JPH08242885A - 細胞活性測定方法 - Google Patents
細胞活性測定方法Info
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- JPH08242885A JPH08242885A JP7047536A JP4753695A JPH08242885A JP H08242885 A JPH08242885 A JP H08242885A JP 7047536 A JP7047536 A JP 7047536A JP 4753695 A JP4753695 A JP 4753695A JP H08242885 A JPH08242885 A JP H08242885A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 白金電極を用いて、簡便にかつ迅速に細胞の
活性を測定できる。 【構成】 生細胞を含む溶液に２−メチル−１，４−ナ
フトキノン（メナジオン）などの酸化型キノンを作用さ
せ、生成したメナジオールなどの還元型キノンあるいは
過酸化水素を白金電極により検出、定量し、細胞活性を
測定する。
活性を測定できる。 【構成】 生細胞を含む溶液に２−メチル−１，４−ナ
フトキノン（メナジオン）などの酸化型キノンを作用さ
せ、生成したメナジオールなどの還元型キノンあるいは
過酸化水素を白金電極により検出、定量し、細胞活性を
測定する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、生細胞の活性を測定す
る方法に関する。
る方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】新薬などを含む化学物質の安全性評価に
は、しばしば動物実験が行われているが、動物実験には
多大な費用と時間を要するため、近年動物実験代替法に
関する研究が数多くなされている。このような動物実験
代替法のひとつとして、生細胞を含む溶液に酸化型キノ
ンを添加し、溶液中に蓄積した過酸化水素を発光反応を
利用して検出・定量し、細胞内のエネルギー代謝活性を
測定する細胞活性測定方法が、山庄司らによる特開平１
−１６０４９９号公報、特開平２−２７６５９４号公
報、特開平３−２２８６９７号公報、特開平３−２６６
９９８号公報、特開平５−２９２９９８号公報に提案さ
れている。これらの公報で開示された方法の原理は、生
細胞内に存在するニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ド（ＮＡＤＨ）もしくはそのリン酸化合物（ＮＡＤＰ
Ｈ）を一方の基質として、酸化還元酵素ＮＡＤＨ（Ｐ）
Ｈ：キノン酸化還元酵素により生細胞を含む溶液に添加
されたキノン化合物が還元されて生じる還元型キノン化
合物がさらに溶液中の溶存酸素と反応して生じる過酸化
水素の溶液中蓄積量を発光反応を利用して測定するもの
である。
は、しばしば動物実験が行われているが、動物実験には
多大な費用と時間を要するため、近年動物実験代替法に
関する研究が数多くなされている。このような動物実験
代替法のひとつとして、生細胞を含む溶液に酸化型キノ
ンを添加し、溶液中に蓄積した過酸化水素を発光反応を
利用して検出・定量し、細胞内のエネルギー代謝活性を
測定する細胞活性測定方法が、山庄司らによる特開平１
−１６０４９９号公報、特開平２−２７６５９４号公
報、特開平３−２２８６９７号公報、特開平３−２６６
９９８号公報、特開平５−２９２９９８号公報に提案さ
れている。これらの公報で開示された方法の原理は、生
細胞内に存在するニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ド（ＮＡＤＨ）もしくはそのリン酸化合物（ＮＡＤＰ
Ｈ）を一方の基質として、酸化還元酵素ＮＡＤＨ（Ｐ）
Ｈ：キノン酸化還元酵素により生細胞を含む溶液に添加
されたキノン化合物が還元されて生じる還元型キノン化
合物がさらに溶液中の溶存酸素と反応して生じる過酸化
水素の溶液中蓄積量を発光反応を利用して測定するもの
である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】従来の技術の項で述べ
た細胞活性測定では、過酸化水素を定量するために過酸
化水素と反応して発光をもたらす発光試薬が必要である
が、発光試薬が高価でかつ化学的に不安定であるという
