JPH0833397B2 - 試 薬 - Google Patents
試 薬Info
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- JPH0833397B2 JPH0833397B2 JP3500229A JP50022990A JPH0833397B2 JP H0833397 B2 JPH0833397 B2 JP H0833397B2 JP 3500229 A JP3500229 A JP 3500229A JP 50022990 A JP50022990 A JP 50022990A JP H0833397 B2 JPH0833397 B2 JP H0833397B2
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- C12N9/0065—Oxidoreductases (1.) acting on hydrogen peroxide as acceptor (1.11)
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- C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
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- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は特異的結合性を有する試薬に関する。本発明
は特に固体表面もしくはトレーサーと連結させた特異的
結合剤を含んでなる試薬に関する。
は特に固体表面もしくはトレーサーと連結させた特異的
結合剤を含んでなる試薬に関する。
天然の抗体はポリクローナル抗体とモノクローナル抗
体のいずれも特異的結合試薬として広く使用されてい
る。これらは、ペグ（peg）、測定用浸漬棒（dipstic
k）、ウェル、透湿膜（フィルター、ストリップなど）
のような固相上に固定、或いは各種トレーサー（標識も
しくはマーカーとしても知られている）に連結させる
と、アッセイに使用することができる。
体のいずれも特異的結合試薬として広く使用されてい
る。これらは、ペグ（peg）、測定用浸漬棒（dipstic
k）、ウェル、透湿膜（フィルター、ストリップなど）
のような固相上に固定、或いは各種トレーサー（標識も
しくはマーカーとしても知られている）に連結させる
と、アッセイに使用することができる。
抗体は複数のペプチド鎖からなる大きなタンパク質複
合構造体である。これらの構造体のかなりの部分は特異
的結合性には関係していないと考えられていた時期もあ
ったが、十分な特異的結合性を与えるために最低限必要
な部分に関しては論争の的となっている。いわゆるFvフ
ラグメント（即ち、単一のＨ鎖可変部及びそれに対応す
るＬ鎖可変部のみから基本的になる抗体フラグメント）
が特異的結合活性を呈し得ることは既に明らかにされて
いる。つい最近、ワード（Ward）他によって、抗体から
得られる単一可変ドメインがかなりの特異的結合活性を
呈し得ることも明らかにされた（Nature,第341巻（198
9）,544-546頁）。ワード他によって記載された単一可
変ドメイン抗体（Dadと略す）の生産法は1990年５月16
日公開の欧州特許公開第0368684号公報（Medical Resea
rch Council）にも記載されている。
合構造体である。これらの構造体のかなりの部分は特異
的結合性には関係していないと考えられていた時期もあ
ったが、十分な特異的結合性を与えるために最低限必要
な部分に関しては論争の的となっている。いわゆるFvフ
ラグメント（即ち、単一のＨ鎖可変部及びそれに対応す
るＬ鎖可変部のみから基本的になる抗体フラグメント）
が特異的結合活性を呈し得ることは既に明らかにされて
いる。つい最近、ワード（Ward）他によって、抗体から
得られる単一可変ドメインがかなりの特異的結合活性を
呈し得ることも明らかにされた（Nature,第341巻（198
9）,544-546頁）。ワード他によって記載された単一可
変ドメイン抗体（Dadと略す）の生産法は1990年５月16
日公開の欧州特許公開第0368684号公報（Medical Resea
rch Council）にも記載されている。
免疫検定法に実際に使用するには特異的結合活性だけ
では十分でない。特異的結合剤は他の材料（例えば、酵
素もしくは粒子のような標識など）又は固相に連結し得
るものでなくてはならない。この連結は特異的結合活性
に重大な悪影響を与えずに達成できるものでなくてはな
らない。こうした悪影響は、特異的結合領域における化
学的変化又はコンホメーション変化を通して、或いは単
に特異的結合領域への接近を妨げる物理的（立体）障害
によって、容易に起こり得る。従来の特異的結合試薬
（即ち、抗体分子全体からなるもの又はFabフラグメン
トなどのように抗体分子のかなりの部分からなるもの）
においては、特異的結合領域（１個又は複数個）は分子
全体のわずかな部分しか占めていない。分子の大半を占
める残りの部分は明らかに特異的結合活性には直接関与
はしていないが、標識及び固相などの他の材料との化学
的又は物理的連結に関与し得るような場所の存在する領
域を多数提供する。これらの領域を本質的な特異的結合
領域から比較的離れたところにとって、生じた連結が特
異的結合活性を害することのないようにすることもでき
る。
では十分でない。特異的結合剤は他の材料（例えば、酵
素もしくは粒子のような標識など）又は固相に連結し得
るものでなくてはならない。この連結は特異的結合活性
に重大な悪影響を与えずに達成できるものでなくてはな
らない。こうした悪影響は、特異的結合領域における化
学的変化又はコンホメーション変化を通して、或いは単
に特異的結合領域への接近を妨げる物理的（立体）障害
によって、容易に起こり得る。従来の特異的結合試薬
（即ち、抗体分子全体からなるもの又はFabフラグメン
トなどのように抗体分子のかなりの部分からなるもの）
においては、特異的結合領域（１個又は複数個）は分子
全体のわずかな部分しか占めていない。分子の大半を占
める残りの部分は明らかに特異的結合活性には直接関与
はしていないが、標識及び固相などの他の材料との化学
的又は物理的連結に関与し得るような場所の存在する領
