CN115480055A - 电化学发光免疫分析试剂盒及其使用方法 - Google Patents

电化学发光免疫分析试剂盒及其使用方法 Download PDF

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Abstract

大多数免疫分析方法中涉及到生物素/(链酶)亲和素偶联化学，而血液样本中的生物素会干扰免疫分析结果的正确输出。采用电化学发光作为免疫分析的检测信号的在先技术都毫无例外地建立在生物素/(链酶)亲和素偶联平台上，有造成临床误检的可能。本发明涉及一种完全不含生物素和(链酶)亲和素组分，从而可避免样本中的生物素干扰的电化学发光免疫分析试剂体系。进一步地，针对试剂组份的变化以及由此引起的磁珠表面免疫复合物的结构变化，本发明提供了一种在电化学发光测量过程中的磁珠捕获和分离的方法。

Description

电化学发光免疫分析试剂盒及其使用方法
技术领域
本发明所属技术领域是电化学发光免疫分析，具体涉及电化学发光免疫分析试剂盒及其使用方法。
背景技术
生物素(biotin)是天然存在于一些食物中的一种水溶性的维生素(B7或H)，它参与人体的多个代谢过程，其与亲和素(avidin)或链酶亲和素(streptavidin)的极强的非共价键相互作用长期以来被用于生物活性物质(如小分子类的激素等，大分子类的核酸、蛋白等) 的分析、分离和提纯。生物素的小分子量(244.31 D)以及生物素-(链酶)亲和素复合物在不同溶剂中的快速形成及其高稳定性(解离常数Kd对生物素-亲和素复合物约为10-14，而对生物素-链酶亲和素约为10-15)确立了生物素-(链酶)亲和素化学作为多个临床免疫分析方法学的平台技术，得到广泛应用(E.P.Diamandis and T.K.Christopoulos，The biotin-(strept)avidin system：principles and applications in biotechnology，Clin.Chem.1991，37， 625-636)。在这些应用中，由于生物素分子中的戊酸羧基(图1)是反应性的，它可以直接或间接(如通过转化为活性酯)地与其它生物分子偶联。当需要时，生物素分子中的戊酸羧基也可以先连接一个增加空间距离的连接单元(1inker)或叫间隔单元(spacer)，以便在后续的操作过程中，生物素分子中由咪唑烷酮环和四氢噻吩环构成的双杂环能够在生物大分子表面容易地与亲和素或链酶亲和素结合。生物大分子或其它被测物通过生物素分子中的戊酸羧基而连接上一个或多个生物素分子中的咪唑烷酮环/四氢噻吩环的过程叫生物素化(biotinylation)，而连接有生物素分子的抗体就叫生物素化抗体(biotinylated antibody)，在竞争法免疫分析中，被生物素化的也可能是被测物抗原(biotinylated antigen) 或抗原衍生物。
尽管缺少强烈证据支持它对头发、皮肤和指甲生长有益，但生物素却被愈来愈多地作为营养补充品被脱发、脆性发质或蓬发综合症患者摄入。由于在怀孕期和哺育期增加的生物素代谢，处于这个阶段的妇女也被推荐使用生物素(尽管其效果存在争议)。因为血液样本中的生物素将与生物素偶联的抗体(或抗原)竞争固相表面的(链酶)亲和素，所有建立在生物素-链酶亲和素偶联化学平台上的免疫分析(如图2所列的某些免疫分析平台技术)结果都会不同程度地受到样本中生物素的干扰，引起正的(在竞争法中)或负的(在夹心法中)偏差。普通人通过正常饮食而获得的生物素在血液中的含量极少，不会对免疫分析结果造成影响。但通过摄入营养补充品而进入血液的生物素对免疫分析结果造成的干扰的案例早在1996年就有报道(J.G.Henry，S.Sobki，N.Arafaty，Interference by BiotinTherapy on Measurement of TSH and FT4 by Enzymeimmunoassay on BoehringerMannheim ES700 Analyser，Ann.Clin.Biochem.1996，33，162-163)，而在电化学发光免疫分析中的生物素干扰的也已见于2009年的案例报告(D.L.Meany，S.M.Jan de Beur，M.J.Bill，1and L.J.Sokoll， A Case of Renal Osteodystrophy with UnexpectedSerum Intact Parathyroid Hormone Concentrations，Clin.Chem.2009，55，1737-1739.)。目前已经报道的被生物素干扰的免疫分析涉及到夹心法免疫分析中的NT-pro-BNP，hs-TnT，TSH，FSH，Anti-Tg，anti-TPO， anti-TSHR等以及竞争法的T3，T4和维生素D等多个体系(D.Li，A.Radulescu，R.T. Shrestha，et al.Association of biotin ingestionwith performance of hormone and nonhormone assays in healthy adults.JAMA2017，318，1150-1160；P.J.Colon1 and D.N.Greene，Biotin Interference in ClinicalImmunoassays，J.Appl.Lab.Med.2018，2，941-951；Jieli Li，Elizabeth A. Wagar，QingH.Meng，Comprehensive assessment of biotin interference in immunoassays，Clinica Chimica Acta，2018，487，293-298.)。即使在单次10mg的口服剂量后24小时内，生物素仍然对甲状腺功能测试有干扰(R.P.M.Biscolla，M.I.Chiamolera，I.Kanashiro，R.M.B. Maciel，J.G.H.Vieira，A single 10mg oral dose of biotin interferes withthyroid function tests， Thyroid2017，27，1099-1100.)。2017年11月28日，美国食品药品监督管理局(FDA)对生物素在临床免疫分析中的干扰发布了警告(FDA.The FDA warnsthat biotin may interfere with lab tests：FDA safety communication.)。两年以后(2019年11月5日)，FDA更新了这一警告。警告的目的是提请消费者、医疗工作者和临床检验人员注意可能添加在营养补充品中的生物素及其对检验结果的影响。FDA推荐的不会干扰测试的生物素剂量是成人每天不超过0.03mg。但市面上那些声称对头发、皮肤或指甲有益的营养补充品的剂量可能达到成人每天20mg，而医生针对多发性硬化症所开的处方中的生物素剂量可能高达成人每天300mg。服用高剂量生物素的患者的血液样本中的生物素含量可能高达100-1200 ng/mL。
虽然生物素的人体代谢很快，不是所有服用生物素的人的血液样本都对免疫分析测试结果有影响，但随着逐渐增多的人群服用生物素以及大剂量生物素的广泛使用，生物素对临床免疫分析结果的影响已经成为临床免疫分析中必须关注的一个问题。美国临床化学会在其2020年发布的关于生物素干扰临床免疫分析的指南文件中汇集了来自多个国家的，由于生物素干扰而导致的误诊案例(D.Li，A.Ferguson，M.A.Cervinski，K.L.Lynch，P.B.Kyle， AACC Guidance Document on Biotin Interference in LaboratoryTests.J.Appl.Lab.Med.2020， 5，575-587.)。
推荐采用的可避免生物素干扰的程序，以及降低或消除生物素干扰的方法有以下一些。
1.避免生物素干扰的注意事项(Jieli Li，Elizabeth A.Wagar，Qing H.Meng，Comprehensive assessment of biotin interference in immunoassays，ClinicaChimica Acta， 2018，487，293-298)：
·询问患者是否服用含生物素的药品/营养品；
·记录摄入时间和摄入量；.
