CN104761632A

CN104761632A - 一种地特胰岛素结晶的制备方法及应用

Info

Publication number: CN104761632A
Application number: CN201510176512.8A
Authority: CN
Inventors: 黄亮; 肖拥军; 曹永恒; 曹春来; 陈航; 周翠
Original assignee: ZHUHAI LIANBANG PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: ZHUHAI LIANBANG PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2015-04-14
Filing date: 2015-04-14
Publication date: 2015-07-08

Abstract

本发明公开了一种地特胰岛素结晶的制备方法及应用。该制备方法包括如下步骤：在0.1～0.2M柠檬酸三钠体系，并且含体积百分比5～10％的有机溶剂的条件下，从含有地特胰岛素、锌离子、酚类物质及一定盐浓度的结晶液中，在pH8.0～8.5的条件下使地特胰岛素结晶。通过该制备方法得到的地特胰岛素结晶具有均一稳定的固定形态，沉降体积小，易于与上清分离，冻干时间短，生产效率高，适合应用于工业化生产。

Description

一种地特胰岛素结晶的制备方法及应用

技术领域

本发明涉及人胰岛素类似物结晶的制备方法，特别涉及一种地特胰岛素结晶的制备方法及应用。

背景技术

随着我国经济的发展，人们生活质量水平大幅度的提高，糖尿病患者的数量也急剧增长。根据最新调查报告显示，中国糖尿病患者持续增加，至2013年，成人糖尿病患病率接近12％，糖尿病患者人数突破1亿，位居全球第一位。糖尿病是一种由于胰岛素分泌缺陷后/或其生物效应降低(胰岛素抵抗)引起的以高血糖为特征的慢性全身代谢性病症。慢性高血糖将导致人体多组织，尤其是眼、肾、神经及心血管的长期损害，功能不全和衰竭，危害性极大。

胰岛素治疗一直被公认为是治疗糖尿病以及控制糖尿病患者血糖的重要手段。随着分子生物学技术和基因工程的发展，20世纪90年代末，人们在对胰岛素结构和成分的深入研究中发现，对肽链进行修饰有可能改变胰岛素的理化和生物学特征，从而能研制出较传统人胰岛素更适合人体生理需要的胰岛素类似物(Insulin analog)。人胰岛素类似物的出现，弥补了传统人胰岛素的局限性，满足不同糖尿病患者的治疗需求。

地特胰岛素作为新一代的长效可溶性胰岛素类似物，是第一个采用化学修饰的方法获得的胰岛素类似物，即将人胰岛素天然排列在B30位的苏氨酸去掉后，通过酰化反应，在B29位的赖氨酸ε氨基上结合一个14碳脂肪酸链(肉豆蔻酸)。一方面，这14碳脂肪酸侧链可使地特胰岛素在皮下注射后形成双六聚体而延缓吸收，同时还与皮下组织的的白蛋白可逆性结合，进一步减缓入血速度；另一方面，地特胰岛素在进入外周血循环后，98％与白蛋白可逆性结合，靶器官分布也延缓。这些特点使地特胰岛素的作用时间长达24小时。在多个国家的研究学者发布的地特胰岛素最新研究结果中显示，地特胰岛素与其他胰岛素相比，具有长效降糖作用的同时，糖尿病患者用后出现低血糖较少，且还具有独特的减少体重增加的作用。

