JP2784455B2 - 肝硬変治療剤 - Google Patents
肝硬変治療剤Info
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
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- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は肝実質細胞増殖因子を有効成分として含有し
てなる肝硬変治療剤に関する。
てなる肝硬変治療剤に関する。
肝臓は糖新生、アミノ酸代謝、脂質代謝、さらには血
漿タンパクの合成、分泌、胆汁の生成分泌、解毒、エネ
ルギー源としての糖の貯蔵、ビタミン類の貯蔵など多く
の生理機能を有する生体にとって必須の臓器である。こ
の肝臓はウイルス感染や長期にわたるアルコール摂取や
薬物の摂取などが原因で肝炎を発症する。この肝炎が慢
性化すると肝硬変へと移行し、高い確立で患者は死亡す
る。
漿タンパクの合成、分泌、胆汁の生成分泌、解毒、エネ
ルギー源としての糖の貯蔵、ビタミン類の貯蔵など多く
の生理機能を有する生体にとって必須の臓器である。こ
の肝臓はウイルス感染や長期にわたるアルコール摂取や
薬物の摂取などが原因で肝炎を発症する。この肝炎が慢
性化すると肝硬変へと移行し、高い確立で患者は死亡す
る。
現在、我国での肝硬変患者数は約40万人と推定され、
年間約２万人の患者が死亡している。肝硬変患者の80％
はＢ型および非Ａ非Ｂ型ウイルス感染による肝炎が原因
で、また残りの20％の大半はアルコール製肝炎が原因で
肝硬変に移行したと推定されている。
年間約２万人の患者が死亡している。肝硬変患者の80％
はＢ型および非Ａ非Ｂ型ウイルス感染による肝炎が原因
で、また残りの20％の大半はアルコール製肝炎が原因で
肝硬変に移行したと推定されている。
しかしながら現在、この肝硬変を治療する治療剤は全
く無いのが実情である。現在、肝硬変の治療法として
は、肝硬変の進行に伴って起こる低栄養、低タンパク症
状を改善するため、対症療法的にビタミンやアミノ酸輸
液の点滴や経腸輸液が行われているにすぎない。また、
肝庇護剤としてグリチルリチン、グルタオチン、チオプ
ロニン、ATP製剤あるいは動物肝抽出物などの投与が行
われているが、その効果のほどは疑わしい。
く無いのが実情である。現在、肝硬変の治療法として
は、肝硬変の進行に伴って起こる低栄養、低タンパク症
状を改善するため、対症療法的にビタミンやアミノ酸輸
液の点滴や経腸輸液が行われているにすぎない。また、
肝庇護剤としてグリチルリチン、グルタオチン、チオプ
ロニン、ATP製剤あるいは動物肝抽出物などの投与が行
われているが、その効果のほどは疑わしい。
一方、肝機能を担っている成熟実質細胞をin vitroで
培養することは長らく不可能であったが、本発明者ら
は、再生肝ラット血清に含まれる特定のタンパク質成分
を培地に添加することにより、成熟肝実質細胞が、極め
て良好に増殖することを見出し、そのタンパク質成分の
部分精製に成功し（Biochem.Biophys.Res.Commun.,122
（No.3）,1450〜1459,1984）、これを肝実質細胞増殖因
子（以下、「HGF」ともいう）と命名した。更に、本発
明者らは本肝実質細胞増殖因子をラット血小板より単離
することに成功し（FFBS LETTER,22，（No.2）,311,198
7）、加えてそのアミノ酸配列を一部決定した（Nature,
342,440〜443,1989）。
培養することは長らく不可能であったが、本発明者ら
は、再生肝ラット血清に含まれる特定のタンパク質成分
を培地に添加することにより、成熟肝実質細胞が、極め
て良好に増殖することを見出し、そのタンパク質成分の
部分精製に成功し（Biochem.Biophys.Res.Commun.,122
（No.3）,1450〜1459,1984）、これを肝実質細胞増殖因
子（以下、「HGF」ともいう）と命名した。更に、本発
明者らは本肝実質細胞増殖因子をラット血小板より単離
することに成功し（FFBS LETTER,22，（No.2）,311,198
7）、加えてそのアミノ酸配列を一部決定した（Nature,
342,440〜443,1989）。
本発明者らは更に得られたHGFのアミノ酸配列をもと
に、ヒトおよびラット由来のHGFのcDNAのクローニング
を行い、得られた該cDNAを動物細胞に組換えて肝実質細
胞増殖因子を得ることに成功した。（Nature,342,440〜
443,1989）。
に、ヒトおよびラット由来のHGFのcDNAのクローニング
を行い、得られた該cDNAを動物細胞に組換えて肝実質細
胞増殖因子を得ることに成功した。（Nature,342,440〜
443,1989）。
肝硬変は肝臓の慢性炎症と線維化の窮極の病態と理解
されている。すなわち、線維隔壁が肝全体に進展し無数
の僞小葉を形成する病態を示している。つまり肝実質細
胞の増殖が抑えられ、間質結合織が異常に増生した病態
であると考えられている。
されている。すなわち、線維隔壁が肝全体に進展し無数
の僞小葉を形成する病態を示している。つまり肝実質細
胞の増殖が抑えられ、間質結合織が異常に増生した病態
であると考えられている。
肝硬変は、一般にその形態により甲型と乙型に分類さ
れている（長与の分類、「肝臓の病気」,225−249頁,19
80年、中外医学社発行など参照）。この長与の分類（長
与・三宅の分類と称されることもある）では、甲型肝硬
変は、「広汎な間細胞壊死とその瘢痕化、残存肝細胞の
結節性肥大によってできる。結節は大小不同、不整形
で、間質は広い。」ことで特徴付けられ、一方、乙型肝
硬変は、「間質の慢性炎症によって、グリソン鞘から伸
びた線維が、既存の肝小葉を線維が囲んでできる。輪状
・多小葉性の結節と薄い間質を有する。」ことで特徴付
けられる。
れている（長与の分類、「肝臓の病気」,225−249頁,19
80年、中外医学社発行など参照）。この長与の分類（長
与・三宅の分類と称されることもある）では、甲型肝硬
変は、「広汎な間細胞壊死とその瘢痕化、残存肝細胞の
結節性肥大によってできる。結節は大小不同、不整形
で、間質は広い。」ことで特徴付けられ、一方、乙型肝
硬変は、「間質の慢性炎症によって、グリソン鞘から伸
びた線維が、既存の肝小葉を線維が囲んでできる。輪状
・多小葉性の結節と薄い間質を有する。」ことで特徴付
けられる。
上記の甲型肝硬変は、広汎な間細胞壊死とその瘢痕化
により起こり、肝炎発症後、半年〜２年で肝硬変に進展
し、肝不全を起こす可能性が強い。それに対して、乙型
肝硬変は、肝炎発症後、２年以上経過して進展し、肝細
胞の壊死を主体とするものではなく、慢性肝炎の結果、
グリソン鞘から線維が延びて既存の肝小葉を囲んででき
る肝硬変である。線維隔壁が進展して、僞小葉が形成さ
れると肝実質細胞が隔離され、円滑な血流の維持あるい
は物質の輸送に支障が生じる。さらに本来の血管系は線
維隔壁を通るシャントとなり、有効な血流の減少が起こ
る。この様な肝硬変の進行に伴う血流の異常は肝実質の
変性を一層おしすすめる一因にもなり、肝硬変におえる
悪循環が続くことになる。
により起こり、肝炎発症後、半年〜２年で肝硬変に進展
し、肝不全を起こす可能性が強い。それに対して、乙型
肝硬変は、肝炎発症後、２年以上経過して進展し、肝細
胞の壊死を主体とするものではなく、慢性肝炎の結果、
グリソン鞘から線維が延びて既存の肝小葉を囲んででき
る肝硬変である。線維隔壁が進展して、僞小葉が形成さ
れると肝実質細胞が隔離され、円滑な血流の維持あるい
は物質の輸送に支障が生じる。さらに本来の血管系は線
維隔壁を通るシャントとなり、有効な血流の減少が起こ
る。この様な肝硬変の進行に伴う血流の異常は肝実質の
変性を一層おしすすめる一因にもなり、肝硬変におえる
悪循環が続くことになる。
肝硬変の成立の主因は接続する慢性炎症であり、結合
織の増生はあくまでも二次的なものと考えられている。
それ故、慢性炎症の成立を防ぐことが肝硬変成立を防ぐ
ために第一に必要なことであろう。一方、繊維芽細胞の
増殖抑制により、線維形成を抑え、同時に肝実質細胞の
増殖を促進することが出来れば、慢性肝炎からの乙型肝
硬変への移行や乙型肝硬変の進行を止めることが出来る
と考えられ、更に高度に成立した乙型肝硬変をも治療出
来ると考えられる。
織の増生はあくまでも二次的なものと考えられている。
それ故、慢性炎症の成立を防ぐことが肝硬変成立を防ぐ
ために第一に必要なことであろう。一方、繊維芽細胞の
増殖抑制により、線維形成を抑え、同時に肝実質細胞の
増殖を促進することが出来れば、慢性肝炎からの乙型肝
硬変への移行や乙型肝硬変の進行を止めることが出来る
と考えられ、更に高度に成立した乙型肝硬変をも治療出
来ると考えられる。
すなわち、特異的に肝実質細胞の増殖を促進すると同
時に特異的に肝非実質線維芽細胞の増殖を抑制するとい
う２つの生理活性を持つ物質が肝硬変治療剤として応用
できると期待されており、本発明の目的はかかる肝硬変
治療剤を提供することにある。
時に特異的に肝非実質線維芽細胞の増殖を抑制するとい
う２つの生理活性を持つ物質が肝硬変治療剤として応用
できると期待されており、本発明の目的はかかる肝硬変
治療剤を提供することにある。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ね