域を多数提供する。これらの領域を本質的な特異的結合
領域から比較的離れたところにとって、生じた連結が特
異的結合活性を害することのないようにすることもでき
る。
しかしながら、原抗体（originating antibody）の如
何なる実質的部分をも伴っていない１個もしくはそれ以
上の可変ドメインのみから基本的になる特異的結合体、
例えばFvフラグメント又は単一可変ドメイン抗体（Da
b）の場合、本質的な特異的結合活性に関与する分子の
相対割合は非常に高い。事実、小さな特異的結合体を他
の材料に連結させる試みは、本質的な特異的結合活性が
悪影響を受けるかも知れないという非常に高い危険性を
必然的に伴っているものと考えられる。
何なる実質的部分をも伴っていない１個もしくはそれ以
上の可変ドメインのみから基本的になる特異的結合体、
例えばFvフラグメント又は単一可変ドメイン抗体（Da
b）の場合、本質的な特異的結合活性に関与する分子の
相対割合は非常に高い。事実、小さな特異的結合体を他
の材料に連結させる試みは、本質的な特異的結合活性が
悪影響を受けるかも知れないという非常に高い危険性を
必然的に伴っているものと考えられる。
本発明の目的は、このように小さな特異的結合体と他
の有用な材料とを、本質的な特異的結合性を損なう危険
性を減少させて、容易に連結させることにある。
の有用な材料とを、本質的な特異的結合性を損なう危険
性を減少させて、容易に連結させることにある。
本発明は、特異的結合試薬にして、 （ｉ）原抗体の如何なる実質的部分をも伴っていない１
個もしくはそれ以上の可変ドメインタンパク質（VH及び
／又はVL）、 （ii）当該試薬の特異的結合性には寄与しない連結基に
して、５個以上のアミノ酸残基を含んでなり、かつ疎水
性でしかも／或いは少なくとも１個のリシン残基を含ん
でおり、それによって該連結基のカップリング特性が高
められている連結基、及び （iii）該連結基を介して上記可変ドメインタンパク質
とカップリングした固体表面又はトレーサー、 を含んでなる特異的結合試薬を供する。
個もしくはそれ以上の可変ドメインタンパク質（VH及び
／又はVL）、 （ii）当該試薬の特異的結合性には寄与しない連結基に
して、５個以上のアミノ酸残基を含んでなり、かつ疎水
性でしかも／或いは少なくとも１個のリシン残基を含ん
でおり、それによって該連結基のカップリング特性が高
められている連結基、及び （iii）該連結基を介して上記可変ドメインタンパク質
とカップリングした固体表面又はトレーサー、 を含んでなる特異的結合試薬を供する。
この明細書中において、本発明に係る「試薬」は水溶
性又は水分散性の物質であっても、或いはビーズ、ペ
グ、測定用浸漬棒、ウェル又は他の容器のような、連結
基によって可変ドメインタンパク質が固定化された表面
を有する固体考案物であってもよい。
性又は水分散性の物質であっても、或いはビーズ、ペ
グ、測定用浸漬棒、ウェル又は他の容器のような、連結
基によって可変ドメインタンパク質が固定化された表面
を有する固体考案物であってもよい。
好ましくは、連結基はアミノ酸残基を20個より多くは
含まない。好ましくは、連結基は疎水性でしかも少なく
とも１個のリシン残基を含む。リシン残基が存在する
と、酵素のようなタンパク質トレーサーへの共有結合に
非常に都合のよい部位が与えられる。
含まない。好ましくは、連結基は疎水性でしかも少なく
とも１個のリシン残基を含む。リシン残基が存在する
と、酵素のようなタンパク質トレーサーへの共有結合に
非常に都合のよい部位が与えられる。
本発明の目的を達成するため十分な疎水性をもつ連結
基を与えるには、連結基含有ポリペプチド鎖がバリン、
ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシ
ン、トリプトファン、プロリン及びアラニンからなる群
から選択される十分な数（残基が隣り合っている場合に
は２個と少なくてもよい）のアミノ酸を含むべきであ
る。我々は、該ポリペプチド中のアミノ酸残基の大多数
がこれら以外の残基即ち比較的極性（従って比較的親水
性）のアミノ酸残基であったとしても、上記の群から選
択した残基が低い割合でも存在すれば該ポリペプチドに
十分有効な疎水性を与えることを発見した。連結基全体
としての本質的な疎水性を失うことなく、１個もしくは
複数の疎水性領域を高電荷密度の領域に隣り合わせるこ
ともできる（即ち、該ペプチドが混合型性質となる）。
基を与えるには、連結基含有ポリペプチド鎖がバリン、
ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシ
ン、トリプトファン、プロリン及びアラニンからなる群
から選択される十分な数（残基が隣り合っている場合に
は２個と少なくてもよい）のアミノ酸を含むべきであ
る。我々は、該ポリペプチド中のアミノ酸残基の大多数
がこれら以外の残基即ち比較的極性（従って比較的親水
性）のアミノ酸残基であったとしても、上記の群から選
択した残基が低い割合でも存在すれば該ポリペプチドに
十分有効な疎水性を与えることを発見した。連結基全体
としての本質的な疎水性を失うことなく、１個もしくは
複数の疎水性領域を高電荷密度の領域に隣り合わせるこ
ともできる（即ち、該ペプチドが混合型性質となる）。
本発明の重要な具体的態様としては、上述の定義に係
る連結基として作用するタンパク質「テール（tail）」
と結合した単一可変ドメインタンパク質（Dab）にして
特異的結合活性をさほど失わずに該テールが固体表面又
はトレーサーにカップリングしているようなDabがあ
る。
る連結基として作用するタンパク質「テール（tail）」
と結合した単一可変ドメインタンパク質（Dab）にして
特異的結合活性をさほど失わずに該テールが固体表面又
はトレーサーにカップリングしているようなDabがあ
る。
特に好ましい（とりわけ固体プラスチック表面へのカ
ップリングに使用するために）連結基は以下の「Myc」
アミノ酸配列： Glu−Gln−Lys−Leu−Ile−Ser−Glu−Glu−Asp−Lue−
Asn を含んでなるものである 連結基は通常は可変ドメインタンパク質の末端もしく
は末端付近に付着している。通常、付着部位はペプチド
連結基のアミノ末端である。これは添付の第２図に示し
た配列Ａ及びＢの左端である。可変ドメインタンパク質
及び連結基は遺伝修飾生物中での発現によって一緒に産