以固态晶体形式存在的胰岛素，相比较于不定形固体粉末以及溶液状态的形式，对于产品稳定性、贮存性能等均较为有优势。因此，亟需一种有效能将地特胰岛素结晶的方法。中国专利CN201110118026.2公开了一种长效胰岛素类似物—甘精胰岛素(Gly^A21-Arg^B31-Arg^B32-人胰岛素)的结晶方法：在室温条件下，制备含2.8～3.2g/L甘精胰岛素、体积分数为10～30％的乙醇、体积分数为0.01～0.2％的苯酚、0.4～0.6M乙酸、70～100mg/L氯化锌、0.3～0.4M氯化钠的结晶液，调节pH值至8.0～8.5，将结晶液温度降至2～8℃，调节pH值至7.1～7.8，结晶3h。本发明发明人参照此专利中的实施例1和实施例2进行了地特胰岛素结晶的制备，未能得到地特胰岛素结晶。应用甘精胰岛素结晶的制备方法进行地特胰岛素结晶，地特胰岛素只能形成沉淀。根本原因在于甘精胰岛素与地特胰岛素是两种分子结构完全不同的胰岛素，物理化学性质差异大。甘精胰岛素是将人胰岛素的A21突变并添加B31和B32位氨基酸形成的，即Gly^A21-Arg^B31-Arg^B32-人胰岛素，其等电点变为6.7左右，在中性pH条件下微溶。而地特胰岛素是用脂肪酸链酰化修饰去(B30)人胰岛素得来的胰岛素类似物，即赖氨酸B29(N^ε-十四烷酰)去(B30)人胰岛素，其疏水性增强，等电点约为5.0至6.0，但在中性pH条件下澄清易溶。其次由于甘精胰岛素难溶于中性pH条件，因此结晶中使用了大量的有机酸作为溶解缓冲体系，但这反而不利于地特胰岛素结构的稳定。可见，地特胰岛素的结晶对于pH，缓冲盐，离子强度，溶液组成等与其他胰岛素相比有着完全不同的要求。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种地特胰岛素结晶的制备方法。该方法能更好的与上游工艺衔接(可从干燥/冻干固体粉末样品或者纯化收集的液体样品中直接制备地特胰岛素结晶)；该方法获得的地特胰岛素结晶具有均一稳定的固体形态，沉降体积小，易于与上清分离(可采用离心或抽滤的方式)，冻干时间短，适合工业化生产。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种地特胰岛素结晶的制备方法，包括如下步骤：在0.1～0.2M柠檬酸三钠体系，并且含体积百分比5～10％的有机溶剂的条件下，从含有地特胰岛素、锌离子、酚类物质及一定盐浓度的结晶液中，在pH8.0～8.5的条件下使地特胰岛素结晶。

所述的地特胰岛素结晶的制备方法，优选包含如下步骤：

(1)配制含0.1～0.2M柠檬酸三钠、1～6g/L地特胰岛素、体积百分比5～10％的有机溶剂、0.05～0.5M盐、质量体积百分比0.005％～0.2％的酚类物质的结晶液；调节pH值至8.5～9.0，加入锌离子；

(2)调节含锌离子的结晶液的pH值至8.0～8.5，结晶3～6小时；

(3)然后在2～8℃条件下静置结晶12～24小时，得到地特胰岛素结晶。

步骤(1)和(2)宜在室温条件下进行；室温条件指的是10～30℃，优选为15～28℃。

所述的柠檬酸缓三钠体系是地特胰岛素形成结晶至关重要的条件。发明人经实验研究发现，在没有柠檬酸三钠的结晶体系下，地特胰岛素只能形成无固定形态的沉淀，无法形成结晶；所述的柠檬酸三钠在所述的结晶液中的浓度优选为0.1～0.15M。

所述的有机溶剂的浓度是地特胰岛素形成结晶的重要参数之一。与其他胰岛素相比，由于地特胰岛素在结构上存在较大的差异，疏水性较强，导致其在水相中的溶解度较差，在结晶液中需要加入一定体积分数的有机溶剂以增强其溶解性质。发明人经试验研究发现，在没有加入有机溶剂的条件下，地特胰岛素只能形成无固定形态的沉淀，无法形成晶体；而有机溶剂浓度的过度增加又会使地特胰岛素溶解度增加，以致无法达到利于结晶析出的过饱和状态；只有在含体积分数5～10％有机溶剂的结晶液中，地特胰岛素才能形成结晶。所述的有机溶剂为乙腈、乙醇和异丙醇中的一种或至少两种，其中优选的有机溶剂为乙腈，结晶液中有机溶剂的浓度优选为体积百分比7～10％。

所述的地特胰岛素可以为干燥/冻干固体粉末或纯化收集的液体样品中的一种；其制备方法可参照专利WO98/02460或CN94193852中披露的方法进行；所述的地特胰岛素在所述的结晶液中的浓度为1～6g/L，优选2～4g/L。

所述的锌离子可以是本领域技术人员所熟悉的锌盐，其中优选的锌盐是乙酸锌、氯化锌、溴化锌、碘化锌、氧化锌和硫酸锌中的一种或至少两种，更优选为乙酸锌。所述的锌离子的用量按锌离子与地特胰岛素按摩尔比(1.5～7):1计，优选为(2.5～4):1。