た結果、肝実質細胞を増殖させる因子として同定したHG
Fが、初代培養ラット肝非実質線維芽細胞群を抑制する
活性をあわせ持つことを見出し、本発明を完成させるに
至った。
た結果、肝実質細胞を増殖させる因子として同定したHG
Fが、初代培養ラット肝非実質線維芽細胞群を抑制する
活性をあわせ持つことを見出し、本発明を完成させるに
至った。
すなわち、本発明はHGFを有効成分として含有する肝
硬変治療剤に関するものである。
硬変治療剤に関するものである。
本発明に用いられるHGFは、肝実質細胞を増殖する活
性と肝非実質線維芽細胞の増殖を抑制させる活性を合わ
せ持つ生理活性ポリペプチドであり、分子量は、非還元
ポリアクリルアミドゲル電気泳動によると７万〜９万で
ある。還元下では分子量６万〜7.5万のα−鎖と分子量
３万〜４万のβ−鎖に分かれるヘテロダイマー構造をと
る。またヒトHGFやラットHGFのアミノ酸配列からみる
と、そのα−鎖にはプラスミノーゲンやプラスミンなど
に見られるクリングル構造と呼ばれる特殊な配列を有
し、またβ−鎖においてもその配列は、カリクレイン、
凝固因子XIIなどのセリン・プロテアーゼ領域に類似す
る特徴をもつ。またHGFはコンカナバリンＡに対し、親
和性を示すことから、その構造の中に糖鎖をもつ糖蛋白
質である。
性と肝非実質線維芽細胞の増殖を抑制させる活性を合わ
せ持つ生理活性ポリペプチドであり、分子量は、非還元
ポリアクリルアミドゲル電気泳動によると７万〜９万で
ある。還元下では分子量６万〜7.5万のα−鎖と分子量
３万〜４万のβ−鎖に分かれるヘテロダイマー構造をと
る。またヒトHGFやラットHGFのアミノ酸配列からみる
と、そのα−鎖にはプラスミノーゲンやプラスミンなど
に見られるクリングル構造と呼ばれる特殊な配列を有
し、またβ−鎖においてもその配列は、カリクレイン、
凝固因子XIIなどのセリン・プロテアーゼ領域に類似す
る特徴をもつ。またHGFはコンカナバリンＡに対し、親
和性を示すことから、その構造の中に糖鎖をもつ糖蛋白
質である。
HGFは種々の方法により得ることができる。例えば、
ウシなどの哺乳類動物の肝臓、脾臓、肺臓、骨髄、脳、
腎臓、胎盤などの臓器および血小板や白血球などの血液
細胞や血漿（血清を含む）などから抽出・精製して得る
ことが出来る。また、HGFを産生する初代培養細胞や株
化細胞を培養し、培養物から分離精製して、HGFを得る
こともできる。勿論、HGFの遺伝子を単離し、いわゆる
遺伝子工学的手法を応用し、適切な宿主細胞を形質転換
し、得られた形質転換体を培養し、その培養物から、目
的とする組換え肝実質細胞増殖因子を分離精製して、得
ることもできる（Nature,342,440〜443,1989参照）。
ウシなどの哺乳類動物の肝臓、脾臓、肺臓、骨髄、脳、
腎臓、胎盤などの臓器および血小板や白血球などの血液
細胞や血漿（血清を含む）などから抽出・精製して得る
ことが出来る。また、HGFを産生する初代培養細胞や株
化細胞を培養し、培養物から分離精製して、HGFを得る
こともできる。勿論、HGFの遺伝子を単離し、いわゆる
遺伝子工学的手法を応用し、適切な宿主細胞を形質転換
し、得られた形質転換体を培養し、その培養物から、目
的とする組換え肝実質細胞増殖因子を分離精製して、得
ることもできる（Nature,342,440〜443,1989参照）。
例えば、組換えヒトHGFを調製するには、 （１）ラット肝細胞やラット巨核球などの動物組織より
mRNAまたは染色体DNAを単離し、常法に従ってcDNAライ
ブラリーまたは染色体DNAライブラリーを作製する。
mRNAまたは染色体DNAを単離し、常法に従ってcDNAライ
ブラリーまたは染色体DNAライブラリーを作製する。
（２）合成オリゴヌクレオチドプローブ、あるいは抗体
を用いて動物、例えばラットのHGFのcDNAまたは染色体D
NAを単離するため、上記動物、例えばラット由来のcDNA
ライブラリーまたは染色体ライブラリーのスクリーニン
グを行い、単離されたクローンより目的とするcDNAまた
は染色体DNAを抽出し、この動物、例えばラット由来のH
GFのcDNAまたは染色体DNAをプローブとして、ヒトの臓
器あるいは血液細胞などのmRNAより調製したcDNAライブ
ラリーのスクリーニングを行い、単離されたクローンよ
り目的とするヒト由来HGFのcDNAを抽出する。また、本
発明者らが明らかにしたDNA配列あるいはヒトや動物のH
GFのアミノ酸配列に基づいて合成されたオリゴヌクレオ
チドやヒトHGFcIDNAやヒトHGF染色体DNAなどをプローブ
に用い、またヒトまたは動物のHGFに対する抗体を用
い、直接ヒトの臓器あるいは血液細胞などから抽出した
mRNAより調製したcDNAライブラリーのスクリーニングを
行い、単離されたクローンより目的とするヒト由来のHG
FのcDNAを抽出することもできる。
を用いて動物、例えばラットのHGFのcDNAまたは染色体D
NAを単離するため、上記動物、例えばラット由来のcDNA
ライブラリーまたは染色体ライブラリーのスクリーニン
グを行い、単離されたクローンより目的とするcDNAまた
は染色体DNAを抽出し、この動物、例えばラット由来のH
GFのcDNAまたは染色体DNAをプローブとして、ヒトの臓
器あるいは血液細胞などのmRNAより調製したcDNAライブ
ラリーのスクリーニングを行い、単離されたクローンよ
り目的とするヒト由来HGFのcDNAを抽出する。また、本
発明者らが明らかにしたDNA配列あるいはヒトや動物のH
GFのアミノ酸配列に基づいて合成されたオリゴヌクレオ
チドやヒトHGFcIDNAやヒトHGF染色体DNAなどをプローブ
に用い、またヒトまたは動物のHGFに対する抗体を用
い、直接ヒトの臓器あるいは血液細胞などから抽出した
mRNAより調製したcDNAライブラリーのスクリーニングを
行い、単離されたクローンより目的とするヒト由来のHG
FのcDNAを抽出することもできる。
（３）このヒト由来HGFのcDNAよりヒトHGFをコードする
cDNA断片を制限酵素を用いて切り出し発現用ベクターに
組み込む。
cDNA断片を制限酵素を用いて切り出し発現用ベクターに
組み込む。
（４）得られた組換発現ベクターにより宿主細胞を形質
転換して形質転換体を得る。
転換して形質転換体を得る。
（５）この形質転換細胞を培養して、その培養上清から
ヒトHGFを採取・製造する。
ヒトHGFを採取・製造する。
さらに形質転換細胞中の組換発現ベクターから、制限
酵素処理によって、ヒトHGFをコードする塩化配列を含
有するDNAを得ることも出来る。
酵素処理によって、ヒトHGFをコードする塩化配列を含
有するDNAを得ることも出来る。
以下に、上記の各工程を詳細に説明する。
（１）mRNAの単離とcDNAライブラリーの調製： 動物、例えばラットまたはヒトのHGFをコードするmRN
Aはラットなどの動物またはヒトの肝臓、腎臓、ひ臓、
肺臓、脳、骨髄、胎盤などの臓器あるいは白血球、巨核
球やリンパ球などの血液細胞などから各々得ることが出
来る。例えば、Biochemistry,18,5294（1979）に記載さ
れているJ.M.Chirgvinらの方法によって、ラットなどの
動物またはヒトの臓器あるいは血液細胞のグラニジンチ
オシアン酸溶液から得たRNAを、さらにオリゴ（dT）セ
ルロースカラムを用いる液体クロマトグラフィーに付す
ことによって該mRNAを調製することが可能である。
Aはラットなどの動物またはヒトの肝臓、腎臓、ひ臓、
肺臓、脳、骨髄、胎盤などの臓器あるいは白血球、巨核
球やリンパ球などの血液細胞などから各々得ることが出
来る。例えば、Biochemistry,18,5294（1979）に記載さ
れているJ.M.Chirgvinらの方法によって、ラットなどの
動物またはヒトの臓器あるいは血液細胞のグラニジンチ
オシアン酸溶液から得たRNAを、さらにオリゴ（dT）セ
ルロースカラムを用いる液体クロマトグラフィーに付す
ことによって該mRNAを調製することが可能である。
また、ヒト肝、脳、胎盤、白血球などのmRNAのような
動物細胞や動物組織などの各種mRNAは、市販品としてク
ロンテック社などから購入して利用することも出来る。
動物細胞や動物組織などの各種mRNAは、市販品としてク
ロンテック社などから購入して利用することも出来る。
これらのmRNAを鋳型として逆転写酵素やポリメラーゼ
・チェーン・リアクション法（PCR）を用いて、例えば
H.Okayamaらの方法（Mol.Cell.Biol.,２,161,1982、お
よびMol.Cell.Biol.,３,280,1983）あるいはU.Gublerら
の方法（Gene,25,263,1983）あるいはM.A.Frohmanらの
方法（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85,8988,1988）に従っ
てcDNAを合成し、このcDNAをプラスミドやファージなど
に組み込むことによりcDNAライブラリーを調製すること
が出来る。cDNAを組み込むプラスミドベクターとして
は、大腸菌由来のpBR322（東洋紡製）、pUC18およびpUC
19（東洋紡製）、枯草菌由来のpUB110（シグマ社製）な
どがある。またcDNAを組み込むファージベクターとして
