KR20050004809A

KR20050004809A - 말초 맥관 질환 치료 및/또는 예방에 사용되는 ｉｌ-18저해제

Info

Publication number: KR20050004809A
Application number: KR10-2004-7014401A
Authority: KR
Inventors: 욜란드 차바트츠코; 알라인 테드구이; 지아드 말라트
Original assignee: 어플라이드 리서치 시스템스 에이알에스 홀딩 엔.브이.; 앵스티띠 나셔날 드 라 쌍뜨 에 드 라 르셰르슈 메디깔
Priority date: 2002-03-22
Filing date: 2003-03-13
Publication date: 2005-01-12
Also published as: AU2003219162A1; MXPA04009135A; JP4885424B2; HRP20040758B1; ES2314191T3; DK1487541T3; SI1487541T1; IL164211A0; ZA200407022B; BRPI0308663B8; CN100540058C; EP1487541A2; EP1487541B1; CA2478855A1; HRP20040758A2; RS81504A; DE60324777D1; IL164211A; BRPI0308663B1; NO20044459L

Abstract

본원 발명은 말초 맥관 질환의 치료 또는 예방하는 약물의 제조에서 IL-18 저해제의 용도에 관한다. 나아가, 사지 절단 예방을 위해 IL-18 저해제를 이용하는 것에 관계한다.

Description

말초 맥관 질환 치료 및/또는 예방에 사용되는 ＩＬ-18 저해제{USE OF IL-18 INHIBITORS FOR THE TREATMENT AND/OR PREVENTION OF PERIPHERAL VASCULAR DISEASES}

사이토킨 인터루킨 18(IL-18)은 초기에는 인터페론(IFN-γ) 유도 인자로 알려졌었다(Nakamura et al., 1989). 이는 T-림프구 보조 1형 세포(TH1) 반응의 발생에서 초기 신호다. IL-18은 IL-12, IL-2, 항원, 유사분열물질, 다른 인자와 함께 IFN-γ의 생산을 유도하는 역할을 한다. 또한, IL-18은 GM-CSF와 IL-2의 생산을 향상시키고 항-CD3 유도된 T 세포 증식을 강화시키며 고유 킬러 세포의 Fas-매개된 살해 능력을 증가시킨다.

성숙 IL-18은 IL-1β전환 효소(ICE, 카스파제-1)에 의해 전구물질로부터 만들어진다.

IL-18 수용체는 리간드 결합에서 동시-작동하는 적어도 2개의 요소 즉, IL-18R 알파 및 IL-18R 베타로 구성된다. 뮤린 IL-12 촉진된 T 세포에서 IL-18에 대한 고-친화성 결합 부위와 저-친화성 결합 부위가 발견되었는데(Yoshimoto et al.,1998), 이는 다중적인 체인 수용체 복합체를 암시한다. 지금까지 2개의 수용체 아단위가 확인되었는데, 이들 둘 모두 IL-1 수용체 계통에 속한다(Parnet et al., 1996; Kim et al., 2001). IL-18의 신호 전달에는 NF-κB의 활성화가 관여한다(DoDonato et al., 1997). IL-18 수용체 복합체는 2개의 수용체 사슬: IL-18Rα 사슬이라고 하는 리간드-결합 사슬 및 IL-18Rβ 사슬이라고 하는 신호-전달 사슬로 구성된다. IL-18R 사슬은 방사성표지된 IL-18에 결합하는 세포 표면 단백질로 처음 분리되었다; 상기 단백질은 정제되었고, 이의 아미노산 서열은 IL-1R-관련된 단백질(IL-1Rrp)이라고 하는 기존의 고아 수용체(orphan receptor)와 상동성을 보였다(Torigoe et al., 1997).

최근에, IL-18에 대하여 높은 친화성을 보이는 가용성 단백질이 사람 소변으로부터 분리되었고, 사람 유전자 및 사람과 생쥐의 cDNA가 클론되었다(Novick et al., 1999; WO99/09063). 상기 단백질은 IL-18 결합 단백질(IL-18BP)로 명명되었다.

IL-18BP는 공지된 IL-18 수용체중 한가지의 세포외 도메인이 아니고 분비되고 자연적으로 순환하는 단백질이다. 이는 신규한 계통의 분비 단백질에 속하는데, 여기에는 몇몇 폭스바이러스-인코드된 단백질이 포함된다(Novick et al., 1999). 재조합 IL-18BP와 소변 IL-18BP는 높은 친화성으로 IL-18과 특이적으로 결합하고 IL-18의 생물학적 활성을 조절한다.

IL-18BP 유전자는 사람 크로모좀 11q13에 위치하고, 막통과 도메인을 코딩하는 엑손은 8.3kb 게놈 서열에서 발견되지 않았다. IL-18BP의 4가지 접합 변이체또는 동소체는 사람에서 발견되어 각각 IL-18BP a, b, c, d로 명명되었는데, 이들은 동일한 N-말단을 공유하지만 C-말단에서는 상이하다(Novick et al., 1999). 이들 동소체는 IL-18에 결합하는 능력에서 서로 상이하다. 이들 중에서, hIL-18BP 동소체 a와 C는 IL-18에 대하여 중화 능력을 갖는 것으로 알려져 있다. 사람 IL-18BP 동소체는 뮤린 IL-18과 교차-반응한다.

말초 맥관 질환은 동맥(기능성 또는 폐색성), 정맥, 복합 동정맥(가령 동정맥류 누관) 또는 임파성 질환이다. 폐색성 동맥 질환에는 말초 동맥 폐색 및 Buerger 질환(폐색성 혈전 맥관염 폐색이라고도 함)이 포함된다. 기능성 동맥 질환은 혈관 경련(Raynaud 현상 및 질환, 선단자람증) 또는 맥관 확장(피부홍통증)이 될 수 있다. 이는 혈관에서 국소적 결함 또는 교감신경계활성에 장애 다음으로 심각하다. 정맥 질환에는 정맥 혈전증, 정맥류 정맥이 포함되고, 복합 동정맥류 질환에는 동정맥류 누관이 포함되고, 임파성 질환에는 임파수종 및 지방성 수종이 포함된다.

말초 동맥 폐색이란 사지 말단에 혈액 공습이 아테롬성 플락(죽종), 혈전 또는 색전증에 의해 차단되는 것을 말한다.

말초 동맥 폐색으로 급성 또는 만성 허혈이 생길 수 있다. 급성 허혈은 파열된 전단 아테롬성 플락에 의한 것이거나, 기존의 아테롬성 질환에서 급성 혈전증에 의해서, 심장, 동맥, 또는 다른 큰 혈관에서의 색전증 또는 절단된 동맥류에 의한 것이다. 만성 허혈은 아테롬성 플락이 점진적으로 확대되어 생긴다.

내피 세포가 파괴되어 혈액이 호모시스테인이 지속적으로 상승되면 동맥 및이의 지류의 조숙한 동맥 분류, 말초 동맥, 대뇌 동맥 및 관상 동맥까지도 병에 걸리기 쉽다. 호모시스테인 수준이 다른 위험 인자들과 연합되어 상승되지만 식이요법과 비타민 B 공급으로 변형될 수도 있다.

동맥 폐색의 임상적인 증상은 관련된 혈관, 폐색 정도, 얼마나 신속하게 폐색이 진행되는지, 부행이 적절한지에 따라 달라진다.

급성 폐색은 사지에 갑자기 심각한 통증, 추위, 무감각, 창백하게 되는 등의 병력을 가진다. 사지는 차가와지고, 창백해지고, 맥박은 차단된 말단에서 사라진다. 급성 폐색은 감각 및 운동 신경 상실로 나타나는 심각한 허열의 원인이 되고, 종국에는 (6시간 내지 8시간 후) 촉진 시에도 근육이 경직되어 아프게 된다.

만성 폐색에서, 증상은 조직 허열이 잠행성으로 진행되는 것과 연관이 있다. 초기 증상은 간헐적 파행이다. 간헐적 파행의 증상으로 걸을 때 통증, 아림, 경련 또는 피곤함 등이 된다. 이와 같은 증상은 주로 종아리에서 공통적으로 나타나지만, 발, 넓적다리, 엉덩이에서도 발생될 수 있다.

결국, 허혈 통증은 사지의 최말단에서 시작하여 휴식 시에도 발생될 수 있는데, 들어올릴 때마다 심각하고 무자비한 통증이 누적되고, 수면을 방해한다.

동맥 폐색 수준과 간헐적 파행 위치는 매우 밀접한 상관관계가 있는데, 예를 들면, 대동맥 질환은 주로 엉덩이, 종아리 파행의 원인이 되고, 대퇴부 맥박이 줄거나 사라진다. 대퇴공 질환에서, 파행은 주로 종아리에서 발생되고, 대퇴부 이하의 모든 맥박이 사라진다. 소(小) 맥관 질환자(혈전맥관염 폐색, 진성 당뇨병)에서 대퇴공 맥박이 존재할 수는 있지만, 발의 맥박은 사라진다. 사지를 들어올린 후 1내지 2분 후에 관련 발이 창백해지고, 발적이 나타나면 동맥 부족을 확인할 수 있다. 사지를 들어올린 후, 다시 사지를 사용할 경우 정맥혈이 충전되는 시간은 통상 15초 한계를 초과한다. 파행의 징후가 양호한 말단 맥박과 함께 나타나는 경우, 척수 협착증으로 다르게 진단 받을 수도 있다.

심각한 허혈성 발은 통증이 있으며, 차가워지고, 가끔 감각이 없을 수도 있다. 만성적인 경우에, 피부가 건조해지고, 비늘이 벗겨지며 손발톱이 약해지고, 모발 생장도 안된다. 허혈이 악화되면, 특히 국소 외상 후에 궤양이 발생할 수도 있다(일반적으로 발가락 또는 발꿈치, 간혹 다리에). 환자가 통증을 완화시키기 위해 다리에 힘을 주지 않는 자세로 있다면 부종은 보통 나타나지 않는다. 그러나 심각한 허혈이 있는 다리는 위축될 수도 있다.

