JPH0826054B2 - 発光性金属キレ−ト標識及び検出手段 - Google Patents

発光性金属キレ−ト標識及び検出手段

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JPH0826054B2
JPH0826054B2 JP60505060A JP50506085A JPH0826054B2 JP H0826054 B2 JPH0826054 B2 JP H0826054B2 JP 60505060 A JP60505060 A JP 60505060A JP 50506085 A JP50506085 A JP 50506085A JP H0826054 B2 JPH0826054 B2 JP H0826054B2
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Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本出願は1984年10月31日出願の米国シリアルNO.666,987
の部分的継続出願であり、前記NO.666,987は本出願に参
考として包含される。
化学的、生化学的及び生物学的物質を短時間で極めて
特異的に検出し且つ計量せしめる方法の必要性は益々高
くなってきている。特に重要なのは少量の薬物、代謝物
質、微生物及び他の診断上重要な物質を測定する方法で
ある。この種の物質としては、、例えば麻酔薬及び毒
薬、治療用として投与された薬剤、ホルモン、病原とな
る微生物及びウイルス、抗体、代謝物質、酵素並びに核
酸が挙げられる。
これらの物質の存在はしばしば、多くの生化学的系及
び生物学的系の特徴をなす高度の特異性を利用する結合
法によって測定できる。頻繁に使用される方法は例えば
抗原−抗体システム、核酸ハイブリダイゼーション技
術、及びタンパク質−リガンドシステムに基づくもので
ある。これらの方法では診断上重要な複合体の存在が通
常、複合体構成物質の１つ又は複数に結合された観察可
能ラベル（標識）の存在又は不在によって示される。
選択された特定ラベリング（標識）法はしばしば問題
の物質の特定検出システムの有効性及び多目的性を支配
する。好ましい標識は安価、安全であり、且つ広範囲に
わたる化学的、生化学的及び生物学的物質にこれら物質
の重要な結合特性を変化させることなく効果的に結合さ
れ得るという条件を満たさなければならない。この好ま
しいラベルは極めて特徴的なシグナルを与えるものでな
ければならず、且つ自然界に余り見られない、又は好ま
しくは全く存在しないものであることが望まれる。この
ラベルはまた、安定性を有し且つ数箇月にわたって水性
システム内で検出できるようなものでなければならな
い。ラベルの検出は高価な専用設備又は人員を必要とせ
ずに短時間で、高感度及び再現性をもって実施されるこ
とが望まれる。ラベルの計量は温度及びアッセイされる
混合物の組成のごとき変数に余り左右されないことが重
要である。最も有利なものは、均質系即ち複合体状のラ
ベルされた物質及び非複合体状のラベルされた物質を分
離する必要のない系で使用できるラベルである。これら
はラベルされた物質が特定複合体内に合体された時にラ
ベルの検出性が変化しても可能である。
これまでにも様々なラベルが開発されてきたが、これ
らのラベルはいずれも特定の利点及び欠点を有する。例
えば、放射性ラベルは使用範囲がかなり広く、且つ極め
て低い濃度で検出できる。しかしながらこの種のラベル
は高価で危険性もあり、その使用には精巧な設備と熟練
した人員とが必要とされる。更に放射性ラベルの感度
は、検出し得る事象がその本質的性質上ラベルされた物
質の放射性原子１つ当たり１度の割合でしか生起し得な
いため限定される。加えて、放射性ラベルは均質性では
使用し得ない。
そこで非放射性ラベルが注目される。この種のラベル
は分光測光法、スピン共鳴法及びルミネセンス法により
観察し得る分子、並びにこれらの分子を産生する酵素を
含む。有用な非放射性ラベリング物質の１つに有機金属
化合物がある。生物系ではある種の金属は希であるた
め、有機金属化合物の金属成分を特異的にアッセイする
方法が有効に使用される。例えば、Caisの米国特許第4,
205,952号には、特定抗原の定量に使用するための特定
有機金属化合物でラベルされた免疫化学的活性物質の使
用が開示されている。たれらのラベルには、発光スペク
トル、吸光スペクトル及び蛍光スペクトルの測定、原子
吸光並びに中性子活性化を含めて、通常の選択金属検出
法のいずれも使用できる。これら通常の方法はしばしば
感度に欠け、均質系にはほとんど使用し得ず、且つ原子
吸光の場合のごとく、時として試料の破壊を生起する。
特に有利なラベルは、光化学的手段、化学的手段及び
電気化学的手段によって発光させ得るラベルである。
“ホトルミネセンス”は物質が電磁放射線（電磁波）を
吸収した時に発光するように誘導されるプロセスであ
る。蛍光及びリン光はホトルミネセンスの一種である。
化学ルミネセンスはエネルギーの化学的移行によって発
光種を発生させるプロセスである。電気化学ルミネセン
スは電気化学的に発光種を発生させる。
これら発光システムの重要性は益々高まってきてい
る。例えばMandleの米国特許第4,372,745号には免疫化
学的用途における化学発光性ラベルの使用が開示されて
いる。このシステムではラベルが化学的手段、例えばラ
ベルとH2O2及びシュウ酸（オキサレート）との反応によ
って発光状態に励起される。これらのシステムではH2O2
がシュウ酸を高エネルギー誘導体に酸化的に変換し、こ
の誘導体がラベルを励起する。このシステムは原則とし
て、このアッセイの酸化性条件下で安定性を示し且つ高
エネルギーシュウ酸誘導体により励起され得る発光物質
のいずれに対しても有効である。ところが残念なこと
に、この広範囲な利用性自体がこの方法を大きく限定す
る。即ち、問題のアナライト（対象分析物,analyte）を
含む通常の生物学的流体は潜在的発光物質も多く含み、
これらの物質が大きなバックグラウンドレベルのルミネ
センス（発光）を誘起し得るのである。
同様の欠点を有する化学ルミネセンスの免疫化学的使
用の別の例がOberhardt他の米国特許第4,280,815号に開
示されている。この場合は化学発光種でラベルされた免
疫反応物の極めて近くにその場で酸化体（例えばH2O2）
を電気化学的に形成せしめる。電気的に発生した酸化体
は化学発光種内に向かって拡散してこれを化学的に酸化
し、その結果１つ以上の電子がこの電気的発生酸化体に
移行する。前記化学発光種は酸化されると光子を放出す
る。これに対しこの発明では、電子を電気化学的エネル
ギー源から光子を繰り返し放出し得る化学発光種に直接
移行しなければならない。
本発明は電気化学ルミネセンスラベルに係わる。適切
なラベルは有機化合物及び有機金属化合物を含む電気化
学発光性化合物からなる。ラベルされた物質の存在を決
定する電気化学ルミネセンス法は多くの理由から他の方
法より好ましい。即ちこの種の方法は特定ラベルの存在
を極めて良く診断し得、感度が高く安全、安価であると
共に使用範囲が広い。電気化学的ラベルに適した有機化
合物としては例えばルブレン及び9,10−ジフェニルアン
トラセンが挙げられる。多くの有機金属化合物が適切な
電気化学的ラベルを構成するが、特に有用なものはRu−
含有化合物及びOs−含有化合物である。
本発明は種々の方法によって検出し得るRu−含有及び
Os−含有ラベルの使用に係わる。これらのラベルは後述
の種々の理由から有利である。
Ru−含有有機金属化合物及びOs−含有有機金属化合物
についてはこれまでにも文献で議論されてきた。Caisの
開示によれば、第VIII族の貴金属、例えばRuを含む任意
の金属元素又は複数の金属元素の組み合わせは原子吸光
法によって検出し得る有機金属ラベルの適切な成分とな
る（Cais、11欄,20行目）。しかしながらルテニウムはC
aisにおいては好ましい金属ではなく、オスミウムにつ
いては特に記述がなく、開示されているいずれの方法で
もRu及びOsの使用の効果についてのデータが全く示され
ていない。また、好ましいとされている検出法、即ち原
子吸光法は試料を破壊する。
Weberの米国特許第4,293,310号はイムノアッセイにお
けるアナライト用の電気化学的ラベルとしてのRu−含有
複合体及びOs−含有複合体の使用を開示している。開示
されている複合体はチオ尿素結合を介してアナライトの
アミノ基に結合される。Weberはまた、ラベルと別のア
ナライトのヒドロキシ基との間でのカルボン酸エステル
形成の可能性について示唆している。
Weberによれば、ラベルされた物質の存在は消光剤と
光手段付き電気化学的フローセル（電池）とからなる装
置及び方法によって決定し得る。光電気化学的活性ラベ
ルは光励起すると電子を消光剤分子に移行させる。酸化
された分子は次いで、適切な電位（ポテンシャル）に保
持されたフローセルの電極からの電子によって還元され
る。この電子は光電流として決定される。このシステム
のラベルされた遊離アナライトの量は光電流信号によっ
て測定される。この方法は発光物質の電気化学発光検出
法の逆の方法であることに留意されたい。
Weber他によるその後の報告（1983年）Clinical Chem
istry29,pp.1665−1672、Photoelectroanalytical Chem
istry:Possible Interferences in Serum and Selectiv
e Detection of Tris（2,2′−bipyridine）ruthenium
（II）in the Presence of Interferentsでは、Ru−含
有ラベルの検出にこの方法を使用することに伴う問題が
議論された。Weber等の表２によれば、トリス（ビピリ
ジル）ルテニウム（II）の補外検出限度は最適条件下で
1.1×10-10モル/Lである。これらのラベルの実際的使用
により複合体混合物の存在が測定されることを期待し
て、Weber等は彼等のシステムにおける潜在的干渉物質
（interferent）をテストした。Weber等の表３には、ジ
メチルアルキルアミン、EDTA、Ｎ−メチルモルホリン、
N,N′−ジメチルピペラジン、水酸化物、シュウ酸
（塩）、アスコルビン酸（塩）、尿酸、及び血清が、実
際の検出限度を1.1×10-10モル/Lよりかなり上昇させ得
る干渉物質として列挙されている。
これらの研究は簡単なRu−含有化合物を用いて行なわ
れた。Ru−含有ラベルでラベルした複雑な物質の検出限
度について、又はラベルされた物質とラベルとの間のチ
オ尿素結合がこのアッセイの条件下で安定しているか否
かについては、Weber又はWeber等による研究では全く報
告されていない。
本発明が係わる特定のラベルは電気化学発光ラベルで
ある。これらのラベルはしばしば、化合物を電磁放射線
又は化学的エネルギー源、例えば典型的シュウ酸−H2O2
システムによって形成されるものに曝すことによって、
酸化又は還元されることなく、発光状態に励起され得
る。加えて、これら化合物のルミネセンスはこれら化合
物の酸化又は還元を伴う電気化学的方法によって誘起さ
れ得る。
光ルミネセンス、化学ルミネセンス及び電気化学ルミ
ネセンス手段を用いるRu（2,2′−ビピリジン）3 2+検出
法に関する研究も報告されている:Rubinstein及びBard
の“Electrogenerated Chemiluminescence.37.Aqueous
Ecl Systems based on Ru（2,2′−bipyridine）3 2+ an
d Oxalate or Organic Acids"、J.Am.Chem.Soc.、103、
pp.512−516（1981年）、並びにWhite及びBardの“Elec
trogenerated Chemiluminescence.41.Electrogenerated
Chemiluminescence and Chemiluminescence of the Ru
（2,2′−bpy）3 2+-S2O8 2- System in Acetonitrile−W
ater Solutions"、J.Am.Chem.Soc.、104、p.6891（1982
年）．この研究は明るいオレンジ色の化学ルミネセンス
が化学的又は電気的に発生したRu(bpy)3 3+（式中、“bp
y"はビピリジルリガンドを表す）と、シュウ酸イオン又
は他の有機酸の酸化の中間生成物として形成される強い
還元剤との水性反応に基づき得ることを示している。ル
ミネセンスは電気的又は化学的に発生したRu(bpy)3 1+と
ペルオキシジスルフェートの還元の間に発生する強い酸
化剤との反応によって有機溶媒−H2O溶液中でも得られ
る。Ru(bpy)3 2+からの電気化学ルミネセンス発生の第３
のメカニズムはRu(bpy)3 1+を発生させるに十分な負の電
位とRu(bpy)3 3+を発生させるに十分な正の電位との間の
電極電位振動を利用する。これら３つの方法は夫々“酸
化的還元”、“還元的酸化”、及び“Ru(bpy)3 3+/+再生
システム”と称する。
酸化的還元法は水中で実施し得、酸素又は不純物の存
在に比較的感応し難い強くて効果的で安定したルミネセ
ンスを生起する。Ru(bpy)3 2+からのこのルミネセンスは
シュウ酸又は他の有機酸、例えばピルビン酸（ピルベー
ト）、乳酸（ラクテート）、マロン酸（マロネート）、
酒石酸（タートレート）、クエン酸（シトレート）の存
在とRu(bpy)3 3+種を酸化的に産生する手段とに依存す
る。この酸化はPbO2又はCe（IV）塩のような強い酸化剤
によって化学的に実施し得、また連続的又は断続的に加
えられる十分に正の電位により電気化学的に実施し得
る。Ru(bpy)3 2+の電気化学的酸化に適した電極は例えば
Pt、熱分解グラファイト、及びガラス質炭素である。シ
ュウ酸又は他の有機酸は化学ルミネセンスの間に消耗さ
れるが、消耗物質の過剰の存在又は反応室内への消耗物
質の連続的供給により、何時間にもわたる強くて一定し
た化学ルミネセンスが生起し得る。
還元的酸化法は例えばアセトニトリルのごとき有機共
存溶媒を含む部分的水性溶液中で実施し得る。このルミ
ネセンスはペルオキシジスルフェートの存在とRu(bpy)3
1+種を還元的に産生する手段とに依存する。この還元は
例えばマグネシウム又は他の金属のごとき強い還元剤に
よって化学的に実施し得、また連続的又は断続的に加え
られる十分な負の電位により電気化学的に実施し得る。
Ru(bpy)3 2+の電気化学的還元に適した電極としては例え
ば磨いたガラス質炭素電極が挙げられる。酸化的還元法
の場合と同様に、過剰試薬の存在又は反応混合物への消
耗試薬の連続的添加により強い連続的発光が何時間にも
わたって得られる。
Ru(bpy)3 3+/+再生システムはアセトニトリルのごとき
有機溶媒又は部分的水性システム中で、Ru(bpy)3 2+を還
元するに十分な負の電位とRu(bpy)3 2+を酸化するに十分
な正の電位との間で電極電位をパルスにすることで実施
し得る。このような再生システムに適した電極としては
例えばPt電極がある。このシステムは化学的試薬を消耗
せず、原則として永久に作動し得る。
これら３種のRu−含有発光化合物産生法はいずれもRu
−含有化合物の酸化−還元又は還元−酸化を繰り返し行
なう。従ってこれらの化合物を含む溶液のルミネセンス
は、加えられるエネルギー源の電位に大きく依存し、そ
のためRu−含有化合物の存在を極めて良く検出（診断）
する。
MandleはCurtis他の“Chemiluminescence;A New Meth
od for Detecting Fluorescent Compounds Separated B
y Thin Layer Chromatography",J. Chromatography 13
4,pp.343−350（1977年）をRu−トリス（ビピリジル）
（II）を化学ルミネセンス用途において使用し得るラベ
ルとして確認するものとして引用している。Curtis他は
Ru複合体がシュウ酸／H2O2システムにより化学的に励起
されると光を発するようになり得るという非公開意見を
報告しているに過ぎない（Curtis他 p.350）。
MandleもCurtisも化学ルミネセンス用途におけるルテ
ニウム及びオスミウム複合体の例外的有用性、又は電気
化学ルミネセンスシステムの有用性は認めなかった。Sp
rintschnik,G.他の“Preparation and Photochemical R
eactivity of Surfactant Ruthenium（II）Complexes i
n Monolayer Assemblies and at Water−Splid Interfa
ces",J.Am.Chem.Soe.99,pp.4947−4954（1977年）には
オクタデカノール又はデヒドロコレステロールでエステ
ル化したトリス（2,2′−ヒピリジン）ルテニウム（I
I）が記載されており、これら界面活性複合体の単層フ
ィルムの形成法が開示されている。これら複合体はホト
ルミネセンス性であった。しかしながら、このフィルム
を水に曝し次いで光に曝すとRu−複合体はホトルミネセ
ンスを発生しなかった。その原因は光の存在下における
エステル基の光加水分解にあった。
本出願人は広範囲のアナライトと当該アナライトに結
合する化学種（moieties）とがRu−含有又はOs−含有ラ
ベルにアミド結合又はアミン結合を介して適切に結合さ
れることを発見した。本明細書はこれを開示する。これ
らのラベルされた物質は広範囲にわたる任意の手段によ
って検出（決定）し得るが、現在のところ最も有効で信
頼できる高感度手段はホトルミネセンス、化学ルミネセ
ンス及び電気化学ルミネセンス手段である。本明細書で
は、Ru−含有及びOs−含有ラベルとルブレン及び9,10−
ジフェニルアントラセンのごとき有機分子とを含む電気
化学ルミネセンスラベルが特に多目的に使用し得、有利
であることも開示する。以下にこれら新規のラベルされ
た物質の使用と、これら物質の検出法との大きな利点を
説明する。