·要求患者在抽取血样前48小时停止服用生物素或含生物素的药品/营养品；
·如果每天服用量大于5mg，在最后一次服用后至少8小时后再取血样；
·如果测试结果与患者临床表现不一致，以及/或者怀疑有生物素干扰时，及时与实验室沟通。
2.在免疫分析测试前对样本进行预处理，如采用链酶亲和素包裹的磁珠除去生物素 (M.-L.Piketty，D.Prie，F.Sedel，D.Bernard，C.Hercend，P.Chanson and J.-C.Souberbielle， High-dose biotin therapy leading to false biochemicalendocrine profiles：validation of a simple method to overcome biotininterference，Clin Chem Lab Med，2017，55，817-825；C. Trambas，Z.Lu，T.Yen andK.Sikaris，Depletion of biotin using streptavidin-coated microparticles：avalidated solution to the problem of biotin interference in streptavidin-biotin immunoassays，Ann.Clin.Biochem.，2018，55216-226；H.M.Stieglitz， N.Korpi-Steiner，Characterization of biotin interference in 21 Vitros 5600immunoassaysand risk mitigation Clin.Biochem.2020，75，53-61.)
3.改变反应顺序，将链酶亲和素包覆的磁珠与生物素化抗体在抗体/抗原免疫反应前先结合形成抗体包覆的磁珠，(L.Johnson and D.Li，Strategy to investigatebiotin interference in light of the FDA safety communication，J.Appl.Lab.Med.，2019，3，914-915；Jianbo Yang， J.R.Wiencek，Mitigating biotin interference in twoRoche immunoassays by premixing biotinylated capturing molecules withstreptavidin coated beads，Clinica Chimica Acta，2020， 505，130-135.)
4.采用一种特定的生物素的单抗与生物素结合；专利申请WO 2018/122043Al披露了一种只与游离生物素结合，而不与偶联在生物大分子(如抗体)上的生物素相结合的生物素单抗。在试剂反应体系中加入这种特异性生物素单抗而改进的高敏心肌肌钙蛋白 T(cTnT-hs)ECL免疫分析试剂有效地中和了添加到血液样本中的生物素，抵御了其对测试结果的干扰(A.von Meyer，G.Albert，S.Kunzelmann，C.Rank，R.Zerback and R. Imdahl，Evaluating the performance of an updated high-sensitivity troponin T assaywith increased tolerance to biotin，Clin Chem Lab Med，2021，59，591-597.)。
电化学发光(ECL，Electrogenerated chemiluminescence orelectrochemiluminescence)免疫分析是一种广泛应用于临床检验的免疫分析方法。在ECL免疫分析中，三联吡啶钌(通常表示为Ru(bpy)3 2+)的琥珀酰亚胺酯(NHS酯，见图3A)或其它发光金属配合物被用作标记物，对被测物抗体或抗原进行标记。在抗体与样本中的被测物在一定条件下反应形成抗体/抗原复合体之后，发光金属配合物在电化学流动池中通过电化学反应和一系列的后续化学反应，最终导致发光金属配合物的发光激发态的形成，产生可检测的发光信号。
ECL免疫分析涉及到抗体(在夹心法中)或被测物(在竞争法中)如何被标记，被测物如何被捕获，ECL反应如何被触发以及工作电极如何再生等诸多技术细节。以ECL夹心法免疫分析为例，在一个典型的商业ECL分析中，使用图3A所示的标记分子，在一个被测物的抗体的赖氨酸残基的ε-氨基位点处标记抗体(信号抗体)，而另一个抗体(捕获抗体) 被生物素化。当一个临床样本与这两类抗体以及链霉亲和素包裹的磁珠按预设的一段时间在一定温度下互相混合后，一种夹心结构免疫复合体就在磁珠表面形成。然后，磁珠被带入一个电化学发光测量池(流动池)并被位于测量池下的可移动磁铁捕获在电化学工作电极表面。含三丙胺(tri-n-propylamine，TPA或N(C3H7)3)的缓冲溶液冲洗掉不需要的物质并提供一种使Ru(bpy)3 2+发光基团经历描述在以下反应路径一中的ECL反应的化学环境。
