１０⁷ｃｆｕ/ｍｌの範囲の５またはそれを超える種々の濃度で調整した以外は、ノレリら、（Norelli et al.）ら、（（ここに参考として引用する）「イン・ビトロおよびグリーンハウスで生育させたズミ・リンゴ種のノボラ植物に対するエルウィニア・アミロボラ株の病原性」（ Phytopathology：７８：１２９２-９７（１９８８年））により記載されているごとく、火傷病の主な原因であるエルウィニア・アミロボラで組織培養植物を接種した。５０％の植物をエルウィニア・アミロボラに感染させるのに要する接種源用量（対数１０ｃｆｕ/ｍｆ単位の平均ＩＤ５０）をプロビット方法（ＳＡＳ、ＳＡＳ研究所（ＳＡＳＩnstitute Ｉnc．）、ノースカロライナ州、キャリー（Ｃary,ＮＣ））により算出し、植物耐性を測定するのに用いた。５０％の植物が感染するのに要する接種源用量が大きい程、火傷病に対する品種の耐性も高くなる。栽培品種Ｍ．２６およびリバティーが、各々、感受性および耐性の標準栽培品種として含まれていた。エルウィニア・アミロボラ株Ｅａ２７３を接種源に用いた。評価は３回反復し、ＩＤ５０値は３評価を平均した。図１７に示されるごとく、Ｔ１、Ｍ．２６（親栽培品種）およびライブラリー（火傷病耐性栽培品種）が、各々、５．４、４．４および５．６のＩＤ５０レートを有していたことは、アタシンＥ蛋白をコードする遺伝子を含むＴ１トランスジェニックの火傷病耐性が感受性親栽培品種Ｍ．２６に比して上昇したことを示している。実施例８-トランスジェニック・リンゴ植物の火傷病耐性Ｔ１のイン・ビトロ繁殖植物をグリーンハウスでの生育に適応させ、一本のシュート植物として生育させた。エルウィニア・アミロボラで接種した後に進行したシュート長のパーセントを測定することにより植物体の火傷病耐性を評価した。接種は、接種源濃度が５×１０⁶ｃｆｕ/ｍｌである以外は、（ここに参考として引用する）エイチ・エス・アルドウィンクル（Ｈ.Ｓ.Aldwinckle）およびジェイ・エル・プレクゼウスキー（Ｊ．Ｌ．Ｐreczewski）「エルウィニア・アミロボラによる侵入に対するリンゴ栽培品種の末端シュートの反応」（Ｐhytopathol ogy；６６：１４３９-４４（１９７６））により以前に記載されている。栽培品種Ｍ．２６が感受性標準栽培品種として含まれていた。エルウィニア・アミロボラ株Ｅａ２７３を接種源に用いた。図１８は、トランスジェニックＴ１および親栽培品種Ｍ．２６の経時的な疾病の進行を示している。Ｔ１は、Ｍ．２６より遅い速度で疾病が進行した。Ｍ．２６およびＴ１についての疾病進行曲線の傾きに、３日目〜１６日目で有意な差があった（Ｔ＝-２．３７、ｄｆ＝１２４、ｐ＝０．０１９；×値の非正常に基づく１/Ｘに対する傾きに基づいている）ことは、Ｔ１が火傷病に対してさらに耐性であることを示している。かかる速度-低下耐性は、（ここに参考として引用する）ダブリュ・フライ（Ｗ．Ｆry）「植物疾病管理の原理」２０３-０４、２１９-３４（１９８２）に記録されているごとく。伝染進行速度を抑制する植物能力のよく知られた指標である。この型の耐性は、疾病進行に好都合な環境条件または多数の病原菌集合によって圧倒され得るが、それは、しばしば疾病管理に用いられており、他の管理技術と効率的に組合せることができる（前掲、２２８-２３１）。