JPH0813274B2 - 遺伝子発現を検出及び変調する糖修飾されたオリゴヌクレオチド - Google Patents

遺伝子発現を検出及び変調する糖修飾されたオリゴヌクレオチド

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、アンチセンス・オリゴヌクレオチド療法、
診断及び研究試薬に有用なヌクレアーゼ耐性のオリゴヌ
クレオチドの設計、合成及び応用に関するものである。
ヌクレアーゼによる分解に耐性で、かつDNA及びRNAの活
性を変調することのできる、糖修飾されたオリゴヌクレ
オチドが提供される。本発明の修飾オリゴヌクレオチド
を用いた、タンパク質の生産を変調する方法も提供され
る。
発明の背景 感染状態を含む、哺乳類の身体状態の大部分が、タン
パク質によって影響されることは良く知られている。そ
うしたタンパク質は、直接あるいはその酵素的機能を通
して作用することにより、動物及びヒトの多数の病気に
大きく関与している。
古典的な治療法は一般に、その病気を起こす、あるい
は病気を起こし得る要素を緩和するために、これらのタ
ンパク質との相互作用に注目していた。しかし、最近で
は、その合成を支配する分子、即ち細胞内RNAとの相互
作用により、そうしたタンパク質の実際の合成を変調す
る試みがなされている。タンパク質の生産を干渉するこ
とにより、治療効果に最大の効果と最少の副作用を生じ
ることが望まれている。特異的な遺伝子発現を阻害する
ための一つの方法は、アンチセンス剤としてのオリゴヌ
クレオチド及びオリゴヌクレオチド類似体の使用であ
る。
アンチセンスの方法論は、比較的短いオリゴヌクレオ
チドを、１本鎖mRNAあるいは１本鎖DNAと相補的にハイ
ブリダイゼーションさせ、その結果、これらの細胞内に
ある核酸の正常かつ必須な機能が破壊されるというもの
である。ハイブリダイゼーションとは、オリゴヌクレオ
チドのRNAあるいは１本鎖DNAのワトソン−クリック塩基
対への、配列特異的な水素結合のことである。このよう
な塩基対は、互いに相補的であると言われる。
オリゴヌクレオチド：遺伝子発現のアンチセンス阻害剤
（Oligonucleotide:Antisense Inhibitor of Gene Expr
ession）、CRCプレス社、ボカ・ラートン、FL（1989）
で、コーエンによって述べられたように、核酸の機能破
壊を与えるような、自然に起こる出来事には２つのタイ
プがあると考えられている。その第一、即ちハイブリダ
イゼーション阻止は、オリゴヌクレオチド阻害剤が標的
核酸に結合し、その結果、単純な立体障害により必須の
タンパク質、大部分はリボソームが核酸に結合すること
を阻害する、終結反応を意味する。ホスホン酸メチルオ
リゴヌクレオチド;P.S.ミラー＆P.O.P. Ts′Ｏ、アン
チ−キャンサー・ドラッグ・デザイン（Anti−Cancer D
rug Design）、2:117−128（1987）及びα−アノマー・
オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション阻止に
よって核酸の機能を破壊すると考えられる、最も良く研
究された２種のアンチセンス剤である。
アンチセンス・オリグヌクレオチドによる第２のタイ
プの終結反応は、細胞内RNaseHによる標的RNAの酵素的
分解を含む。オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオ
チド類似体は、デオキシリボ型でなければならないが、
標的RNAにハイブリダイゼーションし、この複合体はRNa
seH酵素を活性化してRNA鎖を切断させるため、そのRNA
の正常な機能を破壊する。ホスホロチオレート・オリゴ
ヌクレオチドは、このタイプのアンチセンス終結反応に
よって作用するアンチセンス剤の最も顕著な例である。
重要な研究が、治療を目的にして、アンチセンス剤と
してのオリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド類似
体の応用に向けられている。診断薬、研究薬及び有力な
治療薬としてのオリゴヌクレオチドの全ての応用は、オ
リゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体が大
量に合成され、細胞膜を透過するか、あるいは細胞に取
り込まれ、標的RNAまたはDNAに適切にハイブリダイゼー
ションし、続いて核酸の機能を終結または破壊すること
を必要とする。これらの決定的な機能は、ヌクレアーゼ
による分解に対する、オリゴヌクレオチドの初期の安定
性に依存している。
これらの目的、とりわけアンチセンス療法に関するオ
リゴヌクレオチドの重大な欠陥は、細胞内及び細胞外に
局在し、以後「ヌクレアーゼ」と呼ばれる、種々の編在
する核酸分解酵素による、投与されたオリゴヌクレオチ
ドの酵素的分解である。非修飾の、即ち「野生型」のオ
リゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼによって直ちに分解
されるため、有用な治療薬とはならないだろう。従っ
て、ヌクレアーゼに対して耐性となるようなオリゴヌク
レオチドの修飾は、現在アンチセンス研究の第一の中心
である。
ヌクレアーゼ耐性を促進するためのオリゴヌクレオチ
ドの修飾は、これまで、もっぱら糖−リン酸骨格、特に
リン酸原子に対してなされてきた。ホスホロチオエー
ト、ホスホン酸メチル、ホスホイミジル酸及びホスホト
リエステル（リン酸メチル化DNA）は、さまざまなレベ
ルのヌクレアーゼに対する耐性を持つことが報告されて
いる。しかし、アンチセンス・オリゴヌクレオチドが特
異的なDNAあるいはRNAに正確な結合する能力は、アンチ
センス方法論にとって根本であるが、一方、修飾リン酸
を含むオリゴヌクレオチドは、さまざまな度合いのヌク
レアーゼ耐性を提供するとはいえ、ハイブリダイゼーシ
ョン特性の低下をもたらす。
リン酸原子のプロキラルな性質により、修飾リン酸オ
リゴヌクレオチドに内在するリン酸原子の修飾は、Rp及
びSp立体異性体を生ずる。立体配座の一定したオリゴヌ
クレオチド（全てRpあるいはSpのリン酸結合）の実用的
合成法が不明であるため、修飾リン酸原子を持つオリゴ
ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの長さあるいは塩
基数をｎとしたとき、n2個の異性体を持つ。更に、リン
酸原子への修飾は、糖−リン酸骨格の立体配座を妨げ、
その結果、２重鎖の安定性を妨害するような、ホスホジ
エステル結合に関して不自然な嵩高さを持つ。リン酸原
子の修飾の影響により、標的核酸に対して、同じ標的に
ハイブリダイゼーションする非修飾のオリゴヌクレオチ
ドよりも劣ったハイブリダイゼーションが起こる。
相補的核酸へ結合するオリゴヌクレオチドの相対的能
力は、特定のハイブリダイゼーション複合体の融解温度
を決定することによって比較される。融解温度（Tm）は
２重らせんの特徴的な物理的特性であり、コイル（非ハ
イブリダイゼーション）型に対して、50％のらせん型が
存在する摂氏温度を表わす。Tmはハイブリダイゼーショ
ンの成立と開裂（融解）を決定するために、UVスペクト
ルを用いて測定される。ハイブリダイゼーションの間に
起こる塩基の重なりに伴い、UV吸収の減少（淡色効果）
が起こる。従って、UV吸収の減少はより高いTmを意味す
る。Tmが高ければ高いほど、鎖の結合力も強い。非ワト
ソン−クリック塩基対合はTmに強い不安定効果を及ぼ
す。従って、塩基対合の完全な正確さが、標的RNAへの
アンチセンス・オリゴヌクレオチドの最適な結合に必須
である。
ホスホン酸メチル及びホスホロチオエートのハイブリ
ダイゼーション特性の有意な低下は、コーエンによって
報告されている。ホスホン酸メチルは、終結反応とし
て、RNAと形成された２重鎖がRNaseHによる分解を活性
化しない代わりに、リボソームに局在するらせん融解活
性によって打ち消され得るハイブリダイゼーション阻止
によって作用する点にもう一つの欠点がある。ホスホロ
チオエートは大部分のヌクレアーゼに対して高い耐性を
有する。しかし、ホスホロチオエートは、典型的な非ア
ンチセンス的な作用様式、特に非特異的な結合によるさ
まざまな酸素機能の阻害を示す。配列特異的オリゴヌク
レオチドによる酵素の阻害は、アンチセンス化学療法
の、まさしく基礎を危うくするものである。
従って、ヌクレアーゼに対する耐性を示す修飾オリゴ
ヌクレオチドは、RNaseH終結反応を活性化し、その標的
RNA（あるいはDNA）に対して、適切な強度と正確さを持
ってハイブリダイゼーションするために、アンチセンス
・オリゴヌクレオチド療法に強く所望されるものであ
る。
M.イケハラら、European Journal of Biochemistr
y 139:447−450（1984）は、１残基の２′−デオキシ
−２′−フルオログアノシンもしくは１残基の２′−デ
オキシ−２′−フルオロアデニンを含む、混合８量体の
合成を報告している。W.ガッシュルバウアー及びK.ヤン
コフスキー、Nucleic Acids Res. 8:1421（1980）
は、Ｎ型（３′−エンド、２′−エクソ）の寄与によ
り、２′−置換体の電気陰性度が増加することを示し
た。従って、２′−デオキシ−２′−フルオロウリジン
は、85％のC3′−エンド型を含んでいる。M.イケハラ
ら、はTetrhedron Letters 42: 4073（1979）で２
−′置換体の電機陰性度と一連の２−′デオキシ−アデ
ノシンの％Ｎコンホォメーションとの間に直線関係を表
した。Nucleic Acids Res. 5:1877（1978）は、化学
的に２′−デオキシ−２′−フルオロ−アデノシンを
５′−２リン酸に転換した。これは、続いて酵素的に重
合され、ポリ（２′−デオキシ−２′−フルオロアデニ
リル酸）が得られた。
更に、２′−置換型２′−デオキシアデノシン・ポリ
ヌクレオチドは、DNAよりもむしろ２本鎖RNAに似ている
ことを示す証拠が示された。M.イケハラら、Nucleic A
cids Res. 5:3315（1978）は、それぞれＵ、Ｃあるい
はＩ相補鎖と複合体を形成したポリＡ、ポリＩ及びポリ
Ｃにおける２′−フルオリン置換体が、標準的な融解ア
ッセイによって決定されたところによると、リボあるい
はデオキシ・ポリ２本鎖よりも明らかに安定であること
を示している。M.イケハラら、Nucleic Acids Res.