좀더 심각한 폐색은 조직의 생존에 위협을 주게되어 괴저 또는 회저로 이어질 수 있다. 다리에 힘이 가해지면 발적, 통증, 발이 붓는 허혈이 봉와직염 또는 정맥성 부전과 유사할 수 있다. 동맥 비침투성 테스트를 통하여 진단을 명확하게 할 수 있다.

말초 맥관 질환가운데, Buerger 질환(폐색성 혈전맥관염 폐색)은 소혈관 또는 중간 크기의 동맥 및 정맥에 염증 변화를 특징으로 하는 폐색성 질환이다.

Buerger 질환은 주로 20 내지 40대의 흡연 남성에서 주로 나타난다. 이 질환이 여성에 나타나는 경우는 5%정도다. 아테롬성 폐색성에 대해 이 질환의 임상적, 맥관적 특징을 더 많이 이해하면서부터 최근에 진단 빈도는 급격히 감소되었다.

경우가 알려지지 않은 경우라도 Buerger 질환이 비흡연자에 나타난 경우는없었고, 이는 흡연이 주요 병인이며, 아마도 과민성 또는 독성 맥관염의 지연된 형태가 될 것이다. 폐색성 혈전맥관염 폐색은 특정 표현형을 가진 사람이 담배에 대해 나타내는 반응일 수도 있는데, 그 이유는 질병을 가진 환자 또는 혈관의 구성분인 타입 I 및 III 사람 콜라겐에 대해 세포 중개된 감응성을 가진 자가면역 환자에서 HLA-A9 및 HLA-135가 상당히 우세하기 때문이다.

아테롬성 동맥 경화증과는 달리, Buerger 질환은 관상 동맥이 연관되지는 않는다.

이 질병은 작은, 중간 규모 동맥이 관련되고, 부분적인 양상으로 사지의 표면 정맥이 종종 연관되기도 한다. 드물게는 질병이 진전된 경우에는 신체의 다른 부분에 혈관도 영향을 받을 수 있다. 병인이 나타나는 것은 관련 혈간의 혈전과 함께 비-화농성 결절성동맥주위염 또는 범정맥염이 나타난다. 급성 병소에는 내피 세포 증식 및 임파세포의 동맥내막층 침윤이 일어나기도 하나 내부 탄성 박층은 고유한 상태로 유지된다. 혈전이 조직되고, 후에 불완전하게 다시 개통될 수도 있다. 매체는 잘 보존되나 섬유아세포가 침윤할 수 있다. adventitia는 섬유아세포에 의해 더 많이 침윤되고, 더 오래된 병소는 말초동맥 섬유증을 나타내어, 인접 정맥 및 신경이 관련된다고 볼 수 있다.

증상 및 징후는 동맥 허혈 및 표면 혈전성정맥염의 것과 같다. 개시는 점진적으로 시작되는데, 상부 및 하부 말단의 혈관에서 시작되어 전단으로 진행되고, 말단 괴저가 누적된다. 환자는 냉증, 무감각, 따끔따끔한 느낌 또는 화끈거림을 느끼고, 이와 같은 것들이 질병의 객관적인 증거가 된다. Raynaud 현상은 공통적인것이다. 간헐적 파행이 관련 사지(통상 발 또는 다리의 둥근 부분에 나타나고, 드물게는 손, 팔, 넓적다리에도 나타난다). 통증은 선-괴저 단계에서 심각한 허열이 지속되고, 그리고 궤양 또는 괴저가 지속된다. 빈번하게, 냉증, 과다한 땀 분비로 명백히 알 수 있는 교감신경 과다 활성과, 관련 사지이 치아노제(혈액이 검게됨)는 아마도 심각하고, 지속적인 통증이 원인이 된다.

한 개 또는 그이상의 손가락에 허혈성 궤양 및 괴저가 질병 초기에 발생할 수 있으나, 급성으로 나타나지는 않는다. 비-침윤성 연구에서 혈행이 심각하게 줄어들고, 병에 걸린 발가락, 발, 손가락에 압박이 나타난다. 질병은 인접한 부분에서 진행된다.

또 다른 말초 맥관 질환이 말초 동맥 질환인데, 하부 극단 말초 동맥 질환(PAD) 환자는 심각한 사지-위협적인 허혈로 진행될 수 있다. 허혈성 통증, 비-치유성 궤양 및 괴저가 나쁜 결과의 전조이다. 이들 환자는 사지를 절단해야할 위험에 처한다. 심각한 사지 허혈의 즉각적인 감지 및 평가와 효과적인 재맥간형성만이 사지를 구할 수 있고, 오랫동안 건강을 유지할 수 있다.

대부분 주로 아테롬성 동맥경화증가 같은 동맥 폐색 질환이 결과가 만성적 위험한 사지 허혈이다. 고혈압, 과콜레스테롤혈증과 연합된 아테롬성 동맥경화증에 추가하여, 흡연 및 당뇨병이 Buerger 질병, 폐색성혈전맥관염, 동맥염의 일부형태를 포함한 만성적 사지 허혈의 원인이 된다.

만성적 위험한 사지 허혈이 발생되려면 통상 조직으로 흐르는 혈류의 량이 급격히 감소되는 다중 동맥 폐색이 있어야 한다. 주요 조직 허혈은 휴식시 통증,비-치유 상처(상처 치유 시에 대사과정이 증가되어야 하기 때문) 또는 조직 괴사 (괴저)등의 임상적으로 명백하게 알 수 있다.

허혈성 휴식기 통증은 통상 발이나 발가락의 둥근 부분에 화끈거리는 통증으로 설명할 수 있는데, 환자가 수면을 위해 침대에 누워있는 밤에 더 심해진다. 허혈성 휴식시 통증은 심장에서 가장 멀리 있고, 동맥 폐색의 말단 조직이 위치하는 발에서 나타난다. 비-치유 상처는 발에 잘 맞지 않는 신발에 의한 발의 외상이나 상처로 인한 부위에서 흔히 볼 수 있다. 상처가 규칙적인 드레싱 교환, 외상을 피하거나, 감염 치료 및 괴사 조직 제거와 같은 지속적인 치료를 4-12주간 시도한 후에도 치료가 안 되는 경우를 말한다.

괴저는 일반적으로 발가락에서 나타난다. 혈액 공급이 매우 낮아 혈액이 공급안되는 대부분의 조직에서 자발적인 괴사가 발생된다.

신중하게 고려된 치료법은 심각한 사지 허혈이 있는 많은 환자에게 유익하나, 이들 질병이 심각한 성질로 인하여 수술을 고려할 수도 있다. 수술로 인한 치료에는 재맥관형성이나 사지 절단 등이 포함된다. 환자가 재맥관형성술을 원하는 경우에, 수용가능한 수술 대기자가 되고, 추가 측정 및 재맥관술 준비를 위해 동맥 촬영을 한다.

일부 의료기관에서는 자성 공명 동맥 촬영을 대체 또는 동맥 촬영술에 보충 기술로 사용하여 염료 노출 위험을 최소화시킨다. 재맥관형성술을 이용한 사지 보존이 비용 측면에서 효과적이고, 대부분 환자에서 더 나은 삶의 질을 제공하고, 절단보다는 치사율이나 수술주변의 질병율이 낮다. 만성적 위험한 사지 허혈 환자의 대부분의 목표가 사지를 절단하지 않고 보존하는 것이다.

재맥관형성술의 실행 가능성은 동맥 촬영으로 나타난 것과 바이패스(bypass) 관의 이용성에 의해 결정된다. 혈관형성술 또는 스텐트 배치 또는 이들 두 가지를 모두 사용하는 것이 파행 환자의 경우 짧고, 기부 병소에 가장 성공적이다. 그러니, 동맥 폐색 질병의 다중 성질로 인하여 위험한 사지 허혈 세팅에 필수적인 처리하고 볼 수는 없다. 이상적인 바이패스 관은 더 큰 복제(saphenous) 정맥이 되나, 다른 관에는 더 작은 복제 정맥, 팔 정맥 또는 전립선 관도 포함된다. 대부분의 외과술에서, 종아리의 3년 바이패스 개방성 비율은 전립선 바이패스의 경우에 40%부터 복제 정맥 바이패스의 경우 85% 범위가 된다. 비교를 위해, 보존 치료 연구에서는 비-치유 상처와 함께 25 내지 40% 성공률과 허혈성 휴식시 통증이 50 내지 80% 개선된 것으로 나타났다.

상당한 조직 괴사, 생명을 위협하는 감염 또는 재맥관 형성을 이용할 수 없는 병소가 있는 특정 환자에서는 절단이 우선이다. 주의 깊게 기다리면서 환자의 상태를 관찰하거나 재맥관 형성을 실행하거나 사지 절단을 결정하는 것은 관찰자가 외과수술과 보존적 처리에 대해 위험과 장점을 주의 깊게 평가하는 것에 따라 달라진다.

더 중요한 것은 선택할 수 있는 것의 침투성 또는 적절함에 대한 환자의 이해에 달려있다. 이들 상태로 인하여 걸을 수 없는 환자도 사지 절단이 부적절하다고 생각할 수 있고, 모든 환자가 절단 후에 재활 훈련을 받을 수 있다고 동기부여를 하지는 않는다. 절단을 하기로 결정했다면, 환자에게 기능을 할 수 있는 재활에최대한의 기회를 제공하면서 최대 치유 가능성을 가지는 절단 수준을 결정해야 한다.

만성적으로 위험한 사지 허혈 진단에는 휴식기에도 통증이 나타나고, 비-치유 상처 및 괴저가 나타난다. 허혈성 휴식기 통증은 환자가 휴식을 취하는 동안에도 발의 말단 또는 아치부분에 화끈거리는 통증을 느끼지만, 환자가 발로 서 있는 경우에는 통증이 경감되는 것이 특징이다. 위험한 사지 허혈 진단을 뒷받침하는 객관적인 혈동학적 변수는 발목-상완 지수가 0.4 또는 그 이하이고, 발목 수축 압력이 50mmHg 또는 그 이하이거나 발가락 수축 압력이 30mmHg 또는 그 이하가 된다. 치료 방법은 보존성 치료, 재맥관형성술 또는 절단 등이 포함된다. 진행성 괴저, 신속하게 확장되는 상처 또는 지속적인 허혈성 휴식시 통증이 사지에 위협이 된다는 것을 말하며, 수술 위험이 없는 환자의 경우에는 재맥관형성술이 필요하다. 위험한 사지 허혈에서 동맥이 좁아지는 다중적 그리고 말단 특징으로 인하여 바이패스 이식편이 항상 필요하다. 당뇨병이 있는 환자는 다른 환자들보다 바이패스 이식편에 덜 적합한 말단 질병을 가진다. 절단과 비교하면, 재맥관형성술이 더 비용측면에서 효과적이고, 수술 주변 발병율이 더 낮고 치사율로 낮다. 위험한 허혈 환자 대부분의 경우에 사지 보존이 목적이 된다.