生させたものが好ましい。ポリペプチド連結基は、例え
ば、可変ドメインタンパク質と一緒に合成（クローン
化）してもよく、或いはドメイン配列の一端にタンパク
質テールを含んでいてもよい。連結基は、連結すべき表
面又はトレーサーから十分な長さの「距離」を可変ドメ
インに与えるように５個以上のアミノ酸残基を含む。
ップリングに使用するために）連結基は以下の「Myc」
アミノ酸配列： Glu−Gln−Lys−Leu−Ile−Ser−Glu−Glu−Asp−Lue−
Asn を含んでなるものである 連結基は通常は可変ドメインタンパク質の末端もしく
は末端付近に付着している。通常、付着部位はペプチド
連結基のアミノ末端である。これは添付の第２図に示し
た配列Ａ及びＢの左端である。可変ドメインタンパク質
及び連結基は遺伝修飾生物中での発現によって一緒に産
生させたものが好ましい。ポリペプチド連結基は、例え
ば、可変ドメインタンパク質と一緒に合成（クローン
化）してもよく、或いはドメイン配列の一端にタンパク
質テールを含んでいてもよい。連結基は、連結すべき表
面又はトレーサーから十分な長さの「距離」を可変ドメ
インに与えるように５個以上のアミノ酸残基を含む。
実際のカップリングは、例えば従来の二官能価化学的
架橋剤を使用して行うことができる。連結基内のこのよ
うな化学的カップリング部位は、連結基とカップリング
するような分子が可変ドメイン配列とある距離を置くよ
うに、可変ドメイン配列自体から十分に離れているのが
好ましい。
架橋剤を使用して行うことができる。連結基内のこのよ
うな化学的カップリング部位は、連結基とカップリング
するような分子が可変ドメイン配列とある距離を置くよ
うに、可変ドメイン配列自体から十分に離れているのが
好ましい。
トレーサーがタンパク質（例えば酵素など）である場
合、連結基中のリシン残基のε−アミノ基を介して連結
基に結合させるのが好ましい。好適な酵素の例として、
西洋ワサビのペルオキシダーゼ、アルカリホスファター
ゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、
及びウレアーゼなどが挙げられる。
合、連結基中のリシン残基のε−アミノ基を介して連結
基に結合させるのが好ましい。好適な酵素の例として、
西洋ワサビのペルオキシダーゼ、アルカリホスファター
ゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、
及びウレアーゼなどが挙げられる。
連結基を介して可変ドメインを固体表面に付着させる
ような本発明の一つの具体的態様においては、該表面は
ポリスチレン、ポリ塩化ビニル（PVC）又はポリエチレ
ンテレフタレートグリコール（PETG）などのプラスチッ
ク材料から作った固体構造物の表面である。可変ドメイ
ンを固定化するのに極めて有用な表面の例は、いわゆる
「ラテックス」粒子（これはポリスチレンなどのプラス
チック材料の微細固体粒子であり、通常水性懸濁液中で
用いられる）であり、それ以外にもビーズ、ペグ及びウ
ェルなどの、免疫検定法で慣用的に用いられる多くのプ
ラスチック製構造物がある。
ような本発明の一つの具体的態様においては、該表面は
ポリスチレン、ポリ塩化ビニル（PVC）又はポリエチレ
ンテレフタレートグリコール（PETG）などのプラスチッ
ク材料から作った固体構造物の表面である。可変ドメイ
ンを固定化するのに極めて有用な表面の例は、いわゆる
「ラテックス」粒子（これはポリスチレンなどのプラス
チック材料の微細固体粒子であり、通常水性懸濁液中で
用いられる）であり、それ以外にもビーズ、ペグ及びウ
ェルなどの、免疫検定法で慣用的に用いられる多くのプ
ラスチック製構造物がある。
本発明は複数の可変ドメインタンパク質からなる特異
的結合試薬をも包含する。これらは天然のFvフラグメン
ト（即ち１つのＬ鎖可変タンパク質を伴う１つのＨ鎖可
変部）の等価物であってもよいし、Ｈ鎖又はＬ鎖可変部
タンパク質の組み合わせを含んでなるものであってもよ
い。このような組み合わせは通常は比較的弱い相互作用
によって会合している。本発明の連結基は複数の可変部
タンパク質配列の内の一つの配列の一方の末端もしくは
末端付近に組み込むこともできるが、所望によっては同
一もしくは異なる性質をもつ１個以上の連結基を上記組
み合わせ（例えば可変部タンパク質、或いは複数の異な
る可変部タンパク質の末端もしくは末端付近）に組み込
むこともできる。個々の可変ドメインタンパク質をクロ
ーニングの際に別々に発現させることもできる。これら
は、一般にそれらの会合を生じせしめ得る弱い相互作用
を阻害しないような温和な条件下で自然に会合する。
的結合試薬をも包含する。これらは天然のFvフラグメン
ト（即ち１つのＬ鎖可変タンパク質を伴う１つのＨ鎖可
変部）の等価物であってもよいし、Ｈ鎖又はＬ鎖可変部
タンパク質の組み合わせを含んでなるものであってもよ
い。このような組み合わせは通常は比較的弱い相互作用
によって会合している。本発明の連結基は複数の可変部
タンパク質配列の内の一つの配列の一方の末端もしくは
末端付近に組み込むこともできるが、所望によっては同
一もしくは異なる性質をもつ１個以上の連結基を上記組
み合わせ（例えば可変部タンパク質、或いは複数の異な
る可変部タンパク質の末端もしくは末端付近）に組み込
むこともできる。個々の可変ドメインタンパク質をクロ
ーニングの際に別々に発現させることもできる。これら
は、一般にそれらの会合を生じせしめ得る弱い相互作用
を阻害しないような温和な条件下で自然に会合する。
本発明の試薬は、所望によっては、原抗体の如何なる
他の実質的部分をも伴っていない１個の可変ドメインと
原抗体の如何なる他の実質的部分をも伴っていない異な
る特異性をもつ第二の可変ドメインとを介在連結基によ
って連結したものを含有させることによって、２つの異
なる種類の物質に対して特異性を示すように作ることも
できる。特に好適な特異性の組み合わせの例としては、
抗検体と抗酵素が挙げられる。
他の実質的部分をも伴っていない１個の可変ドメインと
原抗体の如何なる他の実質的部分をも伴っていない異な
る特異性をもつ第二の可変ドメインとを介在連結基によ
って連結したものを含有させることによって、２つの異
なる種類の物質に対して特異性を示すように作ることも
できる。特に好適な特異性の組み合わせの例としては、
抗検体と抗酵素が挙げられる。