は、λgt10およびλgt11（東洋紡製）などがある。これ
らのベクターは、宿主細胞内に保持されて複製、増幅さ
れるものであれば、ここに例示したものに限定されるも
のではない。
・チェーン・リアクション法（PCR）を用いて、例えば
H.Okayamaらの方法（Mol.Cell.Biol.,２,161,1982、お
よびMol.Cell.Biol.,３,280,1983）あるいはU.Gublerら
の方法（Gene,25,263,1983）あるいはM.A.Frohmanらの
方法（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85,8988,1988）に従っ
てcDNAを合成し、このcDNAをプラスミドやファージなど
に組み込むことによりcDNAライブラリーを調製すること
が出来る。cDNAを組み込むプラスミドベクターとして
は、大腸菌由来のpBR322（東洋紡製）、pUC18およびpUC
19（東洋紡製）、枯草菌由来のpUB110（シグマ社製）な
どがある。またcDNAを組み込むファージベクターとして
は、λgt10およびλgt11（東洋紡製）などがある。これ
らのベクターは、宿主細胞内に保持されて複製、増幅さ
れるものであれば、ここに例示したものに限定されるも
のではない。
mRNAを鋳型として合成されたcDNAをプラスミドまたは
ファージに組み込んでcDNAライブラリーを調製する方法
として、T.Maniatisの方法（Molecular Cloning,Cold S
pring Harbor Laboratory,1982,p.239）またはT.V.Hyun
hらの方法（DNA Cloning:A Practical approach,１,49,
1985）を各々例示することが出来る。また、mRNAと同様
に各種のcDNAライブラリーを市販品としてクロンテック
社などから購入することが出来るのでそれらを利用する
ことも出来る。
ファージに組み込んでcDNAライブラリーを調製する方法
として、T.Maniatisの方法（Molecular Cloning,Cold S
pring Harbor Laboratory,1982,p.239）またはT.V.Hyun
hらの方法（DNA Cloning:A Practical approach,１,49,
1985）を各々例示することが出来る。また、mRNAと同様
に各種のcDNAライブラリーを市販品としてクロンテック
社などから購入することが出来るのでそれらを利用する
ことも出来る。
（２）cDNAライブラリーのクローニング： cDNAライブラリーとして得られたプラスミドやファー
ジなどの組換発現ベクターは、大腸菌のような適切な宿
主細胞に保持される。宿主となり得る大腸菌としては、
例えばEscherichia coliNM514,C600（ストラタジーン社
製）、NM522,JM101（ファルマシア社製）などを例示す
ることが出来る。cDNAのベクターがプラスミドの場合、
塩化カルシウム法、塩化カルシウム・塩化ルビジウム法
などを用いて、またcDNAのベクターがファージの場合、
インビトロパッケージング法などを用いてあらかじめ増
殖させた宿主細胞に保持させることが出来る（Molecula
r Cloning,Cold Spring Harbor Laboratory,1982,p.24
9）。
ジなどの組換発現ベクターは、大腸菌のような適切な宿
主細胞に保持される。宿主となり得る大腸菌としては、
例えばEscherichia coliNM514,C600（ストラタジーン社
製）、NM522,JM101（ファルマシア社製）などを例示す
ることが出来る。cDNAのベクターがプラスミドの場合、
塩化カルシウム法、塩化カルシウム・塩化ルビジウム法
などを用いて、またcDNAのベクターがファージの場合、
インビトロパッケージング法などを用いてあらかじめ増
殖させた宿主細胞に保持させることが出来る（Molecula
r Cloning,Cold Spring Harbor Laboratory,1982,p.24
9）。
このようにして得られた形質転換体から、ラットなど
の動物またはヒトの肝実質細胞増殖因子の部分のアミノ
酸配列をコードするオリゴヌクレオチドを合成し、この
オリゴヌクレオチドを32P標識して、プローブとして用
いてコロニーハイブリダイゼーション法（Gene,10,63,1
980）、プラークハイブリダイゼーション法（Science,1
96,180,1977）などによってcDNAクローンを釣り上げる
ことが出来る。また、目的とするポリペプチドに対する
抗体を用いて、標識抗体法（DNA Cloning:A Practical
Approach,1,49,1985）によって、cDNAクローンをクロー
ニングすることも可能である。このようにしてクローン
化された形質転換体は、ラットなどの動物またはヒト由
来のHGFの全アミノ酸配列あるいはその部分のアミノ酸
配列をコードする塩基配列を有するcDNAを含有してい
る。
の動物またはヒトの肝実質細胞増殖因子の部分のアミノ
酸配列をコードするオリゴヌクレオチドを合成し、この
オリゴヌクレオチドを32P標識して、プローブとして用
いてコロニーハイブリダイゼーション法（Gene,10,63,1
980）、プラークハイブリダイゼーション法（Science,1
96,180,1977）などによってcDNAクローンを釣り上げる
ことが出来る。また、目的とするポリペプチドに対する
抗体を用いて、標識抗体法（DNA Cloning:A Practical
Approach,1,49,1985）によって、cDNAクローンをクロー
ニングすることも可能である。このようにしてクローン
化された形質転換体は、ラットなどの動物またはヒト由
来のHGFの全アミノ酸配列あるいはその部分のアミノ酸
配列をコードする塩基配列を有するcDNAを含有してい
る。
次に該形質転換体から常法（Molecular Cloning,Cold
Spring Harbor Laboratory,New York,1982）に従って
プラスミドやファージなどの組換DNAを単離し、そのま
ま、あるいは制限酵素で消化してからcDNA塩基配列が決
定される。最初に得られた該ラットなどの動物またはヒ
ト由来のcDNAをプローブとして、同様の方法によってヒ
トの臓器あるいは血液細胞由来のmRNAから調製されたcD
NAライブラリーのクローニングを行うことが出来る。得
られたラットなどの動物あるいはヒト由来のHGFのcDNA
の塩基配列は、マクサムとギルバートの化学法（Proc.N
atl.Acad.Sci.USA,74,560,1977）やサンガーのジデオキ
シ法（Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,74,5463,1977）などに
よって決定される。さらに、必要があれば、前述のmRNA
と塩基配列の決定されたcDNAの１部あるいはそのcDNAの
１部の配列を合成したDNAをプライマーにしてプライマ
ーエクステンション法（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,76,73
1,1979）によって新たにcDNAライブラリーを構築し、上
記と同様にしてそのcDNAライブラリーから、すでに得ら
れた第１のcDNAに連結しうる第２のcDNAを含有するプラ
スミドやファージなどの組換DNAをクローニングするこ
とが可能である。このプライマーエクステンションとク
ローニングの工程は、必要により複数回繰り返される。
Spring Harbor Laboratory,New York,1982）に従って
プラスミドやファージなどの組換DNAを単離し、そのま
ま、あるいは制限酵素で消化してからcDNA塩基配列が決
定される。最初に得られた該ラットなどの動物またはヒ
ト由来のcDNAをプローブとして、同様の方法によってヒ
トの臓器あるいは血液細胞由来のmRNAから調製されたcD
NAライブラリーのクローニングを行うことが出来る。得
られたラットなどの動物あるいはヒト由来のHGFのcDNA
の塩基配列は、マクサムとギルバートの化学法（Proc.N
atl.Acad.Sci.USA,74,560,1977）やサンガーのジデオキ
シ法（Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,74,5463,1977）などに
よって決定される。さらに、必要があれば、前述のmRNA
と塩基配列の決定されたcDNAの１部あるいはそのcDNAの
１部の配列を合成したDNAをプライマーにしてプライマ
ーエクステンション法（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,76,73
1,1979）によって新たにcDNAライブラリーを構築し、上
記と同様にしてそのcDNAライブラリーから、すでに得ら
れた第１のcDNAに連結しうる第２のcDNAを含有するプラ
スミドやファージなどの組換DNAをクローニングするこ
とが可能である。このプライマーエクステンションとク
ローニングの工程は、必要により複数回繰り返される。
（３）ヒトHGF組換発現ベクターの構築： クローン化されたヒトHGFのアミノ酸配列の前部ある