현재, 말초 맥관 질환의 주요 치료 방법에는 사지 절단의 맥관형성술과 같은 침투성 치료도 포함된다. 아테롬성 플락 진행이 증가되지 않으면서 말초 신맥관형성을 자극하는 약물을 확인하는 것이 이 의료 분야에서 중요하다.

발명의 요약

본 발명은 실험 동물 모델에서 말초 허혈 유도 후에 IL-18 저해제가 신맥관형성을 촉진시킨다는 발견에 근거한다. 신맥관형성은 VEGF/Akt 신호발생과 연합되어 발생되고, 골수 내피 세포 이동 및 분화 증가가 수반된다.

이와 같은 결과에 근거하여, 신맥관형성술 또는 맥관재생술을 요하는 말초 맥관 질환 예방 또는 치료를 위한 새로운 방법을 제공한다.

따라서, 본 발명은 말초 맥관 질환, 특히 말초 허혈 치료 및 예방에 IL-18 저해제를 이용하는 것에 관계한다.

본 발명은 또한 파행 및 괴저 치료 및 예방을 위한 약물 제조에 IL-18 저해제를 이용하는 것에 관계한다.

또한, 본 발명은 절단 특히 사지 절단을 예방하기 위한 약물 제조에 IL-18 저해제를 사용하는 것에 관계한다.

말초 맥관 질환 치료 및 예방을 위해 IL-18 저해제의 코딩 서열로 구성된 발현 벡터와 세포에서 IL-18 저해제의 내생 생산을 유도 및 강화시키는데 발현벡터를 이용하는 것도 본 발명의 범위에 속한다.

본 발명은 IL-18 저해제 효과향을 필요 환자에게 투여하는 것으로 구성된 맥관 질환 치료 방법에 관계한다.

본원 발명은 맥관 질환 분야에 관한다. 좀더 구체적으로, 본원 발명은 말초 맥관 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 IL-18 저해제를 이용하는 것에 관계한다.

도 1: A)는 생쥐에서 대퇴부 동맥 폐색후 3일과 28일에 우측 허혈성 후지(hindlimb) 및 좌측 비-허혈성 후지의 혈관조영사진을 나타낸 것이다. B)는 8 또는 28일동안 pcDNA3-mIL1 8BP(IL-1 813P) 또는 빈(empty) 플라스미드(Control)로 처리된 허혈성/비-허혈성 혈관조영 기록을 나타낸 것이다. 수치는 평균±SEM, 그룹당 n=7. **p<0.01 versus 기준 생쥐.

도 2: A) pcDNA3-mIL1 8BP(IL-1 813P) 또는 빈(empty) 플라스미드(Control)로 처리된 생쥐에서 레이져 Doppler 관주를 이용하여in vivo에서 모니터된 후지의 혈행에서 허혈성-유도된 변화를 나타낸 것이다. 색깔로 나타나는 이미지에서 정상적인 관주는 붉은 색으로 나타나고, 허혈성 후지의 혈행이 급격하게 감소된 것은 청색으로 나타난다. B) 비-허혈성의 경우에 대해 허혈성 사지에서 혈행 비율로 나타낸 혈행의 정량 평가이다. 수치는 평균±SEM, 그룹당 n=7. **p<0.01 versus 기준 생쥐.

도 3: A) 대퇴부 동맥 폐색후 28일째에 비-허혈성 다리와 허혈성 다리에서 VEGF 단백질 함량을 웨서턴 블랏으로 나타낸 것이다. B) 비-허혈성의 경우에 대해 허혈성 사지에서 단백질 함량 비율로 나타낸 VEGF 단백질 수준을 정량 평가한 것이다. 수치는 평균±SEM, 그룹당 n=7. **p<0.01 versus 비허혈성 기준. †p<0.05 versus 허혈성 기준.

도 4: A) 대퇴부 동맥 폐색후 28일째에 비-허혈성 다리와 허혈성 다리에서 인(phospho)-Akt 단백질 함량을 웨스턴 블랏으로 나타낸 것이다. B) 비-허혈성의 경우에 대해 허혈성 사지에서 단백질 함량 비율로 나타낸 인(phospho)-Akt 단백질 단백질 수준을 정량 평가한 것이다. 수치는 평균±SEM, 그룹당 n=7. **p<0.05, **p<0.01 versus 비허혈성 기준. †p<0.05 versus 허혈성 기준.

도 5: A) 대퇴부 동백 봉합사(Sham)가 없는 생쥐 골수에서 분리된 EPCs(내피조상 세포)와 pcDNA3-mIL1 8BP(IL-1 813P) 또는 빈(empty) 플라스미드(Control)로 처리된 생쥐의 골수에서 분리된 EPCs를 나타낸 것이다. EPCs는 AcLDL-Dil와 von-Willebrand factor(vWF)에 대해 이중-양성 착색되는 흡착 세포이다. B) pcDNA3-mIL1 8BP(IL-1 813P) 또는 빈(empty) 플라스미드(Control)로 처리된 생쥐에서 이중-양성 세포를 정량적으로 나타낸 것이다. 수치는 평균±SEM, 그룹당 n=5. ***p<0.01 versus 기준 쥐, †††p<0.001 versus 대퇴부 동맥 봉합사가 없는 생쥐(Sham).

본 발명은 in vivo에서 질병이 있는 생쥐 모델에서 비-허혈성 사지의 혈관 밀도에 영향을 주지 않고 사지 허혈 후에 IL-18 저해제가 허혈후 맥관생성을 상당히 증가시킨다는 발견에 기초한 것이다. 따라서, 본 발명은 조직 관주를 요구하는 말초 맥관 질환을 치료 또는 예방하는 새로운 치료 방법을 제공한다.

본 발명은 말초 맥관 질환 치료 또는 예방을 위한 약물 제조에 IL-18 저해제를 이용하는 것에 관계한다.

본원 발명에서 "예방"은 특정 효과의 완전한 예방을 의미할 뿐만 아니라, 발병 이전이나 발병 초기에 이런 효과를 부분적으로 혹은 실질적으로 예방, 약화, 감소 또는 소멸시키는 것을 의미한다.

본원 발명에서 "치료"는 발병이후 병리학적 발생의 약화, 감소 또는 소멸을 비롯한 질환의 진행에 대한 임의의 유익한 효과를 의미한다.

여기에서 언급하는 "말초 맥관 질환"은 사지의 동맥, 정맥, 임차에 영향을주는 질병을 말한다. 말초 맥관 질환에는 동맥(기능성 또는 폐색성), 정맥, 복합 동정맥(가령 동정맥류 누관) 또는 임파성 질환이다. 폐색성 동맥 질환에는 말초 동맥 폐색 및 Buerger 질환(폐색성 혈전 맥관염 폐색이라고도 함)이 포함된다. 기능성 동맥 질환은 혈관 경련(Raynaud 현상 및 질환, 선단자람증) 또는 맥관 확장(피부홍통증)이 될 수 있다. 이는 혈관에서 국소적 결함 또는 교감신경계활성에 장애 다음으로 심각하다. 정맥 질환에는 정맥 혈전증, 정맥류 정맥이 포함되고, 복합 동정맥류 질환에는 동정맥류 누관이 포함되고, 임파성 질환에는 임파수종 및 지방성 수종이 포함된다.

본원에서 "허혈성 말초 맥관 질환"에는 "본원 발명의 배경 기술"에 상세하게 기술된 모든 의학적 징후, 질환 및 증상이 포함된다.

본원 발명에서 "IL-18 저해제"은 IL-18 생산을 약화, 감소, 또는 부분적으로, 실질적으로 혹은 완전히 예방/차단하는 방식으로 IL-18 생산을 조절하는 임의의 분자를 의미한다.

생산 저해물질은 IL-18의 합성, 가공 또는 성숙에 부정적인 영향을 주는 임의의 분자일 수 있다. 본원 발명에 따른 이런 저해물질은 예로써 인터루킨 IL-18유전자의 발현 저해물질, IL-18 mRNA의 전사를 감소시키거나 예방하는 또는 상기 mRNA의 분해를 유도하는 안티센스 mRNA, 정확한 접힘을 손상시키는 단백질, IL-18의 성숙이나 분비를 부분적으로 혹은 실질적으로 예방하는 단백질, 일단 합성된 IL-18을 분해시키는 프로테아제, 카스파제-1 저해물질과 같이 성숙 IL-18을 만들기 위하여 프로-IL-18을 절단하는 프로테아제의 저해물질 등일 수 있다.

IL-18 작용의 저해물질은 예로써 IL-18 길항제일 수 있다. 길항제는 리간드(예, 수용체)에 대한 IL-18 결합을 담당하는 IL-18이나 IL-18 결합부위를 부분적으로 혹은 실질적으로 중화시킬 수 있을 정도로 충분한 친화성과 특이성으로 IL-18 분자 자체와 결합하거나 이를 격리시킬 수 있다. 길항제는 IL-18/수용체 결합 직후에 세포내에서 활성화되는 IL-18 신호 경로를 저해할 수도 있다.

IL-18 작용의 저해물질은 가용성 IL-18 수용체나 이를 모방하는 분자, IL-18 수용체를 차단하는 약물, 다클론이나 단클론 항체와 같은 IL-18 항체, 또는 표적에 대한 IL-18의 결합을 예방하는 임의의 약물이나 분자일 수도 있는데, 이들은 IL-18에 의해 매개되는 세포내 혹은 세포외 반응을 감소시키거나 또는 이의 유인을 예방한다.

본 발명의 구체예에서 말초 맥관 질환은 말초 동맥 질환이다.