所述的酚类物质选自苯酚、间甲苯酚、邻甲苯酚、对甲苯酚、间苯二酚和对羟基苯甲酸甲脂中的一种或至少两种，更为优选苯酚。所述的酚类物质在所述的结晶液中浓度为质量体积百分(g/mL)比0.005～0.2％，优选0.03～0.07％。

所述的盐选自氯化钠、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐和乙酸铵中的一种或至少两种。所述的盐在所述的结晶液中的浓度为0.05～0.5M，优选为0.25～0.5M；其中优选的盐为乙酸铵和氯化钠组合，优选盐的浓度为乙酸铵0.05M～0.1M、氯化钠0.2M。

本发明结晶体系中，pH值的调节也是关键之一。在加入锌盐时，会导致结晶液体系的pH值降低，若pH值降低至7.8或以下，会导致地特胰岛素在结晶液中形成无固定形态的沉淀。发明人研究发现，一旦地特胰岛素在结晶液中形成沉淀，就难以再溶解澄清；因此，在加入锌盐之前，可将结晶液pH值调节至结晶pH值以上(8.5～9.0，优选为8.5～8.7)，加入锌盐后再调节至结晶需要的pH值(8.0～8.5)。本发明所述的结晶液的pH值可通过本领域技术人员所知的酸碱进行调节，优选氢氧化钠、氢氧化钾、氨水、盐酸、磷酸和乙酸中的一种或至少两种，更为优选氢氧化钠和盐酸；优选的结晶pH值为8.0～8.2，更优选为8.0～8.1。

本发明中，地特胰岛素结晶过程的温度并不是关键的，温度的选择范围较宽，只要在样品稳定性可接受范围即可。初始的结晶温度可选择在常温(10～30℃)条件下进行，在该条件下可增加胰岛素的溶解度，利于晶核的形成；待结晶液中有稳定晶核形成后，再降低结晶温度，加快结晶速度。发明人经大量实验研究得出：地特胰岛素在常温(10～30℃)条件下结晶3～6h，再转移至2～8℃条件下结晶12～24h，可得到更加稳定均一的地特胰岛素结晶。

本发明中，地特胰岛素结晶过程可选择静置或者缓慢搅拌，且优先选择初始结晶在缓慢搅拌条件下进行，再转移至低温(2～8℃)条件下静置结晶。

所述地特胰岛素结晶的制备方法在工业化制备地特胰岛素中进行应用。

本发明相对于现有技术具有如下优点及有益效果：本发明克服了地特胰岛素由于结构上与其他胰岛素的差异造成的结晶困难；本发明结晶的制备方法可获得均一稳定的地特胰岛素结晶，且晶体沉降体积小，易于与上清分离(可采用离心或抽滤的方式)，冻干时间短，生产效率高，适合工业化生产。

附图说明

图1是实施例1制备的地特胰岛素结晶在显微镜下160倍放大图。

图2是实施例2制备的地特胰岛素结晶在显微镜下160倍放大图。

图3是实施例3制备的地特胰岛素结晶在显微镜下160倍放大图。

图4是实施例4制备的地特胰岛素结晶在显微镜下160倍放大图。

图5是实施例5制备的地特胰岛素结晶在显微镜下160倍放大图。

图6是实施例6制备的地特胰岛素结晶在显微镜下160倍放大图。

图7是实施例7制备的地特胰岛素结晶在显微镜下160倍放大图。

图8是实施例8制备的地特胰岛素结晶在显微镜下160倍放大图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

材料

地特胰岛素(赖氨酸B29(N^ε-十四酰)去(B30)人胰岛素)：珠海联邦制药股份有限公司提供，批号：201301001

三水合乙酸钠采购于西陇化工股份有限公司，批号：1304011；二水合柠檬酸三钠采购于西陇化工股份有限公司，批号：1301161；氯化钠采购于西陇化工股份有限公司，批号：1303241；乙酸铵采购于西陇化工股份有限公司，批号：1303061；三羟甲基氨基甲烷盐酸盐采购于阿拉丁试剂(上海)有限公司；批号：37963；苯酚采购于西陇化工股份有限公司，批号130306；氯化锌采购于西陇化工股份有限公司，批号：130104；二水合乙酸锌采购于西陇化工股份有限公司，批号：1301112；乙醇采购于西陇化工股份有限公司，批号：1312011；乙腈采购于天津市康科德科技有限公司，批号130409；乙酸采购于西陇化工股份有限公司，批号：1309161；氢氧化铵采购于西陇化工股份有限公司，批号：1312101；氢氧化钠采购于西陇化工股份有限公司，批号1302041；盐酸采购于珠海市华成达化工有限公司，批号:20130626。