4:4249（1978）は、ポリ（２′−デオキシ−アデニリル
酸）内の２′−塩化または臭化置換体がヌクレアーゼ耐
性を与えることを示している。F.エックシュタインら、
Biochemistry 11:4336（1972）は、ポリ（２′−塩化
−２′−デオキシウリジル酸）及びポリ（２′−塩化−
２′−デオキシシチジル酸）が、種々のヌクレアーゼに
耐性であることを示している。H.イノウエら、Nucleic
Acids Res. 15:6131（1987）は、ヌクレオチド単位
ごとに２′−OMeを含む混合オリゴヌクレオチド配列の
合成について述べている。混合２′−OMe置換型配列
は、リボ−リボ複合鎖（RNA−RNA）と同じ強さで、その
リボオリゴヌクレオチド相補鎖にハイブリダイゼーショ
ンし、これは、同じ配列のリーボデオキシリボ・ヘテロ
２本鎖よりも明らかに強いものである（９量体につい
て、Tm、33.0℃に対し49.0及び50.1）。S.シバハラら、
Nucleic Acids Res.17:239（1987）は、ヌクレオチド
単位ごとに２′−OMeを含む混合オリゴヌクレオチド配
列の合成について述べている。混合２′−OMe置換型配
列は、HIVの複製を阻害するために設計された。
水素原子の性質に比べ、水酸基の立体効果と、その水
素結合能、及びその電気陰性度の複合効果が、RNAとDNA
の大きな構造的相違の原因である。温度融解研究によ
り、２′−メトキシ・オリゴヌクレオチド複合鎖の安定
性（ハイブリダイゼーション）の順位は、RNA−RNA、RN
A−DNA、DNA−DNAの順である。
数種の天然に存在するヌクレオチドの２′−デオキシ
−２′−ハロ、アジド、アミノ、メトキシ・ホモポリマ
ーは、ポリメラーゼ処理によって調製された。必要とさ
れる２′−修飾ヌクレオシド・モノマーは、核酸合成機
によってオリゴヌクレオチドに取り込まれた。従って、
それぞれの糖に２′−修飾を含む混合配列（配列特異的
な）オリゴヌクレオチドは、２′−デオキシ−２′−メ
トキシ類似体を除いて知られていない。
発明の目的 本研究の基本的な目的は、アンチセンス・オリゴヌク
レオチド診断、研究試薬及び治療に用いるため、ヌクレ
アーゼ耐性の、糖修飾オリゴヌクレオチドまたはオリゴ
ヌクレオチド類似体を提供することである。
本発明の別の目的は、DNAあるいはRNAの活性の変調に
有効な、そうしたオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌク
レオチド類似体を提供することである。
本研究の別の目的は、所望されないあるいは毒性の副
反応を招く可能性がより低い、そうしたオリゴヌクレオ
チドあるいはオリゴヌクレオチド類似体を提供すること
である。
本研究の更に別の目的は、動物の身体状態、特に病気
の状態をアッセイするための研究及び診断法、並びに材
料を提供することである。
本研究の更に別の目的は、DNA及びRNAの活性変調によ
り、病気の治療を行うための研究及び診断法、並びに材
料を提供することである。
これら及び他の目的は、本明細書及び添付の請求の範
囲を概観することによって、通常の技術を持った当業者
に明らかとなるだろう。
発明の要約 本発明は、RNAまたはDNAとハイブリダイズするヌクレ
アーゼ耐性化合物であって、それぞれリボースまたはデ
オキシリボース糖部分および塩基部分を含む、共有結合
により結合した複数のヌクレオシドを含み；前記ヌクレ
オシドは前記ヌクレオシドの塩基部分がRNA塩基配列ま
たはDNA塩基配列に相補的な混合塩基配列を形成するよ
うにヌクレオシド間結合により互いに連結しており；か
つ少なくとも２つの前記ヌクレオシドは２′−デオキシ
−２′−フルオロフラノシル部分を含むことを特徴とす
る化合物を提供する。好ましくは、本発明の化合物は少
なくとも１つの２′−デオキシ−２′−フルオロリボフ
ラノシル部分を有する。
本発明に従って、ヌクレアーゼ分解に耐性であるが、
DNA及びRNAの活性を変調する組成物が提供される。これ
らの組成物は、糖修飾されたオリゴヌクレオチドもしく
はオリゴヌクレオチド類似体からなり、その標的部分は
１本鎖あるいは２本鎖のDNAもしくはRNAの、あらかじめ
選ばれたヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイゼー
ションすることができる。糖修飾されたオリゴヌクレオ
チドは１本鎖DNA及びRNAを認識して２本鎖を形成する
か、もしくは２本鎖DNA及びRNAと３本鎖を形成する。
本発明のヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチドは、結
合基を介して互いに結合した核酸塩基の１本鎖からな
る。このヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチドの標的部
位は、約５から約50拡散塩基長の範囲をとることができ
る。しかし、本発明の好ましい態様に従い、約15塩基長
の標的配列が最適である。
核酸塩酸はチミン、ウラシルあるいはシトシンなどの
ピリミジンまたは、グアニンもしくはアデニンなどのプ
リン、またはその両者が特異的な配列に整列することが
できる。こうした塩基の糖部分は、デオキシリボースあ
るいはリボース型であることが可能である。塩基どうし
を連結する基は、通常の糖リン酸の核酸骨格であること
も可能だが、また、糖修飾されたオリゴヌクレオチドの
特性を更に促進するために、ホスホロチオエート、ホス
ホン酸メチルあるいはリン酸アルキル化団として、５′
−メチレン基及び／または環型糖の除去とともに修飾さ
れることができる。
本発明に従い、標的部分は少なくともヌクレオシド単
位の２′−デオキシ・リボフラノシル部分のひとつが修
飾されている、オリゴヌクレオチドの類似体である。水
素あるいは水酸基、ハロ、アジド、アミノ、メトキシあ
るいはアルキル基が添加され得る。たとえば、アルキル
はC1からC12の直鎖あるいは分岐鎖が使われることがで
き、炭素鎖には、特に勧められるアリロキシなどの不飽
和結合を含むところの、Ｈ、OH、Ｆ、CN、CF3、OCF3、O
CN、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、SOMe、SO2Me、ON
O2、NO2、N3、NH2、NH−アルキル、OCH2CH＝CH2（アリ
ロキシ）、OCH＝CH2、OCCHを用いることができる。
その結果得られる、新規なオリゴヌクレオチドまたは
オリゴヌクレオチド類似体はヌクレアーゼによる分解に
耐性であり、野生型（DNA−DNA及びRNA−DNA）複合鎖及
びホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホア
ミダイト及びホスホトリエステルを含む、リン酸修飾オ
リゴヌクレオチド・アンチセンス複合鎖に比べて高いハ
イブリダイゼーション特性を示す。
本発明はまた、次の考察に従って構成された組成物を
生物と接触させることからなる、生物によるタンパク質
の生産を変調する方法も対象とする。変調されるべきRN
AあるいはDNA部分は、その構成が変調されるべきタンパ
ク質をコードするDNAまたはRNAのその部分を含むため
に、あらかじめ選択されることが好ましい。従って、用
いられるべき組成物の標的部位は、あらかじめ選択され
たDNAあるいはRNA部分に相補的であるように選択され、
これは即ちその部分に対するアンチセンスオリゴヌクレ
オチドである。
本発明は、所望されないタンパク質の生産によって特
徴付けられる病気にかかった生物の処置法も対象とす
る。この方法は、次の考察に従った組成物を生物と接触
させることからなる。この組成物は、その生産が阻害さ
れるべきタンパク質をコードするメッセンジャーRNAに
特異的に結合するように設計されたものが好ましい。
本発明は更に、生物あるいは細胞内の異常なRNA分子
の存在の有無、あるいは正常型RNA分子の異常な発現ま
たは不適切な発現を検出するための診断法を対象とす
る。
本研究はまた、研究及び診断のためのRNAの選択的結
合に関する方法にも向けられている。このような選択的
で強力な結合は、他の既知のオリゴヌクレオチドまたは
オリゴヌクレオチド類似体いずれよりも分解性ヌクレア
ーゼに耐性であり、より強くハイブリダイゼーション
し、より高い正確さを有する本研究の組成物とこのよう
なRNAまたはDNAと相互作用することによって行われる。
以上に加え、本研究は２′−デオキシ−２′−置換型
ヌクレオシド、とりわけグアノシン化合物の合成法を対
象とする。本法に従い、グアノシンの２′−水酸基が最
初に酸化され、次に２′位の添加により還元され、その
結果９−（β−Ｄ−アラビノフラノシル）グアニンが得
られる。２′アラビノ水酸基は、脱離基によって誘導化
される。求核試薬を用いた脱離基の求核置換は、更に添
加することによって行われ、その結果２′−デオキシ−
２′−置換型グアノシン化合物が得られる。
好ましい態様の詳細な説明 本発明によるRNAあるいはDNA分子の活性変調に有用な
組成物は、一般にあらかじめ選択された１本鎖あるいは
２本鎖のDNAまたはRNA分子のヌクレオチド配列と特異的
にハイブリダイゼーションする標的配列を含み、ヌクレ
アーゼ耐性の糖修飾されたオリゴヌクレオチドからな
る。
一般に、その合成が最終的に変調されるか、または全