"말초 동맥 질환"은 팔에서 다리의 대동맥 및 동맥의 어느 부위에서건 동맥이 좁아지는 질병이다. 이는 갑자기 또는 점진적으로 진행되어 허혈로 나타난다(혈관이 산소 공급을 잘 하지 못하는 부위에서).

본 발명에 따르면, 말초 동맥 질환은 사지 하부에 관계한다. 말초 동맥 질환 또는 폐색은 만성이거나 급성으로 나타날 수 있다. 말초 동맥 질환은 파행과 흔히 함께 나타난다.

따라서, 본 발명은 파행 치료 및 예방에 IL-18 저해제를 이용하는 것에도 관계한다. 파행은 다리 특히 종아리에 통증으로 절룩거리게 되는 것을 말한다. 파행은 일반적으로 걸을 때 느끼고 휴식시에는 그 느낌이 가라앉는다. 따라서, 흔히 간헐적 파행이라고도 한다. 파행의 통증이 간헐적인 성질을 띄는 것은 다리 근육으로 산소 공급이 일시적으로 부적절하게 감소되기 때문이다. 이와 같은 열악한 산소 공급으로 인하여 다리에 혈액을 공급하는 동맥이 좁아지거나 폐색된다.

이는 다리 근육으로 산소 공급을 제한하고, 근육의 산소 요구는 운동이나 보행시에 일어나기 때문에 운동 및 보행 시에 느낀다.

본 발명의 적절한 구체예에서, 말초 맥관 질환은 Buerger 질환(폐색성 혈전맥관염 폐색)인데, 20 내지 40대의 흡연 남성에서 주로 나타나는 소혈관 또는 중간 크기의 동맥 및 정맥에 염증 변화를 특징으로 하는 폐색성 질환이다.

이 질병은 작은, 중간 규모 동맥이 관련되고, 부분적인 양상으로 사지의 표면 정맥이 종종 연관되기도 한다.

추가 적절한 구체예에서, 말초 맥관 질환은 말초 허혈 특히 사지의 허혈이다. "허혈"은 혈관 폐색 또는 외상으로 인하여 일반적으로 혈액 공급이 부족한 것을 말한다. "말초 허혈"은 특히 팔 또는 다리 등에 조직으로 산소 공급이 부족하게 되는 사지에 허혈을 말한다.

본 발명의 추가 구체예에서, 사지 허혈은 위험한 사지 허혈이다. "위험한 사지 허혈"은 사지로 혈액 공급이 부족하여 생존이 위협받는 상태를 말한다. 휴식시에 통증, 궤양 또는 괴저가 있는 경우 위험한 사지 허혈을 암시하는 것이다. 괴저는 죽은 조직을 설명할 때 사용되는 용어로써, 사지 허혈과 함께 또는 복합되어 나타난다. 허혈성 궤양도 부적절한 혈액 공급이 원인이 된다.

괴저 또는 궤양을 포함하는 위험한 사지 허혈의 경우 사지 절단을 방지하기위해서는 재맥관형성술을 해야한다. 따라서, 본 발명은 괴저 또는 궤양의 치료 또는 예방에 IL-18 저해제를 이용하는 것에 관계한다.

말초 맥관 질환의 최종 결과 및 말초 허혈의 경우에 감염 사지, 특히 병든 하부 사지 또는 발을 절단해야할 수도 있다. 재맥관형성술로 병든 조직에 재관주를 시킬 수 있어, 치료 과정을 지원할 수 있다.

따라서, 본 발명은 사지 절단 특히 하부 사지, 발 또는 발가락 절단을 예방하기 위한 약물 제조에 IL-18 저해제를 이용하는 것에 관계한다.

본원 발명의 적절한 구체예에서, IL-18 저해제는 ICE-저해물질, IL-18에 대한 항체, IL-18 수용체 아단위중 임의 한가지에 대한 항체, IL-18 수용체 신호 경로의 저해물질, IL-18과 경합하고 IL-18 수용체를 차단하는 IL-18의 길항제, IL-18 결합단백질, 동소체, 뮤테인, 융합단백질, 기능유도체, 활성 단편 또는 IL-18의 생물 활성을 저해하는 이들의 순환 치환된 유도체에서 선택된다.

"IL-18 결합단백질"은 본원에서 IL-18BP와 동의어로 사용된다. 여기에는 Kim et al., 2000에 정의된 IL-18 결합단백질의 접합변이체 또는 동소체를 비롯하여 WO 99/09063 또는 Novick et al., 1999에 정의된 IL-18 결합단백질이 포함된다. 특히, 본원 발명에서 IL-18BP의 사람 동소체 a와 c가 유용하다. 본원 발명에 효과적인 단백질은 당화되거나 또는 당화되지 않을 수 있고, 천연 공급원(예, 소변)으로부터 유래되거나 또는 재조합 방식으로 만들 수 있다. 재조합 발현은 원핵 발현계(예, 대장균(E. coli)) 또는 진핵, 특히 포유동물 발현계에서 실시할 수 있다. 포유 동물 단백질 발현에 특히 적합한 세포주는 차이니즈 헴스터 오버리(CHO) 세포주이다.

본원에서 "뮤테인"은 IL-18BP의 유사체 혹은 바이러스성 IL-18BP의 유사체를 말하는데, 여기서 고유 IL-18BP 혹은 바이러스성 IL-18BP의 아미노산 잔기중 적어도 하나가 상이한 아미노산 잔기로 치환되거나 결실되고, 대안으로 1개이상의 아미노산 잔기가 IL-18BP 혹은 바이러스성 IL-18BP의 고유 서열에 부가되는데, 이때 야생형 IL-18BP 혹은 바이러스성 IL-18BP과 비교하였을 때 생성된 산물의 능력에 큰 변화가 없다. 이와 같은 뮤테인은 공지된 합성 방법이나 특정부위-돌연변이유발 기술, 또는 임의의 다른 공지된 적절한 기술을 활용하여 만들 수 있다.

본원 발명에서 뮤테인에는 엄격한 조건하에 핵산, 예를 들면 본원 발명에 따른 IL-18BP 또는 바이러스 IL-18BP를 인코드하는 DNA나 RNA와 혼성화되는 DNA나 RNA에 의해 인코드되는 단백질이 포함된다. "엄격한"은 혼성화 및 후속 세척 조건을 의미한다(Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, supra, Interscience, N.Y., &&6.3 and 6.4(1987, 1992); Sambrook et al., supra.). 제한없이, 엄격한 조건의 예에는 조사중인 하이브리드의 계산된 Tm이하의 12-20℃ 세척 조건, 예를 들면 5분동안 2 x SSC와 0.5% SDS, 이후 15분동안 2 x SSC와 0.1% SDS; 30-60분동안 37℃에서 0.1 x SSC와 0.5% SDS, 이후 30-60분동안 68℃에서 0.1 x SSC와 0.5% SDS. 당업자가 인지하는 바와 같이 엄격한 조건은 DNA 서열, 올리고뉴클레오티드 프로브(예, 10-40개 염기) 또는 혼성 올리고뉴클레오티드 프로브의 길이에도 좌우된다. 혼성 프로브가 이용되면, SSC 대신에 테트라메틸 염화암모늄(TMAC)을 사용하는 것이 바람직하다(Ausubel, supra.).

임의의 이런 뮤테인은 IL-18BP 혹은 바이러스성 IL-18BP의 서열과 충분히 유사한 아미노산 서열을 가지기 때문에, IL-18BP와 실제 유사한 활성을 가진다. IL-18BP의 한 가지 활성은 IL-18에 결합하는 능력이다. 뮤테인이 IL-18에 대하여 실제적인 결합 활성을 보유하는 경우에, 이는 친화성 크로마토그래피와 같은 수단으로 IL-18의 정제에 사용될 수 있고, IL-18BP와 실제 동일한 활성을 가지는 것으로 간주될 수 있다. 따라서, 통상적인 실험방법으로 임의의 뮤테인이 IL-18BP와 실질적으로 동일한 활성을 가지는 지를 결정할 수 있는데, 상기 실험방법은 적절히 라벨된 IL-18과 뮤테인이 결합하는 지를 측정하는 간단한 샌드위치 경합 분석 단계, 예를 들면 방사능면역검사 또는 ELISA 분석에 이런 뮤테인을 적용하는 단계로 구성된다.

적절한 구체예에서, 이런 뮤테인은 WO 99/09063에서 규정된 바와 같이 IL-18BP 또는 바이러스-인코드된 IL-18BP 상동체의 서열과 적어도 40% 동일성 또는 상동성을 갖는다. 좀더 적절하게는, 이는 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 가장 바람직하게는 적어도 90% 동일성 또는 상동성을 갖는다.

본원 발명에 사용될 수 있는 IL-18BP 폴리펩티드 혹은 바이러스성 IL-18BP의 뮤테인, 또는 이를 인코드하는 핵산에는 본원에 제시된 내용에 따라 과도한 실험없이 당업자가 용이하게 수득할 수 있는 치환된 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드와 같은 일단의 실질적으로 상응하는 서열이 포함된다.

본원 발명에 따른 뮤테인에 대한 적절한 변화는 "보존성" 치환이다. IL-18BP 폴리펩티드 혹은 단백질 또는 바이러스성 IL-18BP의 보존성 아미노산 치환에는 분자의 생물학적 기능을 보존하면서 유사한 물리화학적 성질을 가지는 일군의 동질성 아미노산이 포함된다(16). 기능의 변화없는 아미노산의 부가 또는 결실이 상기 정의된 서열에서 이루어질 수 있는데, 특히 30개 이하, 적절하게는 10개 이하의 아미노산이 부가 또는 결실되고, 기능적 구조에 중요한 아미노산(시스테인 잔기)이 결실 또는 치환되지 않는 경우에 기능 변화 없는 아미노산의 부가 또는 결실이 가능하다. 이런 결실/부가에 의해 만들어지는 단백질 및 뮤테인은 본원 발명의 목적에 포함된다.

바람직한 동질성 아미노산 군은 표 1에 제시한다. 좀더 바람직한 동질성 아미노산 군은 표 2에 제시한다; 가장 바람직한 동질성 아미노산 군은 표 3에 제시한다.

