JPS6271860A - 受容体抗体サンドイツチアツセイ - Google Patents
受容体抗体サンドイツチアツセイInfo
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- JPS6271860A JPS6271860A JP61209760A JP20976086A JPS6271860A JP S6271860 A JPS6271860 A JP S6271860A JP 61209760 A JP61209760 A JP 61209760A JP 20976086 A JP20976086 A JP 20976086A JP S6271860 A JPS6271860 A JP S6271860A
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- G—PHYSICS
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- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/94—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving narcotics or drugs or pharmaceuticals, neurotransmitters or associated receptors
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- G—PHYSICS
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- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、0−アラニル−D−7ラニンジペブチドまた
は[)−7ラニル−D−アラニンカルボキシ末端オリゴ
ペプチドに結合できる物質を決定するために新規なサン
ドイッチアッセ・fに関する。
は[)−7ラニル−D−アラニンカルボキシ末端オリゴ
ペプチドに結合できる物質を決定するために新規なサン
ドイッチアッセ・fに関する。
それはバンコマイシンの部類あるいはその誘導体または
アグリコンを決定するたさ)に特別の用途を有する。こ
のアー7セイは、パンコマ1シンの部類の抗生物質に対
する適ちなり一アラニルーD−アラニノ、檎導体の高い
選択性および、決定の目的である部類の抗生物質に対し
、て向けられた抗体の特異性を兼備する。
アグリコンを決定するたさ)に特別の用途を有する。こ
のアー7セイは、パンコマ1シンの部類の抗生物質に対
する適ちなり一アラニルーD−アラニノ、檎導体の高い
選択性および、決定の目的である部類の抗生物質に対し
、て向けられた抗体の特異性を兼備する。
バンコマイシンの部類の抗生物質の例は、次のA4Jで
ある(バンコマイシンに加えて):ティコプラニン、ア
クタプラニ〉′、リストセチン、アポバルジ7、アクチ
ノイジン、抗生物QLL−AM−374、抗生物質A4
77、抗生物質OA7653、抗生物質A35512B
、抗生物質A、515668、抗生物質A/1−[12
16、抗生物質A41030、抗生物質A47934な
らびにそれらの個々の因子、誘4体またはアグリコン。
ある(バンコマイシンに加えて):ティコプラニン、ア
クタプラニ〉′、リストセチン、アポバルジ7、アクチ
ノイジン、抗生物QLL−AM−374、抗生物質A4
77、抗生物質OA7653、抗生物質A35512B
、抗生物質A、515668、抗生物質A/1−[12
16、抗生物質A41030、抗生物質A47934な
らびにそれらの個々の因子、誘4体またはアグリコン。
/ヘンコマイシンおよびリストセチンAは、/゛クチリ
ア細胞壁のl−構造成分であるペプチドグリカンの合成
を妨害することが知られている。この妨害は、その細胞
の生長の阻害に導き、そして究極的に、溶菌によりその
細胞の破壊に導き、その理由はこれらの抗体と、カルボ
キシル末端にD−Ala−D−Ala残基を有するペン
タペプチド前駆物?f (LJ D P −N−アセチ
ルムラミルペンタペプチド)との間の特異的結合にある
と考えられている[H、R、パーキンス(Perkin
S)、バイオケミストリー(Biochem、)1、T
、11!、195、 (1969)]。
ア細胞壁のl−構造成分であるペプチドグリカンの合成
を妨害することが知られている。この妨害は、その細胞
の生長の阻害に導き、そして究極的に、溶菌によりその
細胞の破壊に導き、その理由はこれらの抗体と、カルボ
キシル末端にD−Ala−D−Ala残基を有するペン
タペプチド前駆物?f (LJ D P −N−アセチ
ルムラミルペンタペプチド)との間の特異的結合にある
と考えられている[H、R、パーキンス(Perkin
S)、バイオケミストリー(Biochem、)1、T
、11!、195、 (1969)]。
最近、また、ティコプラニンは、感受性のバクテリアの
生長するペプチドグツカンへの結合により、回−の機構
を通して作用することが発見された。さらに詳しくは、
ティコプラニンは、バンコマイシンおよびリストセチン
Aおよび類似する抗体と同様に、カルボキシル末端にD
−Ala−D−Ala残基を有するペプチドグリカンに
詰合することが発見された。モのようにすることにより
、それらは多分バクテリアのトランスペプチダーセを阻
害し、そして細胞壁のペプチドグリカンの架橋を妨害す
る。これらの抗体は、また、D−アラニ)v−D−アラ
ニンジペプチドまたはD−アラニル−D−アラニンカル
ボキシ末端オリゴペプチドに結合する。また、バンコマ
イシンの部類の他の抗体は同一の作用機構により作用す
ることが証明さねあるいは■1定され、そして、それゆ
えD−アラニル−D−アラニ〉・ジペプチドまたはD−
アラニル−D−アラニンカルボキシ末端オリゴペプチ:
゛に結もすることができ、そしてそれは適ちな宿主中で
それらに対する抗体の形成を誘導することができる。
生長するペプチドグツカンへの結合により、回−の機構
を通して作用することが発見された。さらに詳しくは、
ティコプラニンは、バンコマイシンおよびリストセチン
Aおよび類似する抗体と同様に、カルボキシル末端にD
−Ala−D−Ala残基を有するペプチドグリカンに
詰合することが発見された。モのようにすることにより
、それらは多分バクテリアのトランスペプチダーセを阻
害し、そして細胞壁のペプチドグリカンの架橋を妨害す
る。これらの抗体は、また、D−アラニ)v−D−アラ
ニンジペプチドまたはD−アラニル−D−アラニンカル
ボキシ末端オリゴペプチドに結合する。また、バンコマ
イシンの部類の他の抗体は同一の作用機構により作用す
ることが証明さねあるいは■1定され、そして、それゆ
えD−アラニル−D−アラニ〉・ジペプチドまたはD−
アラニル−D−アラニンカルボキシ末端オリゴペプチ:
゛に結もすることができ、そしてそれは適ちな宿主中で
それらに対する抗体の形成を誘導することができる。
バンコマイシンの部類に抗体に加疋て、この方υ、はD
−アラニル−D−アラニンジペプチドまたはD−アラニ
ル−p−アラニンカルボキシ末端オリゴペプチドに結合
することができる他のグリコペプチド以外またはバンコ
マイシン類似物質以外の抗生物質を決定するために適当
に使用することができ、そしてそれは適当な宿−L中で
それらに対する抗体の形成を誘導することができる。
−アラニル−D−アラニンジペプチドまたはD−アラニ
ル−p−アラニンカルボキシ末端オリゴペプチドに結合
することができる他のグリコペプチド以外またはバンコ
マイシン類似物質以外の抗生物質を決定するために適当
に使用することができ、そしてそれは適当な宿−L中で
それらに対する抗体の形成を誘導することができる。
D−アラニル−D−アラニンまたはD−アラニル−D−
アラニンオリゴペプチドは、それゆえ、前述の抗生物質
のための「分子−の受容体」と考えることができる。
アラニンオリゴペプチドは、それゆえ、前述の抗生物質
のための「分子−の受容体」と考えることができる。
抗生物質、とくにティコプラニンおよびバンコマイシン
部類の他の抗生物質を決定するためにそれ自体既知の方
法は、LとしてTI、C,HPLCおよび感受性微生物
を使用するパイオアフヤイに基バく。これらの抗生物質
のあるものの現在の治療学的使用または進歩した臨床学
的研究をかんがみて、特異的、迅速、容易であり、信頼
性があり、そして自動化に適する、流体、ことに生物学
的流体の中のそれらを決定するためのアッセイ法が必要
とされている。
部類の他の抗生物質を決定するためにそれ自体既知の方
法は、LとしてTI、C,HPLCおよび感受性微生物
を使用するパイオアフヤイに基バく。これらの抗生物質
のあるものの現在の治療学的使用または進歩した臨床学
的研究をかんがみて、特異的、迅速、容易であり、信頼
性があり、そして自動化に適する、流体、ことに生物学
的流体の中のそれらを決定するためのアッセイ法が必要
とされている。
とイに1体の滲出物、気管支の吐いた物、うみ、火傷を
した患者からの皮+?:;の試料などの中のこれらの物
質の検出は、既知の技術では、1t;った結果がLばし
ばf’)られるので、ど(に困難である。本発明の方法
は、対照的に、ごれ゛ろの試料について、また、精確で
ありかつ信頼性がある。
した患者からの皮+?:;の試料などの中のこれらの物
質の検出は、既知の技術では、1t;った結果がLばし
ばf’)られるので、ど(に困難である。本発明の方法
は、対照的に、ごれ゛ろの試料について、また、精確で
ありかつ信頼性がある。
したがって、本発明の方法は、D−アラニル−D−7ラ
ニンジベブチドまたはD−アラニル−D−アラニンカル
ボキシ末端オリゴペプチi・によって代表される「分子
−の受容体」に結合するという特徴を有する分析物を特
別に決定するための、迅改な、容易な、信頼性ある、直
接法である。とくに、本発明のL法は、/ヘンコマ1ら
ンの部類の抗生物質の特別の決定を、同一部類の他の抗
生物質が存在してさ見、高い感受性、精度および精確さ
をもって、i+f能とする。
ニンジベブチドまたはD−アラニル−D−アラニンカル
ボキシ末端オリゴペプチi・によって代表される「分子
−の受容体」に結合するという特徴を有する分析物を特
別に決定するための、迅改な、容易な、信頼性ある、直
接法である。とくに、本発明のL法は、/ヘンコマ1ら
ンの部類の抗生物質の特別の決定を、同一部類の他の抗
生物質が存在してさ見、高い感受性、精度および精確さ
をもって、i+f能とする。
さらに詳しくは、本発明の方法は、L程:a) 表面I
−に吸着できる適当な高分子化合物の担体と接合したD
−アラニル−D−アラニンカルボキシ末端オリゴペプチ
ドを支持する前記表面と試験溶液を接触させ、 b) 洗浄後、検出すべき物質(分析物)に対しく特異
的に向けられた抗体を添加し、 Q ) :’J 1−相トの抗原へ結合した前記抗体
を、検出可能なマーカー(marker)に結合したこ
れらの結合抗体(抗抗体抗血清)に直接向けられた種特
異的抗IgG抗体によって、明らかにする、 を含む。
−に吸着できる適当な高分子化合物の担体と接合したD
−アラニル−D−アラニンカルボキシ末端オリゴペプチ
ドを支持する前記表面と試験溶液を接触させ、 b) 洗浄後、検出すべき物質(分析物)に対しく特異
的に向けられた抗体を添加し、 Q ) :’J 1−相トの抗原へ結合した前記抗体
を、検出可能なマーカー(marker)に結合したこ
れらの結合抗体(抗抗体抗血清)に直接向けられた種特
異的抗IgG抗体によって、明らかにする、 を含む。
D−アラニル−D−アラニンカルボキシ末端オリゴペプ
チドはトリペプトド、テトラペプトド、ペンタペプトド
、ヘキサペプトドまたはへプタペプI・ドであることが
でき、ここでカルボキシ末端ジペプトドはD−アラニル
−D−アラニンジペプチドによって代表される。好まし
いD−アラニル−D−アラニンカルボキシ末端オリゴペ
プチドは(−7ミノカプロイルーD−アラニル−D−ア
ラニン(以後、ε−Aca−D−A l a−D−A
1a)である。
チドはトリペプトド、テトラペプトド、ペンタペプトド
、ヘキサペプトドまたはへプタペプI・ドであることが
でき、ここでカルボキシ末端ジペプトドはD−アラニル
−D−アラニンジペプチドによって代表される。好まし
いD−アラニル−D−アラニンカルボキシ末端オリゴペ
プチドは(−7ミノカプロイルーD−アラニル−D−ア
ラニン(以後、ε−Aca−D−A l a−D−A
1a)である。
D−アラニル−D−アラニンカルボキシ末端オリゴペプ
チドを適当な担体と接合して、それが1/、l相表面ヒ
に吸着でさるようにする。適当ぼ担体は、この場合にお
いて、D−アラニル−D−アラニンカルボキシ末端オリ
ゴペプチドに!(有結合して、選釈した固相表面に吸着
できる(すなわち、物理的結合を構成できる)接合体を
形成できる、任意の蛋白質または他の品分/、 l、j
物質であることができる。
チドを適当な担体と接合して、それが1/、l相表面ヒ
に吸着でさるようにする。適当ぼ担体は、この場合にお
いて、D−アラニル−D−アラニンカルボキシ末端オリ
ゴペプチドに!(有結合して、選釈した固相表面に吸着
できる(すなわち、物理的結合を構成できる)接合体を
形成できる、任意の蛋白質または他の品分/、 l、j
物質であることができる。
このような担体の好ましい例は、アルブミンおよびとく
にウシアルブミンである。しかしながら、卵、ヒトまた
はブタのアルブミンを同様によく使用可能である。
にウシアルブミンである。しかしながら、卵、ヒトまた
はブタのアルブミンを同様によく使用可能である。
D−アラニル−D−アラニンカルボキシ末端オリゴペプ
チドを支持する担体をその]−に吸着する固相表面は、
好ましくは分析用支持体の表面である。この本願におい
て、 IlljM ’分析用支持体」は、液状試薬を含
イマすることができるか、あるいは少なくともそれに暴
露することができ、それゆえ適当な高分子化合物のJl
j体と接合したD−アラニル−D−アラニンカルボキシ
末端オリゴペプチドを支持する表面として使用すること
ができる、任意の分析用丁段であることができる。これ
らの好ましい例は、ガラスまたはプラスチ−2りのマイ
クロタイタープレートまたは試験管またはプラスナック
シートである。最も好ましい「分析用支持体」は、ポリ
エチレンまたはポリスチレンのマイクロタイタープレー
トのウェル(we I 1)である。
チドを支持する担体をその]−に吸着する固相表面は、
好ましくは分析用支持体の表面である。この本願におい
て、 IlljM ’分析用支持体」は、液状試薬を含
イマすることができるか、あるいは少なくともそれに暴
露することができ、それゆえ適当な高分子化合物のJl
j体と接合したD−アラニル−D−アラニンカルボキシ
末端オリゴペプチドを支持する表面として使用すること
ができる、任意の分析用丁段であることができる。これ
らの好ましい例は、ガラスまたはプラスチ−2りのマイ
クロタイタープレートまたは試験管またはプラスナック
シートである。最も好ましい「分析用支持体」は、ポリ
エチレンまたはポリスチレンのマイクロタイタープレー
トのウェル(we I 1)である。
したがって、本発明の最も好ましい「被覆された分析用
支持体J (すなわち、オリゴペプチドをその1−に支
持して有する表面)は、0.025マイクログラム〜1
マイクログラム、好ましくはO11イクログラム〜0.