在一个特定的电压下(比如相对于Ag/AgCl而言1.4V)，缓冲溶液中的三丙胺被氧化成阳离子自由基N(C3H7)3 ·+(反应1)，并进一步失去一个质子成为中性自由基H6C3·N(C3H7)2 (反应2)。该中性自由基具有强还原能力，能将Ru(bpy)3 2+还原到Ru(bpy)3 1+(反应3)。具有氧化能力的阳离子自由基N(C3H7)3 ·+再将Ru(bpy)3 1+氧化为激发态Ru(bpy)3 2+*(反应3)。 Ru(bpy)3 2+*发出波长为620nm的光后回到原始的Ru(bpy)3 2+基态(反应5)。
反应路径一
N(C3H7)3-e-→N(C3H7)3 ·+ (1)
N(C3H7)3 ·+-H+→H6C3 ·N(C3H7)2 (2)
Ru(bpy)3 2++H6C3 ·N(C3H7)2→Ru(bpy)3 ++P (3)
Ru(bpy)3 ++N(C3H7)3 ·+→Ru(bpy)3 2+*+N(C3H7)3 (4)
Ru(bpy)3 2+*→Ru(bpy)3 2++hυ (5)
因此，在ECL过程中，Ru(bpy)3 2+不被消耗掉，而是经历一个氧化态的循环变化，即，Ru(bpy)3 2+→Ru(bpy)3 1+→Ru(bpy)3 2+*→Ru(bpy)3 2+(见W.Miao，J.-P.Choi，A.J.Bard，J.Am.Chem.Soc.2002，124，14478-14485)。在测量过程中，这个循环不断重复，一个长延时的 ECL信号由此产生并被检测。在某一时间段(例如0.5-5秒)的全部ECL光发射的积分可以作为ECL强度的度量并与被测物的量相关联。测量结束后，磁珠和附着其上的免疫复合体被水性液流冲走，测量池被清洗，电极表面再通过电化学过程再生使其处于下一个测试的准备状态。这些按时序进行的实验细节在美国专利5,147,806，5,538,687和6,599,473中有所披露。
事实上，反应路径一只是一种可以产生ECL的反应路径。其它可能的反应路径(如以下反应路径二至四)也被提出来解释不同条件下激发态Ru(bpy)3 2+*的形成和ECL的产生(见 J.K.Leland and M.J.Powell，J.Electrochem.Soc.1990，137，3127-3131，andW.Miao，J.-P. Choi，A.J.Bard，J.Am.Chem.Soc.2002，124，14478-14485)。
反应路径二
Ru(bpy)3 2+-e-→Ru(bpy)3 3+ (6)
N(C3H7)3-e-→N(C3H7)3 ·+ (1)
N(C3H7)3 ·+-H+→H6C3 ·N(C3H7)2 (2)
Ru(bpy)3 3++H6C3 ·N(C3H7)2→Ru(bpy)3 2+*+P (7)
Ru(bpy)3 2+*→Ru(bpy)3 2++hυ (5)
反应路径三
Ru(bpy)3 2+-e-→Ru(bpy)3 3+ (6)
Ru(bpy)3 3++N(C3H7)3→Ru(bpy)3 2++N(C3H7)3 ·+ (8)
N(C3H7)3 ·+-H+→H6C3 ·N(C3H7)2 (2)
Ru(bpy)3 3++H6C3 ·N(C3H7)2→Ru(bpy)3 2+*+P (7)
Ru(bpy)3 2+*→Ru(bpy)3 2++hυ (5)
反应路径四
Ru(bpy)3 2+-e-→Ru(bpy)3 3+ (6)
N(C3H7)3-e-→N(C3H7)3 ·+ (1)
N(C3H7)3 ·+-H+→H6C3 ·N(C3H7)2 (2)
Ru(bpy)3 2++H6C3 ·N(C3H7)2→Ru(bpy)3 ++P (3)
Ru(bpy)3 ++Ru(bpy)3 3+→Ru(bpy)3 2++Ru(bpy)3 2+* (9)
Ru(bpy)3 2+*→Ru(bpy)3 2++hυ (5)
以上反应路径二、三和四发生在电极电压高到足以把Ru(bpy)3 2+氧化成为Ru(bpy)3 3+(即反应6)的条件下，而在反应路径一所涉及的几个反应中，不存在Ru(bpy)3 2+被氧化成 Ru(bpy)3 3+的反应6。但在能够导致反应路径二、三和四发生的高电压条件下，反应路径一中的反应也同时发生。尽管本领域的研究人员倾向于认为绝大多数的ECL光发射来自于反应路径一，但在实际的ECL免疫分析***中所采用的工作电压为1.4V(相对于Ag/AgCl参比电极)，在这个电压下，反应路径一、二、三和四都能发生。
美国专利US 10203333和中国专利ZL 201480045420披露了一类电中性金属钌的配位化合物(Neutral Ruthenium Complexes，简称NRC)。这些电中性的ECL标记物能降低免疫分析中的非特异性信号，一些电中性ECL标记分子(如图3C的NRC)还产生了更强的发光。美国专利申请US 2021/0130876 A1和WO 2021/084472 A1进一步披露了含有两个或多个ECL发光体的标记分子。这些性能更好的ECL发光体及其构成的标记分子丰富了电化学发光免疫分析方法学-如同化学发光具有基于不同化学发光体的多个平台技术，电化学发光也包括了基于不同ECL发光体的多个平台(如图2所示)。
在先技术中，ECL临床免疫分析所用的试剂盒由三部分试剂组成。在夹心法中，这三部分试剂是，生物素偶联的捕获抗体试剂，发光标记物(如Ru(bpy)3 2+)标记的信号抗体试剂以及链酶亲和素包裹的磁珠；而在竞争法中，这三部分试剂可以是，生物素偶联的抗原试剂，发光标记物(如Ru(bpy)3 2+)标记的信号抗体试剂以及链酶亲和素包裹的磁珠；也可以是，生物素偶联的捕获抗体试剂，发光标记物(如Ru(bpy)3 2+)标记的抗原试剂以及链酶亲和素包裹的磁珠。
