JP5164862B2 - Ee−1イベントを含むトランスジェニックナス(solanummelongena) - Google Patents
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Description
続いて、可溶性になったタンパクは、昆虫の腸の中のプロテアーゼによって活性化される。これらのプロテアーゼは、タンパクのアミノ末端からのおよそ28のアミノ酸と同様に、タンパクの残部からカルボキシ末端ドメインを切断する。活性化されたタンパクはおよそ600のアミノ酸から成り、昆虫の囲食膜を介して中腸上皮へ拡散する。ここで、それらは標的昆虫の中腸上皮の表面において特定の高親和性レセプターと結合する。膜において、腸ルーメンへの細胞内成分(例えばK+)の漏出、および上皮腸細胞への水の漏出を誘導する開孔が、膜内に形成される。幼虫の腸上皮細胞は浸透圧により膨張し溶解する。腸は腸内の電解質、およびpHの変化の結果として麻痺するようになり、幼虫の昆虫に摂食の中止と死を引き起こす。
(a)配列番号8の配列のヌクレオチド位置11からヌクレオチド位置85の少なくとも50の連続したヌクレオチドを備えるポリヌクレオチドプローブを試料と接触させることと、
(b)試料および前記ポリヌクレオチドプローブをストリンジェントハイブリダイゼーション条件下におくことと、
(c)前記試料中における核酸への前記ポリヌクレオチドプローブの結合を検出することとを備える。
a)配列番号11の第1のヌクレオチド配列、および配列番号12、または配列番号13、または配列番号14からなる群から選択される第2のヌクレオチド配列と試料とを接触させることと、
b)核酸増幅反応を行い、それによって増幅されたフラグメントを生成することと、
c)前記増幅されたフラグメントを検出することと、を備え、
前記増幅されたフラグメントは685ベースペア、または1030ベースペア、または1266ベースペアである。
(d)配列番号8の配列のヌクレオチド位置22からヌクレオチド位置71の少なくとも50の連続したヌクレオチドを備えるポリヌクレオチドプローブを試料と接触させることと、
(e)試料および前記ポリヌクレオチドプローブをストリンジェントハイブリダイゼーション条件下におくことと、
(f)前記試料中における核酸への前記ポリヌクレオチドプローブの結合を検出することと、を備える。
a)配列番号11の第1のヌクレオチド配列、および配列番号12、または配列番号13、または配列番号14からなる群から選択される第2のヌクレオチド配列と試料とを接触させることと、
b)核酸増幅反応を行い、それによって増幅されたフラグメントを生成することと、
c)前記増幅されたフラグメントを検出することとを備える。
前記増幅されたフラグメントは685ベースペア、または1030ベースペア、または1266ベースペアである。
適当な抗生物質が、プラスミドpMON10518を有するアグロバクテリウムの選択的培養のためのバクテリアのイノキュレート前に、当該培地に添加された。バクテリアはフラスコ中の2YT培地にイノキュレートされて、0.01〜2の範囲、好ましくは1.8の光学密度(600nm)を得るためにシェーカー上で維持された。
果実の色:紫色、白色の斑入り
果実の形状:長円形
草性:ブッシュ状
果実形成:塊状
がく:とげ状
ナスの形質転換
系統60208由来のナス種子は、1.5%NaOClを含有する50mlのプラスチック遠心チューブ中で激しく振とうしながら10分間、表面滅菌された(500種子につきNaOCl 20 ml)。5分後、上澄みである溶液が除去され、滅菌された蒸留水で5回洗浄された。種子は滅菌濾紙で1時間、ブロット乾燥され、10種子/ボトルの割合でボトル中のMS0倍地(表1)にイノキュレートされた。種子は、発芽のために、16時間光条件下、8時間暗黒条件下の光周期型で、12−15時間25℃で維持された。
共培養を実行する前日、形質転換ベクターpMON10518を含むアグロバクテリウム株が、抗生物質を含む25mlの液体LB培地中で、175rpmで振とうしながら、28℃で一晩培養された。当該オーバーナイトの培養は、同じ抗生物質を含んでいる、フレッシュストリークされた固形培地プレートから得られた1白金耳のバクテリア細胞で開始された。
共培養の当日、2−15日齢の実生から子葉を取り、中央脈を介して縦方向に半分に切断し、外植体として使用した。外植体は、乾燥するのを防ぐために、液体MS培地(表1)に浸したペトリ皿中の滅菌濾紙上に置かれた。
