DK175120B1 - Rekombinant DNA-molekyle, transformant, 2,5-DKG-reduktase, fremgangsmåde til fremstilling af en 2,5-DKG-reduktase, fremgangsmåde til fremstilling af 2-KLG ud fra glucose samt fremgangsmåde til fremstilling af vitamin C - Google Patents

Description

i DK 175120 B1

Den foreliggende opfindelse angår DNA-sekvenser, rekombi-nant-DNA-molekyler, organismer, som indeholder sådanne sekvenser og molekyler, ekspressionen af visse enzymer ved hjælp af sådanne organismer samt fremstillingen ved fermentering af et 05 vitamin C-forstadium under anvendelse af sådanne organismer og - enzymer. Nærmere betegnet angår den foreliggende opfindelse et ekspressionsvehikel samt genetisk modificerede organismer, der er transformeret ved hjælp af dette vehikel, som ved ekspression frembringer enzymer, der anvendes til omdannelse af glu-10 cose eller en anden carbonkilde ved fermentering til 2-keto-L-gluconsyre (2-KLG), som er et kemisk forstadium for vitamin C (ascorbinsyre).

Der findes adskillige fremgangsmåder til fremstilling af vitamin C. En fremgangsmåde omfatter et antal kemiske synte-15 setrin og et fermentationstrin. Trinnene er i korthed hydrogenering af glucose til sorbitol, fermentering af sorbitol til sorbose under anvendelse af Acetobacter suboxydans, sorbose-acetonisering, diacetonesorbose-oxidering til 2-KLG, forestring af 2-KLG og omdannelse af esteren til ascorbinsyre. Denne 20 fremgangsmåde er kompleks og kræver en forholdsvis kraftig kapitalinvestering i et fabrikationsanlæg.

En anden fremgangsmåde omfatter to fermentationstrin. Fremgangsmåden begynder med fermentering af glucose til 2,5-diketo-D-gluconat (2,5-DKG) med Erwinia sp., fermentering af 25 2,5-DKG til 2-KLG med Corynebacterium sp., forestring af 2-KLG

og omdannelse af esteren til ascorbinsyre. En undersøgelse har vist, at D-gluconat og 2-keto-D-gluconat (2-KDG) fremstilles sekventielt af Erwinia sp. ud fra glucose før 2,5-DKG fremstilles ved det første fermentationstrin. Der henvises til T.

30 Sonoyama et al., "Production of 2-keto-L-gulonic acid from D-glucose by Two-Stage Fermentation", App. and Envir.

Microbiol., 43, 1064-69 (1982). Denne to-trins fermentationsproces er, skønt den kræver en i nogen grad lavere kapitalomkostning end Acetobacter-processen, stadig kompleks og kostbar 35 at anvende.

I europæisk patentansøgning nr. 132.308 omtales en yder- DK 175120 B1 2 ligere fremgangsmåde til omdannelse af glucose til 2-KLG. Denne ansøgning angår omdannelsen af glucose til 2-KLG ved en en-kelttrins-fermentationsproces. Den omtaler først Corynebacte-rium sp. ATCC 31090 som en kilde for en DNA-sekvens, der koder 05 for en særlig 2,5-DKG-reduktase (et enzym, der siges at katalysere fermentationen af 2,5-DKG til 2-KLG). Det anføres så, at denne DNA-sekvens med dens egen eller en syntetisk ribosombindingsplads indføjes på "nedstrømssiden" af en E. coli trp-eller tac-promotor eller pACYC184 CAT promotoren i en ekspres-10 sionsvektor. Det nævnes også, at vektoren indeholder et gen, som koder for tetracyclinresistens eller en anden markør, som kan vælges, samt en replikationsoprindelse stammende fra plas-mider ColEl, 15A eller RSF 1010. Det anføres, at en værtscelle Erwinia herbicola (ATCC 21998) så transformeres med vektoren.

Det siges, at denne transformerede celle ved fermentation frembringer 2-KLG fra glucose i ét trin. Omdannelsen af glucose til 2-KLG ved denne fremgangsmåde er imidlertid ikke fuldstændig tilfredsstillende, da udbyttet af 2-KLG er meget lavt og da fermentationstiden for at opnå selv dette lave udbytte 20 er for lang.

Følgelig er en enkelt organisme, som er i stand til at omdanne en carbonkilde såsom glucose til 2-KLG med acceptable hastigheder og ved et enkelt fermentationstrin, stadig et ikke opnået mål.

25 Den foreliggende opfindelse løser problemet med at finde en enkelt organisme, som er i stand til hurtigt og i højt udbytte at omdanne glucose eller en anden carbonkilde til 2-KLG.

I forbindelse med en udformning af den foreliggende opfindelse tilvejebringes et ekspressionsvehikel, som er i stand til at 30 transformere en vært, således at denne vært udfører alle de fermentationstrin, som er nødvendige for at omdanne glucose eller en anden carbonkilde til 2-KLG ved en enkelt fermentation med acceptable omdannelseshastigheder uden mellemproduktindvindings- eller mellemproduktoprensningstrin. Det fra ud-35 øvelsen af den foreliggende opfindelse resulterende 2-KLG kan så forestres og omdannes til ascorbinsyre (vitamin C), som ved DK 175120 B1 4 figur 4 afbilder DNA-sekvensen af 2,5-DKG-reduktasegenet ifølge opfindelsen og den tilsvarende aminosyresekvens af 2,5-DKG-reduktasen ifølge opfindelsen, og figur 5 afbilder opbygningen af plasmid pPLred332 fra 05 plasmider 210* og pcBR13. I figur 5 har symbolerne følgende j betydningers PL, PL-promotor; S-D, Shine-Dalgarno-sekvens; ori, replikationsoprindelse; Lac, lac-promotor; amp-r, ampi-cillinresistens-gen.

Opfindelsen beskrives i det følgende nærmere. I beskri-10 velsen anvendes følgende udtryk:

Nukleotid — En monomer enhed af DNA eller RNA bestående af en sukkerdel (pentose), et phosphat og en nitrogenholdig heterocyklisk base. Basen er bundet til sukkerdelen via glyco-sidcarbonet (l’-carbonet i pentosen), og denne kombination af 15 base og sukker kaldes et nukleotid. Basen karakteriserer nu-kleotidet. De fire DNA-baser er adenin ("A"), guanin (“G"), cytosin ("C") og thymin ("T"). De fire RNA-baser er A, G, C og uracil f'U"). Med hensyn til DNA angiver *'P" en af purinerne (A eller G), "Q" en af pyrimidinerne (C eller T) og "N" en af 20 de fire baser (A, G, C eller T). Med hensyn til RNA har "P", "Q" og "N" den ovenfor angivne betydning bortset fra, at "U" erstatter "T".

DNA-sekvens — En lineær række af deoxynukleotider, som er indbyrdes forbundet ved phosphodiesterbindinger mellem na-25 bopentosedelse 31 - og 5'-carbonatomer.

Kodon — En DNA-sekvens med tre nukleotider (en triplet), der via mRNA koder for en aminosyre, et translationsstartsignal eller et translationsslutsignal. Fx. koder nukleotidtri-pletterne TTA, TTG, CTT, CTC, CTA og CTG for aminosyren leucin 30 ("Leu"), TAG, TAA og TGA er translationsslutsignaler og ATG er et translationsstartsignal, som også koder for methionin.