発明の要約 本発明によれば、式 〔Ｍ（Ｐ）ｍ（L1）ｎ（L2）ｏ（L3）ｐ（L4）ｑ（L5）
ｒ（L6）ｓ〕ｔ（Ｂ）ｕ 〔式中、Ｍはルテニウム又はオスミウム;PはＭの多座配
位（polydentate）リガンド;L1,L2,L3,L4,L5及びL6はＭ
のリガンドであり、各々が別のリガンドと互いに同じで
もよく異なるものでもよい;Bは１つ以上のアミド又はア
ミン結合によってP,L1,L2,L3,L4,L5,又はL6の１つ以上
に共有結合した物質;mは１以上の整数;n,o,p,q,r及びｓ
の各々は０又は整数;tは１以上の整数;uは１以上の整
数;P,L1,L2,L3,L4,L5,L6及びＢは化学種（chemical moi
ety）が電磁放射線（電磁波）を放出すべく誘導される
ような組成と数とを有しており、Ｍのリガンドによって
Ｍに与えられる結合の総数がＭの配位数に等しい〕で示
される化学種が提供される。
本発明は特に、発光ルテニウム−又はオスミウム−含
有ラベルを化学物質、生化学物質及び生物物質のアミノ
基に結合するための中間体（介在物）として適当な化合
物を提供する。従ってこれら中間体は本発明の化学種の
生成に特に適している。中間体は、ルテニウム−又はオ
スミウム−ビス（2,2′−ビピリジン）（2,2′−ビピリ
ジン−4,4′−ジカルボン酸）のモノ−及びジ−Ｎ−ヒ
ドロキシスクシンイミドエステル及びその塩、並びにル
テニウム−又はオスミウム−ビス（2,2′−ビピリジ
ン）（4,4′−ジ（クロロメチル）−2,2′−ビピリジ
ン）である。これら化合物は当業者に公知の手段で合成
され得る。
本発明は、新規な化学種の存在の判定方法を提供す
る。
本発明はまた、式 〔Ｍ（Ｐ）ｍ（L1）ｎ（L2）ｏ（L3）ｐ（L4）ｑ（L5）
ｒ（L6）ｓ〕ｔ（Ｂ）ｕ 〔式中、Ｍはルテニウム又はオスミウム;PはＭの多座配
位リガンド;L1,L2,L3,L4,L5及びL6はＭのリガンドであ
り、各々が別のリガンドと互いに同じでもよく異なるも
のでもよい;BはＭのリガンド物質であるか又はP,L1,L2,
L3,L4,L5,又はL6の１つ以上に結合した物質;mは１以上
の整数;n,o,p,q,r及びｓの各々は０又は整数;tは１以上
の整数;uは１以上の整数;P,L1,L2,L3,L4,L5,L6及びＢは
化学種が電磁放射線を放出すべく誘導されるような組成
と数とを有しており、ＭのリガンドによってＭに与えら
れる結合の総数がＭの配位数に等しい〕で示される化学
種の存在の判定方法を提供する。
本発明方法は、 ａ）適当な条件下で化学種を含有する反応混合物（reag
ent mixture）を形成させ、 ｂ）反応混合物を化学エネルギ又は電気化学エネルギに
曝露して化学種からの電磁放射線の放出を誘導し、 ｃ）放出された電磁放射線を検出しこれにより化学種の
存在を判定する ステップを含む。
本発明は更に、対象物質の存在を判定する結合方法に
おいてルテニウム含有又はオスミウム含有ラベルの使用
を提案する。これらの方法は、ラベルされた対象化学種
を判定するため、ラベルされた化学種を使用して対象分
析物を判定するため、ラベルされた対象分析物の類似体
を使用して競合結合アッセイで対象分析物を判定するた
め、等に使用され得る。これら結合方法は均一又は不均
一結合方法のいずれでもよい。
更に本発明は、本発明のルテニウム含有又はオスミウ
ム含有化学種の存在を判定するためのシステムを提供す
る。本発明のシステムは化学種からの電磁放射線の放出
を誘導する手段と放出された電磁放射線を検出する手段
とを含む。
本発明は更に、対象分析物判定用の結合方法にルテニ
ウム含有又はオスミウム含有化学種を使用するためのシ
ステムを提供する。
本発明によれば、式 （Ａ）ｋ（Ｂ）ｕ 〔式中、Ａは電気化学エネルギ源に直接曝露されて電磁
放射線を反復的に放出すべく誘導され得る化学物;BはＡ
に結合した物質;kは１以上の整数;uは１以上の整数〕で
示される化学種の存在を判定するために、 ａ）適当な条件下で化学種を含有する反応混合物を形成
し、 ｂ）化学種を電気化学エネルギに直接曝露して化学種か
らの電磁放射線の反復的放出を誘導し、 ｃ）放出された電磁放射線を検出しこれにより化学種の
存在を判定する ステップを含む方法を提供する。
本発明は更に、対象物質の存在を判定するための結合
方法における電気化学ルミネセンス性ラベルの使用を提
案する。これらの方法はラベルされた対象化学種を判定
するため、ラベルされた化学種を使用して対象分析物を
判定するため、ラベルされた対象分析物の類似体を使用
して競合結合アッセイで対象分析物を判定するため、等
に使用され得る。これら結合方法は均一又は不均一結合
方法のいずれでもよい。
本発明の特定具体例では、異なる２種以上の化学種を
含有する組成物が提供される。化学種の各々は異なる波
長の電磁放射線を放出すべく誘導され得る化学物質種
（chemical species）でもよい。本発明の別の具体例で
は、化学種は、各々が異なる値のエネルギ又は異なるエ
ネルギ源からのエネルギに曝露されて電磁放射線を放出
すべく誘導されるような複数の化学物質種から成っても
よい。この場合、別の対象物質又は分析物が異なる化学
種の各々に特異的に結合し得る。これらの組成物及び方
法の使用によって、被検サンプル中に存在する異なる２
種以上の対象物質又は分析物を判定することが可能であ
る。
発明の詳細な説明 本発明によれば、式、 〔Ｍ（Ｐ）ｍ（L1）ｎ（L2）ｏ（L3）ｐ（L4）ｑ（L5）
ｒ（L6）ｓ〕ｔ（Ｂ）ｕ 〔式中、Ｍはルテニウム又はオスミウム;PはＭの多座配
位リガンド;L1,L2,,L3,L4,L5及びL6はＭのリガンドであ
り各々が別のリガンドと互いに同じでもよく異なるもの
でもよい;Bは１つ以上のアミド又はアミン結合によって
P,L1,L2,L3,L4,L5,又はL6の１つ以上に共有結合した物
質;mは１以上の整数;n,o,p,q,r及びｓの各々は０又は整
数;tは１以上の整数;uは１以上の整数;P,L1,L2,L3,L4,L
5,L6及びＢは化学種が電磁放射線を放出すべく誘導され
得るような組成と数とを有しており、Ｍのリガンドによ
ってＭに与えられる結合の総数がＭの配位数に等しい〕
で示される化学種が提供される。
この化学種は、１種類以上のＭの多座配位リガンドを
有していなければならない。この化学種が２つ以上の多
座配位リガンドを有するとき複数の多座配位リガンドは
互いに同じでもよく異なっていてもよい。多座配位リガ
ンドは芳香族及び脂肪族リガンドを含む。適当な芳香族
多座配位リガンドは芳香族複素環リガンドを含む。好ま
しい芳香族複素環リガンドは窒素含有リガンド例えば、
ビピリジル、ビピラジル、テルピリジル及びフェナント
ロリルである。
適当な多座配位リガンドは未置換でもよく、又は当業
者に公知の多数の置換基のいずれかによって置換されて
いてもよい。適当な置換基の例は、アルキル、置換アル
キル、アリール、置換アリール、アラルキル、置換アラ
ルキル、カルボキシレート、カルボキシアルデヒド、カ
ルボキシアミド、シアノ、アミノ、ヒドロキシ、イミ
ノ、ヒドロキシカルボニル、アミノカルボニル、アミジ
ン、グアニジニウム、ウレイド、硫黄含有基、燐含有基
及びＮ−ヒドロキシスクシンイミドのカルボン酸エステ
ルである。
この化学種は１種類以上の単座配位（monodentate）
リガンドを有していてもよい。多数の単座配位リガンド
が当業者に公知である。適当な単座配位リガンドは例え
ば、一酸化炭素、シアニド（シアン化物）、イソシアニ
ド、ハロゲン化物、並びに、脂肪族、芳香族及び複素環
ホスフィン、アミン、スチビン、アルシンである。
本発明の化学種のとくに好ましい具体例は、ビス（2,
2′−ビピリジル）ルテニウム（II）及びトリス（2,2′
−ビピリジル）ルテニウム（II）である。
付加的化学ラベル例えば放射性同位体、蛍光成分又は
付加的発光ルテニウム−もしくはオスミウム−含有中心
に結合されるべき１種類以上のＭのリガンドは本発明の
範囲内に包含される。
更に、２つ以上又は多数の電気化学ルミネセンス性中
心によってラベルされるべきラベル物質（Ｂ）も本発明
の範囲内に包含される。
適当な物質（Ｂ）としては多くの生物物質、例えば全
細胞、ウイルス、細胞下粒子、タンパク質、リポタンパ
ク質、糖タンパク質、ポリペプチド、核酸、多糖類、リ
ポ多糖類、細胞代謝物、ホルモン、薬理物質、トランキ
ライザー、バルビツール酸エステル、アルカロイド、ス
テロイド、ビタミン、アミノ酸及び糖類がある。全細胞
は動物又は植物又は細菌のいずれでもよく、生細胞でも
死細胞でもよい。例えば植物病原体例えば菌類又は線虫
類がある。「細胞下粒子」なる用語は、例えば、細胞下
小器官、破壊細胞の膜粒子、細胞壁の断片、リボソー
ム、多酵素複合体及びその他の生体由来の粒子を包含す
る。核酸は例えば、様々な由来の染色体DNA、プラスミ
ドDNA、ウイルスDNA、及び組換体DNAを含む。核酸はま
た、RNA例えば、メッセンジャーRNA、リボソームRNA、
転移RNAを含む。ポリペプチドは例えば、酵素、輸送タ
ンパク質、受容体タンパク質、及び構造タンパク質例え
ばウイルスコートタンパク質を含む。好ましいポリペプ
チドは酵素及び抗体である。特に好ましいポリペプチド
はモノクローナル抗体である。ホルモンは例えばインシ
ュリン及びT4甲状腺ホルモンを含む。薬理物質（薬理
剤）は例えば、強心配糖体を含む。生物物質に化学的に
類似した合成物質例えば合成ポリペプチド、合成核酸、
合成膜、小胞及びリポソームも勿論本発明の範囲内に包
含される。これらは全て本発明での使用に適した生物物
質の判り易い例として示しただけであり、本発明の範囲
はこれらの物質に限定はされない。
ラベルされた重合物質の如き非生物物質でも本発明の
範囲内に含まれる。これらの物質は可溶重合分子の形態
でもよく、又は、公知の種々の巨視形態のいずれか例え
ばビーズ等でもよく、又は、試験管、壜もしくはアッセ
イウェル等の如き容器でもよい。
生物物質及び非生物物質（Ｂ）はアミド又はアミン結
合を介してＭのリガンドに共有結合する。アミド結合の
場合は、結合は、物質（Ｂ）がアミド結合のカルボニル
又は窒素に直接結合するように配向される。これらの化
学種はイオン化されていてもよい。その場合、異なる多
くの対イオンが化学種調整物の電荷を中和し得ることは
当業者に明らかであろう。適当なカチオンは例えば、
H+、NH4 +、グアニジニウム、Ag+、Li+、Na+、K+、M
g2+、Mn2+、Cd2+である。適当なアニオンは例えば、ハ
ロゲン化物、OH-、炭酸塩、SO4 2-、ヘキサフルオロホス
フェート及びテトラフルオロボレートである。
本発明は更に、ルテニウム含有又はオスミウム含有の
発光ラベルを化学物質、生化学物質及び生物物質のアミ
ノ基に結合させる中間体（介在物）として特に適した化
合物を提供する。従ってこれら中間体は本発明の化学種
の合成に特に適している。本発明の中間体はルテニウム
又はオスミウムのビス（2,2′−ビピリジン）（2,2′−
ビピリジン−4,4′−ジカルボン酸）のモノ−及びジ−
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル及びその塩並び
にルテニウム又はオスミウムビス（2,2′−ビピリジ
ン）（4,4′−ジ（クロロメチル）−2,2′−ビピリジ
ン）である。
これら中間体は以下の化学構造を有する。ルテニウム
又はオスミウムのビス（2,2′−ビピリジン）（2,2′−
ビピリジン−4,4′−ジカルボン酸）のモノ−Ｎ−ヒド
ロキシスクシンイミドエステルは、 〔式中、ＭはRu又はOs、ｎは整数1,2又は３〕又はその
塩及びその立体異性体を含む。
ルテニウム又はオスミウム−ビス（2,2′−ビピリジ
ン）（2,2′−ビピリジン−4,4′−ジカルボン酸）のジ
−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルは、 〔式中、ＭはRu又はOs、ｎは整数1,2又は３〕又はその
塩及びその立体異性体を含む。
ルテニウム又はオスミウム−ビス（2,2′−ビピリジ
ン）4,4′−ジ（クロロメチル）−2,2′−ビピリジン）
は、 〔式中、ＭはRu又はOs、ｎは整数1,2又は３〕又はその
塩及びその立体異性体を含む。これら化合物は当業者に
公知の手段で合成され得る。
ルテニウム含有Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステ
ルの好ましい合成方法によれば、先ず炭酸水素ナトリウ
ムの高温メタノール水溶液中でルテニウムジクロロビス
2,2′−ビピリジンを2,2′−ビピリジン−4,4′−ジカ
ルボン酸と反応させる。酸性化した後にカルボキシル化
したルテニウム化合物の溶液にNaPF6の水溶液を添加す
る。単離したルテニウム錯体のヘキサフルオロホスフェ
ート塩を次に、ジメチルホルムアミド中のジシクロヘキ
シルカルボジイミドの存在中でＮ−ヒドロキシスクシン
イミドと反応させてエステル化する。本発明の中間体の
効果を実質的に悪化させずにＮ−ヒドロキシスクシンイ
ミド成分の構造について多くの変形が可能である。これ
ら中間体はイオン化されてもよい。その場合、異なる多
くの対イオンが中間体調整物の電荷を中和し得ることは
当業者に明らかであろう。適当なカチオンは例えば、
H+、NH4 +、グアニジニウム、Ag+、Li+、Na+、K+、M
g2+、Mn2+、Cd2+である。適当なアニオンは例えばハロ
ゲン化物、炭酸塩、SO4 2-、ヘキサフルオロホスフェー
ト及びテトラフルオロボレートである。
これら中間体は、カルボン酸エステルを攻撃してＮ−
ヒドロキシスクシンイミドを置換し得るか又はクロロメ
チル基を攻撃して塩化物を置換し得る遊離アミノ基を含
有する物質をラベルするために有効である。対象分析物
をラベルするためには従来技術のイソチオシアネート
（例えばWeber、米国特許第4,293,310号）よりも本発明
の中間体のほうが好ましい。イソチオシアネートは一般
に、二硫化炭素又はチオホスゲンと第一級アミンとの反
応によって調製されるが、二硫化炭素及びチオホスゲン
はいずれも揮発性であり極めて有毒である。二硫化炭素
はまた、引火爆発の危険がある。また必要な前駆物質た
る芳香族第一級アミンは本発明で使用される前駆物質た
る芳香族カルボン酸よりも入手が難しい。また、本発明
の中間体はイソチオシアネート誘導体よりも反応しにく
く従って保存及び取り扱いが容易である。
本発明は更に、本発明の化学種の存在を判定する方法
を提供する。金属含有組成物は、当業者に公知の種々の
手段例えば放出（エミッション）、吸収、蛍光スペクト
ル測定、原子吸収、陽極ストリッピング電圧測定、中性
子活性化及び電気化学的方法の如き手段によって検出さ
れ得る。ホトルミネセンス、ケミルミネセンス及び電気
化学ルミネセンスの方法が特に重要である。
ルミネセンスの技術を使用するとRu(bpy)3 2+が極めて
低濃度でも測定できる。酸化的還元法を用いると（Ege
等（1984）、Analytical Chemistry、印刷中）、５×10
-8Ｍの濃度のRu(bpy)3 2+の検出が可能であった。これら
の実験では、燐酸バッファpH5.0中に1mMのシュウ酸ナト
リウムを用い、飽和塩化ナトリウム参照電極に対して電
位を＋1.0V〜＋1.4Vで５〜10秒間隔のパルスにした。還
元的酸化法ではより高い感度が得られることも知見され
た。CH3CN：H2O（1:1容量／容量）中の18mMのNa2S2O8と
0.1Mのテトラ−ｎ−ブチルアンモニウムテトラフルオロ
ボレートとを使用すると10-13Ｍという低い濃度のRu(bp
y)3 2+が検出できた。方法を更に精密にすれば更に高い
感度が期待できる。これらの方法はまた、ラベルされた
物質の敏感で正確な測定値を与える。これに関しては後
出の実施例で十分に説明する。
Ru(bpy)3 2+でラベルした物質に関する本出願人等の実
験によって、ルテニウム含有及びオスミウム含有化合物
の化学ラベルとしての利点が証明された。これらの化合
物は長期安定性であり、種々の化学物質、生化学物質及
び生物物質に有効に結合し得る。ラベルは安全で比較的
安価である。
それらは極めて特徴的なシグナルを与え、自然には生
起しないものである。標識の発光に基づく測定は高感
度，迅速且つ再現性があり、簡単な装置を利用するもの
である。これらの標識の発光に基づく検出はリン酸緩衝
溶液，トウィーン （界面活性財），肝臓組織抽出物又
は血清のような成分によっては殆んど干渉されることは
ない。これら標識の発光に基づく測定は試料又は標識物
質を破壊することなく繰返し行なうことができる。各標
識分子によりシグナルが繰返し発せられ、それによっ
て、これら標識を検出し得るだけに感度が増強される。
特定用途の必要に応じて、標識物質の存在は定量的又は
定性的に測定することができる。注意事項：「測定」と
いう用語は本明細書に於いて標識物質の定量的又は定性
的測定の意味に用いる。
従って、本発明は次式を有する化学種： ［M(P)m(L1)n(L2)o(L3)p(L4)q(L5)r(L6)s］t(B)u ［式中、Ｍはルテニウムまたはオスミウムであり、Ｐは
Ｍの多座配位リガンドであり、L1，L2，L3，L4，L5およ
びL6はＭのリガンドであって各々同一でもまたは互いに
他のリガンドと異なっていてもよく、ＢはＭのリガンド
である物質であるかまたはP,L1，L2，L3，L4，L5もしく
はL6の１個以上に結合している物質であり、ｍは１以上
の整数であり、n,o,p,q,rおよびｓの各々はゼロまたは
整数であり、ｔは１以上の整数であり、ｕは１以上の整
数であり、P,L1，L2，L3，L4，L5，L6およびＢは電磁放
射線を放出させるべくこの化学種を誘導できるような組
成と数になっており、ＭのリガンドとＭとの結合の総数
はＭの配位数に等しい］の存在を測定するための方法で
あって、 ａ）適切な条件下で前記化学種を含有する試薬混合物を
形成し、 ｂ）この試薬混合物を化学エネルギーまたは電気化学エ
ネルギーに曝露することによって化学種を誘導して電磁
放射線を放出させ、 ｃ）放出された電磁放射線を検出することにより対象分
析物の存在を測定することからなる方法 を提供するものである。
本発明方法で使用し得る化学種中に、生物由来の又は
そうでない物質（Ｂ）はＭへの直接の配位によって、又
