JPH08169899A - 安定な亜鉛インスリン類似化合物結晶の製造 - Google Patents
安定な亜鉛インスリン類似化合物結晶の製造Info
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- JPH08169899A JPH08169899A JP7147320A JP14732095A JPH08169899A JP H08169899 A JPH08169899 A JP H08169899A JP 7147320 A JP7147320 A JP 7147320A JP 14732095 A JP14732095 A JP 14732095A JP H08169899 A JPH08169899 A JP H08169899A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 糖尿病の処置に有用な結晶性ＬysB28ＰroB29
−ヒトインスリンの製造方法を提供する。 【構成】 ＬysB28ＰroB29−ヒトインスリン、亜鉛、酢
酸、クエン酸、またはグリシンよりなる群から選択され
る少なくとも０.３Ｎの有機酸、およびフェノール系化
合物を含む溶液から、pＨ 約５.５〜約６.５でＬysB28
ＰroB29−ヒトインスリンを結晶化することより、該結
晶性ＬysB28ＰroB29−ヒトインスリンを製造することが
できる。
−ヒトインスリンの製造方法を提供する。 【構成】 ＬysB28ＰroB29−ヒトインスリン、亜鉛、酢
酸、クエン酸、またはグリシンよりなる群から選択され
る少なくとも０.３Ｎの有機酸、およびフェノール系化
合物を含む溶液から、pＨ 約５.５〜約６.５でＬysB28
ＰroB29−ヒトインスリンを結晶化することより、該結
晶性ＬysB28ＰroB29−ヒトインスリンを製造することが
できる。
Description
【０００１】本発明は、ヒトインスリンのモノマー類似
化合物に関する。とりわけ、本発明は、結晶性インスリ
ン類似化合物の製造方法に関する。該方法は、ＬysB28
ＰroB29−ヒトインスリンの精製および製造に有用であ
る。ＬysB28ＰroB29−ヒトインスリンは、糖尿病の処置
に有用である。
化合物に関する。とりわけ、本発明は、結晶性インスリ
ン類似化合物の製造方法に関する。該方法は、ＬysB28
ＰroB29−ヒトインスリンの精製および製造に有用であ
る。ＬysB28ＰroB29−ヒトインスリンは、糖尿病の処置
に有用である。
【０００２】１９２０年代にインスリンが導入されて以
来、糖尿病の処置を改良しようと絶え間無い進歩が遂げ
られてきた。インスリンの純度、および有効性において
大きな進歩が遂げられてきた。異なった時間−作用を有
する種々の製剤もまた開発されてきた。こういった改良
がなされてきたにもかかわらず、皮下注射療法は今だ、
患者に好都合な調節や正常化した血糖コントロールを与
えるには至っていない。患者が一生涯にわたり正常な血
糖レベルから頻繁に逸脱すると、高血糖症または低血糖
症、および網膜症、神経障害、腎症、並びに細小血管症
および大血管症(macroangiopathy)を含む長期合併症を
招く。
来、糖尿病の処置を改良しようと絶え間無い進歩が遂げ
られてきた。インスリンの純度、および有効性において
大きな進歩が遂げられてきた。異なった時間−作用を有
する種々の製剤もまた開発されてきた。こういった改良
がなされてきたにもかかわらず、皮下注射療法は今だ、
患者に好都合な調節や正常化した血糖コントロールを与
えるには至っていない。患者が一生涯にわたり正常な血
糖レベルから頻繁に逸脱すると、高血糖症または低血糖
症、および網膜症、神経障害、腎症、並びに細小血管症
および大血管症(macroangiopathy)を含む長期合併症を
招く。
【０００３】極端な血糖レベルにならないよう、糖尿病
患者は多数回にわたる注射療法を行うことが多いが、こ
れにより、インスリンを食事毎に投与する。しかし、こ
の治療法はまだ完全であるとは言えない。最も迅速に作
用する市販のインスリンは、注射後、ピークに達するの
が遅すぎて長く持続しすぎるので、グルコースレベルを
最適にコントロールすることができない。近年、皮下吸
収過程の動態を変えるインスリン製剤およびインスリン
類似化合物製剤を作り出そうと、相当な努力がはらわれ
てきた。
患者は多数回にわたる注射療法を行うことが多いが、こ
れにより、インスリンを食事毎に投与する。しかし、こ
の治療法はまだ完全であるとは言えない。最も迅速に作
用する市販のインスリンは、注射後、ピークに達するの
が遅すぎて長く持続しすぎるので、グルコースレベルを
最適にコントロールすることができない。近年、皮下吸
収過程の動態を変えるインスリン製剤およびインスリン
類似化合物製剤を作り出そうと、相当な努力がはらわれ
てきた。
【０００４】市販されているインスリンの医薬品製剤は
全て、自己会合した状態で、主に亜鉛−ヘキサマーの形
でインスリンを含有するので、皮下注射貯留部位から血
流へインスリンが吸収されるにあたっての律速段階は、
自己凝集したインスリンヘキサマーの解離であると考え
られている。この吸収過程を促進するために、モノマー
インスリン類似化合物が開発されてきた。これらのモノ
マー類似化合物は、天然ヒトインスリンの生理学的活性
を保持する一方で、インスリンより比較的迅速な活性発
現を有する。モノマー類似化合物は迅速に吸収されて、
インスリンの注射時間や作用ピークを食事に対する応答
に伴う食後のグルコース可動域へより近似する。
全て、自己会合した状態で、主に亜鉛−ヘキサマーの形
でインスリンを含有するので、皮下注射貯留部位から血