く阻害されるタンパク質の生産に関わるDNAもしくはRNA
の配列を選択することが所望される。組成物の標的部位
は、一般にオリゴヌクレオチド類似体である。これは既
知の方法論である固相合成法によって簡便に合成され、
あらかじめ選択されたRNAまたはDNAのヌクレオチド配列
に相補的な、あるいは少なくとも特異的に結合する。核
酸合成機は市販されており、所望されるであろう適当な
長さを持つほどの様なオリゴヌクレオチドを生産するに
も有効であることから、それらの利用は一般に当業にお
いて通常の技術を有した者によって理解されている。
本発明の文脈中、「オリゴヌクレオチド」という用語
は、天然のホスホジエステル結合により糖基を介して連
結された、天然に存在する塩基及びペントフラノシル基
由来の特異的配列に形成された、連結された多数のヌク
レオチド単位を意味する。これらのヌクレオチド単位と
しては、グアニン、アデニン、シトシン、チミンあるい
はウラシルなどの核酸塩基が可能である。糖基として
は、デオキシリボースまたはリボースが可能である。こ
の用語は、天然物または天然に存在するサブユニットか
ら作られた合成物どちらにも適用する。
本発明に関連して用いられる用語としての「オリゴヌ
クレオチド類似体」とは、オリゴヌクレオチドと同様に
機能する部分を示すが、非天然由来の部分を有する。オ
リゴヌクレオチド類似体は、改変された糖部分あるいは
糖間結合、たとえば当業における使用法が知られるホス
ホロチオエート及び他の含硫黄種を持つことができる。
オリゴヌクレオチド類似体は、また本発明の精神に合致
した改変を行った塩基あるいは他の修飾、特にアンチセ
ンス療法、診断または研究試薬としての、特定のオリゴ
ヌクレオチドの利用を促進するために、オリゴヌクレオ
チド組成物のヌクレアーゼ耐性を強化することができる
ような修飾を含むことができる。
ヌクレオチド塩基のいくつかの位置が、オリゴヌクレ
オチドの結合能力の完全さを保ったまま、組成物のヌク
レアーゼ耐性を増加させるために置換されることは、本
発明のいくつかの態様に用いるために一般に好ましい。
更に修飾されたオリゴヌクレオチドを用いることは、
本発明のいくつかの態様において好ましい。この場合、
修飾オリゴヌクレオチド類似体は一般に天然のオリゴヌ
クレオチドと似ているが、しかし一つあるいはそれ以上
の重要な方法で修飾されている構造を言う。
そうした修飾は、本発明の糖骨格で起きるだろう。糖
修飾されたオリゴヌクレオチドの標的配列が、全組成物
の標的であるメッセンジャーRNAあるいはDNAが存在する
細胞の細胞内空間へ透過してゆく能力を増強することが
一般に好ましい。従って、オリゴヌクレオチドの細胞内
への透過を促進するために、天然型よりも実質的にイオ
ン強度が弱くなるようなオリゴヌクレオチドの修飾が提
供されることが一般に好ましい。この目標を達成するた
めの既存の方法あるいは発見されるべき方法のいずれ
も、本発明の実施にともなって用いることができる。現
在、置換が天然に存在する結合よりも相対的にイオン強
度が弱いだけでなく、また実質的に非キラル型であると
ころの、ホスホジエステル結合の置換を用いることが好
ましいが見いだされている。
理解されるであろう様に、ホスホジエステル結合のリ
ン酸原子は「プロ−キラル」である。ホスホン酸メチル
及びホスホロチオエートタイプのオリゴヌクレオチドで
なされたのと同様な、リン酸における修飾は、基本的に
はキラル構造を生ずる。キラリティーは、細胞の分子と
異なった相互作用をする事のできる、それぞれのキラル
中心に関して２つの異性体の存在をもたらす。こうし
た、分離されていない異性体の混合物は、生じた化合物
を細胞内空間への輸送を阻害するか、あるいは特異的な
標的RNAまたはDNAに対するハイブリダイゼーションの親
和性及び特異性を減少させるかも知れない。従って、本
発明のいくつかの態様において、実質的に非イオン性
で、実質的に非キラルな物をホスホジエステル結合のい
くつかあるいは全ての代わりの用いることが好ましい。
このために、短鎖のアルキルもしくはシクロアルキル構
造、特にC2−C4構造が好ましい。同日付けで本出願とと
もに出願され、かつ本出願の共通の受託者に受託され
た、「細胞により取り込みを促進するためのポリアミン
・オリゴヌクレオチド」、出願番号第558,663号、1990
年７月27日出願（代理人要録ISIS−24）と題された該出
願に述べられるように、酸素の機能の一つを除くことを
含む糖構造の修飾がそのような実質的に非キラルで非イ
オン性の置換体をこの部位に導入することを可能とす
る。出願番号第558,663号で開示される全ては、このよ
うな修飾を更に完全に開示するために、ここに参考文献
として取り入れられている。
ＰをＳ、Me−Ｐ、MeO−Ｐ、H2N−Ｐなどに置換するよ
うな、標準的な骨格の修飾は、本発明の目標と一致して
いる。これらの置換は、いくつかの場合、糖修飾オリゴ
ヌクレオチドの特性を促進すると考えられる。
本発明の組成物の標的部位は５から約50塩基単位を有
するオリゴヌクレオチド類似体が好ましい。こうした機
能単位が８から約40塩基単位を持つことがより好まし
く、また約12から20塩基単位が用いられれば更に好まし
い。約15塩基単位を持つオリゴヌクレオチドまたはオリ
ゴヌクレオチド類似体は、本発明の特定の態様を実施す
るために好ましい。
標的部位は、変調するために選択されたRNAあるいはD
NAの、あらかじめ選ばれたヌクレオチド配列と特異的に
ハイブリダイゼーションすることができるように適合さ
れることが所望される。本発明の一つまたはそれ以上の
態様の実施に特に適したオリゴヌクレオチド類似体は、
ヌクレオシド単位の２′−デオキシ・リボフラノシル団
の一つあるいはそれ以上が、水素または水酸基、ハロ、
アジド、アミノ、アルキロキシ、チオアルコキシ、アル
キルアミノまたはアルキル基で修飾された２′−糖修飾
オリゴヌクレオチドを含む。たとえば、実施可能な置換
は、アルキルがC1からC12の直鎖あるいは分岐鎖であ
り、その炭素鎖にアリロキシなどの不飽和結合を含むと
ころの、Ｈ、OH、Ｆ、CN、CF3、OCF3、OCN、Ｏ−アルキ
ル、Ｓ−アルキル、SOMe、SO2Me、ONO2、NO2、N3、N
H2、NH−アルキル、OCH＝CH2、OCCHを含む。
これらの修飾塩基は、糖連結基を介して互いに連結さ
れ、またオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド
類似体の残りに結合される。連結基は、オリゴヌクレオ
チドの糖団を互いに連結して本発明の組成物の標的部位
を形成できる、本明細書記載のこれらの構造の任意のも
のである。これらの連結基がホスホジエステル構造もし
くはその誘導体からなることが好ましい。ホスホジエス
テル構造の誘導体とは、酸素を硫黄やメチル、メチルオ
キシドなどのアルコキシ基あるいはアミン基と置換した
のを含んでも良い。糖リン酸核酸骨格は、ホスホチオエ
ート、メチルホスホネートあるいはリン酸アルキル化団
（ホスホトリエステル）などのアルキルホスホネートと
して修飾されても良い。ホスホジエステル結合もまた、
炭素もしくはエーテル結合によって置換されることがで
きる。
本発明の別の態様において、連結団は修飾オリゴヌク
レオチドの３′−端の末端部位に、修飾単位が直接連結
できるように工夫されている。従って、エステルまた
は、より好ましくはブロモメチルケト基が、ジメトキシ
トリフェニルメチル基で保護され、もし複素環がシトシ
ン系であれば、ベンゾイル保護基で保護された複素環を
有する、５′−ヒドロキシルを持つ２′−修飾ヌクレオ
シドの３′−ヒドロキシルに連結される。もし所望され
た標的配列が末端に３′−チミンあるいはシトシン塩基
を有する場合、ブロモメチルケト・リンカーを含んだ、
所望される修飾チミンまたはシトシン塩基は、その３′
−水酸基を介して結合した正常なヌクレオシドを含む、
コントロール・ポア・ガラス（CPG）固相担体に連結す
るための、最初の単量体として用いられるだろう。CPG
に連結したヌクレオシドに２′−修飾ヌクレオシドを結
合する、塩基感受性エステル結合は、CPG担体からオリ
ゴヌクレオチドをはずすために用いられる通常の濃アン
モニア水存在下で切断される。これにより、修飾オリゴ
ヌクレオチドがその末端である３′−端に２′−修飾単
位を持つことができるだろう。
核酸分解酵素によるオリゴヌクレオチドの切断は、酵
素−基質複合体の形成、あるいは特にヌクレアーゼ−オ
リゴヌクレオチド複合体の形成を必要とする。ヌクレア
ーゼ酵素は、一般に適切な結合のためにオリゴヌクレオ
チド上に存在する特異的な結合部位を必要とするだろ
う。もし、ヌクレアーゼがオリゴヌクレオチドに結合し
ないようにオリゴヌクレオチド結合部位が除去される
か、妨害されれば、ヌクレアーゼ耐性のオリゴヌクレオ
チドができる。配列特異的な回文２本鎖DNAを切断する
制限酵素の場合、３−及び７−位にある環内窒素などの
特定の結合部位が、必要とされる結合部位として同定さ
れた。これらの部位の一つあるいはそれ以上の除去ある
いは、認識配列内のこれら特定部位へのヌクレアーゼの
接近を妨害することは、特異的なヌクレアーゼに対す
る、さまざまな程度の耐性を提供する。
本発明は、優れたハイブリダイゼーション特性によっ
て特徴付けられるアンチセンス・オリゴヌクレオチドを