Læseramme — Grupperingen af kodoner under translation af mRNA til aminosyresekvenser. Under translation skal den korrekte læseramme opretholdes. Fx. kan DNA-sekvensen 35 GCTGGTTGTAAG udtrykkes i tre læserammer eller -faser, der hver giver forskellige aminosyresekvenser; 5 DK 175120 B1 GCT GGT TGT AAG - Ala-Gly-Cys-Lys G CTG GTT GTA AG - Leu-Val-Val / GC TGG TTG TAA G - Trp-Leu-(STOP) /

Polypeptid — En lineær række af aminosyrer, som er bundet til hinanden ved hjælp af peptidbindinger imellem «-amino-og carboxygrupper på naboaminosyrer. Når "polypeptid" anvendes i det foreliggende, er det åbenbart for fagmanden, at denne 10 betegnelse også omfatter protein.

Genom — Hele DNA-mængden i en celle eller i et virus.

, Denne omfatter bl.a. DNA, som koder for cellens polypeptider samt operator-, promotor- og ribosom-bindings- og interak-tionssekvenser, herunder sekvenser såsom Shine-Dalgarno-se-15 kvenserne for hver af disse kodningssekvenser.

Gen — En DNA-sekvens, som via sit templat eller bud-bringer-RNA ("mRNA") koder for en aminosyresekvens, som er karakteristisk for et specifikt polypeptid.

Ekspression — Den processen, som et gen undergår til 20 dannelse af et polypeptid. Den omfatter transkription af DNA-sekvensen til en mRNA-sekvens og translation af mRNA-sekvensen til et polypeptid.

Plasmid — En non-kromosomal dobbeltstrenget DNA-sekvens, som omfatter et intakt "replikon", således at plasmidet repli-25 keres i en værtscelle. Når plasmidet anbringes i en éncellet organisme, kan egenskaberne af denne organisme ændres eller transformeres som et resultat af plasmidets DNA. Fx. transformerer et plasmid, som bærer et gen for tetracyclinresistens p (Tet ), en celle, som tidligere var følsom over for tetracy-30 clin, til en celle, som er resistent derfor. En med et plasmid transformeret celle kaldes en "transformant".

Fag eller bakteriofag — Et bakterielt virus. Mange fager består af DNA-sekvenser, der er indkapslet i proteinhylstre eller -overtræk ("capsider").

35 Kloningsvehikel — Et plasmid, en fag-DNA eller anden DNA-sekvens, som er i stand til at replikere i en værtscelle.

6 DK 175120 B1

Et kloningsvehikel er karakteriseret ved et eller et lille antal endonukleasegenkendelsespladser, hvor sådanne DNA-sekven-ser kan klippes på en determinerbar måde uden ledsagende tab af en essentiel biologisk funktion hos pågældende DNA, såsom 05 fx. replikation, produktion af overtræksproteiner eller tab af promotor- eller bindingspladser. Et kloningsvehikel indeholder sædvanligvis en markør, der er egnet til anvendelse ved identifikation af transformerede celler, fx. tetracyclinresistens eller ampicillinresistens. Et kloningsvehikel kaldes ofte en 10 vektor.

Kloning — Processen til opnåelse af en population af organismer eller DNA-sekvenser, som stammer fra én sådan organisme eller sekvens, ved aseksuel reproduktion.

Rekombinant-DNA-molekyle eller hybrid-DNA — Et molekyle, 15 der består af segmenter af DNA fra forskellige genomer, hvilke segmenter er forenede ende-til-ende uden for levende celler og som kan opretholdt i levende celler.

Ekspressionskontrolsekvens — En sekvens af nukleotider, som kontrollerer og regulerer ekspression af gener ved opera-20 tiv binding til disse gener. De omfatter lac-systemet, fl-lac-tamasesystemet, trp-systemet, tac-systemet, tre-systemet, hovedoperator- og -promotorområderne i fag λ, kontrolområdet for fd-overtræksprotein, de tidlige og sene promotorer i SV40, promotorer stammende fra polyomavirus og adenovirus, metallo-25 thioninpromotorer, promotoren for 3-phosphoglyceratkinase eller andre glycolytiske enzymer, promotoren for syrephosphata-se, fx. Pho5, promotorerne af gær- “-tilpasningsfaktorerne samt andre sekvenser, som vides at kontrollere ekspressionen af gener af prokaryotiske eller eukaryotiske celler, samt vira 30 derfor eller kombinationer deraf. Til mammalceller kan genet bindes til en eukaryotisk promotor såsom promotoren for det tidlige SV40-område, kobles til genet, der koder for dihydro-folatreduktase og selektivt forøges i ovarieceller fra kinesiske hamstre til fremstilling af en cellelinie, som indehold-35 er mange kopier af aktivt transkriberet eukaryotiske gener.

En udformning af den foreliggende opfindelse angår rekom- w m w m 7 binant-DNA-molekyler stammende fra Corynebacterium sp. SHS 752001# hvilke DNA-molekyler er karakteriseret ved en DNA-se-kvensr som koder for 2,5-DKG-reduktasen ifølge den foreliggende opfindelse. En anden udformning af den foreliggende opfin-05 delse angår en vært, fortrinsvis Erwinia citreus, der er transformeret med et sådant rekombinant-DNA-molekyle.

Rekombinant-DNA-molekylerne ifølge den foreliggende opfindelse er karakteriseret ved en DNA-sekvens, som koder for 2/5-DKG-reduktasen ifølge den foreliggende opfindelse, og en 10 ekspressionskontrolsekvens, som er operativt bundet til denne DNA-sekvens i rekombinant-DNA-molekylet. Et stort antal forskellige ekspressionskontrolsekvenser kan anvendes i rekombi-nant-DNA-molekylerne ifølge opfindelsen. Disse omfatter lac-systemet, fl-lactamasesystemet, trp-systemet, tac-systernet, 15 tre-systemet, hovedoperator- og promotorområderne i fag λ, kontrolområdet for fd-overtræksprotein, de tidlige og sene promotorer i SV40, promotorer stammende fra polyomavirus og adenovirus, metallothioninpromotorer, promotorerne for 3-phosphorglyceratkinase og andre glycolytiske enzymer, promoto-20 rerne for syrephosphatase, fx. Pho5, promotorerne for gær-«-tilpasningsfaktorerne, neomycinphosphortransferasepromotoren og andre sekvenser, som vides at kontrollere ekspressionen af gener af prokaryotiske eller eukaryotiske celler samt vira derfor eller kombinationer deraf. Til manunale celler kan genet 25 bindes til en eukaryotisk promotor såsom promotoren for det tidlige SV40-område, kobles til genet, der koder for dihydro-folatreduktase, og selektivt forøges i ovarieværtsceller af kinesiske hamstre til. fremstilling af en cellelinie, der indeholder mange kopier deraf. Den foretrukne ekspressionskontrol-30 sekvens ifølge opfindelsen er afledt af lac-sekvensen fra pUC8.