流へインスリンが吸収されるにあたっての律速段階は、
自己凝集したインスリンヘキサマーの解離であると考え
られている。この吸収過程を促進するために、モノマー
インスリン類似化合物が開発されてきた。これらのモノ
マー類似化合物は、天然ヒトインスリンの生理学的活性
を保持する一方で、インスリンより比較的迅速な活性発
現を有する。モノマー類似化合物は迅速に吸収されて、
インスリンの注射時間や作用ピークを食事に対する応答
に伴う食後のグルコース可動域へより近似する。
【０００５】本発明は、そのようなモノマー類似化合物
の１つであるＬysB28ＰroB29−ヒトインスリン(ＬysB28
ＰroB29−hＩ)結晶の新規製造方法を提供する。ＬysB28
ＰroB29−hＩは、ＥＰＯ公開第３８３ ４７２号に開示
されている。しかし、商業的に実行可能な結晶性Ｌys
B28ＰroB29−hＩの製造方法は開示されていない。
の１つであるＬysB28ＰroB29−ヒトインスリン(ＬysB28
ＰroB29−hＩ)結晶の新規製造方法を提供する。ＬysB28
ＰroB29−hＩは、ＥＰＯ公開第３８３ ４７２号に開示
されている。しかし、商業的に実行可能な結晶性Ｌys
B28ＰroB29−hＩの製造方法は開示されていない。
【０００６】インスリンの結晶化は当業界において周知
である。最初の発見は、エーベル(Ａbel)がブルシン、
ピリジン、および酢酸アンモニウムで酸性度を調節した
溶液から等電域においてインスリンを結晶化した１９２
６年にさかのぼる［Ａbel Ｊ.Ｊ.，Ｐroc.Ｎat'l Ａca
d.Ｓci.Ｕ.Ｓ. １２：１３２（１９２６）］。ピーター
ソン(Ｐeterson)らは、インスリン結晶および製剤並び
にそれらを製造するための方法を米国特許第２,９２０,
１０４号に記載している。今日、インスリンを結晶化す
るための商業的方法は、０.２５Ｎの酢酸、約２ｇ／ｌ
のインスリン、および２％の亜鉛を含むインスリン溶液
の塩基性度を塩基、好ましくは水酸化アンモニウムでp
Ｈ ５.６〜６.０に調節することからなる［Ｊens Ｂran
ge，ＧＡＬＥＮＩＣＳ ＯＦ ＩＮＳＵＬＩＮ，Ｓpringe
r-Ｖerlag（１９８７）］。最も重要なことは、ヒトイ
ンスリンがいずれかの亜鉛結晶を形成することのできる
条件下にＬysB28ＰroB29−hＩをおいても、そのような
結晶化は起こらないということである。
である。最初の発見は、エーベル(Ａbel)がブルシン、
ピリジン、および酢酸アンモニウムで酸性度を調節した
溶液から等電域においてインスリンを結晶化した１９２
６年にさかのぼる［Ａbel Ｊ.Ｊ.，Ｐroc.Ｎat'l Ａca
d.Ｓci.Ｕ.Ｓ. １２：１３２（１９２６）］。ピーター
ソン(Ｐeterson)らは、インスリン結晶および製剤並び
にそれらを製造するための方法を米国特許第２,９２０,
１０４号に記載している。今日、インスリンを結晶化す
るための商業的方法は、０.２５Ｎの酢酸、約２ｇ／ｌ
のインスリン、および２％の亜鉛を含むインスリン溶液
の塩基性度を塩基、好ましくは水酸化アンモニウムでp
Ｈ ５.６〜６.０に調節することからなる［Ｊens Ｂran
ge，ＧＡＬＥＮＩＣＳ ＯＦ ＩＮＳＵＬＩＮ，Ｓpringe
r-Ｖerlag（１９８７）］。最も重要なことは、ヒトイ
ンスリンがいずれかの亜鉛結晶を形成することのできる
条件下にＬysB28ＰroB29−hＩをおいても、そのような
結晶化は起こらないということである。
【０００７】本発明は、該分子独特の、すなわち、ヒト
インスリンを結晶化しない条件下でのＬysB28ＰroB29−
hＩの結晶化方法を提供する。その方法により、高品質
の亜鉛結晶が高収率で大規模に製造される。結晶は、分
子の安定な固体の形で得られる。結晶性固体が特に有利
であるが、これは、それらが無定形の固体より容易に特
徴付けられ、精製されて、製薬的にも高品質だからであ
る。従って、該方法は商業的応用に適当である。
インスリンを結晶化しない条件下でのＬysB28ＰroB29−
hＩの結晶化方法を提供する。その方法により、高品質
の亜鉛結晶が高収率で大規模に製造される。結晶は、分
子の安定な固体の形で得られる。結晶性固体が特に有利
であるが、これは、それらが無定形の固体より容易に特
徴付けられ、精製されて、製薬的にも高品質だからであ
る。従って、該方法は商業的応用に適当である。
【０００８】本発明は、結晶性ＬysB28ＰroB29−ヒトイ
ンスリンの製造方法であって、ＬysB28ＰroB29−ヒトイ
ンスリン、亜鉛、酢酸、クエン酸、またはグリシンより
なる群から選択される少なくとも０.３Ｎの有機酸、お
よびフェノール系化合物を含む溶液から、pＨ 約５.５
〜約６.５でＬysB28ＰroB29−ヒトインスリンを結晶化
することよりなる方法を提供する。
ンスリンの製造方法であって、ＬysB28ＰroB29−ヒトイ
ンスリン、亜鉛、酢酸、クエン酸、またはグリシンより
なる群から選択される少なくとも０.３Ｎの有機酸、お
よびフェノール系化合物を含む溶液から、pＨ 約５.５
〜約６.５でＬysB28ＰroB29−ヒトインスリンを結晶化
することよりなる方法を提供する。
【０００９】上記のように、本発明は、結晶性ＬysB28
ＰroB29−ヒトインスリンを製造するための方法を提供
する。「ＬysB28ＰroB29−ヒトインスリン」または「Ｌ
ysB28ＰroB29−hＩ」という用語は、ダイマー化した
り、自己会合したりする傾向の少ない速効性のインスリ
ン類似化合物である。ＬysB28ＰroB29−hＩは、ＥＰＯ
公開第３８３ ４７２号［このＥＰＯ公開に記載された
内容は本明細書の一部をなす］に記載されているよう
に、Ｂ鎖のＢ２８位に位置するプロリンがリジンで置換