2マイクログラムのBSA −ε−A Ca−D−A
l a−D −、A I aテ被覆されたプラスチック
のウェルまたは管である。
支持体J (すなわち、オリゴペプチドをその1−に支
持して有する表面)は、0.025マイクログラム〜1
マイクログラム、好ましくはO11イクログラム〜0.
2マイクログラムのBSA −ε−A Ca−D−A
l a−D −、A I aテ被覆されたプラスチック
のウェルまたは管である。
すでに述べたように、「試験溶液1中に存在するとイ[
定ごれる分析物は、バンコマイシンの部類の抗生物質あ
るいは、より一般的には、D−アラニル〜D−7ラニン
ジペブ千ドまたはD−アテニル−D−アラニンカルボキ
シ末・瑞オリゴペプチドに結合できる物質である。
定ごれる分析物は、バンコマイシンの部類の抗生物質あ
るいは、より一般的には、D−アラニル〜D−7ラニン
ジペブ千ドまたはD−アテニル−D−アラニンカルボキ
シ末・瑞オリゴペプチドに結合できる物質である。
12(ましい分析物はテイコブラ二〕あるいはその個々
の因子、誘導体またはアグリコンである。
の因子、誘導体またはアグリコンである。
[決定すべき物質に特異的に向けられた抗体Jは、試験
すべき結合の適当な接合体を注射により、動物の中で誘
導された抗体である。これらの抗体は、動物、例えば、
ウサギ、う・シ(・または他の人:11;以外の咄乳動
物を免疫化することにより得られる汀通の抗血清である
ことができ、あるいはC,マイルスティン(MilsL
ei:r)およびG、コヘラー(Koheler)Ij
イチャー(Na t u re)、256.495−4
97 (1975)]の細胞融合技術に本質的に従って
調製された前記物質に対する七ノ′クローナル抗体であ
ることができろ。
すべき結合の適当な接合体を注射により、動物の中で誘
導された抗体である。これらの抗体は、動物、例えば、
ウサギ、う・シ(・または他の人:11;以外の咄乳動
物を免疫化することにより得られる汀通の抗血清である
ことができ、あるいはC,マイルスティン(MilsL
ei:r)およびG、コヘラー(Koheler)Ij
イチャー(Na t u re)、256.495−4
97 (1975)]の細胞融合技術に本質的に従って
調製された前記物質に対する七ノ′クローナル抗体であ
ることができろ。
分Jfi物はハブテンである(すなわち、分析物は人間
以外の111乳動物に!1:人されたとき、それに対す
る抗体の生産をそれ自体で誘導できるばかりでなぐ、か
つまた適当な品分/、l龜の担体、例えば、蛋白質に結
合したとき、発現されうる免疫原性質を有する)ので、
分析物は、選択した宿主動物を免疫化する前に、一般に
ウシ血清アルブミンのような蛋白質である適当な担体へ
接合される。
以外の111乳動物に!1:人されたとき、それに対す
る抗体の生産をそれ自体で誘導できるばかりでなぐ、か
つまた適当な品分/、l龜の担体、例えば、蛋白質に結
合したとき、発現されうる免疫原性質を有する)ので、
分析物は、選択した宿主動物を免疫化する前に、一般に
ウシ血清アルブミンのような蛋白質である適当な担体へ
接合される。
ff通の抗血清を生産する便利な宿り動物はウサギであ
る。次いで、この抗血清は粘製または分別してIgG類
を巾離することができる。反対に、モノクローナル抗体
は、!−に引用したマイルスティンCMilstein
)およびコヘラー(K。
る。次いで、この抗血清は粘製または分別してIgG類
を巾離することができる。反対に、モノクローナル抗体
は、!−に引用したマイルスティンCMilstein
)およびコヘラー(K。
hejer)のL順に本質的に従い、融合促進剤の存在
下に、ラットの肺細胞または相同骨髄腫細胞を癩合する
ことによって得られたハイブリドーマにより河通に生産
される。汀通の抗血清のポリクローナル抗体の有意の比
率および、[決定すべき物質に特異的に向けられた抗体
」を代表することができるモノクローナル抗体の両者は
、分析物(すなわち、決定すべ5抗生物質)と「分子の
受容体」 (すなわち、適当な表面Hに吸着し、l、D
。
下に、ラットの肺細胞または相同骨髄腫細胞を癩合する
ことによって得られたハイブリドーマにより河通に生産
される。汀通の抗血清のポリクローナル抗体の有意の比
率および、[決定すべき物質に特異的に向けられた抗体
」を代表することができるモノクローナル抗体の両者は
、分析物(すなわち、決定すべ5抗生物質)と「分子の
受容体」 (すなわち、適当な表面Hに吸着し、l、D
。
Ala−D−Alalミオリボペプチド結1\を妨害し
てはならず、そして明らかなように、試#−tixに存
在しかつ同時に分子の受容体へ結合することができる部
類の他の抗生物質と交差反応してはならない。
てはならず、そして明らかなように、試#−tixに存
在しかつ同時に分子の受容体へ結合することができる部
類の他の抗生物質と交差反応してはならない。
本発明の方法において使用する「抗抗体抗血情」は、あ
る動物種の免疫グロブリン類G CI gG類)に対す
るf′f通の抗体調製物であり、ぞして前記動物種は[
第1J抗体(すなわち、ろユ析物に対して向けられたも
の)が屈する動物種である。
る動物種の免疫グロブリン類G CI gG類)に対す
るf′f通の抗体調製物であり、ぞして前記動物種は[
第1J抗体(すなわち、ろユ析物に対して向けられたも
の)が屈する動物種である。
これらの抗体、例えば、ウサギに対するヤキ抗1r11
清、ヤギ抗うヅト抗体の調製物は、?V連の技術に従い
得られ、そしてまた商業的に人’ ”r (kである。
清、ヤギ抗うヅト抗体の調製物は、?V連の技術に従い
得られ、そしてまた商業的に人’ ”r (kである。
この抗抗体抗血清と結合する検出τす能なマーカーは、
免疫アッセイにおいて通常の「マーカー」の1つ1例え
ば、酵素、放射性同位元素または蛍光染料である。好ま
しい酵素はベルオギシダーゼ、例えば、ワサビのベルオ
キシターゼ(horseradish peroxi
dase)であり、これは過酸化水素の存在ドにその発
色性基質の1種、例えば、オルトフェニレンジアミンに
より色度1111+1定的に+!lHらかにしかつ定1
i)することができる。また、検出Ilf能なマーカー
に結合した抗抗体抗血1+′jは商業的に人LIIr能
であり、あるいは昔−通の「順によって調製することが
できる。
免疫アッセイにおいて通常の「マーカー」の1つ1例え
ば、酵素、放射性同位元素または蛍光染料である。好ま
しい酵素はベルオギシダーゼ、例えば、ワサビのベルオ
キシターゼ(horseradish peroxi
dase)であり、これは過酸化水素の存在ドにその発
色性基質の1種、例えば、オルトフェニレンジアミンに
より色度1111+1定的に+!lHらかにしかつ定1
i)することができる。また、検出Ilf能なマーカー
に結合した抗抗体抗血1+′jは商業的に人LIIr能
であり、あるいは昔−通の「順によって調製することが
できる。
この分9?において知られているように、D−アラニル
−D−アラニンカルボキシ末端オリゴペプチドと適当な
神体とに結合1士それ自体既知の技術によって達成する
ことができる。便Jljには、結合剤を使用する。Il
fましい結合剤はグルタルアルデヒドである。他の既知
の結合剤は、次のものを包含する二カーポジイミド、ジ
イソシアネート、無水物、ジアツ:ウム化合物、アジI
S、および臭化ンアン。同様に、既知の結合手順および
試薬を使用して抗抗体抗血清を検出11[俺なマーカー
に結合することができる。これらのL順は、)二として
、逆折した検出可能なマーカーの特性に依存する。
−D−アラニンカルボキシ末端オリゴペプチドと適当な
神体とに結合1士それ自体既知の技術によって達成する
ことができる。便Jljには、結合剤を使用する。Il
fましい結合剤はグルタルアルデヒドである。他の既知
の結合剤は、次のものを包含する二カーポジイミド、ジ
イソシアネート、無水物、ジアツ:ウム化合物、アジI
S、および臭化ンアン。同様に、既知の結合手順および
試薬を使用して抗抗体抗血清を検出11[俺なマーカー
に結合することができる。これらのL順は、)二として
、逆折した検出可能なマーカーの特性に依存する。
検出用′敞なマーカーが酵素であるとき、I−に報告し
たような結合手順を使用できる。また、この場合におい
て、グルタルアルデヒドはIlfましい結合剤である。
たような結合手順を使用できる。また、この場合におい
て、グルタルアルデヒドはIlfましい結合剤である。
これらの結合反応において1反応成分の間の比−Vは非
常に有意に変化することができ、それでもなお多くの場
合において、反応成分間のl:1の比は好ましい。そノ
1−1ε−Aca−D−A I a−D−A I aテ
あるD−アラニル−D−アラニンカルポキシ末端オリゴ
ペプチドとウシ血清アルブミン(B S A)である高
分子化合物の4口体との間の結合反応の場合において、
これらの2試薬の間のモル比はl:l〜10:1の間で
変化できる。
常に有意に変化することができ、それでもなお多くの場
合において、反応成分間のl:1の比は好ましい。そノ
1−1ε−Aca−D−A I a−D−A I aテ
あるD−アラニル−D−アラニンカルポキシ末端オリゴ
ペプチドとウシ血清アルブミン(B S A)である高
分子化合物の4口体との間の結合反応の場合において、
これらの2試薬の間のモル比はl:l〜10:1の間で
変化できる。
さらに詳しく説引すると、本発明の好ましい実施F;様
は次の通りである: a) 既知jliの分析物を使用して適当な希釈wt
衝液中で標準曲線を作成し、 b) 、7.料をべI8備し、モして1−と同一の希
釈緩衝液中で前記試料を適当に希釈し、 C) 別々に、標準の希釈物と試料とを、ヒに定義した
被覆した分析用支持体へ添加し、d) 、−Qをした
湿気を含む箱の中で室温においてインキュベーションし
た後、被覆した分析用支持体を洗浄し、そして便利には
Lの希釈緩衝液中で希釈した「第1」抗体(抗分析物抗
体)の調製物を添加し、 e) 被覆した分析用支持体を再び洗浄し、そして乾炊
した後、「第2」抗体調製物(抗抗体調製物)添加し、
ここで種物異的抗体は検出可能なマーカーへ結合し、そ