实施例1

参照名称为“甘精胰岛素结晶的制备方法”的中国专利CN201110118026.2中的实施例1和实施例2进行地特胰岛素结晶的制备，成分和浓度如下：实验组A为地特胰岛素3.5g/L、乙腈20％(v/v)、乙酸0.7M、苯酚0.4％(w/v)、氯化锌120mg/L、乙酸钠0.5M；实验组B为地特胰岛素3g/L、乙醇15％(v/v)、乙酸0.5M、氯化锌90mg/L、苯酚0.2％(w/v)、氯化钠0.3M。制备过程如下：称取地特胰岛素两份，A1：0.175g，B1：0.15g，分别加入20ml水混悬待用；配制盐溶液a1：乙腈10ml、乙酸2ml、6％(w/v)的苯酚水溶液3.33ml、乙酸钠3.4g和0.5M乙酸锌溶液55μl，加水溶解并定容至25ml；配制盐溶液b1：乙醇7.5ml、乙酸1.43ml、6％(w/v)的苯酚水溶液1.68ml、氯化钠0.88g、和0.5M乙酸锌溶液41μl，加水溶解并定容至25ml；将地特胰岛素A1溶液、B1溶液对应加入盐溶液a1、b1，并加水定容至50ml，摇匀；5M氨水调节pH值分别为8.26和8.30，放置摇床100转/分钟，25℃下放置10分钟后均出现沉淀。实验结果如图1所示，可见实验组A(图1(A))和B(图1(B))得到的均为沉淀，说明采用甘精胰岛素结晶的制备方法，不能使地特胰岛素结晶。甘精胰岛素结晶制备方法不适用于地特胰岛素。

实施例2

制备地特胰岛素结晶液，各组分浓度为：实验组A为地特胰岛素2g/L、乙腈7.5％(v/v)、乙酸铵0.1M、氯化钠0.2M、苯酚0.2％(w/v)、锌离子与地特胰岛素的摩尔比为2:1；实验组B在实验组A的基础上加入0.1M二水合柠檬酸三钠。

制备过程如下：称取0.2g地特胰岛素，加入50ml浓度为15％(v/v)的乙腈水溶液，2M氢氧化钠溶液调节pH值至8.57，溶解完全，待用；配制盐溶液a2：乙酸铵0.39g、氯化钠0.58g、6％(w/v)的苯酚水溶液1.68ml，加水溶解并定容至25ml，2M氢氧化钠调节pH值至8.86；配制盐溶液b2：在溶液a2的基础上，加入1.47g二水合柠檬酸三钠。取两份4g/L地特胰岛素溶液各25ml，对应加入25ml盐溶液a2和b2，摇匀；分别加入浓度为0.5M的乙酸锌溶液68μl，2M盐酸调节pH值分别为8.16和8.13；放置摇床100转/分钟，室温22℃条件下结晶4h，然后转移至4℃条件下静置结晶15h。取结晶悬浮液在显微镜下放大160倍镜检，其结果如图2所示，可见实验组A(图2(A))为沉淀，实验组B(图2(B))为结晶。

实施例3

制备地特胰岛素结晶液，各组分浓度为：地特胰岛素1g/L、乙腈浓度5％(v/v)、柠檬酸三钠0.2M、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐0.4M、苯酚0.05％(w/v)、锌离子与地特胰岛素的摩尔比为7:1。

