JPH083195A - 組織傷害治癒因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 生体の組織、器官などの傷害の治癒を促進す
る活性を有する組織傷害治癒因子（インジュリン）を提
供することを目的とする。 【構成】 本発明の組織傷害治癒因子（インジュリン）
は、ヒトまたは動物の組織または血液成分に由来し、ヒ
トまたは動物の組織の傷害に呼応して増加する特徴を有
する、肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）産生細胞における
ＨＧＦ産生を促進する活性を有する因子である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は組織傷害治癒因子に関
し、より詳細にはヒトまたは動物の組織または血液成分
に由来し、肝実質細胞増殖因子（Hepatocyto Growth Fa
ctor、以下、ＨＧＦという）産生細胞のＨＧＦ産生を促
進する物質に関する。

【０００２】

【従来の技術】ＨＧＦは本発明者らが再生肝ラット血清
中から成熟肝実質細胞を in vitro で増殖させる因子と
して見いだしたタンパク質である（Biochem Biophys Re
s Commun, 122, 1450, 1984）。本発明者らはさらに、
ＨＧＦをラット血小板より単離することに成功し（Pro
c. Natl. Acad. Sci, 83, 6489,1986, FFBS Letter, 2
2,311, 1987）、そのアミノ酸配列を一部決定した。さ
らに、本発明者らは解明されたＨＧＦアミノ酸配列をも
とにヒトおよびラット由来のＨＧＦｃＤＮＡクローニン
グを行い、このｃＤＮＡを動物組織に組換えて肝実質細
胞増殖因子をタンパク質として得ることに成功した（ヒ
トＨＧＦ：Nature, 342, 440, 1989；ラットＨＧＦ：Pr
oc. Natl. Acad. Sci, 87, 3200, 1990）。

【０００３】ＨＧＦの分子量はＳＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動で８２〜８５ｋＤである。ラットＨＧ
Ｆ分子は４６３アミノ酸残基からなるα鎖と２３３アミ
ノ酸残基からなるβ鎖が１個のジスルフィド結合により
架橋したヘテロダイマー構造を持ち、α、β両鎖とも２
個のグルコサミン型糖鎖結合部位が存在する。ヒトＨＧ
Ｆもまたほぼ同じ生理活性を有し、４６３アミノ酸残基
からなるα鎖と２３４アミノ酸残基からなるβ鎖とから
なる。α鎖中には線溶酵素プラスミンと同様のクリング
ル構造が４個存在し、β鎖のアミノ酸配列においてもセ
リンプロテアーゼ活性を有するプラスミンのＢ鎖と約３
７％のホモロジーを有する。ラットＨＧＦとヒトＨＧＦ
のアミノ酸配列のホモロジーはα鎖において91.6％、β
鎖において88.9％と非常に高い相同性を持ち、その活性
は全く互換性がある。

【０００４】肝実質細胞を特異的に増殖させる因子とし
て発見されたＨＧＦは、本発明者をはじめとする研究者
による最近の研究成果によって、生体内で種々の活性を
示している事が明らかとなり、研究対象としてのみなら
ずヒトや動物の治療薬などへの応用に期待が集まってい
る。本発明者らは、ＨＧＦが増殖因子として肝細胞のみ
ならず広く上皮系細胞に働く事を明らかにし、いくつか
の発明を成就した。特願平２−１５８８４１号において
は、ＨＧＦが腎の近位尿細管細胞の増殖を促進すること
より、腎疾患治療剤としての応用開発を、また特願平２
−４１９１５８号においては、ＨＧＦがメラノサイト、
ケラチノサイトなど正常上皮細胞の増殖を促進すること
より、上皮細胞促進剤として創傷治療や皮膚潰瘍治療、
毛根細胞の増殖剤などへの応用開発を成就し、その詳細
を開示した。特に、ＨＧＦはＥＧＦ等他の多くの増殖因
子に見られるガン化作用やガン細胞増殖活性を有さない
ことから、より実用に適している。さらに本発明者ら
は、特願平３−１４０８１２号においてＨＧＦのヒト肝
ガン由来ＨｅｐＧ２細胞株、リンパ芽球ガン由来ＩＭ９
細胞株などのガン細胞増殖抑制活性を利用し、制ガン剤
としても利用可能であることを開示した。