본원 발명에 사용될 수 있는 IL-18BP 폴리펩티드이나 단백질의 뮤테인 또는바이러스성 IL-18BP의 뮤테인을 수득하는데 활용할 수 있는 단백질에서 아미노산의 치환체를 만드는 방법의 예에는 임의의 공지된 방법이 포함되는데, 이들 방법은 가령 미국 특허 RE 33,653, 4,959,314, 4,588,585, 4,737,462(Mark et al); 5,116,943(Koths et al.,) 4,965,195(Namen et al.,); 4,879,111(Chong et al.,); 5,017,691(Lee et al.,); 리신이 치환된 경우는 미국 특허 4,904,584(Shaw et al.,)에서 제시한다.

"융합단백질"은 체액에서 연장된 머무름 시간을 갖는 다른 단백질과 융합된 IL-18BP, 바이러스성 IL-18BP 또는 이들의 뮤테인으로 구성되는 폴리펩티드를 의미한다. 따라서, IL-18BP 또는 바이러스성 IL-18BP는 다른 단백질, 폴리펩티드 등, 예를 들면, 면역글로불린 또는 이의 단편과 융합될 수 있다.

본원에서 "기능성 유도체"에는 IL-18BP 혹은 바이러스성 IL-18BP의 유도체, 이들의 뮤테인, 융합된 단백질이 포함되고, 이들은 당분야에 공지된 수단으로 잔기 또는 N- 혹은 C-말단기에 측쇄로 생성되는 작용기로부터 만들 수 있는데, 이들이 제약학적으로 수용가능하면, 다시 말하면 IL-18BP 혹은 바이러스성 IL-18BP의 활성과 실질적으로 유사한 단백질의 활성을 파괴하지 않고 이를 함유하는 조성물에 독성 성질을 공여하지 않는다면 본원 발명에 포함된다.

가령, 이들 유도체에는 폴리에틸렌 글리콜 측쇄가 포함되는데, 이는 항원성 부위를 차단하고 체액에서 IL-18BP 혹은 바이러스성 IL-18BP의 체류를 연장시킬 수 있다. 다른 유도체에는 카르복실기의 지방족 에스테르, 암모니아 또는 일ㆍ이차 아민과의 반응에 의한 카르복실기의 아마이드, 아실 성분(가령, 알카노일 또는 카르보사이클릭 아로일 작용기)으로 형성된 아미노산 잔기의 유리 아미노기의 N-아실 유도체 또는 아실 성분으로 형성된 유리 하이드록실기(가령, 세릴 또는 테레오닐 잔기)의 O-아실 유도체등이 포함된다.

본원 발명에서 IL-18BP 혹은 바이러스성 IL-18BP, 뮤테인, 융합단백질의 "활성 분취물"에는 단독으로 또는 관련된 분자 혹은 이에 결합된 잔기(예, 당이나 인산염 잔기, 또는 단백질 분자나 당 잔기의 자체적인 응집체)와 조합된 단백질 분자의 폴리펩티드 사슬의 임의 단편이나 전구물질이 포함되는데, 단 이런 단편은 IL-18BP와 실질적으로 유사한 활성을 보유해야 한다.

본원 발명의 다른 적절한 구체예에서, IL-18 저해제는 IL-18이나 이의 수용체, IL-18R을 지향하는 항체이다. IL-18 아단위, 다시 말하면 IL-18Rα와 β를 지향하는 항체가 본원 발명에 사용될 수 있다.

본원 발명의 따른 항체는 다클론이나 단클론, 키메라, 인화 또는 사람 항체이다. 재조합 항체와 이의 단편은 생체내에서 IL-18에 대한 높은 친화성 결합 및 낮은 독성으로 특성화된다. 본원 발명에 사용될 수 있는 항체는 낮은 독성으로 병리 질환이나 이와 관련된 여러 증상을 효과적으로 저하 또는 완화시킬 만큼 충분한 기간동안 환자를 치료할 수 있는 능력으로 특성화된다.

중화 항체는 IL-18 면역주사로 토끼, 염소 또는 생쥐와 같은 동물에서 생성시킨다. 면역화된 생쥐는 하이브리도마 제조를 위한 B 세포의 공급원을 제공하는데 특히 유용한데, 상기 하이브리도마는 배양하여 다량의 항-IL-18 단클론항체를 생산한다.

키메라 항체는 상이한 동물 종으로부터 유래된 2개이상의 분절 또는 일부분으로 특징지어지는 면역글로불린 분자다. 일반적으로, 키메라 항체의 가변 영역은 비-사람 포유동물 항체, 예를 들면 뮤린 단클론항체로부터 유래되고, 면역글로불린 불변 영역은 사람 면역글로불린 분자로부터 유래된다. 가급적, 양 영역 및 이들의 조합은 일반적으로 낮은 면역원성을 갖는다(Elliott et al., 1994). 인화 항체는 유전공학 기술로 만들어진 면역글로불린 항체로, 여기서 뮤린 불변 영역은 사람 불변 영역으로 대체되고 뮤린 항원 결합 영역은 계속 잔존한다. 생성된 생쥐-사람 키메라 항체는 사람에서 낮은 면역원성 및 향상된 약동학을 보유한다(Knight et al., 1993).

따라서, 다른 적절한 구체예에서 IL-18이나 IL-18R 항체는 인화 항체이다. 바람직한 항-IL-18 인화 항체의 예는 유럽 특허 출원 EP 0 974 600에서 기술한다.

다른 적절한 구체예에서, IL-18 항체는 완전한 사람 항체다. 사람 항체를 생산하는 기술은 WO 00/76310, WO 99/53049, US 6,162,963 또는 AU5336100에서 자세히 기술한다.

완전한 사람 항체를 제조하는 한가지 방법은 생쥐 체액 면역계의 "인화", 다시 말하면 내생적 Ig 유전자가 불활화된 생쥐에 사람 면역글로불린(Ig) 좌위의 도입으로 사람 Ig을 생산할 수 있는 생쥐 종(이종유전자도입생쥐)의 생산으로 구성된다. Ig 좌위는 물리적 구조와 유전자 재배열 및 광범위한 면역 반응을 궁극적으로 유도하는데 필요한 발현 과정의 측면에서 복합적이다. 항체 다양성은 Ig 좌위에 존재하는 서로 상이한 V, D, J 유전자간 조합 재배열에 의해 주로 발생한다. 이들좌위는 또한, 산재된 조절 요소를 보유하는데, 이들은 항체, 발현 대립인자 배제, 분류군 전환(class switching), 친화도 증진을 조절한다. 재배열되지 않은 사람 Ig 전이유전자의 생쥐 도입은 생쥐 재조합 조작이 사람 유전자에도 적합함을 입증하였다. 또한, 다양한 이소타입의 항원 특이적 hu-mAB를 분비하는 하이브리도마는 항원으로 이종유전자도입생쥐 면역화에 의해 수득될 수 있다.

완전한 사람 항체 및 이들의 생산 방법은 당분야에 공지되어 있다(Mendez et al(1997); Buggemann et al(1991); Tomizuka et al.,(2000); Patent WO 98/24893).

본원 발명의 좀더 적절한 구체예에서, IL-18 저해제는 IL-18BP, 동소체, 뮤테인, 융합단백질, 기능성 유도체, 활성 단편 또는 이들의 순환 치환된 유도체이다. 이들 동소체, 뮤테인, 융합단백질 또는 기능성 유도체는 IL-18BP의 생물학적 활성, 특히 IL-18에 대한 결합능력을 유지하고, IL-18BP와 적어도 유사한 활성을 보유한다. 이상적으로는, 이런 단백질은 변형되지 않은 IL-18BP와 비교하여 증가된 생물학적 활성을 갖는다. 적절한 활성 단편은 IL-18BP의 활성보다 좀더 높은 활성, 바람직하게는 좀더 높은 안정성 또는 좀더 낮은 독성이나 면역원성을 보유하거나, 대량으로 좀더 용이하게 생산 또는 정제된다.

IL-18BP의 서열 및 이의 접합변이체/동소체는 (Kim et al., 2000)뿐만 아니라, WO 99/09063 또는 (Novick et al., 1999)에서 구할 수 있다.

IL-18BP의 기능성 유도체는 중합체에 공액시켜 단백질의 특성, 예를 들면 안정성, 반감기, 생체이용효율, 사람 신체에 의한 내약성 또는 면역원성을 향상시킬 수 있다. 이를 달성하기 위하여, IL-18BP는 폴리에틸렌글리콜(PEG)에 결합시킬 수있다. PEG화(PEGlaytion)는 WO 92/13095에서 밝힌 방법으로 실시할 수 있다.

따라서, 본원 발명의 적절한 구체예에서 IL-18 저해제, 특히 IL-18BP는 PEG화된다.

본원 발명의 다른 적절한 구체예에서, IL-18 저해제는 IL-18 결합단백질의 전체 또는 일부분으로 구성되는 융합단백질로, 이는 면역글로불린의 전체 또는 일부분과 융합된다. 생성된 융합단백질은 IL-18BP의 생물학적 활성, 특히 IL-18에 대한 결합능력을 계속 유지한다. 융합은 직접적으로, 또는 짧게는 1 내지 3개 아미노산 잔기 혹은 이보다 긴, 예를 들면 13개 아미노산 잔기의 링커 펩티드를 통하여 달성할 수 있다. 상기 링커는 삼중항 IL-18BP 서열과 면역글로불린 서열간에 도입된 펩티드 서열 E-F-M(Glu-Phe-Met) 또는 13개 아미노산 링커 서열 Glu-Phe- Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met이다. 생성된 융합단백질은 체액에서 체류 시간(반감기) 연장, 특이적 활성 증가, 발현 수준 증가 또는 융합단백질의 용이한 정제와 같은 향상된 특성을 보유한다.

적절한 구체예에서, IL-18BP는 Ig 분자의 불변 영역에 융합된다. 바람직하게는, 이는 예로써 사람 IgG1의 CH2와 CH3 도메인과 같은 중쇄 영역에 융합된다. IL-18BP 및 면역글로불린의 일부분으로 구성되는 특이적 융합단백질의 생산은 WP 99/09063(실시예 11)에서 기술한다. Ig 분자의 다른 동소체는 본원 발명에 따른 융합단백질, 예를 들면 동소체 IgG₂혹은 IgG₄, 또는 다른 Ig(IgM, IgA)의 생산에도 적합하다. 융합 단백질은 단량체 또는 다량체(헤테로- 혹은 동종-)일 수 있다.