由于在先技术中所有的ECL临床免疫分析试剂体系中都采用链酶亲和素包裹的磁珠作为一个试剂组份，样本中可能存在的生物素将与试剂中的生物素偶联组分(生物素偶联的捕获抗体试剂或生物素偶联的抗原试剂)竞争磁珠表面的链酶亲和素结合位点，从而导致不真实的信号产生。
前述的降低或消除生物素干扰的方法对ECL免疫分析都有一定的效果，但明显地有各种问题。用户端提出的解决方案增加了测试的繁琐，而且不能对所有的情况都有效。而ECL 试剂制造商采用特异性生物素单抗的方法将大大增加试剂成本。本发明提供一种不同于现有ECL免疫分析试剂体系的双组分试剂盒。该试剂盒不含链酶亲和素组分，从而避免了临床ECL免疫分析样本中可能存在的生物素对测试结果的干扰。
尽管生物素干扰的问题由来已久，ECL试剂开发者不放弃生物素-链酶亲和素化学体系的技术原因有以下几个。
1.在现有的三试剂反应体系中，免疫复合物【抗体/抗原/抗体】或【抗原/抗体】是在均相反应中形成的，在其形成以后，复合物再通过生物素/链酶亲和素反应而被锚定在磁珠表面。理论上讲，抗体抗原的结合反应在均相中的重复性较好，从而导致多次重复测试同一样本的结果重复性较好。
2.不同于其它同样采用磁珠作为固相载体，化学发光作为检测信号的免疫分析技术，电化学发光产生于沉降在二维平面的电极上的磁珠表面，而其它化学发光信号产生于悬浮在三维溶液中磁珠；而且电化学反应只发生在与电极表面相距1-2纳米距离的界面上，因此，磁珠表面化学的任何改变将可能影响电化学反应的发生。放弃生物素-链酶亲和素化学体系不能保证在ECL技术的发展初期就建立在生物素-链酶亲和素化学平台上的电化学发光免疫分析还能具有相当的分析性能；
3.不同于化学发光免疫分析，在电化学发光免疫分析方法中，对形成于磁珠表面的免疫复合物进行的磁分离是在电化学流动池中完成的。在这一过程中，一定量的反应混合物按一定的流速流经电化学流动池中的工作电极表面时被位于工作电极下方的磁铁吸住而停留在电极表面。在ECL免疫分析中，这一过程被称为磁珠捕获过程。由于磁珠表面化学状态的任何改变都可能改变其在液路中的流体动力学，也会影响表面担载免疫复合物的磁珠在电极表面的均匀分布。因此，摒弃生物素-链酶亲和素化学体系将导致磁珠在电极表面的磁分离过程失控，也会改变磁珠在电极表面的均匀分布，导致ECL免疫分析的性能指标下降。
在本发明提供的方法之前，存在一种基于上述原因1的普遍担心，即，双试剂体系把抗体抗原结合反应从均相(缓冲溶液)改变为非均相反应(磁珠表面)，会导致测试精密度(常用变异系数coefficient of variation表示)变差。然而，惊奇的是，本发明实施例描述的体系均给出了与三试剂体系相当的反应重复性。
上述原因2和3是ECL免疫分析所特有的。在本发明之前，基于上述原因2而存在的担心是，在抗体和磁珠之间少了生物素-(链酶)亲和素层级将改变电化学发光反应不同路径的信号贡献，也可能增强非特异性吸附，从而改变已经建立的浓度响应关系，不利于电化学发光技术达到其最佳工作状态，然而，实施本发明的一个意外是，摒弃生物素和链酶亲和素组分后，ECL仍能达到其最佳工作状态。
解决上述原因3引起的担心需要发展建立不同的磁珠捕获程序，通过大量试错，本专利发明人意外地发现，在磁珠流经工作电极表面时，让电极处于一个高于0.0V(相对于饱和氯化钾溶液中的银/氯化银参比电极)，但低于0.45V的电位，不仅有助于提高信号值，也有助于磁珠在电极表面的更均匀分布。
发明内容
本发明提供一种不同于现有ECL免疫分析三组份试剂体系的双组份试剂盒。该试剂由抗体包覆的磁珠和ECL发光标记物标记的抗体(或抗原)两个组分构成。该试剂盒不含链酶亲和素包裹的磁珠，不含生物素偶联的抗体(或抗原)，从而避免了临床ECL免疫分析样本中可能存在的生物素对测试结果的干扰。进一步地，针对这种不含链酶亲和素的试剂体系的使用，本发明提供了一种改进的磁珠捕获方式，即在高于0.0V的电极电位状态下进行磁分离。
附图说明
将结合以下附图描述本发明，在以下附图中，相同的附图标记表示相同的要素，并且其中：
图1生物素的化学结构式
图2基于不同检测信号的常规免疫分析方法
图3美国专利5,744,367(A)、美国专利6,808,939(B)、WO 2014203067A1(C)和美国专利申请US2016/0145281A1(D)中公开的ECL标记分子；
图4ECL免疫分析中的孵育反应结束后磁珠表面状态比较：(左)在先技术；(右) 本发明；
图5工作电极电位在一个测量周期内随时间的变化(虚线是在先技术中的电位设置情况)；
图6ECL免疫测试中信号随孵育时间而上升；
图7ECL免疫测试中不同孵育时间的信号和浓度的关系。
具体实施方式
除非另有定义，否则本文所用的技术和科学术语具有与本文所述的方法所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。这些术语和含义在技术文献中有充分的解释，例如《生物偶联技术》(G.T.Hermanson，Elservier，阿姆斯特丹，2008)和《免疫测定手册》(D.Wild等人，第4版，Elservier，阿姆斯特丹，2013)。