されていて、またＢ鎖のＢ２９位に位置するリジンがプ
ロリンで置換されているヒトインスリンである。
ＰroB29−ヒトインスリンを製造するための方法を提供
する。「ＬysB28ＰroB29−ヒトインスリン」または「Ｌ
ysB28ＰroB29−hＩ」という用語は、ダイマー化した
り、自己会合したりする傾向の少ない速効性のインスリ
ン類似化合物である。ＬysB28ＰroB29−hＩは、ＥＰＯ
公開第３８３ ４７２号［このＥＰＯ公開に記載された
内容は本明細書の一部をなす］に記載されているよう
に、Ｂ鎖のＢ２８位に位置するプロリンがリジンで置換
されていて、またＢ鎖のＢ２９位に位置するリジンがプ
ロリンで置換されているヒトインスリンである。
【００１０】本開示中で使用するアミノ酸の略号は全
て、３７ Ｃ.Ｆ.Ｒ. §１.８２２(ｂ)(２)で詳述されて
いるように、米国特許商標局が認可したものである。
て、３７ Ｃ.Ｆ.Ｒ. §１.８２２(ｂ)(２)で詳述されて
いるように、米国特許商標局が認可したものである。
【００１１】本明細書中で使用する「フェノール系化合
物」または「フェノール誘導体」という用語は、フェノ
ール、レゾルシノール、m−クレゾール、またはメチル
−p−ヒドロキシベンゾエート、もしくはそれらの混合
物を集合的に意味する。
物」または「フェノール誘導体」という用語は、フェノ
ール、レゾルシノール、m−クレゾール、またはメチル
−p−ヒドロキシベンゾエート、もしくはそれらの混合
物を集合的に意味する。
【００１２】本発明中で使用する「結晶化する」という
用語は、ＬysB28ＰroB29−ヒトインスリン結晶の形成を
示す。
用語は、ＬysB28ＰroB29−ヒトインスリン結晶の形成を
示す。
【００１３】「生理学的に許容し得る塩基」という用語
は、ある当業者に知られている。生理学的に許容し得る
塩基には、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムおよび水
酸化アンモニウムが包含される。好ましくは、該塩基は
水酸化アンモニウムである。
は、ある当業者に知られている。生理学的に許容し得る
塩基には、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムおよび水
酸化アンモニウムが包含される。好ましくは、該塩基は
水酸化アンモニウムである。
【００１４】結晶性インスリンの形成は、広く研究され
てきた。ヒトインスリンは、０.２５Ｎの酢酸、１.６〜
２.１ｇ／ｌのインスリン、および２％の亜鉛の存在
下、pＨ ５.９５〜６.０５で商業的に結晶化される。そ
の結晶化は、塩基、一般的には水酸化ナトリウムの添加
で酸性側から結晶化が開始されることにより起こる。最
も意外には、インスリン結晶の既知の製造条件下では、
可溶性ＬysB28ＰroB29-hＩが結晶化しない。ＬysB28Ｐr
oB29−hＩは、自己会合および凝集が最小限となるよう
設計されている。ＬysB28ＰroB29−hＩが凝集しないと
いう観察結果は、ブレムス(Ｂrems)らのＰrotein Ｅngi
neering ５：６，５２７−５３３（１９９２）により初
めて記載された。類似化合物をモノマーとする最小限の
自己会合および凝集は、インスリンに関して開発された
条件下では、ＬysB28ＰroB29−hＩが結晶化しないこと
の原因であると考えられている。
てきた。ヒトインスリンは、０.２５Ｎの酢酸、１.６〜
２.１ｇ／ｌのインスリン、および２％の亜鉛の存在
下、pＨ ５.９５〜６.０５で商業的に結晶化される。そ
の結晶化は、塩基、一般的には水酸化ナトリウムの添加
で酸性側から結晶化が開始されることにより起こる。最
も意外には、インスリン結晶の既知の製造条件下では、
可溶性ＬysB28ＰroB29-hＩが結晶化しない。ＬysB28Ｐr
oB29−hＩは、自己会合および凝集が最小限となるよう
設計されている。ＬysB28ＰroB29−hＩが凝集しないと
いう観察結果は、ブレムス(Ｂrems)らのＰrotein Ｅngi
neering ５：６，５２７−５３３（１９９２）により初
めて記載された。類似化合物をモノマーとする最小限の
自己会合および凝集は、インスリンに関して開発された
条件下では、ＬysB28ＰroB29−hＩが結晶化しないこと
の原因であると考えられている。
【００１５】本発明は、ＬysB28ＰroB29−hＩが亜鉛お
よびフェノール化合物と共に結晶化して、安定な結晶性
固体を形成する条件を記載する。好ましいフェノール系
化合物は、フェノール、レゾルシノール、またはそれら
の混合物よりなる群から選択される。亜鉛およびフェノ
ール系化合物は両方共、結晶化を成し遂げるのに重要で
ある。
よびフェノール化合物と共に結晶化して、安定な結晶性
固体を形成する条件を記載する。好ましいフェノール系
化合物は、フェノール、レゾルシノール、またはそれら
の混合物よりなる群から選択される。亜鉛およびフェノ
ール系化合物は両方共、結晶化を成し遂げるのに重要で
ある。
【００１６】ＬysB28ＰroB29−hＩの溶液は、インスリ
ン類似化合物を水性希釈剤に溶解することにより製造す
る。ＬysB28ＰroB29−hＩ濃度は約１.８ｇ／ｌ〜約２.
５ｇ／ｌである。最も好ましくは、類似化合物濃度は約
２ｇ／ｌである。一般に酸溶解として知られていること
により、すなわち、生理学的に許容し得る酸、好ましく
は塩酸を用いてpＨを約３.０〜３.５まで下げることに
より、溶解を助長することができる。他の生理学的に許
容し得る酸には、酢酸、クエン酸、およびリン酸が包含
される。
ン類似化合物を水性希釈剤に溶解することにより製造す
る。ＬysB28ＰroB29−hＩ濃度は約１.８ｇ／ｌ〜約２.