いはその１部をコードするcDNAを含有する数種のプラス
ミドやファージなどの組換ベクターから制限酵素によっ
てcDNAを切り出し、ヒトHGFの発現に適したプロモータ
ーの下流に制限酵素とDNAリガーゼを用いて再結合して
組換発現ベクターを作製することが出来る。
いはその１部をコードするcDNAを含有する数種のプラス
ミドやファージなどの組換ベクターから制限酵素によっ
てcDNAを切り出し、ヒトHGFの発現に適したプロモータ
ーの下流に制限酵素とDNAリガーゼを用いて再結合して
組換発現ベクターを作製することが出来る。
より詳しくは、ヒトHGFを効率良く発現させるために
組換発現ベクターは、転写方向の順番に必要によりプ
ロモーター、リボソーム結合部位、開始コドン、
ヒトHGFをコードする塩基配列を含有するDNA、終止コ
ドン、ターミネーターを含むように構築される。
組換発現ベクターは、転写方向の順番に必要によりプ
ロモーター、リボソーム結合部位、開始コドン、
ヒトHGFをコードする塩基配列を含有するDNA、終止コ
ドン、ターミネーターを含むように構築される。
採用することが出来るDNAのベクターとして、大腸菌
由来のプラスミドpBR322,PUC18（東洋紡製）、枯草菌由
来のプラスミドpUB110（シグマ社製）、酵母由来のプラ
スミドpRB15（ATCC237062）、バクテリオファージλgt1
1、λgt11（ストラタジーン社製）、ウイルスSV40（BRL
社製）、BPV（ATCC VR−703），レトロウイルスの遺伝
子由来のベクターなどが列挙出来るが、宿主内で複製・
増幅可能なベクターであれば特に限定はない。特に、ヒ
トHGFを簡便に発現させるには、SV40のようなウイルス
の遺伝子由来のベクターを用いるのが好ましい。
由来のプラスミドpBR322,PUC18（東洋紡製）、枯草菌由
来のプラスミドpUB110（シグマ社製）、酵母由来のプラ
スミドpRB15（ATCC237062）、バクテリオファージλgt1
1、λgt11（ストラタジーン社製）、ウイルスSV40（BRL
社製）、BPV（ATCC VR−703），レトロウイルスの遺伝
子由来のベクターなどが列挙出来るが、宿主内で複製・
増幅可能なベクターであれば特に限定はない。特に、ヒ
トHGFを簡便に発現させるには、SV40のようなウイルス
の遺伝子由来のベクターを用いるのが好ましい。
例えば、前述のクローン化されたヒトHGFをコードす
るDNAをSV40ベクターの後期領域に結合した組換発現ベ
クターは、COS細胞（Cell,23,175,1981）と呼ばれるサ
ル細胞株に導入して発現させることが可能である。
るDNAをSV40ベクターの後期領域に結合した組換発現ベ
クターは、COS細胞（Cell,23,175,1981）と呼ばれるサ
ル細胞株に導入して発現させることが可能である。
プロモーターおよびターミネーターに関しても、目的
とするヒトHGFをコードする塩基配列の発現に用いられ
る宿主に対応したものであれば特に限定はない。例え
ば、プロモーターとして、宿主が大腸菌である場合、tr
pプロモーター、lacプロモーターなどを、宿主が枯草菌
である場合、SP01プロモーター、SP02プロモーターなど
を、宿主が酵母である場合、GAPプロモーター、PGKプロ
モーターなどを、宿主がマウス線維芽細胞やチャイニー
ズハムスター卵巣細胞のような動物細胞の場合、ウイル
ス由来のSV40プロモーターやHSV1 TKプロモーターある
いはメタロチオネインプロモーターなどを例示すること
が出来る。またターミネーターとしては、宿主が大腸菌
の場合、trpターミネーター、lppターミネーターなど
を、宿主が枯草菌の場合、amyFターミネーターなどを、
宿主が酵母の場合、CYC1ターミネータなどを、宿主が動
物細胞の場合、SV40ターミネーター、HSV1TKターミネー
ターなどを例示することが出来る。これらのプロモータ
ーとターミネーターは用いる宿主に応じて適切に組み合
わされる。
とするヒトHGFをコードする塩基配列の発現に用いられ
る宿主に対応したものであれば特に限定はない。例え
ば、プロモーターとして、宿主が大腸菌である場合、tr
pプロモーター、lacプロモーターなどを、宿主が枯草菌
である場合、SP01プロモーター、SP02プロモーターなど
を、宿主が酵母である場合、GAPプロモーター、PGKプロ
モーターなどを、宿主がマウス線維芽細胞やチャイニー
ズハムスター卵巣細胞のような動物細胞の場合、ウイル
ス由来のSV40プロモーターやHSV1 TKプロモーターある
いはメタロチオネインプロモーターなどを例示すること
が出来る。またターミネーターとしては、宿主が大腸菌
の場合、trpターミネーター、lppターミネーターなど
を、宿主が枯草菌の場合、amyFターミネーターなどを、
宿主が酵母の場合、CYC1ターミネータなどを、宿主が動
物細胞の場合、SV40ターミネーター、HSV1TKターミネー
ターなどを例示することが出来る。これらのプロモータ
ーとターミネーターは用いる宿主に応じて適切に組み合
わされる。
ヒトHGFをコードする塩基配列を含有するDNAは、その
DNAから転写、翻訳されて作られるポリペプチドが、肝
実質細胞増殖活性を有するならば特に制限はなく、さら
には上記塩基配列の一部が置換、欠損、挿入、あるいは
これらが組み合わされた塩基配列を有するDNAであって
もよい。ヒトHGFをコードする塩基配列を含有する該DNA
の翻訳開始コドンとしてATG、翻訳終止コドンとしてTA
A、TGA、あるいはTAGを有してもよい。また必要に応じ
て開始コドン、あるいは終止コドンを１つ以上組み合わ
せたり、他のコドンと組み合わせて配列してもよく、こ
れらに特に限定されない。さらに、この組換発現ベクタ
ーで形質転換した宿主の選択マーカーとなり得るアンピ
シリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、DHFR遺伝
子など１種または２種以上が該ベクターの適切な位置に
含有されていることが好ましい。
DNAから転写、翻訳されて作られるポリペプチドが、肝
実質細胞増殖活性を有するならば特に制限はなく、さら
には上記塩基配列の一部が置換、欠損、挿入、あるいは
これらが組み合わされた塩基配列を有するDNAであって
もよい。ヒトHGFをコードする塩基配列を含有する該DNA
の翻訳開始コドンとしてATG、翻訳終止コドンとしてTA
A、TGA、あるいはTAGを有してもよい。また必要に応じ
て開始コドン、あるいは終止コドンを１つ以上組み合わ
せたり、他のコドンと組み合わせて配列してもよく、こ
れらに特に限定されない。さらに、この組換発現ベクタ
ーで形質転換した宿主の選択マーカーとなり得るアンピ
シリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、DHFR遺伝
子など１種または２種以上が該ベクターの適切な位置に
含有されていることが好ましい。
（４）宿主細胞の形質転換とその培養： このようにして構築されたヒトHGF組換発現ベクター
は、コンピテント細胞法（J.Mol.Biol.,53,154,197
0）、プロトプラスト法（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75,1
929,1978）リン酸カルシウム法（Science,221,551,198
3）DEAEデキストラン法（Science,215,166,1982）、電
気パルス法（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81,7161,198
4）、インビトロパッケージング法（Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA,72,581,1975）、ウイルスベクター法（Cell,37,1
053,1984）、またはマイクロインジェクション法（Exp.
Cell.Res.,153,347,1984）などによって宿主に導入さ
れ、形質転換体が作製される。このとき、宿主として記
述の大腸菌の他に、枯草菌、酵母、動物細胞などが用い
られる。特にマウス線維芽細胞C127（J.Virol.,26,291,
1978）やチャイニーズハムスター卵巣細胞CHO（Proc.Na
tl.Acad.Sci.USA,77,4216,1980）などの哺乳動物由来の
宿主細胞を用いるのが好適である。
は、コンピテント細胞法（J.Mol.Biol.,53,154,197
0）、プロトプラスト法（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75,1
929,1978）リン酸カルシウム法（Science,221,551,198
3）DEAEデキストラン法（Science,215,166,1982）、電
気パルス法（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81,7161,198
4）、インビトロパッケージング法（Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA,72,581,1975）、ウイルスベクター法（Cell,37,1
053,1984）、またはマイクロインジェクション法（Exp.