Desuden kan rekombinant-DNA-molekylerne ifølge den foreliggende opfindelse omfatte DNA-sekvenser fra forskellige plasmider og fager, der tillader replikation deraf i den valg-35 te vært. Fortrinsvis omfatter de også en udvælgelsesmarkør, fx. en DNA-sekvens, der koder for lægemiddelresistens. Sådanne DK 175120 B1 8 plasmid- og fagsekvenser kan fx. opnås fra segmenter af kromosomale, non-kromosomale og syntetiske DNA-sekvenser såsom forskellige kendte derivater af SV40 og kendte bakterielle plasmider, fx. plasmider fra E. coli, herunder col El, pCRl, 05 pBR322, pMB9 samt derivater deraf, plasmider fra et mere omfattende værtsgrundlag, fx. RP4, fag-DNA, fx. de talrige derivater af fag X, fx. NM989, samt andre DNA-fager, fx. M13 og trådformede enkeltstrengede DNA-fager og vektorer stammende fra kombinationer af plasmider og fag-DNA'er såsom plasmider, 10 der er modificeret til at anvende fag-DNA eller andre ekspressionskontrolsekvenser, eller gærplasmider såsom 2 μ plasmidet eller derivater deraf.

Det er åbenbart, at ikke alle vektorer og ekspressions-kontrolsekvenser vil fungere på samme måde til ekspression af 15 de modificerede DNA-sekvenser ifølge opfindelsen og til frembringelse af den hidtil ukendte 2,5-DKG-reduktase ifølge den foreliggende opfindelse. Ej heller vil alle værter fungere lige godt med det samme ekspressionssystem. Det er imidlertid muligt for fagmanden at foretage en udvælgelse blandt disse 20 vektorer, ekspressionskontrolsekvenser og værter uden unødvendige eksperimenter og uden at afvige fra opfindelsens ånd og rammer. Ved udvælgelse af en vektor skal fx. værten overvejes, da vektoren skal replikere deri. Vektorens kopiantal, evnen til at kontrollere dette kopiantal og ekspressionen af eventu-25 elle andre proteiner, som vektoren koder for, såsom antibiotiske markører, bør også overvejes.

Ved udøvelse af en ekspressionskontrolsekvens bør forskellige faktorer også overvejes. Disse omfatter fx. systemets relative styrke, muligheden for kontrol deraf samt forenelig-30 heden med den DNA-sekvens, som koder for 2,5-DKG-reduktasen ifølge den foreliggende opfindelse, især med hensyn til mulige sekundære strukturer.

DNA-sekvensen for 2,5-DKG-reduktasen ifølge opfindelsen kan anvendes til at fremstille denne reduktase i et stort an-35 tal forskellige værter, fx. bakterier såsom stammer af E. coli såsom E. coli C600, E. coli ED8767, E. coli DH1, E. coli DK 175120 B1 9 LE392, E. coli HB101, E. coli X1776, E. coli X2282, E. coli MRCI, og stammer af Pseudomonas, Bacillus og Streptomyces, gaerarter og andre svampe, animale værter såsom ovarieceller af kinesiske hamstre eller museceller, andre animale værter (her-05 under humane værter), planteceller i kultur eller andre værter. Efter ekspression kan enzymet så anvendes til at omdanne 2.5- DKG til 2-KLG.

Værter for den omhandlede 2,5-DKG-reduktases DNA-sekvens bør i almindelighed udvælges under hensyn til foreneligheden 10 deraf med den valgte vektor, den omhandlede 2,5-DKG-reduktases toxicitet over for værten, det ønskede proteins følsomhed over for proteolytisk nedbrydning med værtscelleenzymer, kontaminering eller binding af 2,5-DKG-reduktasen med værtscelleproteiner, som er vanskelige at fjerne under oprensning, ekspres-15 sionskarakteristika, værtens evne til at producere og udskille 2.5- DKG-reduktasen, værtens evne til at folde reduktasen korrekt, værtens fermentationskrav, den lethed, hvormed 2,5-DKG-reduktasen kan oprenses fra værten, sikkerhed og omkostninger.

Ved en udformning af opfindelsen udvælges Erwinia citreus 20 SHS 2003 som vært, da*den producerer 2,5-DKG fra glucose og da 2-KLG kan fremstilles direkte fra glucose med en transformeret Erwinia citreus SHS 2003.

De mest foretrukne værter ifølge den foreliggende opfindelse er Erwinia citreus SHS 2003 (Ferm-P nr. 5449, ATCC-nr.

25 31623) og en stamme, som er muteret fra Erwinia citreus SHS

2003, Erwinia citreus ER1026, som hverken er i stand til at anvendes 2,5-DKG eller 2-KLG som eneste carbonkilde.

Det følgende eksempel viser nogle udformninger af den foreliggende opfindelse, men har ikke til formål at begrænse op-30 findeisens rammer.

Eksempel

Identifikation af en polypeptidsekvens af 2,5-DKG-reduktasen 35 ifølge opfindelsen samt fremstilling af kloninqsvektorer

Corynebacterium sp. SHS752001 er blevet beskrevet i T.

DK 175120 B1 10

Sonoyama et al., "Production of 2-keto-L-gulonic acid from D-glucose by two-stage Fermentation", App. and Envir.

Microbiol., 43, 1064-69 (1982). Den omhandlede stamme af Cory-nebacterium udvalgtes således som donor for en DNA-sekvens, 05 der koder for en 2,5-DKG-reduktase. Til hjælp ved identificeringen af 2,5-DKG-reduktasegenet fra denne stamme af Coryne-bacterium isoleredes en prøve af et enzym og rensedes til 95% renhed under anvendelse af følgende fremgangsmåde: 10 A. Dyrkning af Corynebacterium SHS 752001 1. En frysetørret kultur af Corynebacterium sp. SHS 752001 rehydreredes umiddelbart efter åbning af et glas indeholdende den frysetørrede kultur ved at sætte 0,4 ml 0,9% NaCl (sterilieret ved 120°C i 20 minutter) til indholdet af glas- 15 set.

2. Kulturen overførtes til et reagensglas, der indeholdt 8 ml af en opløsning af 0,5% glucose, 0,5% gærekstrakt (Difco), 0,5% peptone (Difco), 0,1% KH2PO4, 0,02% MgSCtø, 7H2O og 2,0% agar. Opløsningens pH-værdi var 7,0 og opløsningen var 20 blevet steriliseret ved 120°C i 15 minutter. 40 timer efter tilsætning af kulturen ved 28°C suspenderedes kulturen med 0,4 ml 0,9% NaCl, der var blevet steriliseret ved 120°C i 20 minutter .

3. Fem 0,1 ml portioner af suspensionen fra trin 2 sat- 25 tes til fem agar/substrater, der indeholdt de samme bestandde-: le som opløsningen i trin 2. Kulturerne fermenteredes i samme ' tidsrum og under samme betingelser som under trin 2. Kulturerne suspenderedes med 0,5 ml 0,9% NaCl (steriliseret ved 120°C i 20 minutter) og til hver af 10 podekolber indeholdende 500 30 ml medium overførtes 2,5 ml af suspensionen.

4. En opløsning indeholdende 1% glucose, 0,5% gærekstrakt (Difco), 0,5% peptone (Difco), 0,1% NaNC>3, 0,1% KH2PO4 og 0,02% MgSC>4.7H20 og med pH-værdi på 7,0 steriliseredes ved 120°C i 15 minutter. 60 ml af denne opløsning sattes til en 35 500 ml kolbe, der indeholdt kulturen. Efter dyrkning i 16-18 timer ved 28°C overførtes dyrkningsindholdet af 10 sådanne 500 11 UK Ifdizu Bl ml kolber til en 30 1 fermentationsbeholder.

