JPH0817706B2

JPH0817706B2 - 遺伝子的に修飾された生物体を用いるビタミンｃの製造方法

Info

Publication number: JPH0817706B2
Application number: JP61504243A
Authority: JP
Inventors: ハーディー，キンバー; デポール，ヘンドリックバン; グリンドリー，ジューン; エイペイトン，マーク
Original assignee: バイオジェンインコーポレイテッド
Priority date: 1985-08-02
Filing date: 1986-08-01
Publication date: 1996-02-28
Anticipated expiration: 2011-02-28
Also published as: ATE78297T1; EP0231354B1; JP2526021B2; DK175120B1; EP0231354A4; AU594080B2; JPH0838189A; JPH0838185A; JP2577876B2; AU6221086A; DK169487A; DK169487D0; DE3686041D1; EP0231354A1; JPS63500493A; JPH06319564A; DE3686041T2; WO1987000863A1; JP2577877B2

Description

【発明の詳細な説明】［発明の技術分野］本発明はDNA配列、組換DNA分子、この種の配列および
分子を含有する生物、この種の生物による或る種の酵素
の発現、並びにこの種の生物および酵素を用いた醗酵に
よるビタミンＣ先駆体の製造に関するものである。より
詳細には、本発明は発現ビークル、並びにこのビークル
により形質転換されてグルコースまたはその他の炭素源
を醗酵により２−ケト−Ｌ−グルコン酸（２−KLG）、
すなわちビタミンＣ（アスコルビン酸）に対する化学先
駆体まで変換させるために使用する酵素を発現する遺伝
学的に改変された生物に関するものである。

［従来技術］ビタミンＣを製造するには幾つかの方法がある。１つ
の方法は、多数の化学合成工程と１つの醗酵工程とを含
む。要するに、これらの工程はグルコースからソルビト
ールへの水素化と、アセトバクタ・サブオキシダンスを
用いるソルビトールからソルボースへの醗酵と、ソルボ
ースのアセトン化と、２−KLGへのジアセトン・ソルボ
ース酸化と、２−KLGのエステル化と、エステルからア
ルコルビン酸への変換とである。この方法は複雑であ
り、かつ操作プラントのための比較的高い投資を必要と
する。

他の方法は２つの醗酵工程を含んでいる。この方法は
エルウィニア・スペシース（Erwinia sp.）によるグル
コースから2,5−ジケト−Ｄ−グルコネート（2,5−DK
G）への醗酵から出発し、コリネバクテリウム・スペシ
ース（Corynebacterium sp.）による2,5−DKGから２−K
LGへの醗酵と、２−KLGのエステル化と、このエステル
からアスコルビン酸への変換とを含む。１つの研究が示
すところでは、Ｄ−グルコネートおよび２−ケト−Ｄ−
グルコネート（２−KDG）がエルウィニア・スペシース
によりグルコースから順次に生成された後、2,5−DKGが
最初の醗酵工程で生成される。T.ソノヤマ等、「２工程
醗酵によるＤ−グルコースからの２−ケト−Ｌ−グロン
酸の製造」、アプライド・アンド・エンバイロンメンタ
ル・マイクロバイオロジー、第43巻、第1064〜1069頁
（1982）参照。この２工程醗酵法は、アセトバクター法
よりも若干低い投資額を有するが、まだ複雑であって操
作が高価につく。

グルコースを２−KLGまで変換するさらに他の方法
が、ヨーロッパ特許出願第132,308号明細書に記載され
ている。この出願は、１工程の醗酵法でグルコースを２
−KLGまで変換されることを記載している。これは、先
ず特定の2,5−DKGレダクターゼ（2,5−DKGから２−KLG
への醗酵を触媒すると言われる酵素）をコードするDNA
配列の供給源としてコリネバクテリウム・スペシースAT
CC31090を挙げている。このDNA配列は、それ自身のまた
は合成のリボソーム結合部位を有して、イー・コリtrp
もしくはtacプロモータ或いは発現ベクターにおけるpAC
YC184 CATプロモータの「下流」に挿入されると言われ
ている。さらに、このベクターはテトラサイクリン耐性
またはその他の選択可能な標識をコードする遺伝子を含
有し、かつプラスミドCol E1、15AまたはRSF 1010から
誘導される複製源を有するとも言われる。さらに、宿主
細胞であるエルウィニア・ヘルビコーラ（Frwinia herb
icola）（ATCC 21998）は、ベクターより形質転換され
ると言われる。醗酵に際し、この形質細胞は１工程でグ
ルコースから２−KLGを生産すると言われる。しかしな
がら、この工程におけるグルコースから２−KLGへの変
換は充分満足しうるものでない。何故なら、２−KLGの
収率が極めて低くかつこの低収率を得るにさえ醗酵時間
が長過ぎるからである。

したがって、たとえばグリコースのような炭素源を２
−KLGまで許容しうる割合でかつ単一の醗酵工程にて変
換しうる単一の生物が目標とさており、これはまだ得ら
れていない。

解決しようとする課題本発明は、グルコースまたはその他の炭素源を２−KL
Gまで急速かつ高収率で変換しうる単一の生物を見出す
と言う問題を解決する。一具体例において本発明は、グ
ルコースまたはその他の炭素源を２−KLGまで単一醗酵
にて許容しうる変換割合にて、中間的な生成物回収工程
または中間的な精製工程なしに変換するのに必要とされ
る全醗酵工程を行なうよう、宿主を形質転換しうる発現
ビークルを提供する。本発明を実施して得られる２−KL
Gを次いで上記の慣用方法におけると同様にエステル化
しかつアスコルビン酸（ビタミンＣ）まで変換すること
ができる。

本発明の方法と異なり、グルコースを２−KLGまで変
換させるための公知の工業醗酵工程は、グルコースを２
−KLGまで変換させるのにたとえばエルウィニアおよび
コリネバクテリウムの菌株など２種の別の生物を必要と
する。

本発明の一利点は、遺伝子的に修飾された生物体の単
一株により単一醗酵にてグルコースから直接に２−KLG
の相当な収率を達成することである。したがって、単一
醗酵工程を使用しうる本発明の方法の能力は公知工業方
法よりも比較的簡単な方法をもたらし、したがってグル
コースからビタミンＣを製造するための工程装置および
エネルギの必要性が少なくなる。

本発明の他の目的は、ヨーロッパ特許出願第132,308
号明細書に記載されたものよりも優れた新規な2,5−DKG
レダクターゼおよび新規な形質転換生物を提供し、した
がって本発明の方法および生成物はヨーロッパ特許出願
第132,308号における方法および生成物よりも予想外に
改善されかつ特許性を有するものである。