【０００５】ＨＧＦの医薬品としての実用性を考える上
でさらに重要な点は、ＨＧＦがＧ１期、すなわち増殖期
に入った細胞のみを増殖促進し、Ｇ０期、すなわち静止
期にある細胞には作用しないことである。このことは、
傷害のある組織の増殖再生は促進するが、傷害を受けて
いない組織に対しては全く作用を及ぼさないことを意味
する。従って、過剰にＨＧＦを投与しても、あるいは血
液などを介して非患部にＨＧＦが到達しても、正常組織
にガン化を誘導したり過剰な増殖を起こすことがないと
考えられる。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】前記のようにＨＧＦが
肝細胞だけでなく広く上皮細胞の増殖を促進し、またガ
ン細胞の増殖抑制活性を有することから、生体内ではＨ
ＧＦが組織傷害治癒に働いていることが予想される。Ｈ
ＧＦ産生細胞は上皮細胞自身ではなく、肝臓ではＫｕｐ
ｆｆｅｒ細胞や類洞壁血管内皮細胞、腎臓では毛細血管
内皮細胞、肺では肺胞マクロファージや血管内皮細胞な
ど主に間葉系の細胞により産生されていることが解明さ
れており、近隣細胞から必要に応じてＨＧＦが供給され
る、いわゆるパラクリン機構が成立していることが明ら
かにされている。しかしながら、肝臓や腎臓に傷害を受
けたとき、傷害を受けていない臓器、例えば肺などにお
いてもＨＧＦの産生が高まることから、いわゆるエンド
クリン機構によってもＨＧＦが供給されていると考えら
れる。この事実は、傷害を受けた組織からＨＧＦ産生細
胞に産生促進を伝達する物質が存在していることを意味
している。

【０００７】すなわち、ＨＧＦの産生を促進する物質は
傷害を受けた組織から分泌され、血液などを介してＨＧ
Ｆ産生細胞に到達し、細胞内に蓄えられたＨＧＦを放出
させたり、新たに産生を開始させる働きを持つと考えら
れる。創傷治癒や腎再生促進を目的としてＨＧＦを投与
することは勿論であるが、ＨＧＦ産生を促進する物質を
投与すれば、より少ない投与量、投与回数で同じ効果が
得られると予想される。より詳細には、組織傷害治療法
としてＨＧＦを直接投与する場合と比較すると、ＨＧＦ
産生促進物質を投与するほうが、ＨＧＦの血中濃度を長
時間維持することが可能であり、一回の投与量や投与回
数を減らすことができると予想される。

【０００８】一方、生体は呼吸器、皮膚、消化器を始め
とするあらゆる組織、器官において外的、内的を問わず
常に物理的、化学的、あるいは微生物による傷害を受け
ている。これに対してＨＧＦ、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧ
Ｆなど細胞増殖因子を始め、あらゆる機能を動員して、
器官の機能組織細胞、マトリクス細胞などの修復作業を
行うことが、ホメオスタシスの一つの重要な要因である
が、その補償機能ネットワークを作動させ、調節する中
心的な因子が組織内に存在すると考えられてきた。組織
傷害治癒因子は、肝臓、腎臓等の臓器傷害の補償機能や
ＨＧＦの発現機構を研究するのに有用であるだけでな
く、生体のあらゆる組織、器官傷害を治癒する因子であ
り、治療薬として非常に有用であることは明らかであ
る。例えば肝臓について考えれば、肝切除や肝炎による
器官傷害の際、ＨＧＦ投与によって肝実質細胞のみを再
生させることができるのに対し、器官傷害の修復機能全
体をコントロールする組織傷害治癒因子を投与すること
により、実質細胞のみならず、非実質細胞である類洞周
囲結合組織など支持組織を始め傷害部位全体の再生が加
速され、真の修復促進が行われる。