5. 20 1 af en opløsning med en pH-værdi på 7,2 og inde holdende 1,8% glucose, 2,7 majsstøbevæske, 0,31% NaNC>3, 0,06 KH2PO4, 4,4 ppm ZnS04.7H20, 0,72 ppm MnCl2-4H20, 0,2 ppm vita-05 min Βχ-ΗΟΙ, 0,15 ppm calciumpantotenat og 0,005% antiskummid-del (Adekanol) sattes til ovennævnte 30 1 fermentationsbeholder, som indeholdt kulturen. Fermentationsblandingen inkuberedes ved 28°C under omrøring ved 400 opm og under anvendelse af en luftstrømningshastighed på 0,5 beholdervolumener per minut.

10 Fermentationen standsedes, da glucosen forsvandt fra dyrkningsmediet (22 timer). Den endelige pH-værdi var 7,5 og slut-OD var 19,2.

B. Fremstilling af celleekstrakt 15 Ca. 750 g celler høstedes fra nævnte 30 ml fermentations beholder ved centrifugering under anvendelse af en "Sharples”-centrifuge (10.000 G, 10 minutter). Cellerne suspenderedes i 0,1 M tris-HCl-puffer (pH 7, 2,5 1), vaskedes tre gange med samme puffer (2,5 1 i hvert tilfælde) under anvendelse af en 20 centrifuge og suspenderedes til slut i 1,6 1 af pufferen (OD 150). Cellerne (i form af 80 ml cellesuspension) sønderdeltes ved hjælp af lydbehandling (160 W i 7 minutter). Obrudte celler og rester fjernedes ved centrifugering (15.000 G i 30 minutter) og supernatanten (1 1) forenedes.

25 C. Fraktionering ved hjælp af AmSOd Proteinmaterialet, som udfældede mellem 40% og 70% mætning, opsmaledes ved centrifugering og genopløstes i 80 ml 0,1 M tris-HCl-puffer ved pH 7. Opløsningen dialyseredes imod 0,02 30 M tri-HCl-puffer ved pH 7 natten voer.

D. Ionbytningskromatoqrafi

Den dialyserede opløsning (99 ml) anbragtes på en "DEAE-Sepharose CL-6B"-kolonne (1,6 x 30 cm), som forud var ækvili-35 breret med 0,02 M tris-HCl-puffer (pH 7). Kolonnen vaskedes trinvist med 0,02 M tris-HCl-puffer indeholdende 0 og 0,2 M

--- DK 175120 B1 12

NaCl (pH 7). Enzymet elueredes med samme puffer, som indeholdt 0,3 M NaCl (pH 7). De aktive fraktioner forenedes og proteinet koncnetreredes ved tilsætning af AmS04 op til 70% mætning. Udfældningen opsamledes og dialyseredes som under trin C.

05 E. Første affinitetskromatoqrafi

Den fra trin D opnåede dialyserede opløsning (37 ml) anbragtes på en "Amicon Matrix Red A"-kolonne (1,6 x 19 cm), som forud var ækvilibreret med 0,02 M tris-HCl-puffer (pH 7). Ko-10 lonnen vaskedes trinvist med 0,02 M tris-HCl-puffer (pH 7) indeholdende 0,3-0,5 M NaCl. Enzymet elueredes med samme puffer indeholdende 0,7-1,0 M NaCl. De aktive fraktioner (90 ml) forenedes.

15 F. Anden affinitetskromatoqrafi 0,02 M tris-HCl-puffer (pH 7), 225 ml) sattes til den forenede fraktion fra trin E og den resulterende opløsning anbragtes på en "Amicon Matrix Red A"-kolonne (1,9 x 12,3 cm), som var blevet ækvilibreret forud med 0,02 M trin-HCl-puffer 20 (pH 7). Kolonnen vaskedes med 0,02 M tris-HCl-puffer (pH 7) indeholdende 0,2 M NaCl. Enzymet elueredes med samme puffer indeholdende 0,5 mM NADPH. De aktive fraktioner (35 ml) for-enedés og koncentreredes ved ultrafiltrering (afskæringsgrænse ved molekylvægte under 10.000) til fjernelse af NADPH.

25 For at vise, at 2,5-DKG-reduktasen ifølge opfindelsen ikke var denatureret under lydbehandlingsprocessen og for at bekræfte, at 2,5-DKG-reduktasen ifølge opfindelsen omdanner 2,5-DKG til 2-KLG, fremstilledes en blanding af 0,1 M tris-HCl (pH 7) indeholdende 7 mg NADPH, 2 mg 2,5-DKG og 50 μΐ lydbe-30 handlet cellesuspension med en samlet proteinkoncentration på 2,5 mg/μΐ. Det samlede reaktionsvolumen var 200 μΐ. Reaktionsprodukterne analyseredes ved hjælp af HPLC og nærværelsen af 2-KLG bekræftedes.

Antistoffer imod 2,5-DKG-reduktasen ifølge opfindelsen 35 fremstilledes. Antistofferne udvikledes ved at injicere en kanin intradermalt et antal steder med 100 ug 2,5-DKG-rduktase 13 DK 175120 B1 ifølge opfindelsen i Freunds adjuvans og indgive en booster bestående af 50 pg af enzymet i Freunds ufuldstændige opløsning 21 dage senere. Serum blev udvundet 10 dage efter booster-injektionen og udviste positiv anti-(2,5-DKG-reduktase 05 ifølge opfindelsen)-aktivitet ved en enzymimmunoanalyse ("ELISA").

Det rensede enzym sekvensanalyseredes fra N-terminalenden under anvendelse af et højfølsomt gasfase-sekvensbestemmelses-apparat fremstillet af Applied Biosystems. Den ved denne frem-10 gangsmåde opnåede partielle sekvens vises i figur 1. Et spørgsmålstegn i figuren angiver, at den pågældende aminosyre ikke kunne bestemmes med absolut sikkerhed.

Det rensedes enzym spaltedes også under anvendelse af en standard cyanogenbromidspaltningsmetode. I figur 2 vises en 15 del af aminosyresekvensen af et 14.000 d fragment fremstillet ved denne metode.

For at udvælge en DNA-sekvens, som koder for denne 2,5-DKG-reduktase ifølge opfindelsen fra et bibliotek af kloner, fremstilledes en serie oligonukleotidprober (vist- i figur 3a-20 e) under anvendelse af phosphortriestermetoden. Disse prober afledtes af aminosyresekvenserne i figur 1 og 2.

P.g.a. den genetiske kodes degeneration var hver probe i virkeligheden en familie af strukturelt beslægtede molekyler. 14-mer DNA-proben i figur 3a (probe I i figur 1) besad fx. en 25 redundans på 96 med én C-T fejltilpasning over den indikerede sekvens, 14-mer DNA-proben i figur 3b (probe II i figur 1) besad en redundans på 32 med én G-T fejltilpasning, 17-raer DNA-proberne i figur 3c og 3d (probe III i figur 1) besad hver især en redundans på 32 og adskilte sig kun indbyrdes med hen-30 syn til de første to positioner, og 14-mer DNA-proben i figur 3e (probe IV i figur 2) besad en redundans på 32.