このことは、ファイトフトーラ・インフェスタンス（Ｐhytophthora infestans）により引き起こされるジャガイモ疫病の制御において実証された。これおいては、速度-低下耐性を化学的な制御実践と効率的に組み合わせて、用いた速度-低下耐性の効果は０．５〜０．７Ｋｇ殺菌剤/ヘクタールに相当すると定量された（（出典明示して本明細書の一部とみなす）ダブリュ・イー・フライ（Ｗ.Ｅ.Ｆry）「ジャガイモ疫病の進行に対する多遺伝子耐性および保護殺菌剤の組み合わせ効果」（Ｐhyto pathology；６５：９０８-９１１（１９７５年）および（ここに参考として引用する）ダブリュ・イー・フライ（Ｗ．Ｅ．Ｆry）「ジャガイモ疫病の組合せ制御に対するジャガイモ栽培品種の一般的な抵抗性および殺菌剤効果の定量」（Ｐhy topathology；６８：１６５０-１６５５（１９７８））。リンゴ根茎の火傷病感染の場合においては、速度-低下耐性により、植物が生存して感染するのに十分な疾病進行に速度低下することができた。感染が始まった後は、秋および冬における不都合な条件により病害の進行が阻害されるであろう。速度-低下耐性により、根茎癌腫の形成からの病害を防ぐのに十分に病害進行を阻害できる。次いで、樹木の損失が回避されよう。このことは、Ｍ．２６および他の感受性のリンゴ根茎に対して重要な利点となるであろう。実施例９-Ｔ１中のアタシンＥ遺伝子発現のノザン分析Ｔ１中のアタシンＥをコードする遺伝子の発現は、Ｔ１におけるアタシンＥメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の存在を示すノザン分析によって証明した。葉を収穫する７２時間前に火傷病病原菌であるエルウィニア・アミロボラを接種したＴ１植物から葉を収穫し、葉組織から全ＲＮＡを単離した。膨大な数の真核生物ｍＲＮＡはその３’末端でポリアデニル化されているため、オリゴ（ｄＴ）-セルロース上のアフィニティー・クロマトグラフィーによってバルクの細胞性ＲＮＡからｍＲＮＡを精製した。アガロースゲルはホルムアルデヒドを含有するが、次いで、電気泳動によりポリ（Ａ）ＲＮＡを変性条件下にて分画した。次いで、分画したＲＮＡをニトロセルロース膜上に真空ブロットし、放射線的に標識したアタシンＥ・ＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた。該アタシンＥプローブは、ｐＬＤＢ１５の２４００ｂｐのアタシンＥ・ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントである。アタシンＥの発現は、Ｍ．２６ｍＲＮＡには存在しないＴ１ｍＲＮＡ中に存在するフラグメントに対する該アタシンＥプローブのハイブリダイゼーションにより支持されている（図１９参照）。実施例１０-プラスミドベクターｐＢＰＲＳ１の作製セクロピン（cecropin９Ｂ様ペプチドであるシバ-１（Ｓhiva-1）をコードする遺伝子が膜通過シグナルペプチド（transit signal peptide）であるｓＰＲ１に融合して、植物細胞からのセクロピンの輸送が可能なようにプラスミドベクターｐＢＰＲＳ１（図２０参照）を構築し、該遺伝子をＣａＭＶ（Ｃａ₂３５Ｓ）の増強３５Ｓプロモーターの制御下に設置した。簡単には、ベクタープラスミドにクローン化した重複合成オリゴマーからシバ-１をコードする遺伝子を合成した。