CN110592087A

CN110592087A - Sgr基因的沉默在芸薹属植物中的应用

Info

Publication number: CN110592087A
Application number: CN201910903079.1A
Authority: CN
Inventors: 冯辉; 王楠; 章云; 黄胜楠; 刘志勇; 李承彧; 冀瑞琴; 王玉刚
Original assignee: Shenyang Agricultural University
Current assignee: Shenyang Agricultural University
Priority date: 2019-09-24
Filing date: 2019-09-24
Publication date: 2019-12-20

Abstract

本发明公开了SGR基因的沉默在芸薹属植物中的应用。本发明提供了能够降低植物中SGR基因的编码蛋白的表达量和/或活性的物质在如下任一中的应用：提高植物的耐贮性；延长植物的货架期；降低植物在贮藏和/或运输过程中干物质的损耗；培育持绿植物；提高植物叶绿素含量。本发明提供的技术方案为植物特别是芸薹属植物的选育提供了新的方向和珍贵的基因资源。

Description

SGR基因的沉默在芸薹属植物中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及SGR基因的沉默在芸薹属植物中的应用。

背景技术

SGR(stay-green)基因，编码脱镁螯合酶，是植物叶绿素降解过程的关键酶基因。Ren等从拟南芥中鉴定出一个叶片持绿相关基因AtNYE1。Jiang等从日本粳稻花之舞钴60辐射的种苗中筛选出一株SGR基因缺陷突变体。随后Park从水稻(Oryza sativa)中分离出该基因的同源基因OsSGR。Alos等认为柑橘(Citrus L.citrus orange)果皮持绿表型可能是SGR基因表达受阻所致。此后在番茄(Solarium Lycopersacum)、甜椒(Capsaum annuum)、羊茅草(Festuca pratensas)、豌豆(Pisum satavum)、乌塌菜(Brassaca campestrasL.ssp.Chanensas L Var.rosularas Tsen et Leesavoy)、香蕉(Muses AAA)、大豆(Glycane max L Merr.)等许多作物上也先后发现SGR1/NYE1同源基因。

Barry和Pandey研究了栽培番茄26个不同程度的持绿突变体，发现这些突变体主要是由于GF(SGR同源基因)等位基因发生突变导致的，如某些位点碱基点突变，碱基***、碱基缺失，或有些序列提前***了终止密码子所致，虽然这些基因突变表现出不同程度的持绿，但经过鉴定，这些基因都失去了GF基因的功能，属于无效等位基因。

发现和利用与重要经济性状有关的功能基因是实现农作物优良品种培育的有效途径。在作物育种史上，凡是突破性的成就，都与关键基因的利用密不可分。20世纪50年代，美国对抗胞囊线虫基因的有效利用使得大豆总产量跃居世界第一，并一直保持至今；60年代，矮杆基因的应用导致世界粮食的“绿色革命”和粮食产量的飞跃；70年代，袁隆平先生对水稻野生不育基因的改良催生了中国杂交水稻的诞生并轰动世界；90年代，世界范围内的育种专家开始对重要基因资源进行***性地研究和应用。

随着生物技术的发展，对基因功能的研究帮助人们更好地认识基因表达调控的本质并加以利用,与此同时新兴的基因沉默技术也在不断涌现。基于沉默技术的植物遗传改良及作物育种已取得了相当大的成就。植物病、虫害的防治传统方法主要依赖于化学试剂。然而，化学试剂的大量使用对人类健康和环境构成了严重威胁。此外，农药的长期使用也间接提高了病、虫的耐药性。因此，寻找新的病、虫害防治手段成为近年来研究的热点之一。由于目前具有高水平抗病、虫害的作物品种还未被发现，运用杂交的方法培育抗病、虫害的作物品种受到了一定程度的限制。研究表明，一些来自病原体或昆虫的sRNAs可以进入宿主细胞并抑制宿主内的免疫途径，而宿主细胞中的sRNA也可以转移至病原体/害虫中抑制病原菌的毒性。这一重大发现再一次证明了宿主诱导基因沉默(host-induced genesilencing,HIGS)在抵御生物胁迫中的可行性。Yang等以大豆(Glycine max)花叶病毒(Mosaic virus)SMV SC3 P3基因中一段302bp序列为靶片段，构建RNAi载体并转化大豆，发现转基因植株在野外条件下连续3年对SMV SC3有抗性；与野生型植株相比，转基因植株对其他四种SMV病毒(SC7,SC15,SC18,SMV-R)的抗性均有所提高。

除了生物因素，一些非生物胁迫如：寒冷、干旱、盐分以及重金属等，同样对植物的生长发育和产量造成严重的影响。植物对非生物胁迫响应是许多相关基因基于转录和转录后基因调控的复杂分子过程。虽然目前在与植物抗逆相关基因和局部调节机制的研究方面已有所突破，但植物整体抗逆调节机制仍不清楚。研究表明，植物对胁迫条件的耐受性受胁迫响应基因的调控。目前对植物抵御非生物逆境研究思路相对简单，即对潜在的非生物逆境响应基因进行鉴定与调控。这些潜在的基因大致分为以下三类。第一类，编码不同渗透调节物质的基因；第二类，编码离子转运和水分吸收蛋白的基因；第三类，调节转录控制和信号传导相关的基因，如：MYB、WRKY、DREB等转录因子。

采用基因沉默技术增强植物抗逆性的主要是通过干扰或沉默一些逆境响应的负调控因子来实现。单一地过表达或干扰前两类基因虽然可以提高植物非生物胁迫抗性，但植物抵御胁迫的能力并不能在转化植株中得到完全体现。为使植物抗逆性得到综合性提高，在近年的研究中科研人员以转录因子和信号转导中的相关基因作为操纵对象，转而将一些下游基因的表达与生理分析相结合作为评价转基因植株抗非生物胁迫能力的依据。Hu等将番茄转录因子基因SlHB2沉默后，植株的耐盐抗旱性有所提高，不论在正常条件还是胁迫条件下，多个与抵御胁迫相关的基因均显著上调。Yin等在研究番茄转录因子基因SlMBP8时发现，其启动子区域存在脱落酸(abscisic acid,ABA)、吲哚乙酸(indole-3-ceticacid,IAA)等激素响应元件，说明SlMBP8可能作为一种胁迫响应转录因子参与番茄响应非生物胁迫的信号传导过程，将SlMBP8沉默后，沉默植株耐盐、抗旱性得到了明显提高。