はＭのリガンドに結合することで該種に取り込まれ得る
ものである。結合は共有結合，静電気結合又は水素結合
によってなされ得るものである。物質（Ｂ）をＭのリガ
ンドに共有結合させ得る手段は多様である。例えば、上
記結合はアミドあるいはアミン結合，エステルあるいは
チオエステル結合，エーテルあるいはチオエーテル結合
又は当業者に公知の多数の他の手段のうちのいかなるも
のでも良い。結合の型はリガンドの置換基及び標識され
ることになっている物質上にあるリガンドとの結合に用
い得る適当な化学基によって決定されることになる。適
当な物質（Ｂ）には、例えば、細胞全体，細胞レベル下
の粒子，核酸，多糖，タンパク，糖タンパク，リポタン
パク，リポ多糖，ポリペプチド，細胞代謝物質，ホルモ
ン，薬理剤，鎮静剤（トランキライザー），精神安定剤
（バルビツエート），アルカロイド，ステロイド，ビタ
ミン，アミノ酸，糖及び生物由来でないポリマーがあ
る。本発明の好適具体例では、結合はアミド又はアミン
結合である。アミド又はアミン結合はリガンド上の置換
基及び標識されることになっている物質上のアミン基と
の間で形成される。
本発明方法は相補的物質と特異的複合体（コンプレッ
クス）を形成することによって化学種を測定する方法を
含むものである。特に興味があるのは、抗原−抗体の一
対の物質についてである。
この結合方法は、例えば、血液，尿又は合成反応混合
物のような複合体混合物中のジゴキシン又はジギトキシ
ンのような標識抗原の存在を、まず初めに対象抗原に特
異的な固定化抗体に該混合物を接触させ、その後該固定
化抗体に結合した標識物質の量を測ることによって測定
する為に使用することができる。
「誘導して電磁放射線を放出させる」という語句は該
化学種の励起状態を作り出すことを意味し、これは室温
にて200nm〜900nmの波長は発光を行なうのものである。
本発明はオスミウム含有種及びルテニウム含有種に関す
るものであり、リガンドの化学構造を変化させることに
よって得られる広範囲に恒る様々な発光種を含有するも
のである。これらの金属及びリガンドが変化することに
より、それら発光種が励起状態になる為に必要とされる
エネルギー入力の正確な値が変り得る。これと同様に、
電磁放射線の放出波長はルテニウム又はオスミウム含有
物質の性質及び環境によって変化し得るものである。一
般に、ホトルミネセンスに於ける励起及び発光は約200n
m〜約900nmの波長の電磁放射線を伴って生起するもので
ある。化学発光及び電気化学発光に於ける放出は一般に
約200nm〜約900nmの波長の電磁放射線の放出を伴って生
起するものである。
化学種の酸化・還元が起るポテンシャルは使用する電
極の性質及び溶液のpHのような因子と同様にまさにその
化学構造に左右されるものである。一般に、ホトルミネ
センスシステムに於ける励起及び放出の最適波長及び化
学発光又は電気化学発光システムの最適ポテンシャル及
び最適放出波長の測定方法は当業者には周知のことであ
る。
存在する発光種を定量する方法は多数あるということ
は明らかである。システムへのエネルギー入力の速度に
よって発光種を測定することができる。適当な測定とし
ては、例えば、発光種が電気化学的に生成される際の電
流測定，化学的に発光種を生成する際の還元剤あるいは
酸化剤の使用速度又はホトルミネセンス法に於ける電磁
エネルギーの吸収速度の測定が挙げられる。更に当然の
ことながら、放出される電磁放射線を測定することによ
っても、発光種を検出することができる。これら測定は
全て、速度に基づく連続的な測定、又は長期間に恒りシ
グナルを累積する累積法のいずれかの方法として実施し
得る。
速度に基づく測定の例としては、入射光強度に比例し
た量の電流を生じる光電子増倍管チューブ，光ダイオー
ド又は光トランジスターを用いるものがある。累積法の
例としては、速度に基づいて得られたデータの積分，及
び直接に累積データを与える写真フィルムを用いるもの
がある。
これら全ての発光に基づく方法には、ルテニウム含有
化合物による発光の繰返しが必然的に伴っている。検出
し得る事象が繰返し起るというこれらの標識の持つ性質
は、放射性同位体又はルミノールのような結合化学発光
分子とは明確に異なるものである。後者の標識はその分
子（又は原子）１個につきただの１回しか検出し得る事
象を生起せず、その為にこれら標識の検出可能性は制限
される。
本発明は更に、ルテニウム及びオスミウム含有標識を
対象分析物の存在を測定する為の結合方法に使用するこ
とを提供するものである。このような結合方法は当業者
には数多く知られている。これらの方法はしばしば、生
化学的及び生物的成分が互いに結合する際の高度な特異
性を利用するものである。その例としては、核酸ハイブ
リダイゼーション法に基づく方法，抗原−抗体に基づく
方法及び酵素−リガンドに基づく方法がある。これらの
方法では、対象分析物を測定する為に標識種を用いるか
又は競合結合アッセイに於いては対象分析物を測定する
為に対象分析物の標識類似体を使用する為に標識種を用
いることができる。
対象分析物及び化学種は特異的て様式でお互いに結合
し得る物質の対であればどのようなものでもかまわな
い。このような物質としては、例えば，細胞全体，細胞
レベル以下の粒子，核酸，多糖，タンパク，糖タンパ
ク，リポタンパク，リポ多糖，ポリペプチド，細胞代謝
物質、ホルモン，薬理剤，鎮静剤，精神安定剤，アルカ
ロイド，ステロイド，ビタミン，アミノ酸，糖及び生物
由来でないポリマーがある。
特に興味があるのは、抗原−抗体対である。例えばこ
の方法には細胞表面抗原の存在を測定する為に標識抗体
を使用すること、又は細胞選別法による検出の為に或る
特定の細胞を標識することが含まれる。例えば固定化さ
れた非標識抗体に結合することによって固定化された抗
原は一般に「サンドイッチ法」として公知の方法に於い
て標識抗体によって検出することができる。
競合結合アッセイに於いては、対象分析物及び該分析
物の標識類似体は、例えば、細胞全体，細胞レベル下の
粒子，核酸，多糖，タンパク，糖タンパク，リポタンパ
ク，リポ多糖，ポリペプチド，細胞代謝物質，ホルモ
ン，薬理剤，鎮静剤，精神安定剤，アルカロイド，ステ
ロイド，ビタミン，アミノ酸，糖及び生物由来でないポ
リマーのような相補的物質との特異的複合体の形成に関
与することのできる物質であればどのような物質でもか
まわない。特に興味があるのは抗原−抗体に基づく方法
である。この方法は、対象分析物がその分析物の標識類
似体を抗体から追い出したときにその分析物を検出す
る、ラジオイムノアッセイと呼ばれる周知のものに類似
している。当業者に公知のラジオイムノアッセイの様々
な変法は、放射活性標識された化合物の代りに本発明の
標識化学種を用いることによって原理的には有利に使用
することができる。
本発明は更にホモジーナス又はヘキロジーナスな結合
方法に於いて標識化学種を使用することを提供するもの
である。ヘテロジーナス結合方法に於いては、標識の存
在を測定する前に未結合標識物質から結合標識物質を物
理的に分離しなければならない。これは抗原−抗体シス
テムに於いてしばしば、例えば抗体という一成分を、フ
ィルターのような不溶マトリックスか又はテストチュー
ブのような反応容器或いはビーズの表面に結合させて固
定化することにより達成される。抗原含有溶液をフィル
ターを通すか又は反応容器に注ぎ、その後それをフィル
ター又は反応容器側部から洗滌除去する。抗体に特異的
に結合した抗原のみが残留し測定されることになる。
これと対照的にホモジーナス方法に於いては、標識の
存在を測定するときに結合及び未結合の標識物質が同一
反応混合物中に存在する。これは標識からの検知可能な
シグナルの特性が結合によって修飾されるときに可能と
なる。発光標識をホモジーナスシステムで使用すること
のできるような多数の方法がある。例えば、もし発光消
光剤が抗体上に適切に配置されているならば、標識抗原
が結合することによって該抗体上の発光消光剤が標識の
発光を抑制する。発光標識を用いる多数のホモジーナス
方法が当業者に公知である。そのうちの幾つかはBogusl
aski及びLi（1982）著の「ホモジーナスイムノアッセ
イ」、Applied Biochemistry and Biotechnology 7,401
−414頁中で検討されている。
本発明によって独特で有効なタイプの均質結合アッセ
イが提供される。本文中の記載によれば、これらのラベ
ルは、ラベルされた対象物質の溶液を電極に接触させる
ことによって電気化学的に測定され得る。溶液中に存在
するが電極の表面に接近できないラベル物質は検出され
ないであろう。検出されない場合として例えば、ラベル
物質が電極を収容した反応容器の表面に直接又は間接に
結合しているとき、又は、ラベルが特異的複合体例えば
抗原抗体複合体の内部深くに包埋されているとき、又
は、電極自体がラベル物質を通過させるが錯体を形成し
たラベル物質を通過させない層で被覆されているときが
ある。更に、電極の表面が抗体で被覆されることもあ
り、この場合、固定化抗体に結合したラベル抗原だけが
電極に接近でき従って測定され得る。所望の電極電位が
短いパルスで与えられるときはこの特別な均質法が最も
有効であろう。
ラベル化合物の存在を測定する手段の組み合わせ使用
も本発明の範囲内に包含される。例えば、ホトルミネセ
ンス又はケミルミネセンスの如き結合ラベル物質と未結
合ラベル物質とを識別しない手段によってラベル物質の
総量を測定し、例えば電気化学ルミネセンスの如き結合
ラベル物質と未結合ラベル物質とを識別する手段によっ
て結合ラベル物質の量を測定するのが好ましい。かかる
組み合わせ方法は同じサンプルに実施することができ、
従って方法が個々に使用される場合よりもサンプルに関
して多くの情報が得られる。更に、本発明の範囲内で同
じ反応混合物中の異なる２種以上のラベル化合物の存在
を測定することも可能である。このような方法は、異な
るラベルが異なる波長の電磁放射線を放出するとき、又
は、ラベルが異なる値又は異なるエネルギ源のエネルギ
に曝露されることによって電磁放射線を放出すべく誘導
され得るときに可能である。
本発明は更に、ルテニウム含有又はオスミウム含有化
学種の存在を測定（判定、決定）するシステムを提供す
る。該システムは、化学種を含有する反応混合物（試薬
混合物）と電磁放射線を放出せしむべく化学種を誘導す
る手段と、放出された電磁放射線を検出する手段とを含
む。
本発明は更に、対象分析物を測定するためにルテニウ
ム含有又はオスミウム含有のラベル化学種を使用するシ
ステムを提供する。
本発明のシステムは、本明細書に開示され且つ教示さ
れた種々の方法の迅速、有効且つ柔軟な実行に有用であ
る。
本発明は更に、式（Ａ）ｋ（Ｂ）ｕで示される化学種
の存在の測定方法を提供する。Ａは電気化学エネルギ源
に直接曝露されて電磁放射線を反復的に放出するように
誘導され得る化合物である。これら化合物は、無機、有
機金属又は有機化合物のいずれでもよく、例えばルブレ
ン、9,10−ジフェニルアントラセン、又はルテニウム含
有もしくはオスミウム含有ラベルである。ＢはＡに結合
した物質であり、ｋは１以上の整数であり、ｎは１以上
の整数である。
該方法によれば、適当な条件下で化学種を含有する反
応（試薬）混合物を形成し、化学種を電気化学エネルギ
に直接曝露することによって電磁放射線を反復的に放出
せしむべく誘導する。放出された電磁放射線は適当な方
法によって検出されこれによって化学種の存在を測定し
得る。
生物又は非生物物質（Ｂ）はＡに対する任意の結合形
態によって化学種に組み込まれることが可能である。結
合は、Ａ中に存在する金属原子又はＡのリガンドに対す
る配位によって行なわれる。結合は、共有結合、静電結
合又は水素結合でもよい。結合のタイプは、ＡとＢとの
双方の結合に使用し得る適当な化学基によって決定され
るであろう。
適当な物質（Ｂ）は例えば、全細胞、細胞下粒子、核
酸、多糖類、タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク
質、リポ多糖類、ポリペプチド、細胞代謝物、ホルモ
ン、薬理物質、トランキライザー、バルビツール酸エス
テル、アルカロイド、ステロイド、ビタミン、アミノ酸
及び糖である。物質は生物物質に限定されない。ポリマ
ー、有機又は無機の化合物の如き任意の適当な非生物物
質でもよい。
化学種は、室温で約200ナノメータ〜約900ナノメータ
の波長で発光する化学種の励起状態を生起することによ
って電磁放射線を放出すべく誘導される。本発明のこの
具体例において、化学種は反応（試薬）混合物を電気化
学エネルギに曝露することによって励起される。本発明
の化学種の還元又は酸化が生じる電位は、該化学種の正
確な化学構造と溶液のpH及び使用電極の種類の如き要因
とに依存する。電気化学ルミネセンスシステムの最適な
電位と放出波長との決定方法は当業者に公知である。電
気化学発光性の化学種を測定するには、電流又は放出電
磁放射線の測定の如き任意の適当な方法を用いる。
また、本発明の化学種の存在の測定方法を化学種が別
の化学物質と結合できる場合に利用することも可能であ
る。化学物質は化学種に特異的に結合し得る任意の物質
でよい。かかる方法の例として核酸ハイブリダイゼーシ
ョン法、抗体−抗原に基づく方法及び酵素−リガンド方
法がある。
本発明の別の具体例によれば、電気化学発光性の化学
種（Ａ）ｋ（Ｂ）ｕが、該化学種に結合する対象分析物
の存在を測定するために使用され得る。
対象分析物は、電気化学発光性の化学種に結合し得る
いかなる物質でもよい。例えば電気化学発光性の化学種
でラベルされた抗体に結合し得る抗原でもよい。方法
は、反応（試薬）混合物を形成させるに適した条件下で
分析物を化学種と接触させるステップを含む。次に化学
種を電気化学エネルギに直接曝露することによって電磁
放射線の反復的放出を誘導する。分析物に結合した化学
種によって放出された電磁放射線を検出することによっ
て分析物の存在を測定（判定）する。
また、対象分析物の存在を測定するために競合結合方
法を使用することも可能である。分析物と化学種（Ａ）
ｋ（Ｂ）ｕとは化学物質に競合的に結合する。反応混合
物を形成させるに適した条件下で化学物質を化学種と分
析物とに接触させる。次に化学種を電気化学エネルギに
直接曝露することによって電磁放射線の反復的放出を誘
導する。電磁放射線の放出量を検出することによって対
象分析物の存在を測定（判定）する。
本発明は更に、本発明のルテニウム含有又はオスミウ
ム含有化学種と異なる波長の電磁放射線を放出すべく誘
導され得る１種類以上の別の化学種とを含む組成物に係
る。これら組成物は同じ物質と別の物質との混合物に含
有される異なる２種以上の対象物質又は分析物を検出す
る方法及びシステムにおいて有効である。
別の１種以上の化学種は、電磁放射線を放出すべく誘
導され得る無機、有機及び有機金属化合物の如き任意の
適当な化学種、例えばルブレン又は9,10−ジフェニルア
ントラセンである。これらの化学種は、ルテニウム含有
又はオスミウム含有化学種から電磁放射線を誘導するた
めに使用されるエネルギとは異なる値を持つか又は異な
るエネルギ源からでるエネルギに曝露されるときに電磁
放射線を放出すべく誘導されるような化学種である。本
発明の特定具体例において、別の化学種の各々は、ルテ
ニウム含有又はオスミウム含有化学種の電磁放射線の放
出を誘導するエネルギと同じ値及び同じエネルギ源のエ
ネルギによって電磁放射線の放出を誘導されると別の異
なる波長の電磁放射線を放出する。
これら化学種の測定方法では、適当な条件下で化学種
を含有する反応（試薬）混合物を形成させ、次に反応混
合物を化学エネルギ又は電気化学エネルギに曝露して化
学種の電磁放射線放出を誘導する。化学種の各々によっ
て放出される別々の波長の電磁放射線を検出することに
よって各化学種の存在が決定される。
本発明は更に、同一混合物中に存在する異なる化学種
に選択的に結合する１種類以上の対象分析物の存在を測
定する方法に係る。方法は、反応（試薬）混合物を形成
させる適当な条件下で分析物と化学種とを接触させる。
反応混合物を化学エネルギ又は電気化学エネルギに曝露
することによって化学種を電磁放射線を放出すべく誘導
し、放出された異なる波長の電磁放射線を検出して対象
分析物の各々の存在を決定する。
混合物中の２種以上の化学種の存在を測定するこれら
の方法は、ルテニウム含有及びオスミウム含有の発光ラ
ベルを測定するための前記の全てのケースに適用でき
る。しかし乍ら、かかる具体例では同一サンプル中に同
時に存在する２種以上の異なる物質を測定し得る。
本発明の別の具体例によれば、別々の化学種は、別々
の値又は別々のエネルギ源のエネルギに曝露されて電磁
放射線を放出すべく誘導される。これらの別の化学種の
測定方法は誘導ステップ以外は、異なる波長の電磁放射
線を放出する化学種の測定方法と本質的に同じである。
これら化学種は、異なる値又はエネルギ源のエルネギに
よって電磁放射線を放出すべく誘導される。化学種含有
サンプルが異なる時間に別々の値又はエネルギ源のエネ
ルギの各々に曝露され、特定の化学種によって放出され
た電磁放射線が検出され、これにより化学種の存在が決
定される。方法はまた、サンプル中に存在する別々の化
学種に選択的に結合する対象分析物の存在を決定するた
めにも有効である。
本発明の別の具体例では、同一サンプル中に存在する
１種類以上の式（Ａ）ｋ（Ｂ）ｕをもつ電気化学発光性
の化学種を測定する方法及びシステムを含む。これら化
学種は、電気化学エネルギ源に曝露されると異なる波長
の電磁放射線を放出する化合物又は各々が別々の電気化
学エネルギ源に曝露されて電磁放射線を放出すべく誘導
され得る複数の異なる化合物を含有する。これら複数の
異なる電気化学発光性の化学種は別々の対象物質又は分
析物に特異的に結合し得る。異なる化学種の測定は前記
と同じ手順で行なわれる。
本発明を実施例に基づいて以下に説明する。これらの
実施例は本発明を理解し易くするための非限定例であ
り、本発明の範囲は請求の範囲のみによって限定され
る。
実施例Ｉ ルテニウムビス（2,2′−ビピリジン）（2,2′−ビピリ
ジン−4,4′−ジカルボン酸）ビス（ヘキサフルオロホ