본원 발명의 또 다른 구체예에서, IL-18 저해제는 본 발명의 임상적 상태에서 기관지확장제, Ca-차단제, 아스피린, 베타-차단제 또는 이와 유사한 한가지 이상의 다른 분자와 복합하여 사용된다. TNF 길항물질은 여러 방식으로 활성을 나타낸다. 먼저, 길항물질은 TNF 수용체 결합을 담당하는 TNF 에피토프를 부분적으로 또는 실질적으로 중화시키는데 충분한 친화성과 특이성으로 TNF 분자 자체와 결합하거나 또는 이를 격리시킬 수 있다(이후, "격리 길항물질"). 격리 길항물질은 예로써 TNF에 대한 항체일 수 있다.

대안으로, TNF 길항물질은 TNF 결합이후에 세포표면 수용체에 의해 활성화되는 TNF 신호 경로를 저해할 수 있다(이후, "신호 길항물질"). 이들 길항물질은 말초 맥관 질환의 치료에서 단독으로 사용하거나 또는 IL-18 저해제와 병용한다. TNF 길항물질은 시험관내에서 영향을 쉽게 받는 세포주, 예를 들면 TNF가 증식과 면역글로불린 분비를 유발하는 사람 B 세포에서 고유 TNF의 활성에 대한 효과를 일반적인 후보 스크리닝으로 확인하고 평가한다. 상기 분석에는 다양하게 희석된, 예를 들면 분석에 이용된 TNF 몰농도의 0.1 내지 100배 몰농도의 후보 길항물질의 TNF 제형 및 TNF가 없거나 길항물질만 있는 대조군이 포함된다(Tucci et al., 1992).

격리 길항물질은 본원 발명에 사용하는데 적합한 TNF 길항물질이다. 격리 길항물질 중에서, 높은 친화성으로 TNF와 결합하고 낮은 면역원성을 보유하는 폴리펩티드가 바람직하다. 가용성 TNF 수용체 분자 및 TNF에 대한 중화 항체가 특히 바람직하다. 가령, 가용성 TNF-RI과 TNF-RII가 본원 발명에 유용하다. 수용체의세포외 도메인 또는 이들의 기능성 일부분을 포함하는 이들 수용체의 절두형은 본원 발명에 특히 바람직한 길항물질이다. 절두된 가용성 TNF I형 수용체와 II형 수용체는 EP914431에 기술한다.

TNF 수용체의 절두형은 가용성이고 소변과 혈청에서 30kDa와 40kDa TNF 저해 결합단백질로 검출되는데, 이들은 각각 TBPI과 TBPII라고 한다(Engelmann et al., 1990). 본원 발명에서 TNF 길항물질 및/또는 인터페론과 IL-18 저해제의 동시, 순차적 또는 개별적 사용이 바람직하다.

다른 적절한 구체예에서, 사람 가용성 TNF-RI(TBPI)는 본원 발명에 따라 사용되는 TNF 길항물질이다. 고유와 재조합 가용성 TNF 수용체 분자 및 이들의 생산 방법은 유럽 특허 EP308 378; EP 398 327; EP 433 900에서 기술한다.

수용체의 분자의 유도체, 단편, 영역, 생물학적 활성 부분은 본원 발명에 사용될 수 있는 수용체 분자와 기능적으로 유사하다. 수용체 분자의 이런 생물학적 활성 균등물이나 유도체는 폴리펩티드, 또는 수용체 분자를 인코드하는 서열의 일부분을 의미하는데, 이는 충분한 크기를 가지며 막-결합된 TNF 수용체와의 상호작용을 저해 혹은 차단하는 정도의 친화성으로 TNF와 결합할 수 있다.

IL-18 저해제는 TNF 저해물질과 동시에, 순차적으로 또는 개별적으로 사용될 수 있다.

본원 발명의 적절한 구체예에서, IL-18 저해제는 대략 0.001 내지 100 ㎎/㎏, 대략 1 내지 10 ㎎/㎏, 또는 2 내지 5 ㎎/㎏의 함량으로 사용된다.

적절하게는, 본원 발명에 따른 IL-18 저해제는 피하 또는 근육내 루트를 통하여 전신 투여된다. 매일 또는 하루 걸러 한번씩 투여할 수 있다. 지연 방출 조제물을 이용하여 예를 들면 일주일에 한번씩 투여 횟수를 줄이는 것도 가능하다.

더 나아가, 본원 발명은 말초 맥관 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 약물의 제조에서 IL-18 저해제의 코딩 서열을 포함하는 발현 벡터의 용도에 관한다. 따라서, IL-18 저해제가 필요한 부위에 이를 전달하는데 유전자 치료 방식이 고려된다. 말초 맥관 질환을 치료 및/또는 예방하기 위하여, IL-18 저해제의 서열을 포함하는 유전자 치료 벡터는 병든 조직에 직접 주사하여, 유전자 치료 벡터의 전신 투여와 관련된 문제, 예를 들면 벡터의 희석, 표적 세포나 조직으로의 도달과 표적화, 부작용을 회피할 수 있다.

정상 상태에서는 IL-18 저해제의 발현이 중단되는 또는 충분한 함량의 저해물질을 발현하지 못하는 세포에서 IL-18 저해제의 내생적 생산을 유도 및/또는 강화하기 위한 벡터의 용도 역시 본원 발명에 포함된다. 상기 벡터는 IL-18 저해제를 발현하도록 소요의 세포에서 작동하는 조절 서열을 포함한다. 이런 조절 서열은 프로모터 또는 인헨서일 수 있다. 이후, 조절 서열은 동종 재조합으로 게놈의 정확한 좌위에 도입할 수 있는데, 여기서 이런 조절 서열은 발현을 유도 혹은 강화시켜야 하는 유전자에 동작가능하도록 연결된다. 이런 기술은 "내생적 유전자 활성화(EGA)"라 한다(WO 91/09955).

당업자가 인지하는 바와 같이 동일 기술을 활용하여, 다시 말하면 네거티브 조절 요소(예, 억제 인자)를 IL-18의 유전자 좌위에 도입하여 IL-18 발현을 차단하고, 따라서 IL-18 발현을 하향-조절 또는 예방하는 것이 가능하다. 당업자가 인지하는 바와 같이 IL-18 발현의 이런 하향-조절 또는 억제는 질환을 예방 및/또는 치료하기 위한 IL-18 저해제의 이용과 동일한 효과를 갖는다.

또한, 본원 발명은 말초 맥관 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 약물의 제조에서 IL-18의 저해물질을 생산하도록 유전자 조작된 세포의 용도에 관한다.

본원 발명에 사용될 수 있는 IL-18 저해제는 선택적으로 TNF 저해물질 또는 말초 맥관 질환에 활성이 있는 다른 약물의 치료요법적 효과량과 함께, 제약학적 조성물로 투여될 수 있다.

IL-18BP 및 이의 동소체, 뮤테인, 융합단백질, 기능적 유도체, 활성 분취물 또는 순환 치환된 유도체는 제약학적 조성물의 바람직한 활성 성분이다.

"제약학적으로 수용가능한"은 활성 성분의 생물학적 효능을 방해하지 않고 투여된 숙주에 독성을 보이지 않는 임의의 담체를 의미한다. 가령, 장관외 투여에서 활성 단백질은 식염수, 덱스트로스 용액, 혈청 알부민, 링거액과 같은 부형제에 녹인 주사용 단위 약형 형태로 만들 수 있다.

본원 발명에 따른 제약학적 조성물의 활성 성분은 다양한 방법으로 개체에 투여할 수 있다. 투여 경로에는 피내, 경피(예, 서방 제형), 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 경구, 경막외, 표면, 비강내 경로가 포함된다. 치료요법적으로 유효한 임의의 투여 경로, 예를 들면 상피나 내피 조직을 통한 흡수 또는 활성 성분을 인코드하는 DNA 분자를 환자에 투여하고(예, 벡터를 통하여) 상기 DNA 분자가 생체내에서 활성 성분을 발현 및 분비하는 유전자 요법을 활용할 수 있다. 이에 더하여, 본원 발명에 따른 단백질은 제약학적으로 수용가능한 계면활성제, 부형제, 담체, 희석제, 운반체와 같은 다른 생물학적 활성 성분과 함께 투여될 수 있다.

장관외(예, 정맥내, 피하, 근육내) 투여에서, 활성 단백질은 제약학적으로 수용가능한 장관외 운반체(예, 물, 식염수, 덱스트로스 용액) 및 등장성(예, 만니톨) 또는 화학적 안정성(예, 방부제와 완충제)을 유지시키는 첨가제와 혼합된 용액, 현탁액, 에멀젼 또는 동결건조된 분말 형태로 만들 수 있다. 상기 제형은 통상의 기술로 멸균한다.

본원 발명에 따른 활성 단백질의 생체이용효율은 사람 체내에서 분자의 반감기를 증가시키는 공액 과정으로, 예를 들면 상기 분자에 폴리에틸렌글리콜을 부착시켜 개선할 수 있다(PCT 특허 출원 WO 92/13095).

치료요법적 효과량의 활성 단백질은 길항물질의 유형, IL-18에 대한 길항물질의 친화성, 길항물질에 의한 임의 잔기의 세포독성, 투여 경로, 환자의 임상적 상태(내생적 IL-18 활성의 비-독성 수준의 유지 필요성 포함)를 비롯한 다양한 변수의 함수다.

"치료요법적 효과량"은 IL-18의 생물학적 활성을 저해하는 IL-18 저해제 복용량이다. 개체에 투여된 단일 또는 다중 복용량은 IL-18 저해제 약동학, 투여 경로, 환자 상태와 특성(성별, 연령, 체중, 건강, 크기), 증상의 정도, 병행 치료법, 치료 빈도, 소요 효과를 비롯한 다양한 인자에 따라 변한다. 개체에서 IL-18의 저해를 측정하는 시험관내와 생체내 방법을 비롯하여, 기존 용량 범위의 조정은 당업자에게 공지된 것이다.