芸薹属(Brassica)是一个十字花科下的属。此属的植物包括了多种重要的农业及园艺作物，包括了白菜、包心菜和芥菜等常见的蔬菜。此属物种原生于西欧、环地中海地区以及亚洲的温带地区。主要分布在地中海区域；中国有13个栽培种、11变种，1变型，在我国南北各地广泛栽培，通常用于根茎，结球或苗用叶菜栽培，在蔬菜周年供应中占据重要地位。在根茎，结球菜和叶用菜的栽培后期，以及在叶球贮运保鲜及货架期间，其外叶容易衰老变黄，造成产量损失和产品质量下降。持绿性对于芸薹属作物品种遗传改良具有非常重要的意义，可以用作良种繁育和杂交育种的筛选标记。持绿突变体在观赏植物品种选育和栽培中也有很大的应用潜力。

发明内容

本发明的目的是提供SGR基因的沉默在芸薹属植物中的应用。

第一方面，本发明要求保护能够降低植物中SGR基因的编码蛋白的表达量和/或活性的物质在如下任一中的应用：

(A1)提高植物的耐贮性。

(A2)延长植物的货架期。

(A3)降低植物在贮藏和/或运输过程中干物质的损耗。

(A4)降低植物在贮藏和/或运输过程中的失重率。

(A5)提高植物叶绿素含量。

其中，所述能够降低植物中SGR基因的编码蛋白的表达量和/或活性的物质可为任何能够降低植物中SGR基因的编码蛋白的表达量和/或活性的物质。所述降低植物中SGR基因的编码蛋白的表达量和/或活性可指任何方式的突变沉默或干扰所导致的基因表达降低或产物失活。

进一步地，所述能够降低植物中SGR基因的编码蛋白的表达量和/或活性的物质可为如下任一：

(B1)针对SGR基因的基因组DNA序列的基因编辑工具；

所述基因编辑工具为序列特异核酸酶，所述序列特异核酸酶能够特异性剪切编码所述SGR基因的基因组DNA序列中的靶标序列。

其中，所述序列特异核酸酶可为CRISPR/Cas9核酸酶、转录激活因子样效应因子核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,TALEN)或锌指核酸酶(Zinc-finger nucleases,ZFN)等。所述序列特异核酸酶对所述靶标片段进行特异性剪切会造成所述靶标片段发生***突变、缺失突变和/或替换突变，从而使得所述SGR基因的基因组DNA序列发生能够抑制具有正常功能的SGR蛋白的表达的突变。

(B2)针对SGR基因的RNA干扰片段。

(B3)能够编码(B1)中所述基因编辑工具或者能够转录(B2)中所述RNA干扰片段的DNA片段。

(B4)含有步骤(B3)所述DNA片段的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系。

第二方面，本发明要求保护一种培育植物品种的方法。

本发明所要求保护的培养植物品种的方法为培育具有如下(C1)-(C5)所示性状中至少一种的植物品种的方法，可包括使受体植物中SGR基因的编码蛋白的表达量和/或活性降低的步骤：

(C1)耐贮性提高。

(C2)货架期延长。

(C3)在贮藏和/或运输过程中干物质的损耗降低。

(C4)在贮藏和/或运输过程中的失重率降低；

(C5)叶绿素含量提高。

其中所述使受体植物中SGR基因的编码蛋白的表达量和/或活性降低可指任何方式的突变沉默或干扰所导致的所述SGR基因表达降低或产物失活。

进一步地，所述使受体植物中SGR基因的编码蛋白的表达量和/或活性降低可为如下任一：

(I)育种进程等有性杂交手段致使所述SGR基因的编码蛋白表达降低或失活；

(II)组织培养手段致使所述SGR基因的编码蛋白表达降低或失活；

(III)诱变手段(任何形式的物理及化学诱变)致使所述SGR基因的编码蛋白表达降低或失活。

在所述方法中，所述使受体植物中SGR基因的编码蛋白的表达量和/或活性降低的方法可包括如下步骤：向所述受体植物中导入前文所述的能够降低植物中SGR基因的编码蛋白的表达量和/或活性的物质。

在所述方法中，所述使受体植物中SGR基因的编码蛋白的表达量和/或活性降低的方法可包括如下步骤：将所述受体植物中的SGR基因替换为所述SGR基因的无效等位基因。

所述无效等位基因(null allele)是基因突变后基因功能消失的原等位基因位点的DNA序列。

在前文第一方面和第二方面中，所述SGR基因的编码蛋白(称为BrNYE1蛋白)可为如下任一所示蛋白质：

(D1)氨基酸序列为SEQ ID No.4的蛋白质；

(D2)将SEQ ID No.4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

(D3)与(D1)-(D2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；

(D4)在(D1)-(D3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

进一步地，所述SGR基因(称为BrNYE1基因)可是如下任一所示DNA分子：

(E1)SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示的DNA分子；

(E2)在严格条件下与(E1)限定的DNA分子杂交且编码所述BrNYE1蛋白的DNA分子；

(E3)与(E1)或(E2)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述BrNYE1蛋白的DNA分子。

其中，SEQ ID No.2为BrNYE1基因的基因组序列；SEQ ID No.3为BrNYE1基因的CDS序列。

在前文第二方面中，所述SGR基因的无效等位基因(称为Brnye1基因)可为如下任一所示DNA分子：

(G1)SEQ ID No.1所示的DNA分子；

(G2)在严格条件下与(G1)限定的DNA分子杂交且编码所述Brnye1蛋白的DNA分子；

(G3)与(G1)或(G2)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述Brnye1蛋白的DNA分子。