提供する。我々は、構造と活性の相互作用研究から、そ
のRNA標的（相補的）に対する特定の２′−糖修飾オリ
ゴヌクレオチドの結合（Tm）ｓの顕著な増加が、ヘテロ
２本鎖の「Ａ」型の立体配座の増加と相関があることを
発見した。さらに修飾オリゴヌクレオチドの絶対的な正
確さが維持される。我々の２′−糖修飾された配列特異
的なオリゴヌクレオチドは、文献で知られるようなホス
ホン酸メチル、ホスホチオエート、リン酸トリエステル
及びホスホアミダイトよりも優れた能力及び特異性を提
供する。
DNA及びRNA2本鎖の唯一の構造的相違は、（ウラシル
環系のメチル基の有無は影響がないと仮定して）DNAリ
ボフラノシル団の２′−位には水素原子があるのに対
し、RNAリボフラノシル団の２′−位に水酸基があるこ
とである。しかし、DNA及びRNA2本鎖の間には大きな立
体配座的相違が存在する。
核酸線維のＸ−線回折分析、アーノットとフーキン
ス、Biochemical and Biophysical Research Commu
nication, 47:1504−1510（1979）及び２本鎖核酸の結
晶解析から、DNAが「Ｂ」型構造をとり、RNAのみがずっ
と堅い「Ａ」型構造をとることが知られている。DNA及
びRNAのヌクレオシド単量体単位の糖の襞部分（「Ｂ」
型DNAのC2′エンド及びＡ−型RNAのC3′エンド）の相違
は、２本鎖核酸の間の主要な立体配座の違いである。
ペントフラノシル団の立体配座に対しておもに寄与す
る要因は、２′−位における置換の性質である。従っ
て、２′−置換体の電気陰性度が増加するにつれて、C
3′−エンド型の数はC2′−エンド型に関して増加す
る。たとえば、２′−デオキシ−２′−ハロ−アデニン
ヌクレオシドの内、２′−フルオロ誘導体はC3′−エン
ド型の最大の割合（65％）を示し、２′−ヨード型は最
少の割合（７％）を示す。アデノシン（２′−OH）及び
デオキシアデノシン（２′−Ｈ）の割合は、それぞれ36
％と19％である。更に、アデニン・ジヌクレオチド
（２′−デオキシ−２′−フルオロアデノシン−２′−
デオキシ−２′−フルオロアデノシンまたはウリジン）
の２′−フルオロ基の影響は、リボまたはデオキシリボ
修飾２量体よりも更に強く、重なり立体配座の安定性に
相関する。研究により、ジヌクレオシドリン酸は、幾何
学的にはＡ−Ａの重なり立体配座に似ているが、しかし
Ａ−Ａよりもより強く塩基−塩基間の重なりを持つこと
が示されている。C2′−Ｆ結合の、高い極性のある性質
及びC3′−エンドのパッカリングに対する、極端な選択
性が「Ａ」構造の重なり立体配座を安定化できるのだろ
うと推測されている。
UV淡色効果、円偏光２色性及び1H NMRのデータもま
たハロゲンの電気陰性度が低下するにともなって、重な
りの度合いも低下することを示している。更に、２′−
位における立体的な大きさは、「Ｂ」型の２本鎖よりも
「Ａ」型の２本鎖においてより良く変調されている。
従って、ジヌクレオシド１リン酸の３′−ヌクレオチ
ジル単位上の２′−置換体は、重なり立体配座：即ち立
体相反、フラノース・パッカリング選択性、静電気的相
反、疎水的吸引及び水素係合能などに多くの影響を与え
ると考えられる。これらの置換体の影響は、置換体の分
子サイズ、電気陰性度及び疎水性によって決定されると
考えられている。
２′−ヨード置換されたヌクレオシドは、ハロゲン類
の中では最も低い割合（７％）の３′−エンド型を持
つ。従って、立体効果だけでは、２′−ヨードあるいは
同様の基が重なりによる不安定性と、それによるアンチ
センス・オリゴヌクレオチドに関する結合（Tm）ｓの低
下に寄与すると考えるだろう。しかし、ヨウ素原子とそ
れと同様の基の低い電気陰性度及び高い疎水性による吸
引力は、重なり安定化及び結合強度の予想を複雑にす
る。
２′−デオキシグアノシン、シチジン及びウリジジヌ
クレオチドリン酸の２′−OMe修飾に関する研究は、そ
れらに相当する非メチル化種（２′−OH）に関して重な
り効果の促進を示す。この場合、メチル基の疎水性吸引
力はその立体的大きさ（障害）の不安定効果を打ち消す
傾向がある。
２′−フルオロ−２′−デオキシアデノシンは、ヌク
レオシドの間に異常に高い割合の３′−エンド，パッカ
リングを持つことが決められている。アデノシン、２′
−デオキシアデノシン及びその他の誘導体は、一般に
３′−エンド型配座異性体の40％以下を占める。しっか
りと重なったオリゴヌクレオチドのヌクレオシド残基
は、３′−エンド・リボフラノース・パッカリングを好
むことが知られている。
融解温度（相補的結合）は、２′−置換型アデノシン
２リン酸によって上昇する。立体配座の３′−エンド選
択性あるいは置換体の存在が、係合の増加によるものな
のかは明らかでない。しかし、述べられているように、
隣接した塩基とのより多くの重なり（スタッキング）
は、３′−エンド型立体配座でなされ得る。
より強い結合を得るための現在の新規な試みは、標的
RNAへ結合するアンチセンスRNA構造を調製することであ
る。従って、任意の構造−活性相関関係に関する研究法
は、適切なハアイブリダイゼーション特性を維持した、
ヌクレアーゼ耐性のオリゴヌクレオチドを見いだすため
に行われた。
アデニン、グアニン、シトシン、チミジン及びこれら
の塩基の特定の類似体の一連の２′−デオキシ−２′−
修飾ヌクレオシドが調製され、固相核酸合成法によって
配列特異的なオリゴヌクレオチドに、修飾ヌクレオシド
として挿入された。新規なアンチセンスオリゴヌクレオ
チドは、ヌクレアーゼによる分解に対する耐性及び、非
修飾の親型オリゴヌクレオチドに匹敵するハイブリダイ
ゼーション特性を有するかについてアッセイされた。初
めは、小さな電気陰性原子あるいは基が、必要とされる
ワトソン−クリック塩基対合の水素結合（ハイブリダイ
ゼーション）を立体的に妨害しないであろう故に選ばれ
た。しかし、２′−位の原子あるいは基の電気陰性度に
よる電気的変化は、糖の立体配座にもっぱら影響を与え
ることができる。構造と活性の相関関係に関する研究を
行う間に、我々は糖修飾オリゴヌクレオチドは、非修飾
のもの（２′−デオキシリボシル型）よりも強く標的RN
Aにハイブリダイゼーションする事を見いだされた。
２′−置換型オリゴヌクレオチドは、アプライド・バ
イオシステム社380Bあるいは内蔵型ミリジェン／バイオ
サーチ7500または8800などの標準的な固相、自動核酸合
成機によって合成される。トリエステル、ホスホアミダ
イトあるいはホスホン酸水素カップリング化学（オリゴ
ヌクレオチド．遺伝子発現のアンチセンス阻害剤． M.
Caruthers、pp7−24、J.S.コーエン編、CRC出版社．
ボカ・ラートン、フロリダ、1989）が、所望のオリゴヌ
クレオチドを提供するために、これらの合成機とともに
用いられた。ビュウケイジ試薬（Journal of America
n Chemical Society、112、1253−1255、1990）ある
いは硫黄要素（S.ビュウケイジら、Tetrahedron Lette
rs、22、1859−1862、1981）が、ホスホアミダイトまた
はホスホン酸水素化学とともに、２′−置換型ホスホチ
オエートオリゴヌクレオチドを提供するために用いられ
た。
必要とされる２′−置換型ヌクレオシド（Ａ、Ｇ、
Ｃ、Ｔ（Ｕ）及び核酸塩基類似体）は、一般に下記のい
くつかの文献的方法の修飾によって調製される。
方法1. アラビノ・プリン・ヌクレオシドの２′−脱離
基の求核置換。アデニン、グアニンまたはそれらの類似
体ヌクレオシドの、２′−上位の脱離基（２′−デオキ
シ−２′−（脱離基）アラビノ糖）の求核置換。このタ
イプの一般的な合成法は、M.イケハラら、Tetrahedro
n、34、1133−1138（1978）；同雑誌、31:1369−1372
（1975）;Cehmistry and Pharmaceutical Bulleti
n、26:2449−2453（1978）；同雑誌、26:240−244（197
8）;M.イケハラ、Accounts of Chemical Research、
2:47−53（1969）；及びR.ランガナーサン、Tetrahedro
n Letters、15:1291−1294（1977）によって述べられ
ている。
方法2. 2,2′−アンヒドロ・ピリミジンの求核置換。
ヌクレオシドのチミン、ウラシル、シトシンあるいはそ
れらの類似体は、J.J.フォックスら、Journal of Org
anic Chemistry、29:558−564（1964）の記載に従い、
2,2′−シクロアンヒドロ・ヌクレオシドを仲介して
２′−置換型ヌクレオシドに転換される。
方法3. ２′−カップリング反応。保護されない２′−
水酸基を持つ、適切に３′,5′−糖及び塩基で保護され
たプリン及びピリミジン・ヌクレオシドは、ヨウ化メチ
ルやジアゾメタンなどの求電子試薬とカップルされ、
２′−OMe基を含む混合配列を提供する。H.イノウエ
ら、Nucleic Acids Research 15:6131−6148。
方法4. ２−デオキシ−２−置換型リボシル化。適切に
保護された核酸塩基及び核酸塩基類似体の２−置換型−
２−デオキシリボシル化は、E.T.ヤーヴィら、Nucleosi
des ＆ Nucleotides 8:1111−1114（1989）及びL.W.