Cell.Res.,153,347,1984）などによって宿主に導入さ
れ、形質転換体が作製される。このとき、宿主として記
述の大腸菌の他に、枯草菌、酵母、動物細胞などが用い
られる。特にマウス線維芽細胞C127（J.Virol.,26,291,
1978）やチャイニーズハムスター卵巣細胞CHO（Proc.Na
tl.Acad.Sci.USA,77,4216,1980）などの哺乳動物由来の
宿主細胞を用いるのが好適である。
得られた形質転換体は、目的とする組換ヒトHGFを産
生させるためにその宿主に応じた適切な培地中で培養さ
れる。培地中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、
無機物、ビタミン、血清および薬剤などが含有される。
培地の１例としては、形質転換体の宿主が大腸菌の場
合、LB培地（日水製薬製）、M9培地（J.Exp.Mol.Gene
t.,Cold Spring Harbor Laboratory New York,1972,p.4
31）などを、宿主が酵母の場合、YEPD培地（Genetic En
gineering,１,Plenum Press,New York,1979,p.117）な
どを、宿主が動物細胞の場合、20％以下のウシ胎児血清
を含有するMEM培地、DMEM培地、RPMI1640培地（日水製
薬製）などを挙げることが出来る。形質転換体の培養
は、通常20℃〜45℃、pHは５〜８の範囲で行われ、必要
に応じて通気、撹拌が行われる。また、宿主が接着性の
動物細胞などの場合は、ガラスビーズ、コラーゲンビー
ズ、あるいはアセチルセルロースフォローファイバーな
どの担体が用いられる。これら以外の培地組成あるいは
培養条件下でも形質転換体が生育すれば実施でき、これ
らに限定されるものではない。
生させるためにその宿主に応じた適切な培地中で培養さ
れる。培地中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、
無機物、ビタミン、血清および薬剤などが含有される。
培地の１例としては、形質転換体の宿主が大腸菌の場
合、LB培地（日水製薬製）、M9培地（J.Exp.Mol.Gene
t.,Cold Spring Harbor Laboratory New York,1972,p.4
31）などを、宿主が酵母の場合、YEPD培地（Genetic En
gineering,１,Plenum Press,New York,1979,p.117）な
どを、宿主が動物細胞の場合、20％以下のウシ胎児血清
を含有するMEM培地、DMEM培地、RPMI1640培地（日水製
薬製）などを挙げることが出来る。形質転換体の培養
は、通常20℃〜45℃、pHは５〜８の範囲で行われ、必要
に応じて通気、撹拌が行われる。また、宿主が接着性の
動物細胞などの場合は、ガラスビーズ、コラーゲンビー
ズ、あるいはアセチルセルロースフォローファイバーな
どの担体が用いられる。これら以外の培地組成あるいは
培養条件下でも形質転換体が生育すれば実施でき、これ
らに限定されるものではない。
（５）ヒトHGFの精製： このようにして形質転換体の培養上清中または形質転
換体中に生成した組換ヒトHGFは、公知の塩析法、溶媒
沈澱法、透析法、限外濾過法、ゲル電気泳動法、あるい
はゲル濾過クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラ
フィ、逆相クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグ
ラフィなどを組み合わせて分離精製することが出来る。
特に、硫酸アンモニウムによる塩析法、Ｓ−セファロー
スイオンクロマトグラフィ、ヘパリンセファロースアフ
ィニティクロマトグラフィ、およびフェニルセファロー
ス逆相クロマトグラフィの組み合わせ、あるいは硫酸ア
ンモニウムによる塩析法、Ｓ−セファロースイオンクロ
マトグラフィ、および抗HGF抗体セファロースアフィニ
ティクロマトグラフィの組み合わせなどが好ましく有効
な精製法である。
換体中に生成した組換ヒトHGFは、公知の塩析法、溶媒
沈澱法、透析法、限外濾過法、ゲル電気泳動法、あるい
はゲル濾過クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラ
フィ、逆相クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグ
ラフィなどを組み合わせて分離精製することが出来る。
特に、硫酸アンモニウムによる塩析法、Ｓ−セファロー
スイオンクロマトグラフィ、ヘパリンセファロースアフ
ィニティクロマトグラフィ、およびフェニルセファロー
ス逆相クロマトグラフィの組み合わせ、あるいは硫酸ア
ンモニウムによる塩析法、Ｓ−セファロースイオンクロ
マトグラフィ、および抗HGF抗体セファロースアフィニ
ティクロマトグラフィの組み合わせなどが好ましく有効
な精製法である。
以上述べた方法によって得られた組換ヒトHGFは、ラ
ット肝およびラット血小板由来HGFと同様に肝実質細胞
の増殖を顕著に促進する。
ット肝およびラット血小板由来HGFと同様に肝実質細胞
の増殖を顕著に促進する。
HGFを、ヒトをはじめとする動物の生体組織や動物細
胞培養物から抽出、分離、精製することもでき、その方
法としては、通常のタンパクの抽出、分離、精製法を利
用することが出来る。例えば、エタノールやアセトンな
どの有機溶媒沈澱法、硫安等による塩析法、透析法、限
外濾過法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過ク
ロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、疎水性ク
ロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー
などを組合わせて用いることができる。特に、Ｓ−セフ
ァロースクロマトグラフィー、ヘパリンセファロースク
ロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラ
フィー、抗体アフィニティークロマトグラフィー、C4逆
相クロマトグラフィー、色素アフィニティークロマトグ
ラフィーなどの組み合わせが好ましく、有効な分離、精
製法である。
胞培養物から抽出、分離、精製することもでき、その方
法としては、通常のタンパクの抽出、分離、精製法を利
用することが出来る。例えば、エタノールやアセトンな
どの有機溶媒沈澱法、硫安等による塩析法、透析法、限
外濾過法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過ク
ロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、疎水性ク
ロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー
などを組合わせて用いることができる。特に、Ｓ−セフ
ァロースクロマトグラフィー、ヘパリンセファロースク
ロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラ
フィー、抗体アフィニティークロマトグラフィー、C4逆
相クロマトグラフィー、色素アフィニティークロマトグ
ラフィーなどの組み合わせが好ましく、有効な分離、精
製法である。
HGFは、そのアミノ酸配列の１部が欠失もしくは置換
していたり、他のアミノ酸配列が１部挿入されていた
り、さらには糖類が同様に欠失あるいは置換されていて
も、肝硬変治療に有効であるような十分の肝実質細胞増
殖活性と線維芽細胞増殖抑制活性とを有するかぎり全て
本発明に使用され得る。
していたり、他のアミノ酸配列が１部挿入されていた
り、さらには糖類が同様に欠失あるいは置換されていて
も、肝硬変治療に有効であるような十分の肝実質細胞増
殖活性と線維芽細胞増殖抑制活性とを有するかぎり全て
本発明に使用され得る。
本発明の有効成分であるHGFは、ヒトを含むウシ、ウ
マ、ラット、ヒツジなどの哺乳動物に対して優れた肝実
質細胞増殖活性と線維芽細胞増殖抑制活性を示すもので
あり、いずれの哺乳動物に対しても有効な肝硬変治療剤
である。
マ、ラット、ヒツジなどの哺乳動物に対して優れた肝実
質細胞増殖活性と線維芽細胞増殖抑制活性を示すもので
あり、いずれの哺乳動物に対しても有効な肝硬変治療剤
である。
当該製剤は、通常HGFの単独または自体既知の担体等
と共に注射剤などの態様とされることが一般的である。
例えば、注射剤は、HGFを適切な緩衝液に溶解した後、
フィルターなどで無菌濾過すること等によって調製する
ことができる。
と共に注射剤などの態様とされることが一般的である。
例えば、注射剤は、HGFを適切な緩衝液に溶解した後、
フィルターなどで無菌濾過すること等によって調製する
ことができる。
本発明の肝硬変治療剤には安定化物質、賦形物質、溶
解補助物質、吸着防止物質、酸化防止物質などの添加物
質を含んでもよく、該添加物質として、例えばマンニト
ールやグルコースなどの糖類、グリシン、アラニン、リ
ジン、アルギニンなどのアミノ酸、アルブミンなどのタ
ンパク質、エチレングリコールやグリセロールなどのア
ルコール類、ポリエチレングリコールなどの親水性ポリ
マー、NaClなどの無機塩類、クエン酸ナトリウムなどの
有機塩類、ポリソルベート80など界面活性剤および含硫
還元剤が挙げられ、これら１つまたは２つ以上を含有し
てもよい。
解補助物質、吸着防止物質、酸化防止物質などの添加物
質を含んでもよく、該添加物質として、例えばマンニト
ールやグルコースなどの糖類、グリシン、アラニン、リ