次いで、タバコ由来のＰＲ蛋白１ｂのｓＰＲ１膜通過シグナルペプチドをコードする重複合成オリゴマー（（ここに参考として引用する）デネッケ・ジェイ（Ｄenecke，Ｊ．）、ボターマン・ジェイ（Botterman，J．）およびデブラエア・アール（Deblaere，R．）、「植物細胞における蛋白分泌は欠失経路を介して起こり得る」（Ｔhe Ｐlant Ｃell；２：５１−５９（１９９０））を、シバ-１遺伝子の５’末端に融合した。次いで、融合ペプチドをコードするＤＮＡフラグメント（配列番号１７）をｐＣＡ２（（ここに参考として引用する）ケイ・アール（Ｋay，Ｒ．）、チャン・エイ（Ｃhan，Ａ．）、ダーリー・エム（Ｄaly，Ｍ．）およびマクファーソン・ジェイアール（ＭcＰherson，Ｊr．）「ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター配列の複製は植物遺伝子の増強エンハンサーを生成する」（Ｓ cience；２３６：１２９９-１３０２（１９８７））にサブクローン化し、アグロバクテリウム・ツメファシエンスの５’ないし３’の増強Ｃａ₂３５Ｓプロモーター、融合ペプチドコード領域およびノパリン・シンテース・ターミネーターを含有するＨｉｎｄＩＩＩカセットを作製する。次いで、該カセットをアグロバクテリウム・ツメファシエンス・バイナリー・プラスミドベクター・ｐＢＩ１２１のＨｉｎｄＩＩＩサイトにサブクローン化してｐＢＰＲＳ１（ｓＰＲ１/シバ- １融合）を作製する。実施例１１-セクロピンＢ様ペプチドをコードする遺伝子を含有するトランスジェニック・リンゴ植物の単離セクロピンＢ様溶菌ペプチドを含有するトランスジェニック・リンゴ根茎は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス媒介の遺伝子トランスファーによるリンゴ根茎メイリング２６（Ｍ．２６）由来のものである。トランスジェニックＴ２は、増強ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの制御下のＳＢ-３７ペプチドをコードする遺伝子を含有し、実施例１で作製したバイナリー・プラスミド・ベクターｐＬＤＢ１０を用いて選抜した。トランスジェニックＴ３、Ｔ４、Ｔ５、Ｔ６およびＴ７は、タバコ由来のＰＲ蛋白のｓＰＲ１膜通過シグナルペプチドに融合させたシバ-１ペプチドをコードする遺伝子を含有する。該融合ペプチドをコードする遺伝子は、増強ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの制御下にある。トランスジェニックＴ２〜Ｔ７は、実施例１０により作製したバイナリー・プラスミド・ベクターｐＢＰＲＳ１を用いて選抜した。アグロバクテリウム・ツメファシエンス媒介の遺伝子トランスファーに用いた方法および培地は以下の例外を伴って、実施例４に記載されている。例外１：Ｔ２、Ｔ５およびＴ７用の再生培地は、（出典明示して本明細書の一部とみなす）ティ・ムラシゲ（Ｔ．Ｍurashige）およびエフ・スクーグ（Ｆ．Ｓ koog）、「タバコ組織培養の高速増殖用の修飾培地およびバイオアッセイ」（Ｐ hysiol Ｐlant；１５：４７３-４９７（１９６２）により記載されている主要および微量要素塩混合物、１００ｍｇ/Ｌのミオーイノシトール、０．４ｍｇ/Ｌのチアミン−ＨＣｌ、３０ｇ/Ｌのスクロース、１ｍｇ/Ｌのチジアズロン、０．