ハーテルら、Journal of Organic Chemistry 53:24
06−2409（1988）によって報告されている。
方法5. ２′−デオキシ−２′−置換型ヌクレオシドの
酵素による合成。ピリミジン及びプリンリボもしくはデ
オキシリボリン酸化の助けを受けた、一つのヌクレオシ
ドから別のヌクレオシドへの２−デオキシ−２−置換型
グリコシル転移は、J.R.リドウトとT.A.クレニツキー、
米国特許第4,381,344号（1983）によって述べられてい
る。
方法6. ２′−置換体の、新たな置換体への転換。２′
−置換型−２′−デオキシヌクレオシドは、標準的な化
学的操作により新たな置換体へ転換される。たとえば、
S.クラデックら、Journal of Carbohydrates、Nucles
ides ＆ Nucleotides 7:63−75（1980）は、アラビ
ノフラノシルアデニンから調製された２′−デオキシ−
２′−アジドアデノシンの、２′−デオキシ−２′−ア
ミノアデノシンへの転換について述べている。
方法7. 遊離ラジカル反応。遊離ラジカル反応による、
ハロゲン置換型ヌクレオシドの２′−デオキシ−２′−
置換型ヌクレオシドへの転換は、K.E.B.パークスとK.テ
イラー、Tetrahedron Letters、29:2995−2996（198
8）によって述べられている。
方法8. リボヌクレオシドの２′−デオキシ−２′−置
換型ヌクレオシドへの転換。保護されない２′−水酸基
を持つ、適切に３′,5′−糖及び塩基保護されたプリン
及びピリミジンヌクレオシドは、２′−ケト基への酸
化、求核試薬との反応及び最終的な２′−デオキシ生成
という処理によって、２′−デオキシ−２′−置換型ヌ
クレオシドに転換される。このタイプの方法は、F.ドゥ
・ラ・ハラら、Tetrahedron Letters、29:941−944（1
988）によって述べられている。
方法9. 本発明の好ましい処理法において、２′−デオ
キシ−置換型グアノシン化合物は、酸化−還元反応を介
して得られたｎ（アラビノフラノシル）グアニン中間体
を経て調製される。中間体であるアラビノ化合物のアラ
ビノフラノシル糖団の２′位にある脱離基は、適当な求
核試薬を用いたSN2反応により置換される。従って、こ
の方法は上述の方法１と方法８の原理を取り入れてい
る。２′−デオキシ−２′−フルオログアノシンは、こ
の方法を経て調製されるのが好ましい。中間型のアラビ
ノ化合物は、ハンスケ、F.、マデ、D.及びロビンス、R.
J.（1984）、Tetrahedron、40:125の酸化還元反応の変
法を用いて得られた。本発明に従い、還元反応は−78℃
から実行され、この還元反応は約−２℃まで外部温度に
よる温度上昇が許される。これにより、中間型アラビノ
化合物が高収量で得られる。
低温還元反応の使用と併せて、開始材料のグアノシン
化合物の３′及び５′位に対するテトライソプロピルジ
シロキサンブロッキング基（「TPDS」基）の利用は、酸
化及び還元に続くリボ化合物に対する中間型アラビノ化
合物の割合を改善することに寄与する。酸化／還元に続
き、中間型アラビノ化合物のN2グアニンアミノ窒素及び
２′−水酸基は、イソブチリル保護基（「Ibu」基）で
ブロッキングされる。テトライソプロピルジシロキサン
ブロッキング基は除去され、３′及び５′水酸基は、更
に第２のブロッキング基であるテトラヒドロピラニルブ
ロッキング基（「THP」基）で保護される。イソブチリ
ル基は２′−水酸基から選択的に除去され、続いてトリ
フレート（トリフルオロメチルスルフォニル）脱離基を
用いた２′位の誘導化がなされる。次にトリフレート団
は、２′位に関する反転により置換され、所望の２′−
デオキシ−２′−フルオログアノシン化合物が得られ
る。
トリフレート脱離基に加え、他の脱離基はアルキルス
ルフォニル、置換型アルキルスルフォニル、アリ−ルス
ルフォニル、置換型アリ−ルスルフォニル、ヘテロシク
ロスルフォニルあるいはトリクロロアセチミジル酸を含
むが、しかし必ずしもこれに限定されない。代表的な例
には、ｐ−（2,4−ジニトロアニリノ）ベンゼンスルフ
ォニル、ベンゼンスルフォニル、メチルスルフォニル、
ｐ−メチルベンゼンスルホニル、Ｐ−ブロモ−ベンゼン
スルホニル、トリクロロアセチミジル酸、アクリロキ
シ、2,2,2−トリフルオロ−エタンスルフォニル、イミ
ダゾールスルフォニル及び2,4,6−トリクロロフェニル
が含まれる。
グアニン環のN2ヘテロシクリック・アミノ団に残るイ
ソブチリル基は、完全に脱ブロッキングされたヌクレオ
シドを得るために除かれ得るが；しかし、オリゴヌクレ
オチドへの２′−デオキシ−２′−置換型化合物の取り
込みには、N2イソブチリル保護基の脱ブロッキングは、
オリゴヌクレオチド合成が完了するまで延期されること
が好ましい。通常、自動核酸合成機で使用するには、イ
ソブチリル基によるN2グアニン・アミノ団のブロッキン
グが好ましい。従って、簡便のために、本発明の方法か
ら得られるN2−イソブチリルブロッキングされた２′−
デオキシ−２′−置換型アデノシン化合物は、自動核酸
合成機におけるオリゴヌクレオチドで直接使用すること
ができる。
本発明のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチ
ド類似体は診断、治療において利用可能であり、また研
究試薬やキットとして用いることができる。治療で用い
る場合、オリゴヌクレオチドはいくつかのタンパク質に
よって影響を受ける病気にかかった動物に投与される。
その病気の症状を緩和するために有効な量のオリゴヌク
レオチドを、病気にかかっていると疑われる患者に投与
することが好ましい。こうした処置法のための最適な投
薬量及び処置計画の決定は、当業者の技術範囲内にあ
る。
本発明に従い、治療薬を経口、静脈内あるいは筋肉内
などの内用として適用することが好ましい。経皮的、局
所的あるいは患部内などへの、別の投薬様式も有用であ
ろう。座薬への包含もまた有用であろう。また、医薬的
に許容される担体の使用もいくつかの態様においては有
用である。
以下の実施例は、本発明の実際を述べている。
実施例１− ２′−デオキシ−２′−フルオロ修飾され
たオリゴヌクレオチドの調製。
A.N6−ベンゾイル−［２′−デオキシ−２′−フルオロ
−５′−Ｏ−（4,4′−ジメトキシトリチル）］アデノ
シン−３′−Ｏ−（N,N−ジイソプロピル−β−シアノ
エチル・ホスホアミダイト。
N6−ベンゾイル−９−（２′−フルオロ−β−Ｄ−リ
ボフラノシル）アデニンは、M.イケハラら、Nucleoside
s and Nucleotides 2:373−385（1983）によって報
告された方法の修飾法を用いた、５段階の合成によって
９−β−Ｄ−アラビノフラノシルアデニンから調製され
た。従って、N6−ベンゾイル誘導体は、クロロトリメチ
ルシランによる一過的な保護法を用い、高収率で得られ
た。R.A.ジョーンズ、J.Am.Chem.Soc. 104:1316（198
2）。テトラヒドロピラニル（THP）によるN6−ベンゾイ
ル−９−β−Ｄ−アラビノフラノシルアデニンの３′−
及び５′−水酸基の選択的な保護は、文献の方法、即ち
G.バトケら、Nucleic Acid Cehmistry、第３部:149−
152、タウンセンド、L.B.及びティプソン、R.S.編（J.