在本发明的范围内，“被测物”包括但不限于全细胞、细胞表面抗原、蛋白质配合物、细胞信号传导因子和/或组分、第二信使、第二信使信号传导因子和/或组分、亚细胞颗粒 (例如、细胞器或膜碎片)、病毒、朊病毒、尘螨或其片段、类病毒、免疫因子、抗体、抗体片段、抗原、半抗原、脂肪酸、核酸(和合成类似物)、核糖体、蛋白质(和合成类似物)、脂蛋白、多糖、抑制剂、辅因子、半抗原、细胞受体、受体配体、脂多糖、糖蛋白、肽、多肽、酶、酶底物、酶产物、核酸加工酶(例如聚合酶、核酸酶、整合酶、连接酶、解旋酶、端粒酶等)、蛋白质加工酶(例如蛋白酶、激酶、蛋白磷酸酶、泛素蛋白连接酶等)、细胞代谢产物、内分泌因子、旁分泌因子、自分泌因子、细胞因子、激素、药理学药物、药物、治疗药物、合成有机分子、有机金属分子、镇定剂、巴比妥酸盐、生物碱、类固醇、维生素、氨基酸、糖、凝集素、重组或衍生蛋白、生物素、亲和素、链霉亲和素或样品中存在的无机分子。
根据本发明方法和试剂，一种“被测物特异性试剂”(ASR)是一类具有特异性结合被测物的能力的分子或生物分子，如抗体、多克隆抗体和单克隆抗体、特异性受体蛋白、配体、核酸序列和类似物。它们通过与样品中的物质发生特异性结合或特异性化学反应，旨在生物分析应用中用来对生物样本中的个别化学或生物化学物质或配体进行鉴定和定量。
本发明范围内被称为“被测物特异性试剂包覆的磁珠”(ASR-coated magneticbeads) 是指被测物特异性试剂通过与磁珠表面的功能性基团而与磁珠形成的复合物，测物特异性试剂与磁珠表面的偶联方式可以是共价键结合方式，也可以通过吸附方式。
本发明其范围内被称为“标记物”、“标记物分子”、“钌(II)标记物”和“ECL 标记物”的物质可与其他物质共价键结合，该其他物质如生物活性被测物或其类似物、基于生物亲和性的被测物识别伴侣或其类似物(例如被测物特异性试剂)、以及上述识别伴侣的其他结合伴侣、或一种能够与被测物形成共价键的反应性化学物质、或如上所述的其类似物或其结合***。上述物质也可以与一种或多种结合伴侣和/或一种或多种反应性组分的组合结合。另外，上述物质也可被结合到与结合伴侣、反应性组分、或一种或多种结合伴侣和/或一种或多种反应性组分的组合连接的被测物或其类似物上。将多个上述物质直接结合或通过如上所述的其他分子结合至被测物或其类似物也在本发明的范围内。
如本文所用，术语“标记物”是指任何化学或生化物质，其本身或通过与其他试剂的物理/化学相互作用，产生能与目标被测物的量相关联的可检测信号(无论是可见的信号还是通过使用合适的仪器可检测的信号)。标记物包括但不限于含有放射性原子(放射性)的分子、发光化合物(通过光激发或通过化学反应发光)、电活性化合物(通过氧化还原反应生成电信号)、磁性颗粒(磁信号)、酶(通过与底物的反应生成可检测的物质或光学信号)、酶或酶促底物(催化化学/生化反应)。一种标记物可以由一个或多个信号产生单元和一个或多个反应性基团组成。
术语“发光”是指电子从低能态转变为“激发”高能态，然后再回落到较低能量状态时以电磁辐射(光发射)形式释放的能量。这种光的发射通常发生在电磁光谱的可见光谱或近可见光谱范围内。术语“发光”通常包括但不限于诸如磷光、荧光、生物发光、放射线发光、电致发光、电化学发光和热致发光的发光现象，但在本发明中，如无特指，发光就是电化学发光。
在本发明的范围内，术语“发光基团”和“发光体”是指化合物中负责产生发光现象的官能团。在具有复杂结构的化合物中，例如，具有多个官能团(例如，反应性基团、亲水/疏水/两亲基团、吸电子/供电子基团、电平衡基团、间隔基团、连接基团、支化基团等) 的结构，发光基团是产生发光现象所需的最小结构部分(例如，参见图1中的圆圈部分)。
术语“发光标记物”是指由一个或多个发光基团和一个或多个反应性基团组成的标记物，其易于与待标记的化学或生化分子形成共价键。发光标记物可以是例如荧光分子、磷光分子、放射发光分子、本发明中的电化学发光分子(即，ECL标记物)、或在点表面上具有反应性基团的量子点。但在本发明中，如无特指，“发光标记物”就是电化学发光标记物(ECL标记物)。具有一个发光基团和一个反应基团的电化学发光(ECL)标记物的例子在现有技术中被最频繁地公开(参见，例如，图1中的标记物和WO2003002974A2， WO 2014203067A1中的其他钌配合物标记物和WO2014019711A1中的铱配合物标记物)。在US 2005/0059834 A1中公开了具有三个发光基团(三个钌配合物单元)和一个反应性基团(-COOH或NHS酯)的发光标记物的例子。美国专利6140138公开了具有一个发光基团 (一个钌配合物)和两个反应性基团(-COOH或NHS酯)的发光标记物的例子。中国专利申请202010983872.X、美国专利申请2021/0130876 A1和WO 2021/084472 A1中公开的多含两个和多个发光基团的ECL标记分子
根据本申请，“检测试剂”包括标记有至少一个ECL发光基团的被测物特异性试剂(ASR)、或标记有一个ECL发光基团的被测物类似物/同源物。本领域技术人员已知，在分析中，检测试剂最终固定在固相上。“固相”，也称为“固体载体”，是指非流体物质，如磁珠和颗粒(包括微粒和珠子)，由诸如聚合物、金属(顺磁性、铁磁性颗粒)、玻璃、和陶瓷的材料制成；凝胶物质，例如二氧化硅、氧化铝、和聚合物凝胶；毛细管，其可以由聚合物、金属、玻璃和/或陶瓷制成；沸石和其他多孔物质；电极；微量滴定板；固体条；以及比色皿、试管、薄片或其他光谱仪的样品容器。分析过程中的固相组分不同于所述分析过程可能接触到的惰性固体表面之处在于，“固相”在其表面上含有至少一个旨在与捕获抗体或捕获分子相互作用的结构部分。固相可以是固定的成分，例如试管、条、比色皿、薄片、或微量滴定板，也可以是非固定的成分，例如磁珠、珠子和微粒。