５ｍｇ/Ｌのインドール酢酸および７ｇ/Ｌの寒天よりなる。Ｔ３、Ｔ４およびＴ６用の再生培地は、寒天を２．５ｇ/Ｌのゲルライトで置き換える以外は、Ｔ２について記載したごときであった。例外２：Ｔ３の形質転換に用いたアグロバクテリウム・ツメファシエンス株はＥＨＡ１０５であった。例外３：アグロバクテリウム・ツメファシエンス接種源は、１０ｇ/Ｌのバクト-トリプトン、５ｇ/Ｌの酵母抽出物、５ｇ/Ｌの塩化ナトリウムおよび５０ｍｇ/Ｌのカナマイシンを含有する培地上で生育っせた４８時間培養よりなる。接種源は、実施例４に記載したごとく懸濁した。Ｔ３を形質転換するのに用いた接種源を、（ここに参考として引用する）ジェイ・アルト-モルベ（Ｊ．Ａlt-Ｍ orbe）、エイチ・クールマン（Ｈ．Ｋuhlmann）およびジェイ・シュローダー（Ｊ．Ｓchroder）「Ｔｉプラスミドの病原性遺伝子virＧおよびvirＤの違い、ならびに４つの外部因子によるvirＤ発現の持続的制御」（Ｍolecular Ｐlant-Ｍi crobe Ｉnteractions；２：３０１−３０８により記載されている単純誘導培地中に懸濁した。例外４：共培養培地は、再生培地＋１００μＭのアセトシリンゴンおよび１ｍＭのリン酸ベタインよりなる。例外５：Ｔ３の共培養の間に、接種した葉片を暗所下、室温にて、４８時間ではなく、７２時間インキュベートして、アグロバクテリウム・ツメファシエンスを感染させ形質転換させた。例外６：共培養させた後に、処理した葉片を：Ｔ２に関しては、２５０μｇ/ ｍｌのセフォタキシムおよび２０μｇ/ｍｌのパロモマイシン；Ｔ３に関しては、３５０μｇ/ｍｌのセフォタキシムおよび１００μｇ/ｍｌのカナマイシン；Ｔ４およびＴ６に関しては、２５０μｇ/ｍｌのセフォタキシムおよび４０μｇ/ｍｌのパロモマイシン；ならびに、Ｔ５およびＴ７に関しては、２５０μｇ/ｍｌのセフォタキシムおよび１０μｇ/ｍｌのカナマイシンを含有する再生培地に移した。処理した葉片から***組織が再生した後に、マルシゲおよびスクーグの主要および微量要素塩混合物、１００ｍｇ/Ｌのミオーイノシトール、０．４ｍｇ/Ｌのチアミン-ＨＣｌ）３０ｇ/Ｌのスクロース、１ｍｇ/Ｌのベンジルアデニン、０．５ｍｇ/Ｌのナフタレン酢酸、および７ｇ/Ｌの寒天を含有する修飾再生培地に ***組織を移し、高照明下（４０〜６μmol/ｍ²/秒）、２２℃にて１ヶ月インキュベートした。次いで、１００μｇ/ｍｌのパロモマイシンを含有する（ここに参考として引用する）ジェイ・エル・ノレリら、（Ｊ．Ｌ．Norelli et al．）「イン・ビトロおよびグリーンハウスで生育させたリンゴ類過日に対するエルウィニア・アミロボラの病原性」（Ｐhytopathology；７８：１２９２-９７（１９８８）により記載されている増殖培地に***組織を移した。この培地で生育したシュートを収穫し、 β-ブルクロニダーゼ（ＧＵＳ）活性につきスクリーニングした。ＧＵＳの存在は、４-メチルウンベルリフェール-β-Ｄ-グルクロニド（ＭＵＧ）の４-メチルウンベルリフェロンへの分解に基づく蛍光アッセイを用いて検出した。５０〜１５０ｍｇ新鮮重の葉組織を、（ここに参考として引用する）アール・エイ・ジェファーソンら、（Ｒ．Ａ．Ｊefferson et al．）「ＧＵＳ融合：高等植物における感受性および多用途遺伝子融合マーカーとしてのβ-グルクロニダーゼ」（ＥＭＢＯＪ；６：３９０１により記載されている抽出緩衝液５００μｌ中で摩砕した。