本発明のさらに他の目的および特徴は、以下の記載か
ら明らかとなるであろう。

［図面の簡単な説明］第１図は本発明における2,5−DKGレダクターゼのＮ末
端からの部分アミノ酸配列を示し、第２図は本発明における2,5−DKGレダクターゼの分子
量14,000ダルトンの臭化シアノゲン断片に関するアミノ
酸配列の１部を示し、第3a−ｅ図は本発明における2,5−DKGレダクターゼ遺
伝子を有するコリネバクテリウム・ゲノムの部分をハイ
ブリッド化により位置決定するのに使用される数種のヌ
クレオチドプローブの配列を示し、第４図は本発明における2,5−DKGレダクターゼ遺伝子
のDNA配列および本発明における2,5−DKGレダクターゼ
の対応アミノ酸配列を示し、第５図はプラスミド210^*およびpcBR13からプラスミド
pPLred332の作成を示し、第５図において記号は次の意
味を有する:PL＝P_Lプロモータ;S−Ｄ＝シャイン−ダル
ガルノ配列;ori＝複数のオリジン;Lac＝lacプロモータ;
amp−ｒ＝アンピシリン耐性遺伝子。

［課題を解決するための手段］本発明によれば、エルウィニア属及び2,5−ジケト−
Ｄ−グルコン酸を生成するいずれか他の細胞又は生物体
からなる群から選択され、かつ少なくとも一つの組換DN
A分子により形質転換された宿主により製造され、前記
組換DNA分子は、2,5−DKGレダクターゼをコードし、か
つ（ａ）式：のDNA配列、及び（ｂ）前記（ａ）に規定したDNA配列に対する遺伝コ
ードの結果変性され、それで2,5−DKGレダクターゼをコ
ードするDNA配列からなる群から選択されるDNA配列を特徴とし、前記DNA
配列は、前記分子中の発現制御配列に作用的に結合され
ている、ことを特徴とする2,5−DKGレダクターゼ、及び
前記形質転換された宿主のエルウィニア属の培養による
2,5−DKGレダクターゼの製造、並びにグルコース培地中
で前記宿主、例えばエルウィニア・シトレウスの培養に
より２−KLGを生成させ、次いで前記２−KLGをビタミン
Ｃに変換する単一発酵のよるビタミンＣの新規な製造を
特徴とする。

［本発明を実施する最良の方式］本発明を一層充分に理解しうるよう、以下詳細に説明
する。この説明において、以下の幾つかの用語を使用す
る：ヌクレオチド：糖成分（ペントース）と燐酸と含窒素
複素環塩基とよりなるDNAもしくはRNAのモノマー単位で
ある。この塩基はグリコシド炭素（ペントースの１′炭
素）を介して糖成分に結合され、塩基と糖との組合せを
ヌクレオシドと呼ぶ。塩基はヌクレオチドを特性化す
る。４種のDNA塩基はアデニン（「Ａ」）、グアニン
（「Ｇ」）、シトシン（「Ｃ」）およびチミン
（「Ｔ」）である。４種のRNA塩基はＡ、Ｇ、Ｃおよび
ウラシル（「Ｕ」）である。DNAに関し、「Ｐ」はプリ
ン（ＡもしくはＧ）のいずれかを示し、「Ｑ」はピリミ
ジン（ＣもしくはＴ）のいずれかを示し、かつ「Ｎ」は
４種の塩基（Ａ、Ｇ、ＣもしくはＴ）のいずれかを示
す。RNAに関し「Ｐ」、「Ｑ」および「Ｎ」は、「Ｕ」
を「Ｔ」の代りに用いる以外は同じ意味を有する。

DNA配列：隣接するペントースの３′炭素と５′炭素
との間のホスホジエステル結合により互いに結合された
デオキシヌクレオチドの線状列である。

コドン:3種のヌクレオチド（トリプレット）のDNA配
列であって、そのmRNAを介しアミノ酸、翻訳開始信号ま
たは翻訳停止信号をコードする。たとえば、ヌクレオチ
ドトリプレットTTA、TTG、CTT、CTC、CTAおよびCTGはア
ミノ酸ロイシン（「Leu」）をコードし;TAG、TAAおよび
TGAは翻訳停止信号であり、かつATGは翻訳開始信号であ
って、さらにメチオニンをもコードする。

解読枠:mRNAをアミノ酸配列に翻訳する際のコドンの
群である。翻訳に際し、適切な解読枠を維持せねばなら
ない。たとえば、DNA配列GCTGGTTGTAAGは３つの解読枠
もしくは相で発現することができ、そのそれぞれは次の
異なるアミノ酸配列を生ずる：ポリペプチド：隣接するアミノ酸のα−アミノ基とカ
ルボキシ基との間のペプチド結合によって互いに結合さ
れたアミノ酸の線状列である。「ポリペプチド」と言う
用語を本明細書中で使用する場合、「蛋白」と言う用語
を包含することが当業者には了解されよう。

ゲノム：細胞またはウィルスの全DNAである。これは
特に細胞のポリペプチドをコードするDNA、並びにオペ
レータ、プロモータおよびリボソームの結合および相互
作用配列を包含し、たとえばこれらコード配列をそれぞ
れにつきシャイン−ダルガルノ配列のような配列を含
む。

遺伝子：特定のポリペプチドに特徴的なアミノ酸の配
列を雛型もしくはメッセンジャRNA（「mRNA」）を介し
てコードするDNA配列である。

発現：ポリペプチドを生産すべく遺伝子によって受け
る過程である。これは、DNA配列からmRNA配列への転写
およびmRNA配列からポリペプチドへの翻訳を含む。

プラスミド：完全「レプリコン」を含んでプラスミド
を宿主細胞にて複製するような非染色体二重鎖DNA配列
である。プラスミドを単細胞生物中に組込むと、この生
物の特徴はプラスミドにおけるDNAの結果として変化し
または形質転換する。たとえば、テトラサイクリン耐性
（Tet^R）の遺伝子を有するプラスミドは、テトラサイク
リンに対し感受性であった細胞をこれに対し耐性の細胞
に形質転換させる。プラスミドにより形質転換された細
胞を「形質転換体」と呼ぶ。

ファージもしくはバクテリオファージ：細菌性ウィル
スである。多くのファージは、蛋白エンベロプもしくは
コートにカプセル化されたDNA配列（「カプシド」）で
構成される。