５ｇ／ｌである。最も好ましくは、類似化合物濃度は約
２ｇ／ｌである。一般に酸溶解として知られていること
により、すなわち、生理学的に許容し得る酸、好ましく
は塩酸を用いてpＨを約３.０〜３.５まで下げることに
より、溶解を助長することができる。他の生理学的に許
容し得る酸には、酢酸、クエン酸、およびリン酸が包含
される。
【００１７】酢酸、クエン酸、またはグリシンよりなる
群から選択される有機酸濃度は、少なくとも０.３Ｎで
ある。０.３Ｎより低いと、主として無定形の生成物が
得られる結果となる。好ましくは、ＬysB28ＰroB29−h
Ｉを約０.８〜約１.２Ｎの酢酸に溶解する。最も好まし
くは、１Ｎの酢酸に溶解する。
群から選択される有機酸濃度は、少なくとも０.３Ｎで
ある。０.３Ｎより低いと、主として無定形の生成物が
得られる結果となる。好ましくは、ＬysB28ＰroB29−h
Ｉを約０.８〜約１.２Ｎの酢酸に溶解する。最も好まし
くは、１Ｎの酢酸に溶解する。
【００１８】添加する亜鉛濃度は、最終濃度が約４０mg
〜約４００mg／ｇ(類似化合物)となるようにする。亜鉛
は塩として添加するのが好ましい。亜鉛塩の典型的な例
には、酢酸亜鉛、臭化亜鉛、塩化亜鉛、フッ化亜鉛、ヨ
ウ化亜鉛および硫酸亜鉛が包含される。当業者には、本
発明の方法においてまた使用することのできる亜鉛塩が
他に多く存在することが分かるであろう。好ましくは、
酢酸亜鉛または塩化亜鉛を使用するが、これは、これら
の塩なら、商業的に許容し得る製法に新たな化学イオン
を添加することにはならないからである。結晶化におけ
る最適な亜鉛濃度は、約１００〜約３００mg／ｇ(Ｌys
B28ＰroB29−hＩ)である。
〜約４００mg／ｇ(類似化合物)となるようにする。亜鉛
は塩として添加するのが好ましい。亜鉛塩の典型的な例
には、酢酸亜鉛、臭化亜鉛、塩化亜鉛、フッ化亜鉛、ヨ
ウ化亜鉛および硫酸亜鉛が包含される。当業者には、本
発明の方法においてまた使用することのできる亜鉛塩が
他に多く存在することが分かるであろう。好ましくは、
酢酸亜鉛または塩化亜鉛を使用するが、これは、これら
の塩なら、商業的に許容し得る製法に新たな化学イオン
を添加することにはならないからである。結晶化におけ
る最適な亜鉛濃度は、約１００〜約３００mg／ｇ(Ｌys
B28ＰroB29−hＩ)である。
【００１９】結晶化条件は、フェノール系化合物、塩基
および亜鉛濃度に影響されやすい。すなわち、該方法を
行うある当業者は、はっきりした結晶が得られるよう、
本明細書中で記載するパラメーターを調節する。各々の
フェノール系化合物−塩基の組合せに対する最適条件
は、開示された範囲内で種々に変化する。好ましくは、
フェノール系化合物は、濃度が約０.１５〜約０.２５％
(ｖ／ｖ，最終濃度)のフェノールである。さらに好まし
くは、濃度が０.２％のフェノールである。
および亜鉛濃度に影響されやすい。すなわち、該方法を
行うある当業者は、はっきりした結晶が得られるよう、
本明細書中で記載するパラメーターを調節する。各々の
フェノール系化合物−塩基の組合せに対する最適条件
は、開示された範囲内で種々に変化する。好ましくは、
フェノール系化合物は、濃度が約０.１５〜約０.２５％
(ｖ／ｖ，最終濃度)のフェノールである。さらに好まし
くは、濃度が０.２％のフェノールである。
【００２０】本発明の方法には、ＬysB28ＰroB29−hＩ
を溶液に溶解する方法、またはフェノール系化合物、亜
鉛、およびＬysB28ＰroB29−hＩを溶液に添加する順序
は重要ではない。しかし、フェノール系化合物をＬys
B28ＰroB29−hＩの等電点より低いpＨでＬysB28ＰroB29
−hＩと相互作用させることは重要である。従って、亜
鉛を添加することにより、または生理学的に許容し得る
塩基の添加で溶液の塩基性度を酸性pＨから約５.５〜
６.５へ調節することにより、結晶化を開始することが
できる。生理学的に許容し得る塩基には、水酸化ナトリ
ウム、水酸化カリウムおよび水酸化アンモニウムが包含
される。好ましくは、塩基は水酸化アンモニウムであ
る。
を溶液に溶解する方法、またはフェノール系化合物、亜
鉛、およびＬysB28ＰroB29−hＩを溶液に添加する順序
は重要ではない。しかし、フェノール系化合物をＬys
B28ＰroB29−hＩの等電点より低いpＨでＬysB28ＰroB29
−hＩと相互作用させることは重要である。従って、亜
鉛を添加することにより、または生理学的に許容し得る
塩基の添加で溶液の塩基性度を酸性pＨから約５.５〜
６.５へ調節することにより、結晶化を開始することが
できる。生理学的に許容し得る塩基には、水酸化ナトリ
ウム、水酸化カリウムおよび水酸化アンモニウムが包含
される。好ましくは、塩基は水酸化アンモニウムであ
る。
【００２１】ＬysB28ＰroB29−ヒトインスリン、亜鉛、
酢酸、クエン酸、またはグリシンよりなる群から選択さ
れる少なくとも０.３Ｎの有機酸、およびフェノール系
化合物を含む溶液の塩基性度を生理学的に許容し得る塩
基でpＨ 約５.５〜約６.５に調節することにより、結晶
化を行うことができる。好ましくは、pＨをpＨ 約５.９
〜６.２に調節する。pＨを調節すると、結晶が形成され
る。
酢酸、クエン酸、またはグリシンよりなる群から選択さ
れる少なくとも０.３Ｎの有機酸、およびフェノール系
化合物を含む溶液の塩基性度を生理学的に許容し得る塩
基でpＨ 約５.５〜約６.５に調節することにより、結晶
化を行うことができる。好ましくは、pＨをpＨ 約５.９
〜６.２に調節する。pＨを調節すると、結晶が形成され
る。
【００２２】さらに好ましくは、ＬysB28ＰroB29−hＩ
を約１Ｎの酢酸に溶解する(溶解を助長するのに必要な
らば、pＨを３.０〜３.５に調節してよい)。次いで、そ