ジン、アルギニンなどのアミノ酸、アルブミンなどのタ
ンパク質、エチレングリコールやグリセロールなどのア
ルコール類、ポリエチレングリコールなどの親水性ポリ
マー、NaClなどの無機塩類、クエン酸ナトリウムなどの
有機塩類、ポリソルベート80など界面活性剤および含硫
還元剤が挙げられ、これら１つまたは２つ以上を含有し
てもよい。
液状製剤は凍結保存するとか、また凍結乾燥、真空乾
燥等の方法により水分を除去して保存することが好まし
い。さらに、HGFを含有する水溶液を塩析法や溶媒沈澱
法により、該因子を析出させ、得られた沈澱物を乾燥し
て保存することもできる。
燥等の方法により水分を除去して保存することが好まし
い。さらに、HGFを含有する水溶液を塩析法や溶媒沈澱
法により、該因子を析出させ、得られた沈澱物を乾燥し
て保存することもできる。
本発明の肝硬変治療剤は、通常、静脈、動脈、皮下等
の投与経路によって投与される。その投与量は、HGFと
して、0.01mg〜100mgであり、これを１日１〜数回に分
けて投与することが好適である。
の投与経路によって投与される。その投与量は、HGFと
して、0.01mg〜100mgであり、これを１日１〜数回に分
けて投与することが好適である。
本発明の肝硬変治療剤は、HGFを有効成分として含有
してなり、HGFは線維芽細胞の増殖抑制により、維形成
を抑え、同時に肝実質細胞の増殖を促進することが出
来、すなわち、特異的に肝実質細胞の増殖を促進すると
同時に特異的に肝非実質線維芽細胞の増殖を抑制すると
いう２つの生理活性を持つ物質であるから、慢性肝炎か
らの肝硬変への移行や肝硬変の進行を止めることが出来
ると考えられ、更に高度に成立した肝硬変をも治療出来
るという効果を奏し、これまで有効な治療方法のなかっ
た肝硬変に対する治療剤として極めて有用である。ま
た、肝炎等の肝疾患治療剤としても有用である。
してなり、HGFは線維芽細胞の増殖抑制により、維形成
を抑え、同時に肝実質細胞の増殖を促進することが出
来、すなわち、特異的に肝実質細胞の増殖を促進すると
同時に特異的に肝非実質線維芽細胞の増殖を抑制すると
いう２つの生理活性を持つ物質であるから、慢性肝炎か
らの肝硬変への移行や肝硬変の進行を止めることが出来
ると考えられ、更に高度に成立した肝硬変をも治療出来
るという効果を奏し、これまで有効な治療方法のなかっ
た肝硬変に対する治療剤として極めて有用である。ま
た、肝炎等の肝疾患治療剤としても有用である。
以下、実施例・参考例・実験例にて本発明をより詳細
に説明するが、本発明はこれらによって限定されるもの
ではない。
に説明するが、本発明はこれらによって限定されるもの
ではない。
参考例１ （HGF活性の測定） HGF活性は、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80,7229（198
3）に記載の方法に準じて次のように測定した。ウイス
ター系ラットからコラゲナーゼ還流法によって肝実質細
胞を分離精製した。得られたラット肝実質細胞を５％ウ
シ血清、２×10-9Mインスリンおよび２×10-9Mデキサメ
ゾンを添加したウイリアムスＥ培地（フローラボラトリ
ー社）に懸濁し、24ウエルマルチプレートに1.25×105
個／ウエルの濃度で播いた。５％CO2および30％O2およ
び65％N2の存在下、37℃で20時間培養後、0.1μg/mlの
アプロチニンを添加したウィリアムスＥ培地に交換する
と同時に所定量の被試験料を添加した。15時間後、15μ
Ci/mlの125Iデオキシウリジン10μ／ウエルを添加し
た。コントロール群には、125Iデオキシウリジン添加の
15分前に５μm/mlのアフィディコリンを添加した。さら
に６時間培養して125Iでラベルした。細胞をpH7.4のPBS
（リン酸塩緩衝食塩水）で２回洗浄後、冷10％トリクロ
ロ酢酸水溶液（TCA）で固定した。細胞を１ウエル当た
り0.5mlの1N水酸化ナトリウム水溶液で可溶化し、その
放射能をガンマカウンターにより測定した。また放射能
測定後の試料の１部をとってローリー法（J.Biol.Chem,
193,265,1951）に従い蛋白質を測定した。被試験料を添
加したとき肝実質細胞に取り込まれた125Iの量をコント
ロールとのカウントの差として求め、これをラット肝実
質細胞蛋白質1mg当たりに換算して、DNA合成活性（dpm/
mg蛋白質）とした。被験試料のHGF活性は、同一試験に
おいて上皮細胞成長因子（EGF）10ng/mlを用いた時の肝
実質細胞のDNA合成活性の50％に相当する活性を１単位
と定義して表示した。
3）に記載の方法に準じて次のように測定した。ウイス
ター系ラットからコラゲナーゼ還流法によって肝実質細
胞を分離精製した。得られたラット肝実質細胞を５％ウ
シ血清、２×10-9Mインスリンおよび２×10-9Mデキサメ
ゾンを添加したウイリアムスＥ培地（フローラボラトリ
ー社）に懸濁し、24ウエルマルチプレートに1.25×105
個／ウエルの濃度で播いた。５％CO2および30％O2およ
び65％N2の存在下、37℃で20時間培養後、0.1μg/mlの
アプロチニンを添加したウィリアムスＥ培地に交換する
と同時に所定量の被試験料を添加した。15時間後、15μ
Ci/mlの125Iデオキシウリジン10μ／ウエルを添加し
た。コントロール群には、125Iデオキシウリジン添加の
15分前に５μm/mlのアフィディコリンを添加した。さら
に６時間培養して125Iでラベルした。細胞をpH7.4のPBS
（リン酸塩緩衝食塩水）で２回洗浄後、冷10％トリクロ
ロ酢酸水溶液（TCA）で固定した。細胞を１ウエル当た
り0.5mlの1N水酸化ナトリウム水溶液で可溶化し、その
放射能をガンマカウンターにより測定した。また放射能
測定後の試料の１部をとってローリー法（J.Biol.Chem,
193,265,1951）に従い蛋白質を測定した。被試験料を添
加したとき肝実質細胞に取り込まれた125Iの量をコント
ロールとのカウントの差として求め、これをラット肝実
質細胞蛋白質1mg当たりに換算して、DNA合成活性（dpm/
mg蛋白質）とした。被験試料のHGF活性は、同一試験に
おいて上皮細胞成長因子（EGF）10ng/mlを用いた時の肝
実質細胞のDNA合成活性の50％に相当する活性を１単位
と定義して表示した。
参考例２ 〔肝非実質線維芽細胞増殖抑制活性の測定〕 若い成熟ラット（体重180g前後）の肝臓をコラゲナー
ゼにて灌流することにより粗細胞分散液を調製後、50×
ｇ、１分間の低速遠心により肝実質細胞を沈澱させた上
清を分離する。
ゼにて灌流することにより粗細胞分散液を調製後、50×
ｇ、１分間の低速遠心により肝実質細胞を沈澱させた上
清を分離する。
この上清を次に100×ｇ、３分間の遠心を行い、完全
に肝実質細胞を沈澱させた後、肝非実質細胞を350×
ｇ、３分間の遠心により沈澱に集める。このようにして
肝実質細胞をほぼ完全に除去した肝非実質細胞を、10％
ウシ血清を含むRPMI1640培地に約26万細胞/mlの細胞濃
度に懸濁し、12−ウェル−マルチプレートの各ウェル毎
に1mlずつ培養した。３日間培養後、培地を10％fetal c
alf serum（ウシ胎児血清）を含むRPMI1040培地に交換
し、培養を続けた。培養開始から７日目に組換えヒトお
よびラット肝臓由来のHGFを1ng〜5ng/mlの濃度範囲で添
加した。HGF添加24時間後に各ウェルに2.5μCiの〔3H〕
−チミジンを加え、さらに12時間培養を続けた。培地を
除きPBSで細胞をよく洗浄後、各ウェルに1mlのジェンダ
ー液を加え、細胞を固定した。20分後にジェンダー液を
除去し、PBSで洗浄後、暗室下でＸ線感光乳剤〔エマル
ジョン タイプNR−M2（小西六社）〕を塗布した。４℃
で、６日間露光した後、細胞を現像定着しオートラジオ
グラムを作成した。現像、定着後エオジンで細胞質を染
色し、写真撮影を行った。ラベリングインデックスは、
写真上で核がラベルされている肝非実質細胞をカウント
することにより算出した。
に肝実質細胞を沈澱させた後、肝非実質細胞を350×
ｇ、３分間の遠心により沈澱に集める。このようにして
肝実質細胞をほぼ完全に除去した肝非実質細胞を、10％
ウシ血清を含むRPMI1640培地に約26万細胞/mlの細胞濃
度に懸濁し、12−ウェル−マルチプレートの各ウェル毎
に1mlずつ培養した。３日間培養後、培地を10％fetal c
alf serum（ウシ胎児血清）を含むRPMI1040培地に交換
し、培養を続けた。培養開始から７日目に組換えヒトお
よびラット肝臓由来のHGFを1ng〜5ng/mlの濃度範囲で添
加した。HGF添加24時間後に各ウェルに2.5μCiの〔3H〕
−チミジンを加え、さらに12時間培養を続けた。培地を
除きPBSで細胞をよく洗浄後、各ウェルに1mlのジェンダ
ー液を加え、細胞を固定した。20分後にジェンダー液を
除去し、PBSで洗浄後、暗室下でＸ線感光乳剤〔エマル
ジョン タイプNR−M2（小西六社）〕を塗布した。４℃
で、６日間露光した後、細胞を現像定着しオートラジオ
グラムを作成した。現像、定着後エオジンで細胞質を染
色し、写真撮影を行った。ラベリングインデックスは、
写真上で核がラベルされている肝非実質細胞をカウント
することにより算出した。
参考例３ 〔肝臓からの肝実質細胞増殖因子の製造〕 ラット体重の0.2％四塩化炭素を腹腔投与し、投与後
約30時間目で肝臓を摘出した。肝臓はワーリングブレン
ダーで破砕後、日立20PR−52型冷却遠心器を用いて10,0
00rpm20分間遠心し、上清を得た。上清を50mMトリス塩
酸（pH8.5）＋0.15M NaCl＋10mMヘペス＋2mM CaCl2＋0.