して最後に、 f) 被覆した分析系に結合した「検出可能なマーカー
」を決定することによって、試料中の分析物のC度を標
準曲線の値を参照して1汁イ面する。
は次の通りである: a) 既知jliの分析物を使用して適当な希釈wt
衝液中で標準曲線を作成し、 b) 、7.料をべI8備し、モして1−と同一の希
釈緩衝液中で前記試料を適当に希釈し、 C) 別々に、標準の希釈物と試料とを、ヒに定義した
被覆した分析用支持体へ添加し、d) 、−Qをした
湿気を含む箱の中で室温においてインキュベーションし
た後、被覆した分析用支持体を洗浄し、そして便利には
Lの希釈緩衝液中で希釈した「第1」抗体(抗分析物抗
体)の調製物を添加し、 e) 被覆した分析用支持体を再び洗浄し、そして乾炊
した後、「第2」抗体調製物(抗抗体調製物)添加し、
ここで種物異的抗体は検出可能なマーカーへ結合し、そ
して最後に、 f) 被覆した分析系に結合した「検出可能なマーカー
」を決定することによって、試料中の分析物のC度を標
準曲線の値を参照して1汁イ面する。
1−の希釈緩衝液は、水性緩衝液であり、好ましぐはp
H7,0〜7.5のリン酸塩緩衝食塩水(:5alin
e)である、好ましくは、試料が血清、気管支の吐いた
物、うみまたはIu病であるとき、希釈緩衝液は10〜
30容星二%、最も好ましくは約20容コ龜%の血清ま
たは血清蛋白質調装を含イ1する。
H7,0〜7.5のリン酸塩緩衝食塩水(:5alin
e)である、好ましくは、試料が血清、気管支の吐いた
物、うみまたはIu病であるとき、希釈緩衝液は10〜
30容星二%、最も好ましくは約20容コ龜%の血清ま
たは血清蛋白質調装を含イ1する。
未発明の方法の1つの利点は、同・の部類の他の構成(
1の存在ドにバンコマイシンの部類の抗生物質を容易に
かつ迅速に決定することが今回rIr能となったという
ことである。′19実、/゛::ンコマイシン類のすべ
ての抗生物質は選択的に、′異なる程度であるが、D−
A l a−D−A I aカルボキシ末端ペプチドに
結合し、試験すべきWi生物質のみが特定の抗体と反応
するであろう。したがって、例えば、バンコマイシンの
部類の2種類の抗生物質(例えば、バンコマイシンおよ
びティコプラニン)を含有する生物学的流体を本発明の
ノj法により7ツセイするとき、両者の抗生物質は、適
当な高分子化合物の担体と接合したD−アラニル−D−
アラニンカルボキシ末端オリゴペプチドを表面1−に吸
着して有する分析用支持体へ選択的に結合するが、試料
中に存在しかつ通常妨害するすべての他の物質は洗?T
1シ去られるであろう。次いで、特定の抗体(例えば、
ティコプラニンに対して向けられた抗体)は吸着したD
−アラニル−D−アラニンペプチドに結合した関連する
抗生物質(、例えば、ティコプラニン)にのみ結合する
が、他の抗生物質(例えば、バンコマイシン)には同様
には結合しないであろう。
1の存在ドにバンコマイシンの部類の抗生物質を容易に
かつ迅速に決定することが今回rIr能となったという
ことである。′19実、/゛::ンコマイシン類のすべ
ての抗生物質は選択的に、′異なる程度であるが、D−
A l a−D−A I aカルボキシ末端ペプチドに
結合し、試験すべきWi生物質のみが特定の抗体と反応
するであろう。したがって、例えば、バンコマイシンの
部類の2種類の抗生物質(例えば、バンコマイシンおよ
びティコプラニン)を含有する生物学的流体を本発明の
ノj法により7ツセイするとき、両者の抗生物質は、適
当な高分子化合物の担体と接合したD−アラニル−D−
アラニンカルボキシ末端オリゴペプチドを表面1−に吸
着して有する分析用支持体へ選択的に結合するが、試料
中に存在しかつ通常妨害するすべての他の物質は洗?T
1シ去られるであろう。次いで、特定の抗体(例えば、
ティコプラニンに対して向けられた抗体)は吸着したD
−アラニル−D−アラニンペプチドに結合した関連する
抗生物質(、例えば、ティコプラニン)にのみ結合する
が、他の抗生物質(例えば、バンコマイシン)には同様
には結合しないであろう。
したがろて、検出11「俺なマーカーに結合した種物W
的抗抗体抗血清は、いったん添加されると、抗分析物(
この場合、抗ティコプラニン)抗体に特U的に結合し、
これは、次いで、「静市相」へ特異的抗原(この場合、
ティコプラニン)の結合を介して結合するであろう。し
たがって、結合した[マーカー」の検出による「結合し
た」種4¥IIIIj的抗抗体抗血清の引き続く評価は
、同一部類の他の抗生物質(この場合、バンコマイシン
)の存在五においてさえ、アッセイの選択した目的であ
る部類の特異的抗生物質(この場合、ティコプラニン)
にのみ相互に関係づけられる。
的抗抗体抗血清は、いったん添加されると、抗分析物(
この場合、抗ティコプラニン)抗体に特U的に結合し、
これは、次いで、「静市相」へ特異的抗原(この場合、
ティコプラニン)の結合を介して結合するであろう。し
たがって、結合した[マーカー」の検出による「結合し
た」種4¥IIIIj的抗抗体抗血清の引き続く評価は
、同一部類の他の抗生物質(この場合、バンコマイシン
)の存在五においてさえ、アッセイの選択した目的であ
る部類の特異的抗生物質(この場合、ティコプラニン)
にのみ相互に関係づけられる。
本発明の好ましい実施態様はヒに記載した方法であり、
ここで表面上ぼ吸着できる適当な高分子化合物の担体と
接合したD−アラニル−D−アラニンカルボキシ末端オ
リゴペプヂドを前記表面1−に支持する分析用支持体は
BSA−ε−Aca−D−A l a−D−A l a
で被覆したプラスチックのマイクロブl/−トのウェル
であり、検出すべき物質に対して向けられた抗体はバン
コマイシンの部類の抗生物質に対するウサギ抗血清であ
り、そして検出可イ駐なマーカーに結合した抗抗体抗血
清はベルオキシダーセと結合したウサギIgGである。
ここで表面上ぼ吸着できる適当な高分子化合物の担体と
接合したD−アラニル−D−アラニンカルボキシ末端オ
リゴペプヂドを前記表面1−に支持する分析用支持体は
BSA−ε−Aca−D−A l a−D−A l a
で被覆したプラスチックのマイクロブl/−トのウェル
であり、検出すべき物質に対して向けられた抗体はバン
コマイシンの部類の抗生物質に対するウサギ抗血清であ
り、そして検出可イ駐なマーカーに結合した抗抗体抗血
清はベルオキシダーセと結合したウサギIgGである。
バンコマイシンの部類の前もって決定した抗生物質(「
前もって決定した抗生物質」)に対するウサギ抗血1+
’iは、それ自体既知の方7.l:により、例えば、ウ
シ血清アルブミンのlΦ゛j11部につき約1〜約10
市早部のr +iiiもって決定した抗生物質」を使用
することにより、 r +iQちって決定した抗生物r
1」およびウシ血清アルブミンを結合することによって
調製された[而もって決定した抗生物質」−アルブミノ
接合体の有効抗r l1ijもって決定した抗生物質」
抗体+H411’1−を、ウサギに、反復(3か月間3
閘毎に)注入することによって得られる。
前もって決定した抗生物質」)に対するウサギ抗血1+
’iは、それ自体既知の方7.l:により、例えば、ウ
シ血清アルブミンのlΦ゛j11部につき約1〜約10
市早部のr +iiiもって決定した抗生物質」を使用
することにより、 r +iQちって決定した抗生物r
1」およびウシ血清アルブミンを結合することによって
調製された[而もって決定した抗生物質」−アルブミノ
接合体の有効抗r l1ijもって決定した抗生物質」
抗体+H411’1−を、ウサギに、反復(3か月間3
閘毎に)注入することによって得られる。
動物から4ij ’d4採血し、そして抗r +iDも
って決定した抗生物質」抗体の力価を、分析法、例えば
、エリザ(ELISA)法に従い、同一の[曲もって決
定した抗生物質」で被覆した分析用支持体および適当な
検出11r1七なプローブ、例えば、ベルオギシターゼ
と結合したウサギTgG類に対するヤギ抗血清を使用し
て決定する。分析的に有効な抗体の生トfが達成された
とき、動物から採血し、そして抗血清を回収し、次いで
、必要に応じて、トとし、て抗ウシ血清アルブミンの免
疫グロブリンを除去するためにさらに精製する。前記精
製は、変性したマトリ二・クス、例えば、それ自体既知
の方法により活性化されたアガロースゲル[例えば、セ
フyロース(Sepharose@3 ]とウシ血清ア
ルブミンを結合することによって調製したマトリ−、ク
スを使用する吸収クロマトグラフィーを含むことができ
る。Lで使用した用語「分析用支持体」はヒと同一の意
味を有する。とくに、[1i1ちって決定した抗生物質
」の分析的に検出+−+(俺な峨をその表面トに吸着で
きるPvCマイクロブし一ト、試験管またはプラスチ・
シクシ−1・は分析法における使用にとくに適当な手段
である。
って決定した抗生物質」抗体の力価を、分析法、例えば
、エリザ(ELISA)法に従い、同一の[曲もって決
定した抗生物質」で被覆した分析用支持体および適当な
検出11r1七なプローブ、例えば、ベルオギシターゼ
と結合したウサギTgG類に対するヤギ抗血清を使用し
て決定する。分析的に有効な抗体の生トfが達成された
とき、動物から採血し、そして抗血清を回収し、次いで
、必要に応じて、トとし、て抗ウシ血清アルブミンの免
疫グロブリンを除去するためにさらに精製する。前記精
製は、変性したマトリ二・クス、例えば、それ自体既知
の方法により活性化されたアガロースゲル[例えば、セ
フyロース(Sepharose@3 ]とウシ血清ア
ルブミンを結合することによって調製したマトリ−、ク
スを使用する吸収クロマトグラフィーを含むことができ
る。Lで使用した用語「分析用支持体」はヒと同一の意
味を有する。とくに、[1i1ちって決定した抗生物質
」の分析的に検出+−+(俺な峨をその表面トに吸着で
きるPvCマイクロブし一ト、試験管またはプラスチ・
シクシ−1・は分析法における使用にとくに適当な手段
である。
溶液、例えば、発酵培養基または抽出液の中の分析物の
特異的な、迅速な、容易な検出およびアッセイにおいて
有用であるほかに、本発明の方法は、生物学rド流体、
例えば、血液およびその分画、尿、体の滲出物、うみ、