５０μｌアリコートの葉抽出液を、マルチウェル・マイクロタイター・デッシュ中の２ｍＭのＭＵＧ５０μｌと混合した。該混合液を３７ ℃にて一晩インキュベートし、蛍光用の紫外線下で観察した。シュート片から陽性ＧＵＳ活性のトランスジェニック体を同定し増殖させた。１つのトランスジェニックだけは、単一処理葉片から選抜した。説明の目的において本発明を詳細に記載したが、かかる詳細はその目的のための１例に過ぎず、当業者なら、以下の請求の範囲により定義される本発明の趣旨および視野から離れることなく、ここに変形を作り出せることは理解されよう。配列表 (１)一般的情報： (i)出願人：アルドウィンクル，ハーバート・エス（Ａldwinckle,Ｈerbert Ｓ .）ノレリ，ジョン・エル（Ｎorelli,Ｊohn Ｌ.） (ii)発明の名称：火傷病耐性を有するトランスジェニック・リンゴ類果実 (iii)配列数：２８ (iv)通信住所： (Ａ)受信人：マイケル、エル・ゴールドマン（Ｍichael Ｌ.Ｇoldman） (Ｂ)通り：クリントン・スクウェア，ピィ・オウ、ボックス１０５１（Ｃli nton Ｓquare,Ｐ.Ｏ.Ｂox １０５１）) (Ｃ)都市：ロチェスター（Ｒochester） (Ｄ)州：ニュー・ヨーク州（Ｎew Ｙork） (Ｅ)国籍：合衆国（Ｕ.Ｓ.Ａ.） (Ｆ)郵便番号：１４６０３ (v)コンピューター判読形態： (Ａ)媒体形態：フロッピー・デイスク (Ｂ)コンピューター：ＩＢＭ・ＰＣ・コンパチブル (Ｃ)オペレーティング・システム：ＰＣ-ＤＯＳ/ＭＳ-ＤＯＳ (Ｄ)ソフトウェア：パテントイン・リリース（ＰatentＩn Ｒelease）＃１．０，バージョン＃１．２５ (vi)最新出願データ： (Ａ)出願番号： (Ｂ)出願日： (Ｃ)分類： (vii)先行出願データ： (Ａ)出願番号．ＵＳ０７／９５４，３４７ (Ｂ)出願日：１９９２年９月３０日 (vii)代理人/代理事務所情報： (Ａ)氏名：ゴールドマン・ミスター，マイケル・エル（Ｇoldman Ｍr.,Mich ael Ｌ.） (Ｂ)登録番号：３０，７２７ (Ｃ)参照/ファイル番号：１９６０３／００１４０ (ix)電信電話情報： (Ａ)電話番号：（７１６）２６３-１３０４ (Ｂ)ファックス番号：（７１６）-２６３-１６００ (２)配列番号１に関する情報： (i)配列の特徴： (Ａ)配列の長さ：３９６塩基対 (Ｂ)配列の型：核酸 (Ｃ)配列の数：二本鎖 (Ｄ)トポロジー：未知 (ii)分子の型：ＤＮＡ（ゲノム） (xi)配列：配列番号１ (２)配列番号２に関する情報 (ii)配列の特徴： (Ａ)配列の長さ・１３１アミノ酸 (Ｂ)配列の型：アミノ酸 (Ｃ)配列の数：一本鎖 (Ｄ)トポロジー：未知 (ii)分子の型：ペプチド (xi)配列：配列番号２： (２)配列番号３に関する情報 (i)配列の特徴 (Ａ)配列の長さ：５８３塩基対 (Ｂ)配列の型：核酸 (Ｃ)配列の数：二本鎖 (Ｄ)トポロジー：未知 (ii)分子の型：ＤＮＡ（ゲノム） (xi)配列：配列番号３： (２)配列番号４に関する情報： (i)配列の特徴 (Ａ)配列の長さ：１４７アミノ酸 (Ｂ)配列の型：アミノ酸 (Ｃ)配列の数：一本鎖 (Ｄ)トポロジー：未知 (ii)分子の型：ペプチド (xi)配列：配列番号４： (２)配列番号５に関する情報： (i)配列の特徴： (Ａ)配列の長さ：５７０塩基対 (Ｂ)配列の型：核酸 (Ｃ)配列の数：二本鎖 (Ｄ)トポロジー：未知 (ii)分子の型：ＤＮＡ（ゲノム） (xi)配列配列番号５： (２)配列番号６に関する情報： (i)配列の特徴 (Ａ)配列の長さ：１８８アミノ酸 (Ｂ)配列の型：アミノ酸 (Ｃ)配列の数：一本鎖 (Ｄ)トポロジー：未知 (ii)分子の型：ペプチド (xi)配列：配列番号６： (２)配列番号７に関する情報： (i)配列の特徴 (Ａ)配列の長さ：３７アミノ酸 (Ｂ)配列の型：アミノ酸 (Ｃ)配列の数：一本鎖 (Ｄ)トポロジー：未知 (ii)分子の型：ペプチド (xi)配列：配列番号７ (２)配列番号８に関する情報： (i)配列の特徴： (Ａ)配列の長さ：１８６塩基対 (Ｂ)配列の型：核酸 (Ｃ)配列の数：二本鎖 (Ｄ)トポロジー：未知 (ii)分子の型：ＤＮＡ（ゲノム） (xi)配列：配列番号８： (２)配列番号９に関する情報： (i)配列の特徴 (Ａ)配列の長さ：６１アミノ酸 (Ｂ)配列の型：アミノ酸 (Ｃ)配列の数：一本鎖 (Ｄ)トポロジー：未知 (ii)分子の型：ペプチド (xi)配列：配列番号９： (２)配列番号１０に関する情報： (i)配列の特徴 (Ａ)配列の長さ３６アミノ酸 (Ｂ)配列の型：アミノ酸 (Ｃ)配列の数：一本鎖 (Ｄ)トポロジー：未知 (ii)分子の型：ペプチド (xi)配列：配列番号１０： (２)配列番号１１に関する情報： (i)配列の特徴 (Ａ)配列の長さ：３７アミノ酸 (Ｂ)配列の型：アミノ酸 (Ｃ)配列の数：一本鎖 (Ｄ)トポロジー：未知 (ii)分子の型：ペプチド (xi)配列：配列番号１１ (２)配列番号１２に関する情報： (i)配列の特徴 (Ａ)配列の長さ：３８アミノ酸 (Ｂ)配列の型：アミノ酸 (Ｃ)配列の数：一本鎖 (Ｄ)トポロジー：未知 (ii)分子の型：ペプチド (xi)配列：配列番号１２： (２)配列番号１３に関する情報 (i)配列の特徴 (Ａ)配列の長さ：２１０塩基対 (Ｂ)配列の型：核酸 (Ｃ)配列の数：二本鎖 (Ｄ)トポロジー：未知 (ii)分子の型：ＤＮＡ（ゲノム） (xi)配列：配列番号１３： (２)配列番号１４に関する情報 (i)配列の特徴 (Ａ)配列の長さ：６３アミノ酸 (Ｂ)配列の型：アミノ酸 (Ｃ)配列の数：一本鎖 (Ｄ)トポロジー：未知 (ii)分子の型：ペプチド (xi)配列：配列番号１４： (２)配列番号１５に関する情報： (i)配列の特徴 (Ａ)配列の長さ：２０７塩基対 (Ｂ)配列の型：核酸 (Ｃ)配列の数：二本鎖 (Ｄ)トポロジー：未知 (ii)分子の型：ＤＮＡ（ゲノム） (xi)配列：配列番号１５： (２)配列番号１６に関する情報： (i)配列の特徴 (Ａ)配列の長さ：６２アミノ酸 (Ｂ)配列の型：アミノ酸 (Ｃ)配列の数：一本鎖 (Ｄ)トポロジー：未知 (ii)分子の型：ペプチド (xi)配列：配列番号１６： (２)配列番号１７に関する情報： (i)配列の特徴 (Ａ)配列の長さ：２１６塩基対 (Ｂ)配列の型：核酸 (Ｃ)配列の数：二本鎖 (Ｄ)トポロジー：未知 (ii)分子の型：ＤＮＡ（ゲノム） (xi)配列配列番号１７： (２)配列番号１８に関する情報： (i)配列の特徴 (Ａ)配列の長さ：６９アミノ酸 (Ｂ)配列の型：アミノ酸 (Ｃ)配列の数：一本鎖 (Ｄ)トポロジー：未知 (ii)分子の型：ペプチド (xi)配列：配列番号１８： (２)配列番号１９に関する情報： (i)配列の特徴 (Ａ)配列の長さ：２１３塩基対 (Ｂ)配列の型：核酸 (Ｃ)配列の数：二本鎖 (Ｄ)トポロジー：未知 (ii)分子の型：ＤＮＡ（ゲノム） (xi)配列：配列番号１９： (２)配列番号２０に関する情報： (i)配列の特徴 (Ａ)配列の長さ：６８アミノ酸 (Ｂ)配列の型：アミノ酸 (Ｃ)配列の数：一本鎖 (Ｄ)トポロジー：未知 (ii)分子の型：ペプチド (xi)配列：配列番号２０： (２)配列番号２１に関する情報： (i)配列の特徴 (Ａ)配列の長さ：４２塩基対 (Ｂ)配列の型：核酸 (Ｃ)配列の数：一本鎖 (Ｄ)トポロジー：未知（(i)分子の型：ＤＮＡ（ゲノム） (xi)配列配列番号２１： (２)配列番号２２に関する情報： (i)配列の特徴 (Ａ)配列の長さ：４０塩基対 (Ｂ)配列の型：核酸 (Ｃ)配列の数：一本鎖 (Ｄ)トポロジー：未知 (ii)分子の型：ＤＮＡ（ゲノム） (xi)配列：配列番号２２： (２)配列番号２３に関する情報： (i)配列の特徴 (Ａ)配列の長さ：４０塩基対 (Ｂ)配列の型：核酸 (Ｃ)配列の数：一本鎖 (Ｄ)トポロジー：未知 (ii)分子の型：ＤＮＡ（ゲノム） (xi)配列：配列番号２３： (２)配列番号２４に関する情報： (i)配列の特徴 (Ａ)配列の長さ：５２塩基対 (Ｂ)配列の型：核酸 (Ｃ)配列の数：一本鎖 (Ｄ)トポロジー：未知 (ii)分子の型：ＤＮＡ（ゲノム） (xi)配列：配列番号２４： (２)配列番号２５に関する情報： (i)配列の特徴 (Ａ)配列の長さ：４１塩基対 (Ｂ)配列の型：核酸 (Ｃ)配列の数：一本鎖 (Ｄ)トポロジー：未知 (ii)分子の型：ＤＮＡ（ゲノム） (xi)配列：配列番号２５： (２)配列番号２６に関する情報： (i)配列の特徴 (Ａ)配列の長さ：３０塩基対 (Ｂ)配列の型：核酸 (Ｃ)配列の数：一本鎖 (Ｄ)トポロジー：未知 (ii)分子の型：ＤＮＡ（ゲノム） (xi)配列配列番号２６： (２)配列番号２７に関する情報： (i)配列の特徴 (Ａ)配列の長さ：７２３塩基対 (Ｂ)配列の型：核酸 (Ｃ)配列の数：一本鎖 (Ｄ)トポロジー：未知 (ii)分子の型：ＤＮＡ（ゲノム） (xi)配列：配列番号２７： (２)配列番号２８に関する情報： (i)配列の特徴 (Ａ)配列の長さ：１８８アミノ酸 (Ｂ)配列の型：アミノ酸 (Ｃ)配列の数：一本鎖 (Ｄ)トポロジー：未知 (ii)分子の型：ペプチド (xi)配列：配列番号２８：

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ，ＮＺ

Claims

【特許請求の範囲】１．リンゴ類果実の接ぎ穂または根茎栽培品種を、溶菌蛋白をコードする遺伝子で形質転換することを特徴とするリンゴ類果実の接ぎ穂または根茎栽培品種に火傷病耐性を付与する方法。２．該形質転換が、リンゴ類果実の接ぎ穂または根茎栽培品種の組織を、溶菌蛋白をコードする遺伝子を含むベクターで形質転換されたアグロバクテリウム（ Agrobacterium）属の細菌の接種物と接触させることからなる請求項１記載の方法。３．アグロバクテリウム属の細菌が、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）である請求項２記載の方法。