スフェート）の調製 重炭酸ナトリウム（0.40g），ルテニウムジクロロビ
ス（2,2′−ビピリジン）（0.40g）及び2,2′−ビピリ
ジン−4,4′−ジカルボン酸（0.30g）を、環流メタノー
ル（20ml）−水（5ml）中で９時間撹拌した。得られた
溶液を氷浴中で冷却し、５滴の濃H2SO4で処理し、1.5時
間氷温に維持した。形成した沈殿を別しMeOH（8ml）
で洗浄した。
炉液と洗浄液を合わせたものを水（25ml）中のナトリ
ウムヘキサフルオロホスフェート（5.0g）の溶液で処理
した。得られた溶液を氷浴で３時間冷却し、赤紫色結晶
の得られた沈殿を過により回収した（0.40g）。
実施例II ルテニウムビス（2,2′−ビピリジン）（2,2′−ビピリ
ジン−4,4′−ジカルボン酸）の活性エステルの調製 ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC.0.046g）及び
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（0.034g）をDMF（2ml）
中に撹拌して溶解し、氷溶中で冷却した。ルテニウムビ
ス（2,2′−ビピリジン）（2,2′−ビピリジン−4,4′
−ジカルボン酸）（0.101g、実施例Ｉのように調製し
た）をDMF（1ml）中に溶解した溶液を加え、混合物を氷
浴温度で５時間撹拌した。形成した沈殿を遠心分離し
た。活性化ルテニウム複合体を含む上清を、基質を標識
するために保存した。
実施例III 子牛血清アルブミン（BSA）の活性化ルテニウム複合体
による標識化 実施例IIで調製した活性化ルテニウム複合体のDMF溶
液（1ml）を、撹拌下の水性生理緩衝塩溶液（PBS,5ml）
中のBSA溶液（25mg/ml BSA）に加えた。混合物を１夜撹
拌し、沈殿を遠心分離で除去した。ルテニウム標識BSA
を含む上清を２つの方法で分析した。
方法1:透析 ルテニウム標識BSA溶液をPBS溶液で透析した。コント
ロールとして実施例IIで調製した非結合の活性化ルテニ
ウム複合体もPBS溶液で透析した。８時間後、コントロ
ールでは透析チューブ中には蛍光を有するものは見られ
なかった。それに対し、ルテニウム標識BSA溶液は強い
蛍光を示し、ルテニウム複合体が高分子量BSAに結合し
たことを示した。
方法2:マイクロフィルトレーション ルテニウム標識BSA溶液をアミコンマイクロコンセン
トレーター中に入れ、8000rpmで遠心した。赤橙色溶液
の小画分がフィルター上に残り、この着色画分を洗浄PB
S溶液で希釈し遠心した。この手順は数回繰り返した。
４回の洗浄後、フィルターを通しては無色の溶液が見ら
れ、フィルター上には強く赤橙色に着色した物質が残っ
た。この結果は、ルテニウム複合体が高分子量BSAに結
合したことを示している。
実施例IV ヒトイムノグロブリンＧ（IgG）の活性化ルテニウム複
合体による標識化 実施例IIで調製した活性化ルテニウム複合体のDMF溶
液を撹拌下に水性バッファー中のアフィニティー精製ヒ
トIgG溶液に加えた。ルテニウム標識化IgG溶液は、充分
に透析した後に強い蛍光を示し、ルテニウム複合体が高
分子量のアフィニティー精製ヒトIgGに結合したことが
示された。
実施例Ｖ ウサギ抗サルモネラ抗体の標識化 実施例IIで調製した活性化ルテニウム複合体のDMF溶
液（0.1ml）を抗サルモネラ抗体を含むウサギ血清（1m
l）と共に室温で１時間撹拌し、その後ジエタノールア
ミン（0.1ml）を加えて停止した。ルテニウム標識抗サ
ルモネラ抗体を含む得られた溶液でサルモネラ細胞を処
理した。細胞の遠心分離及び新鮮バッファーへの再懸濁
を５回繰り返し、全ての非結合抗体（ルテニウム標識非
結合抗体を含む）及び全ての遊離ルテニウム複合体から
細胞を分離した。ルテニウム標識抗サルモネラ抗体で処
理したサルモネラ細胞は、蛍光光学顕微鏡で観察すると
明るい赤橙色光を発しており、抗サルモネラ抗体がルテ
ニウム複合体で標識され、ルテニウム標識抗体はルテニ
ウム複合体が蛍光を発する条件下でサルモネラ細胞に結
合する能力を保有することが示された。
実施例VI 正常マウス血清（即ち、抗サルモネラ抗体を持たな
い）を抗サルモネラ抗体を含むウサギ血清の代りに使用
して実施例Ｖの手順を繰り返した。処理後、サルモネラ
細胞は蛍光光学顕微鏡で観察しても赤橙色を発しておら
ず、ルテニウム標識正常マウス血清成分のサルモネラ細
胞に対する非特異的結合は起らないことが示された。
実施例VII ヤギ抗ウサギイムノグロブリン（IgG）の標識化及びロ
ーダミンとの比較 実施例IIで調製した活性化ルテニウム複合体のDMF溶
液を撹拌下にアフィニティー精製ヤギ抗ウサギIgG溶液
に加えた。反応後、混合物をバッファーに対して透析し
た。透析チューブ内に残った物質はUVライト下で蛍光を
発した。
ルテニウム標識IgGのウサギ抗サルモネラ抗体被覆サ
ルモネラに対する反応性をテストした。ガラス顕微鏡ス
ライドに固定したサルモネラ・ワーシントン（Salmonel
la worthington）とウサギ抗サルモネラ抗体を反応さ
せ、非反応抗体をバッファーで洗い流した。次にルテニ
ウム標識ヤギ抗ウサギIgGを抗体処理サルモネラ・ワー
シントンと反応させ、非反応物質をバッファーで洗い流
した。このスライドを50W水銀ランプを備えた光学顕微
鏡で観察すると、非常に明るい橙赤色螢光がバクテリア
上及び周囲に見られた。
ルテニウム標識抗体の非特異性結合についてコントロ
ールの実験を行なった。ガラス顕微鏡スライドに固定し
たサルモネラ・ワーシントンを正常マウス血清と反応さ
せ、その後ルテニウム標識ヤギ抗ウサギIgG抗血清と反
応させた。その後同じ洗浄工程を行なった。橙赤色蛍光
は観察されなかった。
比較の目的で、ローダミンイソチオシアナート結合ヤ
ギ抗ウサギIgG抗血清を（ルテニウム結合抗体と等価の
タンパク質濃度で）、ウサギ抗サルモネラ抗体で被膜し
たサルモネラ・ワーシントンと反応させた。赤色の蛍光
がわずかに検出されたが、蛍光の強度はルテニウム結合
体に比較して有意に小さいものであった。
実施例VIII ルテニウム標識・子ウシ血清アルブミン（BSA）の電気
化学発光（ECL）検知 光学的に平坦な底部を有する１区角タイプのセル（30
ml）中でECL測定を行なった。測定電極はガラス状炭素
で、対する電極はプラチナネットとし、疑似対照電極は
銀ワイヤで行なった。光強度の測定は、−2.0V（Agワイ
ヤに対して）の電位をかけ、光増強管（Hamamatsu 92
8）で発光を検知し、２つに対して得られる信号をBasco
m−Turner Recorderで統合した。
アセトニトリル−水（9ml,50:50v/v），テトラブチル
アンモニウムテトラフルオロボレート（329mg）及びジ
アンモニウムパーオキシジスルフェート（42mg）をECL
セル中で混合し、バックグラウンド光強度を記録した。
ルテニウム標BSA溶液（実施例IIIで調製したもの）を、
アセトニトリル−水（50:50v/v）中に希釈し、該希釈BS
A溶液（1ml）をECLセル中に加えた。得られた溶液は溶
媒飽和窒素気泡で脱気した。表Ｉはルテニウム標識BSA
の異なる濃度に対して得られた結果を示している。
実施例IX 4,4′−ジ（クロロメチル）−2,2′−ビピリジン−ビス
（2,2′−ビピリジン）ルテニウム（II）2+の調製 Sprintschink等（J.Amer.Chem.Soc.99,4947（197
7））の方法により、2,2−ビピリジン−4,4′−ジカル
ボン酸から4,4′−ジエトキシカルボニル−2,2′−ビピ
リジンを調製した。該ジエチルエステル（100mg）を無
水ジエチルエーテル（35ml）中に溶解した。リチウムア
ルミニウムヒドリド（100mg）を加え、30分インキュベ
ートした後ジエチルエーテル（35ml）を及び氷冷脱イオ
ン水（100ml）を加えた。溶液をよく混合し、エーテル
層を回収した。水成層はエーテル（70ml）で２回以上抽
出した。エーテル抽出物を合わせ、無水硫酸ナトリウム
で乾燥し過した。ロータリーエバポレーターで溶媒を
除去し、所望生成物（43mg）を得た。この43mgの4,4−
ジ（ヒドロキシメチル）−2,2′−ビピリジン及び120mg
のcis−ジクロロビス（2,2′−ビピリジン）ルテニウム
（II）ジヒドレートをエタノール（25ml）に加え、溶液
を14時間環流させた。溶液を冷却した後、アンモニウム
ヘキサフルオロホスフェートの溶液（水1ml中1mg）の50
μｌを加え、得られた結晶状固体を回収し、少量のエタ
ノールで洗浄して乾燥し、138mgの4,4−ジヒドロキシメ
チル複合体のヘキサフルオロホスフェート塩を得た。こ
の複合体（6mg）を塩化チオニル（5ml）に加え、溶液を
６時間環流させた。蒸留により塩化チオニルを除去し、
固体残渣をジオキサン−水（1:1）混合物（500μｌ）に
溶解した。4,4′−ジ（クロロメチル）−2,2′−ビピリ
ジン−ビス−（2,2′−ビピリジン）ルテニウム（II）
2+を含むこの溶液を抗体の標識に使用した。
実施例Ｘ 4,4′−ジ（クロロメチル）−2,2′−ビピリジン−ビス
（2,2′−ビピリジン）ルテニウム（II）2+によるウサ
ギ及びヒツジ抗マウスIgGの標識化 ウサギ及びヒツジ抗体をPBS中の2mg/mlの溶液とし
た。これ等の溶液を重炭酸ナトリウム（500ml,50mM,pH
9）に対して一晩透析した。その後抗体（2mg）を重炭酸
ナトリウム溶液で希釈し2mlの最終容量とした。この溶
液（1ml）を炭酸ナトリウム溶液（1ml,50mM）に加えpH
を10に調整した。ジオキサン−水中の活性化複合体溶液
（100μｌ）を抗体溶液に加え４℃で16時間反応させ
た。この後、反応物にBSA（5mg）を加え、溶液を直ちに
炭酸バッファー（500ml,25mM,pH9）に対して透析した。
透析バッファーは24時間間隔で３回交換した。
実施例XI 蛍光光度測定分析による標識ウサギ及びヒツジ抗マウス
イムノグロブリンの免疫学的反応性のデモンストレーシ
ョン レジオネラ・ニューモフィラ１（Legionella pneumop
hila1,Philadelphia 1単離体）のホルマリン化懸濁液を
PBSバッファーで希釈して光学密度1.00（425nm）に調整
した。この懸濁液の1.3希釈物（1ml）を一連の円垂形マ
イクロ遠心分離管に入れた。細胞を遠心分離（10分,100
00RPM），上清を傾瀉して細胞をマウスモノクローナルI
gG抗体を含むPBS（“10C8"0.85mg/ml）（1ml）あるいは
陰性対照としてのPBS中に1:100希釈物として再懸濁し
た。室温で１時間インキュベートした後、細胞を先と同
じように遠心分離し、上清を傾瀉して細胞をPBSバッフ
ァー中に再懸濁し、再度遠心分離した。上清を傾瀉した
後、細胞を貯蔵ルテニウム標識ウサギ及びヒツジ抗マウ
スIgG抗体の1:5希釈物（PBS中）（1ml,10mgルテニウム
複合体/ml）、あるいは陽性対照としてフルオレセイン
標識ヤギ抗マウスIgG抗体の1:50希釈物（PBS中）（1ml,
0.5mgIgG/ml）、あるいは陰性対照としてPBS中に再懸濁
した。室温で１時間インキュベートした後、前と同じよ
うに細胞を遠心分離して上清を傾瀉し、細胞をPBS中に
再懸濁して前のように遠心分離で２回洗浄した。最後の
洗浄の後細胞をPBS（1ml）中に再懸濁し、ポリスチレン
キュベット中に移して蛍光光度測定分析に供した。
フルオレセイン標識ヤギ抗マウスIgG抗体溶液の励起
及び放射を精査したところ、491nmに励起ピーク、519nm
に放射ピークが観察された。これ等の波長をフルオレセ
イン標識細胞の蛍光測定に使用した。ルテニウム標識ウ
サギ／ヒツジ抗マウスIgG抗体溶液の励起及び放射を精
査したところ、455nmに励起ピーク、623nmに放射ピーク
が認められた。これ等の波長をルテニウム標識細胞の蛍
光測定に使用した。“10C8"第１抗体及び蛍光性結合体
の代りにPBSとインキュベートした細胞懸濁液を陰性コ
ントロールとし、蛍光光度計のブランクに使用した。
“10C8"第１抗体と蛍光性結合体の両方と共にインキュ
ベートした細胞懸濁液の蛍光を100とし、その他の全て
の蛍光測定はこれ等の内部標準に対する相対的な蛍光単
位で行なった。表IIに示した結果は、ルテニウム標識抗
マウスIgG結合体は蛍光を発し、“10C8"第１抗体の存在
下で特異的な免疫学的反応性を示すことを表わしてい
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/58

Claims (189)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】次式を有する化合種 〔M(P)m(L1)n(L2)o(L3)p(L4)q(L5)r(L6)s〕t(B)u 〔式中、Ｍはルテニウムまたはオスミウムであり； ＰはＭの窒素含有芳香族複素環式の二座配位リガンドで
    あって、ビピリジル、置換ビピリジル、ビピラジル、置
    換ビピラジル、フェナントロリル及び置換フェナントロ
    リル（ここでこれらの置換された基のそれぞれは、アル
    キル、アリール、アラルキル、カルボキシレート、カル
    ボキサルデヒド、カルボキサミド、シアノ、アミノ、ヒ
    ドロキシカルボニル、ヒドロキシアミノ、アミノカルボ
    ニル、アミジン、グアニジニウム、ウレイド、イオウ含
    有基、リン含有基またはＮ−ヒドロキシスクシンイミド
    のカルボキシレートエステルによって置換されている）
    から選ばれ； L1およびL2は、それぞれ独立に、Ｍの窒素含有芳香族複
    素環式の二座配位リガンドであって、ビピリジル、置換
    ビピリジル、ビピラジル、置換ビピラジル、フェナント
    ロリル及び置換フェナントロリル（ここでこれらの置換
    された基のそれぞれは、アルキル、アリール、アラルキ
    ル、カルボキシレート、カルボキサルデヒド、カルボキ
    サミド、シアノ、アミノ、ヒドロキシカルボニル、ヒド
    ロキシアミノ、アミノカルボニル、アミジン、グアニジ
    ウム、ウレイド、イオウ含有基、リン含有基あるいはＮ
    −ヒドロキシスクシンイミドのカルボキシレートエステ
    ルによって置換されている）から選ばれるか、あるいは
    一酸化炭素、シアニド、イソシアニド、ハライド、並び
    に脂肪族、芳香族及び複素環ホスフィン、アミン、スチ
    ルビン及びアルシンから選ばれる単座配位リガンドであ
    り； L3、L4、L5およびL6は、それぞれ、一酸化炭素、シアニ
    ド、イソシアニド、ハライド、並びに脂肪族、芳香族及
    び複素環ホスフィン、アミン、スチルビン及びアルシン
    から選ばれる単座配位リガンドであり； Ｐ、L1、L2、L3、L4、L5及びL6のそれぞれは同じでも異
    なっていてもよく； Ｂは、生物学的物質、相補性物質と結合競争反応におい
    て生物学的物質と競合し得る合成物質、あるいは非生物
    学的ポリマーであり； ｍは１であり； ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ及びｓのそれぞれはゼロまたは１で
    あり； ｔは１以上の整数であり； そして該リガンドＬの２つが二座配位である時には、そ
    の化学種は下記式 で表され、ｎ及びｏは１であり、ｐ、ｑ、ｒ及びｓはゼ
    ロであり、linkは共有結合、静電気的結合、またはＰ、
    Ｍ、L1あるいはL2の少なくとも１つとの水素結合Ｂであ
    り； 該リガンドＬの１つが二座配位である時には、その化学
    種は下記式 で表され、ｎは１であり、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ及びｓのそれ
    ぞれはゼロまたは１であり、linkは共有結合、静電気的
    結合、またはＰ、Ｍ、L1、L2、L3、L4、L5及びL6の少な
    くとも１つとの水素結合Ｂであり； 該リガンドＬのいずれもが二座配位でない時には、その
    化学種は下記式 で表され、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ及びｓのそれぞれはゼロ
    または１であり、linkは共有結合、静電気的結合、ある
    いはＰ、Ｍ、L1、L2、L3、L4、L5及びL6の少なくとも１
    つとの水素結合Ｂであり； Ｐ、Ｍ、L1、L2、L3、L4、L5、L6及びＢは、電磁放射線
    を放出させるべくこの化学種を誘導できるような組成と
    数になっており、Ｍのリガンドによって与えられるＭと
    の結合の総数はＭの配位数に等しい〕。
  2. 【請求項２】Ｍがルテニウムである請求の範囲１の化学
    種。
  3. 【請求項３】Ｍがオスミウムである請求の範囲１の化学
    種。
  4. 【請求項４】Ｐが芳香族複素環式リガンドである請求の
    範囲１の化学種。
  5. 【請求項５】Ｐが窒素を含有している請求の範囲４の化
    学種。
  6. 【請求項６】Ｐがビピリジル、ビピラジル、ターピリジ
    ル、フェナントロリル、置換ビピリジル、置換ビピラジ
    ル、置換ターピリジルまたは置換フェナントロリルであ
    る請求の範囲５の化学種。
  7. 【請求項７】Ｐがアルキル、置換アルキル、アリール、
    置換アリール、アルアルキル、置換アルアルキル、カル
    ボキシレート、カルボキサルデヒド、カルボキサミド、
    シアノ、アミノ、ヒドロキシカルボニル、ヒドロキシア
    ミノ、アミノカルボニル、アミジン、グアニジニウム、
    ウレイド、イオウ含有基、リン含有基またはＮ−ヒドロ
    キシスクシンイミドのカルボキシレートエステル置換基
    によって置換されている請求の範囲６の化学種。
  8. 【請求項８】L1、L2、L3、L4、L5及びL6の少なくとも１
    個が多座配位の芳香族複素環式リガンドである請求の範
    囲１の化学種。
  9. 【請求項９】L1、L2、L3、L4、L5及びL6の少なくとも１
    個が窒素を含有している請求の範囲８の化学種。