気管支の吐いた物および皮膚の検出およびアー、セイに
応用できる。
特異的な、迅速な、容易な検出およびアッセイにおいて
有用であるほかに、本発明の方法は、生物学rド流体、
例えば、血液およびその分画、尿、体の滲出物、うみ、
気管支の吐いた物および皮膚の検出およびアー、セイに
応用できる。
未発明の方法を生物学的流体に適用するために、一般に
、試料の特定の予備処理は不必要であるが、通常、選択
した条件ドでこの方法の測定の用途に入れるためにR+
i液によりん釈(および、まれに、試料のe縮)は七分
であろう。
、試料の特定の予備処理は不必要であるが、通常、選択
した条件ドでこの方法の測定の用途に入れるためにR+
i液によりん釈(および、まれに、試料のe縮)は七分
であろう。
好ましくは、アシセイすべき同一に生物学的流体中に溶
解した分析物の標準の調製物を使用して検1.j線を作
成する。
解した分析物の標準の調製物を使用して検1.j線を作
成する。
Sj;管支の吐いた物、滲出物、うみおよび皮1−1の
場合において、分析的に試ネ1を通常の「1段により均
質化することが・般°に必要である。試料を、 一般に
、通常均質化の+iJに、緩衝液で希釈する。
場合において、分析的に試ネ1を通常の「1段により均
質化することが・般°に必要である。試料を、 一般に
、通常均質化の+iJに、緩衝液で希釈する。
tirましくは、緩4+1液jよ、pH7〜7.5の水
性緩衝液であり、血清または血清蛋白質と一緒に添加し
、希釈緩衝液は合計容H,H−の約10〜30%、好ま
しくは約20%である。
性緩衝液であり、血清または血清蛋白質と一緒に添加し
、希釈緩衝液は合計容H,H−の約10〜30%、好ま
しくは約20%である。
本発明の々fましい実施態様は、バンコマイシン、アポ
バルシン、リストセチン、抗生物’5jA35512B
、アクタブラニン、抗生物質A41030、FiC生物
’6 /、 47934およびノヘンコマイシンC′)
部類の他の抗生物質と交差反応しない抗ティコプラニン
抗血枯の使用によτて代表される。
バルシン、リストセチン、抗生物’5jA35512B
、アクタブラニン、抗生物質A41030、FiC生物
’6 /、 47934およびノヘンコマイシンC′)
部類の他の抗生物質と交差反応しない抗ティコプラニン
抗血枯の使用によτて代表される。
本発明の好ましいへ用範囲は110−1O00n /
m Iの分析物であり、最もOfましい範囲はlO〜l
oOng/miの分析物である。アッセイ間の粘度ζC
〜′)は−・般に10”25%である。
m Iの分析物であり、最もOfましい範囲はlO〜l
oOng/miの分析物である。アッセイ間の粘度ζC
〜′)は−・般に10”25%である。
この方法のIF確さおよび精度は、既知の統計学的分布
法の寄与−により誤差を最小とすることを目的とする適
pJな実験の設計によりさらに改良することができる。
法の寄与−により誤差を最小とすることを目的とする適
pJな実験の設計によりさらに改良することができる。
未発1!11の「分析用支持体」は、「動ならびにnt
lj化されたアi・セイのL順における使用に適する。
lj化されたアi・セイのL順における使用に適する。
この柔軟性は最絆の使Il1者の要求を満足するために
適する。・疼実、1〕動化された手順は、多くの処置し
た患者の臨床的監視において、例えば、治療の投グー州
の調節および生物学的流体中・〜の薬物の分41の研究
のために極めて有用であることがあり、 一方り動手順
は実験室規模の分析に十分であろう。
適する。・疼実、1〕動化された手順は、多くの処置し
た患者の臨床的監視において、例えば、治療の投グー州
の調節および生物学的流体中・〜の薬物の分41の研究
のために極めて有用であることがあり、 一方り動手順
は実験室規模の分析に十分であろう。
組成物の面で、本発明は、また、構成成分:a) 表面
を有する分析用支持体、前記支持体はその表面にに吸着
できる適当な高分子化合物の担体と接合したD−アラニ
ル−D−アラニ〉・カルボキシ末端オリゴペプチドを支
持する、 b) 検出すべき物質である分析物に対して特異的に向
けられた抗体を含有する抗体:A型物、および必要に応
じて、 C) 分析物に対して向けられかつ検出0■能なマーカ
ーと結合した「第1」抗体の源の動物種の免疫グロブリ
ンに対して特異的に向けられた抗生を含有する種物異的
抗抗体調袈物、 からなる試薬のキットを包含し、このキットは、D−ア
ラニル−D−アラニンジペプチドまたはD−アラニル−
D−7ラニンカルボキシ末端オリゴペプチドによって代
表される「分子の受容体」、ことにパンコマ1゛シンの
部類の抗生物質、その個々のlu f、誘導体またはア
グリコソヘ結合する特徴を有する分析物の容易な、迅速
な、信頼性あるかつi′I確な決定のための本発明の方
法を実施するために使用する。
を有する分析用支持体、前記支持体はその表面にに吸着
できる適当な高分子化合物の担体と接合したD−アラニ
ル−D−アラニ〉・カルボキシ末端オリゴペプチドを支
持する、 b) 検出すべき物質である分析物に対して特異的に向
けられた抗体を含有する抗体:A型物、および必要に応
じて、 C) 分析物に対して向けられかつ検出0■能なマーカ
ーと結合した「第1」抗体の源の動物種の免疫グロブリ
ンに対して特異的に向けられた抗生を含有する種物異的
抗抗体調袈物、 からなる試薬のキットを包含し、このキットは、D−ア
ラニル−D−アラニンジペプチドまたはD−アラニル−
D−7ラニンカルボキシ末端オリゴペプチドによって代
表される「分子の受容体」、ことにパンコマ1゛シンの
部類の抗生物質、その個々のlu f、誘導体またはア
グリコソヘ結合する特徴を有する分析物の容易な、迅速
な、信頼性あるかつi′I確な決定のための本発明の方
法を実施するために使用する。
すでに述へたように、好ましい「表面を有する分析用支
持体、iif記支持体はその表面1−に吸着できる適当
な品分Y−化合物の担体と接合し、たD−アラニル−D
−アラニンカルポギシ末端オリゴペプチ:・を支持する
」 (被覆された分析用支持体)は、0.025マイク
ログラ1、〜lマイクログラム、好ましくはO1■マイ
クロクラム〜0.2マイクログラムのBSA −ε−A
Ca−D−A l a−D−Alaで#覆された微1
Ii−滴定用のプレートのプラスチックウェル、試験管
またはプラスチックシートによって代表される。
持体、iif記支持体はその表面1−に吸着できる適当
な品分Y−化合物の担体と接合し、たD−アラニル−D
−アラニンカルポギシ末端オリゴペプチ:・を支持する
」 (被覆された分析用支持体)は、0.025マイク
ログラ1、〜lマイクログラム、好ましくはO1■マイ
クロクラム〜0.2マイクログラムのBSA −ε−A
Ca−D−A l a−D−Alaで#覆された微1
Ii−滴定用のプレートのプラスチックウェル、試験管
またはプラスチックシートによって代表される。
第1抗体調製中の分析物に対して特急的な抗体のj!−
は、検出すべき分M;物のX+1°を越えてはならなン
)。ぞれはモノクローナル抗体によって、あるいは採血
時にio−4より高い抗体力化を有する免疫化したウサ
ギによって好ましくは得られたポリクローナル抗体によ
って代表される。
は、検出すべき分M;物のX+1°を越えてはならなン
)。ぞれはモノクローナル抗体によって、あるいは採血
時にio−4より高い抗体力化を有する免疫化したウサ
ギによって好ましくは得られたポリクローナル抗体によ
って代表される。
明らかなように、「第2」抗体調製物、すなわち、種物
異的抗体調製物、の濃度は、支持する固体表面l―の分
析物に結合するようになる「第1」抗体の喉に15Fl
係し、そして等モル比率であるかあるいは便利な過剰j
IFであるべきである。
異的抗体調製物、の濃度は、支持する固体表面l―の分
析物に結合するようになる「第1」抗体の喉に15Fl
係し、そして等モル比率であるかあるいは便利な過剰j
IFであるべきである。
57者にとって明らかなように、他の構成成分、例えば
、緩衝液、明らかにする1段(revealing
means)などを必要に応じて「キラI・」中に存在
させることができるばがりでなぐ、かづまた別に形態で
あるが同一用途のために存在させることができる。また
、本発明の方法において使用するための成分のこれらの
別々の形態は本発明の組成物および方法に包含される。
、緩衝液、明らかにする1段(revealing
means)などを必要に応じて「キラI・」中に存在
させることができるばがりでなぐ、かづまた別に形態で
あるが同一用途のために存在させることができる。また
、本発明の方法において使用するための成分のこれらの
別々の形態は本発明の組成物および方法に包含される。
本発明は、ウシ血情アルブミンの1重ψ部につき約1〜
約10 屯+1j一部のティコプラニンの結合により調
製されたテイコプラニン−アルブミン接合体の有効抗テ
ィコプラニン抗体湧導H,Xをウサギに反復往射(71
分析的に有効な抗体の生産を達成するためば十分な時間
の後、前記動物から採血し、得られた抗血清を回収し、
ぞして必要に応じて、約1重XIF部のウシ血清アルブ
ミンを約100容:y部の活性化+影iy;アガロース
と結合することによって得られたマトリックスの約17
i) (容: l、j、 )との接触により前記抗血清
を抗つシ血清アルブミン免疫グロブリ〉′から精製する
ことによって得られたことを特命・とする抗テイコプラ
ニ/ウサギ抗血情、をさらに提供する。
約10 屯+1j一部のティコプラニンの結合により調
製されたテイコプラニン−アルブミン接合体の有効抗テ
ィコプラニン抗体湧導H,Xをウサギに反復往射(71
分析的に有効な抗体の生産を達成するためば十分な時間
の後、前記動物から採血し、得られた抗血清を回収し、
ぞして必要に応じて、約1重XIF部のウシ血清アルブ
ミンを約100容:y部の活性化+影iy;アガロース
と結合することによって得られたマトリックスの約17
i) (容: l、j、 )との接触により前記抗血清
を抗つシ血清アルブミン免疫グロブリ〉′から精製する
ことによって得られたことを特命・とする抗テイコプラ
ニ/ウサギ抗血情、をさらに提供する。