在一个实施方案中，该方法可以夹心法分析形式进行。在一个实施方案中，该方法可以竞争性分析形式进行。在一个实施方案中，该方法也可以双抗原桥接分析形式(DAGS)进行。已知的免疫测定形式在以下书籍中有详细的描述：D.Wild等人，《免疫测定手册》，第4版，Elservier，阿姆斯特丹(2013)以及E.P.Diamondis和T.K.Christopoulos，《免疫测定》，圣地亚哥，学术出版社(1996)。
“电化学发光免疫分析”或“ECL免疫分析分析”是通过电化学激发使ECL发光基团产生发光信号的一种分析方法。工作电极和参比电极之间的一个电压以电化学方式启动与结合到ASR或被测物类似物/同源物的ECL发光基团发光。从ECL发光基团发出的光由光电探测器测量，并指示目标被测物的存在或数量。美国专利No.5,543,112、5,935,779、和 6,316,607详细描述了ECL方法。
在本发明中的术语“工作电压”是本发明的一个关键概念和实验参数。在由工作电极、对电极和参比电极组成的三电极电化学测量***中，“工作电压”是工作电极和参比电极之间的电压。如无特指，本发明提到的工作电压或电压都是相对于银/氯化银(Ag/AgCl，饱和氯化钾)参比电极，其相对于标准氢电极(Standard Hydrogen Electrode，SHE)的电极电位为+0.197V。在产生电化学发光或开展电化学发光免疫分析时，不同的仪器***也许配置有不同的参比电极，其与工作电极之间的电压与本发明中的工作电压有差异，差异的大小可以通过参比电极的电极电位换算而得到。本领域的技术人员知道，不同参比电极相对于标准氢电极(SHE)的电极电位以及其换算方法可以在涉及电化学的文献和书籍中找到。本发明涉及到的针对本发明中的试剂盒的一种方法是通过磁珠捕获过程中的“工作电压”的调节来提高信号。
在ECL分析程序中，可以将磁珠悬浮在样品和检测试剂中以有效结合被测物。磁珠可具有0.05μm至200μm、0.1μm至100μm、或0.5μm至10μm的直径，并具有能够结合生物分子的表面组分。在本发明申请者使用的ECL分析***(安赛诊断YnY 2020、YnY2050 和YnY 3030***)中，磁珠的直径为2.8μm。磁珠可由以下物质形成：有机聚合物、聚苯乙烯、苯乙烯共聚物例如苯乙烯/丁二烯共聚物、丙烯腈/丁二烯/苯乙烯共聚物、乙烯基乙酰丙烯酸酯共聚物、氯乙烯/丙烯酸酯共聚物、惰性无机材料、二氧化铬、铁的氧化物、二氧化硅、二氧化硅混合物、蛋白质物质或它们的混合物，
根据本申请，“试剂组分”包含支持ECL信号产生的试剂，例如共反应剂(如三丙胺TPA)、用于pH控制的缓冲剂、表面活性剂、防腐剂或抗菌剂、以及可选的其他组分。技术人员知道在电化学发光检测方法中产生ECL信号所需的试剂构成中存在的组分。
如本文所用，“水溶液”是溶解于水中的颗粒、物质或液体化合物的均相溶液，或具有悬浮在水溶液中的微粒(直径从0.05μm至200μm)的非均相悬浮液。水溶液也可以包含有机溶剂。有机溶剂是本领域技术人员已知的，例如胺、甲醇、乙醇、二甲基甲酰胺或二甲基亚砜。如本文所用，还应理解，水溶液可包含至多50％的有机溶剂。
在本文中，与ECL标记物共同参与ECL过程的物质被称为ECL“共反应剂”。ECL常用的共反应剂包括叔胺(例如三正丙胺TPA)及其类似物/同系物(例如2-(二丁基氨基) 乙醇等)、草酸盐和过硫酸盐。本领域技术人员知道可用于ECL检测方法的共反应剂。
如本文所用，“过渡金属配合物”涉及包含与合适的络合剂或螯合剂结合的过渡金属离子的ECL发光基团。在一个实施方案中，过渡金属选自由钌、铱、铼、锇、铕、铽、镝组成的集合；在另一个实施方案中，过渡金属是钌、铱、铼、或锇；在进一步的实施方案中，过渡金属是钌或铱。
在一个实施方案中，ECL发光基团是美国专利US 10203333和中国专利ZL201480045420披露了一类电中性金属钌的配位化合物。
在另一个实施方案中，ECL发光基团是铱配合物，并且选自下面的ECL标记物。Ir(6- 苯基菲啶)2-吡啶-2-羧酸或其衍生物，包括，例如Ir(6-苯基菲吡啶)2-3-羟基吡啶-2-羧酸、Ir(6- 苯基菲啶)2-4-(羟甲基)吡啶-2-羧酸、Ir(6-苯基菲啶)2-2-(羧乙基-苯基)吡啶-2-羧酸、Ir(6-苯基菲啶)2-5-(甲氧基)吡啶-2-羧酸、或Ir(6-苯基菲啶)2-2-(羧乙基-苯基)吡啶-2-羧酸酯、或其衍生物，例如配体被一种或多种磺酸取代的铱配合物、或者如WO2012107419(A1)、 WO2012107420(A1)、WO2014019707(A2)、WO2014019708(A1)、WO2014019709 (A2)、WO2014019710(A1)、WO2014019711(A1)中所述的铱配合物。本领域技术人员众所周知，铱(III)配合物在水溶液中的溶解性较差，可以使用上述ECL化合物的亲水性衍生物。因此，在另一个实施方案中，可以用亲水性取代基对上述铱(III)ECL发光基团进行修饰。在另一个实施方案中，ECL发光基团是具有两个苯基菲啶配体的铱配合物，所述苯基菲啶配体具有两个磺酰基丙氧基取代基、两个磺甲基，其包含2，9-菲啶二甲磺酸、 6-苯基-钠盐(CAS登记号1554465-50-7)、或两个聚乙二醇取代基、或每个苯基菲啶配体中含有上述基团中的三个，或每个苯基菲啶配体中含有上述基团的组合。