ワイリー・アンド・サンズ社、ニューヨーク1986）の修
飾法によって行われ、高収量でN6−ベンゾイル−９−
［３′,5′−ジ−Ｏ−（テトラヒドロピラン−２−イ
ル）−β−Ｄ−アラビノ・フラノシル］アデニンが得ら
れた。ジクロロメタン中での、無水トリフルオロメタン
スルホン酸を用いたN6−ベンゾイル−９−［３′,5′−
ジ−Ｏ−（テトラヒドロピラン−２−イル）−β−Ｄ−
アラビノ・フラノシル］アデニンの処理により、その不
安定性から単離されていない２′−トリフレート誘導体
であるN6−ベンゾイル−９−［２′−Ｏ−トリフルオロ
メチルスルホニル−３′,5′−ジ−Ｏ−テトラヒドロピ
ラン−２−イル）−β−Ｄ−アラビノフラノシル］アデ
ニンが得られた。２′−トリフレート基の置換は、テト
ラヒドロフラン中でのフッ化テトラブチルアンモニウム
との反応によってなされ、適当量の２′−フッ化誘導体
であるN6−ベンゾイル−９−［２′−フルオロ−３′,
5′−ジ−Ｏ−（テトラヒドロピラン−２−イル）−β
−Ｄ−アラビノフラノシル］アデニンが得られた。N6−
ベンゾイル−９−［２′−フルオロ−３′,5′−ジ−Ｏ
−（テトラヒドロピラン−２−イル）−β−Ｄ−アラビ
ノフラノシル］アデニンのTHP基の脱保護は、メタノー
ル中においてDowex−50Wで処理することによって行わ
れ、適当な収量のN6−ベンゾイル−９−（２′−デオキ
シ−２′−フルオロ−β−Ｄ−リボフラノシル）アデニ
ンが得られた。６の1H−NMRスペクトルは文献値と一致
した。M.イケハラとH.ミキ、Chem.Pharm.Bull. 26:244
9−2453（1978）。標準的な方法論が、５′−ジメトキ
シトリチル−３′−ホスホアミダイト中間体であるN6−
ベンゾイル−９−［２′−フルオロ−５′−Ｏ−（4,
4′−ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−リボフラノシ
ル］アデニン及び、N6−ベンゾイル−９−［２′−デオ
キシ−２′−フルオロ−５′−Ｏ−（4,4′−ジメトキ
シトリチル）］アデノシン−３′−Ｏ−（N,N−ジイソ
プロピル−β−シアノエチルホスホアミダイトを得るた
めに用いられた。K.K.オギルヴィ、Can J. Chem. 6
7:831−839（1989）。
B. N6−ベンゾイル−９−β−Ｄ−アラビノフラノシル
アデニン。
９−β−Ｄ−アラビノフラノシルアデニン（1.07g、
4.00m.mol）を、アルゴンガス中で無水ピリジン（20m
l）及び無水ジメチルホルムアミド（20mL）に溶解し
た。この溶液は氷温まで冷やされ、クロロトリメチルシ
ラン（3.88ml、30.6m.mol）が注射器によってゆっくり
と反応混液に加えられた。氷温で30分間反応混液を攪拌
した後、塩化ベンゾイル（2.32ml、20m.mol）がゆっく
りと加えられた。この反応混液は20℃に暖められ、２時
間攪拌された。この反応混液を氷温まで冷やした後、冷
水（8ml）が添加され、この混合液は15分間攪拌され
た。アンモニアが終濃度2Mになるように、この反応混液
に濃水酸化アンモニウム水（8ml）がゆっくりと加えら
れた。この冷反応混液を30分間攪拌した後、溶媒は20℃
で真空（60torr）蒸発乾燥され、続いて40℃で真空（1t
orr）蒸発乾燥され、油性物が得られた。この油性物を
ジメチル・エーテル（50ml）で粉末化し、過され、ジ
メチル・エーテルで３回洗われた固形物が得られる。こ
の粗固形物は還流温度においてメタノール（100ml）中
で３回粉末化され、溶媒が蒸発乾燥されて、固形物とし
てN6−ベゾイル−９−β−Ｄ−アラビノフラノシルアデ
ニンが生じた（1.5g,100％）。
C. N6−ベンゾイル−９−［３″,5″−ジ−）テトラヒ
ドロピラン−２−イル）−Ｄ−アラビノフラノシル］ア
デニン。
N6−ベンゾイル−９−（β−Ｄ−アラビノフラノシ
ル）アデニン（2.62g、7.06m.mol）は、アルゴンガス中
で無水ジメチルホルムアミド（150ml）に溶解され、ｐ
−トルエスルホン酸１水和物（1.32g、6.92m.mol）が添
加された。この溶液は氷温まで冷やされ、ジヒドロピラ
ン（1.26ml、13.8m.mol）が注射器によって加えられ
た。この反応混液は20℃まで暖められた。５時間にわた
って、合計10倍相当量のジヒドロピランが記載された様
にして２倍相当量ごとに加えられた。この反応混液は氷
温まで冷却され、飽和炭酸ナトリウム溶液がpH8になる
までゆっくりと添加され、次に水が750mlとなるように
添加された。この水性混合液は、塩化メチレンで４回
（４×200ml）抽出され、有機層をまとめて硫酸マグネ
シウム上で乾燥させた。固形物は過され、溶媒は30℃
で真空（60torr）蒸発乾燥されて少量の液体になり、こ
れは40℃で真空（1torr）蒸発乾燥されて油性物を生じ
た。この油性物は40℃でｐ−キシレンと共に真空乾燥さ
れて油性物を生じ、これは塩化メチレン（100ml）に溶
解された。ヘキサン（200ml）が溶液に加えられ、低沸
点溶媒は30℃で真空蒸発乾燥され、ヘキサンに懸濁され
た白色の固形物が残った。この固形物は過され、ヘキ
サンで３回（３×10ml）洗われた後、シリカを用いたカ
ラムクロマトグラフィーにより、塩化メチレン−メタノ
ール（93:7、v/v）を溶出剤として精製された。最初の
画分からは、白色の泡（3.19g、83％）として化合物３
と名付けられた化合物が得られ、２番目の画分からは白
色の泡（0.81g）が得られ、これはN6−ベンゾイル−９
−（β−Ｄ−アラビノフラシル）アデニンの５′−モノ
−テトラヒドロピラニル誘導体と同定された。
D. N6−ベンゾイル−９−［２′−Ｏ−トリフルオロメ
チルスルホニル−３′,5′−ジ−Ｏ−（テトラヒドロピ
ラン−２−イル）−β−Ｄ−アラビノフラノシル］アデ
ニン。
N6−ベンゾイル−９−［３′,5′−ジ−Ｏ−（テトラ
ヒドロピラン−２−イル）−Ｄ−アラビノフラノシル］
アデニン（2.65g、4.91m.mol）は無水ピリジン（20ml）
に溶解され、溶媒は40℃で真空（1mmHg）蒸発乾燥され
た。これによって生じた油性物は、アルゴンガス中で無
水塩化メチレン（130ml）に溶解され、無水ピリジン
（3.34ml、41.3m.mol）及びN,N−ジメチルアミノピリジ
ン（1.95g、16.0mmol）が添加された。この反応混合液
は氷温まで冷却され、無水トリフルオロメタンスルホン
酸（1.36ml、8.05mmol）が注射器によってゆっくりと加
えられた。氷温で１時間この反応混合液を攪拌した後、
冷飽和重炭酸ナトリウム溶液（140ml）に注がれた。こ
の混合液を振盪し、有機層を分離して氷温に保った。水
層はさらに２回（２×140ml）塩化メチレンで抽出され
た。注意深く低温に保たれた有機抽出物をまとめ、硫酸
マグネシウム上で乾燥した。溶媒は、20℃で真空（60to
rr）蒸発乾燥され、次に20℃で真空（1torr）蒸発乾燥
されて、粗油性物としてN6−ベンゾイル−９−［２′−
Ｏ−トリフルオロメチルスルホニル−３′,5′−ジ−Ｏ
−（テトラヒドロピラン−２−イル）−β−Ｄ−アラビ
ノフラノシル］アデニンが得られ、これはそれ以上精製
されなかった。
E. N6−ベンゾイル−９−［２′−フルオロ−３′,5′
−ジ−Ｏ−（テトラヒドロピラン−２−イル）−β−Ｄ
−アラビノフラノシル］アデニン。
粗油性物状のN6−ベンゾイル−９−［２′−Ｏ−トリ
フルオロメチルスルホニル−３′,5′−ジ−Ｏ−（テト
ラヒドロピラン−２−イル）−β−Ｄ−アラビノフラノ
シル］アデニン（＜4.9mmol）は、無水テトラヒドロ−
フラン（120ml）に溶解され、この溶液はアルゴンガス
中で氷温まで冷やされた。水和物としてテトラブチルア
ンモニウム（12.8g、49.1mmol）が無水テトラヒドロフ
ラン（50ml）に溶解され、その半分が注射器を用いて冷
やした反応混液にゆっくりとと添加された。氷温で１時
間攪拌した後、試薬の残りがゆっくりと添加された。こ
の反応混液は、氷温でさらに１時間攪拌され、その後溶
媒は20℃で真空（60torr）蒸発乾燥されて油性物を生じ
た。この油性物は塩化メチレン（250ml）に溶解され、
塩類溶液で３回洗われた。有機層が分離され、硫酸マグ
ネシウム上で乾燥された。この固形物を過し、溶媒を
蒸発乾燥させて油性物が得られた。この粗産物は焼結ガ
ラスじょうご（600ml）に入れたシリカを用いたカラム
クロマトグラフィーによって精製され、溶出剤として酢
酸エチルが用いられた。N6−ベンゾイル−９−［２′−
デオキシ−２′−フルオロ−３′,5′−ジ−Ｏ−（テト
ラヒドロピラン−２−イル）−β−Ｄ−アラビノフラノ
シル］アデニンが油性物として得られた（2.03g、76
％）。
F. N6−ベンゾイル−９−［２′−デオキシ−２′−フ
ルオロ−β−Ｄ−リボフラノシル）アデニン。
N6−ベンゾイル−９−［２′−フルオロ−３′,5′−
ジ−Ｏ−（テトラヒドロピラン−２−イル）−β−Ｄ−
アラビノフラノシル］アデニン（1.31g、2.42mmol）は
メタノール（60ml）に溶解され、Dowex50Wx2−100（4cm
3、2.4m.eq）が反応混液に添加された。この反応混液は
20℃で１時間攪拌され、次に氷温まで冷やされた。次
に、この冷反応混液にpH12になるまでトリメチルアミン
（5ml）をゆっくりと添加した。樹脂は過され、洗液
がUV吸収物質を含まなくなるまで30％トリエチルアミン
・エタノール溶液で洗われた。トルエン（50ml）が洗液
に添加され、溶媒は24℃で真空（60torr、次に1torr）