上述各蛋白质中，所述标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。

上述基因中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNa₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

在本发明中，所述叶绿素含量为叶片中叶绿素含量。

在前文第一方面和第二方面中，所述植物可为双子叶植物或单子叶植物。

进一步地，所述双子叶植物可为十字花科植物；

更进一步地，所述植物为芸薹属植物(如白菜)或拟南芥属植物(如拟南芥)。

第三方面，本发明要求保护一种培育具有如下(C1)-(C5)中任一所示性状的白菜(Brassica campestris)品种的方法。

(C1)耐贮性提高。

(C2)货架期延长。

(C3)在贮藏和/或运输过程中干物质的损耗降低。

(C4)降低植物在贮藏和/或运输过程中的失重率。

(C5)叶绿素含量提高。

该方法包括如下步骤(G1)或(G2)：

(G1)以白菜品种A为母本，将SEQ ID No.1所示的DNA分子转育到所述白菜品种A中，培育得到目标白菜品种。

(G2)以白菜不育系A为母本，将SEQ ID No.1所示的DNA分子转育到所述白菜不育系A中，培育得到目标白菜不育系，用于杂交配组。

进一步地，在步骤(G1)中，是通过多代回交，将SEQ ID No.1所示的DNA分子转育到所述白菜品种A中，培育得到所述目标白菜品种。

进一步地，在步骤(G2)中，是以所述白菜不育系A为母本，通过多代回交，将SEQ IDNo.1所示的DNA分子转育到所述白菜不育系A中，培育得到所述目标白菜不育系，用于杂交配组。

所述白菜品种A不含有SEQ ID No.1所示的DNA分子。

所述白菜不育系A不含有SEQ ID No.1所示的DNA分子。所述白菜不育系A为农艺性状优良的不育系。

第四方面，本发明要求保护一种培育持绿青梗菜品种的方法。

所述方法具体包括如下步骤：

(H1)以青梗菜持绿突变体‘nye’为母本，以‘13A510’为父本，进行杂交，从F₂代中筛选出具有持绿表型植株作为供体材料，利用游离小孢子培养创造出青梗菜持绿双单倍体；

(H2)以与Ogrua不育源细胞质雄性不育系杂交的青梗菜‘East 18’为不育源，以青梗菜持绿突变体‘nye’为育种轮回亲本材料，培育青梗菜持绿性细胞质雄性不育系；

(H3)利用步骤(H1)得到的持绿双单倍体与步骤(H2)得到的持绿性细胞质雄性不育系配制杂交组合，得到目标青梗菜。

在本发明中，所述白菜(Brassica campestris)为芸薹属A基因组白菜类蔬菜。

本发明首次发现了SGR基因沉默对植物叶色，植株货架期及耐储性存在影响，并通过试验验证了所述基因具有调控叶色的功能，SGR基因沉默突变体呈现持绿突变表型，衰老叶片叶绿素含量明显提高，SGR基因沉默显著延长了白菜货架期，提高了耐储性，同时也极大地降低了贮藏或运输过程中干物质的损耗。而回补或过表达所述基因能够降低突变体衰老叶片叶绿素含量，间接说明了SGR基因沉默在十字花科芸薹属植物货架期、耐贮性等方面的应用。实验证明，白菜Brnye1基因能够保证植株采收后期、货架期及储运期叶片始终保持绿色不变黄，提高商品性。本发明提供的技术方案为植物特别是芸薹属植物的选育提供了新的方向和珍贵的基因资源。

附图说明

图1为转BrNYE1基因实验相关结果图。a为T₂阳性转基因植物的黄色表型形态(nye1-1，左；T₂转基因植物，右)；b为阳性转基因植株PCR验证(目的条带795bp)；c为阳性转基因植株衰老叶片叶绿素含量分析(不同小写字母之间表示差异显著)；d为阳性转基因植株衰老叶片中BrNYE1基因表达的相对定量分析。oxBrNYE1#1-6表示向拟南芥持绿突变体nye1-1中导入BrNYE1基因后的6个转基因阳性株系。

图2为SGR基因沉默突变体与常规品种进行常温贮藏实验对比图。

图3为SGR基因沉默突变体与常规品种进行低温贮藏实验对比图。

图4为持绿白菜的创制过程及结果图。采用小孢子培养法，获得持绿白菜的双单倍体(DH)。a为小孢子胚细胞；b为胚状体；c为愈伤组织；d为再生植株；e为再生植株生根；f为所获持绿植株。

图5为CMS定向转育的遗传模型。

图6为绿白菜细胞质不育系与其不育源对比图。a为不育源East 18”植物；b持绿不育新品系“CMS-nye”单株；c为不育源“East18”的花序；d持绿不育新品系“CMS-nye”花序。

图7为常规对照品种“Wall918”与持绿白菜品种比较实验图。

图8为常规品种“Wall 98”(CK)与新持绿白菜品种组合(ZH01-15)产量对比。公斤是产量的单位。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

青梗菜持绿突变体‘nye’和非持绿青梗菜品种‘13A510’：均记载于“Wang et al.,Identification and fine mapping of a stay-green gene(Brnye1)in pakchoi(Brassica campestris L.ssp.chinensis).Theoretical and Applied Genetics,2018,131:673-684”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用，不得他用。

拟南芥持绿突变体nye1-1：记载于“Ren et al.,Identification of novelchloroplast protein AtNYE1 regulating chlorophyll degradation during leafsenescence in Arabidopsis.Plant Physiol 144(3):1429–1441”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用，不得他用。

青梗菜‘East 18’：为记载于“徐海,陈龙正,宋波,张慧,况媛媛,袁希汉.2013.东方18号白菜雄性不育杂交制种技术[J].江苏农业科学,41(07):138-139.”一文中的“东方18号”，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用，不得他用。