共培養の朝に、一晩培養したバクテリア培養物を、1000rpmで10分間遠心分離した。上澄みを除去し、沈殿物を液体MS培地(25 ml)中で再懸濁し、十分に混合した(表1)。100mMのアセトシリンゴンをバクテリア培養物に25μl添加し、インキュベーター中に振とうしながらさらに2時間置いた。バクテリア培養物の吸光度(OD)は、600nmにおけるODが1.5から1.8に達するまで測定された。外植体は、ペトリ皿またはガラスビーカー中のバクテリア培養物中で、ゆっくり攪拌しながら10分間インキュベートされた。次に、外植体は余剰分のバクテリアを除去するために滅菌濾紙上にブロットされ、共培養のために、3日間共培養培地B1AsP(表の培地組成を参照)上に置かれた(15 外植体/プレート)。プレートは、25℃、16時間光条件下、8時間暗黒条件下の光周期型の光照射下で3日間インキュベートされた。
3日後、外植体を、2週間の期間で、50mg/lのカナマイシンおよび250mg/lのセファトキシンを含む選択培地B1KC(表1)に移した。形質転換された外植体は、外植体の切除端部にカルスを形成する。一方、形質転換されていない外植体は白化する。形質転換したものと推定された外植体は、2週間、新たな選択培地B1KC上で再び維持された。これは、合計の期間が6週間に達するまで選択培地上で繰り返された。6週間経過後、緑色の***組織/カルスが発達する。
緑色の***組織は、2週間の期間、50mg/lのカナマイシン、250mg/lのセホタキシムを含有するCF2 KC(表1)に移された。当該カルスは新たな培地上で2週間ごとに3回継代培養され(3selections)、その結果カルスが小さな緑色のシュートの芽となった。
シュートの芽は、2週間の期間、50mg/litのカナマイシン、250 mg/lのセホタキシムを含有するBrootKC 培地(表1)に移された。当該シュートの芽は新たな培地上で2週間ごとに2回継代培養された(2 selections)。4週間経過後、シュートの芽は伸長し、発根できる状態となった。伸長培地上で発根が開始されることもあった。伸長培地上で発根を開始した場合、小植物体(plantlet)は、根にダメージを与えないようにするためにそのまま維持された。
シュートは、2週間の期間、50mg/litのカナマイシン、250 mg/lのセホタキシムを含有する発根培地TMRGKC(表1)に移された。シュートは、根が生じるまで2週間ごとに継代培養された。
発根した植物体はゲル化剤(寒天またはphytagel)を除くために十分に滅菌された蒸留水で洗浄された。植物体は、Promix(60%)と土(40%)のミクスチャを含むカップに移す少なくとも一時間前に、0.1%のバビスチンで処理された。植物体は7日間、ポリエチレン製の袋で覆われた。7日後、ポリエチレン製の袋は、ハードニング処理を開始するために端部が切除され、約2週間後に完了した。
ナス植物EE−1エリートイベントの同定
商用のトランスジェニックナス系統を作り出すためのトランス遺伝子を強く発現し、遺伝的に安定であるイベントの可能性を最大化するために、多量(>50)の独立形質転換イベントが作られた。形質転換実験により得られた全てのナス植物体は、PCRによりcry1Ac遺伝子の存在について分析され、ポジティブである植物体は、トランス遺伝子の発現度を決定するためにELISAに供された。最初の形質転換体(TO)は自家受精により次の世代に進み、T1子孫植物体はトランスジーンの分離(segregation)を決定するためにPCRによりチェックされた。単一のcry1Ac遺伝子が挿入された系統内のトランスジーンの予想されたT1分離比は、メンデル遺伝学に基づき、3:1であった。さらに、cry1Acがトランス遺伝子として導入されたときに優性遺伝子として機能するため、T1世代において遺伝子の発現がモニターされた。また、単一の挿入イベントについて、Cry1Ac発現植物体と非発現植物体との予想された比率は3:1である。昆虫のバイオアッセイは、どの系統が果実やシュートに穴を開ける害虫に対しより高い効果を有するか決定するために、選択された系統由来の組織について実行された。選択された形質転換イベントのサザンブロット分析は、トランスジーンがナスゲノムに組み込まれた位置の数(挿入コピー数)を確認するために行われた。
EE−1エリートイベントの分子的特性
トランスジェニックEE−1エリートイベントナスは、cry1Ac遺伝子発現カセットのフランキングナスゲノムDNA配列を同定するために、Cottageらの方法(2001)を使用して分析された。植物体のゲノムDNAは、EE−1エリートイベントを有する植物体のフレッシュな幼葉から、当該技術分野において公知の方法により抽出された。