の溶液にフェノール系化合物を添加して、平衡となるま
で放置する。溶液のpＨを生理学的に許容し得る塩基でp
Ｈ 約５.５〜約６.５に調節する。好ましくは、塩基は
水酸化アンモニウムであり、pＨはpＨ 約５.９〜６.２
に調節する。次いで、亜鉛を添加することにより、結晶
化を開始する。
を約１Ｎの酢酸に溶解する(溶解を助長するのに必要な
らば、pＨを３.０〜３.５に調節してよい)。次いで、そ
の溶液にフェノール系化合物を添加して、平衡となるま
で放置する。溶液のpＨを生理学的に許容し得る塩基でp
Ｈ 約５.５〜約６.５に調節する。好ましくは、塩基は
水酸化アンモニウムであり、pＨはpＨ 約５.９〜６.２
に調節する。次いで、亜鉛を添加することにより、結晶
化を開始する。
【００２３】結晶化するためにどちらの方法を利用して
も、撹拌しながら、または撹拌せずに結晶は形成される
ので、これを集めて洗浄することができる。好ましく
は、結晶化は撹拌しながら行う。所望により、濾過が容
易に行われるよう、ＬysB28ＰroB29−hＩを再結晶する
ことができる。従来の方法により、結晶を集めて乾燥す
ることができる。結晶を濾過により集めるならば、さら
に亜鉛を濾液、または母液に添加して、さらにＬysB28
ＰroB29−hＩを回収することができる。本発明の方法に
より製造した結晶は高品質であり、商業的規模では高収
率である。結晶は、効力を満たし／完全なものとするよ
う、保持し、調合して与えるのに適当な、塊状薬物の安
定な固体の形で得られる。その結晶化方法により、原料
の純度または凝集動態は変化しない。
も、撹拌しながら、または撹拌せずに結晶は形成される
ので、これを集めて洗浄することができる。好ましく
は、結晶化は撹拌しながら行う。所望により、濾過が容
易に行われるよう、ＬysB28ＰroB29−hＩを再結晶する
ことができる。従来の方法により、結晶を集めて乾燥す
ることができる。結晶を濾過により集めるならば、さら
に亜鉛を濾液、または母液に添加して、さらにＬysB28
ＰroB29−hＩを回収することができる。本発明の方法に
より製造した結晶は高品質であり、商業的規模では高収
率である。結晶は、効力を満たし／完全なものとするよ
う、保持し、調合して与えるのに適当な、塊状薬物の安
定な固体の形で得られる。その結晶化方法により、原料
の純度または凝集動態は変化しない。
【００２４】結晶化温度は重要ではない。許容し得る温
度範囲は約４℃〜約２６℃である。好ましくは、温度は
約２２℃〜約２４℃である。
度範囲は約４℃〜約２６℃である。好ましくは、温度は
約２２℃〜約２４℃である。
【００２５】ＬysB28ＰroB29−hＩは、古典(溶液)法、
固相法、半合成法、およびごく最近では組換えＤＮＡ法
を含め、認可されている種々のペプチド合成法の幾つか
により製造することができる。例えば、ＣhanceらのＥ
ＰＯ公開第３８３ ４７２号では、ＬysB28ＰroB29−ヒ
トインスリンの製造を開示している。
固相法、半合成法、およびごく最近では組換えＤＮＡ法
を含め、認可されている種々のペプチド合成法の幾つか
により製造することができる。例えば、ＣhanceらのＥ
ＰＯ公開第３８３ ４７２号では、ＬysB28ＰroB29−ヒ
トインスリンの製造を開示している。
【００２６】以下の実施例は、単にインスリン類似化合
物の製造および本発明をさらに説明するために示すもの
である。本発明の範囲は、単に以下の実施例からなるも
のとして構成されるものではない。
物の製造および本発明をさらに説明するために示すもの
である。本発明の範囲は、単に以下の実施例からなるも
のとして構成されるものではない。
【００２７】実 施 例 １ ステンレス鋼製のドラム中、精製水(２６０.６Ｌ)およ
び氷酢酸(１９.４４Ｌ)を用い、プロセス・ストリーム
８４６.５ベースグラムのＬysB28ＰroB29−hＩの酢酸緩
衝液(１１６Ｌ)を２７６nmでの吸光度が２.２５となる
まで希釈して、最終濃度を１Ｎの酢酸とした。その溶液
に２ml／Ｌの割合で液化フェノール(合計 ７９２ml)を
加えて、その結果得られる溶液のpＨがpＨ ３より低い
ことを確認した。水酸化アンモニウム２４Ｌを加えるこ
とにより、その溶液をpＨ ６.０１に調節した後、２２
℃まで温めた。温めた後、塩化亜鉛溶液(２％ ｗ／ｖ
水溶液)５.３５Ｌを加えた。溶液のpＨが望ましい範囲
(５.９〜６.１)にあることを再確認して、溶液を１２時
間撹拌した。その溶液を８℃まで冷却して、撹拌を停止
し、２〜８℃で１８時間以上放置して結晶を析出させ
た。結晶が析出した後、上澄み液３７０Ｌを傾斜して流
し出し、さらに沈殿させるため、傾斜して流し出した上
澄み液の一部を元のドラムを濯ぐのに用いて、残りの上
澄み液と結晶層をより小さなドラムに移し入れた。１４
時間析出させた後、上澄み液６１Ｌを傾斜して流し出す
と、湿った結晶層と上澄み液約９Ｌが残った。
び氷酢酸(１９.４４Ｌ)を用い、プロセス・ストリーム
８４６.５ベースグラムのＬysB28ＰroB29−hＩの酢酸緩
衝液(１１６Ｌ)を２７６nmでの吸光度が２.２５となる
まで希釈して、最終濃度を１Ｎの酢酸とした。その溶液
に２ml／Ｌの割合で液化フェノール(合計 ７９２ml)を
加えて、その結果得られる溶液のpＨがpＨ ３より低い
ことを確認した。水酸化アンモニウム２４Ｌを加えるこ
とにより、その溶液をpＨ ６.０１に調節した後、２２
℃まで温めた。温めた後、塩化亜鉛溶液(２％ ｗ／ｖ
水溶液)５.３５Ｌを加えた。溶液のpＨが望ましい範囲
(５.９〜６.１)にあることを再確認して、溶液を１２時
間撹拌した。その溶液を８℃まで冷却して、撹拌を停止
し、２〜８℃で１８時間以上放置して結晶を析出させ
た。結晶が析出した後、上澄み液３７０Ｌを傾斜して流
し出し、さらに沈殿させるため、傾斜して流し出した上