本発明は原則として単一ドメイン抗体フラグメントの
新規生産方法に関わるものでも、かかるフラグメントと
ペプチドテールとの組み合わせの新規生産方法に関わる
ものでもない。これらの目的に適した方法はワード他の
論文に開示されている。事実、ワード他は「Myc」テー
ルを有する抗リゾチーム単一ドメイン抗体フラグメント
の生産法を開示している。この組み合わせは本発明にお
いて用いることができるが、ワード他は「Myc」テール
を彼等が作った抗リゾリームDabの実験上の同定及び単
離に役立てるためのエピトープとして使用することしか
意図していない。ワード他は「Myc」テールがプラスチ
ック表面上へのDabの固定化に理想的であるとは全く示
唆していない。かかる着想は欧州特許公開第0368684号
公報にも開示されていない。しかも、かかるペプチドテ
ールにリシン基を有することの利点についてはこれらの
文献のいずれにも記載されていない。
新規生産方法に関わるものでも、かかるフラグメントと
ペプチドテールとの組み合わせの新規生産方法に関わる
ものでもない。これらの目的に適した方法はワード他の
論文に開示されている。事実、ワード他は「Myc」テー
ルを有する抗リゾチーム単一ドメイン抗体フラグメント
の生産法を開示している。この組み合わせは本発明にお
いて用いることができるが、ワード他は「Myc」テール
を彼等が作った抗リゾリームDabの実験上の同定及び単
離に役立てるためのエピトープとして使用することしか
意図していない。ワード他は「Myc」テールがプラスチ
ック表面上へのDabの固定化に理想的であるとは全く示
唆していない。かかる着想は欧州特許公開第0368684号
公報にも開示されていない。しかも、かかるペプチドテ
ールにリシン基を有することの利点についてはこれらの
文献のいずれにも記載されていない。
本発明の活性化可変ドメインフラグメント、特異性の
異なる２つの可変ドメインを含む二特異的試薬、及び酵
素標識含有抱合生成物の生産方法を、単なる例示として
以下に挙げる。
異なる２つの可変ドメインを含む二特異的試薬、及び酵
素標識含有抱合生成物の生産方法を、単なる例示として
以下に挙げる。
例１ ａ）抗リゾチームVHフラグメントD1.3をPstl-BstEIIカ
セットとして含むベクターの調製 抗リゾチームVHフラグメントD1.3を発現ベクターpSW1
-VHD1.3-VKD1.3からPst1-BstEIIフラグメントとして切
り取る。このベクターとこの例で使用したもう一つの発
現ベクターpSW1-VHPOLY-TAG1はワード他（1989）によっ
て十分に記載されている。
セットとして含むベクターの調製 抗リゾチームVHフラグメントD1.3を発現ベクターpSW1
-VHD1.3-VKD1.3からPst1-BstEIIフラグメントとして切
り取る。このベクターとこの例で使用したもう一つの発
現ベクターpSW1-VHPOLY-TAG1はワード他（1989）によっ
て十分に記載されている。
pSW1-VHPOLY-TAG1を制限酵素Pst1とBstEIIで切断し、
該開環ベクターにD1.3の抗リゾチームPst1-BstEIIVHフ
ラグメントを連結する。この連結によって、発現ベクタ
ーpSW1-VHD1.3-TAG1（ワード他）と本質的に同一（ただ
しPst1及びBstEII制限酵素部位が組み込まれている）
の、VHD1.3フラグメントが挿入された発現ベクターが生
じる。この発現ベクターはpVHD1.3-TAG1と呼び得るもの
である。
該開環ベクターにD1.3の抗リゾチームPst1-BstEIIVHフ
ラグメントを連結する。この連結によって、発現ベクタ
ーpSW1-VHD1.3-TAG1（ワード他）と本質的に同一（ただ
しPst1及びBstEII制限酵素部位が組み込まれている）
の、VHD1.3フラグメントが挿入された発現ベクターが生
じる。この発現ベクターはpVHD1.3-TAG1と呼び得るもの
である。
ｂ）pVHD1.3-TAG1にクローン化したVH遺伝子下流の連結
基配列のクローニング VH遺伝子下流におけるTAG1の連結基配列による置換は
大オリゴヌクレオチドを用いる特異的変異導入法で行
う。この方法はベルホイエン（Verhoeyen）他のScience
第239巻（1988）1534-1536頁に記載されている。
基配列のクローニング VH遺伝子下流におけるTAG1の連結基配列による置換は
大オリゴヌクレオチドを用いる特異的変異導入法で行
う。この方法はベルホイエン（Verhoeyen）他のScience
第239巻（1988）1534-1536頁に記載されている。
一重鎖鋳型DNAをmp19VHD1.3-TAG1から調製する。これ
はpVHD1.3-TAG1から得られるHindIII-EcoRIフラグメン
トで、VHD1.3及びTAG1を含み、mp19のHindIII及びEcoRI
部位にクローン化したものである。このクローンから得
られた一重鎖DNAはVHD1.3-TAG1配列のコード鎖を含む。
この鋳型にDNAオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさ
せて、２本目のDNA鎖を重合させるためのプライマーと
作用させる。このオリゴヌクレオチドは組込み部位と相
同な12個の塩基で両側を挟んだ所要の連結基配列を含
む。得られた二重鎖分子で大腸菌（E.coli）を形質転換
するが、このときある割合の分子は活性化配列の導入に
よって「修復」される。組込み部位と相同な上記12個の
フランキング塩基は、VHD1.3の最後の４つのコドン並び
にpVHD1.3-TAG1に存在する２つの終結コドンとそれに続
く６塩基である。該オリゴヌクレオチドは、TAG1遺伝子
配列を連結基遺伝子配列で置き換える。
はpVHD1.3-TAG1から得られるHindIII-EcoRIフラグメン
トで、VHD1.3及びTAG1を含み、mp19のHindIII及びEcoRI
部位にクローン化したものである。このクローンから得
られた一重鎖DNAはVHD1.3-TAG1配列のコード鎖を含む。
この鋳型にDNAオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさ
せて、２本目のDNA鎖を重合させるためのプライマーと
作用させる。このオリゴヌクレオチドは組込み部位と相
同な12個の塩基で両側を挟んだ所要の連結基配列を含