ゲノムDNA(2μg)は、標準バッファを使用し、反応体積20μl中でXmnI酵素により切断された。切断反応は37℃で一晩インキュベートされた。切断産物は酵素の不活性化のために65℃でインキュベートされ、3Mの酢酸ナトリウムおよびエタノールで沈殿された。DNAは空気乾燥され、12μlの滅菌された蒸留水に溶解された。
切断されたDNAは、メーカーによって供給されたリガーゼ・バッファ中でアニールアダプタにライゲーションされた。当該アダプタの配列は以下のとおりである。
ADAP 1: 5’-CTA ATACGACTCACTATAGGGCGGCCGCCCGGGCAGGT- 3’(配列番号1)
ADAP 2: 5’- P-ACC TGC CC-H2N -3’ (配列番号2)
MHIP-10 - 5’- TTG GGT CTT TCA GAC TGA CAA G -3’ (配列番号3)
AP - 5’- GGA TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC-3’ (配列番号4)
ゲノムDNA 12.0 μl (2 μg)
10X 反応バッファ 2.0 μl (最終濃度 1x)
XmnIenzyme 1.0 μl (10units/ μl)
蒸留水 20.0 μlとなる量
切断されたゲノムDNA (熱不活性化) 12.0 μl (2 μg)
アニールアダプタ 2.0 μl (100 ng/μl)
10X 反応バッファ 3.0 μl (最終濃度 1x)
T4-ligase enzyme 1.0 μl (5units/ μl)
蒸留水 30.0 μlとなる量
試薬 Volume
Nuclease-free water 25 μlとなる量
10X 反応バッファ (MgCl2含有) 2.5 μl
10mM dNTPs 0.5 μl
プライマー MHIP-10(100ng/μl) 1.0 μl
プライマー AP (100 ng/μl) 1.0 μl
Taq DNA polymerase (5 units/μl) 0.5 μl
DNAテンプレート 3.0 μl
Temperature Time Cycles
95℃ 5 分 1
94℃ 30秒
58℃ 30秒 40
68℃ 4分
68℃ 10分 1
4℃ Hold
MHIP-11- 5'- CTG ACA AGA TCG ATC TGA AGT C -3' (配列番号5)
NAP - 5'- TAT AGG GCT CGA GCG GC-3’ (配列番号6)
試薬 Volume
Nuclease-free water 25μlとなる量
10X 反応バッファ (MgCl2含有) 2.5 μl
10mM dNTPs 0.5 μl
プライマー MHIP-11(100ng/μl) 1.0 μl
プライマー NAP (100 ng/μl) 1.0 μl
Taq DNA polymerase (5 units/μl) 0.5 μl
DNA テンプレート 2.0 μl
Temperature Time Cycles
95℃ 5分 1
94℃ 30秒
58℃ 30秒 40
68℃ 4分
68℃ 10分 1
4℃ Hold
CTGACAAGATCGATCTGAAGTCTAAACAATTCTAAGAGGTATCATGTAGCAGTGTCCTGCCACAATATTGAATTGACCTGCAGGCATGCAAGCTGGGATCAGATAGTCGTTTCCCGCCTTCAGTTTAAACTATCAGTGTTTGTTACCAAAAGTGCTGTCAATAAACACTTAGAAAGGTGTTATCCAAATTTTAAAAAGAAAAAAATAAATGTAAGATTTAAATTTCTAACTTCAAGAGATGCATTCAATTATCACCGCATTATATGATATTCCAAGAATACCTGCCCGGGCGGCCGCTCGAGCCCTATA
GATCAGATAGTCGTTTCCCGCCTTCAGTTTAAACTATCAGTGTTTGTTACCAAAAGTGCTGTCAATAAACACTTAGAAAGGTGTTATCCAAATTTTAAAAAGAAAAAAATAAATGTAAGATTTAAATTTCTAACTTCAAGAGATGCATTCAATTATCACCGCATTATATGATATTCCAAGAA
GATCAGATAGTCGTTTCCCGCCTTCAGTTTAAACTATCAGTGTTTGTTACCAAAAGTGCTGTCAATAAACACTTAGAAAGGTGTTATCCAAATTTTAAAAAGAAAAAAATAAATGTAAGATTTAA