【０００９】すなわち、組織傷害治癒因子を治療薬とし
て利用することができれば、従来の発見されてきた種々
の細胞増殖因子を単独で使用するのに比べて、格段にマ
イルドかつすみやかに傷害を治療することができ、その
有用性は計り知れない。組織傷害治癒因子を追跡し、そ
の本体を解明するためには細胞増殖因子の産生促進活性
をメルクマールにするのが最も効率的であり、実際に
は、ＨＧＦ産生促進物質が組織傷害治癒因子の本体と考
えてまちがいない。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、人工的に
肝臓または腎臓に傷害を与えたラットの血液中に、ＨＧ
Ｆ産生細胞を刺激し、産生能を高める作用があることを
見いだし、その作用物質を組織傷害治癒因子「インジュ
リン」と命名した（本明細書においても、便宜上、組織
傷害治癒因子の名称としてインジュリンを使用する）。
さらに、ＨＧＦｍＲＮＡもしくはＨＧＦの産生量を指標
として詳細に検討した結果、インジュリンに関して精製
方法の確立とその分子量、物理化学的性質の解明を果た
し、本発明を完成するに至った。

【００１１】すなわち、正常ラットに開腹手術を行い、
70%部分肝切除または門脈血管の部分結紮により虚血状
態にして肝傷害を与えた後、経時的に血液を採取し、正
常ラットの腹腔下に注射したところ、6時間後から18時
間後にかけて肺におけるＨＧＦｍＲＮＡの発現量が著し
く増加していることが判明した（実験例１参照）。同様
にin vitroでも、ヒト胎児肺由来線維芽細胞ＭＲＣ−５
細胞株を用いたＨＧＦ産生定量法によって、70%部分肝
切除、四塩化炭素投与、肝虚血処理による肝傷害、また
は片腎摘出、塩化水銀投与、カナマイシン投与による腎
傷害を与えたラットの血液中にＨＧＦ産生を促進する作
用があることが確かめられた（実験例２参照）。これら
の結果より、肝臓、腎臓等に傷害を受けた動物の血中
に、傷害に呼応して、ＨＧＦの産生を促進する作用物質
が存在することが予想された。本発明者らは、四塩化炭
素投与ラットの血清を原料として、バイオゲルＰ−６０
およびセファデックスＧ−１５０の各分子ふるい用ゲル
カラム、さらにイオン交換ＦＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ、調
製用ＳＤＳ−ＰＡＧＥなどを用いて本作用物質を精製す
ることに成功した（実施例２、４参照）。得られた組織
傷害治癒因子インジュリンについて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
によってより詳細に分子量を測定し、また種々の物理化
学的処理を施して安定性を調べた（実施例１、３、４参
照）。

【００１２】すなわち本発明は、 1.ヒトまたは動物の組織または血液成分に由来し、ヒト
または動物の組織の傷害に呼応して増加する特徴を有す
る、肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）産生細胞におけるＨ
ＧＦ産生を促進する活性を有する組織傷害治癒因子、イ
ンジュリン。 2.下記の1)ないし4)の処理により活性を保持し、5)の処
理により失活する組織傷害治癒因子、インジュリン。 1) 60℃ 5分、または100℃ 5分の熱処理。 2) pH 1.0、3.5、5.0の酸処理。 3) 1mM ジチオスレイトールの還元処理。 4) 0.31mU/ml、37℃、1時間のヘパリナーゼ処理。 5) 100μg/ml、37℃、3時間のトリプシン処理。 3.バイオゲルＰ−６０およびセファデックスＧ−１５０
の各ゲルカラム処理により10kDないし30kDの分子量を示
す組織傷害治癒因子、インジュリン。 4.非還元条件下、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳
動により10kDないし20kDの分子量を示す組織傷害治癒因
子、インジュリン。 5.非還元条件下、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳
動により40kDないし60kDの分子量を示す組織傷害治癒因
子、インジュリン。に関する。

【００１３】本発明の組織傷害治癒因子、インジュリン
を得る方法としては、四塩化炭素処理や片腎摘出手術を
施したラットなどの動物の組織や血液成分、あるいは肝
炎、腎炎患者もしくはその手術直後のヒトの組織や血液
成分を原料とし、実施例２に示すゲルろ過法や、実施例
４に示すようなＦＰＬＣ、ＳＤＳポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動などにより精製することができる。また、実
験例２に示す in vitro アッセイ系によりブタの種々臓
器抽出物のインジュリン活性を測定したところ、表１に
示す如く多くの臓器に活性が見いだされた（実験例５参
照）。特に、小脳、大脳、肝臓、肺において高い活性が
認められ、本発明のインジュリンが高濃度に蓄積されて
いることが明らかとなった。本実施例に用いられたＭＲ
Ｃ−５細胞のアッセイ系においてラット、ブタ、ヒト
（実験例４参照）で同じように活性が認められたことか
ら、ＨＧＦ同様、インジュリンの活性が少なくとも哺乳
類間で互換性があることを示している。