クローン化ビークル：宿主細胞中で複製しうるプラス
ミド、ファージDNAまたはその他のDNA配列である。クロ
ーン化ビークルは１個もしくは少数のエンドヌクレアー
ゼ認識部位を特徴とし、これらの部位においてDNA配列
はDNAの本質的な生物学的機能、たとえば複製、コート
蛋白の生成の喪失を伴わずに或いはプロモータもしくは
結合部位の喪失を伴わずに決定可能に切断することがで
きる。クローン化ビークルは一般に形質転換細胞の同定
に使用するのに適したマーカー、たとえばテトラサイク
リン耐性もしくはアンピシリン耐性を有する。クローン
化ビークルはしばしばベクターと呼ばれる。

クローン化：生物群または１種の生物もしくは配列か
ら誘導されるDNA配列を無性繁殖によって得る過程であ
る。

組換DNA分子、すなわちハイブリッドDNA:生細胞の外
部で末端結合された異なるゲノムからのDNAの断片から
なり、生細胞中に維持しうる分子である。

発現規制配列：遺伝子に作用結合された際これら遺伝
子の発現を制御しかつ調整するヌクレオチドの配列であ
る。これらはlac系、β−ラクタマーゼ系、trp系、tac
系、trc系、ファージλの主オペレータおよびプロモー
タ領域、fdコート蛋白の制御領域、SV40の早期および後
期プロモータ、ポリオーマウィルスおよびアデノウィル
スから誘導されるプロモータ、メタロチオニン・プロモ
ータ、３−ホスホグリセレートキナーゼまたはその他の
糖分解酵素のプロモータ、酸ホスファターゼのプロモー
タ（たとえばPho5）、酵母α−接合因子のプロモータ、
並びに原核もしくは真核細胞およびそのウィルスまたは
その組合せの遺伝子の発現を制御することが知られた配
列を包含する。哺乳動物細胞の場合、遺伝子は真核プロ
モータに結合することができ、たとえばSV40の早期領域
はジヒドロホレートレダクターゼをコードする遺伝子に
結合しかつ支那ハムスター卵細胞で選択的に増殖して活
性転写された真核遺伝子の多数のコピーを含有する細胞
ラインを生成することができる。

一具体例において、本発明はコリネバクテリウム・ス
ペシースSHS 752001から得られる組換DNA分子に向けら
れ、これは本発明の2,5−DKGレダクターゼをコードする
DNA配列を特徴とする。他の具体例において、本発明は
この種の組換DNA分子により形質転換された宿主、好ま
しくはエルウィニア・シトレウス（Erwinia citreus）
に向けられる。

本発明の組換DNA分子は、本発明の2,5−DKGレダクタ
ーゼをコードするDNA配列および組換DNA分子におけるこ
のDNA配列に作用結合される発現制御配列を特徴とす
る。広範な種類の発現制御配列を、本発明の組換DNA分
子に使用することができる。これらはlac系、β−ラク
タマーゼ名、trp系、tac系、trc系、ファージλの主オ
ペレータおよびプロモータ領域、fdコード蛋白の制御領
域、SV40の早期および後期プロモータ、ポリオーマウィ
ルスおよびアデノウィルスから誘導されるプロモータ、
メタロチオニンプロモータ、３−ホスホグリセレートキ
ナーゼまたはその他の糖分解酵素のプロモータ、酸ホス
ファターゼのプロモータ（たとえばPho5）、酵母α−接
合因子のプロモータ、ネオマイシンホスホトランスフェ
ラーゼのプロモータ、並びにその他の原核もしくは真核
細胞およびそのウィルスまたはその組合せの遺伝子の発
現を制御することが知られた配列を包含する。哺乳動物
細胞の場合、遺伝子は、たとえばジヒドロホレートレダ
クターゼをコードする遺伝子に結合されかつ支那ハムス
ター卵細胞で選択的に増幅されて、その多数コピーを含
む細胞ラインを生成するSV40早期領域のプロモータなど
の真核プロモータに結合することができる。本発明の好
適発現制御配列は、pUC8のlac配列から誘導される。

さらに、本発明の組換DNA分子は、各種のプラスミド
およびこれらを選択宿主中で複製させうるファージーか
らのDNA配列を含むことができる。好ましくは、さらに
これらは選択マーカー、たとえば薬剤耐性をコードする
DNA配列をも包含する。この種のプラスミドおよびファ
ージ配列はたとえば染色体、非染色体および合成のDNA
配列の断片から誘導することができ、たとえばSV40およ
び公知の細菌性プラスミド、たとえばcol E1、pCR1、pB
R 332、pMB9およびその誘導体を含むイー・コリからの
プラスミド、広範な宿主範囲のプラスミド、たとえばRP
4、ファージDNA、たとえばファージλの多数の誘導体
（たとえばNM989）、並びにその他のDNAファージ（たと
えばM13）およびフィラメント状一本鎖DNAファージ、並
びにプラスミドおよびファージDNAの組合体、たとえば
ファージDNAもしくはその他の発現抑制配列を用いて改
変されたプラスミド、或いはたとえば２μプラスミドも
しくはその誘導体のような酵母プラスミドから誘導され
るベクターとすることができる。

勿論、全てのベクターおよび発現制御配列が同様に機
能して本発明の改変DNA配列を発現しかつ本発明の新規
な2,5−DKGレダクターゼを生産するとは限らないことを
了解すべきである。また、全ての宿主が同じ発現系にて
同等に機能するとも限らない。しかしながら、当業者は
これらベクター、発現制御配列および宿主のうちから不
当な実験を伴わずにかつ本発明の範囲を逸脱することな
く選択を行なうことができる。たとえば、ベクターを選
択するには宿主を考慮せねばならない。何故なら、ベク
ターがそこで複製せねばならないからである。ベクター
のコピー数、このコピー数を制御する能力およびベクタ
ーによりコードされるその他任意の蛋白の発現（たとえ
ば抗生物質マーカー）も考慮せねばならない。

発現制御配列を選択するには、各種の因子も考慮せね
ばならない。これらは、たとえばこの系の相対的強度、
その制御可能性、並びに本発明の2,5−DKGレダクターゼ
をコードするDNA配列に対する適合性、特に有力な二次
構造を包含する。