制备过程如下：称取地特胰岛素0.05g，加入25ml浓度为10％(v/v)的乙腈水溶液，2M氢氧化钠溶液调节pH值至8.64，溶解完全，待用；配制盐溶液：二水合柠檬酸三钠2.94g、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐3.15g、浓度为6％(w/v)的苯酚水溶液420μl，加水溶解并定容至25ml，2M氢氧化钠溶液调节pH值至8.78，并加至25ml地特胰岛素溶液中，混匀；最后加入0.5M乙酸锌溶液118μl，2M盐酸调节pH值至8.21；放置摇床100转/分钟，15℃条件下结晶3h，然后转移至2℃条件下静置结晶15h。取结晶悬浮液在显微镜下放大160倍镜检，其结果如图3所示，可见晶体均一性较好，晶体颗粒较细长。

实施例4

制备地特胰岛素结晶液，各组分浓度为：地特胰岛素4g/L、乙醇浓度8％(v/v)、柠檬酸三钠0.1M、乙酸铵0.4M、苯酚0.01％(w/v)、锌离子与地特胰岛素的摩尔比为3:1。

制备过程如下：称取地特胰岛素0.2g，加入25ml浓度为16％(v/v)的乙腈水溶液，2M氢氧化钠调节pH值至8.52，溶解完全，待用；配制盐溶液：二水合柠檬酸三钠1.47g、乙酸铵1.54g、6％苯酚水溶液84μl，加水溶解并定容至25ml，2M氢氧化钠溶液调节pH值至8.58，加至25ml地特胰岛素溶液中，混匀；加入0.5M乙酸锌203μl，2M盐酸调节pH至8.10；放置摇床100转/分钟，室温条件28℃下结晶5h，然后转移至8℃条件下静置结晶24h。取结晶悬浮液在显微镜下放大160倍镜检，其结果如图4所示，晶体形状呈三角短棒状。

实施例5

制备地特胰岛素结晶液，各组分浓度为：地特胰岛素4g/L、乙腈浓度10％、柠檬酸三钠0.1M、乙酸铵0.4M、苯酚0.005％(w/v)、锌离子与地特胰岛素的摩尔比为3:1。

制备过程如下：称取地特胰岛素0.2g，加入25ml浓度为20％(v/v)的乙腈水溶液，2M氢氧化钠调节pH值至8.55，溶解完全，待用；配制盐溶液：二水合柠檬酸三钠1.47g、乙酸铵1.54g、6％苯酚水溶液42μl，加水溶解并定容至25ml，2M氢氧化钠溶液调节pH值至8.55，加至25ml地特胰岛素溶液中，混匀；加入0.5M乙酸锌203μl，2M盐酸调节pH至8.10；放置摇床100转/分钟，室温条件25℃下结晶4h，然后转移至6℃条件下静置结晶20h。取结晶悬浮液在显微镜下放大160倍镜检，其结果如图5所示。

实施例6

制备地特胰岛素结晶液，各组分浓度为：地特胰岛素6g/L、乙腈浓度7.5％(v/v)、柠檬酸三钠0.15M、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐0.05M、氯化钠0.2M、苯酚0.03％(w/v)，锌离子与地特胰岛素的摩尔比为6:1。

制备过程如下：称取地特胰岛素0.3g，加入25ml浓度为15％的乙腈水溶液，2M氢氧化钠调节pH值至8.60，溶解完全，待用；配制盐溶液：二水合柠檬酸三钠2.2g、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐0.39g、氯化钠0.58g，6％苯酚水溶液250μl，加水溶解并定容至25ml，2M氢氧化钠调节pH值至8.73，加至25ml地特胰岛素溶液中，混匀；加入0.5M乙酸锌608μl，2M盐酸调节pH至8.01；放置摇床100转/分钟，室温条件25℃下结晶3h，然后转移至4℃条件下静置结晶18h。取结晶悬浮液在显微镜下放大160倍镜检，其结果如图6所示，可见晶体均一性较好，晶体颗粒较细。

实施例7

制备地特胰岛素结晶液，各组分浓度为：地特胰岛素4g/L、乙腈浓度7.5％(v/v)、柠檬酸三钠0.1M、乙酸铵0.05M、氯化钠0.2M、苯酚0.07％(w/v)，锌离子与地特胰岛素的摩尔比为4:1。