【００１４】

【発明の効果】本発明の組織傷害治癒因子は新規な因子
であり、本発明の組織傷害治癒因子によれば、生体の組
織、器官などの傷害の治癒を促進することができるとい
う効果を奏する。

【００１５】

【実施例】本発明をより詳細に説明するために実施例を
挙げるが、本発明はこれらによってなんら限定されるも
のではない。また、以下の実験例および実施例に用いた
ラットはすべて、ウイスター系の成熟雄正常ラット(130
〜150g)である。

【００１６】実験例１ 正常ラットに開腹手術により70%部分肝切除を施し、も
しくは門脈血管を部分結紮して虚血状態にし、肝臓に傷
害を与えた。これら肝傷害ラットから経時的に血清を2m
l採取し、それぞれ正常ラットの腹腔内に投与した。対
照として、正常ラット末梢血および生理食塩水を投与
し、投与6時間後、ラットを解剖して肺を摘出し、ＨＧ
ＦｍＲＮＡ測定に供した。より詳細には、摘出した肺か
ら酸-グアニジン-フェノール-クロロホルム法（ＡＧＰ
Ｃ法）によりＲＮＡを抽出し、Oligotex dT-30 でポリ
(Ａ)ＲＮＡを精製した。ポリ(Ａ)ＲＮＡ2μgをホルムア
ルデヒドで変性させた後、0.7%ホルムアルデヒドを含む
1.2%アガロースゲルで電気泳動した。泳動後、Hybond-N
フィルターに転写し、［α-Ｐ³²］-ＣＴＰでラベルし
た1.4kb ＲＢＣ-１フラグメントをハイブリダイズさせ
た。ハイブリダイゼーションは20μg/mlのサケ***ＤＮ
Ａ、50%(V/V)ホルムアルデヒド、0.5%(W/V)ＳＤＳ、0.9
M ＮａＣｌ、50mM ＮａＨ₂ＰＯ₄、5mM ＥＤＴＡおよび
２Ｘデンハート溶液を含む緩衝液を用い、42℃ 17時間
で行った。0.36M ＮａＣｌ、20mM ＮａＨ₂ＰＯ₄、2mM
ＥＤＴＡ、0.5% ＳＤＳからなる緩衝液で65℃、15分間
の条件で２回洗浄し、Ｘ線フィルム（富士フィルム社
製）で撮影した。その結果を図１に示す。図１に示す如
く部分肝切除、肝虚血の何れの場合も、肺におけるＨＧ
ＦｍＲＮＡの発現が促進されていることが認められた。

【００１７】実験例２ 肝傷害、または腎傷害ラットの血清中にＨＧＦ誘導活性
物質がある事を次の手順により in vitro のアッセイ系
で確認した。肝傷害ラットとして70%部分肝切除を施し
たラット、四塩化炭素投与（2mg CCl₄/g体重）したラッ
トおよび肝虚血状態にしたラット、また腎傷害ラットと
して片腎のみ摘出したラット、塩化水銀投与（2mg HgCl
₄/g体重）したラットおよびカナマイシン投与（0.3mg
カナマイシン/g体重）したラットのそれぞれから経時的
に血清を採取した。ヒト胎児肺由来線維芽細胞株ＭＲＣ
−５細胞は、10%ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、ペニシリン1
00IU/ml、ストレプトマイシン100IU/mlを添加したダル
ベッコのイーグル培地（ＤＭＥＭ）にて培養した。イン
ジュリン活性は、ＭＲＣ−５細胞が産生するＨＧＦを定
量する事により測定した。すなわち、24穴マイクロプレ
ート（コーニング社製）でＭＲＣ−５細胞を培養し、80
〜90%飽和細胞密度になった時点で、培地をＦＣＳを含
まないＤＭＥＭに交換し、サンプル血清を各ウエルに添
加してさらに24時間培養を続けた。インジュリン活性の
単位は、ブタ肺の酸性抽出物を加えたときに発現される
ＨＧＦ最大濃度の50%濃度を与える活性をもって1mU（1/
1000単位活性）とした。