本発明は、さらに、表面−Hに適当な−tizのティコ
プラニンを吸着する、PVCマイクロプレート、試験管
またはプラスチックシートかう成ることを特徴とするテ
ィコプラニンおよび抗テイコブラニ、/抗体の分析的決
定に使用するための被覆分析用支持体、を提供する。
プラニンを吸着する、PVCマイクロプレート、試験管
またはプラスチックシートかう成ることを特徴とするテ
ィコプラニンおよび抗テイコブラニ、/抗体の分析的決
定に使用するための被覆分析用支持体、を提供する。
次の実施例により本発明を説明するが、これらの実施例
は本発明の範囲を限定するもと解釈すべきではない。
は本発明の範囲を限定するもと解釈すべきではない。
実施例1
BSA −q−A c a−D−A I a−D−A
l a0週舅 a) ε−7ミノカプロイル−D−アラニル−D−ア
ラニン(e−A c a−D−A i a−D−A 1
a)のウシ血清アルブミン(BSA)への接合 ε−A Ca−D−A I a、−D−A l aをB
SAヘグルタルアルデヒドを使用する12王程法」によ
り接合し、この2官能性架橋試薬: BSA (250
mg)を0.1モル+7) N a −i5酸N a
/ iK’+R酸塩、pH9、5(4,5m1)中に溶
解する。グルタルアルデヒド(0,5mlの25%の抗
血清)を添加し、そして室温で1時間反応させる。次い
で、この反応の塊を0.9%のいNaC1に対して1夜
透析する。ε−Aca−D−A I a−D−A I
a (125mg)を0.5mlの0.5モルのNa−
13酸塩緩衝液、pH9,5中に溶解し、透析した反応
の塊に添加し、そして室温で6時間j■拌する。次いで
、1モルのリジン(0、5m i)を添加し そしてこ
の混合物を室温に2時間保持して未反応の活性基を遮断
する。次いで、この接合体を0915モルのNaC1を
含イJする0、05モルのに一リン酸塩に対して透析す
る。
l a0週舅 a) ε−7ミノカプロイル−D−アラニル−D−ア
ラニン(e−A c a−D−A i a−D−A 1
a)のウシ血清アルブミン(BSA)への接合 ε−A Ca−D−A I a、−D−A l aをB
SAヘグルタルアルデヒドを使用する12王程法」によ
り接合し、この2官能性架橋試薬: BSA (250
mg)を0.1モル+7) N a −i5酸N a
/ iK’+R酸塩、pH9、5(4,5m1)中に溶
解する。グルタルアルデヒド(0,5mlの25%の抗
血清)を添加し、そして室温で1時間反応させる。次い
で、この反応の塊を0.9%のいNaC1に対して1夜
透析する。ε−Aca−D−A I a−D−A I
a (125mg)を0.5mlの0.5モルのNa−
13酸塩緩衝液、pH9,5中に溶解し、透析した反応
の塊に添加し、そして室温で6時間j■拌する。次いで
、1モルのリジン(0、5m i)を添加し そしてこ
の混合物を室温に2時間保持して未反応の活性基を遮断
する。次いで、この接合体を0915モルのNaC1を
含イJする0、05モルのに一リン酸塩に対して透析す
る。
b) 接合体のゲル@過
i剰の未反応材制または紙分(H,X副生物か、′:)
接合体を精製するために、トで得られた透析した混合物
を、令却したセファクリル(:5ephacryl)S
−100カラと(調節された穴の共有架橋したアルキル
デキストランおよびN、N’−7チレンヒスーアクリル
7三ド)rファーマシアーファイン・ケミカルズ(P
h a r r−1a c i aFine Chm
eicals)] (0゜8cmX100cm)に通
過させ、接触させ、そしてPBS pH1O,4(流
速=10ml/時間)で溶離した。溶離を280nmに
おける透過の記録によって分光光度測定的に監視する。
接合体を精製するために、トで得られた透析した混合物
を、令却したセファクリル(:5ephacryl)S
−100カラと(調節された穴の共有架橋したアルキル
デキストランおよびN、N’−7チレンヒスーアクリル
7三ド)rファーマシアーファイン・ケミカルズ(P
h a r r−1a c i aFine Chm
eicals)] (0゜8cmX100cm)に通
過させ、接触させ、そしてPBS pH1O,4(流
速=10ml/時間)で溶離した。溶離を280nmに
おける透過の記録によって分光光度測定的に監視する。
カラムの空隙体積で溶離されたピークに相当する分画を
プールしく合計の体積= 15m l>、1モルのHC
lで中和し、そしてPBS pH7,3で4倍に希釈
する。この混合物の0.5mlの7リコートをバイアル
の中に分配し、IJt結乾燥し、そして−80℃に保持
する。
プールしく合計の体積= 15m l>、1モルのHC
lで中和し、そしてPBS pH7,3で4倍に希釈
する。この混合物の0.5mlの7リコートをバイアル
の中に分配し、IJt結乾燥し、そして−80℃に保持
する。
−1重施例2
凍結乾燥したBSA −e−A c a−D−A I
a−D−Alaのバイアルの内容物(I−の実施例に記
載したようにA!Aした)をPBS PH1,3(0
、5m l)中に溶解することによって、マイクロプレ
ートの毎酉調製用に原溶液を調製する:この溶液は数−
1111活性の損失なしに貯蔵することができ、それゆ
えイlt四の調製のための原溶液として使iTlするた
めに漱する。
a−D−Alaのバイアルの内容物(I−の実施例に記
載したようにA!Aした)をPBS PH1,3(0
、5m l)中に溶解することによって、マイクロプレ
ートの毎酉調製用に原溶液を調製する:この溶液は数−
1111活性の損失なしに貯蔵することができ、それゆ
えイlt四の調製のための原溶液として使iTlするた
めに漱する。
マイクロプレートのウェル[ファルコン・マイクロテニ
:l・(Faicon Micrctest Q!I
+) lItフレキシブルΦアー、セイ・プレート(F
lexible As5ay Plate);ベク
I・ン・ディ千ンソン・アンド・カンパニー(Beck
tcn Dickin:;an and C0−
)、カリフ中ルニア州、;「キシナート(Oxnard
)93030]に、この原溶液ノ1/20OA、釈物の
100−fイクロリットル/ウェルを充填し、ただしブ
ランクとして保持したウェルの4i 11’7の列を除
外する。これらのウェルに、 100マ、fクロ9.ト
ルのPBS pH7,3を充填する。マイクロブし・
−トを室温t%蓋をした箱の中で3時間インキュベーシ
ョンし、次いで空にしかつノに留水を充填することによ
って5回洗浄する。PBS pH7,3中の3%のB
S A−の20QマイクロリンI・ル/つ□ルを添加
し、そして室温において2時間吸ノiさせて未被覆のプ
ラスチック表面を4断する。プレートを+Ir tJ蒸
留水で洗浄し、振盪乾奴・シ、そして使川するまで4℃
で!貯蔵する。
:l・(Faicon Micrctest Q!I
+) lItフレキシブルΦアー、セイ・プレート(F
lexible As5ay Plate);ベク
I・ン・ディ千ンソン・アンド・カンパニー(Beck
tcn Dickin:;an and C0−
)、カリフ中ルニア州、;「キシナート(Oxnard
)93030]に、この原溶液ノ1/20OA、釈物の
100−fイクロリットル/ウェルを充填し、ただしブ
ランクとして保持したウェルの4i 11’7の列を除
外する。これらのウェルに、 100マ、fクロ9.ト
ルのPBS pH7,3を充填する。マイクロブし・
−トを室温t%蓋をした箱の中で3時間インキュベーシ
ョンし、次いで空にしかつノに留水を充填することによ
って5回洗浄する。PBS pH7,3中の3%のB
S A−の20QマイクロリンI・ル/つ□ルを添加
し、そして室温において2時間吸ノiさせて未被覆のプ
ラスチック表面を4断する。プレートを+Ir tJ蒸
留水で洗浄し、振盪乾奴・シ、そして使川するまで4℃
で!貯蔵する。
X庵例A
抗ティコプラニン抗血清の調製
テイコプラニン−アルブミン接合体(T−BSA)を使
用して、ウサギを免疫して抗テイコブラニ〉抗什の生産
を誘導する。
用して、ウサギを免疫して抗テイコブラニ〉抗什の生産
を誘導する。
T−BSAは、ゲットフィールド(G o o d f
i e I d)らに従い、pH5,5の5mlの水中
で結合試薬とし、てl−エチル−3−(3−メチルアミ
ノプロピル)−カーポジイミド■!!酸塩(300r!
1g)を使川して、200mgのティコプラニンを50
mgのBSAへ結合することによって調製する[ゲット
フィールド(Goodfielcl)T、L、、C、シ
ービン(Levin)およびG、D、77スマン(Fa
sman)、1964、サイエンス(Sc i enc
e)144.134.4]。このT−BSAを!夜透析
し、凍結乾燥し、次し゛で1 m g / m l (
r、濃度で50容ji%−%(7)70インドアシユパ
ンI・を含有する生理学的溶液中に懸濁させる。5匹の
雌のu庚なニューシーラントの白ウサギの各々に、1.
2mlのしの浮:液を皮F−注射する。0.5mlの同
一抗原溶液を使用して、3濾毎に3か月間併進注射を行
なう。この1り1間の間、動物から%濾採血し、そして
明らかにするプローブ(revaaling p
r o ve)としてウサギIgG類に対するワサビの
ベルオキンターゼ標識ヤキ抗血清を使用して、テメコブ
ラニン被覆マイクロブレーI・を用いるエリザ(ELr
SA)法により、抗テイコブラ二ンカ価を決定する。
i e I d)らに従い、pH5,5の5mlの水中
で結合試薬とし、てl−エチル−3−(3−メチルアミ
ノプロピル)−カーポジイミド■!!酸塩(300r!
1g)を使川して、200mgのティコプラニンを50
mgのBSAへ結合することによって調製する[ゲット
フィールド(Goodfielcl)T、L、、C、シ
ービン(Levin)およびG、D、77スマン(Fa
sman)、1964、サイエンス(Sc i enc
e)144.134.4]。このT−BSAを!夜透析
し、凍結乾燥し、次し゛で1 m g / m l (
r、濃度で50容ji%−%(7)70インドアシユパ
ンI・を含有する生理学的溶液中に懸濁させる。5匹の
雌のu庚なニューシーラントの白ウサギの各々に、1.