青梗菜‘Wall 918’：为记载于“屈高扬.2018.矮脚黄和青梗菜雄性不育系的创制与利用[D].沈阳农业大学.”一文中的‘沃尔918’，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用，不得他用。该品种耐热性强，束腰美观，叶色亮绿肥厚，整齐高产，抗病性强易高产。

pCAMIBA1300-M载体：是申请人在原购自于武汉伯远生物的商业空载pCAMIBA1300(产品目录号CAS：MLCC1244)基础上，以其为骨架，进行多酶切位点及接口的改造后所得的质粒；具体为向pCAMIBA1300载体的多克隆位点(MCS)处引入单一的AarI酶切识别序列CACCTGC。

实施例1、白菜BrNYE1基因的功能验证

一、BrNYE1基因的克隆

本发明中涉及的SGR基因，是本团队前期通过二代测序技术与传统连锁标记相结合的方法从青梗菜持绿突变体‘nye’中定位克隆获得的持绿基因Brnye1，根据文献中持绿基因Brnye1序列(Brnye1基因序列如SEQ ID No.1)，利用Primer 5软件设计CDS全长扩增引物，具体设计的引物序列如下：

上游引物：5'-cagtCACCTGCaaaacaacATGTGTAGTTTGTCAGCGAA-3'；

下游引物：5'-cagtCACCTGCaaaatacaCTAGAGTTTCTCCGGCTTAG-3'。

其中，小写为保护碱基，下划线表示酶切位点，大写表示基因序列。

以非持绿青梗菜品种‘13A510’的cDNA为模板，利用上述引物PCR扩增获得Brnye1基因的等位基因BrNYE1(BrNYE1基因的基因组序列如SEQ ID No.2所示，CDS序列如SEQ IDNo.3所示，编码蛋白如SEQ ID No.4)，该等位基因的核苷酸序列作为遗传互补转化序列。

二、植物表达载体的构建和农杆菌的转化

构建基因BrNYE1的过表达载体，具体步骤如下:

1、目的基因的扩增

PCR反应体系(50μl)：KOD酶1μl；2×KOD Buffer 25μl；dNTP Mixture 10μl；上下游引物各1μl；cDNA1μl；蒸馏水补足至50μl。其中，上下游引物为步骤一种设计的上下游引物；cDNA为从非持绿青梗菜品种‘13A510’中提取总RNA后反转录所得的cDNA。

PCR反应参数设置：98℃预变性10min；98℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，32个循环；72再延伸15min；14℃10min。

目的基因的扩增产物经浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳检测后，采用TaKaRa公司琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的基因，具体操作步骤如下：(1)制备浓度为1％的琼脂糖凝胶，采用琼脂糖凝胶电泳鉴定、分离目的DNA条带；(2)用滤纸吸除凝胶表面附着的缓冲液，并在紫外灯照射下小心切出含目的基因的胶块；(3)取出胶块后称其质量，按1mg＝1μL比例计算胶块体积；(4)取3倍胶块体积量的Buffer GM加入胶块中；(5)50℃水浴加热，以促进胶块完全溶解；(6)琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒中取出核酸纯化柱，置于收集管上；(7)取步骤5的澄清溶液至纯化柱中，12000rpm离心1min，弃滤液；(8)取500μL的Buffer WA至核酸纯化柱中，室温12000rpm离心30s，弃滤液；(9)取700μL的Buffer WB至核酸纯化柱中，室温12000rpm离心30s，弃滤液；(10)重复步骤(8)操作；(11)将核酸纯化柱放置于收集管上，室温12000rpm空离2min，尽可能除去残留液体；(12)弃收集管，取核酸纯化柱置于1.5mL EP管中，并加入30μL洗脱液洗脱核酸纯化柱膜上附着的DNA(洗脱液可事先置于65℃恒温水浴锅内预热，有助于洗脱DNA)，室温静置2min；(13)室温12000rpm离心2min，将回收后的DNA于-20℃低温冰箱保存备用；(14)取微量回收产物，采用浓度1％的琼脂糖凝胶电泳检测回收质量。

2、重组载体的构建及鉴定

目的片段与空载酶切连接体系(10μl)：pCAMIBA1300-M载体(潮霉素抗性)2μl；限制性内切酶AarI 0.5μl；目的基因(步骤1扩增得到)3μl；T4 Buffer 1μl；T4连接酶0.5；蒸馏水补足至10μl。反应条件：恒温水浴锅，37℃酶切2h

按照如下步骤进行重组质粒的转化：(1)取200μL大肠杆菌感受态细胞DH5a与5μL连接产物混合，冰浴30min；(2)迅速置于42℃恒温水浴锅中，热激90s，冰浴2min；(3)加入500μL LB液体培养基，混匀；(4)37℃、200rpm,培养45min，使细胞恢复正常生长状态；(5)将菌液均匀涂布于LB固体培养基平板上；(6)30min后，置37℃恒温培养箱，过夜培养。

按照如下进行重组质粒的菌检：

菌检反应体系(20μl)：2×Mix 10μl；正向检测引物1μl；反向检测引物1μl；蒸馏水补足至20μl。

正向菌检引物：5'-ATGTGTAGTTTGTCAGCGAA-3'；

反向菌检引物：5'-CTAGAGTTTCTCCGGCTTAG-3'。

PCR反应参数设置：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，32个循环；72再延伸15min；14℃10min。