む。得られた二重鎖分子で大腸菌（E.coli）を形質転換
するが、このときある割合の分子は活性化配列の導入に
よって「修復」される。組込み部位と相同な上記12個の
フランキング塩基は、VHD1.3の最後の４つのコドン並び
にpVHD1.3-TAG1に存在する２つの終結コドンとそれに続
く６塩基である。該オリゴヌクレオチドは、TAG1遺伝子
配列を連結基遺伝子配列で置き換える。
好適な制限酵素部位を結合オリゴヌクレオチドに導入
して、DNA配列操作を容易にすることができる。
して、DNA配列操作を容易にすることができる。
添付図面の第１図は、上述の手順において有用な３種
類のオリゴヌクレオチド配列I,II,及びIIIを示したもの
である。配列ＩとIIは同一の親水性連結基を製造するた
めに採用し得る配列を示したものであり、配列IIIは疎
水性連結基を製造するために用いることができるもので
ある。
類のオリゴヌクレオチド配列I,II,及びIIIを示したもの
である。配列ＩとIIは同一の親水性連結基を製造するた
めに採用し得る配列を示したものであり、配列IIIは疎
水性連結基を製造するために用いることができるもので
ある。
第２図は、２種類の連結基Ａ及びＢのcDNAとアミノ酸
配列を示したものである。連結基Ａは親水性で、配列Ｉ
とIIのどちらを用いても製造することのできるものであ
る。連結基Ｂは疎水性で、配列IIIを用いて製造するこ
とができる。
配列を示したものである。連結基Ａは親水性で、配列Ｉ
とIIのどちらを用いても製造することのできるものであ
る。連結基Ｂは疎水性で、配列IIIを用いて製造するこ
とができる。
このようにして得られる３種類のプラスミド、即ちそ
の連結基配列構造が12又は11個のアミノ酸（ｎ＝１）を
含むようなpVHD1.3-ADI,pVHD1.3-ADII,及びpVHD1.3-ADI
IIと名付けたプラスミドは、配列I,II,及びIIIを用いて
作る。これらのプラスミドを大腸菌中で発現させる（ワ
ード他の方法に従って）。
の連結基配列構造が12又は11個のアミノ酸（ｎ＝１）を
含むようなpVHD1.3-ADI,pVHD1.3-ADII,及びpVHD1.3-ADI
IIと名付けたプラスミドは、配列I,II,及びIIIを用いて
作る。これらのプラスミドを大腸菌中で発現させる（ワ
ード他の方法に従って）。
例２ ２種類の可変ドメインを含む双特異性試薬の構築 VHD1.3から得られ標準的な組換えDNA技術を用いてDNA
フラグメントとして調製した特異性の異なる第二のVHド
メインをpVHD1.3-ADI、pVHD1.3-ADII、又はpVHD1.3-ADI
IIのいずれかのKpn1制限酵素部位にクローン化する。こ
のようにして得られる発現ベクターは、リシン残基（こ
れに他の材料をカップリングさせることができる）を含
むアミノ酸「架橋」によって異なる特異性のVHドメイン
と連結したVHD1.3を発現する。
フラグメントとして調製した特異性の異なる第二のVHド
メインをpVHD1.3-ADI、pVHD1.3-ADII、又はpVHD1.3-ADI
IIのいずれかのKpn1制限酵素部位にクローン化する。こ
のようにして得られる発現ベクターは、リシン残基（こ
れに他の材料をカップリングさせることができる）を含
むアミノ酸「架橋」によって異なる特異性のVHドメイン
と連結したVHD1.3を発現する。
例３ pVHD1.3-ADI,pVHD1.3-ADII,pVHD1.3-ADIIIから得られ
るタンパク質生成物の抱合 ａ）アリカリホスファターゼの抱合 100μｌの「テール」付着可変ドメインフラグメント
タンパク質（2.5〜5.0mg/ml）を、100μｌのアルカリホ
スファターゼ（10mg/ml）及び５μｌのグルタルアルデ
ヒド（５％）と共に、室温で60分間インキュベートす
る。次に5mlのトリス（Tris）／卵白アルブミン緩衝液
（0.05M Tirs,pH7.5;5％卵白アルブミン）を加え、この
混合物を24時間以上＋４℃に置く。次いで、この抱合混
合物を試験し、小分けした状態で急速冷凍して使用時ま
で低温（例えば−20〜−80℃）で保存する。
るタンパク質生成物の抱合 ａ）アリカリホスファターゼの抱合 100μｌの「テール」付着可変ドメインフラグメント
タンパク質（2.5〜5.0mg/ml）を、100μｌのアルカリホ
スファターゼ（10mg/ml）及び５μｌのグルタルアルデ
ヒド（５％）と共に、室温で60分間インキュベートす
る。次に5mlのトリス（Tris）／卵白アルブミン緩衝液
（0.05M Tirs,pH7.5;5％卵白アルブミン）を加え、この
混合物を24時間以上＋４℃に置く。次いで、この抱合混
合物を試験し、小分けした状態で急速冷凍して使用時ま
で低温（例えば−20〜−80℃）で保存する。
ｂ）西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）の抱合 4mgのHRPを1mlの蒸留水中に溶解する。次に、0.2mlの
調製したばかりの0.1M NaIO4を加えて、その溶液を20分
間室温で撹拌する。HRP−アルデヒド溶液を1mM酢酸ナト
リウム緩衝液（pH4.4）に対して＋４℃で一晩透析す
る。透析後、20μｌの0.2M炭酸ナトリウム緩衝液（pH9.
5）を加えて溶液のpHを9.0〜9.5に上げる。その後すぐ
に、0.01M炭酸ナトリウム緩衝液（pH9.5）に溶解させた
5mgの「テール」付着可変ドメインタンパク質を加え、
混合物を室温で２時間撹拌する。次に、0.1mlの調製し
たばかりの水素化硼素ナトリウム溶液（4mg/ml水）を加
え、その混合物を２時間＋４℃に置く。こうしてインキ
ュベートした後、該抱合溶液を、PBSで平衡化したセフ
ァクリル（Sephacryl）S-200の35×2.5cmカラムのクロ
マトグラフィーにかける。各フラクション（2ml）の吸
光度を280nmと403nmで測定し、所望とする抱合物のピー
クを含むフラクションをプールする。ウシ血清アルブミ
ンを最終濃度で10mg/ml加えて、小分けした標品を急速
冷凍して使用時まで低温（例えば−20〜−80℃）で保存
する。
調製したばかりの0.1M NaIO4を加えて、その溶液を20分
間室温で撹拌する。HRP−アルデヒド溶液を1mM酢酸ナト
リウム緩衝液（pH4.4）に対して＋４℃で一晩透析す
る。透析後、20μｌの0.2M炭酸ナトリウム緩衝液（pH9.