본원 발명에 따라, IL-18 저해제는 체중 ㎏당 대략 0.001 내지 100 ㎎, 대략0.01 내지 10 ㎎, 대략 0.1 내지 5 ㎎, 1 내지 3 ㎎, 또는 2 ㎎ 함량으로 사용된다.

본원 발명에서 바람직한 투여 경로는 피하 경로를 통한 투여다. 본원 발명에서 좀더 바람직한 투여 경로는 근육내 투여다. IL-18 저해제를 작용 부위에 직접 투여하기 위하여, 이의 국소 투여도 바람직하다.

다른 적절한 구체예에서, IL-18의 저해물질은 매일 또는 격일로 투여된다.

일일 복용량은 분할 분량으로 또는 소요 결과를 달성하는데 효과적인 지속 방출 형태로 제공한다. 2차 또는 후속 투여는 개체에 투여된 초기분량이나 이전 분량과 동일한, 이보다 적은 또는 이보다 많은 복용량으로 실시될 수 있다. 2차 또는 후속 투여는 발병동안 또는 발병이전에 실시될 수 있다.

본원 발명에 따른 IL-18 저해제는 치료요법적 효과량의 다른 섭생이나 약물(예, 다중 약물 요법), 특히 TNF 저해물질 및/또는 다른 심장보호제에 앞서, 동시에 또는 순차적으로 예방이나 치료 목적으로 투여될 수 있다. 다른 치료 약물과 동시에 투여되는 활성 약물은 동일하거나 상이한 조성물로 투여될 수 있다.

본원 발명은 제약학적 조성물의 제조 방법에 관하는데, 상기 방법은 IL-18 저해제 및/또는 TNF 길항물질의 효과량을 제약학적으로 수용가능한 담체와 혼합하는 단계로 구성된다.

본원 발명은 또한, 말초 맥관 질환을 치료하는 방법에 관하는데, 상기 방법은 선택적으로 TNF 길항물질의 제약학적 효과량과 함께, IL-18 저해제의 제약학적 효과량을 환자에 투여하는 단계로 구성된다.

본원의 상세한 설명에 비추어, 본원 발명은 과도한 실험없이 본원 발명의 기술적 사상과 범주를 벗어나지 않는 광범위한 등가의 파라미터, 농도, 조건에서 동일하게 실시할 수 있다.

본원 발명을 특정 구체예와 연계하여 기술하였지만, 추가적인 개변이 가능하다. 본 출원에는 본원 발명의 원칙을 전반적으로 따르고 본원 발명이 속하는 분야의 당업자가 용이하게 유추할 수 있는 본원 발명의 임의 변용, 활용 또는 적용이 포함된다.

논문이나 초록, 공개되거나 공개되지 않은 특허 출원, 특허 혹은 외국 특허, 또는 임의 다른 자료를 비롯한 본원에 언급된 모든 자료, 예를 들면 모든 데이터, 표, 도면 및 언급된 자료에 제시된 참고문헌은 여기에 순전히 참고로 한다.

공지된 방법 단계, 통상적인 방법 단계, 공지된 방법 또는 통상적인 방법에 대한 참고문헌은 본원 발명의 임의 측면, 설명 또는 구체예가 선행 기술에 개시, 설시 또는 제안되었음을 인정하는 것이 아니다. 이에 덧붙여, 본원에 언급된 참고문헌의 전체내용은 순전히 참고로 한다.

특정 구체예의 전술한 설명에서는 본원 발명의 전반적인 특성을 제시하는데, 당업자는 통상적인 지식을 활용하여 과도한 실험없이 본원 발명의 기술적 사상과 범주를 벗어나지 않는 범위에서 이런 특정 구체예를 용이하게 개변할 수 있다. 따라서, 이런 개변은 본원에 제시된 내용에 기초하여 개시된 구체예의 균등물 범위에 속한다. 본원에서 사용된 용어는 본원을 설명하기 위한 것으로, 이를 제한하지 않으며, 본원에 개시된 내용에 비추어 당업자가 통상적인 지식으로 이해할 수 있다.

실시예 1: IL-18 저해제는 말초 허혈을 감소시킨다.

방법:

후지 허혈 유도

수컷 C57BL/6J 생쥐(Iffa Creddo, Lyon, France)에 수술을 하여 한쪽에 후지 허혈을 유도한다. 이소플루란 흡입을 통하여 동물을 마취시켰다. 우측 대퇴부 동맥을 봉하였다. 우측 대퇴부 동맥에서 0.5㎝ 앞쪽의 복제 동맥과 슬와 동맥으로 갈라지는 부분을 봉하였다. 생쥐(그룹 당 7마리)들은 3일 또는 28일간 특정 병인균이 없는 상태에서 우리에 가둔다. 허혈이 유도된 맥관재생술에서 IL-18BP의 역할을 검사하기 위해, Mallat et al., 2001에서 설명하는 것과 같이, 1군의 생쥐에 IL-18BP 발현 플라스미드 pcDNA3-mIL18BP 60㎍을 경골 두개골 근육에 주사하였다. 기준 생쥐에는 빈(empty) 플라스미드를 동일 약량으로 주사하였다. 다리 양쪽에 4 내지 5.3㎜로 떨어진 두 개 스테인레스 강 플레이트 전극을 이용하여, PS-15 전기맥동기 (Genetronics)를 통하여 피하로 전기적 진동(8 스퀘어 웨이브 전기 펄스 200 V/cm, 20ms, 2 Hz)를 제공하였다. 이와 같이 하는 이유는 기존 실험에서, 이와 같은 진동이 IL-18BP 혈장 수준을 증가시키고, 혈장 IL-18 활성을 감소시켜 아테롬성 플락 발생 및 진행을 저해하는 것으로 나타났기 때문이다(Mallat et al., 2001).

맥관형성 정량

마이크로 맥관형성술

Silvestre et al., 2000; Silvestre et al., 2001에서 설명하는 것과 같이처리 기간이 끝날 때 높은 해상력을 가진 혈관조영술을 이용하여 맥관 밀도를 평가할 수 있다. 간단하게 설명하면, 생쥐를 마취시키고(이소플루란 흡입), 복부 대동맥을 통해 유입된 카테테르로 대비 배지(Barium sulfate, 1 g/ml)를 주사하였다. 디지털 X-레이 변환기를 통하여 얻은 이미지(동물 한 마리당 3장)를 모아서, 후지를 완벽하게 관찰하였다. 맥관 밀도는 정량적으로 맥관에서 수득되는 이미지당 픽셀(pixel) 비율로 나타낸다. 대퇴부 동맥, 무릎, 대퇴골 및 다리의 외부 한계상에 봉합선이 있는 부분에 정량 구역을 그린다.

모세관 밀도

Silvestre et al., 2000; Silvestre et al., 2001에서 설명하는 것과 같이 허혈성 및 비-허혈성 근육에서 모세관 밀도를 평가함으로써 혈관 조영술 분석을 완정하였다. 냉동 조직 단편(7㎛)을 CD31(20pg/ml, Pharmingen)에 대한 생쥐 단클론 항체와 배양시켜, 모세관을 확인하였다.

아비딘-바이오틴 양고추냉이 관산화효소 시각화 시스템을 이용하여 면역 착색을 볼 수 있다(Vectastain ABC kit elite, Vector Laboratories). Histolab 소프트웨어(Microvision)를 이용하여 정해진 부위의 무작위로 선택된 부분에서 모세관 밀도를 계산하였다.

레이져 도플러 관주 이미지

맥관형설술에서 허혈-유도된 변화에 대한 기능적인 증거를 제공하기 위해, 레이져 도플러 관주 이미지 실험을 Silvestre et al., 2000; Silvestre et al., 2001에서 설명하는 것과 같이 실시하였다. 간단하게 설명하면, 영상촬영전에 사지에서 탈모 크림을 이용하여 털을 제거하고, 37℃에서 가열 플레이트상에 생쥐를 두어, 온도 변화를 최소화시켰다. 그럼에도 불구하고, 주변 빛, 온도 등을 포함하는 변수를 고려하기 위해, 계산된 관주는 비-허혈성 다리에 대한 허혈 성 다리의 비율로 나타내었다.

통계학적 분석

결과는 평균±SEM으로 나타낸다. 변수 ANOVA의 한 가지 분석 방업을 이용하여 각 변수를 비교하였다. Post hoc Bonferonni's t 테스트 비교를 실행하여 유의성있는 전체적인 ANOVA에 대해 그룹간의 차이를 확인하였다. p<0.05 값은 통계학적으로 유의성이 있는 것으로 간주하였다.

결과

혈관조영술

3일째에, 각 그룹간에 허혈성/비-허혈성 다리 혈관조영 기록 비율에는 차이가 없었다(도 1). 대조적으로, 28일째에, 기준 생쥐와 비교하였을 때, IL-18BP를 처리한 생쥐에서 혈관조영 수치에서 1.6배 증가되었다(p<0.01).

모세관 밀도

CD31 착색 후에 모세관 밀도 분석으로 혈관조영 데이터를 확인하였다. 28일째에, 기준 생쥐의 허혈성 다리에 모세관 밀도는 비-허혈성 다리의 것보다 더 낮았다(415±31 versus 688±42 혈관/㎟, p<0.01). 그러나, IL-1 8BP-처리된 생쥐의 허혈성 다리의 모세관 밀도는 기준 생쥐의 것보다 훨씬 높았다(1 배 증가)(588±48 versus 415±31 vesseIS/MM2, 각각, p=0.01) 그리고, 비-허혈성 다리에서 관찰된것과는 큰 차이가 없었다.

레이져 도플러 관주 이미지

혈관조영 및 모세관 밀도 측정은 혈액 관주시에 변화와 연관된다. 처리된 생쥐와 처리안된 생쥐 모두에서 후지 혈동 회복이 나타났다. 그러나, IL-18BP 처리된 생쥐에서 28일째에 기준 동물과 비교하였을 때, 혈동이(발 관주에서) 더 많이 증가된 것이 명백하였다(1 fold, p<0.01, 도 2).

실시예 2: VEGF, phospho-Akt 및 eNOS 단백질 수준 조절.