本発明の2,5−DKGレダクターゼに対するDNA配列を用
いて、広範な種類の宿主、たとえばイー・コリの菌株の
ような細菌類（たとえばイー・コリC 600、イー・コリE
D8767、イー・コリDH1、イー・コリLE 392、イー・コリ
HB 101、イー・コリX1776、イ−・コリX2282、イー・コ
リMRC1）或いはシュードモナス、バチルスおよびストレ
プトミセス、酵母並びにその他の真菌類の菌株、動物宿
主、たとえば支那ハムスター卵細胞もしくはネズミ細
胞、その他の動物（ヒトを含む）宿主、培養植物細胞ま
たはその他の宿主などにおいてこのレダクターゼを生産
させることができる。発現の後、酵素は2,5−DKGを２−
KLGまで変換するのに使用することができる。

本発明の2,5−DKGレダクターゼのDNA配列に関する宿
主は、一般に選択ベクターに対する適合性、宿主に対す
る本発明の2,5−DKGの毒性、宿主細胞酵素による蛋白分
解減成に対する所望蛋白の感受性、精製に際し除去する
のが困難な宿主細胞蛋白による2,5−DKGレダクターゼの
汚染もしくは結合、発現特性、2,5−DKGレダクターゼを
生産しかつ分泌する宿主の能力、正確にレダクターゼを
複製する宿主の能力、宿主の醗酵要件、宿主からの2,5
−DKGレダクターゼの精製の容易さ、安全性、並びにコ
ストを考慮して選択すべきである。

一具体例において、宿主としてはエルウィニア・シト
レウスSHS2003を選択する。何故なら、これはグルコー
スから2,5−DKGを生産しかつ２−KLGを形質転換された
エルウィニア・シトレウスSHS2003によりグルコースか
ら直接生産しうるからである。

特に好ましくは、本発明の宿主はエルウィニア・シト
レウスSHS2003（Ferm-PNo.5449;ATCCNo.31623）並びに
エルウィニア・シトレウスSHS2003から突然変異された
菌株、すなわちエルウィニア・シトレウスER1026であ
り、これは唯一の炭素源として2,5−DKGもしくは２−KL
Gのいずれかを使用することができない。

以下の実施例は本発明の幾つかの具体例を示している
が、本発明の範囲を限定する目的でない。

実施例本発明の2,5−DKGレダクターゼのポリペプチド配列の同
定、並びにクローン化ベクターの作成コリネバクテリウム・スペシースSHS752001は、T.ソ
ノヤマ等、「２段階醗酵によるＤ−グルコースからの２
−ケト−Ｌ−グロン酸の製造」、アプライド・アンド・
エンバイロンメンタル・マイクロバイオロジー、第43
巻、第1064〜1069頁（1982）に記載されている。すなわ
ち、コリネバクテリウムの開示された菌株を、2,5−DKG
レダクターゼをコードするDNA配列の供与体として選択
した。コリネバクテリウムのこの菌株からの2,5−DKGレ
ダクターゼ遺伝子を同定するため、酵素の試料を分離し
かつ次の手順を用いて純度95％まで精製した： A. コリネバクテリウムSHS752001の培養 1. コリネバクテリウム・スペシースSHS752001の凍結
乾燥培養物を、開放直後に0.4mlの0.9％NaCl（120℃に
て20分間殺菌したもの）を前記凍結乾燥培養物を含有す
る小壜の内容物へ添加することにより再加水した。

2. この培養物を、0.5％のグリコースと0.5％の酵母抽
出物（ディフコ社）と0.5％のペプトン（ディフコ社）
と0.1％のKH₂PO₄と0.02％のMgSO₄・7H₂Oと2.0％の寒天
とを含有する溶液8mlを入れた試験管に移した。この溶
液のpHは7.0であり、かつこの溶液は120℃で15分間殺菌
されている。28℃にて培養物を添加してから40時間後、
培養物を120℃にて20分間殺菌されている0.9％NaClの0.
4mlで懸濁させた。

3. 工程２からの懸濁物0.1mlよりなる５個のロット
を、工程２の溶液と同じ成分を含有する５本の寒天スラ
ントに加えた。これら培養物を工程２と同じ時間かつ同
じ条件下で醗酵させた。培養物を5mlの0.9％NaCl（120
℃にて20分間殺菌したもの）で懸濁させ、かつ2.5mlの
懸濁物を500mlの培地を含有する10本の種フラスコのそ
れぞれに移した。

4. １％のグルコースと0.5％の酵母抽出物（ディフコ
社）と0.5％のペプトン（ディフコ社）と0.1％のNaNO₃
と0.1％のKH₂PO₄と0.02％のMgSO₄・H₂Oとを含有しかつp
H7.0を有する溶液を120℃にて15分間殺菌した。この溶
液60mlを、培養物を含有する500mlフラスコに添加し
た。28℃にて16〜18時間培養した後、10本のこれら500m
lの培養内容物を30lのジャーファーメンタに移した。

5. 1.8％のグルコースと2.7％のコーンスチープリカー
と0.31％のNaNO₃と0.06％のKH₂PO₄と4.4ppmのZnSO₄・7H
₂Oと0.72ppmのMnCl₂・4H₂Oと0.2ppmのビタミンB₁−HCl
と0.15ppmのパントテン酸カルシウムと0.005％の消泡剤
（アデカノール）とを含有するpH7.2の溶液20lを、培養
物を含有する30lのジャーファーメンタに加えた。この
ファーメンタを400rpmにて撹拌しながら0.5v.v.m.の空
気流速にて28℃で培養した。培地からグルコースが消失
した時（22時間）、醗酵を停止させた。最終pHは7.5で
あり、最終ODは19.2であった。

B. 細胞抽出物の作成約750gの菌体を、シャープレス遠心分離器を用いて遠
心分離（10,000Gにて10分間）することにより30lジャー
ファーメンタから収穫した。これら菌体を0.1M-HCl緩衝
液（pH7、2.5l）に懸濁させ、同じ緩衝液（それぞれの
場合2.5lづつ）で遠心分離器により、３回洗浄し、最後
に1.6lの緩衝液中に再懸濁させた（OD150）。これら菌
体（80mlの菌体懸濁物として）を音波処理（160ワット
にて７分間）により破壊した。破壊されない菌体および
残骸を遠心分離機（15,000Gで30分間）により除去し、
かつ上澄液（１）を集めた。