蒸発乾燥され、残渣が得られた。この残渣を部分的に塩
化メチレン（30ml）に溶解し、この溶媒は分離用じょう
ごに移された。残渣の残りは温水（60℃）に溶解され、
溶媒を冷却した後、これも分離用じょうごに加えられ
た。この２層系は抽出され、有機層が分離されて水で３
回（３×100ml）抽出された。まとめた水性抽出物は40
℃で真空（60torr、次に1torr Hg）蒸発乾燥されて油
性物を生じ、これは無水ピリジン（50ml）と供に蒸発乾
燥された。この油性物は更に、５酸化リン存在下で一
夜、20℃で真空（1torr Hg）乾燥され、少量の不純物
を含む黄色泡状のN6−ベンゾイル−９−［２′−デオキ
シ−２′−フルオロ−β−Ｄ−リボフラノシル）アデニ
ン（1.08g、100％）が得られた。
G. N6−ベンゾイル−９−［２′−フルオロ−５′−Ｏ
−（4,4′−ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−リボフラ
ノシル］アデニン。
少量の不純物を含むN6−ベンゾイル−９−［２′−フ
ルオロ−β−Ｄ−リボフラノシル）アデニン（1.08g、
2.89mmol）は、アルゴンガス中で無水ピリジン（20ml）
に溶解され、乾燥したトリエチルアミン（0.52ml、3.76
mmol）が添加され、続いて4,4′−ジメトキシトリチル
クロライド（1.13g、3.32mmol）が添加された。20℃で
４時間攪拌した後、反応混液は分離用じょうごに移さ
れ、ジメチル・エーテル（40ml）が添加されて白色懸濁
液が生じた。この混合物を水で３回（３×10ml）洗い、
有機層が分離されて硫酸マグネシウム上で乾燥された。
この溶液にトリメチルアミン（1ml）が添加され、20℃
で真空（60torr Hg）蒸発乾燥されて油性物を生じ、こ
れはトリメチルアミン（1ml）を含むトルエン（20ml）
と供に蒸発乾燥された。この粗産物は、シリカ及び酢酸
エチル−トリエチルアミン（99:1、v/v）に続いて酢酸
エチル−メタノール−トリエチルアミン（80:19:1）を
用いたカラムクロマトグラフィーによって精製され、２
つの画分の産物を生じた。この画分は20℃で真空（60to
rr、次に1torr Hg）蒸発乾燥されて泡を生じ、これは
更に水酸化ナトリウム共存の下、20℃で真空（1torr H
g）乾燥され、泡状のN6−ベンゾイル−９−［２′−フ
ルオロ−５′−Ｏ−（4,4′−ジメトキシトリチル）−
β−Ｄ−リボフラノシル］アデニン（1.02g、52％）が
得られた。
H. N6−ベンゾイル−［２′−フルオロ−５′−Ｏ−
（4,4′−ジメトキシトリチル）］アデノシン−３′−
Ｏ−N,N−ジイソプロピル−β−シアノエチルホスホア
ミダイト。
N6−ベンゾイル−９−［２′−フルオロ−５′−Ｏ−
（4,4′−ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−リボフラノ
シル］アデニン（1.26g、1.89mmol）はアルゴンガス中
で無水ジクロロメタン（13ml）に溶解され、ジイソプロ
ピルエチルアミン（0.82ml、4.66mmol）が添加され、こ
の反応混液は氷温まで冷却された。クロロ（ジイソプロ
ピルアミノ）−β−シアノエトキシホスフィン（0.88m
l、4.03mmol）がこの反応溶液に添加され、これは20℃
まで暖められ、３時間攪拌された。酢酸エチル（80ml）
及びトリエチルアミン（1ml）が添加され、この溶液は
塩類溶液で３回（３×25ml）洗われた。有機層が分離さ
れ、硫酸マグネシウム上で乾燥された。固形物の過を
した後、溶楳は20℃で真空蒸発乾燥されて油性物を生
じ、これはシリカ及び溶出剤としてヘキサン−酢酸エチ
ル−トリエチルアミン（50:49:1）精製された。この画
分を20℃で真空蒸着乾燥することにより泡が得られ、こ
れは無水ピリジン（20ml）と供に26℃で真空（1torr）
蒸発乾燥され、更に水酸化ナトリウム共存の下、20℃で
24時間真空（1torr Hg）乾燥する事により、泡状のN6
−ベンゾイル−［２′−デオキシ−２′−フルオロ−
５′−Ｏ−（4,4′−ジメトキシトリチル）］アデノシ
ン−３′−Ｏ−N,N−ジイソプロピル−β−シアノエチ
ルホスホアミダイト（1.05g、63％）が得られた。
I. ２′−デオキシ−２′−フルオロ−５′−Ｏ−（4,
4′−ジメトキシトリチル）−ウリジン−３′−Ｏ−
（N,N−ジイソプロピル−β−シアノエチルホスホアミ
ダイト）。
2,2′−シクロウリジンを、ジオキサン中で70％フッ
化水素／ピリジン溶液と、120℃で10時間処理処理し、
溶媒を除去すると75％の収率で２′−デオキシ−２′−
フルオロウリジンが得られる。５′−DMT及び３′−シ
アノエトキシジイソプロピルホスホアミダイト誘導化ヌ
クレオシドは標準的な文献による方法、即ちM.J.ガイト
ら、Oligonucleotide Synthesis. Ａ Pracical App
roach、（IRL出版、ワシントン、DC、1984）あるいは実
施例1Aの方法により得られる。
J. ２′−デオキシ−２′−フルオロ−５′−Ｏ−（4,
4′−ジメトキシトリチル）−シチジン−３′−Ｏ−
（N,N−ジイソプロピル−β−シアノエチルホスホアミ
ダイト）。
２′−デオキシ−２′−フルオロウリジンは、トリア
ゾロ中間体を経て対応するシチジン類似体に転換され、
これは次にアミノ化される。次に、ヘテロシクルはN4−
ベンゾイル化によって保護される。５′−Ｏ−（4,4′
−ジメトキシ−トリチル）−３′−Ｏ−（N,N−ジイソ
プロピル−β−シアノエチルホスホアミダイト）は、実
施例1Aに従って調製することができる。
K. ９−（３′,5′−［1,1,3,3,−テトライソプロピル
ジシロクス−1,3−ジイル］−β−Ｄ−アラビノフラノ
シル）グアニン。
グアノシンの３′及び５′位は、M.J.ウィルソン、J.
S.,ソウヤー、L.及びジェイムス、M.N.G.（1983）Can.
J.Chem.、61:1911の方法により、TPDS（1,1,3,3,−テト
ライソプロピルジシロクス−1,3−ジイル）保護基の添
加によって保護された。攪拌されたDMSO（160ml）及び
無水酢酸（20.0ml、212mmol）溶液に、TPDSグアノシン
（21.0g、0.040mol）が添加された。反応液は室温で36
時間攪拌され、次に０℃に冷却された。冷エタノール
（400ml、95％）が添加され、反応混液は更にドライア
イス／アセトン浴中で−78℃に冷却された。NaBH4（2.0
g、1.32mol.eq）が添加された。この反応液は−２℃ま
で冷やされ、−２℃で30分間攪拌されて再び−78℃に冷
却された。この操作を更に２回繰り返した。NaBH4添加
完了後、反応液は氷温で30分間、次に室温で１時間攪拌
された。この反応液にEtOAc（1l）加え、飽和食塩水で
２回洗った。有機層は硫酸マグネシウム上で乾燥され、
室温で蒸発乾燥された。この残りをトルエンと供に２回
蒸発乾燥し、CH2Cl2−MeOH（90:10）を溶出剤として用
いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。
これらの画分を蒸発乾燥する間に、適当なカラム画分か
沈澱された6.02gの純粋な産物及び、それに加えて11.49
gの産物が、この画分を蒸発乾燥した残渣として得られ
た。
L. N2−イソブチリル−９−（２′−Ｏ−イソブチリル
−３′,5′−［1,1,3,3,−テトライソプロピルジシロク
ス−1,3−ジイル］−β−Ｄ−アラビノフラノシル）グ
アニン。
９−（３′,5′−［1,1,3,3,−テトライソプロピルジ
シロクス−1,3−ジイル］−β−Ｄ−アラビノフラノシ
ル）グアニン（6.5g、0.01248mmol）はアルゴンガス中
で無水ピリジン（156ml）に溶解された。DMAP（9.15g）
が添加された。無水イソ酪酸（6.12ml）をゆっくりと添
加し、反応混液は室温で一夜攪拌された。この反応混液
は飽和冷NaHCO3（156ml）に注がれ、10分間攪拌され
た。この水溶液はEtOAc（156ml）で３回抽出された。有
機層は飽和NaHCO3で洗い、室温で蒸発乾燥された。この
残渣を室温でトルエンと供に蒸発乾燥した。残渣は、CH
2Cl2−アセトン（85:15）を用いたシリカゲルクロマト
グラフィーで精製され、5.67g（68％）の産物が得られ
た。
M. N2−イソブチリル−９−（２′−Ｏ−イソブチリル
−β−Ｄ−アラビノフラノシル）グアニン。
N2−イソブチリル−９−（２′−Ｏ−イソブチリル−
３′,5′−［1,1,3,3,−テトライソプロピルヂシロクス
−1,3−ジイル］−β−Ｄ−アラビノフラノシル）グア
ニン（9.83g、0.01476mol）はアルゴンガス中、室温で
無水THF（87.4ml）に溶解された。THF中、1MのＮ（nB
u）4F（29.52ml、2eq.）が添加され、この混合液は30分
間攪拌された。この反応混液は室温で蒸発乾燥され、Et
OAc−MeOH（85:15）を用いたシリカゲルカラムクロマト
グラフィーによって精製され、4.98g（80％）の産物が
得られた。
N. N2−イソブチリル−９−（２′−Ｏ−イソブチリル
−３′,5′−ジ−Ｏ−［テトラヒドロピラン−２−イ
ル］−β−Ｄ−アラビノフラノシル）グアニン。
N2−イソブチリル−９−（２′−Ｏ−イソブチリル−
β−Ｄ−アラビノフラノシル）グアニン（4.9g）はアル
ゴンガス中、室温で無水1,4−ジオキサン（98ml）に溶
解された。ｐ−トルエンスルホン酸１水和物（0.97g、.