菌检正确，摇菌，抽提质粒，酶切验证(AarI)。

重组质粒的抽提，具体操作步骤如下：从LB固体培养基平板中挑取单克隆接种至终浓度为50μg/mL的卡那抗性LB液体培养基中，37℃过夜培养；(2)取4mL活化菌液，室温10000rpm离心2min，彻底弃除上清；(3)取250μL含核糖核酸酶A的SolutionⅠ试剂彻底重悬菌块；(4)取250μL SolutionⅡ试剂裂解菌块，上下轻轻颠倒数次直至菌体透明；(5)取350μL SolutionⅢ试剂，颠倒数次，直至形成白色紧实絮状物；(6)室温12000rpm离心10min，取上清；(7)从试剂盒中取出核酸纯化柱，放置于收集管上；(8)取上述操作步骤(6)的澄清上清至核酸纯化柱中，室温12000rpm离心1min，弃滤液；(9)取500μL的Buffer WA至核酸纯化柱中，室温12000rpm离心30s，弃滤液；(10)取700μL的Buffer WB至核酸纯化柱中，室温12000rpm离心30s，弃滤液；(11)重复上述操作步骤(10)；(12)将核酸纯化柱放置于收集管上，室温12000rpm空离2min，尽可能除去残留液体；(13)弃收集管，取核酸纯化柱置于1.5mLEP管中，并加入50μL洗脱液洗脱核酸纯化柱膜上附着的DNA(洗脱液可事先置于65℃恒温水浴锅内预热，有助于洗脱DNA)，室温静置2min；(14)室温12000rpm离心2min，洗脱核酸纯化柱膜上附着的DNA，并于-40℃低温冰箱保存备用；(15)取微量回收产物，采用浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳检测质粒抽提质量。

按照如下进行重组质粒的酶切鉴定(AarI)：

酶切反应体系(10μL体系)：10×Green Buffer 1μL；限制性内切酶AarI 0.5μL；重组质粒3μL；灭菌蒸馏水补足至10μL。

温箱37℃孵育30min，目标条带为795bp左右的片段，酶切产物可利用浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测分析。经检测，出现目标大小条带，说明重组载体构建成功。

将所得重组载体命名为pCAMIBA1300M-BrNYE1，该载体的结构描述为将SEQ IDNo.3所示基因***到pCAMIBA1300-M载体的酶切位点AarI处后得到的重组质粒。

3、将得到的重组植物表达载体pCAMIBA1300M-BrNYE1利用冻融法将植物表达载体转入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)GV3101。

实验同时设置向根癌农杆菌GV3101中导入pCAMIBA1300-M空载体的对照。

三、BrNYE1基因在拟南芥中表达

1、拟南芥种植

本实验使用的拟南芥持绿突变体nye1-1，取100粒种子放到4℃冰箱低温处理3-5天后点播于10cm×10cm营养钵中，营养钵中装有草炭:蛭石:珍珠岩＝7:4:2的基质，并已浇透自来水。完成后，在钵上集中敷一层透明的塑料薄膜，置于培养室培养3-4天，种子萌发后适当掀膜，放风。小苗稍健壮，去掉薄膜，浇透水。掀膜后每隔一周浇一次透水。待苗长出6-8片真叶时开始浇1/2MS营养液，每次浇10mL，营养液和水分开浇，直至抽薹开花。

2、农杆菌介导，蘸花法侵染

将异源过表达载体(步骤二构建的重组表达载体pCAMIBA1300M-BrNYE1)通过冻融法转入农杆菌中，涂板(含Kana)，封口倒置培养于28℃条件下暗培养48h。挑取圆形大个单菌落于10mL液体LB(Kana)中，28℃，200rpm振摇48h，待菌液浑浊后取5μL检测，合格的菌液取1mL送华大基因测序，取1mL于100mL液体LB中(Kana)扩繁，其余分装到2mL离心管中保存，备用。待拟南芥长到盛蕾期，进行侵染实验。第一天给拟南芥植株浇透水，当天用小剪刀将拟南芥植株上已开放的小花和已结的角果全部剪掉，保留即将开放的大花蕾。同时将扩繁振摇48h的浑浊菌液取出10μL，用酶标仪测OD600，判断菌液浓度。然后均分到50mL离心管中12,000rpm，10min离心，注意一定要配平；弃上清，加50mL 1/2MS培养基(提前灭菌，含有表面活性剂)，混匀配平，离心收菌，倒掉上清，重复一次。将回收到的菌种用含有表面活性剂的1/2MS液体培养基稀释，测得OD600为0.8-1.2时，菌液处理完成。将浓度合格的菌液倒入灭过菌的大口径玻璃培养皿中，将修剪过的拟南芥的花序完全浸于菌液内，来回均匀的转动培养皿，50s后取出，将植株平放于黑暗环境下，依次侵染30株。24h后将侵染的拟南芥植株取出，竖直放置，在适宜的环境中培养，到后期单株收种。

3、转基因植株筛选及鉴定

分别取每个单株收取的种子若干粒，混匀后装入一个2mL的离心管中，在4℃冰箱内放置3天，取出后加入ddH₂O浸泡1h，与此同时将用到的试剂放入超净工作台紫外杀菌。将浸泡的种子，3,000rpm，离心1min，弃上清；在超净工作台上向装有拟南芥种子的离心管中加入1mL 1％升汞，盖盖并上下翻转离心管，5min后离心，弃上清；然后加入70％乙醇1mL，上下颠倒，5min后离心，弃上清；再向离心管中加入1mL ddH₂O，上下颠倒清洗，重复5次，每次5min。将得到的种子用500μL ddH₂O悬浮，移液器吸打到直径为9cm的MS固体培养基上(Hyg)，轻轻旋转，平铺均匀，盖盖并用封口膜封严，置于20-25℃常温光照环境中筛选25d。将筛选培养基中成活的植株用自来水冲洗根部，移栽到浇透水的基质中，覆一层塑料薄膜，置于拟南芥培养室，常温光照环境培养。五天后，揭膜，浇水施肥。待植株长出10-15片真叶后，各单株分别取2-3片嫩叶，提取基因组DNA及总RNA，进行PCR检测，qRT-PCR及叶片叶绿素含量的检测。