5）を加えて溶液のpHを9.0〜9.5に上げる。その後すぐ
に、0.01M炭酸ナトリウム緩衝液（pH9.5）に溶解させた
5mgの「テール」付着可変ドメインタンパク質を加え、
混合物を室温で２時間撹拌する。次に、0.1mlの調製し
たばかりの水素化硼素ナトリウム溶液（4mg/ml水）を加
え、その混合物を２時間＋４℃に置く。こうしてインキ
ュベートした後、該抱合溶液を、PBSで平衡化したセフ
ァクリル（Sephacryl）S-200の35×2.5cmカラムのクロ
マトグラフィーにかける。各フラクション（2ml）の吸
光度を280nmと403nmで測定し、所望とする抱合物のピー
クを含むフラクションをプールする。ウシ血清アルブミ
ンを最終濃度で10mg/ml加えて、小分けした標品を急速
冷凍して使用時まで低温（例えば−20〜−80℃）で保存
する。
例４ 大腸菌上清中の可変ドメインフラグメントの検出、精
製、並びにトレーサー免疫複合体の構築を目的として、
リンカーＡ及びＢ（第２図）に対する結合特異性を有す
るモノクローナル抗体を調製する。免疫原性（例えばウ
シ血清アルブミン又はカサガイ（keyhole limpet）ヘモ
シアニンへの抱合）を与えるためにペプチド（例えば固
相ペプチド合成法による）及び抱合高分子を合成した
後、従来技術を用いてマウス中でモノクローナル抗体を
産生させることができる。
製、並びにトレーサー免疫複合体の構築を目的として、
リンカーＡ及びＢ（第２図）に対する結合特異性を有す
るモノクローナル抗体を調製する。免疫原性（例えばウ
シ血清アルブミン又はカサガイ（keyhole limpet）ヘモ
シアニンへの抱合）を与えるためにペプチド（例えば固
相ペプチド合成法による）及び抱合高分子を合成した
後、従来技術を用いてマウス中でモノクローナル抗体を
産生させることができる。
例5:ペプチドテールを有する可変ドメイン抗体を用いる
リゾチームの免疫検定 実験手順 抗リゾチームVHフラグメントを、例１並びにワード他
（1989）の記載した方法で作った。該フラグメント試料
はテール付もしくはテールなしで調製した。このとき、
それぞれ第２図のＡとＢの配列をもつ親水性と疎水性の
２種類のテールを用いた。上記３種類のフラグメントの
各々について２種類の抱合体（即ち、ビオチンと抱合し
たもの及び西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）と抱合
したもの）を作った。
リゾチームの免疫検定 実験手順 抗リゾチームVHフラグメントを、例１並びにワード他
（1989）の記載した方法で作った。該フラグメント試料
はテール付もしくはテールなしで調製した。このとき、
それぞれ第２図のＡとＢの配列をもつ親水性と疎水性の
２種類のテールを用いた。上記３種類のフラグメントの
各々について２種類の抱合体（即ち、ビオチンと抱合し
たもの及び西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）と抱合
したもの）を作った。
ａ）HRPとの抱合。各々の抱合に0.042mgのフラグメント
を用いたこと以外は、例3bの方法を繰り返した。
を用いたこと以外は、例3bの方法を繰り返した。
ｂ）ビオチンとの抱合。80μg/ml（＋／−10μg/ml）の
濃度のフラグメント溶液（0.5ml）を炭酸緩衝液（pH9.
5）に対して透析した。ビオチン−Ｎ−ヒドロキシスク
シンイミド（ビオチン−NHS,シグマ（Sigma）社製）を
ジメチルスルホキシドに1mg/mlの濃度となるように溶解
し、この溶液75μｌを上記の透析フラグメント溶液に加
えた。この反応混合物を撹拌して、室温で２時間放置
し、しかる後にpH7.2の生理的リン酸緩衝液（PBS）で容
積を2.5mlに増やした。この希釈溶液を使い捨てゲル濾
過カラム（ファルマシア（Pharmacia）社製,PD10）に通
して、未反応のビオチン−NHSと未抱合ビオチンを抱合
フラグメントから分離した。フラグメント含有フラクシ
ョンを回収し、プールして、2lのPBSに対して４℃で24
時間透析した。
濃度のフラグメント溶液（0.5ml）を炭酸緩衝液（pH9.
5）に対して透析した。ビオチン−Ｎ−ヒドロキシスク
シンイミド（ビオチン−NHS,シグマ（Sigma）社製）を
ジメチルスルホキシドに1mg/mlの濃度となるように溶解
し、この溶液75μｌを上記の透析フラグメント溶液に加
えた。この反応混合物を撹拌して、室温で２時間放置
し、しかる後にpH7.2の生理的リン酸緩衝液（PBS）で容
積を2.5mlに増やした。この希釈溶液を使い捨てゲル濾
過カラム（ファルマシア（Pharmacia）社製,PD10）に通
して、未反応のビオチン−NHSと未抱合ビオチンを抱合
フラグメントから分離した。フラグメント含有フラクシ
ョンを回収し、プールして、2lのPBSに対して４℃で24
時間透析した。
ｃ）固相の調製。市販のポリスチレン製の微量滴定用プ
レートのウェルに、PBS中の100μg/mlリゾチーム溶液を
100μｌ等量ずつ投与した。投与プレートを37℃で２時
間インキュベートして、ポリスチレン表面上にリゾチー
ムが十分に吸着するようにした。ツイーン（Tween）20
を含有するPBS（0.15v/v％,PBSTと略す）中でプレート
を５回洗浄し、次に、PBS中の２％（w/v）脱脂乳タンパ
ク質溶液（ウェル１個当り150μｌ）でさらに２時間37
℃で処理した。この２度目の処理は、タンパク質吸着能
を有するウェル表面の未吸着部位を（脱脂乳タンパク質
で）ブロックして、その後の検定成分の非特異的吸着を
最小にするためのものである。
レートのウェルに、PBS中の100μg/mlリゾチーム溶液を
100μｌ等量ずつ投与した。投与プレートを37℃で２時
間インキュベートして、ポリスチレン表面上にリゾチー
ムが十分に吸着するようにした。ツイーン（Tween）20
を含有するPBS（0.15v/v％,PBSTと略す）中でプレート
を５回洗浄し、次に、PBS中の２％（w/v）脱脂乳タンパ
ク質溶液（ウェル１個当り150μｌ）でさらに２時間37
℃で処理した。この２度目の処理は、タンパク質吸着能
を有するウェル表面の未吸着部位を（脱脂乳タンパク質
で）ブロックして、その後の検定成分の非特異的吸着を
最小にするためのものである。
ｄ）リゾリーム検定用標準曲線の作成。１％（w/v）ウ
シ血清アルブミン（BSAと略す）を含む適当な容積のPBS
Tに保存リゾチーム溶液を稀釈して、２×10-6M,2×10-7