澄み液の一部を元のドラムを濯ぐのに用いて、残りの上
澄み液と結晶層をより小さなドラムに移し入れた。１４
時間析出させた後、上澄み液６１Ｌを傾斜して流し出す
と、湿った結晶層と上澄み液約９Ｌが残った。
【００２８】結晶をこの容積にてスラリー化し、１リッ
トルの遠心分離用ボトル６本に分け入れて、ＤＰＲ６０
００遠心分離機を用い、４０００rpm(約４０００×Ｇ)
で４５分間遠心分離を行った。ボトル６本に結晶スラリ
ーを全て入れるには、２回行わなければならなかった。
遠心分離して得られた上澄み液(centrate)を傾斜して流
し出した。遠心分離用ボトル１本につき精製水５００ml
を用いて、結晶(ボトル１本につき約２５０ml)をスラリ
ー化し、再び４０００rpmで４５分間遠心分離を行っ
た。次いで、ボトル１本につき冷却しておいた(２〜８
℃)アルコール ＳＤ Ｎo.３Ａ Ａbsolute ５００mlを用
いて、結晶を再び遠心分離用ボトルにスラリー化し、再
び４０００rpmで１５分間遠心分離を行った。遠心分離
して得られたアルコールの上澄み液(alcohol centrate)
を傾斜して流し出し、アルコール洗浄を２回以上繰り返
し行った。アルコール洗浄した結晶(湿重量 １.９kg)を
減圧下に乾燥した。
トルの遠心分離用ボトル６本に分け入れて、ＤＰＲ６０
００遠心分離機を用い、４０００rpm(約４０００×Ｇ)
で４５分間遠心分離を行った。ボトル６本に結晶スラリ
ーを全て入れるには、２回行わなければならなかった。
遠心分離して得られた上澄み液(centrate)を傾斜して流
し出した。遠心分離用ボトル１本につき精製水５００ml
を用いて、結晶(ボトル１本につき約２５０ml)をスラリ
ー化し、再び４０００rpmで４５分間遠心分離を行っ
た。次いで、ボトル１本につき冷却しておいた(２〜８
℃)アルコール ＳＤ Ｎo.３Ａ Ａbsolute ５００mlを用
いて、結晶を再び遠心分離用ボトルにスラリー化し、再
び４０００rpmで１５分間遠心分離を行った。遠心分離
して得られたアルコールの上澄み液(alcohol centrate)
を傾斜して流し出し、アルコール洗浄を２回以上繰り返
し行った。アルコール洗浄した結晶(湿重量 １.９kg)を
減圧下に乾燥した。
【００２９】実 施 例 ２ 約２ｇ／ＬのＬysB28ＰroB29−hＩ溶液を調製して、最
終濃度を１Ｍの酢酸(２８０nmでの吸光度により測定す
る)とする。その溶液に液化フェノール(３.３ml／Ｌの
溶液)を加えた後、濃水酸化アンモニウムでpＨ ５.９〜
６.２に調節して、塩化亜鉛を２％(ｗ／ｖ)または２０
％(ｗ／ｖ)溶液として加え、最終濃度を４０〜１６０mg
(塩化亜鉛)／ｇ(ＬysB28ＰroB29−hＩ)とする。その結
果得られる結晶を放置して析出させ、傾斜して流し出す
ことにより母液を取り除いた後、遠心分離を行う。引き
続き、結晶を水でスラリー化して遠心分離を行い、最
後、減圧下に乾燥する前に無水エタノールで洗浄する。
１６０mg／ｇのＬysB28ＰroB29−hＩを限度として、母
液に亜鉛を添加することにより、第２回目に得られる結
晶を得ることができる。
終濃度を１Ｍの酢酸(２８０nmでの吸光度により測定す
る)とする。その溶液に液化フェノール(３.３ml／Ｌの
溶液)を加えた後、濃水酸化アンモニウムでpＨ ５.９〜
６.２に調節して、塩化亜鉛を２％(ｗ／ｖ)または２０
％(ｗ／ｖ)溶液として加え、最終濃度を４０〜１６０mg
(塩化亜鉛)／ｇ(ＬysB28ＰroB29−hＩ)とする。その結
果得られる結晶を放置して析出させ、傾斜して流し出す
ことにより母液を取り除いた後、遠心分離を行う。引き
続き、結晶を水でスラリー化して遠心分離を行い、最
後、減圧下に乾燥する前に無水エタノールで洗浄する。
１６０mg／ｇのＬysB28ＰroB29−hＩを限度として、母
液に亜鉛を添加することにより、第２回目に得られる結
晶を得ることができる。
【００３０】実 施 例 ３ ＬysB28ＰroB29−ヒトインスリン(２２２mg)をＭilli−
Ｑ水１００mlに溶解した。その溶液をＨＰＬＣ分析によ
り測定すると、溶液１mlにつきＬysB28ＰroB29−hＩを
２.０mg含有していた。その溶液を１０％のＨＣlでpＨ
約３.０に調節することにより清澄した。５ml量を４回
分取し、氷酢酸を加えることにより１Ｎの酢酸溶液とし
て、pＨが３.５より低いことを確認した。各々の試料に
液化フェノール１０μlを加えた後、塩化亜鉛溶液(２０
％ ｗ／ｖ 水溶液)６μlを加えた。各々に、濃水酸化ア
ンモニウム、水酸化ナトリウム(１０％ ｗ／ｖ 溶液)、
または水酸化カリウム(１０％ ｗ／ｖ 溶液)のいずれか
を加えることにより、pＨを６.０に調節した。その溶液
を約１５分間撹拌した後、蓋をし、室温で静置しておい
た。約２時間後には、３つの溶液全てに、はっきりした
菱面体結晶が観察されたが、結晶は水酸化カリウムで調
節した溶液中で最も迅速に形成された。
Ｑ水１００mlに溶解した。その溶液をＨＰＬＣ分析によ
り測定すると、溶液１mlにつきＬysB28ＰroB29−hＩを
２.０mg含有していた。その溶液を１０％のＨＣlでpＨ
約３.０に調節することにより清澄した。５ml量を４回
分取し、氷酢酸を加えることにより１Ｎの酢酸溶液とし
て、pＨが３.５より低いことを確認した。各々の試料に
液化フェノール１０μlを加えた後、塩化亜鉛溶液(２０
％ ｗ／ｖ 水溶液)６μlを加えた。各々に、濃水酸化ア
ンモニウム、水酸化ナトリウム(１０％ ｗ／ｖ 溶液)、
または水酸化カリウム(１０％ ｗ／ｖ 溶液)のいずれか
を加えることにより、pＨを６.０に調節した。その溶液
を約１５分間撹拌した後、蓋をし、室温で静置しておい
た。約２時間後には、３つの溶液全てに、はっきりした
菱面体結晶が観察されたが、結晶は水酸化カリウムで調