  10. 【請求項１０】L1、L2、L3、L4、L5及びL6の少なくとも
    １個がビピリジル、ビピラジル、ターピリジル、フェナ
    ントロリル、置換ビピリジル、置換ビピラジル、置換タ
    ーピリジルまたは置換フェナントロリルである請求の範
    囲９の化学種。
  11. 【請求項１１】L1、L2、L3、L4、L5及びL6の少なくとも
    １個がアルキル、置換アルキル、アリール、置換アリー
    ル、アルアルキル、置換アルアルキル、カルボキシレー
    ト、カルボキサルデヒド、カルボキサミド、シアノ、ア
    ミノ、ヒドロキシカルボニル、ヒドロキシアミノ、アミ
    ノカルボニル、アミジン、グアニジニウム、ウレイド、
    イオウ含有基、リン含有基またはＮ−ヒドロキシスクシ
    ンイミドのカルボキシレートエステル置換基によって置
    換されている請求の範囲10の化学種。
  12. 【請求項１２】二座配位リガンドを２個含有し、各二座
    配位リガンドがビピリジル、ビピラジル、ターピリジ
    ル、フェナントロリル、置換ビピリジル、置換ビピラジ
    ル、置換ターピリジルまたは置換フェナントロリルであ
    る請求の範囲１の化学種。
  13. 【請求項１３】二座配位リガンドを３個含有し、各二座
    配位リガンドがビピリジル、ビピラジル、ターピリジ
    ル、フェナントロリル、置換ビピリジル、置換ビピラジ
    ル、置換ターピリジルまたは置換フェナントロリルであ
    る請求の範囲１の化学種。
  14. 【請求項１４】Ｍがルテニウムである請求の範囲13の化
    学種。
  15. 【請求項１５】二座配位ビピリジルリガンドを２個、置
    換された二座配位ビピリジルリガンドを１個含有する請
    求の範囲14の化学種。
  16. 【請求項１６】Ｂが全細胞、細胞下粒子、ポリペプチ
    ド、核酸、多糖、タンパク質、糖タンパク質、リポタン
    パク質、リポ多糖、ポリペプチド、細胞代謝物、ホルモ
    ン、薬理剤、トランキライザー、バルビツエート、アル
    カロイド、ステロイド、ビタミン、アミノ酸または非生
    体ポリマーである請求の範囲１の化学種。
  17. 【請求項１７】Ｂが植物病原体である請求の範囲16の化
    学種。
  18. 【請求項１８】Ｂが血清由来抗体またはモノクローナル
    抗体である請求の範囲16の化学種。
  19. 【請求項１９】ＢがT4甲状腺ホルモンである請求の範囲
    16の化学種。
  20. 【請求項２０】アミド結合の配向が、このアミド結合の
    カルボニル基が前記の置換ビピリジルリガンドに直接結
    合するようなものである請求の範囲１の化学種。
  21. 【請求項２１】次式を有する化学種 〔M(P)m(L1)n(L2)o(L3)p(L4)q(L5)r(L6)s〕t(B)u 〔式中、Ｍはルテニウムまたはオスミウムであり； ＰはＭの窒素含有芳香族複素環式の二座配位リガンドで
    あって、ビピリジル、置換ビピリジル、ビピラジル、置
    換ビピラジル、フェナントロリル及び置換フェナントロ
    リル（ここでこれらの置換された基のそれぞれは、アル
    キル、アリール、アラルキル、カルボキシレート、カル
    ボキサルデヒド、カルボキサミド、シアノ、アミノ、ヒ
    ドロキシカルボニル、ヒドロキシアミノ、アミノカルボ
    ニル、アミジン、グアニジニウム、ウレイド、イオウ含
    有基、リン含有基またはＮ−ヒドロキシスクシンイミド
    のカルボキシレートエステルによって置換されている）
    から選ばれ； L1およびL2は、それぞれ独立に、Ｍの窒素含有芳香族複
    素環式の二座配位リガンドであって、ビピリジル、置換
    ビピリジル、ビピラジル、置換ビピラジル、フェナント
    ロリル及び置換フェナントロリル（ここでこれらの置換
    された基のそれぞれは、アルキル、アリール、アラルキ
    ル、カルボキシレート、カルボキサルデヒド、カルボキ
    サミド、シアノ、アミノ、ヒドロキシカルボニル、ヒド
    ロキシアミノ、アミノカルボニル、アミジン、グアニジ
    ウム、ウレイド、イオウ含有基、リン含有基あるいはＮ
    −ヒドロキシスクシンイミドのカルボキシレートエステ
    ルによって置換されている）から選ばれるか、あるいは
    一酸化炭素、シアニド、イソシアニド、ハライド、並び
    に脂肪族、芳香族及び複素環ホスフィン、アミン、スチ
    ルビン及びアルシンから選ばれる単座配位リガンドであ
    り； L3、L4、L5およびL6は、それぞれ、一酸化炭素、シアニ
    ド、イソシアニド、ハライド、並びに脂肪族、芳香族及
    び複素環ホスフィン、アミン、スチルビン及びアルシン
    から選ばれる単座配位リガンドであり； Ｐ、L1、L2、L3、L4、L5及びL6のそれぞれは同じでも異
    なっていてもよく； Ｂは、生物学的物質、相補性物質との結合競争反応にお
    いて生物学的物質と、競合し得る合成物質、あるいは非
    生物学的ポリマーであり； ｍは１であり； ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ及びｓのそれぞれはゼロまたは１で
    あり； ｔは１以上の整数であり； そして該リガンドＬの２つが二座配位である時には、そ
    の化学種は下記式 で表され、ｎ及びｏは１であり、ｐ、ｑ、ｒ及びｓはゼ
    ロであり、linkは共有結合、静電気的結合、またはＰ、
    Ｍ、L1あるいはL2の少なくとも１つとの水素結合Ｂであ
    り； 該リガンドＬの１つが二座配位である時には、その化学
    種は下記式 で表され、ｎは１であり、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ及びｓのそれ
    ぞれはゼロまたは１であり、linkは共有結合、静電気的
    結合、またはＰ、Ｍ、L1、L2、L3、L4、L5及びL6の少な
    くとも１つとの水素結合Ｂであり； 該リガンドＬのいずれもが二座配位でない時には、その
    化学種は下記式 で表され、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ及びｓのそれぞれはゼロ
    または１であり、 linkは共有結合、静電気的結合、あるいはＰ、Ｍ、L1、
    L2、L3、L4、L5及びL6の少なくとも１つとの水素結合Ｂ
    であり； Ｐ、Ｍ、L1、L2、L3、L4、L5、L6及びＢは、電磁放射線
    を放出させるべくこの化学種を誘導できるような組成と
    数になっており、Ｍのリガンドによって与えられるＭと
    の結合の総数はＭの配位数に等しい〕の化学種の存在を
    測定するための方法であって、前記化学種を含有する試
    薬混合物を形成し、前記種の存在を検出することからな
    る方法。
  22. 【請求項２２】前記種の存在の測定が、原子吸光法、分
    光光度法、電気化学法、化学法、化学ルミネセンス法、
    ホトルミネセンス法または電気化学ルミネセンス法から
    なる請求の範囲21の方法。
  23. 【請求項２３】前記種の存在の測定が、前記化学種を誘
    導して電磁放射線を放出させ、この放出された電磁放射
    線を検出することからなる請求の範囲21の方法。
  24. 【請求項２４】電磁放射線を放出させるための前記化学
    種の誘導が試薬混合物を電磁エネルギー、化学エネルギ
    ーまたは電気化学エネルギーに曝露することからなる請
    求の範囲23の方法。
  25. 【請求項２５】試薬混合物を化学エネルギーまたは電気
    化学エネルギーに曝露する請求の範囲24の方法。
  26. 【請求項２６】Ｂが全細胞、細胞下粒子、核酸、多糖、
    タンパク質、リポタンク質、リポ多糖、糖タンパク質、
    ポリペプチド、細胞代謝物、ホルモン、薬理剤、トラン
    キライザー、バルビツエート、アルカロイド、ステロイ
    ド、ビタミン、アミノ酸、糖または非生体ポリマーであ
    る請求の範囲25の方法。
  27. 【請求項２７】Ｂがヌクレオチドまたはポリヌクレオチ
    ドである請求の範囲26の方法。
  28. 【請求項２８】Ｂが血清由来抗体またはモノクローナル
    抗体である請求の範囲26の方法。
  29. 【請求項２９】試薬混合物を電気化学エネルギーに曝露
    する請求の範囲25の方法。
  30. 【請求項３０】試薬混合物を化学エネルギーに曝露する
    請求の範囲25の方法。
  31. 【請求項３１】試薬混合物を電磁放射線、化学エネルギ
    ーおよび電気化学エネルギーの組合せに曝露する請求の
    範囲25の方法。
  32. 【請求項３２】化学種をエネルギー源に曝露することに
    よって酸化する請求の範囲25の方法。
  33. 【請求項３３】化学種をエネルギー源に曝露することに
    よって還元する請求の範囲25の方法。
  34. 【請求項３４】電磁放射線を放出させるべく誘導される
    各化学種が誘導されて電磁放射線を一回より多く放出す
    る請求の範囲24または25の方法。
  35. 【請求項３５】試薬混合物がオキサレート、ピルベー
    ト、ラクテート、マロネート、シトレート、タートレー
    トまたはバーオキシジサルフェートを含有する請求の範
    囲25の方法。
  36. 【請求項３６】エネルギー源が化学還元剤である請求の
    範囲33の方法。
  37. 【請求項３７】化学還元剤がマグネシウムである請求の
    範囲36の方法。
  38. 【請求項３８】エネルギー源が化学酸化剤である請求の
    範囲32の方法。
  39. 【請求項３９】酸化剤がCe（IV）塩またはPbO2である請
    求の範囲38の方法。
  40. 【請求項４０】試薬混合物がパーオキシジサルフェート
    を含有する請求の範囲33の方法。
  41. 【請求項４１】試薬混合物がオキサレート、ピルベー
    ト、ラクテート、マロネート、シトレートまたはタート
    レートを含有する請求の範囲32の方法。
  42. 【請求項４２】前記化学種を還元するのに充分なポテン
    シャルとこの化学種を酸化するのに充分なポテンシャル
    の間で振動するポテンシャルをもつ電極に試薬混合物を
    連続的に曝露する請求の範囲29の方法。
  43. 【請求項４３】エネルギー源が化学種を酸化するのに充
    分なポテンシャルの上下で振動するポテンシャルをもつ
    電極であり、試薬混合物がオキサレート、ピルベート、
    ラクテート、マロネート、タートレートまたはシトレー
    トを含有する請求の範囲32の方法。
  44. 【請求項４４】エネルギー源が前記化学種を酸化するの
    に充分で一定のポテンシャルをもつ電極であり、試薬混
    合物がオキサレート、ピルベート、ラクテート、マロネ
    ート、タートレートまたはシトレートを含有する請求の
    範囲32の方法。
  45. 【請求項４５】エネルギー源が前記化学種を還元するの
    に充分なポテンシャルの上下で振動するポテンシャルを
    もつ電極であり、試薬混合物がパーオキシジサルフェー
    トを含有する請求の範囲32の方法。
  46. 【請求項４６】エネルギー源が前記化学種を還元するの
    に充分で一定のポテンシャルをもつ電極であり、試薬混
    合物がパーオキシジサルフェートを含有する請求の範囲
    33の方法。
  47. 【請求項４７】試薬混合物がアセトニトリルを含有する
    請求の範囲45の方法。
  48. 【請求項４８】試薬混合物がアセトニトリルを含有する
    請求の範囲46の方法。
  49. 【請求項４９】放出された電磁放射線を連続的に検出す
    ることを含む請求の範囲29または30の方法。
  50. 【請求項５０】放出電磁放射線の検出を視覚的に実施す
    る請求の範囲49の方法。
  51. 【請求項５１】電磁放射線の連続的検出がフォトダイオ
    ードの使用を含む請求の範囲49の方法。
  52. 【請求項５２】放出された電磁放射線を累積的に検出す
    ることを含む請求の範囲29または30の方法。
  53. 【請求項５３】放出電磁放射線の検出が写真フィルムの
    使用を含む請求の範囲52の方法。
  54. 【請求項５４】次式を有する化学種 〔M(P)m(L1)n(L2)o(L3)p(L4)q(L5)r(L6)s〕t(B)u 〔式中、Ｍはルテニウムまたはオスミウムであり； ＰはＭの窒素含有芳香族複素環式の二座配位リガンドで
    あって、ビピリジル、置換ビピリジル、ビピラジル、置
    換ビピラジル、フェナントロリル及び置換フェナントロ
    リル（ここでこれらの置換された基のそれぞれは、アル
    キル、アリール、アラルキル、カルボキシレート、カル
    ボキサルデヒド、カルボキサミド、シアノ、アミノ、ヒ
    ドロキシカルボニル、ヒドロキシアミノ、アミノカルボ
    ニル、アミジン、グアニジニウム、ウレイド、イオウ含
    有基、リン含有基またはＮ−ヒドロキシスクシンイミド
    のカルボキシレートエステルによって置換されている）
    から選ばれ； L1およびL2は、それぞれ独立に、Ｍの窒素含有芳香族複
    素環式の二座配位リガンドであって、ビピリジル、置換
    ビピリジル、ビピラジル、置換ビピラジル、フェナント
    ロリル及び置換フェナントロリル（ここでこれらの置換
    された基のそれぞれは、アルキル、アリール、アラルキ
    ル、カルボキシレート、カルボキサルデヒド、カルボキ
    サミド、シアノ、アミノ、ヒドロキシカルボニル、ヒド
    ロキシアミノ、アミノカルボニル、アミジン、グアニジ
    ニウム、ウレイド、イオウ含有基、リン含有基あるいは
    Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドのカルボキシレートエス
    テルによって置換されている）から選ばれるか、あるい
    は一酸化炭素、シアニド、イソシアニド、ハライド、並
    びに脂肪族、芳香族及び複素環ホスフィン、アミン、ス
    チルビン及びアルシンから選ばれる単座配位リガンドで
    あり； L3、L4、L5およびL6は、それぞれ、一酸化炭素、シアニ
    ド、イソシアニド、ハライド、並びに脂肪族、芳香族及
    び複素環ホスフィン、アミン、スチルビン及びアルシン
    から選ばれる単座配位リガンドであり； Ｐ、L1、L2、L3、L4、L5及びL6のそれぞれは同じでも異
    なっていてもよく； Ｂは、生物学的物質、相補性物質との結合競争反応にお
    いて生物学的物質と競合し得る合成物質、あるいは非生
    物学的ポリマーであり； ｍは１であり； ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ及びｓのそれぞれはゼロまたは１で
    あり； ｔは１以上の整数であり； そして該リガンドＬの２つが二座配位である時には、そ
    の化学種は下記式 で表され、ｎ及びｏは１であり、ｐ、ｑ、ｒ及びｓはゼ
    ロであり、linkは共有結合、静電気的結合、またはＰ、
    Ｍ、L1あるいはL2の少なくとも１つとの水素結合Ｂであ
    り； 該リガンドＬの１つが二座配位である時には、その化学
    種は下記式 で表され、ｎは１であり、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ及びｓのそれ
    ぞれはゼロまたは１であり、linkは共有結合、静電気的
    結合、またはＰ、Ｍ、L1、L2、L3、L4、L5及びL6の少な
    くとも１つとの水素結合Ｂであり； 該リガンドＬのいずれもが二座配位でない時には、その
    化学種は下記式 で表され、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ及びｓのそれぞれはゼロ
    または１であり、linkは共有結合、静電気的結合、ある
    いはＰ、Ｍ、L1、L2、L3、L4、L5及びL6の少なくとも１
    つとの水素結合Ｂであり； Ｐ、Ｍ、L1、L2、L3、L4、L5、L6及びＢは、電磁放射線
    を放出させるべくこの化学種を誘導できるような組成と
    数になっており、Ｍのリガンドによって与えられるＭと
    の結合の総数はＭの配位数に等しい〕の存在を測定する
    ための方法であって、 （ａ）前記化学種を含有する試薬混合物を形成し、ある
    いは当該試薬混合物を電気化学的エネルギーに曝露した
    際にリダクタントあるいはオキシダントを形成する試薬
    と前記化学種とを含有する試薬混合物を形成し； （ｂ）前記化学種を酸化するに十分なポジティブのポテ
    ンシャルと、前記化学種を還元するに十分なネガティブ
    のポテンシャルとの間を変動するポテンシャルの電気化
    学的エネルギーに前記試薬混合物を曝露し、あるいは前
    記化学種が酸化され前記試薬がリダクタントを形成する
    ようなあるいは前記化学種が還元され前記試薬がオキシ
    ダントを形成するような電気化学的エネルギーに前記試
    薬混合物を曝露し、前記化学種を誘導して電磁放射線を
    放出させ； （ｃ）放出された電磁放射線を検出することにより前記
    化学種の存在を測定することからなる方法。
  55. 【請求項５５】前記試薬混合物中に更に、（ｉ）１つも
    しくはそれ以上の付加的な対象分析物、（ii）１つもし
    くはそれ以上の付加的な化学種、あるいは（iii）１つ
    もしくはそれ以上の付加的な対象分析物及び１つもしく
    はそれ以上の化学種、を導入する請求の範囲54の方法。
  56. 【請求項５６】前記種が化学試剤に結合できるものであ
    る請求の範囲54の方法。
  57. 【請求項５７】Ｂが１個以上のアミド結合またはアミン
    結合を介してＰ、L1、L2、L3、L4、L5またはL6の１個以