M,2×10-8M,2×10-9M,及び２×10-10Ｍの濃度とするこ
とによって、一連の較正用標準リゾチーム標品を調製し
た。ビオチン抱合物については1/12に、HRP抱合物につ
いては1/50に、それぞれの保存抱合溶液を稀釈すること
によって、使用強度の抱合溶液を調製した。上記（ｃ）
に記載のように感作させた微量滴定プレートをPBST中で
５回洗浄し、その後、適切に標識したウェルに等容積の
抱合物並びに較正用標準標品を投与した（ウェル１個当
り100μｌ）。この競争結合アッセイ段階を37℃で１時
間続けた後、ウェルをPBST中で５回洗浄した。
シ血清アルブミン（BSAと略す）を含む適当な容積のPBS
Tに保存リゾチーム溶液を稀釈して、２×10-6M,2×10-7
M,2×10-8M,2×10-9M,及び２×10-10Ｍの濃度とするこ
とによって、一連の較正用標準リゾチーム標品を調製し
た。ビオチン抱合物については1/12に、HRP抱合物につ
いては1/50に、それぞれの保存抱合溶液を稀釈すること
によって、使用強度の抱合溶液を調製した。上記（ｃ）
に記載のように感作させた微量滴定プレートをPBST中で
５回洗浄し、その後、適切に標識したウェルに等容積の
抱合物並びに較正用標準標品を投与した（ウェル１個当
り100μｌ）。この競争結合アッセイ段階を37℃で１時
間続けた後、ウェルをPBST中で５回洗浄した。
ビオチン抱合物を用いた手順においては、ウェルにス
トレプトアビジン／アルカリホスファターゼ抱合物（シ
グマ社製）の溶液を投与してさらに１時間37℃でインキ
ュベートした。プレートを再び５回洗浄して、1Mジエタ
ノールアミン緩衝液（pH9.8）中で1mg/mlのシグマ社製1
04ホスファターゼ基質を投与した。発色反応を室温で10
乃至15分間持続した後、光学密度を読み取った。
トレプトアビジン／アルカリホスファターゼ抱合物（シ
グマ社製）の溶液を投与してさらに１時間37℃でインキ
ュベートした。プレートを再び５回洗浄して、1Mジエタ
ノールアミン緩衝液（pH9.8）中で1mg/mlのシグマ社製1
04ホスファターゼ基質を投与した。発色反応を室温で10
乃至15分間持続した後、光学密度を読み取った。
HRP抱合物を用いた手順においては、即座にリン酸ク
エン酸緩衝液（pH6.5）中のテトラメチルベンジジン溶
液をウェルに投与し、室温で発色反応を10〜15分間持続
した。光学密度を測定する前に、各ウェルに50μｌの2M
HClを投与した。
エン酸緩衝液（pH6.5）中のテトラメチルベンジジン溶
液をウェルに投与し、室温で発色反応を10〜15分間持続
した。光学密度を測定する前に、各ウェルに50μｌの2M
HClを投与した。
結果 HRP抱合物から得られた較正曲線を第３図に示し、ビ
オチン抱合物から得られたものを第４図に示す。それぞ
れの図から分かるように、テールをもたないVHの抱合物
が満足できるような較正曲線を与えなかったのに対し
て、いずれかのテールを有するフラグメントは満足すべ
き結果を与えており、適切な連結基の効果を明瞭に示し
ている。
オチン抱合物から得られたものを第４図に示す。それぞ
れの図から分かるように、テールをもたないVHの抱合物
が満足できるような較正曲線を与えなかったのに対し
て、いずれかのテールを有するフラグメントは満足すべ
き結果を与えており、適切な連結基の効果を明瞭に示し
ている。
例6:プラスチック表面を感作する際のVHフラグメントの
効率−種々のペプチドテールの効果 実験手順 抗リゾチームVHフラグメントを、例１並びにワード他
（1989）の記載した方法に従って、単独でもしくはペプ
チドテールを付けて、作成した。第２図に示す２種類の
テール配列Ａ及びＢ、並びにワード他の記載した「My
c」ペプチド（Nature,第341巻（1989）,544-546頁）と
同一の第３のテールを使用した。この「Myc」テールの
アミノ酸配列は以下の通りである： Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Lue-Asn。
効率−種々のペプチドテールの効果 実験手順 抗リゾチームVHフラグメントを、例１並びにワード他
（1989）の記載した方法に従って、単独でもしくはペプ
チドテールを付けて、作成した。第２図に示す２種類の
テール配列Ａ及びＢ、並びにワード他の記載した「My
c」ペプチド（Nature,第341巻（1989）,544-546頁）と
同一の第３のテールを使用した。この「Myc」テールの
アミノ酸配列は以下の通りである： Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Lue-Asn。
これらのフラグメントの溶液を、単なる吸着による微
量滴定プレートのウェルの感作に用いた。これらのフラ
グメントがリゾチームへの特異的結合能を保持したまま
プラスチック表面に結合する効率を、その後のリゾチー
ム／西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）抱合体の免疫
化学的結合によって評価した。
量滴定プレートのウェルの感作に用いた。これらのフラ
グメントがリゾチームへの特異的結合能を保持したまま
プラスチック表面に結合する効率を、その後のリゾチー
ム／西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）抱合体の免疫
化学的結合によって評価した。
ａ）HRPとリゾチームの抱合。活性化VHの代りに精製リ
ゾチームを用いたことを除いては、例3bの方法を繰り返
した。
ゾチームを用いたことを除いては、例3bの方法を繰り返
した。
ｂ）固相の調製。微量滴定用プレートのウェル（コスタ
ー（Costar）社のポリエチレンテレフタレートグリコー
ル製「ファーストバインダー（fastbinder）」に、炭酸
緩衝液（pH9.8）中で80ng/mlの濃度のVHフラグメント10
0μｌ等量を投与した。ウェルの幾つかを炭酸緩衝液で
処理して未感作対照用のウェルとした。投与プレートを
37℃で２時間インキュベートして、ウェル表面上にペプ
チドが十分に吸着するようにした。
ー（Costar）社のポリエチレンテレフタレートグリコー
ル製「ファーストバインダー（fastbinder）」に、炭酸
緩衝液（pH9.8）中で80ng/mlの濃度のVHフラグメント10
0μｌ等量を投与した。ウェルの幾つかを炭酸緩衝液で
処理して未感作対照用のウェルとした。投与プレートを
37℃で２時間インキュベートして、ウェル表面上にペプ
チドが十分に吸着するようにした。