問題があった。また、過酸化水素と発光試薬が反応して
生じる発光が不安定であるため、発光試薬を添加してか
ら発光量を測定するまでの時間を厳密に制御する必要が
あり、このような制御を行うために高価な自動測定装置
を利用するか、あるいは、測定操作に熟練した技術者を
養成する必要があった。
た細胞活性測定では、過酸化水素を定量するために過酸
化水素と反応して発光をもたらす発光試薬が必要である
が、発光試薬が高価でかつ化学的に不安定であるという
問題があった。また、過酸化水素と発光試薬が反応して
生じる発光が不安定であるため、発光試薬を添加してか
ら発光量を測定するまでの時間を厳密に制御する必要が
あり、このような制御を行うために高価な自動測定装置
を利用するか、あるいは、測定操作に熟練した技術者を
養成する必要があった。
【０００４】本発明の目的は、上述のような問題点を解
決し、簡便に生細胞の活性を測定できる方法を提供する
ことにある。
決し、簡便に生細胞の活性を測定できる方法を提供する
ことにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明は、生細胞を含む
溶液に酸化型キノンを添加し、溶液中に生成する還元型
キノン又は過酸化水素を定量して前記細胞の活性を測定
する方法であって、生成する還元型キノン又は過酸化水
素を白金電極により検出、定量することを特徴とする。
溶液に酸化型キノンを添加し、溶液中に生成する還元型
キノン又は過酸化水素を定量して前記細胞の活性を測定
する方法であって、生成する還元型キノン又は過酸化水
素を白金電極により検出、定量することを特徴とする。
【０００６】酸化型キノンとしては、例えば２−メチル
−１，４−ナフトキノン（メナジオン）などを用いるこ
とができる。
−１，４−ナフトキノン（メナジオン）などを用いるこ
とができる。
【０００７】
【作用】本発明の細胞活性測定方法は、生細胞を含む溶
液に酸化型キノンを添加し、溶液中に生成した還元型キ
ノンあるいは過酸化水素を白金電極により検出、定量し
て細胞活性を測定するものである。
液に酸化型キノンを添加し、溶液中に生成した還元型キ
ノンあるいは過酸化水素を白金電極により検出、定量し
て細胞活性を測定するものである。
【０００８】生細胞では、細胞のエネルギー代謝によっ
て生じるニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡ
ＤＨ）及びそのリン酸化合物（ＮＡＤＰＨ）と、主とし
て細胞膜内に存在するＮＡＤ（Ｐ）Ｈ−キノン酸化還元
酵素の存在が知られている。また、特開平１−１６０４
９９号公報では、細胞培養溶液に添加したメナジオンを
始めとするキノン化合物が生細胞と反応して溶液中に過
酸化水素が蓄積されるという報告がある。本願発明者
は、この過酸化水素あるいは過酸化水素が生成される前
の反応で生成される還元型キノンが、細胞培養液中で白
金電極を用い検出可能であることを見いだし本発明の創
出に至った。
て生じるニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡ
ＤＨ）及びそのリン酸化合物（ＮＡＤＰＨ）と、主とし
て細胞膜内に存在するＮＡＤ（Ｐ）Ｈ−キノン酸化還元
酵素の存在が知られている。また、特開平１−１６０４
９９号公報では、細胞培養溶液に添加したメナジオンを
始めとするキノン化合物が生細胞と反応して溶液中に過
酸化水素が蓄積されるという報告がある。本願発明者
は、この過酸化水素あるいは過酸化水素が生成される前
の反応で生成される還元型キノンが、細胞培養液中で白
金電極を用い検出可能であることを見いだし本発明の創
出に至った。
【０００９】本発明の方法により、生細胞を含む溶液に
酸化型キノンを添加することにより溶液中に生成された
還元型キノンあるいは過酸化水素を白金電極により定電
位電解酸化を行って、電流測定により溶液中の還元型キ
ノンあるいは過酸化水素を定量することにより、細胞活
性を測定することができる。
酸化型キノンを添加することにより溶液中に生成された
還元型キノンあるいは過酸化水素を白金電極により定電
位電解酸化を行って、電流測定により溶液中の還元型キ
ノンあるいは過酸化水素を定量することにより、細胞活
性を測定することができる。
【００１０】
【実施例】次に本発明の一実施例について図面を参照し
て説明する。第１の実施例は、酸化型キノンを添加し、
生成した還元型キノンを定量することによる細胞活性測