GTTTAAACTATCAGTGTTTGTTACCAAAAGTGCTGTCAATAAACACTTAGAAAGGTGTTATCCAAATTTTAAAAA
EE−1エリートイベント同定の診断方法
ナスEE−1エリートイベントが存在するか否か決定するために、分子的診断方法が開発された。配列番号8に示すフラグメントの配列分析が行われ、診断ツールとして使用するために、トランスジェニック挿入部位を増幅するためのプライマーが設計された。設計された二つのプライマーは、EE−1ゲノムDNA由来のトランスジェニック挿入部位を増幅するためのフォワードプライマー MHTBJ−2(配列番号11)および第2のプライマーMHIP−2(配列番号12)である。
MHTBJ-2: 5’- TGC GGT GAT AAT TGA ATG CAT C -3’ (配列番号11)
MHIP-2: 5’- GGA GCT TCT CTT GAT GGA GG -3’ (配列番号12)
Primer 1:- 5’- CGAGCTTAAGTTCTCCAACTGC-3’ (配列番号13)
Primer 2:- 5’- GGAATGTGAAAGGTCATGTGG- 3’ (配列番号14)
Nuclease-free water 25 μlとなる量
10X 反応バッファ (MgCl2含有) 2.5 μl
10mM dNTPs 0.5 μl
プライマー MHIP-2 (100 ng/μl) 1.0 μl
プライマー MHTBJ-2 (100 ng/μl) 1.0 μl
Taq DNA polymerase (5 units/μl) 0.5 μl
DNA テンプレート 2.0 μl
95℃ 5分 1
94℃ 30秒
58℃ 30秒 35
72℃ 1分
72℃ 5分 1
4℃ Hold ---
ナスEE-1エリートイベントの接合アッセイ
挿入部分の周辺のゲノム領域が特定された。挿入部分の一方の端部はその配列が分析され、当該配列は配列番号8に記載された。T−DNAの他方のフランキング側部由来のナスゲノムDNA配列が分析され、配列番号15に示されるようなヌクレオチド配列を有するプライマーが設計された。配列番号11および配列番号12のヌクレオチド配列を有するプライマーと組み合わせて使用されたとき、当該プライマーにより、対立遺伝子特異的なトランス遺伝子の増幅により、EE−1エリートイベントを含むトランスジェニックナス植物体から685塩基対のフラグメントが得られた。また、配列番号11および配列番号15からの非トランスジェニック対立遺伝子バンドの増幅により、非トランスジェニックナス植物体から330塩基対のフラグメントが得られた。
MHTBJ-6: 5’-CCA TCT ACT AAC GGT GAT GGT -3’ (配列番号15)
Nuclease-free water 25 μlとなる量
10X 反応バッファ (MgCl2含有) 2.5 μl
10mM dNTPs 0.5 μl
プライマー MHTBJ-6 (100 ng/μl) 1.0 μl
プライマー MHIP-2 (100 ng/μl) 1.0 μl
プライマー MHTBJ-2 (100 ng/μl) 1.0 μl
Taq DNA polymerase (5 units/μl) 0.5 μl
DNA テンプレート 2.0 μl
Temperature Time Cycles
95℃ 5分 1
94℃ 40秒
58℃ 40秒 35
72℃ 1:40分
72℃ 5分 1
4℃ Hold ---
ATGGACAACAACCCAAACATCAACGAATGCATTCCATACAACTGCTTGAGTAACCCAGAAGTTGAAGTACTTGGTGGAGAACGCATTGAAACCGGTTACACTCCCATCGACATCTCCTTGTCCTTGACACAGTTTCTGCTCAGCGAGTTCGTGCCAGGTGCTGGGTTCGTTCTCGGACTAGTTGACATCATCTGGGGTATCTTTGGTCCATCTCAATGGGATGCATTCCTGGTGCAAATTGAGCAGTTGATCAACCAGAGGATCGAAGAGTTCGCCAGGAACCAGGCCATCTCTAGGTTGGAAGGATTGAGCAATCTCTACCAAATCTATGCAGAGAGCTTCAGAGAGTGGGAAGCCGATCCTACTAACCCAGCTCTCCGCGAGGAAATGCGTATTCAATTCAACGACATGAACAGCGCCTTGACCACAGCTATCCCATTGTTCGCAGTCCAGAACTACCAAGTTCCTCTCTTGTCCGTGTACGTTCAAGCAGCTAATCTTCACCTCAGCGTGCTTCGAGACGTTAGCGTGTTTGGGCAAAGGTGGGGATTCGATGCTGCAACCATCAATAGCCGTTACAACGACCTTACTAGGCTGATTGGAAACTACACCGACCACGCTGTTCGTTGGTACAACACTGGCTTGGAGCGTGTCTGGGGTCCTGATTCTAGAGATTGGATTAGATACAACCAGTTCAGGAGAGAATTGACCCTCACAGTTTTGGACATTGTGTCTCTCTTCCCGAACTATGACTCCAGAACCTACCCTATCCGTACAGTGTCCCAACTTACCAGAGAAATCTATACTAACCCAGTTCTTGAGAACTTCGACGGTAGCTTCCGTGGTTCTGCCCAAGGTATCGAAGGCTCCATCAGGAGCCCACACTTGATGGACATCTTGAACAGCATAACTATCTACACCGATGCTCACAGAGGAGAGTATTACTGGTCTGGACACCAGATCATGGCCTCTCCAGTTGGATTCAGCGGGCCCGAGTTTACCTTTCCTCTCTATGGAACTATGGGAAACGCCGCTCCACAACAACGTATCGTTGCTCAACTAGGTCAGGGTGTCTACAGAACCTTGTCTTCCACCTTGTACAGAAGACCCTTCAATATCGGTATCAACAACCAGCAACTTTCCGTTCTTGACGGAACAGAGTTCGCCTATGGAACCTCTTCTAACTTGCCATCCGCTGTTTACAGAAAGAGCGGAACCGTTGATTCCTTGGACGAAATCCCACCACAGAACAACAATGTGCCACCCAGGCAAGGATTCTCCCACAGGTTGAGCCACGTGTCCATGTTCCGTTCCGGATTCAGCAACAGTTCCGTGAGCATCATCAGAGCTCCTATGTTCTCTTGGATACACCGTAGTGCTGAGTTCAACAACATCATCGCATCCGATAGTATTACTCAAATCCCTGCAGTGAAGGGAAACTTTCTCTTCAACGGTTCTGTCATTTCAGGACCAGGATTCACTGGTGGAGACCTCGTTAGACTCAACAGCAGTGGAAATAACATTCAGAATAGAGGGTATATTGAAGTTCCAATTCACTTCCCATCCACATCTACCAGATATAGAGTTCGTGTGAGGTATGCTTCTGTGACCCCTATTCACCTCAACGTTAATTGGGGTAATTCATCCATCTTCTCCAATACAGTTCCAGCTACAGCTACCTCCTTGGATAATCTCCAATCCAGCGATTTCGGTTACTTTGAAAGTGCCAATGCTTTTACATCTTCACTCGGTAACATCGTGGGTGTTAGAAACTTTAGTGGGACTGCAGGAGTGATTATCGACAGATTCGAGTTCATTCCAGTTACTGCAACACTCGAGGCTGAGTACAACCTTGAGAGAGCCCAGAAGGCTGTGAACGCCCTCTTTACCTCCACCAATCAGCTTGGCTTGAAAACTAACGTTACTGACTATCACATTGACCAAGTGTCCAACTTGGTCACCTACCTTAGCGATGAGTTCTGCCTCGACGAGAAGCGTGAACTCTCCGAGAAAGTTAAACACGCCAAGCGTCTCAGCGACGAGAGGAATCTCTTGCAAGACTCCAACTTCAAAGACATCAACAGGCAGCCAGAACGTGGTTGGGGTGGAAGCACCGGGATCACCATCCAAGGAGGCGACGATGTGTTCAAGGAGAACTACGTCACCCTCTCCGGAACTTTCGACGAGTGCTACCCTACCTACTTGTACCAGAAGATCGATGAGTCCAAACTCAAAGCCTTCACCAGGTATCAACTTAGAGGCTACATCGAAGACAGCCAAGACCTTGAAATCTACTCGATCAGGTACAATGCCAAGCACGAGACCGTGAATGTCCCAGGTACTGGTTCCCTCTGGCCACTTTCTGCCCAATCTCCCATTGGGAAGTGTGGAGAGCCTAACAGATGCGCTCCACACCTTGAGTGGAATCCTGACTTGGACTGCTCCTGCAGGGATGGCGAGAAGTGTGCCCACCATTCTCATCACTTCTCCTTGGACATCGATGTGGGATGTACTGACCTGAATGAGGACCTCGGAGTCTGGGTCATCTTCAAGATCAAGACCCAAGACGGACACGCAAGACTTGGCAACCTTGAGTTTCTCGAAGAGAAACCATTGGTCCGGTGAAGCTCTCGCTCGTGTGAAGAGAGCAGAGAAGAAGTGGAGGGACAAACGTGAGAAACTCGAATGGGAAACTAACATCGTTTACAAGGAGGCCAAAGAGTCCGTGGATGCTTTGTTCGTGAACTCCCAATATGATCAGTTGCAAGCCGACACCAACATCGCCATGATCCACGCCGCAGACAAACGTGTGCACAGCATTCGTGAGGCTTACTTGCCTGAGTTGTCCGTGATCCCTGGTGTGAACGCTGCCATCTTCGAGGAACTTGAGGGACGTATCTTTACCGCATTCTCCTTGTACGATGCCAGAAACGTCATCAAGAACGGTGACTTCAACAATGGCCTCAGCTGCTGGAATGTGAAAGGTCATGTGGACGTGGAGGAACAGAACAATCAGCGTTCCGTCCTGGTTGTGCCTGAGTGGGAAGCTGAAGTGTCCCAAGAGGTTAGAGTCTGTCCAGGTAGAGGCTACATTCTCCGTGTGACCGCTTACAAGGAGGGATACGGTGAGGGTTGCGTGACCATCCACGAGATCGAGAACAACACCGACGAGCTTAAGTTCTCCAACTGCGTCGAGGAAGAAATCTATCCCAACAACACCGTTACTTGCAACGACTACACTGTGAATCAGGAAGAGTACGGAGGTGCCTACACTAGCCGTAACAGAGGTTACAACGAAGCTCCTTCCGTTCCTGCTGACTATGCCTCCGTGTACGAGGAGAAATCCTACACAGATGGCAGACGTGAGAACCCTTGCGAGTTCAACAGAGGTTACAGGGACTACACACCACTTCCAGTTGGCTATGTTACCAAGGAGCTTGAGTACTTTCCTGAGACCGACAAAGTGTGGATCGAGATCGGTGAAACCGAGGGAACCTTCATCGTGGACAGCGTGGAGCTTCTCTTGATGGAGGAAagatctagaggcctgaattcgagctcggtacccggggatcccgtcctttgtcttcaattttgagggctttttactgaataagtatgtagtactaaaatgtatgctgtaatagctcatagtgagcgaggaaagtatcgggctatttaactatgacttgagctccatctatgaataaataaatcagcatatgatgcttttgttttgtgtacttcaactgtctgcttagctaatttgatatggttggcacttggcacgtataaatatgctgaagtaatttactctgaagctaaataactagattagatgagtgtattatatacaaaaggcattaaatcagatacatcttagacaaattgtcacggtctaccagaaaagaaattgcatttgtttttgggtctttcagactgacaagatcgatctgaagtctaaacaattctaagaggtatcatgtagcaatgtcctgccacaatATTGAATTGACCTGCAGGCATGCAAGCTGGGATCAGATAGTCGTTTCCCGCCTTCAGTTTAAACTATCAGTGTTTGTTACCAAAAGTGCTGTCAATAAACACTTAGAAAGGTGTTATCCAAATTTTAAAAAGAAAAAAATAAATGTAAGATTTAAATTTCTAACTTCAAGAGATGCATTCAATTATCACCGCATTATATGATATTCCAAGAATACCTGCCCGGGCGGCCGCTCGAGCCCTATA
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Claims (12)
- 試料中のcry1Ac遺伝子を含む耐虫性ナス植物EE-1イベントの核酸配列の存在の検出方法であって、
(a)配列番号8のヌクレオチド配列のヌクレオチド位置11からヌクレオチド位置85の少なくとも50の連続したヌクレオチドを備えるポリヌクレオチドプローブを試料と接触させることと、