    上と共有結合している物質である請求の範囲54、56また
    は57の方法。
  58. 【請求項５８】Ｂが全細胞、細胞下粒子、核酸、多糖、
    タンパク質、リポタンク質、リポ多糖、糖タンパク質、
    ポリペプチド、細胞代謝物、ホルモン、薬理剤、トラン
    キライザー、バルビツエート、アルカロイド、ステロイ
    ド、ビタミン、アミノ酸、糖または非生体ポリマーであ
    る請求の範囲54または56の方法。
  59. 【請求項５９】Ｂがヌクレオチドまたはポリヌクレオチ
    ドである請求の範囲58の方法。
  60. 【請求項６０】Ｂが血清由来抗体またはモノクローナル
    抗体である請求の範囲58の方法。
  61. 【請求項６１】前記化学試剤が全細胞、細胞下粒子、核
    酸、多糖、タンパク質、リポタンパク質、リポ多糖、糖
    タンパク質、ポリペプチド、細胞代謝物、ホルモン、薬
    理剤、トランキライザー、バルビツエート、アルカロイ
    ド、ステロイド、ビタミン、アミノ酸、糖または非生体
    ポリマーである請求の範囲56の方法。
  62. 【請求項６２】前記化学試剤がアッセイ容器表面に固定
    化されている請求の範囲56の方法。
  63. 【請求項６３】方法が均一法であり、適切な条件が、結
    合化学種および未結合化学種が試薬混合物をエネルギー
    源に曝露する前には分離されないようなものである請求
    の範囲56の方法。
  64. 【請求項６４】方法が不均一法であり、適切な条件が試
    薬混合物をエネルギー源に曝露する前に結合化学種と未
    結合化学種とを分離することからなる請求の範囲56の方
    法。
  65. 【請求項６５】試薬混合物を電気化学エネルギーに曝露
    する請求の範囲54または56の方法。
  66. 【請求項６６】試薬混合物を化学エネルギーに曝露する
    請求の範囲54または56の方法。
  67. 【請求項６７】試薬混合物を電磁放射線、化学エネルギ
    ーおよび電気化学エネルギーの組合せに曝露する請求の
    範囲54または56の方法。
  68. 【請求項６８】化学種をエネルギー源に曝露することに
    よって酸化する請求の範囲54または56の方法。
  69. 【請求項６９】化学種をエネルギー源に曝露することに
    よって還元する請求の範囲54または56の方法。
  70. 【請求項７０】電磁放射線を放出させるべく誘導される
    各化学種が誘導されて電磁放射線を一回より多く放出す
    る請求の範囲54または56の方法。
  71. 【請求項７１】試薬混合物がオキサレート、ピルベー
    ト、ラクテート、マロネート、シトレート、タートレー
    トまたはパーオキシジサルフェートを含有する請求の範
    囲54または56の方法。
  72. 【請求項７２】エネルギー源が化学還元剤である請求の
    範囲69の方法。
  73. 【請求項７３】化学還元剤がマグネシウムである請求の
    範囲72の方法。
  74. 【請求項７４】エネルギー源が化学酸化剤である請求の
    範囲68の方法。
  75. 【請求項７５】酸化剤がCe（IV）塩またはPbO2である請
    求の範囲74の方法。
  76. 【請求項７６】試薬混合物がパーオキシジサルフェート
    を含有する請求の範囲69の方法。
  77. 【請求項７７】試薬混合物がオキサレート、ピルベー
    ト、ラクテート、マロネート、シトレートまたはタート
    レートを含有する請求の範囲68の方法。
  78. 【請求項７８】前記化学種を還元するのに充分なポテン
    シャルとこの化学種を酸化するのに充分なポテンシャル
    の間で振動するポテンシャルをもつ電極に試薬混合物を
    連続的に曝露する請求の範囲65の方法。
  79. 【請求項７９】エネルギー源が化学種を酸化するのに充
    分なポテンシャルの上下で振動するポテンシャルをもつ
    電極であり、試薬混合物がオキサレート、ピルベート、
    ラクテート、マロネート、タートレートまたはシトレー
    トを含有する請求の範囲68の方法。
  80. 【請求項８０】エネルギー源が前記化学種を酸化するの
    に充分で一定のポテンシャルをもつ電極であり、試薬混
    合物がオキサレート、ピルベート、ラクテート、マロネ
    ート、タートレートまたはシトレートを含有する請求の
    範囲68の方法。
  81. 【請求項８１】エネルギー源が前記化学種を還元するの
    に充分なポテンシャルの上下で振動するポテンシャルを
    もつ電極であり、試薬混合物がパーオキシジサルフェー
    トを含有する請求の範囲69の方法。
  82. 【請求項８２】エネルギー源が前記化学種を還元するの
    に充分で一定のポテンシャルをもつ電極であり、試薬混
    合物がパーオキシジサルフェートを含有する請求の範囲
    69の方法。
  83. 【請求項８３】試薬混合物がアセトニトリルを含有する
    請求の範囲81の方法。
  84. 【請求項８４】試薬混合物がアセトニトリルを含有する
    請求の範囲82の方法。
  85. 【請求項８５】放出された電磁放射線を連続的に検出す
    ることを含む請求の範囲65または66の方法。
  86. 【請求項８６】放出電磁放射線の検出を視覚的に実施す
    る請求の範囲85の方法。
  87. 【請求項８７】電磁放射線の連続的検出がフォトダイオ
    ードの使用を含む請求の範囲85の方法。
  88. 【請求項８８】放出された電磁放射線を累積的に検出す
    ることを含む請求の範囲65または66の方法。
  89. 【請求項８９】放出電磁放射線の検出が写真フィルムの
    使用を含む請求の範囲88の方法。
  90. 【請求項９０】試薬混合物が、各々異なる波長の電磁放
    射線を放出させるべく誘導することができるいろいろな
    化学種を１種以上含む請求の範囲54の方法。
  91. 【請求項９１】化学種に結合する対象分析物の存在を測
    定する方法であって、前記化学種が式 〔M(P)m(L1)n(L2)o(L3)p(L4)q(L5)r(L6)s〕t(B)u 〔式中、Ｍはルテニウムまたはオスミウムであり； ＰはＭの窒素含有芳香族複素環式の二座配位リガンドで
    あって、ビピリジル、置換ビピリジル、ビピラジル、置
    換ビピラジル、フェナントロリル及び置換フェナントロ
    リル（ここでこれらの置換された基のそれぞれは、アル
    キル、アリール、アラルキル、カルボキシレート、カル
    ボキサルデヒド、カルボキサミド、シアノ、アミノ、ヒ
    ドロキシカルボニル、ヒドロキシアミノ、アミノカルボ
    ニル、アミジン、グアニジニウム、ウレイド、イオウ含
    有基、リン含有基またはＮ−ヒドロキシスクシンイミド
    のカルボキシレートエステルによって置換されている）
    から選ばれ； L1およびL2は、それぞれ独立に、Ｍの窒素含有芳香族複
    素環式の二座配位リガンドであって、ビピリジル、置換
    ビピリジル、ビピラジル、置換ビピラジル、フェナント
    ロリル及び置換フェナントロリル（ここでこれらの置換
    された基のそれぞれは、アルキル、アリール、アラルキ
    ル、カルボキシレート、カルボキサルデヒド、カルボキ
    サミド、シアノ、アミノ、ヒドロキシカルボニル、ヒド
    ロキシアミノ、アミノカルボニル、アミジン、グアニジ
    ニウム、ウレイド、イオウ含有基、リン含有基あるいは
    Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドのカルボキシレートエス
    テルによって置換されている）から選ばれるか、あるい
    は一酸化炭素、シアニド、イソシアニド、ハライド、並
    びに脂肪族、芳香族及び複素環ホスフィン、アミン、ス
    チルビン及びアルシンから選ばれる単座配位リガンドで
    あり； L3、L4、L5およびL6は、それぞれ、一酸化炭素、シアニ
    ド、イソシアニド、ハライド、並びに脂肪族、芳香族及
    び複素環ホスフィン、アミン、スチルビン及びアルシン
    から選ばれる単座配位リガンドであり； Ｐ、L1、L2、L3、L4、L5及びL6のそれぞれは同じでも異
    なっていてもよく； Ｂは、生物学的物質、相補性物質との結合競争反応にお
    いて生物学的物質と競合し得る合成物質、あるいは非生
    物学的ポリマーであり； ｍは１であり； ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ及びｓのそれぞれはゼロまたは１で
    あり； ｔは１以上の整数であり； そして該リガンドＬの２つが二座配位である時には、そ
    の化学種は下記式 で表され、ｎ及びｏは１であり、ｐ、ｑ、ｒ及びｓはゼ
    ロであり、linkは共有結合、静電気的結合、またはＰ、
    Ｍ、L1あるいはL2の少なくとも１つとの水素結合Ｂであ
    り； 該リガンドＬの１つが二座配位である時には、その化学
    種は下記式 で表され、ｎは１であり、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ及びｓのそれ
    ぞれはゼロまたは１であり、linkは共有結合、静電気的
    結合、またはＰ、Ｍ、L1、L2、L3、L4、L5及びL6の少な
    くとも１つとの水素結合Ｂであり； 該リガンドＬのいずれもが二座配位でない時には、その
    化学種は下記式 で表され、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ及びｓのそれぞれはゼロ
    または１であり、linkは共有結合、静電気的結合、ある
    いはＰ、Ｍ、L1、L2、L3、L4、L5及びL6の少なくとも１
    つとの水素結合Ｂであり； Ｐ、Ｍ、L1、L2、L3、L4、L5、L6及びＢは、電磁放射線
    を放出させるべくこの化学種を誘導できるような組成と
    数になっており、Ｍのリガンドによって与えられるＭと
    の結合の総数はＭの配位数に等しい〕を有しており、 （ａ）前記化学種を含有する試薬混合物、あるいは当該
    試薬混合物を電気化学的エネルギーに曝露した際にリダ
    クタントあるいはオキシダントを形成する試薬と前記化
    学種とを含有する試薬混合物と、分析対象物とを前記化
    学種と分析対象物とが互いに特異的に結合するように形
    成し； （ｂ）前記化学種を酸化するに十分なポジティブのポテ
    ンシャルと前記化学種を還元するに十分なネガティブの
    ポテンシャルとの間を変動するポテンシャルの電気化学
    的エネルギーに前記試薬混合物を曝露し、あるいは前記
    化学種が酸化され前記試薬がリダクタントを形成するよ
    うなあるいは前記化学種が還元され前記試薬がオキシダ
    ントを形成するような電気化学的エネルキーに前記試薬
    混合物を曝露し、前記化学種を誘導して電磁放射線を放
    出させ； （ｃ）放出された電磁放射線を検出することにより前記
    対象分析物の存在を測定することからなる方法。
  92. 【請求項９２】前記試薬混合物中に更に、（ｉ）１つも
    しくはそれ以上の付加的な対象分析物、（ii）１つもし
    くはそれ以上の付加的な化学種、あるいは（iii）１つ
    もしくはそれ以上の付加的な対象分析物及び１つもしく
    はそれ以上の付加的な化学種、を導入する請求の範囲91
    の方法。
  93. 【請求項９３】Ｂが１個以上のアミド結合またはアミン
    結合を介してＰ、L1、L2、L3、L4、L5またはL6の１個以
    上と共有結合している物質である請求の範囲91の方法。
  94. 【請求項９４】Ｂが全細胞、細胞下粒子、核酸、多糖、
    タンパク質、リポタンク質、リポ多糖、糖タンパク質、
    ポリペプチド、細胞代謝物、ホルモン、薬理剤、トラン
    キライザー、バルビツエート、アルカロイド、ステロイ
    ド、ビタミン、アミノ酸、糖または非生体ポリマーであ
    る請求の範囲91の方法。
  95. 【請求項９５】Ｂがヌクレオチドまたはポリヌクレオチ
    ドである請求の範囲94の方法。
  96. 【請求項９６】Ｂが血清由来抗体またはモノクローナル
    抗体である請求の範囲94の方法。
  97. 【請求項９７】前記化学試剤が血清由来抗体またはモノ
    クローナル抗体である請求の範囲92の方法。
  98. 【請求項９８】前記分析物が全細胞、細胞下粒子、核
    酸、多糖、タンパク質、リポタンパク質、リポ多糖、糖
    タンパク質、ポリペプチド、細胞代謝物、ホルモン、薬
    理剤、トランキライザー、バルビツエート、アルカロイ
    ド、ステロイド、ビタミン、アミノ酸、糖または非生体
    ポリマーである請求の範囲91の方法。
  99. 【請求項９９】前記分析物がインシュリン、ジゴキシ
    ン、ジギトキシンまたはT4甲状腺ホルモンである請求の
    範囲98の方法。
  100. 【請求項１００】前記分析物が菌類又は線虫である請求
    の範囲98の方法。
  101. 【請求項１０１】前記分析物が抗体である請求の範囲98
    の方法。
  102. 【請求項１０２】方法が均一法であり、適切な条件が、
    結合化学種および未結合化学種が試薬混合物をエネルギ
    ー源に曝露する前には分離されないようなものである請
    求の範囲91の方法。
  103. 【請求項１０３】方法が不均一法であり、適切な条件が
    試薬混合物をエネルギー源に曝露する前に結合化学種と
    未結合化学種とを分離することからなる請求の範囲91の
    方法。
  104. 【請求項１０４】分析物が不溶性マトリックスに固定さ
    れている請求の範囲91の方法。
  105. 【請求項１０５】方法がサンドイッチ法である請求の範
    囲104の方法。
  106. 【請求項１０６】化学試剤が不溶性マトリックスに固定
    されており、化学種が生物学的流体または合成反応混合
    物の一成分である請求の範囲92の方法。
  107. 【請求項１０７】試薬混合物を電気化学エネルギーに曝
    露する請求の範囲91の方法。
  108. 【請求項１０８】試薬混合物を化学エネルギーに曝露す
    る請求の範囲91の方法。
  109. 【請求項１０９】試薬混合物を電磁放射線、化学エネル
    ギーおよび電気化学エネルギーの組合せに曝露する請求
    の範囲91の方法。
  110. 【請求項１１０】化学種をエネルギー源に曝露すること
    によって酸化する請求の範囲91の方法。
  111. 【請求項１１１】化学種をエネルギー源に曝露すること
    によって還元する請求の範囲91の方法。
  112. 【請求項１１２】電磁放射線を放出させるべく誘導され
    る各化学種が誘導されて電磁放射線を一回より多く放出
    する請求の範囲91の方法。
  113. 【請求項１１３】試薬混合物がオキサレート、ピルベー
    ト、ラクテート、マロネート、シトレート、タートレー
    トまたはパーオキシジサルフェートを含有する請求の範
    囲91の方法。
  114. 【請求項１１４】エネルギー源が化学還元剤である請求
    の範囲111の方法。
  115. 【請求項１１５】化学還元剤がマグネシウムである請求
    の範囲114の方法。
  116. 【請求項１１６】エネルギー源が化学酸化剤である請求
    の範囲110の方法。
  117. 【請求項１１７】酸化剤がCe（IV）塩またはPbO2である
    請求の範囲116の方法。
  118. 【請求項１１８】試薬混合物がパーオキシジサルフェー
    トを含有する請求の範囲111の方法。
  119. 【請求項１１９】試薬混合物がオキサレート、ピルベー
    ト、ラクテート、マロネート、シトレートまたはタート
    レートを含有する請求の範囲110の方法。
  120. 【請求項１２０】前記化学種を還元するのに充分なポテ
    ンシャルとこの化学種を酸化するのに充分なポテンシャ
    ルの間で振動するポテンシャルをもつ電極に試薬混合物
    を連続的に曝露する請求の範囲107の方法。
  121. 【請求項１２１】エネルギー源が化学種を酸化するのに
    充分なポテンシャルの上下で振動するポテンシャルをも
    つ電極であり、試薬混合物がオキサレート、ピルベー
    ト、ラクテート、マロネート、タートレートまたはシト
    レートを含有する請求の範囲110の方法。
  122. 【請求項１２２】エネルギー源が前記化学種を酸化する
    のに充分で一定のポテンシャルをもつ電極であり、試薬
    混合物がオキサレート、ピルベート、ラクテート、マロ
    ネート、タートレートまたはシトレートを含有する請求
    の範囲110の方法。
  123. 【請求項１２３】エネルギー源が前記化学種を還元する
    のに充分なポテンシャルの上下で振動するポテンシャル
    をもつ電極であり、試薬混合物がパーオキシジサルフェ
    ートを含有する請求の範囲111の方法。
  124. 【請求項１２４】エネルギー源が前記化学種を還元する
    のに充分で一定のポテンシャルをもつ電極であり、試薬
    混合物がパーオキシジサルフェートを含有する請求の範
    囲111の方法。
  125. 【請求項１２５】試薬混合物がアセトニトリルを含有す
    る請求の範囲123の方法。
  126. 【請求項１２６】試薬混合物がアセトニトリルを含有す
    る請求の範囲124の方法。
  127. 【請求項１２７】放出された電磁放射線を連続的に検出
    することを含む請求の範囲107または108の方法。
  128. 【請求項１２８】放出電磁放射線の検出を視覚的に実施
    する請求の範囲127の方法。
  129. 【請求項１２９】電磁放射線の連続的検出がフォトダイ