定方法に関する。大日本製薬株式会社製ヒト株化肝細胞
Ｈｅｐ Ｇ２を常法に従ってトリプシン処理後、遠心分
離により集め、細胞密度が１×１０7 ｃｅｌｌｓ／ｍｌ
になるようにＥａｇｌｅ ＭＥＭ培地に懸濁した。この
細胞懸濁液をそれぞれ２ｍｌずつ３枚の３５mmシャーレ
にとり、この内の２枚にはそれぞれ細胞活性を阻害する
エチルアルコールを細胞懸濁液に対し１０％、５％含有
するように添加し、１枚はエチルアルコールを無添加と
し対照用とした。これらを二酸化炭素濃度５％、飽和水
蒸気、３７℃の条件で１時間培養した後、図１に示した
ように測定用容器５に細胞懸濁液４をとり有効電極面積
１１．１mm2 の白金作用電極１、対極２、銀・塩化銀参
照電極３を挿入し、白金作用電極１に銀・塩化銀参照電
極３を基準としてポテンシオスタット６を用いて０．２
Ｖの電位をかけて、白金作用電極１に流れる電流を測定
し、記録計７に１秒ごとに記録した。引き続き電位をか
けながら２００ｍＭメナジオン溶液を２０μｌ添加し
た。メナジオン溶液添加後直ちに電流値は上昇し、３分
後ほぼ添加前の値に戻った。図２は本実施例による測定
方法で測定した電流値の経時変化を説明するための模式
図である。メナジオン溶液添加前の定常的電流値はメナ
ジオン溶液を矢印８の時点で添加した後、曲線９のよう
に一時的な上昇を示した後、メナジオン添加前の定常的
な電流値に戻る。メナジオン添加前の定常電流値を延長
した線１０と曲線９で囲まれる領域１１の面積を細胞活
性値とした。その結果、エチルアルコールを添加しなか
った対照で得られた細胞活性値を１００とするとエチル
アルコールを１０％含む細胞懸濁液では細胞活性値は３
２、エチルアルコールを５％含む細胞懸濁液では８７と
なった。このように細胞活性を阻害するエチルアルコー
ルを添加した試料では、細胞活性値が小さくなってお
り、本発明によれば容易に細胞活性を測定することがで
き、また化学物質の安全性評価も行うことができる。
て説明する。第１の実施例は、酸化型キノンを添加し、
生成した還元型キノンを定量することによる細胞活性測
定方法に関する。大日本製薬株式会社製ヒト株化肝細胞
Ｈｅｐ Ｇ２を常法に従ってトリプシン処理後、遠心分
離により集め、細胞密度が１×１０7 ｃｅｌｌｓ／ｍｌ
になるようにＥａｇｌｅ ＭＥＭ培地に懸濁した。この
細胞懸濁液をそれぞれ２ｍｌずつ３枚の３５mmシャーレ
にとり、この内の２枚にはそれぞれ細胞活性を阻害する
エチルアルコールを細胞懸濁液に対し１０％、５％含有
するように添加し、１枚はエチルアルコールを無添加と
し対照用とした。これらを二酸化炭素濃度５％、飽和水
蒸気、３７℃の条件で１時間培養した後、図１に示した
ように測定用容器５に細胞懸濁液４をとり有効電極面積
１１．１mm2 の白金作用電極１、対極２、銀・塩化銀参
照電極３を挿入し、白金作用電極１に銀・塩化銀参照電
極３を基準としてポテンシオスタット６を用いて０．２
Ｖの電位をかけて、白金作用電極１に流れる電流を測定
し、記録計７に１秒ごとに記録した。引き続き電位をか
けながら２００ｍＭメナジオン溶液を２０μｌ添加し
た。メナジオン溶液添加後直ちに電流値は上昇し、３分
後ほぼ添加前の値に戻った。図２は本実施例による測定
方法で測定した電流値の経時変化を説明するための模式
図である。メナジオン溶液添加前の定常的電流値はメナ
ジオン溶液を矢印８の時点で添加した後、曲線９のよう
に一時的な上昇を示した後、メナジオン添加前の定常的
な電流値に戻る。メナジオン添加前の定常電流値を延長
した線１０と曲線９で囲まれる領域１１の面積を細胞活
性値とした。その結果、エチルアルコールを添加しなか
った対照で得られた細胞活性値を１００とするとエチル
アルコールを１０％含む細胞懸濁液では細胞活性値は３
２、エチルアルコールを５％含む細胞懸濁液では８７と
なった。このように細胞活性を阻害するエチルアルコー
ルを添加した試料では、細胞活性値が小さくなってお
り、本発明によれば容易に細胞活性を測定することがで
き、また化学物質の安全性評価も行うことができる。
【００１１】次に酸化型キノンを添加することにより生
成する過酸化水素を定量することによる細胞活性測定の
一例を示す。大日本製薬株式会社製ヒト株化肝細胞Ｈｅ
ｐＧ２を常法に従ってトリプシン処理後、遠心分離によ
り集め、細胞密度が１×１０7 ｃｅｌｌｓ／ｍｌになる
ようにＥａｇｌｅ ＭＥＭ培地に懸濁した。この細胞懸
濁液を前記活性測定と同様に、それぞれ２ｍｌずつ３枚