C. AmSO₄による分画 40％飽和と70％飽和との間で沈澱した蛋白物質を遠心
分離機により集め、かつ80mlの0.1Mトリス−HCl緩衝液
（pH7）に再溶解させた。この溶液をpH7の0.02Mトリス
−HCl緩衝液に対し１晩透析した。

D. イオン交換クロマトグラフィー透析した溶液（99ml）を、予め0.02Mトリス−HCl緩衝
液（pH7）で平衡化させたDEAE−セファロースCL-6Bカラ
ム（1.6×30cm）に入れた。このカラムをそれぞれ０お
よび0.2MのNaClを含有する0.02Mトリス−HCl緩衝液（pH
7）で段階的に洗浄した。酵素を、0.3M NaClを含有する
同じ緩衝液（pH7）で溶出させた。活性フラクションを
集め、かつAmSO₄を70％飽和まで添加することにより蛋
白を濃縮した。沈澱物を集め、かつ工程Ｃにおけると同
様に透析した。

E. 第１親和性クロマトグラフィー工程Ｄから得られた透析溶液（37ml）を、予め0.02M
トリス−HCl緩衝液（pH7）で平衡化されたアミコン・マ
トリックス・レッドＡカラム（1.6×19cm）に入れた。
このカラムを0.3〜0.5MのNaClを含有する0.02Mトリス−
HCl緩衝液（pH7）で段階的に洗浄した。酵素を、0.7〜
1.0MのNaClを含有する同じ緩衝液で溶出させた。活性フ
ラクション（90ml）を集めた。

F. 第２親和性クロマトグラフィー 0.02Mトリス−HCl緩衝液（pH、225ml）を工程Ｅから
集めたフラクションへ添加し、かつ得られた溶液を予め
0.02Mトリス−HCl緩衝液（pH7）で平衡化されたアミコ
ン・マトリックス・レッドＡカラム（1.9×12.3cm）に
入れた。このカラムを、0.2MのNaClを含有0.02Mトリス
−HCl緩衝液（pH7）で洗浄した。酵素を、0.5mMのNADPH
を含有する同じ緩衝液で溶出させた。活性フラクション
（35ml）を集め、限外濾過（分子量10,000以下のカット
オフ）により濃縮してNADPHを除去した。

本発明の2,5−DKGレダクターゼが音波処理工程に際し
変性されなかったことを示しかつ本発明の2,5−DKGレダ
クターゼが2,5−DKGを２−KLGに変換させることを確認
するため、7mgのNADPHと2mgの2,5−DKGと2.5mg/μｌの
全蛋白濃度の菌体音波処理物50μｌとを含有する0.1Mト
リス−HCl緩衝液（pH7）の混合物を作成した。全反応容
積は、200μｌであった。反応の生成物をHPLCによる分
析し、かつ２−KLGの存在を確認した。

本発明の2,5−DKGレダクターゼに対する抗体を作成し
た。これらの抗体は、ウサギの複数部位に対しフロイン
ドアジュバントにおける本発明の2,5−DKGレダクターゼ
100μｇを皮内注射し、かつフロインド不完全溶液にお
ける酵素50μｇにて21日後に加速させることにより発生
した。加速注射してから10日間に血清を集め、酵素結合
免疫吸収（「ELISA」）分析にて、本発明の抗−2,5−DK
Gレダクターゼ活性につき陽性であることが示された。

この精製酵素を、アプライド・バイオシステムス社に
より製作された高感度気相配列決定装置によりＮ−末端
から配列決定した。この方法により得られた部分配列を
第１図に示す。第１図における？マークは、特定アミノ
酸が確実性をもって決定しえなかったことを示してい
る。

さらに、精製酵素を標準臭化シアノゲン切断法により
切断した。この方法により生成された１種の14,000ダル
トンの断片におけるアミノ酸配列の１部を第２図に示
す。

クローンの保存物から本発明の2,5−DKGレダクターゼ
をコードするDNA配列を選択するため、ホスホトリエス
テル法を用いて一連のオリゴヌクレオチドプローブ（第
3a〜ｅ図に示す）を作成した。これらのプローブは、第
１図および第２図のアミノ酸配列から誘導したものであ
る。

遺伝子コードの縮退により、各プローブは実際上１群
の構造的に関連した分子であった。たとえば、第3a図の
14量体DNAプローブは予想配列に対し１個のＣ−Ｔ不整
合を伴う96の重複（redundancy）を有し、第3b図の14量
体DNAプローブ（第１図のプローブII）は１個のＧ−Ｔ
不整合を伴う32の重複を有し、第3c図および3d図の17量
体DNAプローブ（第１図のプローブIII）はそれぞれ32の
重複を有しかつ互いに最初の２個の位置においてのみ相
違し、さらに第3e図の14量体DNAプローブ（第２図のプ
ローブIV）は32の重複を有した。

本発明の2,5−DKGレダクターゼ遺伝子を選択すべく第
３（ａ〜ｅ）図のプローブによるスクリーニングを可能
にするようコリネバクテリウムDNAの保存物を作成する
ため、コリネバクテリウム・スペシースSHS752001の菌
体懸濁物を10mMトリス−HCl緩衝液（pH8）におけるリゾ
チーム（1mg/l）と1mMEDTAと20％（w/v）の蔗糖とドデ
シル硫酸ナトリウム（SDS）（5mg/ml）とで処理するこ
とにより、コリネバクテリウム・スペシースSHS752001
を溶菌させた。次いで、溶菌したコリネバクテリウム・
スペシースSHS752001菌体からのDNAを、150mM NaClと6m
Mのトリス−HCl緩衝液（pH7.9）と6mMのMgCl₂と100μg/
mlの牛血清アルブミンとからなる緩衝液において制限エ
ンドヌクレアーゼSau3aにより断片化させた。次いで、
これらDNA断片を、Ｊ、ビエラおよびJ.R.メッシング、
ジーン、第19巻、第259頁（1982）の方法によりBamH1部
位にてpUC8ベクター中へ挿入し、かつ組換プラスミドを
大腸菌JM83、W3110i^qおよびW3110i^q recＡに形質転換さ
せた。組換プラスミドからイー・コリJM83への形質転換
法は、J.R.メッシング、R.コレア、P.H.シーブルグ、ヌ
クレイック・アシッド・リサーチ、第９巻、第309頁（1
981）に示されている。他の宿主菌株につき同様な方法
を用いた。

得られた保存物のコロニーをR.B.ワレス、M.J.ジョン
ソン、T.ヒロセ、T.ミヤケ、E.H.カワシマおよびK.イタ
クラ、ヌクレイック・アシッド、リサーチ、第９巻、第
879〜894頁（1981）に記載された方法を用いて第３（ａ
〜ｅ）図のプローブでスクリーニングした。これらプロ
ーブを37℃でハイブリッド化させ、かつ6XSSCと5Xデン
ハルト緩衝液と0.1％SDSと50μg/mlt−RNAとからなる標
準洗浄液にて37℃で洗浄した。第3e図のプローブに対し
陽性（ハイブリッジ化したもの）であった17種のコロニ
ーのうち、２種はさらに第3c図もしくは3d図のクローン
またはその両者に対しても陽性であった。これらクロー
ンの２種の組換プラスミドをpCBR10およびpCBT13と命名
した。これら２種の組換プラスミドのそれぞれにおける
外来DNAの長さ3.0kbであった。