(b)試料および前記ポリヌクレオチドプローブをストリンジェントハイブリダイゼーション条件下におくことと、
(c) 前記試料中における配列番号10のヌクレオチド配列を含む前記核酸配列への前記ポリヌクレオチドプローブの結合を検出することと、を備えることを特徴とする検出方法。 - 試料中の前記cry1Ac遺伝子を含む耐虫性ナス植物EE−1イベント核酸配列の存在の検出方法であって、
a)配列番号11に記載された第1のヌクレオチド配列、および配列番号12、配列番号13、および配列番号14からなる群から選択される第2のヌクレオチド配列と試料とを接触させることと、
b)核酸増幅反応を行い、それによって増幅されたフラグメントを生成することと、
c)前記増幅されたフラグメントを検出することとを備え、前記増幅されたフラグメントは配列番号10のヌクレオチド配列を含むことを特徴とする検出方法。 - cry1Ac遺伝子を含む耐虫性ナス植物EE−1イベントの検出に使用可能である単離されたポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドが配列番号8のポリヌクレオチド配列またはその相補的配列を備えることを特徴とするポリヌクレオチド。
- cry1Ac遺伝子を含む耐虫性ナス植物EE−1イベントの検出に使用可能である単離されたポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドが配列番号9のポリヌクレオチド配列またはその相補的配列を備えることを特徴とするポリヌクレオチド。
- cry1Ac遺伝子を含む耐虫性ナス植物EE−1イベントの検出に使用可能である単離されたポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドが配列番号10のポリヌクレオチド配列またはその相補的配列を備えることを特徴とするポリヌクレオチド。
- 試料中のcry1Ac遺伝子を含む耐虫性ナス植物EE−1イベントの核酸配列の存在の検出キットであって、
前記キットは、
配列番号8、または配列番号9、または配列番号10、またはそれらの相補的配列であるポリヌクレオチド配列と、
バッファとを備えることを特徴とする検出キット。 - 試料中のcry1Ac遺伝子を含む耐虫性ナス植物EE−1イベントの核酸配列の存在の検出キットであって、
前記キットは、
配列番号11の配列を有する第1のヌクレオチドと、
配列番号12、配列番号13、および配列番号14からなる群から選択される第2のヌクレオチド配列を備えることを特徴とする検出キット。 - cry1Ac遺伝子を含む耐虫性ナス植物EE−1イベントの存在の検出のための、2つのオリゴヌクレオチドを備える合成オリゴヌクレオチドセットであって、
第1のオリゴヌクレオチドは配列番号11のヌクレオチド配列を備え、
第2のオリゴヌクレオチドは配列番号12、配列番号13、および配列番号14からなる群から選択されるヌクレオチド配列を備えることを特徴とする合成オリゴヌクレオチドセット。 - cry1Ac遺伝子を含む耐虫性ナス植物EE−1イベントを有する子孫(progeny)の接合性を決定するための、2つのオリゴヌクレオチドを備える合成オリゴヌクレオチドセットであって、
第1のオリゴヌクレオチドは配列番号11のヌクレオチド配列を備え、
第2のオリゴヌクレオチドは配列番号12および配列番号15からなる群から選択されるヌクレオチド配列を備えることを特徴とする合成オリゴヌクレオチドセット。 - cry1Ac遺伝子を含む耐虫性ナス植物EE−1イベントを有するトランスジェニック植物体または種子であって、
前記EE-1イベントのゲノムが配列番号8、または配列番号9、または配列番号10またはそれらの相補的配列であるヌクレオチド配列を備えることを特徴とするトランスジェニック植物体または種子。 - cry1Ac遺伝子を含む耐虫性ナス植物EE−1イベントを有するトランスジェニック植物細胞であって、前記EE−1イベントのゲノムが配列番号8、または配列番号9、または配列番号10、またはそれらの相補的配列であるヌクレオチド配列を備えることを特徴とするトランスジェニック植物細胞。
- cry1Ac遺伝子を含む耐虫性ナス植物EE−1イベントを有する子孫(progency)であって、前記EE−1イベントのゲノムが配列番号8、または配列番号9、または配列番号10、またはそれらの相補的配列であるヌクレオチド配列を備えることを特徴とする子孫。
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