    オードの使用を含む請求の範囲127の方法。
  130. 【請求項１３０】放出された電磁放射線を累積的に検出
    することを含む請求の範囲107または108の方法。
  131. 【請求項１３１】放出電磁放射線の検出が写真フィルム
    の使用を含む請求の範囲130の方法。
  132. 【請求項１３２】試薬混合物が、各々異なる波長の電磁
    放射線を放出させるべく誘導することができるいろいろ
    な化学種を１種以上含み、各々の種が異なる対象分析物
    に結合している請求の範囲91の方法。
  133. 【請求項１３３】試薬混合物が、各々異なる値のエネル
    ギーまたは異なるエネルギー源からのエネルギーに曝露
    することによって誘導して電磁放射線を放出させること
    ができるいろいろな化学種を１種以上含み、各々の種が
    異なる対象分析物に結合している請求の範囲91の方法。
  134. 【請求項１３４】対象分析物と化学種とが相補的物質に
    競合して結合するかあるいは該相補的物質と該対象分析
    物とが該化学種に競合して結合する場合の当該分析物の
    存在を測定するための競合結合法であって、 前記化学種が式 〔M(P)m(L1)n(L2)o(L3)p(L4)q(L5)r(L6)s〕t(B)u 〔式中、Ｍはルテニウムまたはオスミウムであり； ＰはＭの窒素含有芳香族複素環式の二座配位リガンドで
    あって、ビピリジル、置換ビピリジル、ビピラジル、置
    換ビピラジル、フェナントロリル及び置換フェナントロ
    リル（ここでこれらの置換された基のそれぞれは、アル
    キル、アリール、アラルキル、カルボキシレート、カル
    ボキサルデヒド、カルボキサミド、シアノ、アミノ、ヒ
    ドロキシカルボニル、ヒドロキシアミノ、アミノカルボ
    ニル、アミジン、グアニジニウム、ウレイド、イオウ含
    有基、リン含有基またはＮ−ヒドロキシスクシンイミド
    のカルボキシレートエステルによって置換されている）
    から選ばれ； L1およびL2は、それぞれ独立に、Ｍの窒素含有芳香族複
    素環式の二座配位リガンドであって、ビピリジル、置換
    ビピリジル、ビピラジル、置換ビピラジル、フェナント
    ロリル及び置換フェナントロリル（ここでこれらの置換
    された基のそれぞれは、アルキル、アリール、アラルキ
    ル、カルボキシレート、カルボキサルデヒド、カルボキ
    サミド、シアノ、アミノ、ヒドロキシカルボニル、ヒド
    ロキシアミノ、アミノカルボニル、アミジン、グアニジ
    ニウム、ウレイド、イオウ含有基、リン含有基あるいは
    Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドのカルボキシレートエス
    テルによって置換されている）から選ばれるか、あるい
    は一酸化炭素、シアニド、イソシアニド、ハライド、並
    びに脂肪族、芳香族及び複素環ホスフィン、アミン、ス
    チルビン及びアルシンから選ばれる単座配位リガンドで
    あり； L3、L4、L5およびL6は、それぞれ、一酸化炭素、シアニ
    ド、イソシアニド、ハライド、並びに脂肪族、芳香族及
    び複素環ホスフィン、アミン、スチルビン及びアルシン
    から選ばれる単座配位リガンドであり； Ｐ、L1、L2、L3、L4、L5及びL6のそれぞれは同じでも異
    なっていてもよく； Ｂは、生物学的物質、相補性物質との結合競争反応にお
    いて生物学的物質と競合し得る合成物質、あるいは非生
    物学的ポリマーであり； ｍは１であり； ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ及びｓのそれぞれはゼロまたは１で
    あり； ｔは１以上の整数であり； そして該リガンドＬの２つが二座配位である時には、そ
    の化学種は下記式 で表され、ｎ及びｏは１であり、ｐ、ｑ、ｒ及びｓはゼ
    ロであり、linkは共有結合、静電気的結合、またはＰ、
    Ｍ、L1あるいはL2の少なくとも１つとの水素結合Ｂであ
    り； 該リガンドＬの１つが二座配位である時には、その化学
    種は下記式 で表され、ｎは１であり、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ及びｓのそれ
    ぞれはゼロまたは１であり、linkは共有結合、静電気的
    結合、またはＰ、Ｍ、L1、L2、L3、L4、L5及びL6の少な
    くとも１つとの水素結合Ｂであり； 該リガンドＬのいずれもが二座配位でない時には、その
    化学種は下記式 で表され、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ及びｓのそれぞれはゼロ
    または１であり、linkは共有結合、静電気的結合、ある
    いはＰ、Ｍ、L1、L2、L3、L4、L5及びL6の少なくとも１
    つとの水素結合Ｂであり； Ｐ、Ｍ、L1、L2、L3、L4、L5、L6及びＢは、電磁放射線
    を放出させるべくこの化学種を誘導できるような組成と
    数になっており、Ｍのリガンドによって与えられるＭと
    の結合の総数はＭの配位数に等しい〕を有しており、 （ａ）対象分析物、相補的物質及び化学種を含有する試
    薬混合物、あるいは当該試薬混合物を電気化学的エネル
    ギーに曝露した際にリダクタントあるいはオキシダント
    を形成する試薬と前記化学種とを含有する試薬混合物を
    形成して、前記化学種と対象分析物とが相補的物質に競
    合して結合するようにし、あるいは相補的物質と対象分
    析物とが前記化学種に競合して結合するようにし、； （ｂ）前記化学種を酸化するに十分なポジティブのポテ
    ンシャルと、前記化学種を還元するに十分なネガティブ
    のポテンシャルとの間を変動するポテンシャルの電気化
    学的エネルギーに前記試薬混合物を曝露し、あるいは前
    記化学種が酸化され前記試薬がリダクタントを形成する
    ようなあるいは前記化学種が還元され前記試薬がオキシ
    ダントを形成するような電気化学的エネルギーに前記試
    薬混合物を曝露し、前記化学種を誘導して電磁放射線を
    放出させ； （ｃ）放出された電磁放射線を検出することにより前記
    対象分析物の存在を測定することからなる方法。
  135. 【請求項１３５】前記試薬混合物中に更に、（ｉ）１つ
    もしくはそれ以上の付加的な対象分析物、（ii）１つも
    しくはそれ以上の付加的な化学種、あるいは（iii）１
    つもしくはそれ以上の付加的な対象分析物及び１つもし
    くはそれ以上の付加的な化学種、を導入する請求の範囲
    134の方法。
  136. 【請求項１３６】Ｂが１個以上のアミド結合またはアミ
    ン結合を介してＰ、L1、L2、L3、L4、L5またはL6の１個
    以上と共有結合している物質である請求の範囲134の方
    法。
  137. 【請求項１３７】Ｂが全細胞、細胞下粒子、核酸、多
    糖、タンパク質、リポタンク質、リポ多糖、糖タンパク
    質、ポリペプチド、細胞代謝物、ホルモン、薬理剤、ト
    ランキライザー、バルビツエート、アルカロイド、ステ
    ロイド、ビタミン、アミノ酸、糖または非生体ポリマー
    である請求の範囲135または136の方法。
  138. 【請求項１３８】Ｂがヌクレオチドまたはポリヌクレオ
    チドである請求の範囲137の方法。
  139. 【請求項１３９】Ｂが血清由来抗体またはモノクローナ
    ル抗体である請求の範囲137の方法。
  140. 【請求項１４０】Ｂが前記分析物と同一物質である請求
    の範囲135の方法。
  141. 【請求項１４１】前記分析物が全細胞、細胞下粒子、核
    酸、多糖、タンパク質、リポタンパク質、リポ多糖、糖
    タンパク質、ポリペプチド、細胞代謝物、ホルモン、薬
    理剤、トランキライザー、バルビツエート、アルカロイ
    ド、ステロイド、ビタミン、アミノ酸、糖または非生体
    ポリマーである請求の範囲134の方法。
  142. 【請求項１４２】前記分析物がインシュリン、ジゴキシ
    ン、ジギトキシンまたはT4甲状腺ホルモンである請求の
    範囲141の方法。
  143. 【請求項１４３】前記分析物が菌類又は線虫である請求
    の範囲141の方法。
  144. 【請求項１４４】前記分析物が抗体である請求の範囲14
    1の方法。
  145. 【請求項１４５】前記物質が全細胞、細胞下粒子、核
    酸、多糖、タンパク質、リポタンパク質、リポ多糖、糖
    タンパク質、ポリペプチド、細胞代謝物、ホルモン、薬
    理剤、トランキライザー、バルビツエート、アルカロイ
    ド、ステロイド、ビタミン、アミノ酸、糖または非生体
    ポリマーである請求の範囲134の方法。
  146. 【請求項１４６】前記化学物質が血清由来抗体またはモ
    ノクローナル抗体である請求の範囲145の方法。
  147. 【請求項１４７】前記化学物質がDNA断片またはRNA断片
    である請求の範囲145の方法。
  148. 【請求項１４８】方法が均一法であり、適切な条件が、
    結合化学種および未結合化学種が試薬混合物をエネルギ
    ー源に曝露する前には分離されないようなものである請
    求の範囲134の方法。
  149. 【請求項１４９】方法が不均一法であり、適切な条件が
    試薬混合物をエネルギー源に曝露する前に結合化学種と
    未結合化学種とを分離することからなる請求の範囲134
    の方法。
  150. 【請求項１５０】分析物が不溶性マトリックスに固定さ
    れている請求の範囲134の方法。
  151. 【請求項１５１】方法がサンドイッチ法である請求の範
    囲150の方法。
  152. 【請求項１５２】方法が、物質が不溶性マトリックスに
    固定されている競合結合法である請求の範囲135の方
    法。
  153. 【請求項１５３】物質がモノクローナル抗体であり、不
    溶性マトリックスがアッセイ容器表面である請求の範囲
    152の不均一法。
  154. 【請求項１５４】物質がモノクローナル抗体であり、不
    溶性マトリックスがアッセイ容器表面である請求の範囲
    152の均一法。
  155. 【請求項１５５】試薬混合物を電気化学エネルギーに曝
    露する請求の範囲134の方法。
  156. 【請求項１５６】試薬混合物を化学エネルギーに曝露す
    る請求の範囲134の方法。
  157. 【請求項１５７】試薬混合物を電磁放射線、化学エネル
    ギーおよび電気化学エネルギーの組合せに曝露する請求
    の範囲134の方法。
  158. 【請求項１５８】化学種をエネルギー源に曝露すること
    によって酸化する請求の範囲134の方法。
  159. 【請求項１５９】化学種をエネルギー源に曝露すること
    によって還元する請求の範囲134の方法。
  160. 【請求項１６０】電磁放射線を放出させるべく誘導され
    る各化学種が誘導されて電磁放射線を一回より多く放出
    する請求の範囲134の方法。
  161. 【請求項１６１】試薬混合物がオキサレート、ピルベー
    ト、ラクテート、マロネート、シトレート、タートレー
    トまたはパーオキシジサルフェートを含有する請求の範
    囲134の方法。
  162. 【請求項１６２】エネルギー源が化学還元剤である請求
    の範囲159の方法。
  163. 【請求項１６３】化学還元剤がマグネシウムである請求
    の範囲162の方法。
  164. 【請求項１６４】エネルギー源が化学酸化剤である請求
    の範囲158の方法。
  165. 【請求項１６５】酸化剤がCe（IV）塩またはPbO2である
    請求の範囲164の方法。
  166. 【請求項１６６】試薬混合物がパーオキシジサルフェー
    トを含有する請求の範囲159の方法。
  167. 【請求項１６７】試薬混合物がオキサレート、ピルベー
    ト、ラクテート、マロネート、シトレートまたはタート
    レートを含有する請求の範囲158の方法。
  168. 【請求項１６８】前記化学種を還元するのに充分なポテ
    ンシャルとこの化学種を酸化するのに充分なポテンシャ
    ルの間で振動するポテンシャルをもつ電極に試薬混合物
    を連続的に曝露する請求の範囲155の方法。
  169. 【請求項１６９】エネルギー源が化学種を酸化するのに
    充分なポテンシャルの上下で振動するポテンシャルをも
    つ電極であり、試薬混合物がオキサレート、ピルベー
    ト、ラクテート、マロネート、タートレートまたはシト
    レートを含有する請求の範囲158の方法。
  170. 【請求項１７０】エネルギー源が前記化学種を酸化する
    のに充分で一定のポテンシャルをもつ電極であり、試薬
    混合物がオキサレート、ピルベート、ラクテート、マロ
    ネート、タートレートまたはシトレートを含有する請求
    の範囲158の方法。
  171. 【請求項１７１】エネルギー源が前記化学種を還元する
    のに充分なポテンシャルの上下で振動するポテンシャル
    をもつ電極であり、試薬混合物がパーオキシジサルフェ
    ートを含有する請求の範囲159の方法。
  172. 【請求項１７２】エネルギー源が前記化学種を還元する
    のに充分で一定のポテンシャルをもつ電極であり、試薬
    混合物がパーオキシジサルフェートを含有する請求の範
    囲159の方法。
  173. 【請求項１７３】試薬混合物がアセトニトリルを含有す
    る請求の範囲171の方法。
  174. 【請求項１７４】試薬混合物がアセトニトリルを含有す
    る請求の範囲172の方法。
  175. 【請求項１７５】放出された電磁放射線を連続的に検出
    することを含む請求の範囲155または156の方法。
  176. 【請求項１７６】放出電磁放射線の検出を視覚的に実施
    する請求の範囲175の方法。
  177. 【請求項１７７】電磁放射線の連続的検出がフォトダイ
    オードの使用を含む請求の範囲175の方法。
  178. 【請求項１７８】放出された電磁放射線を累積的に検出
    することを含む請求の範囲155または156の方法。
  179. 【請求項１７９】放出電磁放射線の検出が写真フィルム
    の使用を含む請求の範囲178の方法。
  180. 【請求項１８０】試薬混合物が、各々異なる値のエネル
    ギーまたは異なるエネルギー源からのエネルギーに曝露
    することによって誘導して電磁放射線を放出させること
    ができるいろいろな化学種を１種以上含む請求の範囲13
    8の方法。
  181. 【請求項１８１】式 (A)k(B)u 〔式中、Ａは電気化学エネルギー源に直接曝露すること
    によって電磁放射線を繰り返し放出するように誘導する
    ことができる化合物であり、ＢはＡに結合している物質
    であり、ｋは１以上の整数であり、ｕは１以上の整数で
    ある〕を有する化学種の存在を測定する方法であって、 ａ）適切な条件下で前記化学種を含有する試薬混合物を
    形成し、 ｂ）前記種を電気化学エネルギーに直接曝露することに
    よって化学種を誘導して電磁放射線を繰り返し放出さ
    せ、 ｃ）放出された電磁放射線を検出することにより前記化
    学種の存在を決定することからなる方法。
  182. 【請求項１８２】前記種が化学試剤に結合できるもので
    ある請求の範囲181の方法。
  183. 【請求項１８３】式 (A)k(B)u 〔式中、Ａは電気化学エネルギー源に直接曝露すること
    によって電磁放射線を繰り返し放出するように誘導する
    ことができる化合物であり、ＢはＡは結合している物質
    であり、ｋは１以上の整数であり、ｕは１以上の整数で
    ある〕を有する化学種の存在を測定する方法であって、 ａ）適切な条件下で前記分析物を前記化学種に接触せし
    めて試薬混合物を形成し、 ｂ）前記種を電気化学エネルギーに直接曝露することに
    よって化学種を誘導して電磁放射線を繰り返し放出さ
    せ、 ｃ）放出された電磁放射線を検出することにより前記対
    象分析物の存在を決定することからなる方法。
  184. 【請求項１８４】対象分析物と化学種とがある化学物質
    に競合して結合する場合の当該分析物の存在を決定する
    ための競合結合法であって、前記化学種が式 (A)k(B)u 〔式中、Ａは電気化学エネルギー源に直接曝露すること
    によって電磁放射線を繰り返し放出するように誘導する
    ことができる化合物であり、ＢはＡに結合している物質
    であり、ｋは１以上の整数であり、ｕは１以上の整数で
    ある〕を有しており、 ａ）適切な条件下で前記物質、前記化学種および前記分
    析物を接触せしめて試薬混合物を形成し、 ｂ）前記種を電気化学エネルギーに直接曝露することに
    よって化学種を誘導して電磁放射線を繰り返し放出さ
    せ、 ｃ）放出された電磁放射線を検出することにより前記対
    象分析物の存在を決定することからなる方法。
  185. 【請求項１８５】Ａがレブレンまたは9,10−ジフェニル
    アントラセンである請求の範囲181、182、183または184
    の方法。
  186. 【請求項１８６】次式を有する化学種 〔M(P)m(L1)n(L2)o(L3)p(L4)q(L5)r(L6)s〕t(B)u 〔式中、Ｍはルテニウムまたはオスミウムであり； ＰはＭの窒素含有芳香族複素環式の二座配位リガンドで
    あって、ビピリジル、置換ビピリジル、ビピラジル、置
    換ビピラジル、フェナントロリル及び置換フェナントロ
    リル（ここでこれらの置換された基のそれぞれは、アル