Til opbygning af biblioteker af Corynebacterium-DNA for at muliggøre screening med proberne i figur 3(a-e) med henblik på udvælgelse af 2,5-DKG-reduktasegenet ifølge opfindelsen ly-35 seredes Corynebacterium sp. SHS 752001 ved behandling af en cellesuspension af Corynebacterium sp. 752001 med lysozym (1 DK 175120 B1 14 mg/1) i 10 raM Tris-HCl (pH 8), 1 mM EDTA og 20% (vægt/volumen) saccharose efterfulgt af natriuradodecylsulfat (SDS) (5 mg/ml).

DNA fra de lyserede Corynebacterium sp. SHS 752001 celler fragmenteredes så under anvendelse af restriktionsendonuklease 05 Sau3a i en puffer bestående af 150 raM NaCl, 6 mM Tris-HCl (pH /,9), 6 mM MgCl2 og 100 yg/ml kvægserumalbumin. DNA-fragmenterne indføjedes så i pUC8-vektorer ved en BamHl-plads under anvendelse af den af J. Viera og J.R. Messing, Gene, 19, 259 (1982) beskrevne metode, og rekombinantplasmiderne transforme-10 redes i Escherichia coli JM83, W3110i^ og WSllOi^ recA. Metoderne til transformation af rekombinantplasmiderne i E. coli JM83 fremgår af J.R. Messing, R. Corea, P.H. Seeburg, Nucleic Acids Res., 9, 309 (1981). Tilsvarende metoder anvendtes ved andre værtsstammer.

15 Kolonier af det resulterende bibliotek screenedes med proberne i figur 3(a-e) under anvendelse af den i R.B.

Wallace, M.J. Johnson, T. Hirose, T. Miyake, E.H. Kawashima og K. Itakura, Nucleic Acids Res., 9, 879-94 (1981) anførte metode. Proberne hybridiseredes ved 37°C og vaskedes også ved 37°C 20 ved en standardudvaskning omfattende 6 x SSC, 5 x Denhardt's puffer, 0,1% SDS og 50 yg/ml t-RNA. Blandt 17 kolonier, som viste sig positive (hybridiserede) med proben i figur 3e, viste to sig også positive med proberne i figur 3c eller 3d eller begge. De to rekombinant-plasmider blandt- disse kloner be-25 tegnedes pCBRIO og pCBR13. Den fremmede DNA i hver af disse to rekombinantplasmider havde en længde på 3,0 kb.

Egenskaber af ekspressionsvektorer og transformanter ifølge opfindelsen 30 For at bestemme egenskaberne af rekombinantplasmiderne, herunder fremstillingshastigheder for den omhandlede 2,5-DKG-reduktase ved hjælp af transformerede værter, transformeredes de to rekombinantplasmider og pUC8, som er en vektor, der indeholder DNA, som koder for 2,5-DKG-reduktase ifølge opfindel-35 sen, i E. coli W3110i^ recA og Erwinia punctata ved hjælp af den i S.N. Cohen, A.C.Y. Chang og L. Hsu, Proc. Natl. Acad.

15

Sci. USA, 69/ 2110 (1972) beskrevne fremgangsmåde. Vektor pUC8, som er beslægtet med pBR322, besidder en stærk lac-pro-motor/ som er lokaliseret en smule ovenstrøms for en BamHl-plads.

05 Der undersøgtes adskillige fremgangsmåder til frigørelse af 2,5-DKG-reduktasen ifølge opfindelsen fra de transformerede celler, der fremstillede denne, således at produktionshastighederne kunne måles. Til E. coli og Erwinia viste lydbehandling sig at være bedst.

10 Ekstrakter af E. punctata og E. coli, som indeholdt pCBRIO og pCBR13, analyseredes ved hjælp af natriumdodecylsul-fat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) (U.K. Laemmli, Nature, 227, 680-85 (1970)) og ved hjælp af Western blot-metoden (P.S. Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 5201-05 15 (1980)) under anvendelse af det ovenfor fremstillede anti- (2,5-DKG-reduktase ifølge opfindelsen)-antistof til bestemmelse af den mængde af omhandlede 2,5-DKG-reduktase, som fremstilledes af transformanterne. Ekstrakter af E. coli W3110i^ recA (pCBR13), der var behandlet med lac-induktoren isopropyl-20 fl-D-thiogalactopyranosid (IPTG), indeholdt ca. 5 gange mere enzym end ekstrakterne fra uinducerede celler med et plasmid-bærende gen.

i

Bekræftelse af, at 2,5-DKG-reduktasen ifølge opfindelsen ikke 25 ændredes under rekombination

Den af E. punctata og E. coli efter transformation med pCBRIO og pCBR13 fremstillede 2,5-DKG-reduktase undersøgtes for at konstatere, om det var det samme enzym, som isoleredes fra Corynebacterium sp. SHS 752001.

30 Molekylvægten af de ved Western blot overførelse af eks trakter af Erwinia (pCBR13), af E. coli WSllOi^ recA (pCBR13) og af Corynebacterium mærkede protein var den samme som molekylvægten af den rensede 2,5-DKG-reduktase ifølge opfindelsen (dvs. ca 29.000 d). Baseret på en sammenligning af blot-over-35 førelsen fra de forskellige celler blev det anslået, at 1-2% af det samlede celleprotein i Erwinia (pCBR13) var 2,5-DKG-re-

I DK 175120 B1 I

I 16 I

I duktasen ifølge opfindelsen. I

I Der har været foretaget yderligere opbygninger under an- I

I vendelse af XPL~promotoren, som er en stærk promotor, der I

I kan kontrolleres ved hjælp af Xcl-repressorproteinet. Eks- I

I 05 pression af λΡχ,-promotoren kan i en stamme, som også bærer I

I den temperaturfølsomme XcIe57-repressor kontrolleres ved at I

I ændre temperaturen fra 30°C til 42°C. Forøgede udbytter af 2- I

I KLG fra rekombinantstammer opnåedes under anvendelse af dette I

I promotorsystem. I

I 10 Figur 5 viser den fysiske kortlægning af den vektor, der I

I anvendes til fremstilling af plasmiderne, som ved ekspression I

I frembringer 2,5-DKG-reduktasen under kontrol af XPL-promoto- I

I ren. Plasmid pPLred332 fremstilledes ved at indføje fragmen- I

I tet, som koder for 2,5-DKG-reduktase, fra plasmid pCBR13 i I

I 15 plasmid p210*. Det indføjede fragment blev frembragt ved ned- I

I brydning af pCBR13 med restriktionsendonuklease BcoRI og I

I Hindlll, idet de to fragmenter separeredes ved elektroforese I

I igennem lavt-smeltende agarose. Vektoren blev også nedbrudt I

I med EcoRI og Hindlll (se figur 5), således at vedkommende I

I 20 fragmenter kunne indføjes ved ligering. Det resulterende plas- I

I mid pPLred332 transformeredes i stamme W3110 cits til dannelse I

I af stamme EC1083. Denne stamme bærer en kromosomal indføjelse I

I i form af det temperaturfølsomme Xclgsy-repressorgen. Plas- I mid pPLred332, der omfatter det fra 210* afledte vektorele- I 25 ment, og indføjelsen fra pCBR13 som vist i figur 5, specifice- rer 2,5-DKG-reduktase, som har den samme molekylvægt i både E.