節した溶液中で最も迅速に形成された。
【００３１】実 施 例 ４ 氷酢酸１.２mlを含有するＭilli−Ｑ水２０mlのどちら
か一方にＬysB28ＰroB2 9−hＩ約４２mgを溶解した。液
化フェノール４４μlを最初の試料に加え、液化フェノ
ール３４μlをもう一方の試料に加えた。どちらの場合
も、濃水酸化アンモニウムを加えることでpＨを６.０に
調節した後、塩化亜鉛溶液(２０％ ｗ／ｖ水溶液)４５
μlを加えた。その溶液を約５分間撹拌して、蓋をし、
室温で静置しておいた。約２４時間後には、はっきりし
た菱面体結晶が観察された。
か一方にＬysB28ＰroB2 9−hＩ約４２mgを溶解した。液
化フェノール４４μlを最初の試料に加え、液化フェノ
ール３４μlをもう一方の試料に加えた。どちらの場合
も、濃水酸化アンモニウムを加えることでpＨを６.０に
調節した後、塩化亜鉛溶液(２０％ ｗ／ｖ水溶液)４５
μlを加えた。その溶液を約５分間撹拌して、蓋をし、
室温で静置しておいた。約２４時間後には、はっきりし
た菱面体結晶が観察された。
【００３２】実 施 例 ５ ＬysB28ＰroB29−ヒトインスリン(２２２mg)をＭilli−
Ｑ水１００mlに溶解して、その溶液をＨＰＬＣ分析によ
り測定すると、溶液１mlにつきＬysB28ＰroB29−hＩを
２.０mg含有していた。その溶液を１０％のＨＣlでpＨ
約３.０に調節することにより清澄した。５ml量を４回
分取し、氷酢酸を加えることにより１Ｎの酢酸溶液とし
て、pＨが３.５より低いことを確認した。各々に、m−
クレゾール(１２μl)、フェノール(１０μl)、レゾルシ
ノール(１００mg／mlの水溶液２.１μl)、またはメチル
パラベン(１０mg／mlの水溶液１.６ml)のいずれかを加
えると、フェノール系化合物に対して同様なペプチドの
モル比を有する結晶化溶液が生成した。各々の試料に塩
化亜鉛溶液(２０％ ｗ／ｖ 水溶液)６μlを加え、濃水
酸化アンモニウムでpＨを６.０に調節した。その溶液を
約１５分間撹拌した後、蓋をし、室温で静置しておい
た。約２４時間後には、フェノールを含有する溶液に、
はっきりした菱面体結晶が観察された。メチルパラベン
を含有する溶液には、あまりはっきりしない平面結晶が
生じた。これらの条件下、m−クレゾールおよびレゾル
シノールを含有する溶液には、結晶が生じなかった。
Ｑ水１００mlに溶解して、その溶液をＨＰＬＣ分析によ
り測定すると、溶液１mlにつきＬysB28ＰroB29−hＩを
２.０mg含有していた。その溶液を１０％のＨＣlでpＨ
約３.０に調節することにより清澄した。５ml量を４回
分取し、氷酢酸を加えることにより１Ｎの酢酸溶液とし
て、pＨが３.５より低いことを確認した。各々に、m−
クレゾール(１２μl)、フェノール(１０μl)、レゾルシ
ノール(１００mg／mlの水溶液２.１μl)、またはメチル
パラベン(１０mg／mlの水溶液１.６ml)のいずれかを加
えると、フェノール系化合物に対して同様なペプチドの
モル比を有する結晶化溶液が生成した。各々の試料に塩
化亜鉛溶液(２０％ ｗ／ｖ 水溶液)６μlを加え、濃水
酸化アンモニウムでpＨを６.０に調節した。その溶液を
約１５分間撹拌した後、蓋をし、室温で静置しておい
た。約２４時間後には、フェノールを含有する溶液に、
はっきりした菱面体結晶が観察された。メチルパラベン
を含有する溶液には、あまりはっきりしない平面結晶が
生じた。これらの条件下、m−クレゾールおよびレゾル
シノールを含有する溶液には、結晶が生じなかった。
【００３３】１０分の１量のレゾルシノールを用い、ま
た水酸化ナトリウム(１０％ ｗ／ｖ溶液)で調節して、
同様の方法を行うと、はっきりした菱面体結晶が結果と
して得られた。この実施例から、一般に条件を最適化す
ることにより、はっきりした結晶がフェノール系化合物
で形成され得ることが実証される。
た水酸化ナトリウム(１０％ ｗ／ｖ溶液)で調節して、
同様の方法を行うと、はっきりした菱面体結晶が結果と
して得られた。この実施例から、一般に条件を最適化す
ることにより、はっきりした結晶がフェノール系化合物
で形成され得ることが実証される。
【００３４】実 施 例 ６ ＬysB28ＰroB29−hＩ(２２２mg)をＭilli−Ｑ水１００m
lに溶解して、その溶液をＨＰＬＣ分析により測定する
と、溶液１mlにつきＬysB28ＰroB29−hＩを２.０mg含有
していた。その溶液を１０％のＨＣlでpＨ 約３.０に調
節することにより清澄した。５ml量を１回分取し、氷酢
酸を加えることにより０.２５Ｎの酢酸溶液として、pＨ
が３.５より低いことを確認した。塩化亜鉛溶液(２％
ｗ／ｖ水溶液)２０μlを試料に加えた。濃水酸化アンモ
ニウムを加えることによりpＨを６.０に調節した。その
溶液を約１５分間撹拌した後、蓋をし、室温で静置して
おいた。約２４時間後では、溶液に結晶は全く観察され
なかったが、無定形の沈澱物が容器の底に沈澱してい
た。
lに溶解して、その溶液をＨＰＬＣ分析により測定する
と、溶液１mlにつきＬysB28ＰroB29−hＩを２.０mg含有
していた。その溶液を１０％のＨＣlでpＨ 約３.０に調
節することにより清澄した。５ml量を１回分取し、氷酢
酸を加えることにより０.２５Ｎの酢酸溶液として、pＨ
が３.５より低いことを確認した。塩化亜鉛溶液(２％
ｗ／ｖ水溶液)２０μlを試料に加えた。濃水酸化アンモ
ニウムを加えることによりpＨを６.０に調節した。その
溶液を約１５分間撹拌した後、蓋をし、室温で静置して
おいた。約２４時間後では、溶液に結晶は全く観察され
なかったが、無定形の沈澱物が容器の底に沈澱してい
た。
【００３５】対照として、５ml量をもう１回分取して、
実施例１に記載した水酸化アンモニウム処置を行った。
ＬysB28ＰroB29−hＩのはっきりした菱面体結晶が形成