    キル、アリール、アラルキル、カルボキシレート、カル
    ボキサルデヒド、カルボキサミド、シアノ、アミノ、ヒ
    ドロキシカルボニル、ヒドロキシアミノ、アミノカルボ
    ニル、アミジン、グアニジニウム、ウレイド、イオウ含
    有基、リン含有基またはＮ−ヒドロキシスクシンイミド
    のカルボキシレートエステルによって置換されている）
    から選ばれ； L1およびL2は、それぞれ独立に、Ｍの窒素含有芳香族複
    素環式の二座配位リガンドであって、ビピリジル、置換
    ビピリジル、ビピラジル、置換ビピラジル、フェナント
    ロリル及び置換フェナントロリル（ここでこれらの置換
    された基のそれぞれは、アルキル、アリール、アラルキ
    ル、カルボキシレート、カルボキサルデヒド、カルボキ
    サミド、シアノ、アミノ、ヒドロキシカルボニル、ヒド
    ロキシアミノ、アミノカルボニル、アミジン、グアニジ
    ウム、ウレイド、イオウ含有基、リン含有基あるいはＮ
    −ヒドロキシスクシンイミドのカルボキシレートエステ
    ルによって置換されている）から選ばれるか、あるいは
    一酸化炭素、シアニド、イソシアニド、ハライド、並び
    に脂肪族、芳香族及び複素環ホスフィン、アミン、スチ
    ルビン及びアルシンから選ばれる単座配位リガンドであ
    り； L3、L4、L5およびL6は、それぞれ、一酸化炭素、シアニ
    ド、イソシアニド、ハライド、並びに脂肪族、芳香族及
    び複素環ホスフィン、アミン、スチルビン及びアルシン
    から選ばれる単座配位リガンドであり； Ｐ、L1、L2、L3、L4、L5及びL6のそれぞれは同じでも異
    なっていてもよく； Ｂは、生物学的物質、相補性物質との結合競争反応にお
    いて生物学的物質と競合し得る合成物質、あるいは非生
    物学的ポリマーであり； ｍは１であり； ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ及びｓのそれぞれはゼロまたは１で
    あり； ｔは１以上の整数であり； そして該リガンドＬの２つが二座配位である時には、そ
    の化学種は下記式 で表され、ｎ及びｏは１であり、ｐ、ｑ、ｒ及びｓはゼ
    ロであり、linkは共有結合、静電気的結合、またはＰ、
    Ｍ、L1あるいはL2の少なくとも１つとの水素結合Ｂであ
    り； 該リガンドＬの１つが二座配位である時には、その化学
    種は下記式 で表され、ｎは１であり、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ及びｓのそれ
    ぞれはゼロまたは１であり、linkは共有結合、静電気的
    結合、またはＰ、Ｍ、L1、L2、L3、L4、L5及びL6の少な
    くとも１つとの水素結合Ｂであり； 該リガンドＬのいずれもが二座配位でない時には、その
    化学種は下記式 で表され、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ及びｓのそれぞれはゼロ
    または１であり、linkは共有結合、静電気的結合、ある
    いはＰ、Ｍ、L1、L2、L3、L4、L5及びL6の少なくとも１
    つとの水素結合Ｂであり； Ｐ、Ｍ、L1、L2、L3、L4、L5、L6及びＢは、電磁放射線
    を放出させるべくこの化学種を誘導できるような組成と
    数になっており、Ｍのリガンドによって与えられるＭと
    の結合の総数はＭの配位数に等しい〕の化学種の存在を
    測定する方法であって、 ａ）適切な条件下で前記化学種を含有する試薬混合物を
    形成し、 ｂ）この試薬混合物を電磁エネルギー、化学エネルギー
    または電気化学エネルギーに曝露することによって化学
    種を誘導して電磁放射線を放出させ、 ｃ）放出されたいろいろな波長の電磁放射線を検出する
    ことにより前記化学種の存在を決定することからなる方
    法。
  187. 【請求項１８７】次式を有する化学種 〔M(P)m(L1)n(L2)o(L3)p(L4)q(L5)r(L6)s〕t(B)u 〔式中、Ｍはルテニウムまたはオスミウムであり； ＰはＭの窒素含有芳香族複素環式の二座配位リガンドで
    あって、ビピリジル、置換ビピリジル、ビピラジル、置
    換ビピラジル、フェナントロリル及び置換フェナントロ
    リル（ここでこれらの置換された基のそれぞれは、アル
    キル、アリール、アラルキル、カルボキシレート、カル
    ボキサルデヒド、カルボキサミド、シアノ、アミノ、ヒ
    ドロキシカルボニル、ヒドロキシアミノ、アミノカルボ
    ニル、アミジン、グアニジニウム、ウレイド、イオウ含
    有基、リン含有基またはＮ−ヒドロキシスクシンイミド
    のカルボキシレートエステルによって置換されている）
    から選ばれ； L1およびL2は、それぞれ独立に、Ｍの窒素含有芳香族複
    素環式の二座配位リガンドであって、ビピリジル、置換
    ビピリジル、ビピラジル、置換ビピラジル、フェナント
    ロリル及び置換フェナントロリル（ここでこれらの置換
    された基のそれぞれは、アルキル、アリール、アラルキ
    ル、カルボキシレート、カルボキサルデヒド、カルボキ
    サミド、シアノ、アミノ、ヒドロキシカルボニル、ヒド
    ロキシアミノ、アミノカルボニル、アミジン、グアニジ
    ウム、ウレイド、イオウ含有基、リン含有基あるいはＮ
    −ヒドロキシスクシンイミドのカルボキシレートエステ
    ルによって置換されている）から選ばれるか、あるいは
    一酸化炭素、シアニド、イソシアニド、ハライド、並に
    脂肪族、芳香族及び複素環ホスフィン、アミン、スチル
    ビン及びアルシンから選ばれる単座配位リガンドであ
    り； L3、L4、L5およびL6は、それぞれ、一酸化炭素、シアニ
    ド、イソシアニド、ハライド、並びに脂肪族、芳香族及
    び複素環ホスフィン、アミン、スチルビン及びアルシン
    から選ばれる単座配位リガンドであり； Ｐ、L1、L2、L3、L4、L5及びL6のそれぞれは同じでも異
    なっていてもよく； Ｂは、生物学的物質、相補性物質との結合競争反応にお
    いて生物学的物質と競合し得る合成物質、あるいは非生
    物学的ポリマーであり； ｍは１であり； ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ及びｓのそれぞれはゼロまたは１で
    あり； ｔは１以上の整数であり； そして該リガンドＬの２つが二座配位である時には、そ
    の化学種は下記式 で表され、ｎ及びｏは１であり、ｐ、ｑ、ｒ及びｓはゼ
    ロであり、linkは共有結合、静電気的結合、またはＰ、
    Ｍ、L1あるいはL2の少なくとも１つとの水素結合Ｂであ
    り； 該リガンドＬの１つが二座配位である時には、その化学
    種は下記式 で表され、ｎは１であり、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ及びｓのそれ
    ぞれはゼロまたは１であり、linkは共有結合、静電気的
    結合、またはＰ、Ｍ、L1、L2、L3、L4、L5及びL6の少な
    くとも１つとの水素結合Ｂであり； 該リガンドＬのいずれもが二座配位でない時には、その
    化学種は下記式 で表され、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ及びｓのそれぞれはゼロ
    または１であり、linkは共有結合、静電気的結合、ある
    いはＰ、Ｍ、L1、L2、L3、L4、L5及びL6の少なくとも１
    つとの水素結合Ｂであり； Ｐ、Ｍ、L1、L2、L3、L4、L5、L6及びＢは、電磁放射線
    を放出させるべくこの化学種を誘導できるような組成と
    数になっており、Ｍのリガンドによって与えられるＭと
    の結合の総数はＭの配位数に等しい〕のいろいろな化学
    種に選択的に結合する１種以上の対象分析物の存在を測
    定する方法であって、 ａ）適切な条件下で前記分析物を前記化学種に接触せし
    めて試薬混合物を形成し、 ｂ）この試薬混合物を電磁エネルギー、化学エネルギー
    または電気化学エネルギーに曝露することによって化学
    種を誘導して電磁放射線を放出させ、 ｃ）放出されたいろいろな波長の電磁波を検出すること
    により前記対象分析物の各々の存在を決定することから
    なる方法。
  188. 【請求項１８８】次式を有する化学種 〔M(P)m(L1)n(L2)o(L3)p(L4)q(L5)r(L6)s〕t(B)u 〔式中、Ｍはルテニウムまたはオスミウムであり； ＰはＭの窒素含有芳香族複素環式の二座配位リガンドで
    あって、ビピリジル、置換ビピリジル、ビピラジル、置
    換ビピラジル、フェナントロリル及び置換フェナントロ
    リル（ここでこれらの置換された基のそれぞれは、アル
    キル、アリール、アラルキル、カルボキシレート、カル
    ボキサルデヒド、カルボキサミド、シアノ、アミノ、ヒ
    ドロキシカルボニル、ヒドロキシアミノ、アミノカルボ
    ニル、アミジン、グアニジニウム、ウレイド、イオウ含
    有基、リン含有基またはＮ−ヒドロキシスクシンイミド
    のカルボキシレートエステルによって置換されている）
    から選ばれ； L1およびL2は、それぞれ独立に、Ｍの窒素含有芳香族複
    素環式の二座配位リガンドであって、ビピリジル、置換
    ビピリジル、ビピラジル、置換ビピラジル、フェナント
    ロリル及び置換フェナントロリル（ここでこれらの置換
    された基のそれぞれは、アルキル、アリール、アラルキ
    ル、カルボキシレート、カルボキサルデヒド、カルボキ
    サミド、シアノ、アミノ、ヒドロキシカルボニル、ヒド
    ロキシアミノ、アミノカルボニル、アミジン、グアニジ
    ウム、ウレイド、イオウ含有基、リン含有基あるいはＮ
    −ヒドロキシスクシンイミドのカルボキシレートエステ
    ルによって置換されている）から選ばれるか、あるいは
    一酸化炭素、シアニド、イソシアニド、ハライド、並び
    に脂肪族、芳香族及び複素環ホスフィン、アミン、スチ
    ルビン及びアルシンから選ばれる単座配位リガンドであ
    り； L3、L4、L5およびL6は、それぞれ、一酸化炭素、シアニ
    ド、イソシアニド、ハライド、並びに脂肪族、芳香族及
    び複素環ホスフィン、アミン、スチルビン及びアルシン
    から選ばれる単座配位リガンドであり； Ｐ、L1、L2、L3、L4、L5及びL6のそれぞれは同じでも異
    なっていてもよく； Ｂは、生物学的物質、相補性物質との結合競争反応にお
    いて生物学的物質と競合し得る合成物質、あるいは非生
    物学的ポリマーであり； ｍは１であり； ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ及びｓのそれぞれはゼロまたは１で
    あり； ｔは１以上の整数であり； そして該リガンドＬの２つが二座配位である時には、そ
    の化学種は下記式 で表され、ｎ及びｏは１であり、ｐ、ｑ、ｒ及びｓはゼ
    ロであり、linkは共有結合、静電気的結合、またはＰ、
    Ｍ、L1あるいはL2の少なくとも１つとの水素結合Ｂであ
    り； 該リガンドＬの１つが二座配位である時には、その化学
    種は下記式 で表され、ｎは１であり、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ及びｓのそれ
    ぞれはゼロまたは１であり、linkは共有結合、静電気的
    結合、またはＰ、Ｍ、L1、L2、L3、L4、L5及びL6の少な
    くとも１つとの水素結合Ｂであり； 該リガンドＬのいずれもが二座配位でない時には、その
    化学種は下記式 で表され、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ及びｓのそれぞれはゼロ
    または１であり、linkは共有結合、静電気的結合、ある
    いはＰ、Ｍ、L1、L2、L3、L4、L5及びL6の少なくとも１
    つとの水素結合Ｂであり； Ｐ、Ｍ、L1、L2、L3、L4、L5、L6及びＢは、電磁放射線
    を放出させるべくこの化学種を誘導できるような組成と
    数になっており、Ｍのリガンドによって与えられるＭと
    の結合の総数はＭの配位数に等しい〕の化学種の存在を
    測定する方法であって、 ａ）適切な条件下で前記化学種を含有する試薬混合物を
    形成し、 ｂ）この試薬混合物を様々な時にいろいろな値のエネル
    ギーまたは種々のエネルギー源からのエネルギーに曝露
    することによって化学種を誘導して様々な時に電磁放射
    線を放出させ、 ｃ）混合物をいろいろな値または種々のエネルギー源の
    エネルギーの各々に曝露した後に放出された電磁放射線
    を検出することにより化学種の各々の存在を決定するこ
    とからなる方法。
  189. 【請求項１８９】次式を有する化学種 〔M(P)m(L1)n(L2)o(L3)p(L4)q(L5)r(L6)s〕t(B)u 〔式中、Ｍはルテニウムまたはオスミウムであり； ＰはＭの窒素含有芳香族複素環式の二座配位リガンドで
    あって、ビピリジル、置換ビピリジル、ビピラジル、置
    換ビピラジル、フェナントロリル及び置換フェナントロ
    リル（ここでこれらの置換された基のそれぞれは、アル
    キル、アリール、アラルキル、カルボキシレート、カル
    ボキサルデヒド、カルボキサミド、シアノ、アミノ、ヒ
    ドロキシカルボニル、ヒドロキシアミノ、アミノカルボ
    ニル、アミジン、グアニジニウム、ウレイド、イオウ含
    有基、リン含有基またはＮ−ヒドロキシスクシンイミド
    のカルボキシレートエステルによって置換されている）
    から選ばれ； L1およびL2は、それぞれ独立に、Ｍの窒素含有芳香族複
    素環式の二座配位リガンドであって、ビピリジル、置換
    ビピリジル、ビピラジル、置換ビピラジル、フェナント
    ロリル及び置換フェナントロリル（ここでこれらの置換
    された基のそれぞれは、アルキル、アリール、アラルキ
    ル、カルボキシレート、カルボキサルデヒド、カルボキ
    サミド、シアノ、アミノ、ヒドロキシカルボニル、ヒド
    ロキシアミノ、アミノカルボニル、アミジン、グアニジ
    ウム、ウレイド、イオウ含有基、リン含有基あるいはＮ
    −ヒドロキシスクシンイミドのカルボキシレートエステ
    ルによって置換されている）から選ばれるか、あるいは
    一酸化炭素、シアニド、イソシアニド、ハライド、並び
    に脂肪族、芳香族及び複素環ホスフィン、アミン、スチ
    ルビン及びアルシンから選ばれる単座配位リガンドであ
    り； L3、L4、L5およびL6は、それぞれ、一酸化炭素、シアニ
    ド、イソシアニド、ハライド、並びに脂肪族、芳香族及
    び複素環ホスフィン、アミン、スチルビン及びアルシン
    から選ばれる単座配位リガンドであり； Ｐ、L1、L2、L3、L4、L5及びL6のそれぞれは同じでも異
    なっていてもよく； Ｂは、生物学的物質、相補性物質との結合競争反応にお
    いて生物学的物質と競合し得る合成物質、あるいは非生
    物学的ポリマーであり； ｍは１であり； ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ及びｓのそれぞれはゼロまたは１で
    あり； ｔは１以上の整数であり； そして該リガンドＬの２つが二座配位である時には、そ
    の化学種は下記式 で表され、ｎ及びｏは１であり、ｐ、ｑ、ｒ及びｓはゼ
    ロであり、linkは共有結合、静電気的結合、またはＰ、
    Ｍ、L1あるいはL2の少なくとも１つとの水素結合Ｂであ
    り； 該リガンドＬの１つが二座配位である時には、その化学
    種は下記式 で表され、ｎは１であり、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ及びｓのそれ
    ぞれはゼロまたは１であり、linkは共有結合、静電気的
    結合、またはＰ、Ｍ、L1、L2、L3、L4、L5及びL6の少な
    くとも１つとの水素結合Ｂであり； 該リガンドＬのいずれもが二座配位でない時には、その
    化学種は下記式 で表され、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ及びｓのそれぞれはゼロ
    または１であり、linkは共有結合、静電気的結合、ある
    いはＰ、Ｍ、L1、L2、L3、L4、L5及びL6の少なくとも１
    つとの水素結合Ｂであり； Ｐ、Ｍ、L1、L2、L3、L4、L5、L6及びＢは、電磁放射線
    を放出させるべくこの化学種を誘導できるような組成と
    数になっており、Ｍのリガンドによって与えられるＭと
    の結合の総数はＭの配位数に等しい〕のいろいろな化学
    種に選択的に結合する１種以上の対象分析物の存在を測
    定する方法であって、 ａ）適切な条件下で前記分析物を前記化学種に接触せし
    めて試薬混合物を形成し、 ｂ）この試薬混合物を様々な時にいろいろな値のエネル
    ギーまたは種々のエネルギー源からのエネルギーに曝露
    することによって化学種を誘導して様々な時に電磁放射
    線を放出させ、 ｃ）混合物をいろいろな値または種々のエネルギー源の
    エネルギーの各々に曝露した後に放出された電磁放射線
    を検出することにより化学種の各々の存在を決定するこ
    とからなる方法。
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