制备过程如下：称取地特胰岛素0.1g，加入25ml浓度为15％(v/v)的乙腈水溶液，2M氢氧化钠调节pH值至8.63，溶解完全，待用；配制盐溶液：二水合柠檬酸三钠1.47g，乙酸铵0.19g，氯化钠0.58g，6％苯酚水溶液583μl，加水溶解并定容至25ml，2M氢氧化钠调节pH值至8.59，加至25ml地特胰岛素溶液中，混匀；加入0.5M乙酸锌270μl，2M盐酸调节pH至8.11；放置摇床100转/分钟，室温条件25℃下结晶3h，然后转移至2℃条件下静置结晶18h。取取结晶悬浮液在显微镜下放大160下镜检，其结果如图7所示，可见晶体均一性较好，晶体颗粒粗。

实施例8

制备地特胰岛素结晶液，各组分浓度为：地特胰岛素3.2g/L，乙腈浓度7％(v/v)，柠檬酸三钠0.1M，乙酸铵0.05M，氯化钠0.2M，苯酚0.05％(w/v)，锌离子与地特胰岛素的摩尔比为3:1。

取含量为16.19g/L地特胰岛素纯化收集液25L，地特胰岛素总质量为404.75g，纯化收集液中乙腈浓度约为35％，往纯化收集液中加入75L水，2M氢氧化钠调节pH值至8.68，待用；配制盐溶液：二水合柠檬酸三纳3.68kg，乙酸铵0.48kg，氯化钠1.46kg，二水合乙酸锌45g，苯酚62.5g，加水溶解并定容至25L，用2M氢氧化钠调节pH值至8.59，加至已稀释好的纯化收集液中，搅拌均匀，用2M盐酸调节pH值至8.09；常温(26℃)下缓慢搅拌结晶6h，将温度降至4℃，静置结晶12h。取结晶上清进行HPLC检测，结晶上清中地特胰岛素的含量为0.01g/L，符合要求；取结晶悬浮液在显微镜下放大160倍镜检，其结果如图8所示，可见晶体均一性较好，晶体颗粒较粗。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种地特胰岛素结晶的制备方法，其特征在于包括如下步骤：在0.1～0.2M柠檬酸三钠体系，并且含体积百分比5～10％的有机溶剂的条件下，从含有地特胰岛素、锌离子、酚类物质及一定盐浓度的结晶液中，在pH8.0～8.5的条件下使地特胰岛素结晶。

2.根据权利要求1所述地特胰岛素结晶的制备方法，其特征在于包含如下步骤：

(1)配制含0.1～0.2M柠檬酸三钠、1～6g/L地特胰岛素、体积百分比5～10％的有机溶剂、0.05～0.5M盐、质量体积百分比0.005％～0.2％的酚类物质的结晶液；调节pH值至8.5～9.0，加入锌离子，锌离子的用量按锌离子与地特胰岛素按摩尔比(1.5～7):1计；

(2)调节含锌离子的结晶液的pH值至8.0～8.5，结晶3～6小时；

3.根据权利要求1或2所述地特胰岛素结晶的制备方法，其特征在于：所述的柠檬酸三钠在所述的结晶液中的浓度为0.1～0.15M。

4.根据权利要求1或2所述地特胰岛素结晶的制备方法，其特征在于：所述的有机溶剂为乙腈、乙醇和异丙醇中的一种或至少两种。

5.根据权利要求1或2所述地特胰岛素结晶的制备方法，其特征在于：所述的有机溶剂在所述的结晶液中的浓度为体积百分比7～10％。

6.根据权利要求1或2所述地特胰岛素结晶的制备方法，其特征在于：

所述的地特胰岛素为干燥/冻干固体粉末或纯化收集的液体样品中的一种；

所述的地特胰岛素在所述的结晶液中的浓度为2～4g/L。

7.根据权利要求1或2所述地特胰岛素结晶的制备方法，其特征在于：所述的锌离子来源于自乙酸锌、氯化锌、溴化锌、碘化锌、氧化锌和硫酸锌中的一种或至少两种。

8.根据权利要求1或2所述地特胰岛素结晶的制备方法，其特征在于：所述的酚类物质选自苯酚、间甲苯酚、邻甲苯酚、对甲苯酚、间苯二酚和对羟基苯甲酸甲脂中的一种或至少两种。

9.根据权利要求1或2所述地特胰岛素结晶的制备方法，其特征在于：所述的盐选自氯化钠、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐和乙酸铵中的一种或至少两种。

10.权利要求1～9任一项所述地特胰岛素结晶的制备方法在工业化制备地特胰岛素中的应用。