在另一个实施方案中，ECL标记物是中国专利申请202010983872.X、美国专利申请2021/0130876 A1和WO 2021/084472 A1中公开的多标记ECL标记分子。
本领域技术人员知道，在ECL免疫分析中，发光信号由一个恒定的工作电压触发ECL 反应，最终导致被固定在磁珠表面的ECL发光体产生光信号。恒定电压激发的时间通常在 0.2到10秒之间，优选1.0到3.0秒之间。在此电压激发期间，ECL发光信号逐渐衰减。在一定时间内，ECL发光衰减曲线下的面积就是相对发光强度(RLU)。在一个特定的免疫分析中，不同的RLU对应于不同的被测物浓度。以RLU表示的信号响应与浓度的关系通常由拟合得到的函数关系(线性或非线性)来描述。图7中的五条拟合曲线符合四参数logistics 方程。
本领域技术人员也知道，在一个自动ECL测试***中，通常有一个电极表面的预处理程序，在样本测试前应用该程序能确保电极表面在测试前保持同样的表面化学状态。一个测试结束后，需对电化学测量池和电极表面进行清洗和再生处理。这些步骤在美国专利5147806中有所披露，美国专利6599473进一步地披露了改进的方案。在描述这些步骤时，在先专利使用的术语是preoperative，conditioning，cleaning。图5描述了一个包含预处理和测试步骤的电化学发光信号产生程序。在不同的ECL***中，预处理和清洗程序可能不同，比如，美国专利6599473披露的电化学程序中增加了一个被认为可以改进磁珠在电极上的沉积状态的电压脉冲。本发明不涉及测量后清洗程序和电极后处理的改进，本发明对预处理阶段和捕获阶段的改进是将负电压脉冲从-1.2V改为-0.5V，并在捕获阶段将工作电极的电压从0.0V调高到0.05和0.40V之间。
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本精神，可以对每种实施方式做出不同程度的修改，只要不脱离或偏离本发明的基本精神(即试剂构成中不含链酶亲和素)，该实施方式就在本发明的范围之内。
实施例
根据前述说明书，本发明的这些和其他优点对于本领域技术人员将是显而易见的。因此，本领域技术人员将认识到，可以在不脱离本发明的广泛发明构思的情况下对上述实施例进行改变或修改。应当理解，本发明不限于在此描述的特定实施例，而是旨在包括在本发明的范围和精神内的所有改变和修改。
实施例1-采用表面含有羧基的磁珠制备PCT抗体包覆的磁珠
a.将磁珠(粒径范围在2.8μm，30mg/mL)悬浮混匀，使用1 mL的25mM MES(pH 5.0)缓冲液清洗磁珠，并旋转混合10分钟，随后进行磁分离。重复清洗磁珠2-3次。
b.添加600μg PCT捕获抗体(浓度为1mg/mL，添加600μL)到磁珠里(抗体与磁珠包被比例为0.02mg∶1mg)，室温下低速旋转混匀反应30分钟。
c.用100mM MES(pH 5.0)缓冲液配制100mg/mL的EDC溶液，现配现用。
d.将300μL的EDC(即3mg)加入到磁珠和抗体的反应溶液中混匀，补加100μL的25mM MES(pH 5.0)缓冲液至最终体积为1mL(使得磁珠反应浓度为30mg/mL)，4℃下低速旋转混匀反应2小时。
e.封闭和清洗已包被磁珠：将已包被抗体的磁珠与50mM Tris、pH 7.4室温下低速旋转混匀反应15分钟，或与50mM乙醇胺在PBS、pH 8.0室温下低速旋转混匀反应60分钟，以封闭多余活性反应基团。使用1mL的PBS或50mM的Tris清洗已包被抗体的磁珠四次。洗涤过程中可添加0.1％的Tween-20或Triton X-100以减少非特异性结合，之后添加0.1％-0.5％的 BSA或脱脂奶粉，最后将磁珠重悬到PBS缓冲液中至所需浓度(对应磁珠浓度0.25mg/mL)。
该试剂为PCT-M试剂，用于后续的免疫反应性验证和临床样本测试。
实施例2-用电中性钌配位化合物(Electronically Neutral Rutheniumcomplex，NRC)标记抗体
用图3C所示的NRC标记物，即Ru(2，2′-联吡啶)(红菲咯啉二磺酸盐)[4-(2，2′-联吡啶-4- 基)丁酸]，标记PCT抗体以形成NRC标记的信号抗体。
将2.5mg(2.5μmol)的NRC以5.0mmol L-1的浓度溶解于500μL的MES缓冲液(0.1molL-1，pH＝4.7)中。向该溶液中加入1.0mg(5.2μmol)的EDC和3.0mg(13.8μmol)磺基 NHS，以获得浓度约10mmol L-1的EDC和27mmol L-1的磺基NHS。将该溶液在室温下摇动 10分钟。将0.7μL(10μmol)的2-巯基乙醇添加到上述反应溶液中(最终浓度为20mmolL-1)。在室温下放置5分钟后，将8.0μL(含40nmol的NRC)的该孵育溶液添加到500μL PCT抗体(1.2mg/mL，约4nmol的纯PCT抗体，摩尔反应比为10)PBS(0.1mol L-1，pH＝7.4) 中。将其混合并在室温下孵育2小时。