방법

VEGF, phospho-Akt, eNOS(내피 산화질소 합성효소 단백질) 발현은 Silvestre et al., 2000; Silvestre et al., 2001에서 설명한 것과 같이, 허혈성 다리 및 비-허혈성 다리에서 웨스턴 블랏으로 결정하였다.

결과

VEGF.

어느 그룹이건 3일째 허혈성 다리와 비-허혈성 다리간에 VEGF 수준에서 변화는 없었다. 28일째, 기준 생쥐에서, 비-허혈성 다리와 비교하였을 때, 허혈성 다리에서 VEGF 단백질 함량이 증가되는 경향을 보였으나, 이것이 통계학적으로 유의성있는 수치는 아니었지만, 대조적으로 기준과 비교하였을 때, IL-186P-처리된 생쥐에서 허혈성 다리에서 VEGF 단백질 수준이 120% 상당히 상향 조절되었다(p<0.05) (도 3).

Phospho-Akt.

3일째, 어떤 처리를 하건 허혈성 후지와 비-허혈성 후지에서 phospho-Akt 단백질 수준에는 변화가 없었다. 28일째에, 기준 생쥐에서, 비-허혈성 생쥐의 것과 비교하였을 때, 허혈성 후지에서 phospho-Akt 단백질 함량이 약 60% 증가되었다(p<0.01). 이와 같이 IL-1 813P 처리된 생쥐에서 허혈성 다리에 있는 phospho-Akt 함량이 2배이다(기준 생쥐의 허혈성 다리에서 나타난 증가와 비교하였을 때 110% 증가, p<0.05)(도 4).

eNOS.

3일째, 기준 생쥐와 IL18-BP-처리된 동물에서 eNOS 단백질 함량은 허혈성 다리(107±8% versus 103±24%)와 비허혈성 다리(100±12% versus 94±21%)에서 영향을 받지 않았다. 28일째에, 기준 생쥐에서, 비-허혈성 다리에 비하여 허혈성 다리에서 eNOS 수준이 55% 상승되었다(155±8% versus 28 ±11%, 각각, p<0.05). IL-18BP 단백질로 처리하여도 이와 같은 증가에 영향을 받지 않았다(160±12%, P=0.61 versus 허혈 기준).

실시예 3: EPCs(내피 조상 세포)상에 IL-18BP 효과

방법

유동 혈구계산기 분석

EPCs 세포는 Sca-1-포지티브 조혈 조상 세포(Takahashi et al., 1999)로부터 유도되는 것으로 보고 있다. Sca-1에서 EPCs 표식 단백질을 발현시키는 단핵 세포 비율은 유동 혈구계산기로 결정하였다. 허혈후 7일째에, pcDNA3 플라스미드(empty) 또는 pcDNA3-mIL 18BP 플라스미드 처리된 생쥐(그룹당 n=5)골수의 말초 혈액(300㎕)으로부터 단핵 세포를 분리하였다. 경골과 대퇴를 씻어내어 뼈 골수 세포를 수득하였다. Ficoll을 이용한 밀도차 원심분리를 통하여 저밀도 단핵 세포를 분리하였다. 그 다음 단세포는 형광 이소티오시아네이트(FITC) 공액된 Sca-1(D7, BD Pharmingen)에 대한 단클론항체와 함께 배양한다. 기준으로는 이소타입-동일한 항체를 이용하였다.

EPC 차등 검사

분리후에 바로, 단핵 세포에서 분리한 5.10⁶골수를 혈장 비트로넥틴(Sigma) 및 젤라틴(0.1%) 피복된 35mm-세포 배양 접시에 도말하고, 내피 기저 매체(EBM2, Bio whittaker)에 유지시킨다. 배양물에서 몇일 지난 후에, 비-흡착 세포를 제거하고, 흡착 세포를 면역화학 분석한다.

1,1'-디옥타데실-3,3,3',3'-테트라메틸인도카르보시아닌-라벨된 아세틸화된 저-밀도 리포프로테인(AcLDL-Dil)의 수취를 감지하기 위해, 세포는 1시간동안 37℃에서 AcLDL-Dil(Tebu)로 배양시켰다. 그 다음 세포를 2% 파라포름알데히드로 고정시키고, von-Willbrand factor(vWF)(DAKO)에 대한 1차 다클론성 토끼 항체로 1사간 배양시키고, FITC-라벨된 단클론항체 항-토끼 IgG(H+L)와 30분간 배양시켰다. AcLDL-Dil 및 vWF에 대해 양성인 이중-착색된 세포가 EPCs인 것으로 판단되고, 웰당 수를 헤아린다. 세가지 독립 조사관들은 무작위로 선택된 세 가지 고출력 필드에서 카운트하여 웰당 EPCs 수를 헤아린다. 결과는 단핵세포 총 수에 비율로 나타내었다.

결과

EPCs는 Sca-1 포지티브 단핵 세포에서 유도된 것으로 간주된다(Takahashi et al., 1999). 말초 혈액에서 Sca-1 포지티브 단핵 세포는 기준 동물과 비교하였을 때, IL-18BP-처리된 생쥐에서 변화가 없는 것으로 나타났다(각각 31.5±13% versus 28.5±13%). 유사하게, 골수에서 분리된 포지티브 Sca-1 단핵세포의 전체 수는 IL-18BP-처리된 생쥐와 기준 동물(4.35±0.95% versus 5.87±0.22%)간에 큰 차이가 없었다. 또한, IL-18BP 처리로 인하여 말초 혈액 또는 골수 단핵 세포의 총 수에는 영향을 주지 못하였다(자료 없음).

골수 단핵 세포로부터 EPCs를 분리하고, AcLDL-Dil 및 vWF에 양성인 이중-착색 세포로 특징을 조사하였다. 이중-포지티브 착색을 가지는 세포 비율이 비-허혈 동물에서 거의 감지되지 않았다(<5%, n=4). 허혈이 AcLDL-Dil 및 vWF에 이중-포지티브 착색을 가지는 세포 비율을 상당히 증가시켰다(48±3%, p<0.001 versus 비-허혈 동물).

이와 같은 효과는 IL-18BP 처리(기준에서 48±3% versus IL-18BP-처리된 생쥐에서 85±2%, p<0.001)(도 5)에 의해 설명된다. 따라서, IL-18BP 처리하면 순환하는 조상 세포의 수를 증가시키는 것이 아니라 단핵세포가 EPCs로 분화되는 것을 자극시키는 것으로 보인다.

Claims

말초 맥관 질환의 치료 및 예방을 위한 약물의 제조에서 IL-18 저해제의 용도.
제 1 항에 있어서, 말초 맥관 질환은 말초 동맥 질환인 것을 특징으로 하는 용도.
제 1 항 또는 2 항에 있어서, 말초 맥관 질환은 사지 하부의 말초 맥관 질환인 것을 특징으로 하는 용도.
파행 치료 또는 예방을 위한 약물 제조에 IL-18 저해제를 사용하는 것을 특징으로 하는 용도.
전술한 어느 한 항에 있어서, 말초 맥관 질환은 Buerger 질환(폐색성혈전맥관염)인 것을 특징으로 하는 용도.
전술한 어느 한 항에 있어서, 말초 맥관 질환은 말초 허혈인 것을 특징으로 하는 용도.
제 6 항에 있어서, 사지 허혈은 위험한 사지 허혈인 것을 특징으로 하는 용도.
괴저 또는 궤양 치료 또는 예방을 위한 약물 제조에 IL-18 저해제를 사용하는 것을 특징으로 하는 IL-18 용도.
사지 절단 예방을 위한 약물 제조에 IL-18 저해제를 사용하는 것을 특징으로 하는 IL-18 용도.
제 1 항 내지 9 항중 어느 한 항에 있어서, IL-18 저해제는 카스파제-1 저해물질(ICE), IL-18에 대한 항체, Il-18 수용체 아단위중 하나에 대한 항체, IL-18 신호 경로의 저해물질, IL-18과 경쟁하고 IL-18 수용체를 차단하는 IL-18의 길항물질, IL-18 결합 단백질, 또는 IL-18의 생물 활성을 저해하는 동소체, 뮤테인, 융합단백질, 기능적 유도체, 활성 분취물 또는 이들의 순환 치환된 유도체에서 선택되는 것을 특징으로 하는 용도.
제 10 항에 있어서, IL-18 저해제는 IL-18에 대한 항체인 것을 특징으로 하는 용도.
제 10 항에 있어서, IL-18 저해제는 IL-18 수용체 α에 대한 항체인 것을 특징으로 하는 용도.
제 10 항에 있어서, IL-18 저해제는 IL-18 수용체 β에 대한 항체인 것을 특징으로 하는 용도.
제 10 항 내지 13 항중 어느 한 항에 있어서, IL-18 항체는 인화 항체 또는 사람 항체인 것을 특징으로 하는 용도.
제 10 항에 있어서, IL-18 저해제는 IL-18 결합 단백질, 또는 IL-18의 생물 활성을 저해하는 동소체, 뮤테인, 융합단백질, 기능적 유도체, 활성 분취물 또는 이들의 순환 치환된 유도체에서 선택되는 것을 특징으로 하는 용도.
전술한 항중 어느 한 항에 있어서, IL-18 저해제는 하나 또는 복수의 부위에서 당화되는 것을 특징으로 하는 용도.
제 10 항에 있어서, 융합된 단백질은 면역글로불린(Ig) 융합을 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
제 10 항에 있어서, 기능적 유도체는 아미노산 잔기에서 하나 또는 복수의 측쇄로 존재하는 하나 또는 복수의 기능기에 부착되는 적어도 한가지 성분(moiety)을 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
제 18 항에 있어서, 성분은 폴리에틸렌 성분인 것을 특징으로 하는 용도.
말초 맥관 질환의 치료 또는 예방을 위한 약물의 제조에서 IL-18 저해제의 코딩 서열을 포함하는 발현 벡터의 용도.
말초 맥관 질환의 치료 또는 예방을 위한 약물의 제조에서 IL-18 저해제의 세포내 내생적 생산을 유도 또는 강화하는 발현 벡터의 용도.
말초 맥관 질환의 치료 방법에 있어서, IL-18 저해제의 효과량을 이를 필요로 하는 숙주에 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.