本発明による発現ベクターおよび形質転換体の性質形質転換宿主、２種の組換プラスミドおよびpCU8によ
る本発明の2,5−DKGレダクターゼの生産速度を含む組換
プラスミドの性質を決定するため、本発明の2,5−DKGレ
ダクターゼをコードするDNAを有していないベクター
を、S.N.コーヘン、A.C.Y.シャングおよびL.シュ、プロ
シーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス・
USA、第69巻、第2110頁（1972）に示された方法により
イー・コリW3110i^q recＡおよびエルウィニア・プンクタ
ータ（Erwinia punctata）に形質転換させた。pBR332に
関連するベクターpUC8は、BamH1部位から僅か上流に位
置する強力なlacプロモータを有する。

本発明の2,5−DKGレダクターゼを生産した形質転換細
胞から2,5−DKGレダクターゼを放出させてその生産割合
を測定しうるよう、幾つかの方法を検査した。音波処理
がイー・コリおよびエルウィニアにつき最良であると判
明した。

pCBR10およびpCBT13を含むイー・プンクタータおよび
イー・コリの抽出物を、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）［U.K.レム
リ、ネイチャー、第227巻、第680〜685頁（1970）］、
並びにウエスタン・ブロット法［P.S.トーマス、プロシ
ーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス・US
A、第77巻、第5201〜5205頁（1980）］によって分析
し、その際上記で生産された抗−（本発明の2,5−DKGレ
ダクターゼ）抗体を用いて形質転換体により生産された
本発明の2,5−DKGレダクターゼの量を測定した。lacイ
ンデューサであるイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピ
ラノシド（IPTG）で処理されたイー・コリW3110i^q recＡ
（pCBR13）の抽出物は、この遺伝子を有するプラスミド
で誘発されていない菌体からの抽出物よりも約５倍量の
酵素を含有した。

本発明の2,5−DKGレダクターゼが組換の際に変化しなか
ったことの確認 pCBR10およびpCBR13での形質転換後にイー・プンクタ
ータおよびイー・コリにより生産された2,5−DKGレダク
ターゼを検査して、これがコリネバクテリウム・スペシ
ーSHS752001から分離されたと同じ酵素であったかどう
かを調べた。

エルウィニア（pCMR13）、イー・コリW3110i^q recＡ
（pCBR13）およびコリネバクテリウムの抽出物のウエス
タンブロッドにより標識された蛋白の分子量は、本発明
の精製2,5−DKGレダクターゼの分子量と同じであった
（すなわち、約29,000d）。異なる菌体に対するブロッ
トの比較に基づき、エルウィニア（pCBR13）の全菌体蛋
白の１〜２％が本発明の2,5−DKGレダクターゼであると
推定された。

さらに、λP_Lプロモータ、すなわちλcIリプレッサ蛋
白により制御しうる強力なプロモータを用いて作成を行
なった。λP_Lプロモータの発現は、λcI₈₅₇温度感受性
リプレッサをも有する菌株にて温度を30℃から42℃まで
変化させることにより制御することができる。組換菌株
からの２−KLGの収率増加が、このプロモータ系を用い
て得られた。

第５図は、λP_Lプロモータの制御下で2,5−DKGレダク
ターゼを発現するプラスミドを作成するために用いたベ
クターの物理的地図を示している。プラスミドpPLred33
2は、プラスミドpCBR13からの2,5−DKGレダクターゼを
コードする断片をプラスミドp210^*中へ挿入して作成し
た。挿入した断片は、pCBR13を制限エンドヌクレアーゼ
EcoRIおよびHindIIIで切断して生ぜしめた。これら２種
の断片を、低融点のアガロースを用いて電気泳動により
分離した。さらに、このベクターをEcoRIおよびHindIII
で切断し（第５図参照）、適当な断片を結合させうるよ
うにした。得られたプラスミド、すなわちpPLred332を
菌株W3110cI_ts中に形質転換させて菌株EC1083を形成さ
せた。この菌株は、ラムダ温度感受性リプレッサ遺伝子
cI₈₅₇の染色体挿入物を有する。210^*から得られたベク
ター要素と第５図に示したpCBR13からの挿入物とからな
るプラスミドpPLred332は、pCBR13で特定されたものと
同様に、イー・コリおよびエルウィニア・シトレウス両
者と同じモル重量を有する2,5−DKGレダクターゼを特定
している。

エルウィニア・シトレウスER1026はpPLred332により
形質転換してER1116菌株を形成した。

アミノ酸および本発明の2,5−DKGレダクターゼのDNA
配列を確認するため、pCBR13の3kb挿入物をマキサムお
よびギルバートの技術［プロシーディング・ナショナル
・アカデミー・サイエンス・USA、第74巻、第560頁（19
77）並びにA.M.マキサムおよびW.ギルバート、メソッズ
・エンチモロジー、第65巻、第499〜560頁（1980）］お
よびプラスミドM13を用いるサンガーの配列決定［（F.
サンガー、S.ニッケレンおよびA.R.クールセン、プロシ
ーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス・US
A、第74巻、第5463〜5467頁（1977）］によって配列決
定した。3.0kb挿入物の配列検査は、酵素自身につき決
定された最初の60個のアミノ酸（第１図に示す）をほぼ
正確にコードする配列を示した。さらに、3.0kb挿入物
は、第２図のアミノ酸配列をほぼ正確にコードする配列
をも含有した。3.0kb挿入物におけるレダクターゼ遺伝
子の末端は、停止コドンによって示される。このように
して、レダクターゼ遺伝子は長さ831個のヌクレオチド
であると決定され（停止コドンがなく、かつATG、すな
わち開始コドンを含む）、さらにその配列を第４図に示
す。

本発明の2,5−DKGレダクターゼのアミノ酸配列をコー
ドするDNA配列は、ヨーロッパ特許出願第132,308号のポ
リペプチドをコードするDNA配列およびそのアミノ酸配
列と対比することができる。第４図は本発明の2,5−DKG
レダクターゼに関するDNA配列とアミノ酸配列との両者
を示している。ヨーロッパ特許出願第132,308号の第４
図は、そのポリペプチドの関連DNA配列およびアミノ酸
配列を示している。これら２つの図面を比較すれば、明
らかにpCBR13により特定されると同じ分子量を有する2,
5−DKGレダクターゼをイー・コリおよびエルウィニア・
シトレウスの両者において特定する。