将以上获得的溶液(约0.5ml)加载到预先用PBS平衡的PD-10柱上。分离过程中形成两个黄色带。收集对应于标记抗体的第一洗脱带(约0.75ml)。确定标记物NRC与抗体的结合比为6.1∶1。
收集到的NRC标记的抗体溶液进一步稀释至1.0μg/mL备用。该试剂为PCT-N试剂，用于后续的免疫反应性验证和临床样本测试。
实施例3-免疫反应性验证
用PCT抗原配制一系列不同浓度的PBS溶液，作为标准溶液。在可编程全自动电化学发光免疫分析仪(深圳安赛诊断技术有限公司YnY系列或ProScientia 2020)上采用不同孵育时间进行免疫反应性验证。
通过免疫分析仪的取样针分别将30μl的不同浓度PCT的PBS溶液作为被测物与85μl浓度为4μgmL-1的PCT-M试剂和85μl的PCT-N试剂相混合。每种混合物在37摄氏度下孵育不同时间(2，5，10，15和30分钟)。在设定孵育时间结束后，将150μl上述反应悬浮液注入全自动免疫分析仪的三电极测量池中，其工作电极上方为光电倍增管，工作电极下方为可移动磁体。当反应悬浮液通过电位维持在0.2V的工作电极时，其中的免疫免疫复合物被位于工作电极下方的磁铁驻留在电极表面。随后，液路***再吸入含三丙胺的磷酸盐缓冲液(pH6.8，0.18mol L-1三丙胺)对驻留在电极表面的磁珠进行清洗。最后，经过的磁分离和清洗的表面包覆有【抗体/抗原/抗体】复合物的磁珠处在磷酸盐缓冲液(pH 6.8，0.18 mol L-1三丙胺)中。在工作电极和参比(饱和氯化钾中的Ag/AgCl)之间应用一个1.4V的电压就产生ECL，置于测量池上方的光电倍增管采集光信号并经数学处理就得到ECL的相对发光值。每次测量后，应用一个3.0V的电压清洗所述测量池并对电极进行电化学再生处理(后处理，见图5描述的电位随时间变化的方式)，以备下一个测试。
上述测试结果，即不同孵育时间的信号值以及信号和浓度的关系被展现在图6和图7中。
实施例4-抗生物素干扰的验证
将生物素溶于10mol L-1氢氧化钠溶液中配制浓度为20mg mL-1的生物素水溶液。将50 μL的该溶液分别加入950μL含不同浓度PCT的混合血清样本中以得到生物素浓度为1mg mL-1的血清。该浓度(1mg mL-1生物素)是服用最大剂量生物素(每日300mg)的人血液中可能达到的浓度的103-104倍，更是大大超过一般评价试剂抗干扰浓度的上限。作为对比，将50μL不含生物素的10molL-1氢氧化钠溶液加入950μL一份血清样本。
将以上配制的样本作为待测样本，按照实施例3的测量方法，采用5分钟孵育对每个样本进行三次重复测试，得到的结果取平均，计算相对偏差。
表1和表2分别是测量的浓度值和ECL信号值。结果表明，在添加了极高浓度的生物素后，浓度值和信号值的变化小于可接受的10％。对常年服用最大剂量生物素的人，其血液免疫分析结果不受生物素的影响。
表1两个浓度的混合血清样本在添加生物素后的浓度测量值。
Figure RE-GDA0003925360580000181
表2两个浓度的混合血清样本在添加生物素后的信号值。
Figure RE-GDA0003925360580000182

Claims (5)

1.一种仅由以下两种试剂组成的电化学发光生物分析试剂盒：
a)一种悬浮有磁珠的缓冲液试剂，其磁珠表面被一种对被测物具有特异性亲和识别能力的抗体包裹；
b)一种标记有电化学发光物质的抗体的缓冲液，其抗体对被测物具有特异性亲和识别能力。
其中，两种试剂中的抗体不同，它们分别识别被测物的不同位点；所述磁珠的直径为0.2–5微米；所述电化学发光物质是过渡金属配合物，优选钌和铱配合物。
2.一种仅由以下两种试剂组成的电化学发光免疫分析试剂盒：
a)一种悬浮有磁珠的缓冲液试剂，其磁珠表面被一种对被测物具有特异性亲和识别能力的抗体包裹；；
b)与电化学发光物质相偶联的被测物分子、被测物分子衍生物或者被测物分子的类似物的缓冲液试剂。
其中，所述磁珠的直径为0.2–5微米，所述电化学发光物质是过渡金属配合物，优选钌和铱配合物。
3.一种仅由以下两种试剂组成的电化学发光免疫分析试剂盒：
a)一种由被测物分子、被测物分子衍生物或者被测物分子的类似物包裹的磁珠悬浮液试剂；
b)一种标记有电化学发光物质的抗体的缓冲液，其抗体对被测物具有特异性亲和识别能力。
其中，所述磁珠的直径为0.2–5微米，所述电化学发光物质是过渡金属配合物，优选钌和铱配合物。
4.权利要求1-3中的过渡金属配合物是含钌的电中性配合物。
5.一种配合权利要求1-3中的电化学发光生物分析试剂盒进行免疫测定的电极预处理、磁珠捕获和磁珠测量前清洗程序，其包含以下步骤：
a)在磁珠随反应液体流经工作电极前，在工作电极和参比电极之间交替地应用一个正电压和一个负电压，所述负电压在-0.3V和-0.9V之间；
b)在磁珠随反应液体流经工作电极时，将工作电极和参比电极之间的电压保持在0.05V和0.4V之间；
c)在磁珠被驻留在工作电极后，继续保持工作电极和参比电极之间的电压在0.05V和0.4V之间，同时采用含有机胺的磷酸盐缓冲液对磁珠进行清洗，所述有机胺是含直链或支链烷基的叔胺(例如三正丙胺TPA)及其类似物/同系物。
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