I coli og i Erwinia citreus som den af pCBR13 specificerede.

I Erwinia citreus ER1026 transformeredes med pPLred332 til I dannelse af stamme ER1116.

I 30 For at bekræfte aminosyresekvensen af og DNA-sekvensen I for 2,5-DKG-reduktasen ifølge opfindelsen sekvensanalyseredes I 3 kb indføjelsen i pCBR13 ved hjælp af Maxam og Gilbert meto- I den (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 560 (1977) og A.M. Maxam I og W. Gilbert, Meth. Enzym., 65, 499-560 (1980)) og ved hjælp I 35 af Sanger-sekvensanalyse under anvendelse af plasmid M13 (F.

I Sanger, S. Nickelen og A.R. Coulsen, Proc. Natl. Acad. Sci.

DK 175120 B1 17 USA., 74, 5463-67 (1977)). Sekvensundersøgelsen af 3/0 kb indføjelsen afslørede en sekvens, der næsten nøjagtigt kodede for de første 60 aminosyrer, som var bestemt for selve enzymet (som vist i figur 1). 3,0 kb indføjelsen indeholdt også en °5 sekvens, som næsten nøjagtigt kodede for aminosyresekvensen i figur 2. Reduktasegenets afslutning i 3,0 kb indføjelsen var angivet af en stopkodon. På denne måde bestemtes reduktasege-net til at besidde en nukleotidlængde på 831 (under udeladelse af stopkodonen og medtagelse af ATG, START-kodonen), og dens sekvens fremgår af figur 4.

DNA-sekvensen, som koder for aminosyresekvensen af 2,5-DKG-reduktasen ifølge opfindelsen, kan sammenlignes med DNA-sekvensen, som koder for, og aminosyresekvensen af polypepti-det ifølge europæisk patentansøgning nr. 132.308. Figur 4 vi-ser både DNA-sekvensen for aminosyresekvensen af 2,5-DKG-re-duktasen ifølge den foreliggende opfindelse. Figur 4 i europæisk patentansøgning nr. 132.308 viser den påståede DNA-sekvens for og aminosyresekvens af dette polypeptid. En sammenligning . af de to figurer viser klart, at 2,5-DKG-reduktasen ifølge op-20 findelsen og DNA-sekvensen herfor tydeligt adskiller sig fra den i europæisk patentansøgning nr. 132.308 omhandlede aminosyresekvens og DNA-sekvens herfor.

Michaelis-konstanten (Km) for et enzym måler dette enzyms kinetik. Jo lavere værdien af konstanten er, jo højere er en-25 zymets aktivitet eller hastighed. Michaelis-konstanten for den i europæisk patentansøgning nr. 132.308 omhandlede 2,5-DKG er 15,5 mM og Michaelis-konstanten for 2,5-DKG-reduktasen ifølge den foreliggende opfindelse (under anvendelse af 100 μΜ NADPH som cofaktor) i 0,1 M Tris-HCl, pH 7,0 ved 30°C, er 2,0 mM.

Følgende fremgangsmåder belyser fermentationen af glucose til 2-KLG, som er et vitamin C-forstadium, under anvendelse af en genetisk modificeret organisme ifølge opfindelsen.

Fermentation af glucose til 2-KLG under anvendelse af trans-^5 formeret Erwinia

Erwinia citreus SHS 2003, der er deponeret hos American DK 175120 B1 18

Type Culture Collection, Maryland, USA, under ATCC-nr. 31623, og hos Fermentation Research Institute, Yatabe, Japan, under FERM-P-nr. 5449, frembringer ved ekspression normalt enzymer til omdannelse af glucose til 2,5-DKG. Denne stamme transfor-05 meredes med pCBR13, der som beskrevet ovenfor indeholder et gen, der koder for 2,5-DKG-reduktasen ifølge den foreliggende opfindelse/ under anvendelse af den i S.N. Cohen, A.C.Y. Chang og L. Hsu, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972) anførte fremgangsmåde. Den resulterende stamme, der er benævnt ER817, 10 skulle således indeholde generne for alle de til omdannelse af glucose til 2-KLG ved en enkelt fermentation nødvendige enzymer .

Stamme ER817 inokuleredes på en plade af L-næringsmedium-agar, som indeholdt ampicillin (40 μ/ml). Stammen var udtaget 15 fra en forrådskultur, som opbevaredes i L-næringsmedium plus 15% glycerol ved -70°C. Efter at pladen havde været underkastet inkubering i 24 timer ved 18°C inokuleredes 10 ml af et podningsmedium (glycerol, 5 g/1, majsstøbevæske, 27,5 g/1, KH2PO4, 1 g/1, pH 6,8) i en 250 ml konisk kolbe til en absor-20 bans ved 650 mm på 0,05 (Agso = 0,05) med stamme ER817 udtaget fra pladen.

Den resulterende podekultur inkuberedes i 24 timer ved 18°C under rotationsomrystning. 10 ml af et produktionsmedium (majsstøbevæske, 30 g/1, KH2PO4, 1 g/1, NaCl, 1 g/1, CaCC>3, 29 25 g/1, glucose, 10 g/1, pH 6,8) inokuleredes i en 250 ml konisk kolbe til A550 = 0,2 med podekulturen og inkuberedes under rotationsomrystning ved 28°C i 65 timer.

Kulturen centrifugeredes så og supernatenten analyseredes for nærværelse af 2-KLG ved højeffektiv væskekromatografi 30 (HPLC). 50 μΐ prøver af supernatanten analyseredes under an vendelse af en "Biorad HPX-87H"-kolonne ved 65°C i 0,18 N H2SO4 (0,6 ml/minut). En top med en retentionstid på 8,86 minut angiver nærværelsen af 2-KLG. Retentionstiderne for de andre forbindelser af interesse er som følger: 2,5-DKG, 8,46 35 minut; 2-keto-D-gluconsyre (2-KDG), 9,20 minut; gluconsyre, 10,0 minut; og fucose, 12,1 minut.

I/I\ If VI u i 19

Oe forskellige supernatantprøver udviste en top ved 8,86 minut og angav, at 2-KLG var til stede i en koncentration på 1 g/1. Til bekræftelse af, at forbindelsen, som gav en top ved 8,86 minut, var 2-KLG, tilsattes en mængde veldefineret 2-KLG 05 (som natriumsaltet) til en supernatantprøve. Dette forøgede kun toppen ved 8,86 minut og gav således den ønskede bekræftelse. Når en prøve af kulturen blev udtaget kun 18 timer efter inokulering (fremfor efter 65 timer), udviste HPLC-analyse af supernatanten i modsætning hertil et indhold af 2,5-DKG i 10 en koncentration på 7 g/1, men ingen påviselig 2-KLG.

For yderligere at bekræfte, at 2-KLG (og ikke 2-KDG) faktisk fremstilledes i 65-timer kulturen, sattes en mængde veldefineret 2-KDG (som calciumsaltet) til en prøve af supernatanten til opnåelse af en koncentration på 1 g/1. HPLC-analyse 15 af denne berigede kultur udviste så tilstedeværelse af en ny top ved 9,16 minut, men i alt væsentligt ingen forandring med hensyn til 2-KLG-toppen ved 8,86 minut.