其中，进行PCR检测采用的引物序列如下：

正向引物：5'-ATGTGTAGTTTGTCAGCGAA-3'；

反向引物：5'-CTAGAGTTTCTCCGGCTTAG-3'。

扩增得到大小为795bp(如SEQ ID No.3所示)的目的片段即为阳性。

进行qRT-PCR检测，以ACT2为内参基因(Ren et al.2007)，采用的引物序列如下：

用于检测内参基因ACT2的引物：

正向引物：5'-CGCTCTTTCTTTCCAAGCTC-3'；

反向引物：5'-AACAGCCCTGGGAGCATC-3'。

用于检测BrNYE1基因的引物：

正向引物：5'-GCA TCC ACC AAC GCTTC-3'。

反向引物：5'-GCC TAT TTG CCC ATC CTT G-3'；

转基因拟南芥叶片叶绿素含量的检测方法：选取抗性筛选所得植株，取倒数第二片衰老叶片，参照Arnon(1949)的方法略有修改，选用80％(v/v)丙酮乙醇溶液提取植株第四片真叶的叶绿素。利用DU 800型紫外分光光度计(Beckman Coulter公司，美国)分别在663、645和470nm波长下测定吸光值，每次测量重复3次。参照Holm(1954)的方法计算总叶绿素含量。

实验同时设置哥伦比亚野生型拟南芥(Col-0)、未转基因的拟南芥持绿突变体(nye1-1)和向拟南芥持绿突变体中转入pCAMIBA1300-M空载体的对照。

未转基因的拟南芥持绿突变体(nye1-1)和向nye1-1中转入BrNYE1基因的拟南芥单株的植株表型如图1中a所示。各拟南芥株系的PCR检测BrNYE1基因表达量结果如图1中b所示，叶片叶绿素含量检测结果如图1中c所示，qRT-PCR检测BrNYE1基因表达量结果如图1中d所示。空载对照拟南芥的各项检测指标与Col-0基本一致，无统计学差异。

上述结果表明：与nye1-1相比，向nye1-1中转入BrNYE1基因的拟南芥单株的叶色衰老时期恢复为黄色(与哥伦比亚野生型拟南芥表型基本一致)，衰老叶片中叶绿素含量降低，符合转基因预期的表型。

实施例2、白菜BrNYE1基因沉默的应用

白菜(Brassica campestris L.ssp.chinensis)幼嫩时采收，在常温下2d后开始黄化，5d后全部枯黄，货架期仅有3d。本试验以SGR基因沉默持绿突变体(青梗菜持绿突变体‘nye’)与市售常规品种矮脚青(自用编号‘13A510’)为试材，研究其采后叶片衰老变黄情况，为货架期保鲜提供理论基础。

SGR基因沉默持绿突变体(青梗菜持绿突变体‘nye’)的遗传背景为非持绿青梗菜品种‘13A510’，其与非持绿青梗菜品种‘13A510’相比差别仅在于将非持绿青梗菜品种‘13A510’基因组中的BRNYE1基因(SEQ ID No.3)替换为了其无效等位基因Brnye1基因(SEQID No.1)，而基因组中其他序列两者完全一致。

突变体及对照品种种植于沈阳农业大学园艺学院科研基地，播种后40天，选择无病虫害长势均一植株进行采收，采后立即运回实验室，去除老黄叶后，在室内摊晾2～4h。分别在对照品种和持绿突变体中随机选择30株植株置于一个收纳盒内，称重记录，重复3次。然后用聚乙烯穿孔塑料袋(0.03mm厚，每侧有6个直径1cm的孔)将收纳盒包装好，以避免水分流失，并防止袋子中气体条件发生改变。其中3次重复的对照品种和3次重复的持绿突变体收纳盒置于恒温培养箱内，在(20±1)℃、湿度85％～95％的条件下模拟货架期贮藏；另外3次重复的对照品种和3次重复的持绿突变体收纳盒置于冷库内，在(0±0.1)℃、湿度75％～85％的条件下模拟低温贮藏及运输。恒温贮藏7d，每天观察记录一次叶片黄化情况；低温贮藏30d，每三天观察记录一次。最后一天分别称重，计算失重率。

结果如图2和图3所示。结果表明SGR基因沉默显著延长了白菜货架期，提高了耐储性，同时也极大地降低了贮藏或运输过程中干物质的损耗。

实施例3、白菜Brnye1基因在培育持绿性白菜中的应用

1、利用游离小孢子培养，创制持绿双单倍体

选择青梗菜持绿突变体‘nye’为母本，选择叶片在衰老过程中变黄的‘13A510’为杂交组合的父本。从F₂代中筛选出具有持绿表型的优良株作为供体材料，根据Zhang等(Zhang L,Zhang Y,Gao Y,Jiang XL,Zhang MD,Wu H,Liu ZY,Feng H 2016.Effects ofhistone deacetylase inhibitors on microspore embryogenesis and plantregeneration in Pakchoi(Brassica rapa ssp.chinensis L.)Scientia Horticulturae209,61-66)的方法，利用游离小孢子培养，创造出更多的持绿双单倍体(DH)(图4)。

2、持绿细胞质雄性不育系的选育

以与Ogrua不育源细胞质雄性不育系杂交的青梗菜‘East 18’为不育源，以青梗菜持绿突变体‘nye’为育种轮回亲本材料，培育细胞质雄性不育系。CMS定向转移的遗传模型如图5。对每一代植株的肥力进行持续的鉴定和筛选。在确定花器官是否完全败育后，选择最终植株作为新的雄性不育系——“CMS-nye”(图6)。

3、持绿组合的品比实验

创制优良的持绿白菜品种，对农业和园艺业具有重要意义。利用上述游离小孢子创制的15个优异持绿DH系与上述创制的持绿性细胞质雄性不育系“CMS-nye”配制杂交组合，进行品比实验(图7)，以青梗菜‘Wall 918’为对照，评价其产量和品质。

结果表明，这些持绿组合的生物学产量接近“Wall 918”或略高于“Wall 918”(对照品种)(图8)，筛选出两个综合性状较好的持绿组合(ZH03、ZH02)。