【００１８】ＭＲＣ−５細胞の培養上清中のＨＧＦは酵
素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）により定量した。抗ヒト
ＨＧＦポリクローナル抗体は組換え型ヒトＨＧＦをウサ
ギに免疫し、得られた血清からプロテインＡセファロー
スゲル（ファルマシア社製）を用いてＩｇＧを精製して
得た。得られた抗体はラットＨＧＦとは交差反応しなか
った。抗ヒトＨＧＦ抗体を50mM炭酸緩衝液中に20μg/ml
の濃度で溶解させ、96穴マイクロプレート（コースター
社製）に分注し、飽和湿度恒温室内で37℃、15時間静置
し、プレート固相を調製した。リン酸緩衝食塩水（ＰＢ
Ｓ）中に3%の濃度で調製したウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）でブロッキングした後、培養上清をウエルに加え、
37℃、2時間でインキュベートした。各ウエルを、0.025
%Tween20を含むＰＢＳ（ＰＢＳ-Tween20）で３回洗浄
し、ＰＢＳ-Tween20に溶解したビオチン結合抗ヒトＨＧ
Ｆ抗体を添加して37℃、2時間インキュベートした。Ｐ
ＢＳ-Tween20で３回洗浄した後、Horse Radish Peroxid
ase標識したストレプトアビジンを加え、37℃で1時間イ
ンキュベートし、ＰＢＳ-Tween20にて再度３回洗浄し
た。50mM クエン酸、100mM リン酸ナトリウム、2.5mg/m
l ｏ-フェニレンジアミン、0.015% Ｈ₂Ｏ₂からなる発色
剤を加えて酵素反応を開始した。1.5M硫酸を加えて反応
を停止させた後490nｍの吸収度を測定した。その結果を
図２に示す。図２において、（Ａ）：四塩化炭素投与
(●)、部分肝切除(○)、肝虚血処理(▲)、（Ｂ）：片腎
摘出(△)、塩化水銀投与(■)、カナマイシン投与(□)の
それぞれの処理を施したラットの結果を示す。図２に示
す如く、各処置3時間後にはインジュリン活性が非常に
高まり、6〜12時間後には最高に達した。

【００１９】実験例３ 実験例１の方法に従って、四塩化炭素投与ラットの血清
中の組織傷害治癒因子によるＭＲＣ−５細胞のｍＲＮＡ
発現の経時的変化を調べた。ＭＲＣ−５細胞を10%ＦＣ
Ｓを含むＤＭＥＭで80〜90%飽和細胞密度になるまで培
養し、ＦＣＳを含まないＤＭＥＭに正常ラット血清およ
び四塩化炭素投与12時間後のラット血清を添加した培地
に交換した。3〜48時間後、培地をサンプリングしてＡ
ＧＰＣ法でＲＮＡを抽出し、実験例１の方法に従ってノ
ーザンハイブリダイゼーションを行ってＨＧＦｍＲＮＡ
の発現量を経時的に追跡した。対照として、血清を添加
しない培地に交換した例を示す。その結果を図３に示
す。図３に示す如く、ＭＲＣ−５細胞のＨＧＦｍＲＮＡ
発現量は3時間後に非常に高まり、一旦下がった後24時
間後に再び高まっていることが認められた。

【００２０】実験例４ ヒト血清中のインジュリン活性を調べるため、以下の実
験を行った。肝ガンと診断された２人の患者の外科的治
療に際し、血清中のインジュリン活性、すなわちＨＧＦ
産生誘導活性の変化を追跡した。手術の４日前から１４
日後までの間、数回に分けて患者から血清を採取し、そ
のインジュリン活性をＭＲＣ−５細胞を用い実験例２の
方法に従って測定した。その結果を図４に示す。図４に
示す如く、手術直後からインジュリン活性は２〜２.５
倍に高まり、その後次第に低下し、約２週間で正常値に
戻った。

【００２１】実験例５ ブタの各種臓器抽出物に存在するインジュリン活性を以
下の方法により測定した。摘出した各ブタ臓器は１重量
当り５倍量(5ml/g・サンプル)の１Ｍ酢酸(pH3.5)を加
え、ポリトロン・ホモジナイザーを用いて０℃で２分間
ホモジナイズした。破砕物を100,000xgで１時間遠心分
離し、得られた上清を中和してpH7.0に調整した。さら
に100,000xgで20分間遠心分離した後、上清をＰＢＳで
透析し、0.22μmメッシュのフィルターで濾過した。得
られた抽出物について、実験例２の方法に従って、ＭＲ
Ｃ−５細胞ＨＧＦ産生刺激活性によりインジュリン活性
を測定した。蛋白質濃度はＢＣＡ蛋白アッセイキット
（ピアースケミカル社）を用いて測定した。その結果を
表１に示す。表１に示す如く、蛋白質当たりのインジュ
リン活性は小脳、肺、大脳において高く、臓器当たりの
活性総量は肺が顕著に高いことが明らかとなった。