の３５mmシャーレにとり、２枚にはそれぞれエチルアル
コールを１０％，５％になるように添加し、１枚はエチ
ルアルコールを無添加とし対照用とした。これらを二酸
化炭素濃度５％、飽和水蒸気、３７℃の条件で１時間培
養した後、図１に示したように測定用容器５に細胞懸濁
液４をとり有効電極面積１１．１mm2 の白金作用電極
１、対極２、銀・塩化銀参照電極３を挿入し、白金作用
電極１に銀・塩化銀参照電極３を基準としてポテンシオ
スタット６を用いて０．７Ｖの電位をかけて、白金作用
電極１に流れる電流を測定し、記録計７に１秒ごとに記
録した。引き続き電位をかけながら２００ｍＭメナジオ
ン溶液を２０μｌ添加した。メナジオン溶液添加後電流
値は徐々に上昇し、１分後ほぼ一定の値で安定した。こ
の時の電流値とメナジオン溶液添加前の電流値との差を
細胞活性値とした。その結果、エチルアルコールを添加
しなかった対照で得られた細胞活性値を１００とすると
エチルアルコールを１０％含む細胞懸濁液では細胞活性
値は３６、エチルアルコールを５％含む細胞懸濁液では
８４となった。本実施例においても、第１の実施例と同
様の結果が得られた。
成する過酸化水素を定量することによる細胞活性測定の
一例を示す。大日本製薬株式会社製ヒト株化肝細胞Ｈｅ
ｐＧ２を常法に従ってトリプシン処理後、遠心分離によ
り集め、細胞密度が１×１０7 ｃｅｌｌｓ／ｍｌになる
ようにＥａｇｌｅ ＭＥＭ培地に懸濁した。この細胞懸
濁液を前記活性測定と同様に、それぞれ２ｍｌずつ３枚
の３５mmシャーレにとり、２枚にはそれぞれエチルアル
コールを１０％，５％になるように添加し、１枚はエチ
ルアルコールを無添加とし対照用とした。これらを二酸
化炭素濃度５％、飽和水蒸気、３７℃の条件で１時間培
養した後、図１に示したように測定用容器５に細胞懸濁
液４をとり有効電極面積１１．１mm2 の白金作用電極
１、対極２、銀・塩化銀参照電極３を挿入し、白金作用
電極１に銀・塩化銀参照電極３を基準としてポテンシオ
スタット６を用いて０．７Ｖの電位をかけて、白金作用
電極１に流れる電流を測定し、記録計７に１秒ごとに記
録した。引き続き電位をかけながら２００ｍＭメナジオ
ン溶液を２０μｌ添加した。メナジオン溶液添加後電流
値は徐々に上昇し、１分後ほぼ一定の値で安定した。こ
の時の電流値とメナジオン溶液添加前の電流値との差を
細胞活性値とした。その結果、エチルアルコールを添加
しなかった対照で得られた細胞活性値を１００とすると
エチルアルコールを１０％含む細胞懸濁液では細胞活性
値は３６、エチルアルコールを５％含む細胞懸濁液では
８４となった。本実施例においても、第１の実施例と同
様の結果が得られた。
【００１２】
【発明の効果】以上説明したとおり、本発明の細胞活性
測定方法は、細胞の培養液に酸化型キノンを添加し、生
成した還元型キノンあるいは過酸化水素を白金電極によ
り検出し、細胞内のエネルギー代謝を測定し、細胞の活
性を測定する。本発明によれば、細胞活性測定に特別な
発光試薬などを用いずに、簡便かつ短時間に細胞の活性
を測定できる。また、測定に用いる白金電極は微小化で
きるため、装置が小型で、また少量の細胞懸濁液での測
定が可能である。
測定方法は、細胞の培養液に酸化型キノンを添加し、生
成した還元型キノンあるいは過酸化水素を白金電極によ
り検出し、細胞内のエネルギー代謝を測定し、細胞の活
性を測定する。本発明によれば、細胞活性測定に特別な
発光試薬などを用いずに、簡便かつ短時間に細胞の活性
を測定できる。また、測定に用いる白金電極は微小化で
きるため、装置が小型で、また少量の細胞懸濁液での測
定が可能である。
【００１３】また、本発明により化学物質の安全性評価
を簡便に行うことができる。
を簡便に行うことができる。
【図１】本発明に関する白金電極を用いて細胞活性を測
定する装置の構成図である。
定する装置の構成図である。
【図２】本発明の細胞活性測定法により得られる電流の
経時変化を示す模式図である。
経時変化を示す模式図である。
１ 白金作用電極 ２ 対極 ３ 銀・塩化銀参照電極 ４ 細胞懸濁液 ５ 測定溶液 ６ ポテンシオスタット ７ 記録計 ８ メナジオン溶液添加時点 ９ 電流値の経時的変化 １０ 定常電流値 １１ 領域
Claims (2)
- 【請求項１】生細胞を含む溶液に酸化型キノンを添加
し、前記溶液中に生成する還元型キノン又は過酸化水素
を定量して前記細胞の活性を測定する方法であって、生
成する前記還元型キノン又は前記過酸化水素を白金電極