Fremstillingen af 2-KLG med kulturen påvistes også ved hjælp af en anden metode. Ved at omdanne den ved fermentatio-20 nen eventuelt dannede 2-KLG til ascorbinsyre, som er et reduktionsmiddel, kan reduktionsevnen af et fermentationsmedium, som indeholder 2-KLG, måles, og mængden af 2-KLG, som er til stede i opløsningen før omdannelsen deraf til ascorbinsyre, kan beregnes. For at kompensere for nærværelsen af andre re-25 duktionsmidler end ascorbinsyre i fermentationsblandingen, behandles en første prøve af en fermentationsblanding til omdannelse af 2-KLG til ascorbinsyre og derpå bestemmes prøvens samlede reduktionsevne. En anden prøve, hvor efter omdannelse af 2-KLG al ascorbinsyren elimineres fra mediet, fremstilles.

30 Reduktionsevnen af de to prøver sammenlignes så og forskellen i aktivitet skulle indikere mængden af tilstedeværende ascorbinsyre i prøverne og således den i fermentationsmediet tilstedeværende mængde 2-KLG.

En supernatantprøve af et ferroentationsmedium behandledes 35 til omdannelse af al tilstedeværende 2-KLG til vitamin C. 75 yl 8N HC1 sattes til 50 yl af supernatanten og blandingen in- DK 175120 B1 20 kuberedes i 30 minutter ved 95°C. 120 μΐ 5N NaOH tilsattes og pH-værdien indstilledes til 3,75 under anvendelse af IN natriumacetat.

Ascorbinsyre og eventuelt andre reduktionsmidler i bland-ingen vil reducere tetrazoliumsaltet MTT [3-(4,5-dimethylthia-zolyl-2)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid] i nærværelse af elektronbæreren PMS [5-methylphenaziummethylsulfat] til en forma-zan. Denne behandling udførtes og en angivelse af den samlede mængde reduktionsmidler (herunder vitamin C) i blandingen op-10 nåedes.

For at lette den specifikke bestemmelse af vitamin C, behandledes en prøve af fermentationsblandingen før behandling med MTT og PMS med ascorbinsyreoxidase og oxygen til ødelæggelse af alt tilstedeværende vitamin C. Efterfølgende behand-15 ling med MTT og PMS angav så mængden af andre tilstedeværende reduktionsmidler end vitamin C og mængden af vitamin C (og således 2-KLG) bestemtes som differencen. På denne måde påvistes nærværelsen af vitamin C i blandingen og derfor nærværelsen af 2-KLG i supernatanten.

20 Fremgangsmåden til omdannelse af 2-KLG til vitamin C und er anvendelse af prøver indeholdende kendte koncentrationer af 2-KLG tillod fremstilling af en standardkurve. Kurven viste, at supernatanten, der opnåedes fra 65-timer kulturen af stamme ER817, indeholdt 1 g/1 2-KLG, hvilket bekræftede HPLC-analyse-25 resultaterne. 2-KLG påvistes ikke i supernatanten fra en tilsvarende fremstillet og behandlet kultur af en anden stamme af Erwinia citreus, som mangler pCBR13 (stamme SHS2002).

Omdannelse af glucose til 2-KLG udførtes ved følgende fermentationsmetode under anvendelse af en transformeret ER817 30 stamme. Inokuleringen udførtes som i eksempel 1, men inkube-ringen i produktionsmediet udførtes i 30 timer i stedet for i 65 timer og 100 ml kultur anvendtes. Kultursupernatanten indeholdt 1 g/1 2-KLG, men mindre end 0,1 g/1 glucose, 2-KDG, 2,5-DKG eller gluconsyre.

35 En måde at opnå bedre udbytter af 2-KLG er at sikre, at ingen af de ved fermentationen af glucose til 2-KLG dannede 21 DK 175120 B1 mellemprodukter forbruges ved biologiske reaktioner, som er 2-KLG-produktionen uvedkommende. Af denne årsag isoleredes en mutant af Ervinia citreus (SHS2003), som var ude af stand til at anvende 2,5-DKG eller 2-KLG som eneste carbonkilde, efter 05 nitrosoguanidinmutagenfremkaldelse ved den af Miller, Experiments in Molecular Genetics (Cold Spring Harbor, 1974), beskrevne metode, bortset fra, at cellerne inkuberedes i nærværelse af nitrosoguanidin ved 30°C. Efter mutagenfremkaldelse inkuberedes cellerne i 18 timer ved 30°C i M9-medium, som in-10 deholdt glucose (0,2% vægt/volumen) eller glycerol (0,4% vægt/volumen) som beskrevet i Miller, Experiments in Molecular Genetics (Cold Spring Harbor, 1974). Prøver af kulturen udspredtes på plader af M9-glucose- eller M9-glycerol-medium og replikeredes så på plader af M9-medium indeholdende 2,5-DKG 15 (0,5% vægt/volumen) eller 2-KLG (0,2% vægt/volumen). Mutanter, som var ude af stand til at vokse på begge disse medier, rensedes ved stregkulturgenfremstilling og afprøvedes med hensyn til evnen deraf til anvendelse af forskellige substrater som eneste carbonkilde. Adskillige mutanter opnåedes, som ikke 20 kunne anvende hverken 2,5-DKG, 2-KDG eller 2-KLG som eneste carbonkilde. En sådan mutant transformeredes med plasmid pCBR13 til dannelse af stamme ER1037, som derpå afprøvedes med hensyn til evnen deraf til omdannelse af glucose til 2-KLG.

En kultur af Erwinia citreus ER1037 deponeredes ved 25 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen. Kulturen deponeredes d.

22. Juli 1985 og tildeltes nummeret DSM nr. 3404.

En kultur af stamme ER1037 dyrkedes i 18 timer i L-næ-ringsmedium og 90 ml af denne kultur inokuleredes i 500 ml af et medium, som indeholdt (per liter) K2HPO4, 4 g, KH2PO4, 1 g, 30 NH4CI, 1 g, CaCl2, 0,01 g, K2SO4, 2,6 g, casaminosyrer, 10 g, gærekstrakt, 1,5 g, majsstøbevæske, 10 g, D-raannitol, 20 g og glucose, 10 g. Efter dyrkning i 20 timer ved pH 6,0 i et 1 liters fermentationsapparat (luftning med 0,7 beholdervolumener per minut-1 (v.v.m), omrøring med en hastighed på 800 opm) var 35 koncentrationen af 2-KLG i dyrkningsmediet 6,25 g/1.

Ved anvendelse af Erwinia citreus ER1026 transformeret 22 DK 175120 B1 med plasmidet pPLred332 kan yderligere forbedring af udbyttet af 2-KLG opnås. Den resulterende stamme ER1116 dyrkes som beskrevet ovenfor. I stedet for afslutning af fermentationen efter 20 timer som beskrevet i eksemplet forlængedes imidler-05 tid fermentationen ved tilsætning af yderligere 10 g/1 af glucose med 12 timer efter inokulering.

To yderligere tilsætninger af 10 g/1 af glucose kan også foretages 36 timer og 60 timer efter fermentationsstarten. En slutkoncentration af 2-KLG i fermentationsmediet var 19,83 10 g/1, hvilket udgør en omdannelse frå glucose på 49,4%.