エルウィニア・シトレウスER1026をpPLred332で形質
転換させて菌株ER1116を形成させた。

本発明による2,5−DKGレダクターゼのアミノ酸および
DNA配列を確認するため、pCBR13の3.0kb挿入の2,5−DKG
レダクターゼとそのDNA配列とがヨーロッパ特許出願第1
32,308号のアミノ酸配列およびDNA配列とは明らかに相
違していることが示される。

酵素のミハエリス定数（Km）は、この酵素の反応速度
の尺度となる。この数値が低い程、酵素の活性（すなわ
ち速度）が大である。ヨーロッパ特許出願第132,308号
明細書に報告された2,5−DKGに対するミハエリス定数は
15.5mMであり、かつ本発明の2,5−DKGレダクターゼに対
するミハエリス定数（コファクターとして100μＭのNAD
PHを用いる）は、0.1Mトリス−HCl（pH7.0）にて30℃で
2.0mMである。

次の手順は、本発明の遺伝学的に改変した生物を用い
るグルコースから２−KLG、すなわちビタミンＣ先駆体
への醗酵を示している。

形質転換されたエルウィニアを用いるグルコースから２
−KLGへの醗酵アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、メ
リーランド州、USAに寄託したATCCNo.31623並びに日本
国醗酵研究所（ヤタベ）に寄託したFERM-PNo.5449のエ
ルウィニア・シトレウスSHS2203は、通常、グルコース
を2,5−DKGに変換させる酵素を発現する。この菌株を、
上記したように本発明の2,5−DKGレダクターゼをコード
する遺伝子を含んだpCBR13によってS.N.コーヘン、A.C.
Y.チャングおよびL.シュー、プロシーディング・ナショ
ナル・アカデミー・サイエンス・USA、第69巻、第2110
頁（1972）に示された方法により形質転換させた。かく
して、ER817と命名したこの得られた菌株は、単一の醗
酵してグルコースを２−KLGに変換させるのに必要な全
ての酵素に関する遺伝子を含有する筈である。

菌株ER817を、アンピシリン（40μg/ml）を含有するＬ
−ブロス寒天のピレートに接種した。この菌株は、Ｌ−
ブロス＋15％グリセリン中で−70℃にて保存した保存培
養物から得たものである。このプレートを18℃にて24時
間培養した後、250mlの三角フラスコにおける種培地
（グリセリン,5g/l;コーンスチープリカー、27.5g/l;KH
₂PO₄、1g/l;pH6.8）10mlヘプレートから採取した菌株ER
817を650mmにて0.05の吸光値（A₆₅₀＝0.05）まで接種し
た。

得られた種培養物を回転振とうしながら18℃にて24時
間培養した。250ml三角フラスコにおける生産培地（コ
ーンスチープリカー、30g/l;KH₂PO₄、1g/l;NaCl1g/l;Ca
CO₃、29g/l;グルコース、10g/l:pH6.8）10mlに種培養物
をA₆₅₀＝0.2まで接種し、かつ回転振とうしながら28℃
にて65時間培養した。

次いで培養物を遠心分離し、かつ上澄液を高性能液体
クロマトグラフィー（HPLC）により２−KLGの存在につ
き分析した。上澄液の50μｌ試料を65℃のビオラドHPX-
87Hカラム（0.6ml/min）により0.18N H₂SO₄中で分析し
た。8.86minの滞留時間を有するピークは、２−KLGの存
在を示す。興味ある他の化合物の滞留時間は次の通りで
ある:2,5−DKG、8.46min:2−ケト−Ｄ−グルコン酸（２
−KLG）、9.20min;グルコン酸、10.0min;およびフコ−
ス12.1min。

上澄液の各試料は8.86minにピークを示し、これは1g/
lの濃度における２−KLGの存在を示す。8.86minにてピ
ークを生ずる化合物が２−KLGであることを確認するた
め、所定量の既知２−KLG（ナトリウム塩として）を上
澄液の試料に添加した。これは8.86minにおけるピーク
をのみを増大させ、したがって求める確認を示した。こ
れに対し、培養物の試料を接種してから18時間後に採取
した場合（65時間後でなく）、上澄液のHPLC分析は7g/l
の濃度の2,5−DKGを示したが、検出しうる２−KLGを示
さなかった。

さらに、２−KLG（２−KDGでない）が実際に65時間培
養物中に生産されていることを確認するため、所定量の
既知２−KDG（カルシウム塩として）を上澄液の試料へ1
g/lの濃度まで添加した。かくして、この処理した培養
物のHPLC分析は9.16minに新たなピークの存在を示した
が、8.86minにおける２−KLGのピークには変化を実質的
に示さなかった。

培養による２−KLGの生産を示すため、他の方法をも
用いた。醗酵により生産された全ての２−KLGをアスコ
ルビン酸（すなわち還元剤）まで変換させることによ
り、２−KLGを含有する醗酵培地の還元能力を測定しか
つアスコルビン酸まで変換する前の溶液中に存在する２
−KLGの量を計算することができる。醗酵混合物中にア
スコルビン酸以外の還元剤が存在するかどうか確認する
ため、醗酵混合物の第１試料を処理して２−KLGをアス
コルビン酸に変換させ、次いで試料の全還元能力を測定
した。第２の試料を作成し、これは２−KLGの変換後に
培地から全アスコルビン酸が除去されている。次いで、
２種の試料の還元活性を比較し、かつ活性におけるこの
差は試料中に存在するアスコルビン酸の量を示し、した
がって醗酵培地に存在する２−KLGの存在を示す。

醗酵培地の上澄液試料を処理して、存在する全ての２
−KLGをビタミンＣに変換させた。75μｌの8N HClを50
μの上澄液に添加し、かつ混合物を95℃にて30分培養し
た。

120μｌの5N NaOHを添加し、pHを1N酢酸ナトリウムに
より3.75に調整した。

混合物中のアスコルビン酸およびその他全ての還元剤
は、電子キャリヤPMS［５−メチルフェナジウムメチル
サルフェート］の存在下でテトラゾリウム塩MTT［３−
（4,5−ジメチルチアゾリル−２）−2,5−ジフェニルテ
トラゾリウムをホルマザンまで還元する。このような処
理を行なって、混合物中の全還元剤（ビタミンＣを含
む）を示した。