により検出、定量することを特徴とする細胞活性測定方
法。 - 【請求項２】前記酸化型キノンが２−メチル−１，４−
ナフトキノン（メナジオン）である請求項１記載の細胞
活性測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7047536A JPH08242885A (ja) | 1995-03-07 | 1995-03-07 | 細胞活性測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7047536A JPH08242885A (ja) | 1995-03-07 | 1995-03-07 | 細胞活性測定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08242885A true JPH08242885A (ja) | 1996-09-24 |
Family
ID=12777863
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7047536A Pending JPH08242885A (ja) | 1995-03-07 | 1995-03-07 | 細胞活性測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH08242885A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003072428A (ja) * | 2001-09-06 | 2003-03-12 | Suzuki Motor Corp | 運転者用操作パネル |
| JP2007248071A (ja) * | 2006-03-13 | 2007-09-27 | Horiba Ltd | 微生物検出方法及び微生物検出装置 |
| JP2012518161A (ja) * | 2009-02-17 | 2012-08-09 | シーメンス アクチエンゲゼルシヤフト | 診断装置 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5255691A (en) * | 1975-09-24 | 1977-05-07 | Yellow Springs Instr | Improved diaphragm for enzyme electrode |
| JPS61500930A (ja) * | 1984-01-21 | 1986-05-08 | ザ ブリテイツシユ ピトロ−リアム コンパニ− ピ−．エル．シ−． | 膜結合系の検知 |
| JPH03228696A (ja) * | 1990-01-31 | 1991-10-09 | King Jozo Kk | 酵母の生菌数測定法 |
-
1995
- 1995-03-07 JP JP7047536A patent/JPH08242885A/ja active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5255691A (en) * | 1975-09-24 | 1977-05-07 | Yellow Springs Instr | Improved diaphragm for enzyme electrode |
| JPS61500930A (ja) * | 1984-01-21 | 1986-05-08 | ザ ブリテイツシユ ピトロ−リアム コンパニ− ピ−．エル．シ−． | 膜結合系の検知 |
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|---|---|---|---|---|
| JP2003072428A (ja) * | 2001-09-06 | 2003-03-12 | Suzuki Motor Corp | 運転者用操作パネル |
| JP2007248071A (ja) * | 2006-03-13 | 2007-09-27 | Horiba Ltd | 微生物検出方法及び微生物検出装置 |
| JP2012518161A (ja) * | 2009-02-17 | 2012-08-09 | シーメンス アクチエンゲゼルシヤフト | 診断装置 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 19980106 |