Det vil være tydeligt for fagmanden, at opfindelsen kan modificeres på forskellig måde uden at afvige fra dennes ånd eller rammer, og den grundlæggende opbygning kan ændres for at . tilvejebringe andre udformninger, der udnytter fremgangsmåder-15 ne og præparaterne ifølge den foreliggende opfindelse. Det er derfor åbenbart, at omfanget af den foreliggende opfindelse er afgrænset af kravene frem for de særlige udformninger, der er eksemplificeret.

20 25 i 1 35

Claims (15)

1. Rekombinant-DNA-molekyle, KENDETEGNET ved en DNA-sekvens , som koder for en 2,5-DKG-reduktase og som er udvalgt fra gruppen bestående af: 05 (a) en DNA-sekvens med formlen: ATGCCGAACATCCCCACCATCAGCCTCAACGACGGACGCCCCTTCGCCGAG cctgggctcggcacgtacaacctgcgcggcgacgagggggtcgcggccatg gtcgccgcgatcgactcgggctaccgcctgctcgacacggcggtgaactac gagaacgagagcgaggtcggccgagcggtgcgcgcgagcagcgtcgatcgc 1 10 gacgagctcatcgtggcgagcaagatcccgggccgccagcacgggcgcgcc gaggcggtcgacagcatccgcggatcgctcgaccggctggggctcgacgtg atcgacctgcagctgatccactggccgaaccccagcgtgggccggtggctc gacacctggcgcggcatgatcgacgcgcgcgaggcgggcctggtccgctcg

1 ATCGGCGTCTCGAACTTCACCGAGCCGATGCTGAAGACCCTCATCGACGAG ACCGGGGTCACACCCGCGGTCAACCAGGTCGAGCTCCACCCGTACTTCCCC i CAGGCGGCGCTGCGCGCGTTCCACGACGAGCACGGCATCCGCACCGAGAGC TGGAGCCCGCTCGCCCGGCGCAGCGAGCTGCTCACCGAGCAGCTGCTGCAG GACCTGGCGGTCGTCTACGGAGTGACGCCGACCCAGGTGGTGCTGCGGTGG 1

2. CACGTGCAGCTCGGCAGCACCCCGATCCCCAAGTCCGCCGACCCCGATCGC CAGCGCGAGAACGCCGATGTGTTCGGCTTCGCCCTCACCGCCGACCAGGTC I GATGCGATCTCGGGCCTCGAGCGCGGGCGGCTCTGGGACGGCGACCCCGAC ACGCACGAAGAGATG;. 1 og (b) DNA-sekvenser, der som et resultat af den genetiske 25 kode er degenereret til den under (a) definerede DNA-sekvens, og som koder for en 2,5-DKG-reduktase.

2. Rekombinant-DNA-molekyle ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, at DNA-sekvensen er operativt bundet til en ekspressionskontrolsekvens i molekylet.

3. Rekombinant-DNA-molekyle ifølge krav 2, KENDETEGNET ved, at ekspressionskontrolsekvensen er udvalgt fra gruppen bestående af lac-systemet, β-lactamasesystemet, trp-systemet, tac-systemet, tre-systemet, hovedoperator- og -promotorområderne i fag λ, kontrolområdet for fd-overtræksprotein, de 35 tidlige og sene promotorer i SV40, promotorer stammende fra polyomavirus og adenovirus, metallothioninpromotorer, promoto- DK 175120 B1 ren for 3-phosphogIyceratkinase eller andre glycolytiske enzymer, promotorerne for syrephosphatase, fx. Pho5, promotorerne for gær-«-tilpasningsfaktorer, promotorer for manunale celler såsom de tidlige og sene SV-40-promotorer, sene adenoviruspro-05 motorer og andre sekvenser, som kontrollerer ekspressionen af gener af prokaryotiske eller eukaryotiske celler og vira derfor samt kombinationer deraf.

4. Transformant, KENDETEGNET ved, at den omfatter en vært, som er transformeret med mindst et rekombinant-DNA-mole- 10 kyle ifølge krav 2 eller 3.

5. Transformant ifølge krav 4, KENDETEGNET ved, at værten er udvalgt fra gruppen bestående af slægten Erwinia og andre celler eller organismer, som fremstiller 2,5-diketo-D-glucon-syre.

6. Transformant ifølge krav 4, KENDETEGNET ved, at værten er Erwinia citreus. 7. 2,5-DKG-reduktase, KENDETEGNET ved, at den er udvalgt fra gruppen bestående af: (a) en 2,5-DKG-reduktase med aminosyresekvensen: 20 ProAsnlleProThrlleSerLeuAsnAspGlyArgProPheAlaGluPro GlyLeuGlyThrTyrAsnLeuArgGlyAspGluGlyValAlaAlaMetVal AlaAlalleAspSerGlyTyrArgLeuLeuAspThrAlaValAsnTyrGlu AsnGluSerGluValGlyArgAlaValArgAlaSerSerValAspArgAsp GluLeuIleValAlaSerLysIleProGlyArgGlnHisGlyArgAlaGlu 25 AlaValAspSerI1eArgGlySerLeuAspArgLeuGlyLeuAspValIle AspLeuGlnLeuIleHisTrpProAsnProSerValGlyArgTrpLeuAsp ThrTrpArgGlyMetlleAspAlaArgGluAlaGlyLeuValArgSerIle GlyValSerAsnPheThrGluProMetLeuLysThrLeuIleAspGluThr /

30 GlyValThxProAlaValAsnGlnValGluLeuHisProTyrPheProGln \ AlaAlaLeuArgAlaPheHisAspGluHisGlylleArgThrGluSerTrp SerProLeuAlaArgArgSerGluLeuLeuThrGluGlnLeuLeuGlnGlu LeuAlaValValTyrGlyValThrProThrGlnValValLeuArgTrpHis Val GlnLeuGlyS erThrP ro I lePr o Ly s S er Al aAspPro AspAr gGl n·'

3. ArgGluAsnAlaAspValPheGlyPheAlaLeuThrAlaAspGlnValAsp AlaI1eSerGlyLeuGluArgGlyArgLeuTrpAspGlyAspProAspThr HisGluGluMet; 1 og ur, bl (b) 2,5-DKG-reduktase med den under (a) angivne aminosy-resekvens og yderligere omfatter methionin i aminoenden deraf. 8. 2,5-DKG-reduktase, KENDETEGNET ved, at den er fremstillet af værten ifølge krav 4. Q5 9. Fremgangsmåde til fremstilling af en 2,5-DKG-redukta- se, KENDETEGNET ved, at man dyrker en vært, der er transformeret med et rekombinant-DNA-molekyle ifølge krav 1 eller 2.

10. Fremgangsmåde ifølge krav 9, KENDETEGNET ved, at man yderligere isolerer 2,5-DKG-reduktasen.

11. Fremgangsmåde til fremstilling af 2-KLG ud fra glucose, KENDETEGNET ved, at man fermenterer transformanten ifølge krav 6 i et medium indeholdende glucose.

12. Fremgangsmåde til fremstilling af vitamin C, KENDETEGNET ved, at man 15 (a) fermenterer transformanten ifølge krav 6 i et medi um, der indeholder glucose, til fremstilling af 2-KLG, og (b) omdanner 2-KLG til vitamin C.

13. Transformant ifølge krav 6, KENDETEGNET ved, at værten er udvalgt fra gruppen bestående af Erwinia citreus

20 SHS2003 og Erwinia citreus ER1026. 25 1 35