2mlのしの浮:液を皮F−注射する。0.5mlの同
一抗原溶液を使用して、3濾毎に3か月間併進注射を行
なう。この1り1間の間、動物から%濾採血し、そして
明らかにするプローブ(revaaling p
r o ve)としてウサギIgG類に対するワサビの
ベルオキンターゼ標識ヤキ抗血清を使用して、テメコブ
ラニン被覆マイクロブレーI・を用いるエリザ(ELr
SA)法により、抗テイコブラ二ンカ価を決定する。
1i1述のエリザ(ELISA)法は次のように実施す
る。
る。
PVCマイ〃ロブレート [ファルコン1マイクロテス
ト(Falcon Micratest@)[1フレ
キシブル拳アツセイ・プレー1・(F!exible
As5ay Plate):ベクトレ・ディキンソ
ンΦアンド・カンパニー(Beckton Dick
inson ar、d C09)、カリフ≠ルニア
州、オキシナート(Oxnard)93030jに、0
.4g/lのティコプラニンおよび58g/lのNaC
1を含有する溶液の0.1ml/ウェルを充填する。マ
イクロプレートを37°Cで4をした箱の中で3時間イ
ンキ、ペーションし、次いで空にしかつリンI’lXN
i食塩水pH7,3(0,15モルtT) N a C
1,0,05モルのリン酸ナトリウム)を充填すること
によ−)て3回洗浄する。
ト(Falcon Micratest@)[1フレ
キシブル拳アツセイ・プレー1・(F!exible
As5ay Plate):ベクトレ・ディキンソ
ンΦアンド・カンパニー(Beckton Dick
inson ar、d C09)、カリフ≠ルニア
州、オキシナート(Oxnard)93030jに、0
.4g/lのティコプラニンおよび58g/lのNaC
1を含有する溶液の0.1ml/ウェルを充填する。マ
イクロプレートを37°Cで4をした箱の中で3時間イ
ンキ、ペーションし、次いで空にしかつリンI’lXN
i食塩水pH7,3(0,15モルtT) N a C
1,0,05モルのリン酸ナトリウム)を充填すること
によ−)て3回洗浄する。
リン酸I′i!緩衝食塩水pH7,3(0,15モルの
rJacl、o、c’5モルのリン酸ナトリウム)中の
BSAの溶液(30g/I)をウェルに加え(0,2m
l/ウェル)、そして室温で2時間吸71させて未反応
のプラス千ンク表面を遮断する。
rJacl、o、c’5モルのリン酸ナトリウム)中の
BSAの溶液(30g/I)をウェルに加え(0,2m
l/ウェル)、そして室温で2時間吸71させて未反応
のプラス千ンク表面を遮断する。
プレートを+Irびリン耐塩緩衝食塩水pH7、3CQ
、 l りモルc7)N aCl 、 0 、05
モル(7)リン酸ナトリウム)で3回洗浄し、次し゛で
ウサキ抗血清試験溶液(0,1ml/ウェル)を異なる
10のスカラー希釈物(scala、r dilut
ion) (1: J−1: 106)に添加し、そ
して37°Cで2時間増団したウェル1′対して反応さ
せる。+) ンNItt[[if[5に、pH7、3(
0、15モルのNaC1,0,05モルのリン酸す1・
11、ラム)でよ〈洗浄した後、ワサビのペルオキシダ
ーゼで標識したウサギIgG類に対するヤギ抗血?+’
jをウェルに添加しr□、1ml/ウェル)、そして3
7℃で1時間反応させる。0.01%(V/v)のツイ
ーン(Tween@)20を含有する0、01%(V
/ V ) (7) ’;イーン(Tvteen@)2
0でよく坊、fI11シた後、マイクロプレートを振盪
乾燥し、そして0.2nulのペルオキシダーゼ基質の
発色性溶液(0,1モルのクエン酸1′11緩衝液pH
5中のl m g / m l l71o −7、−=
、 L/ 7ジアミン、5ミリモルの過酸化水素)を各
1゛イクロタイターウエルに添加する。
、 l りモルc7)N aCl 、 0 、05
モル(7)リン酸ナトリウム)で3回洗浄し、次し゛で
ウサキ抗血清試験溶液(0,1ml/ウェル)を異なる
10のスカラー希釈物(scala、r dilut
ion) (1: J−1: 106)に添加し、そ
して37°Cで2時間増団したウェル1′対して反応さ
せる。+) ンNItt[[if[5に、pH7、3(
0、15モルのNaC1,0,05モルのリン酸す1・
11、ラム)でよ〈洗浄した後、ワサビのペルオキシダ
ーゼで標識したウサギIgG類に対するヤギ抗血?+’
jをウェルに添加しr□、1ml/ウェル)、そして3
7℃で1時間反応させる。0.01%(V/v)のツイ
ーン(Tween@)20を含有する0、01%(V
/ V ) (7) ’;イーン(Tvteen@)2
0でよく坊、fI11シた後、マイクロプレートを振盪
乾燥し、そして0.2nulのペルオキシダーゼ基質の
発色性溶液(0,1モルのクエン酸1′11緩衝液pH
5中のl m g / m l l71o −7、−=
、 L/ 7ジアミン、5ミリモルの過酸化水素)を各
1゛イクロタイターウエルに添加する。
色を室温で30分間発生させ、そして0.05m1/ウ
エルの4.5モルの硫酸を添加すること【こよって件I
I−させる。
エルの4.5モルの硫酸を添加すること【こよって件I
I−させる。
15分ψ、492nmにおける吸収を測定する。0.2
光学IC度中位をγえる希釈計数として、抗体の力価を
表わす。
光学IC度中位をγえる希釈計数として、抗体の力価を
表わす。
抗体の力価が少なくとも1:10’であるとき、分析的
に右動な抗体の生産が達成され、そして動物を完全に放
血し、そして所q!の抗血清を回11yL、そして使用
するまで一20°Cに保持する。
に右動な抗体の生産が達成され、そして動物を完全に放
血し、そして所q!の抗血清を回11yL、そして使用
するまで一20°Cに保持する。
実施例4
結合緩衝液として0.1モルの炭酸ナトリウム緩衝液(
pH8,3)を使用して、ウシ血清アルブミン(BSA
)、80mg、をCNBr活性化セフ70−ズ(Sep
harose@)[77−マシア・ファイン・ケミカル
ズ(Pharmacia Fine Chmeic
als):10m1の膨fitJシた樹庄]と結合する
ことによって、変性マトリックスを調製する。次いで、
このRSA−7カロースマトリツクスを使用して、前の
実施例3に従い得られた抗血清から抗BSA免疫グロブ
リンを除去する。これは+i?j記ウサギを2mlの沈
殿シたBSA−7ガロースマトす・、クスと接触させる
パン千1吸着クロマトグラフィーによって実施する。こ
の混合物を1時間室温で接触ゴせ、次いでガラスフィル
ター口に注ぎ、3%(W/V)のBSAおよび0.05
%(v/v)ノツィーン(Tween@)20を含有す
るリン酸+1! Hli食塩水pH7,3(0,15モ
ルのNac I、0゜05モルのリン酸ナトリウム、)
の6mlで3回洗n−する。回収される6F!液は、抗
PSA抗体が除去されてたもとの抗血清の1.0倍の希
釈物に相当する。
pH8,3)を使用して、ウシ血清アルブミン(BSA
)、80mg、をCNBr活性化セフ70−ズ(Sep
harose@)[77−マシア・ファイン・ケミカル
ズ(Pharmacia Fine Chmeic
als):10m1の膨fitJシた樹庄]と結合する
ことによって、変性マトリックスを調製する。次いで、
このRSA−7カロースマトリツクスを使用して、前の
実施例3に従い得られた抗血清から抗BSA免疫グロブ
リンを除去する。これは+i?j記ウサギを2mlの沈
殿シたBSA−7ガロースマトす・、クスと接触させる
パン千1吸着クロマトグラフィーによって実施する。こ
の混合物を1時間室温で接触ゴせ、次いでガラスフィル
ター口に注ぎ、3%(W/V)のBSAおよび0.05
%(v/v)ノツィーン(Tween@)20を含有す
るリン酸+1! Hli食塩水pH7,3(0,15モ
ルのNac I、0゜05モルのリン酸ナトリウム、)
の6mlで3回洗n−する。回収される6F!液は、抗
PSA抗体が除去されてたもとの抗血清の1.0倍の希
釈物に相当する。
χ凰例1
ティコプラニンう、右のアラでイ
3%(w/v) のBsAおよび0.05%(v/V)
のツイーン(Tween’u)20を含有するリン酸塩
緩衝食塩水pH7,3(0,15モルのNaC1,0,
05モルのリン酸ナトリウム)中の0.001−1マイ
クログラム/mlの濃度のティコプラニンのスカラー希
釈物を使用して、標へ11曲線を作成する。これらの溶
液ならびに血清緩衝液中で10倍に孔釈した試料を、1
〕の実施例2 (7) L順に従い調製したBSA −
q−Ac a−D−A I a−D−A l a被覆フ
レキシブルプレートのウェルに、3回の反復実験におい
て、別々に添加する。より高いC1■の溶液を、また、
「ブランク」のワエル(すなわち、特界的D−Ala−
D−Ala結合剤で被覆されていないもの)に添加して
特I苗的結合を評価する。次いで、各プレートをZiを
した湿った箱内で室温において2時間インキュベーショ
ンし、そして空にしかつリン酸a!緩衝食塩水pH7、
3[0、15モルノN aCl、0.05モルのリン酸
ナトリウム、0.05%(v / v )のツイーン(
Tween@’)20を含イ!1“る]を范ルすること
によって8回洗浄し、そして振盪乾燥する。
のツイーン(Tween’u)20を含有するリン酸塩
緩衝食塩水pH7,3(0,15モルのNaC1,0,
05モルのリン酸ナトリウム)中の0.001−1マイ
クログラム/mlの濃度のティコプラニンのスカラー希
釈物を使用して、標へ11曲線を作成する。これらの溶
液ならびに血清緩衝液中で10倍に孔釈した試料を、1
〕の実施例2 (7) L順に従い調製したBSA −
q−Ac a−D−A I a−D−A l a被覆フ
レキシブルプレートのウェルに、3回の反復実験におい
て、別々に添加する。より高いC1■の溶液を、また、
「ブランク」のワエル(すなわち、特界的D−Ala−
D−Ala結合剤で被覆されていないもの)に添加して
特I苗的結合を評価する。次いで、各プレートをZiを
した湿った箱内で室温において2時間インキュベーショ
ンし、そして空にしかつリン酸a!緩衝食塩水pH7、
3[0、15モルノN aCl、0.05モルのリン酸
ナトリウム、0.05%(v / v )のツイーン(
Tween@’)20を含イ!1“る]を范ルすること