ｃ）リゾチーム捕獲効率の評価。上記感作プレートのウ
ェルを空にして、0.15v/v％のツイーン20を含有するPBS
（PBST）中で５回洗浄した。１％（w/v）のウシ血清ア
ルブミンを含有するPBS中のリゾチーム/HRP抱合物（保
存溶液を1/100に稀釈したもの、例3b参照）の溶液で各
ウェルを処理した。この免疫化学的結合（捕獲）段階を
37℃で１時間続けて、しかる後にプレートを空にしてPB
ST中で５回洗浄した。リン酸クエン酸緩衝液（pH6.5）
中のテトラメチルベンジジン溶液をウェルに投与し、す
べてのプレートを適度に発色するまで室温に維持した。
適度に発色した時点で各ウェルに50μｌの2M HClを投与
して、光学密度を測定した。
ェルを空にして、0.15v/v％のツイーン20を含有するPBS
（PBST）中で５回洗浄した。１％（w/v）のウシ血清ア
ルブミンを含有するPBS中のリゾチーム/HRP抱合物（保
存溶液を1/100に稀釈したもの、例3b参照）の溶液で各
ウェルを処理した。この免疫化学的結合（捕獲）段階を
37℃で１時間続けて、しかる後にプレートを空にしてPB
ST中で５回洗浄した。リン酸クエン酸緩衝液（pH6.5）
中のテトラメチルベンジジン溶液をウェルに投与し、す
べてのプレートを適度に発色するまで室温に維持した。
適度に発色した時点で各ウェルに50μｌの2M HClを投与
して、光学密度を測定した。
結果 それぞれのタイプの感作実験で得られた平均光学密度
を表１に示す。各種のペプチドテールを付けたフラグメ
ントのPETGウェル上への吸着によって得られた固相の捕
獲効率、測定した光学密度に比例する。
を表１に示す。各種のペプチドテールを付けたフラグメ
ントのPETGウェル上への吸着によって得られた固相の捕
獲効率、測定した光学密度に比例する。
これらの結果は、免疫化学的結合活性を有するフラグ
メントに適切な連結基を加えることの実際的効果を明瞭
に示している。驚くべきことに、上記の如き経済的で低
い濃度において、短い疎水性領域を含有する荷電ペプチ
ド（Mycのような）が最も効率が高かった。
メントに適切な連結基を加えることの実際的効果を明瞭
に示している。驚くべきことに、上記の如き経済的で低
い濃度において、短い疎水性領域を含有する荷電ペプチ
ド（Mycのような）が最も効率が高かった。
市販のポリスチレン製ウェル並びにポリ塩化ビニルウ
ェル製ウェルを使用しても、疎水性連結基の有利さを示
す同様の結果が得られた。
ェル製ウェルを使用しても、疎水性連結基の有利さを示
す同様の結果が得られた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 デ・ウィンター、ロナルド・フランク・ヤ コブス 英国、ベッドフォード、ダドリー・ストリ ート 97 (56)参考文献 国際公開88／09344（ＷＯ，Ａ) 欧州特許出願公開341498（ＥＰ，Ａ)
Claims (11)
- 【請求項１】特異的結合試薬にして、 （ｉ）本質的に１個もしくはそれ以上の可変ドメインタ
ンパク質だけからなる特異的結合体、 （ii）当該試薬の特異的結合性には寄与しない連結基に
して、当該連結基は５個以上のアミノ酸残基を含んでな
るものであって、当該連結基は疎水性であり、しかも当
該連結基は任意には少なくとも１個のリシン残基を含ん
でおり、それによって該連結基のカップリング特性が高
められている連結基、及び （iii）上記連結基を介して上記可変ドメインタンパク
質とカップリングした固体表面又はトレーサー、 を含んでなることを特徴とする特異的結合試薬。 - 【請求項２】請求項１記載の特異的結合試薬において、
前記連結基が20個以下のアミノ酸残基からなることを特
徴とする特異的結合試薬。 - 【請求項３】請求項１又は請求項２記載の特異的結合試
薬において、前記連結基が疎水性でしかも少なくとも１
個のリシン残基を含むことを特徴とする特異的結合試
薬。 - 【請求項４】請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載
の特異的結合試薬において、当該試薬が、連結基として
作用するタンパク質テールに結合した単一可変ドメイン
タンパク質からなり、当該テールが特異的結合活性をさ
ほど失うことなく固体表面又はトレーサーにカップリン
グしていることを特徴とする特異的結合試薬。 - 【請求項５】請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載
の特異的結合試薬において、前記連結基が以下のアミノ
酸配列： Glu−Gln−Lys−Leu−Ile−Ser−Glu−Glu−Asp−Lue−
Asn を含んでなることを特徴とする特異的結合試薬。 - 【請求項６】請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載
の特異的結合試薬において、前記１個もしくはそれ以上
の可変ドメインタンパク質と前記連結基が遺伝修飾生物
中での発現によって一緒に産生させたものであることを
特徴とする特異的結合試薬。 - 【請求項７】請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載
の特異的結合試薬において、前記固体表面がプラスチッ
ク材料でできていることを特徴とする特異的結合試薬。 - 【請求項８】請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載
の特異的結合試薬において、前記固体表面がラテックス
粒子の表面であることを特徴とする特異的結合試薬。 - 【請求項９】請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載
の特異的結合試薬において、前記トレーサーが酵素のよ
うなタンパク質であって、連結基中に存在するリシン残
基のε−アミノ基を介して連結基に共有結合したもので
あることを特徴とする特異的結合試薬。 - 【請求項１０】請求項７又は請求項８記載の特異的結合
試薬において、前記連結基に、連結基に疎水性を付与す
るようなアミノ酸残基が少なくとも２個連続して存在し
ていることを特徴とする特異的結合試薬。 - 【請求項１１】請求項１乃至請求項10のいずれか１項記
載の特異的結合試薬において、前記特異的結合体がFv又
はDab抗体フラグメントであることを特徴とする特異的
結合試薬。
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