４．アグロバクテリウム・ツメファシエンスがＬＢＡ４４０４株である請求項３記載の方法。５．組織が、葉組織、根組織、***組織およびプロトプラストからなる群から選ばれる請求項１記載の方法。６．該形質転換が、粒子が細胞内部に浸透し、溶菌蛋白をコードする遺伝子を含むベクターを細胞内部に導入するに有効な条件下、リンゴ類果実の接ぎ穂または根茎栽培品種の細胞組織に粒子を推進させることからなる請求項１記載の方法。７．ベクターが粒子に付随し、それによりベクターが粒子と共に細胞内部に運びこまれる請求項６記載の方法。８．ベクターが細胞を囲み、粒子の覚醒によって細胞内部に導入される請求項６記載の方法。９．さらに、溶菌蛋白をコードする遺伝子で形質転換された栽培品種を再生させてトランスジェニック・リンゴ類果樹を形成することからなる請求項１記載の方法。１０．溶菌蛋白がリゾチーム、セクロピン類、アタシン類およびそれらの同族体からなる群から選択される請求項１記載の方法。１１溶菌蛋白がアタシンＥである請求項１０記載の方法。１２．リンゴ根茎がＭ．７、Ｍ．９、Ｍ．２６、Ｍ．２７、ＭＭ．１０６、ＭＭ．１１１、メルトン７９２、マルバ・カイド、ブダゴフスキ−９、マーク、オタワ３および苗からなる群から選ばれる請求項１記載の方法。１３．根茎がＭ．２６である請求項１２記載の方法。１４．ベクターが、ｐＬＤＢ１０、ｐＬＤＢ１５、ｐＢＰＲＳ１、ｐＢＣＣＳ１、ｐＢＰＲＢ３７およびｐＢＣＣＢ３７からなる群から選択される請求項２記載の方法。１５．アグロバクテリウム属の細菌がアグロバクテリウム・ツメファシエンス株ＬＢＡ４４０４であり、根茎がＭ．２６である請求項２記載の方法。１６．リンゴ類果実の接ぎ穂または根茎栽培品種が、リンゴ接ぎ穂または根茎栽培品種である請求項１記載の方法。１７．リンゴ類果実の接ぎ穂または根茎栽培品種が、ナシ接ぎ穂または根茎栽培品種である請求項１記載の方法。１８．栽培品種に火傷病耐性を付与する菌蛋白をコードする遺伝子で形質転換されたトランスジェニック・リンゴ類果実の接ぎ穂または根茎栽培品種。１９．溶菌蛋白がリゾチーム、セクロピン類、アタシン類およびそれらの同族体からなる群から選択される請求項１８記載のトランスジェニック栽培品種。２０．溶菌蛋白がアタシンＥである請求項１９記載のトランスジェニック栽培品種。２１．リンゴ根茎がＭ．７、Ｍ．９、Ｍ．２６、Ｍ．２７、ＭＭ．１０６、ＭＭ．１１１、メルトン７９２、マルバ・カイド、ブダゴフスキー９、マーク、オタワ３および苗からなる群から選ばれる請求項１８記載のトランスジェニック栽培品種。２２．根茎がＭ．２６である請求項２１記載のトランスジェニック栽培品種。２３．リンゴ類果実がリンゴである請求項１８記載のトランスジェニック栽培品種。２４．リンゴ類果実がナシである請求項１８記載のトランスジェニック栽培品種。２５．木に火傷病耐性を付与する菌蛋白をコードする遺伝子で形質転換されたトランスジェニック・リンゴ類果樹。２６．溶菌蛋白がリゾチーム、セクロピン類、アタシン類およびそれらの同族体からなる群から選択される請求項２５記載のトランスジェニック果樹。２７．溶菌蛋白がアタシンＥである請求項２６記載のトランスジェニック果樹。２８．リンゴ類果実がリンゴである請求項２５記載のトランスジェニック果樹。２９．リンゴ類果実がナシである請求項２５記載のトランスジェニック果樹。