<110> 沈阳农业大学

<120> SGR 基因的沉默在芸薹属植物中的应用

<130> GNCLN190895

<160> 4

<170> Patent In version 3.5

<210> 1

<211> 1164

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

atgtgtagtt tgtcagcgaa catgttgtta ccgacaaagc tgaaacctgc ttattcagac 60

aaacggagta atagtctgaa ctgtctcccc gtctccaata caagatccaa gaggaagaac 120

caatcaattg ttcctgtaag gcttctttta atcatttctt ttgtctcttt atttgattta 180

ttcttggaat tacttgaaat tgttttgttt tggattcaag gaatttgagt atctactaat 240

gattcattaa atcaaagtaa agatcaaatc ttggaagttt tttttttttt aaatttggtt 300

gcagatggca agattatttg gaccggctat cttcgaatca tccaagttga aagtattgtt 360

tctaggtgtt gatgacaaga agcatccacc aacgcttcca aggacttaca ctctcactca 420

cagtgacatt actgctaaac taaccttagc tatttctctt tttttttttt tttttttttt 480

tgacagcagc tatttctcat tcaattaata attctcaggt atgtatgcgt ctatacgttt 540

ctgagaaaga acggttttag aaaatataga ggctgatgta tatagattta tgttatatac 600

agttgcaagg atgggcaaat aggctataca gagatgaagt ggtagcagaa tggaagaaag 660

ttaaagggga catgtctctt cacgtccact gccacattag cggtggccat ttcctcttgg 720

atctcttccc aaagcttaga tactacatct tttccaaaga actacctgtt gtaagtaaaa 780

atatttattt ttggtttctt ggtttcatta caaaatgttg attgtttatt ttgatatatg 840

tatcaggtgt tgaaggctat tgttcatgga gacggcaact tgttgaacaa ctatccggat 900

ttacaagaag ctcttgtttg ggtttatttc cattctaatg ccgatgagtt caacagagtt 960

gaatgttggg gtccgctttg ggaagctact tcgtctgatg gtcacaggac tcaaactctt 1020

cctcagactc ggtgcaagga tgagtgcagt tgttgtttcc cgcaggttag ctcgattccg 1080

tggtctcata gtcttagtaa cgaaggtgtt actgactacc ctgggacgca ggccgaggga 1140

atgcctaagc cggagaaact ctag 1164

<210> 2

<211> 1124

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

atgtgtagtt tgtcagcgaa catgttgtta ccgacaaagc tgaaacctgc ttattcagac 60

aaacggagta atagtctgaa ctgtctcccc gtctccaata caagatccaa gaggaagaac 120

caatcaattg ttcctgtaag gcttctttta atcatttctt ttgtctcttt atttgattta 180

ttcttggaat tacttgaaat tgttttgttt tggattcaag gaatttgagt atctactaat 240

gattcattaa atcaaagtaa agatcaaatc ttggaagttt tttttttttt aaatttggtt 300

gcagatggca agattatttg gaccggctat cttcgaatca tccaagttga aagtattgtt 360

tctaggtgtt gatgacaaga agcatccacc aacgcttcca aggacttaca ctctcactca 420

cagtgacatt actgctaaac taaccttagc tatttctcat tcaattaata attctcaggt 480

atgtatgcgt ctatacgttt ctgagaaaga acggttttag aaaatataga ggctgatgta 540

tatagattta tgttatatac agttgcaagg atgggcaaat aggctataca gagatgaagt 600

ggtagcagaa tggaagaaag ttaaagggga catgtctctt cacgtccact gccacattag 660

cggtggccat ttcctcttgg atctcttccc aaagcttaga tactacatct tttccaaaga 720

actacctgtt gtaagtaaaa atatttattt ttggtttctt ggtttcatta caaaatgttg 780

attgtttatt ttgatatatg tatcaggtgt tgaaggctat tgttcatgga gacggcaact 840

tgttgaacaa ctatccggat ttacaagaag ctcttgtttg ggtttatttc cattctaatg 900

ccgatgagtt caacagagtt gaatgttggg gtccgctttg ggaagctact tcgtctgatg 960

gtcacaggac tcaaactctt cctcagactc ggtgcaagga tgagtgcagt tgttgtttcc 1020

cgcaggttag ctcgattccg tggtctcata gtcttagtaa cgaaggtgtt actgactacc 1080

ctgggacgca ggccgaggga atgcctaagc cggagaaact ctag 1124

<210> 3

<211> 795

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

atgtgtagtt tgtcagcgaa catgttgtta ccgacaaagc tgaaacctgc ttattcagac 60

aaacggagta atagtctgaa ctgtctcccc gtctccaata caagatccaa gaggaagaac 120

caatcaattg ttcctatggc aagattattt ggaccggcta tcttcgaatc atccaagttg 180

aaagtattgt ttctaggtgt tgatgacaag aagcatccac caacgcttcc aaggacttac 240

actctcactc acagtgacat tactgctaaa ctaaccttag ctatttctca ttcaattaat 300

aattctcagt tgcaaggatg ggcaaatagg ctatacagag atgaagtggt agcagaatgg 360

aagaaagtta aaggggacat gtctcttcac gtccactgcc acattagcgg tggccatttc 420

ctcttggatc tcttcccaaa gcttagatac tacatctttt ccaaagaact acctgttgtg 480

ttgaaggcta ttgttcatgg agacggcaac ttgttgaaca actatccgga tttacaagaa 540