された。ヒトインスリン(１Ｎの酢酸中、２.３mg／ml)
を水酸化アンモニウムを使用する実施例１に記載した条
件下においても、７日以内では、結晶は全く形成されな
かった。
実施例１に記載した水酸化アンモニウム処置を行った。
ＬysB28ＰroB29−hＩのはっきりした菱面体結晶が形成
された。ヒトインスリン(１Ｎの酢酸中、２.３mg／ml)
を水酸化アンモニウムを使用する実施例１に記載した条
件下においても、７日以内では、結晶は全く形成されな
かった。
【００３６】この実験から、生合成的なヒトインスリン
の結晶化において一般に利用される条件は、ＬysB28Ｐr
oB29−ヒトインスリンの結晶化には不適当であり、また
同様に、ＬysB28ＰroB29−hＩの結晶化に関して記載し
た結晶化条件では、ヒトインスリンの結晶は生じないで
あろうことが実証される。
の結晶化において一般に利用される条件は、ＬysB28Ｐr
oB29−ヒトインスリンの結晶化には不適当であり、また
同様に、ＬysB28ＰroB29−hＩの結晶化に関して記載し
た結晶化条件では、ヒトインスリンの結晶は生じないで
あろうことが実証される。
【００３７】実 施 例 ７ １Ｎの酢酸の代わりに１Ｎのクエン酸を使用し、実施例
１と同じ方法で行った。その結晶化により、はっきりし
たＬysB28ＰroB29−hＩの結晶が生じた。
１と同じ方法で行った。その結晶化により、はっきりし
たＬysB28ＰroB29−hＩの結晶が生じた。
フロントページの続き (72)発明者 ナンシー・デロリス・カーター アメリカ合衆国46222インディアナ州イン ディアナポリス、ミッドベイル・ドライブ 3149番 (72)発明者 ブルース・ヒル・フランク アメリカ合衆国46260インディアナ州イン ディアナポリス、スプリング・フォレス ト・ドライブ9377番
Claims (4)
- 【請求項１】 結晶性ＬysB28ＰroB29−ヒトインスリン
の製造方法であって、ＬysB28ＰroB29−ヒトインスリ
ン、亜鉛、酢酸、クエン酸、またはグリシンよりなる群
から選択される少なくとも０.３Ｎの有機酸、およびフ
ェノール系化合物を含む溶液から、pＨ 約５.５〜約６.
５でＬysB28ＰroB29−ヒトインスリンを結晶化すること
よりなる方法。 - 【請求項２】 ＬysB28ＰroB29−ヒトインスリン濃度が
約１.８〜約２.５ｇ／ｌであり、フェノール系化合物が
フェノールであって、亜鉛濃度が約４０mg／ｇ(ＬysB28
ＰroB29−ヒトインスリン)〜約４００mg／ｇ(ＬysB28Ｐ
roB29−ヒトインスリン)である、請求項１に記載の方
法。 - 【請求項３】 pＨが約５.９〜約６.２である、請求項
１に記載の方法。 - 【請求項４】 結晶性ＬysB28ＰroB29−ヒトインスリン
の製造方法であって、 （ａ） フェノールを最終容積に基づき０.１５％〜０.
２５％の割合で約１Ｎ酢酸中のＬysB28ＰroB29−hＩ溶
液(約１.８〜２.５ｇ／ｌ)に加え、 （ｂ） pＨを水酸化アンモニウムで約５.９〜約６.２に
調節して、 （ｃ） 最終亜鉛濃度が約４０〜約４００mg／ｇ(Ｌys
B28ＰroB29−hＩ)となるように亜鉛塩溶液を加えること
よりなる方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/260,647 US5504188A (en) | 1994-06-16 | 1994-06-16 | Preparation of stable zinc insulin analog crystals |
| US260647 | 1994-06-16 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08169899A true JPH08169899A (ja) | 1996-07-02 |
| JP3595607B2 JP3595607B2 (ja) | 2004-12-02 |
Family
ID=22990041
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP14732095A Expired - Lifetime JP3595607B2 (ja) | 1994-06-16 | 1995-06-14 | 安定な亜鉛インスリン類似化合物結晶の製造 |
Country Status (29)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5504188A (ja) |
| EP (1) | EP0692489B1 (ja) |
| JP (1) | JP3595607B2 (ja) |
| KR (1) | KR100369951B1 (ja) |
| CN (1) | CN1184234C (ja) |
| AT (1) | ATE233278T1 (ja) |
| AU (1) | AU697794B2 (ja) |
| BR (1) | BR9502798A (ja) |
| CA (1) | CA2151563C (ja) |
| CO (1) | CO4410205A1 (ja) |
| CZ (1) | CZ286066B6 (ja) |
| DE (1) | DE69529708T2 (ja) |
| DK (1) | DK0692489T3 (ja) |
| ES (1) | ES2188637T3 (ja) |
| FI (1) | FI952930A (ja) |
| HU (1) | HUT73495A (ja) |
| IL (1) | IL114152A (ja) |
| IN (1) | IN178919B (ja) |
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