【００２２】

【００２３】実施例１ 実験例１の方法に従って肝傷害ラット血清中の組織傷害
治癒因子インジュリンの物性を調べた。正常ラットの血
清、および70%肝切除を行った正常ラットの手術３時間
後の血清をサンプルとして用いた。本因子の酸に対する
安定性を調べるため、1M 酢酸を添加してpH 3.5とし、4
℃で12時間インキュベートした後、100,000xgで1時間遠
心分離して、その上清を下記の試験に供した。次に熱に
対する安定性を調べるため、上記の酸処理を施したサン
プルを100℃で5分間熱処理し、0.22μmメッシュのフィ
ルターでろ過した後、濾液を下記の試験に供した。ま
た、分子量が10kD以上か、それ未満かを調べるためアミ
コンYM10メンブレンフィルターを用いてサンプルを限外
ろ過し、フィルターを透過した（分子量10kD未満のもの
を含む）溶液とフィルターに残った（分子量10kD以上の
ものを含む）溶液とをそれぞれ下記の試験に供した。

【００２４】正常血清、酸処理血清、酸及び熱処理血清
を各2ml、および正常血清2mlを10kDフィルター処理した
濾液と残渣のそれぞれを正常ラット腹腔に注射し、6時
間後、肺を摘出して、実験例１の方法に従ってＲＮＡ抽
出、精製およびノーザンハイブリダイゼーションを行っ
た。その結果を図５に示す。図５に示す如く、酸処理、
熱処理によってインジュリン活性は減衰しておらず、本
発明のインジュリンが酸、熱に耐性があること、および
分子量10kDのフィルターを通過しないことが明らかにな
った。

【００２５】実施例２ 四塩化炭素投与ラットの血清から分子ふるいクロマトグ
ラフィーにより本発明の組織傷害治癒因子インジュリン
を精製した。 (1)ラット腹部に四塩化炭素を接種し、15時間後血清を
採取した。得られた血清を蟻酸を用いてpH3.5に調整
し、4℃で2時間撹拌したのち0.22μmメッシュのフィル
ターでろ過した。得られた酸処理血清20mlを、100mM蟻
酸アンモニウム（pH3.5）で平衡化したバイオゲルＰ−
６０（バイオラッド社製）カラム（19.6cm² x60cm）に
かけた。8mlづつフラクション分離し、得られたフラク
ションは細胞培養液に添加するため、凍結乾燥した後、
50mM ＨＥＰＥＳ-ＮａＯＨ緩衝液（pH7.4）に溶解し、
ろ過滅菌した。インジュリン活性はＭＲＣ−５細胞を用
いて、実験例２の方法に従って定量した。その結果を図
６に示す。図６に示す如く、インジュリンはフラクショ
ンNo.43〜60に溶出していることが明らかとなった。

【００２６】(2)さらに詳細に分子量を測定するため、
上記(1)で得られたインジュリン活性フラクションを集
め、0.2M ＮａＣｌを含む10mM ＨＥＰＥＳ-ＮａＯＨ緩
衝液（pH7.2）で平衡化したセファデックスＧ−１５０
（ファルマシア社製）カラム（5.3cm² x 90cm）にかけ
た。分子量マーカーとして、アルドラーゼ（158kD）、
ＢＳＡ（67kD）、キモトリプシンＡ（25kD）、リボヌク
レアーゼＡ（14kD）を用い、図中に示した。6mlずつフ
ラクション分離し、得られた中の偶数番のフラクション
について、インジュリン活性を測定した。活性測定は実
験例２の方法に従い、ＭＲＣ−５細胞ＨＧＦ産生刺激活
性により測定した。その結果を図７に示す。図７に示す
如く、本発明のインジュリンは約１万から３万（10kD〜
30kD）の分子量を示すことが明らかとなった。