gctcttgttt gggtttattt ccattctaat gccgatgagt tcaacagagt tgaatgttgg 600

ggtccgcttt gggaagctac ttcgtctgat ggtcacagga ctcaaactct tcctcagact 660

cggtgcaagg atgagtgcag ttgttgtttc ccgcaggtta gctcgattcc gtggtctcat 720

agtcttagta acgaaggtgt tactgactac cctgggacgc aggccgaggg aatgcctaag 780

ccggagaaac tctag 795

<210> 4

<211> 264

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 4

Met Cys Ser Leu Ser Ala Asn Met Leu Leu Pro Thr Lys Leu Lys Pro

1 5 10 15

Ala Tyr Ser Asp Lys Arg Ser Asn Ser Leu Asn Cys Leu Pro Val Ser

20 25 30

Asn Thr Arg Ser Lys Arg Lys Asn Gln Ser Ile Val Pro Met Ala Arg

35 40 45

Leu Phe Gly Pro Ala Ile Phe Glu Ser Ser Lys Leu Lys Val Leu Phe

50 55 60

Leu Gly Val Asp Asp Lys Lys His Pro Pro Thr Leu Pro Arg Thr Tyr

65 70 75 80

Thr Leu Thr His Ser Asp Ile Thr Ala Lys Leu Thr Leu Ala Ile Ser

85 90 95

His Ser Ile Asn Asn Ser Gln Leu Gln Gly Trp Ala Asn Arg Leu Tyr

100 105 110

Arg Asp Glu Val Val Ala Glu Trp Lys Lys Val Lys Gly Asp Met Ser

115 120 125

Leu His Val His Cys His Ile Ser Gly Gly His Phe Leu Leu Asp Leu

130 135 140

Phe Pro Lys Leu Arg Tyr Tyr Ile Phe Ser Lys Glu Leu Pro Val Val

145 150 155 160

Leu Lys Ala Ile Val His Gly Asp Gly Asn Leu Leu Asn Asn Tyr Pro

165 170 175

Asp Leu Gln Glu Ala Leu Val Trp Val Tyr Phe His Ser Asn Ala Asp

180 185 190

Glu Phe Asn Arg Val Glu Cys Trp Gly Pro Leu Trp Glu Ala Thr Ser

195 200 205

Ser Asp Gly His Arg Thr Gln Thr Leu Pro Gln Thr Arg Cys Lys Asp

210 215 220

Glu Cys Ser Cys Cys Phe Pro Gln Val Ser Ser Ile Pro Trp Ser His

225 230 235 240

Ser Leu Ser Asn Glu Gly Val Thr Asp Tyr Pro Gly Thr Gln Ala Glu

245 250 255

Gly Met Pro Lys Pro Glu Lys Leu

260

Claims

1.能够降低植物中SGR基因的编码蛋白的表达量和/或活性的物质在如下任一中的应用：

(A1)提高植物的耐贮性；

(A2)延长植物的货架期；

(A3)降低植物在贮藏和/或运输过程中干物质的损耗；

(A4)降低植物在贮藏和/或运输过程中的失重率；

(A5)提高植物叶绿素含量。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述能够降低植物中SGR基因的编码蛋白的表达量和/或活性的物质为如下任一：

(B1)针对SGR基因的基因组DNA序列的基因编辑工具；

所述基因编辑工具为序列特异核酸酶，所述序列特异核酸酶能够特异性剪切编码所述SGR基因的基因组DNA序列中的靶标序列；

(B2)针对SGR基因的RNA干扰片段；

(B3)能够编码(B1)中所述基因编辑工具或者能够转录(B2)中所述RNA干扰片段的DNA片段；

3.一种培育具有如下(C1)-(C5)所示性状中至少一种的植物品种的方法，包括使受体植物中SGR基因的编码蛋白的表达量和/或活性降低的步骤：

(C1)耐贮性提高；

(C2)货架期延长；

(C3)在贮藏和/或运输过程中干物质的损耗降低；

(C4)在贮藏和/或运输过程中的失重率降低；

(C5)叶绿素含量提高。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述使受体植物中SGR基因的编码蛋白的表达量和/或活性降低的方法包括如下步骤：向所述受体植物中导入权利要求2中所述的能够降低植物中SGR基因的编码蛋白的表达量和/或活性的物质；或

所述使受体植物中SGR基因的编码蛋白的表达量和/或活性降低的方法包括如下步骤：将所述受体植物中的SGR基因替换为所述SGR基因的无效等位基因。

5.根据权利要求1-4中任一所述的应用或方法，其特征在于：所述SGR基因的编码蛋白为如下任一所示蛋白质：

(D1)氨基酸序列为SEQ ID No.4的蛋白质；(D2)将SEQ ID No.4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

6.根据权利要求1-5中任一所述的应用或方法，其特征在于：所述SGR基因是如下任一所示DNA分子：

(E1)SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示的DNA分子；

(E2)在严格条件下与(E1)限定的DNA分子杂交且编码权利要求6中所述蛋白质的DNA分子；

(E3)与(E1)或(E2)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码权利要求6中所述蛋白质的DNA分子。

7.根据权利要求4-6中任一所述的方法，其特征在于：所述SGR基因的无效等位基因为如下任一所示DNA分子：

(F1)SEQ ID No.1所示的DNA分子；

(F2)在严格条件下与(F1)限定的DNA分子杂交且编码权利要求8中所述蛋白质的DNA分子；

(F3)与(F1)或(F2)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码权利要求8中所述蛋白质的DNA分子。

8.根据权利要求1-7中任一所述的应用或方法，其特征在于：所述植物为双子叶植物或单子叶植物；

进一步地，所述双子叶植物为十字花科植物；

更进一步地，所述十字花科植物为芸薹属植物或拟南芥属植物。

9.一种培育具有如下(C1)-(C5)所示性状中至少一种的白菜品种的方法：

(C1)耐贮性提高。

(C2)货架期延长。

(C3)在贮藏和/或运输过程中干物质的损耗降低。

(C4)在贮藏和/或运输过程中的失重率降低；

(C5)叶绿素含量提高。

所述方法包括如下步骤(G1)或(G2)：

(G1)以白菜品种A为母本，将SEQ ID No.1所示的DNA分子转育到所述白菜品种A中，培育得到目标白菜品种；

10.一种培育持绿白菜品种的方法，包括如下步骤：

(H1)以青梗菜持绿突变体‘nye’为母本，以青梗菜‘13A510’为父本，进行杂交，从F₂代中筛选出具有持绿表型植株作为供体材料，创造出持绿双单倍体；

(H2)以与Ogrua不育源细胞质雄性不育系杂交的青梗菜‘East 18’为不育源，以青梗菜持绿突变体‘nye’为育种轮回亲本材料，培育持绿性细胞质雄性不育系；

(H3)利用步骤(H1)得到的持绿双单倍体与步骤(H2)得到的持绿性细胞质雄性不育系配制杂交组合，得到目标白菜。