によって8回洗浄し、そして振盪乾燥する。
次いで、1−の実施例3および4に従って調製したティ
コ1プラニンに対する精製したウサギ抗血清を、リン酩
11!緩衝食塩水[0,05モルのリン酸ナトリウム、
0 、15−t−ルc7)NaCI、0.05モル
のリン酸ナトリウム、pH7,3,3%(sq/’v)
のBSAおよび0.05%(v/v)のンイー7 (T
wee n@’)20を含有する1で50倍に6釈する
:この溶液の100マイクロリツトルを各ウェルに添加
し、そして室温において1時間反応させる。前述のよう
にリン酸塩緩衝食塩水pH7,3[0,15モルc7)
NaClO,05モルのリン酸ナトリウム、0.05%
(v /’ v )のツイーン(Twee n@)20
を含有する]で8回洗節し、振盪乾燥した後、ウサギE
gG類ヤこ対するワサとのペルオキシダーゼ接合ヤギ
抗+fil i+’;Q/<イオネチクス・インコーポ
!/−テッド(Bionetics Inc、)]
のリン酸用緩衝食塩水中の1〜500倍希釈物の10
0マイルロリツトルを各ウェルに添加し、そして室温で
1時間装置する。次いで、各ウェルを再び前述のように
リン酸114緩衝食塩水pH7,3[0,15モルfN
ac1.0.05モルのリン酸すI・リウム、0.05
%(V/V)(7)ツイーン(Tweei’)20を含
イfする]で洗油しかつ振盪乾燥し、そしてベルオキシ
ターゼの発色性基質(0゜1モルのクエン酸ナトリウム
緩衝液、pH5中の1mg/m Iの0−フェニレンジ
アミン、5ミリモルの過酸化水素)の200マイクロリ
ツトル/ウエルの溶液を各ウェルに添加し、そして色を
室温で30分間発生させる。次いで発色反応を50マイ
クロリツトル/ウエルの4.5モルの硫酸の流力11に
より!’7’+l−させ、そ(7)15分後、492n
mにおける吸収をタイターチク−マルチスキャン(Ti
tertek Multiscan)光度計[フロー
ラボラトリーズ・インコーボレー・テッド(Flow
Lab、 Inc、)] で測定する。吸収値を半
対数紙上にティコプラニンの濃1■の関数としてプロ、
、、 トすることによって、結合曲線を4j+rる。0
.01マイルログラム/m l−1マイクロそル/ml
の範囲のティコプラニンを使用して投jt−一応答曲線
を作成し、そして試料中の濃度を標準曲線I−で内槽す
ることによって決定する。
コ1プラニンに対する精製したウサギ抗血清を、リン酩
11!緩衝食塩水[0,05モルのリン酸ナトリウム、
0 、15−t−ルc7)NaCI、0.05モル
のリン酸ナトリウム、pH7,3,3%(sq/’v)
のBSAおよび0.05%(v/v)のンイー7 (T
wee n@’)20を含有する1で50倍に6釈する
:この溶液の100マイクロリツトルを各ウェルに添加
し、そして室温において1時間反応させる。前述のよう
にリン酸塩緩衝食塩水pH7,3[0,15モルc7)
NaClO,05モルのリン酸ナトリウム、0.05%
(v /’ v )のツイーン(Twee n@)20
を含有する]で8回洗節し、振盪乾燥した後、ウサギE
gG類ヤこ対するワサとのペルオキシダーゼ接合ヤギ
抗+fil i+’;Q/<イオネチクス・インコーポ
!/−テッド(Bionetics Inc、)]
のリン酸用緩衝食塩水中の1〜500倍希釈物の10
0マイルロリツトルを各ウェルに添加し、そして室温で
1時間装置する。次いで、各ウェルを再び前述のように
リン酸114緩衝食塩水pH7,3[0,15モルfN
ac1.0.05モルのリン酸すI・リウム、0.05
%(V/V)(7)ツイーン(Tweei’)20を含
イfする]で洗油しかつ振盪乾燥し、そしてベルオキシ
ターゼの発色性基質(0゜1モルのクエン酸ナトリウム
緩衝液、pH5中の1mg/m Iの0−フェニレンジ
アミン、5ミリモルの過酸化水素)の200マイクロリ
ツトル/ウエルの溶液を各ウェルに添加し、そして色を
室温で30分間発生させる。次いで発色反応を50マイ
クロリツトル/ウエルの4.5モルの硫酸の流力11に
より!’7’+l−させ、そ(7)15分後、492n
mにおける吸収をタイターチク−マルチスキャン(Ti
tertek Multiscan)光度計[フロー
ラボラトリーズ・インコーボレー・テッド(Flow
Lab、 Inc、)] で測定する。吸収値を半
対数紙上にティコプラニンの濃1■の関数としてプロ、
、、 トすることによって、結合曲線を4j+rる。0
.01マイルログラム/m l−1マイクロそル/ml
の範囲のティコプラニンを使用して投jt−一応答曲線
を作成し、そして試料中の濃度を標準曲線I−で内槽す
ることによって決定する。
既知jIS゛のティコプラニンを含有する溶液の反復す
るアッセイによって、この方法は感度、精度および1F
確さの分析の要件を満足することが示された。
るアッセイによって、この方法は感度、精度および1F
確さの分析の要件を満足することが示された。
1−の方法を反復しかつアポパルうン、リストセチン、
アクタプラニン、抗生物?tA35512B、抗生物r
t A 41030 B、抗生物′eiA47934B
およびバンコマイシンの溶液を使用すると、結合は観測
されなかった。
アクタプラニン、抗生物?tA35512B、抗生物r
t A 41030 B、抗生物′eiA47934B
およびバンコマイシンの溶液を使用すると、結合は観測
されなかった。
実施例6
血清試料を含有するティコプラニンの7−7セイ3%(
w/v) のBsA、0.05%(v/■)のツイーン
(Tween’)20および20%のヒト面詰を含有す
るリン酸塩緩衝食に11木pH7,3(0,15モルの
NaC1,0,05モルのリン酸ナトリウム)中の0.
001〜1マイクログラム/m+の濃度のティコプラニ
ンのスカラー希釈物を使用して、標準曲線を作成する。
w/v) のBsA、0.05%(v/■)のツイーン
(Tween’)20および20%のヒト面詰を含有す
るリン酸塩緩衝食に11木pH7,3(0,15モルの
NaC1,0,05モルのリン酸ナトリウム)中の0.
001〜1マイクログラム/m+の濃度のティコプラニ
ンのスカラー希釈物を使用して、標準曲線を作成する。
試料を血枯綴衝液中で5倍希釈し、そして011m1の
これらの溶液を前の実施例2の手IMjに従ッテ調製し
たBSA −q−A c a−D−A l a−D−A
la被覆したフレキシブルプレートのウェルに、3回の
反復実験において、添加する。
これらの溶液を前の実施例2の手IMjに従ッテ調製し
たBSA −q−A c a−D−A l a−D−A
la被覆したフレキシブルプレートのウェルに、3回の
反復実験において、添加する。
濃度が高い溶液を、また、「ブランク」のウェル(すな
わち、特W的の結合剤で被覆されていないもの)に添加
して′I¥異的結合を評価する。次いで、各マイクロブ
′/−トを室温において苫をした箱内で2・1ν間イン
キュベーションし、そして空に(、かつ+) ンMj2
jR衝食塩水pH7,3[0,15モルのNaC1,0
,05モルのリン酸ナトリウL、、0.05%(V/V
)のツイーン(Tween■)20を含有する]を充填
することによって8回洗顔しか一つ振盪乾燥する。
わち、特W的の結合剤で被覆されていないもの)に添加
して′I¥異的結合を評価する。次いで、各マイクロブ
′/−トを室温において苫をした箱内で2・1ν間イン
キュベーションし、そして空に(、かつ+) ンMj2
jR衝食塩水pH7,3[0,15モルのNaC1,0
,05モルのリン酸ナトリウL、、0.05%(V/V
)のツイーン(Tween■)20を含有する]を充填
することによって8回洗顔しか一つ振盪乾燥する。
次いで、トの実施例3および4に従って調製したティコ
プラニンに対する精製したウサギ抗血清を、リン酸It
!緩衝食塩水[0,05モルのリン酸ナトリウム、0
、15−fニル(1)NaCI、0.05モルのリン酸
ナトリウム、PH7,3,3%(W/V)のBSAおよ
び0.05%(v/v)のツイーン(Tween@)2
0を含有する]テ50倍に希釈する。
プラニンに対する精製したウサギ抗血清を、リン酸It
!緩衝食塩水[0,05モルのリン酸ナトリウム、0
、15−fニル(1)NaCI、0.05モルのリン酸
ナトリウム、PH7,3,3%(W/V)のBSAおよ
び0.05%(v/v)のツイーン(Tween@)2
0を含有する]テ50倍に希釈する。
この溶液のlOOマイクロリットルを各ウェルに添加し
、そして室温において1時間反応させる。リン酸11!
緩衝食塩水pH7,3[0,15モルのNaCl 0
.05モルのリン酸ナトリウム、0.05%(V/V)
(7)ツイーン(Tween@)2C’を含有する]で
8回洗浄し、振盪乾燥した後、ウサギIgG類に対する
ワサビのペルオキシダーゼ接合ヤギ抗血清[パイオネチ
クス・インコーホレーテッド(Bionetics
InC9)]のリン酸1′!!緩衝食塩水中の1〜50
0倍希釈物の100マイルロリツトルを各ウェルに添加
し、そ[5て室温で1時間放置する0次いで、各ウェル
をHTfび前述のようにリン酸塩緩衝食塩水pH7,3
[0,15モルのNaC1,0,05モルのリン酸ナト
リウム、0.05%(V/V)のツイーン(Twee
n・)20を含有する]で洗浄しかつ振盪乾燥し、そし
てペルオキシダーゼの発色性基質(0,1モルのクエン
酸ナトリウム緩衝液、pH5中の1mg/mlのo−7
,=レンジアミン、5ミリモルの過酸化水素)の200
マイクロリツトル/ウエルの溶液を各ウェルに添加し、
そして色を室温で30分間発生させる0次いで発色反応
を50マイクロリツトル/ウエルの4.5モルの硫酸の
添加により停止Fさせ、その15分後、492nmにお
ける吸収をタイターチク・マルチスキャン(Titer
tek Multi SCa n)光度計[フローラ
ボラトリーズ・インコーホレーテッドCFIOW L
ab、 InC0)]でAll定する。吸収値を半対
数紙トにティコプラニンの濃度の関数としてプロットす
ることによって、結合曲線を得る。0.01マイルログ
ラム/m1−1マイクロモル/mlの範囲のティコプラ
ニンを使用して投乍一応答曲線を作成し、そして試料中
の濃度を標準曲線りで白檀することによって決定する。
、そして室温において1時間反応させる。リン酸11!