ビタミンＣの特異的決定を容易化させるため、MTTお
よびPMSで処理する前の醗酵混合物の試料をアスコルビ
ン酸オキシダーゼおよび酵素で処理して、存在する全て
のビタミンＣを破壊した。次いで、MTTおよびPMSでの処
理は存在するビタミンＣ以外の還元剤の量を示し、かつ
その差によりビタミンＣ（したがって２−KLG）の量を
決定した。このようにして、混合物中のビタミンＣの存
在、したがって上澄液中の２−KLGの存在が証明され
た。

既知濃度の２−KLGを含有する試料を用いて２−KLGを
ビタミンＣへ変換させる手順により、標準曲線を作成し
た。この曲線は、菌株ER817の65時間培養物から得られ
た上澄液が1g/lの２−KLGを含有することを示し、これ
はHPLC分析の結果と一致した。２−KLGは、pCBR13を欠
如するエルウィニア・シトレウスの他の菌株（菌株SHS2
003）の同様に作成されかつ処理された培養物の上澄液
には検出されなかった。

グルコースから２−KLGへの変換は、形質転換菌株ER8
17を用いて下記の醗酵手順によって行なった。接種は実
施例１におけると同様に行なったが、生産培地における
培養は65時間でなく30時間とし、かつ100mlの培地を用
いた。培養上澄液は1g/lの２−KLGを含有したが、0.1g/
l未満のグルコース、２−KDG、2,5−DKGもしくはグルコ
ン酸を含有した。

2,5−DKGのより良好な収率を得るための１つの方法
は、グルコースから２−KLGへの醗酵に際し生産される
中間体が２−KLG生産に無関係な生物学的反応で全く消
費されないよう確保することである。したがって、唯一
の炭素源として2,5−DKGもしくは２−KLGを使用しえな
いエルウィニア・シトレウス（SHS2003）の突然変異種
を、ミラーにより記載された方法［エキスペリメンツ・
イン・モレキュラ・ジェネティックス、コールド・スプ
リング・ハーバー（1974）］でニトロソグアニジン突然
変異にしたがって分離し、ただし菌体は30℃にてニトロ
ソグアニジンの存在下で培養した。突然変異の後、菌体
をグルコース（0.2％w/v）またはグリセリン（0.4％w/
v）を含有するM9培地にて30℃で18時間培養し、これに
ついてもミラーのエキスペリメンツ・イン・モレキュラ
・ジェネティックス、コールド・スプリング・ハーバー
（1974）に記載されている。培養物の試料をM9グルコー
スもしくはM9グリセリン培地のプレート上に展延し、次
いで2,5−DKG（0.5％w/v）または２−KLG（0.2％w/v）
を含有するM9培地のプレート上で複製させた。これら培
地のいずれでも増殖しえない突然変異種を再塗抹によっ
て精製し、かつ唯一の炭素源として各種の基質を使用す
る能力につき試験した。2,5−DKG、２−KDGまたは２−K
LGのいずれをも唯一の炭素源として使用しえない数種の
突然変異種が得られた。この種の一突然変異種をプラス
ミドpCBR13で形質転換させて菌株ER1037を形成させ、次
いでこれをグルコーズを２−KLGに変換させる能力につ
き試験した。

エルウィニア・シトレウスER1037の培養物はドイッチ
ェ・ザンムルンク・フォン・マイクロオルガニスメン・
カルチャー・コレクションに寄託した。さらに、この培
養物は1985年７月22日づけで寄託し、次ぎのように同定
された:DSMNo.3404。

菌株ER1037の培養物をＬ−ブロス中で18時間増殖さ
せ、かつこの培養物90ml2を１当りK₂HPO₄、4g;KH₂P
O₄、1g;NH₄Cl、1g;CaCl₂,0.01g;K₂SO₄、2.6g;カザミノ
酸、10g;酵母抽出物、1.5g;コーンスチープリカー、10
g;D−マニトール、20g;およびグルコース、10gからなる
培地500mlに接種した。１ファ−メンタ中でpH6.0にて
20時間増殖した後（0.7容器容積min^-1（v.v.m.）の通
気;800r.p.m.の撹拌）、増殖培地における２−KLGの濃
度は6.25g/lであった。

プラスミドpPLred332で形質転換させたエルウィニア
・シトレウスER1026を用いて、２−KLG収率の向上をさ
らに達成することができる。得られた菌株ER1116を上記
と同様に増殖させた。しかしながら、実施例に記載した
醗酵を20時間後に停止させる代りに、醗酵を10g/lのグ
ルコースを追加してさらに接種後12時間延長した。

さらに、２回にわたり10g/lのグルコースの追加を醗
酵の開始後36時間および60時間で行なった。醗酵ブロス
における２−KLGの最終レベルは19.83g/lであり、これ
は49.4％のグルコースからの変換を示している。

本発明の範囲または思想から逸脱することなく本発明
のおいて種々の改変を行なうことができ、さらにこの基
本構成を変化させて本発明の方法および構成を利用する
他の具体例を与えうることが当業者には了解されよう。
したがって、本発明の範囲は実施例として示した特定具
体例のみに限定されないことが了解されよう。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｒ 1:18） (72)発明者グリンドリー，ジューンアメリカ合衆国、カリフォルニア州 94501、アラミーダ、オークパークドライブ 138 (72)発明者ペイトン，マークエイスイス国、1226 ジュネーブ、アベニュートロンシェ 22ベー

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ビタミンＣの製造方法であって、（ａ）2,5−ジケト−Ｄ−グルコネートレダクターゼを
コードし、且つ、（ｉ）式：のDNA配列、及び（ii）１つ以上のコドンが（ｉ）に規定したDNA配列
によりコードされたと同じアミノ酸をコードするシノニ
ムコドンにより置換され、且つ、2,5−ジケト−Ｄ−グ
ルコネートレダクターゼをコードするDNA配列より成る
群から選択されるDNA配列であって、グルコースを含有
する培地中で２−ケト−Ｌ−グルコン酸が生成されるよ
うに分子中で発現制御配列に機能的に結合されているDN
A配列を特徴とする、少なくとも１つの組換DNA分子によ
り形質転換されたエルウィニア・シトレウスを、グリコ
ースを含有する培地中で発酵させる工程と、（ｂ）前記２−ケト−Ｌ−グルコン酸をビタミンＣへ
変換する工程とから成る、ビタミンＣの製造方法。