01％ツイン80溶液で４℃一昼夜透析した。透析内液を透
析液で平衡化したＳ−セファロース（FF）（ファルマシ
ア社製）カラムに注入し、洗浄後、NaClの濃度勾配によ
り溶出した。肝実質細胞増殖因子はNaCl濃度0.7M付近に
溶出した。次にこの肝実質細胞増殖因子をブルートリス
アクリルＭ（IBF社製）クロマトグラフィーにて精製し
た。溶出はアルギニンの濃度勾配により行い、肝実質細
胞増殖因子はアルギニン濃度0.25M付近で溶出した。得
られた画分を次にヘパリン−セファロース（ファルマシ
ア社製）クロマトグラフィーにより精製した。溶出はNa
Clの濃度勾配により行い、肝実質細胞増殖因子は1M前後
のNaCl濃度付近で溶出した。次にフェニル5PW（東ソー
社製）クロマトグラフィーにより精製した。溶出はNaCl
濃度減少およびエチレングリコール濃度上昇勾配により
行った。ラット100匹の肝臓当たり10μｇの肝実質細胞
増殖因子が得られた。精製された肝実質細胞増殖因子は
SDS−PAGE電気泳動において、非還元下で分子量７万か
ら９万のバンドを与え、還元後は分子量約７万と約３万
のαとβ鎖の２本のバンドを与えた。得られた肝実質細
胞増殖因子に0.25％BSA（ウシ血清アルブミン）を加
え、PBSにて透析した後、実験に供した。
約30時間目で肝臓を摘出した。肝臓はワーリングブレン
ダーで破砕後、日立20PR−52型冷却遠心器を用いて10,0
00rpm20分間遠心し、上清を得た。上清を50mMトリス塩
酸（pH8.5）＋0.15M NaCl＋10mMヘペス＋2mM CaCl2＋0.
01％ツイン80溶液で４℃一昼夜透析した。透析内液を透
析液で平衡化したＳ−セファロース（FF）（ファルマシ
ア社製）カラムに注入し、洗浄後、NaClの濃度勾配によ
り溶出した。肝実質細胞増殖因子はNaCl濃度0.7M付近に
溶出した。次にこの肝実質細胞増殖因子をブルートリス
アクリルＭ（IBF社製）クロマトグラフィーにて精製し
た。溶出はアルギニンの濃度勾配により行い、肝実質細
胞増殖因子はアルギニン濃度0.25M付近で溶出した。得
られた画分を次にヘパリン−セファロース（ファルマシ
ア社製）クロマトグラフィーにより精製した。溶出はNa
Clの濃度勾配により行い、肝実質細胞増殖因子は1M前後
のNaCl濃度付近で溶出した。次にフェニル5PW（東ソー
社製）クロマトグラフィーにより精製した。溶出はNaCl
濃度減少およびエチレングリコール濃度上昇勾配により
行った。ラット100匹の肝臓当たり10μｇの肝実質細胞
増殖因子が得られた。精製された肝実質細胞増殖因子は
SDS−PAGE電気泳動において、非還元下で分子量７万か
ら９万のバンドを与え、還元後は分子量約７万と約３万
のαとβ鎖の２本のバンドを与えた。得られた肝実質細
胞増殖因子に0.25％BSA（ウシ血清アルブミン）を加
え、PBSにて透析した後、実験に供した。
参考例４ 〔遺伝子組換え法によるC127細胞を宿主とするヒト肝実
質細胞増殖因子の製造〕 ヒト肝実質細胞増殖因子のアミノ酸配列をコードする
遺伝子により形質転換されたマウスC127細胞を培養し、
その培養液上清より、ヒト肝実質細胞増殖因子を得た。
以下にその要約を示す。
質細胞増殖因子の製造〕 ヒト肝実質細胞増殖因子のアミノ酸配列をコードする
遺伝子により形質転換されたマウスC127細胞を培養し、
その培養液上清より、ヒト肝実質細胞増殖因子を得た。
以下にその要約を示す。
ヒト肝臓のmRNAから作られたcDNAライブラリーをスク
リーニングし、ヒト肝実質細胞増殖因子のアミノ酸配列
をコードするクローンHAC19とHBC25を得た。
リーニングし、ヒト肝実質細胞増殖因子のアミノ酸配列
をコードするクローンHAC19とHBC25を得た。
HAC19からのDNAをBamH IとSca Iで、HBC25からのDNA
をSca IとPst Iで消化し、それぞれ得られた２つのDNA
フラグメントをブルースクリプトKS IIのBamH IとPst I
部位に連結し挿入、pBS〔hHGF II〕を得た（微工研菌寄
第11050号）。pBS〔hHGF II〕をXba IとSal IとNae Iで
消化し、更にT4DNAポリメラーゼで平滑末端とした後、
ヒト肝実質細胞増殖因子をコードする約3KbのDNAフラグ
メントを、ウシパピローマウイルスDNAをベクターとす
る発現ベクターpBPMTのEcoRV部位に挿入し、pBPMT〔hHG
F II〕を得た。得られた肝実質細胞増殖因子発現ベクタ
ーpBPMT〔hHGF II〕を、リン酸カルシウム法によりマウ
スC127細胞を形質転換した。形質転換体の選択は、G418
を含む培地で増殖させることにより行った。得られた形
質転換体の中から、高い肝実質細胞増殖因子産生能を示
す細胞株BPH89を選び出した。BPH89細胞を牛胎児血清を
加えた培地で増殖させた後、培地を２日おきに変換し
て、肝実質細胞増殖因子を生産させた。培養液から目的
とする肝実質細胞増殖因子を参考例３の精製法に準じた
方法により精製した。精製した肝実質細胞増殖因子がSD
Sポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果、非還元下で
分子量約８万ダルトンの単一バンドを与え、還元下では
分子量約７万ダルトンのα鎖と約３万ダルトンβ鎖の２
本のバンドを与えることを確認した。得られた肝実質細
胞増殖因子に0.25％BSAを加え、PBSで透析した後実験に
供した。
をSca IとPst Iで消化し、それぞれ得られた２つのDNA
フラグメントをブルースクリプトKS IIのBamH IとPst I
部位に連結し挿入、pBS〔hHGF II〕を得た（微工研菌寄
第11050号）。pBS〔hHGF II〕をXba IとSal IとNae Iで
消化し、更にT4DNAポリメラーゼで平滑末端とした後、
ヒト肝実質細胞増殖因子をコードする約3KbのDNAフラグ
メントを、ウシパピローマウイルスDNAをベクターとす
る発現ベクターpBPMTのEcoRV部位に挿入し、pBPMT〔hHG
F II〕を得た。得られた肝実質細胞増殖因子発現ベクタ
ーpBPMT〔hHGF II〕を、リン酸カルシウム法によりマウ
スC127細胞を形質転換した。形質転換体の選択は、G418
を含む培地で増殖させることにより行った。得られた形
質転換体の中から、高い肝実質細胞増殖因子産生能を示
す細胞株BPH89を選び出した。BPH89細胞を牛胎児血清を
加えた培地で増殖させた後、培地を２日おきに変換し
て、肝実質細胞増殖因子を生産させた。培養液から目的
とする肝実質細胞増殖因子を参考例３の精製法に準じた
方法により精製した。精製した肝実質細胞増殖因子がSD
Sポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果、非還元下で
分子量約８万ダルトンの単一バンドを与え、還元下では
分子量約７万ダルトンのα鎖と約３万ダルトンβ鎖の２
本のバンドを与えることを確認した。得られた肝実質細
胞増殖因子に0.25％BSAを加え、PBSで透析した後実験に
供した。
実験例 〔初代培養肝実質細胞と初代培養肝非実質線維芽細胞に
対するHGFの効果〕 参考例４に基づき調製した精製ヒト組換え肝実質細胞
増殖因子を、参考例１において示した方法に従って、成
熟ラット初代培養肝実質細胞に１〜5ng/mlとなるように
添加し、そのDNA合成活性を測定した。さらに、同因子
を参考例２に示したごとくラット肝非実質細胞系に１〜
5ng/ml添加し、ラベリングインデックスを算出した。以
上の結果を第１図としてグラフにまとめた。組換えヒト
肝実質細胞増殖因子は、肝実質細胞に対しては用量依存
的に増殖を促進させたが、一方の非実質細胞に対しては
増殖を顕著に抑制した。即ち本因子は肝臓を構成する実
質細胞と非実質細胞に対し、全く逆の作用を有すること
が明らかになった。
対するHGFの効果〕 参考例４に基づき調製した精製ヒト組換え肝実質細胞
増殖因子を、参考例１において示した方法に従って、成
熟ラット初代培養肝実質細胞に１〜5ng/mlとなるように
添加し、そのDNA合成活性を測定した。さらに、同因子
を参考例２に示したごとくラット肝非実質細胞系に１〜
5ng/ml添加し、ラベリングインデックスを算出した。以
上の結果を第１図としてグラフにまとめた。組換えヒト
肝実質細胞増殖因子は、肝実質細胞に対しては用量依存
的に増殖を促進させたが、一方の非実質細胞に対しては
増殖を顕著に抑制した。即ち本因子は肝臓を構成する実
質細胞と非実質細胞に対し、全く逆の作用を有すること
が明らかになった。
実施例１ 0.15M NaClと0.01％ポリソルベート80を含むpH7.4の
0.02Mリン酸緩衝液100mlに肝実質細胞増殖因子1mgとヒ
ト血清アルブミン100mgを含む水溶液を無菌的に調製
し、1mlずつバイアルに分注し、凍結乾燥し密封する。
別に注射用蒸留水を無菌的に1mlずつアンプルに分注
し、溶解溶液とする。
0.02Mリン酸緩衝液100mlに肝実質細胞増殖因子1mgとヒ
ト血清アルブミン100mgを含む水溶液を無菌的に調製
し、1mlずつバイアルに分注し、凍結乾燥し密封する。
別に注射用蒸留水を無菌的に1mlずつアンプルに分注
し、溶解溶液とする。
実施例２ 0.15M NaClと0.01％ポリソルベート80を含むpH7.4の
0.02Mリン酸緩衝液100mlに肝実質細胞増殖因子1mgとヒ
ト血清アルブミン100mgを含む水溶液を無菌的に調製
し、1mlずつアンプルに無菌的に分注熔閉する。
0.02Mリン酸緩衝液100mlに肝実質細胞増殖因子1mgとヒ
ト血清アルブミン100mgを含む水溶液を無菌的に調製
し、1mlずつアンプルに無菌的に分注熔閉する。
実施例３ 生理的食塩水100ml中に肝実質細胞増殖因子1mgとマン
ニトール1gとポリソルベート10mgを含む溶液を無菌的に
調製し、1mlずつバイアルに分注し、凍結乾燥し密封す
る。
ニトール1gとポリソルベート10mgを含む溶液を無菌的に
調製し、1mlずつバイアルに分注し、凍結乾燥し密封す
る。
実施例４ 肝実質細胞増殖因子１重量部、ヒト血清アルブミン50
重量部、注射用蒸留水100,000重量部の組成比の水溶液
を無菌的に調製し、バイアル瓶に分注し、凍結乾燥し密
封する。
重量部、注射用蒸留水100,000重量部の組成比の水溶液
を無菌的に調製し、バイアル瓶に分注し、凍結乾燥し密
封する。
実施例５ 注射用蒸留水100mlに肝実質細胞増殖因子1mg、ポリソ
ルベート80 10mg、グリシン2g、ソルビトール2gを含む
溶液を無菌的に調製し、1mlずつバイアルに分注し、凍
結乾燥し密封する。
ルベート80 10mg、グリシン2g、ソルビトール2gを含む
溶液を無菌的に調製し、1mlずつバイアルに分注し、凍
結乾燥し密封する。
第１図は初代培養肝実質細胞と初代培養肝非実質線維芽