緩衝食塩水pH7,3[0,15モルのNaCl 0
.05モルのリン酸ナトリウム、0.05%(V/V)
(7)ツイーン(Tween@)2C’を含有する]で
8回洗浄し、振盪乾燥した後、ウサギIgG類に対する
ワサビのペルオキシダーゼ接合ヤギ抗血清[パイオネチ
クス・インコーホレーテッド(Bionetics
InC9)]のリン酸1′!!緩衝食塩水中の1〜50
0倍希釈物の100マイルロリツトルを各ウェルに添加
し、そ[5て室温で1時間放置する0次いで、各ウェル
をHTfび前述のようにリン酸塩緩衝食塩水pH7,3
[0,15モルのNaC1,0,05モルのリン酸ナト
リウム、0.05%(V/V)のツイーン(Twee
n・)20を含有する]で洗浄しかつ振盪乾燥し、そし
てペルオキシダーゼの発色性基質(0,1モルのクエン
酸ナトリウム緩衝液、pH5中の1mg/mlのo−7
,=レンジアミン、5ミリモルの過酸化水素)の200
マイクロリツトル/ウエルの溶液を各ウェルに添加し、
そして色を室温で30分間発生させる0次いで発色反応
を50マイクロリツトル/ウエルの4.5モルの硫酸の
添加により停止Fさせ、その15分後、492nmにお
ける吸収をタイターチク・マルチスキャン(Titer
tek Multi SCa n)光度計[フローラ
ボラトリーズ・インコーホレーテッドCFIOW L
ab、 InC0)]でAll定する。吸収値を半対
数紙トにティコプラニンの濃度の関数としてプロットす
ることによって、結合曲線を得る。0.01マイルログ
ラム/m1−1マイクロモル/mlの範囲のティコプラ
ニンを使用して投乍一応答曲線を作成し、そして試料中
の濃度を標準曲線りで白檀することによって決定する。
既知量のティコプラニンを含有する溶液の反復するアッ
セイによって、この方法は感度、精度および正確さの分
析の要件を満足することが示された。
セイによって、この方法は感度、精度および正確さの分
析の要件を満足することが示された。
1、tに例示した場合において、次の結果が得られ、こ
れらの結呆は一般的に本発明の方法のいかなる応用につ
いても有効である: 応用範囲(反復実験に基づ<):10ng/mlから 好ましい応用範囲+ Long/ml−1mg/lのテ
ィコプラニン。
れらの結呆は一般的に本発明の方法のいかなる応用につ
いても有効である: 応用範囲(反復実験に基づ<):10ng/mlから 好ましい応用範囲+ Long/ml−1mg/lのテ
ィコプラニン。
杭度ニ
ーアッセイ内:10.5類に等しいCV%−アー7セイ
聞:13.5類に等しいCV%I−の方法を反復しかつ
アポバルシン、リストセチン、アクタプラニン、抗生物
質A35512B、抗生物質A41030B、抗生物質
A47934Bおよびバンコマイシンの溶液を使用する
と、結合は観測されなかった。
聞:13.5類に等しいCV%I−の方法を反復しかつ
アポバルシン、リストセチン、アクタプラニン、抗生物
質A35512B、抗生物質A41030B、抗生物質
A47934Bおよびバンコマイシンの溶液を使用する
と、結合は観測されなかった。
ティコプラニンで処置した患者からのうみ、気管支の吐
いたおよび火傷をした患者からの皮膚の試料に1−の実
施例6に記載する回−手順を実質的に適用して、1−の
実施例に記載した20%の血清緩衝溶液中で試料を均質
化した後、この抗生物質の濃度を決定した。この方法は
、また、これらの試料について、1−に報告した同一の
レベルの感度、精度およびIL確さを維持した。
いたおよび火傷をした患者からの皮膚の試料に1−の実
施例6に記載する回−手順を実質的に適用して、1−の
実施例に記載した20%の血清緩衝溶液中で試料を均質
化した後、この抗生物質の濃度を決定した。この方法は
、また、これらの試料について、1−に報告した同一の
レベルの感度、精度およびIL確さを維持した。
ティコプラニンは、米国特許第4,239,73112
1を培養し、そしてセファデクス(Sep )、 a
d e x反応)のカラムクロマトグラフィーまたは他
の同等の技術によって精製することによって調製する。
1を培養し、そしてセファデクス(Sep )、 a
d e x反応)のカラムクロマトグラフィーまたは他
の同等の技術によって精製することによって調製する。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、工程: a)表面上に吸着できる適当な高分子化合物の担体と接
合したD−アラニル−D−アラニンカルボキシ末端オリ
ゴペプチドを支持する前記表面と、試験溶液を、接触さ
せ、 b)洗浄後、検出すべき物質に対して特異的に向けられ
た抗体を添加し、 c)静止相上の抗原へ結合した前記抗体を、検出可能な
マーカーに結合したこれらの結合抗体(抗−抗体抗血清
)に直接向けられた種特異的抗IgG抗体によって、明
らかにする、からなることを特徴とするD−アラニル−
D−アラニンジペプチドまたはD−アラニル−D−アラ
ニンカルボキシ末端オリゴペプチドによって代表される
「分子の受容体」に結合する分析物を決定する方法。 2、分析物は、バンコマイシン、テイコプラニン、アク
タプラニン、アポバルシン、アクチノイジン、抗生物質
LL−AM−374、抗生物質A477、抗生物質OA
7653、抗生物質A35512B、抗生物質A515
668、抗生物質AAD216、抗生物質A41030
、抗生物質A47934ならびにそれらの個々の因子、
誘導体またはアグリコンから選択されるバンコマイシン
の部類の抗生物質である特許請求の範囲第1項記載の方
法。 3、分析物はテイコプラニンまたはその個々の因子、誘
導体またはアグリコンである特許請求の範囲第1項記載
の方法。 4、D−アラニル−D−アラニンカルボキシ末端オリゴ
ペプチドはε−アミノカブロイル−D−アラニル−D−
アラニンである特許請求の範囲第1項記載の方法。 5、高分子化合物の担体は蛋白質である特許請求の範囲
第1項記載の方法。 6、高分子化合物の担体はアルブミンである特許請求の
範囲第1項記載の方法。 7、支持手段はマイクロタイタープレートのウェルまた
は試験管、またはプラスチックシートによって提供され
る特許請求の範囲第1項記載の方法。 8、支持手段はポリエチレンまたはポリスチレンのマイ
クロタイタープレートのウェルである特許請求の範囲第
1項記載の方法。 9、特異的抗体はウサギの抗体であり、そして種特異的
抗−抗体抗血清はウサギのIgG類に対するヤギの抗血
清である特許請求の範囲第1項記載の方法。 10、特異的抗体は、分析物と吸着した「分子の受容体
」との結合を損傷しないモノクローナル抗体である特許
請求の範囲第1項記載の方法。 11、構成成分: a)表面を有する分析用支持体、前記支持体はその表面
上に吸着できる適当な高分子化合物の担体と接合したD
−アラニル−D−アラニンカルボキシ末端オリゴペプチ
ドを支持する、 b)検出すべき物質である分析物に対して特異的に向け
られた抗体を含有する抗体調製物、および必要に応じて
、 c)分析物に対して向けられかつ検出可能なマーカーと
結合した「第1」抗体の源の動物種の免疫グロブリンに
対して特異的に向けられた抗体を含有する種特異的抗−
抗体調製物、 からなることを特徴とする特許請求の範囲第1項記載の
方法において使用するための分析用キット。 12、D−アラニル−D−アラニンカルボキシ末端オリ
ゴペプチドはε−アミノカブロイル−D−アラニル−D
−アラニンである特許請求の範囲第11項記載のキット
。 13、高分子化合物の担体は蛋白質である特許請求の範
囲第11項記載のキット。 14、高分子化合物の担体はアルブミンである特許請求
の範囲第11項記載のキット。 15、分析用支持体はマイクロタイタープレートのウェ
ルまたは試験管、またはプラスチックシートである特許
請求の範囲第11項記載のキット。 16、分析用支持体はポリエチレンまたはポリスチレン
のマイクロタイタープレートのウェルである特許請求の
範囲第11項記載のキット。 17、それ自体既知の方法によりウシ血清アルブミンの
1重量部につき約1〜約10重量部のテイコプラニンの
結合により調製されたテイコプラニン−アルブミン接合
体の有効抗テイコプラニン抗体誘導量をウサギに反復し
て注射し、分析的に有効な抗体の生産を達成するために
十分な時間の後、前記動物から採血し、得られた抗血清
を回収し、そして必要に応じて、約1重量部のウシ血清
アルブミンを約100容量部の膨潤したアガロースと結
合することによって得られたマトリックスの約等量(容
量)との接触により前記抗血清を抗ウシ血清アルブミン
免疫グロブリンから精製する、ことによって得られたこ
とを特徴とする抗テイコプラニンウサギ抗血清。 18、分析的に有効な抗体の生産は、エリサ(ELIS
A)法によって、テイコプラニン被覆マイクロプレート
を用い、検出可能なプローブとしてウサギIgG類に対
するワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗血清を使用して
決定されている特許請求の範囲第17項記援の抗血清。 19、表面上に分析的に検出可能な量のテイコプラニン
を吸着するPVCマイクロプレート、試験管またはプラ
スチックシートから成ることを特徴とするテイコプラニ
ンおよび抗−テイコプラニン抗体の分析的決定に使用す
るためのテイコプラニン被覆分析用支持体。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB858522388A GB8522388D0 (en) | 1985-09-10 | 1985-09-10 | Receptor-antibody sandwich assay |
GB8522388 | 1985-09-10 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
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JPS6271860A true JPS6271860A (ja) | 1987-04-02 |
Family
ID=10584952
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP61209760A Pending JPS6271860A (ja) | 1985-09-10 | 1986-09-08 | 受容体抗体サンドイツチアツセイ |
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JP (1) | JPS6271860A (ja) |
KR (1) | KR870003386A (ja) |
CN (1) | CN86105930A (ja) |
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AU (1) | AU600446B2 (ja) |
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DE (1) | DE3680072D1 (ja) |
DK (1) | DK165075C (ja) |
ES (1) | ES2001636A6 (ja) |
FI (1) | FI82987C (ja) |
GB (1) | GB8522388D0 (ja) |
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PT (1) | PT83299B (ja) |
ZA (1) | ZA866643B (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2014021387A1 (ja) * | 2012-07-31 | 2014-02-06 | 積水メディカル株式会社 | ラテックス凝集阻害免疫法 |
WO2020171158A1 (ja) * | 2019-02-20 | 2020-08-27 | 株式会社パートナーファーム | 固相反応チップ及びこれを用いた測定方法 |
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---|---|---|---|---|
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JP3879866B2 (ja) * | 1995-04-04 | 2007-02-14 | アボット・ラボラトリーズ | 生物体液中のバンコマイシンの検出および定量化用試薬および方法 |
US6797479B2 (en) | 1995-04-04 | 2004-09-28 | Abbott Laboratories | Reagents and methods for the detection and quantification of vancomycin in biological fluids |
KR100505783B1 (ko) * | 2001-12-27 | 2005-08-03 | 근화제약주식회사 | 항생제 테이코플라닌의 면역분석 방법 |
EP1806150A1 (en) * | 2006-01-05 | 2007-07-11 | NEED PHARMA S.r.l. | Teicoplanin composition |
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---|---|---|---|---|
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US4410634A (en) * | 1979-10-26 | 1983-10-18 | Dynasciences Corporation | Method of passively adsorbing immuno-reactive haptens to solid phases |
US4606855A (en) * | 1982-07-26 | 1986-08-19 | Mex Research Associates C/O Leon Reimer | Monoclonal antibody to digoxin |
US4558009A (en) * | 1982-12-20 | 1985-12-10 | Eli Lilly And Company | Process for producing antibiotic A-51568 by fermentation and microorganism |
GB8311136D0 (en) * | 1983-04-25 | 1983-06-02 | Lepetit Spa | Immobilised oligopeptides |
GB8427436D0 (en) * | 1984-10-30 | 1984-12-05 | Lepetit Spa | Receptor assay |
-
1985
- 1985-09-10 GB GB858522388A patent/GB8522388D0/en active Pending
-
1986
- 1986-09-01 NO NO863493A patent/NO167421C/no unknown
- 1986-09-02 IL IL79924A patent/IL79924A0/xx not_active IP Right Cessation
- 1986-09-02 ZA ZA866643A patent/ZA866643B/xx unknown
- 1986-09-02 ES ES8601560A patent/ES2001636A6/es not_active Expired
- 1986-09-03 DE DE8686112170T patent/DE3680072D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1986-09-03 CN CN198686105930A patent/CN86105930A/zh active Pending
- 1986-09-03 EP EP86112170A patent/EP0221282B1/en not_active Expired - Lifetime
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- 1986-09-04 GR GR862271A patent/GR862271B/el unknown
- 1986-09-05 CA CA000517532A patent/CA1276880C/en not_active Expired - Fee Related
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- 1986-09-10 FI FI863637A patent/FI82987C/fi not_active IP Right Cessation
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JPWO2020171158A1 (ja) * | 2019-02-20 | 2021-12-23 | 株式会社パートナーファーム | 固相反応チップ及びこれを用いた測定方法 |
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