【００２７】実施例３ 本発明の細胞傷害治癒因子インジュリンの物性を調べる
ため、実施例２で得られたインジュリン活性フラクショ
ンを用いて種々の処理を行った。耐熱性を調べるため、
60℃で5分、および100℃で5分の２種類の熱処理を行っ
た。耐酸性を調べるため、酢酸を用いてpH5.0、pH3.5、
および塩酸を用いてpH1.0に調整した。トリプシン処理
として、蛋白濃度470μg/mlのインジュリンフラクショ
ンに対し100μg/mlとなるようにトリプシンを加え、37
℃で3時間インキュベートした。酵素反応の停止はダイ
ズ由来トリプシンインヒビターを200μg/mlの濃度で添
加して行った。還元剤に対する安定性を調べるため、ジ
チオスレイトールを1mMの濃度で添加した。ヘパリナー
ゼ処理として、蛋白濃度470μg/mlのインジュリンフラ
クションに対し0.31mU/mlとなるようにヘパリナーゼを
加えて37℃で1時間インキュベートし、1M 塩酸を加えて
酵素反応を停止した。以上の処理を行ったサンプルを用
いて、実験例２の方法に従いＭＲＣ−５細胞ＨＧＦ産生
刺激活性を、無処理のインジュリンフラクションとの比
較で調べた。その結果を表２に示す。表２に示す如く、
本発明のインジュリンは熱、酸、還元剤に安定であり、
またトリプシン処理により失活し、ヘパリナーゼにより
影響を受けない事から少なくとも活性を担う部分はヘパ
リン様多糖類ではなく、蛋白質であると想定された。

【００２８】

【００２９】実施例４ 本発明のインジュリンをさらに精製し、より詳細に分子
量を求めるため、インジュリンフラクションを電気泳動
にかけた。実施例２-(2)で得られたインジュリン活性フ
ラクションをイオン交換ＦＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ、調製
用ＳＤＳ−ＰＡＧＥで精製した後、非還元条件下で10-2
0%グラジエント・ポリアクリルアミドゲルにより電気泳
動した。分子量マーカーとして次の５種類の蛋白質を用
いた。ホスホリパーゼｂ（94kD）、ＢＳＡ（67kD）、卵
白アルブミン（43kD）、ダイズ由来トリプシンインヒビ
ター（21kD）、リゾチーム（14kD）。ＳＤＳ電気泳動終
了後、ゲルを小片に切り分けテフロン製のホモジナイザ
ーで破砕した。それぞれのゲル片を試験管にとり、ＰＢ
Ｓを加えて4℃で15時間振盪した。1,000xgで20分間遠心
分離した後、上清にＢＳＡを加え、最終濃度が25μg/ml
になるよう調整した。得られた抽出物を精製水で4℃12
時間透析し、凍結乾燥した後、0.15M ＮａＣｌを含む10
mM ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（pH7.2）に溶解した。
最終濃度が4mg/mlになるようＢＳＡを添加した後、冷エ
タノール（ー20℃）を加えて氷上で30分間インキュベー
トした。15,000xgで10分間遠心分離し、沈渣を集めて10
mM酢酸アンモニウムに溶解し、再度凍結乾燥した。凍結
乾燥品を0.15M ＮａＣｌを含む10mM ＨＥＰＥＳ−Ｎａ
ＯＨ緩衝液（pH7.2）に溶解し、インジュリン活性測定
に供した。インジュリン活性は、実験例２の方法に従
い、ＭＲＣ−５細胞ＨＧＦ産生刺激活性により測定し
た。その結果を図８に示す。図８に示す如く、本発明の
インジュリンは約１万から２万の分子量を示すことが明
らかとなった。また、分子量約４万から６万（40kD〜60
kD）の画分にもインジュリン活性が認められた。

【００３０】実施例５ ヒト血清中のインジュリンを以下の方法により精製して
得た。実験例４で得た、肝ガンと診断された患者より得
られた血清を実施例２の方法に従ってバイオゲルＰ−６
０、セファデックスＧ−１５０にて精製した後、実施例
４の方法に従ってイオン交換ＦＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ、
調製用ＳＤＳ−ＰＡＧＥで精製し、得られたインジュリ
ン活性フラクションを非還元条件下で10-20%グラジエン
ト・ポリアクリルアミドゲルにより電気泳動した。実施
例４の方法に従ってゲル切片に切り分け、ＭＲＣ−５細
胞のHGF誘導活性を指標としてインジュリン活性画分を
精製し、本発明の組織傷害治癒因子、インジュリンを得
た。