細胞に対するHGFの効果を示すグラフである。
細胞に対するHGFの効果を示すグラフである。
Claims (7)
- 【請求項１】肝実質細胞増殖因子（HGF）を有効成分と
して含有してなる乙型肝硬変治療剤。 - 【請求項２】HGFが、HGFをコードする遺伝子を宿主細胞
内で形質発現させて得たものである請求項（１）記載の
乙型肝硬変治療剤。 - 【請求項３】HGFを有効成分として含有してなる肝非実
質細胞増殖抑制剤。 - 【請求項４】HGFが、HGFをコードする遺伝子を宿主細胞
内で形質発現させて得たものである請求項（３）記載の
肝非実質細胞増殖抑制剤。 - 【請求項５】肝線維症治療剤である請求項（３）又は
（４）記載の肝非実質細胞増殖抑制剤。 - 【請求項６】HGFを有効成分として含有してなる肝繊維
形成抑制剤。 - 【請求項７】HGFを有効成分として含有してなる乙型肝
硬変の進行抑制剤。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2119030A JP2784455B2 (ja) | 1990-05-09 | 1990-05-09 | 肝硬変治療剤 |
| DE69127017T DE69127017T2 (de) | 1990-05-09 | 1991-05-07 | Arzneimittel gegen Leberzirrhose |
| EP91107405A EP0456188B1 (en) | 1990-05-09 | 1991-05-07 | Therapeutic agent for hepatocirrhosis |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2119030A JP2784455B2 (ja) | 1990-05-09 | 1990-05-09 | 肝硬変治療剤 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0418028A JPH0418028A (ja) | 1992-01-22 |
| JP2784455B2 true JP2784455B2 (ja) | 1998-08-06 |
Family
ID=14751244
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2119030A Expired - Lifetime JP2784455B2 (ja) | 1990-05-09 | 1990-05-09 | 肝硬変治療剤 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0456188B1 (ja) |
| JP (1) | JP2784455B2 (ja) |
| DE (1) | DE69127017T2 (ja) |
Families Citing this family (23)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5871959A (en) * | 1989-12-27 | 1999-02-16 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Method of producing hepatocycte growth factor/scatter factor and related cell lines |
| TW318142B (ja) * | 1991-06-03 | 1997-10-21 | Mitsubishi Chemicals Co Ltd | |
| US5316921A (en) * | 1992-05-18 | 1994-05-31 | Genentech, Inc. | Single-chain hepatocyte growth factor variants |
| US5328837A (en) * | 1992-05-18 | 1994-07-12 | Genentech, Inc. | Hepatocyte growth factor protease domain variants |
| EP0642580B1 (en) * | 1992-05-18 | 2002-08-21 | Genentech, Inc. | Hepatocyte growth factor variants |
| WO1994006420A2 (en) * | 1992-09-15 | 1994-03-31 | Creative Biomolecules, Inc. | Morphogen treatment of gastrointestinal ulcers |
| CA2144081C (en) * | 1992-09-16 | 2004-11-30 | Filip Roos | Protection against liver damage by hgf |
| DK0662130T3 (da) * | 1992-09-18 | 1998-08-10 | Us Gov Health & Human Serv | Fremgangsmåde til fremstilling af hepatocytvækstfaktor og en cellelinje |
| JP3552240B2 (ja) * | 1993-02-23 | 2004-08-11 | 第一製薬株式会社 | 高濃度ｔｃｆ製剤 |
| WO1994021678A1 (en) * | 1993-03-23 | 1994-09-29 | Taisho Pharmaceutical Co., Ltd. | Hepatic parenchymal cell growth substance |
| JP3680114B2 (ja) * | 1993-09-17 | 2005-08-10 | 敏一 中村 | 脳神経障害治療剤 |
| JP3818322B2 (ja) * | 1994-04-28 | 2006-09-06 | 敏一 中村 | コラーゲン分解促進剤 |
| EP0823256A4 (en) * | 1995-04-21 | 2000-06-21 | Mitsubishi Chem Corp | PREVENTIVE OR THERAPEUTIC MEDICINE, OR BOTH, FOR ISCHEMIC CONDITIONS |
| JP3927248B2 (ja) * | 1995-07-11 | 2007-06-06 | 第一製薬株式会社 | Ｈｇｆ凍結乾燥製剤 |
| AU4027601A (en) * | 1995-07-11 | 2001-07-26 | Snow Brand Milk Products Co., Ltd. | Lyophilized HGF preparations |
| JPH11512435A (ja) * | 1995-09-12 | 1999-10-26 | ジェネンテック インコーポレーテッド | 嚢胞性繊維症の治療 |
| JP4006058B2 (ja) | 1997-03-11 | 2007-11-14 | 第一三共株式会社 | 多臓器不全予防及び／又は治療剤 |
| ZA982068B (en) | 1997-03-14 | 1998-09-16 | Snow Brand Milk Products Co Ltd | Agent for preventing and/or treating cachexia |
| DE60034445T2 (de) * | 1999-05-31 | 2008-01-03 | Mitsubishi Chemical Corp. | Gefriergetrocknete hgf-präparationen |
| WO2005058951A1 (ja) | 2003-12-16 | 2005-06-30 | Toshikazu Nakamura | 糖鎖欠損型肝細胞増殖因子 |
| JPWO2006093211A1 (ja) * | 2005-03-02 | 2008-08-07 | 田辺三菱製薬株式会社 | 抗ウイルス剤 |
| WO2007122975A1 (ja) | 2006-04-20 | 2007-11-01 | Kringle Pharma Inc. | Ｈｇｆ前駆体蛋白質改変体及びその活性型蛋白質 |
| US20220050228A1 (en) * | 2019-08-21 | 2022-02-17 | Nitto Denko Corporation | Pressure-sensitive adhesive layer-including transparent electrically conductive sheet, touch sensor, and image display device |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2022752C (en) * | 1989-08-11 | 1998-07-07 | Naomi Kitamura | Hepatic parenchymal cell growth factor, gene encoding the same, process for producing the factor, and transformants producing the factor |
-
1990
- 1990-05-09 JP JP2119030A patent/JP2784455B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1991
- 1991-05-07 DE DE69127017T patent/DE69127017T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-05-07 EP EP91107405A patent/EP0456188B1/en not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｎａｔｕｒａ，Ｖｏｌ．３４２（１９８９），Ｐ．４４０−４４３ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE69127017T2 (de) | 1998-01-22 |
| EP0456188B1 (en) | 1997-07-30 |
| JPH0418028A (ja) | 1992-01-22 |
| EP0456188A1 (en) | 1991-11-13 |
| DE69127017D1 (de) | 1997-09-04 |
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