【図面の簡単な説明】

【図１】部分肝切除および虚血状態により肝傷害を起こ
したラットの血清を経時的に採取して正常ラットの腹腔
に注射し、肺におけるＨＧＦｍＲＮＡの発現を追跡した
結果を示す。

【図２】肝傷害および腎傷害ラットの血清を経時的に採
取し、ＭＲＣ−５細胞ＨＧＦ発現誘導によりインジュリ
ン活性を測定した結果を示す。図において、（Ａ）：四
塩化炭素投与(●)、部分肝切除(○)、肝虚血処理(▲)、
（Ｂ）：片腎摘出(△)、塩化水銀投与(■)、カナマイシ
ン投与(□)のそれぞれの処理を施したラットの結果を示
す。

【図３】四塩化炭素投与ラット血清をＭＲＣ−５細胞培
養系に添加した場合のＨＧＦｍＲＮＡ発現量の経時変化
を示す。アガロースゲル電気泳動後、ノーザンハイブリ
ダイゼーションにより検出した。

【図４】肝臓手術を施行したヒト血清を経時的に採取
し、ＭＲＣ−５細胞ＨＧＦ発現誘導によりインジュリン
活性を測定した結果を示す。○および●は２人の患者を
示し、◇は健常人の血清（正常血清）を示す。

【図５】部分肝切除を施行したラットの血清に物理化学
的処理を行った場合のインジュリン活性を測定した結果
を示す。（Ａ）は酸・熱処理を行った場合、（Ｂ）は限
外ろ過を行った場合のＨＧＦｍＲＮＡ測定の結果を示
す。

【図６】四塩化炭素投与ラット血清からバイオゲルＰ−
６０カラムクロマトグラフィーによりインジュリンを分
離した結果を示す。●はインジュリン活性測定値を、○
は280nmの吸光度を示す。

【図７】バイオゲルＰ−６０カラム分離後の活性フラク
ションからセファデックスＧ−１５０ゲルカラムクロマ
トグラフィーによりインジュリンを分離した結果を示
す。●はインジュリン活性測定値を、○は280nmの吸光
度を示す。

【図８】ゲルろ過後の活性フラクションを用いてＳＤＳ
−ＰＡＧＥにより分離した結果を示す。●はゲル抽出物
のインジュリン活性測定値を、図中の数値は分子量マー
カーの溶出位置を示す。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 肝実質細胞増殖因子（Hepatocyto G
   rowth Factor、ＨＧＦ）産生細胞のＨＧＦ産生を促進す
   る活性を有する組織傷害治癒因子、インジュリン。
2. 【請求項２】 ヒトまたは動物の組織または血液成
   分に由来する請求項１記載の組織傷害治癒因子、インジ
   ュリン。
3. 【請求項３】 ヒトまたは動物の組織の傷害に呼応
   して増加する特徴を有する請求項１記載の組織傷害治癒
   因子、インジュリン。
4. 【請求項４】 下記の1)ないし4)の処理により活性
   を保持し、5)の処理により失活する請求項１記載の組織
   傷害治癒因子、インジュリン。 1) 60℃ 5分、または100℃ 5分の熱処理。 2) pH 1.0、3.5、5.0の酸処理。 3) 1mM ジチオスレイトールの還元処理。 4) 0.31mU/ml、37℃、1時間のヘパリナーゼ処理。 5) 100μg/ml、37℃、3時間のトリプシン処理。
5. 【請求項５】 バイオゲルＰ−６０およびセファデ
   ックスＧ−１５０の各ゲルカラム処理により10kDないし
   30kDの分子量を示す請求項１記載の組織傷害治癒因子、
   インジュリン。
6. 【請求項６】 非還元条件下、ＳＤＳポリアクリル
   アミドゲル電気泳動により10kDないし20kDの分子量を示
   す請求項１記載の組織傷害治癒因子、インジュリン。
7. 【請求項７】 非還元条件下、ＳＤＳポリアクリル
   アミドゲル電気泳動により40kDないし60kDの分子量を示
   す請求項１記載の組織傷害治癒因子、インジュリン。