44eq.）が添加され、続いて3,4−ジヒドロ−2H−ピラ
ン、即ちDHP（9.34ml、8.8eq.）が添加された。この混
合液は２時間攪拌され、次に氷温まで冷却されて、反応
を停止するために飽和NaHCO3（125ml）が添加された。
反応混液は125mlのCH2Cl2の一部で３回抽出され、有機
層はMgSO4上で乾燥された。有機層は蒸発乾燥され、残
渣は最少量であるがシロップ状ではなく、透明な液体と
なるに充分な量のCH2Cl2に溶解され、CH2Cl2の100倍量
のヘキサンに滴下された。沈澱物が過されて5.59g（8
1.5％）の産物が得られた。
O. N2−イソブチリル−９−（３′,5′−ジ−Ｏ−［テ
トラヒドロピラン−２−イル］−β−Ｄ−アラビノフラ
ノシル）グアニン。
N2−イソブチリル−９−（２′−Ｏ−イソブチリル−
３′,5′−ジ−Ｏ−［テトラヒドロピラン−２−イル］
−β−Ｄ−アラビノフラノシル）グアニン（5.58g）
は、室温でピリジン:MeOH:H2O（65:30:15、52ml）に溶
解された。この溶液は氷温まで冷却され、EtOH−MeOH
（95:15）に溶かした2NのNaOH 52mlがゆっくりと添加
され、続いて氷温で２時間攪拌された。氷酢酸がpH6と
なるように添加された。次に飽和NaHCO3がpH7となるよ
うに添加された。この混合液は室温で蒸発乾燥され、そ
の残査はトルエンと供に蒸発乾燥された。この残査はEt
OAc（150ml）に溶解され、飽和NaHCO3で３回洗われた。
有機層は蒸発乾燥され、残査はEtOAc−MeOH（95:5）を
用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精
製され、3.85g（78.3％）の産物が得られた。
P. N2−イソブチリル−９−（３′,5′−ジ−Ｏ−［テ
トラヒドロピラン−２−イル］−２′−Ｏ−トリフルオ
ロメチルスルホニル−β−Ｄ−アラビノフラノシル）グ
アニン。
N2−イソブチリル−９−（３′,5′−ジ−Ｏ−［テト
ラヒドロピラン−２−イル］−β−Ｄ−アラビノフラノ
シル）グアニン（3.84g）は、アルゴンガス中、室温で
無水CH2Cl2（79ml）、無水ピリミジン（5.0ml）及び４
−ジメチルアミノピリジン（2.93g）に溶解された。こ
の溶液は氷温まで冷却され、攪拌しながら無水トリフル
オロメタンスルホン酸（1.99ml）がゆっくりと加えられ
た。この混合液は１時間攪拌され、次に100mlの飽和NaH
CO3が注ぎ込まれた。水層は冷CH2Cl2で３回抽出され
た。有機層はMgSO4上で乾燥され、室温で無水CH3CNと供
に蒸発乾燥されて粗産物が得られた。
Q. N2−イソブチリル−９−（２′−デオキシ−２′−
フルオロ−３′,5′−ジ−Ｏ−［テトラヒドロピラン−
２−イル］−β−Ｄ−アラビノフラノシル）グアニン。
実施例１−Ｐ由来の粗産物、即ちN2−イソブチリル−
９−（３′,5′−ジ−Ｏ−［テトラヒドロピラン−２−
イル］−２′−Ｏ−トリフルオロメチルスルホニル−β
−Ｄ−アラビノフラノシル）グアニンは、アルゴンガス
中、氷温で無水THF（113ml）に溶解された。THFに溶か
した（ピリジンと供に蒸発乾燥することにより乾燥され
た）1M無水Ｎ（nBu）4F（36.95ml）を、攪拌しながら添
加した。１時間後、更にTHFに溶かした1M無水Ｎ（nBu）
4F（36.95ml）溶液（合計10mol.eq.）が添加された。こ
の混合液は氷温で５時間攪拌され、一夜−30℃で凍結保
存された。この反応混液は室温で蒸発乾燥され、残査は
CH2Cl2（160ml）に溶解され、脱イオン水で５回抽出さ
れた。有機層はMgSO4上で乾燥され、蒸発乾燥された。
残査はEtOAc−MeOH（95:5）を用いたシリカゲルカラム
クロマトグラフィーによって精製され、5.25gの産物が
得られた。
R. N2−イソブチリル−９−（２′−デオキシ−２′−
フルオロ−β−Ｄ−アビノフラノシル）グアニン。
N2−イソブチリル−９−（２′−デオキシ−２′−フ
ルオロ−３′,5′−ジ−Ｏ−［テトラヒドロピラン−２
−イル］−β−Ｄ−アラビノフラノシル）グアニン（3.
85g）は、室温でMeOH（80ml）に溶解された。あらかじ
め洗ったDowex50W樹脂12.32cm3を添加し、この混合物を
室温で１時間攪拌した。樹脂は過され、過液は蒸発
乾燥された。樹脂は透明になるまでピリジン−トリエチ
ルアミン−H2O（1:3:3）で洗われた。この過液は蒸発
乾燥され油性物を生じた。この２つの過液由来の残査
をH2O（200ml）中で合わせ、CH2Cl2（100ml）で３回洗
った。水層は蒸発乾燥され、この残査は熱MeOHから再結
晶されて白色結晶の最初の0.299gの産物が得られた。残
りのMeOH溶液はシリカゲルクロマトグラフィーで精製さ
れ、EtOAc−MeOH（80:20）による溶出で、更に0.783gの
産物が得られた。
S. N2−イソブチリル−９−（２′−デオキシ−２′−
フルオロ−５′−Ｏ−［4,4′−ジメトキシトリチル］
−β−Ｄ−リボフラノシル）グアニン N2−イソブチリル−９−（２′−デオキシ−２′−フ
ルオロ−β−Ｄ−アラビノフラノシル）グアニン（1.09
g）は、アルゴンガス中、室温でピリジン（20ml）及び
トリエチルアミン（0.56ml）に溶解された。4,4′−ジ
メトキシトリチル塩化物（1.20g、1.15molar eq.）が
添加され、この混合液は室温で５時間攪拌された。この
混合液を分離用じょうごに移し、Et2O（100ml）で抽出
した。有機層は飽和NaHCO3で３回（70mlを分割）洗い、
水層はEt2Oで３回戻し抽出した。まとめられた有機層は
MgSO4上で乾燥され、溶液を塩基性に保つためにトリエ
チルアミン（4ml）が添加された。溶液は蒸発乾燥さ
れ、残査はシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製
された。カラムはEtOAc−Et3N（100:1）溶出され、次に
EtOAc−MeOH−Et3N（95:5:1）で溶出されて、1.03gの産
物が得られた。1H−NMR（DMSO−d6）δ6.09（dd、１、H
1′、J1-2＝2.61、J1′,F＝16.2Hz）；δ5.28（ddd、1H
2′、J2′-F＝52.8Hz）；δ4.38（ｍ、１、H3′、J3′,
F＝19.8Hz）。
T. N2−イソブチリル−９−（２′−デオキシ−２′−
フルオロ−５′−Ｏ−［4,4′−ジメトキシトリチル］
グアノシン−３′−Ｏ−N,N−ジイソプロピル−β−シ
アノエチルホスホアミダイト。
N2−イソブチリル−９−（２′−デオキシ−２′−フ
ルオロ−５′−Ｏ−［4,4′−ジメトキシトリチル］−
β−Ｄ−リボフラノシル）グアニン（0.587g）はアルゴ
ンガス中、室温で無水CH2Cl2（31ml）及びジイソプロピ
ルエチルアミン（0.4ml）に溶解された。この溶液は氷
温まで冷却され、クロロ（ジイソプロピルアミノ）−β
−シアノエトキシホスフィン（0.42ml）がゆっくりと添
加された。反応液は室温まで暖められ、3.5時間攪拌さ
れた。CH2Cl2−Et3N（100:1、35ml）が添加され、この
混合液は飽和NaHCO3（6ml）で１回洗われた。有機層はM
gSO4上で乾燥され、室温で蒸発乾燥された。残査は、２
カラム容量のHex−EtOAc−Et3N（75:25:1）、続いてHex
−EtOAc−Et3N（25:75:1）、最後にCH2Cl2−Et3Nを用い
たシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製さ
れた。産物を含む画分は保存され、室温で蒸発乾燥され
た。その結果生じた油性物はCH3CNと供に２回蒸発乾燥
され、乾燥するために真空ポンプ内に一夜置かれた。こ
の結果生じた白色の固体はCH2Cl2（3ml）に溶解され、
攪拌しているヘキサン（300ml）に滴下された。生じた
沈澱は過され、真空ポンプで乾燥されて0.673g（83
％）の産物が得られた。31P−NMR（CDCl3）δ150.5、15
1.5。
実施例２ − ２′−デオキシ−２′−シアノ修飾オリ
ゴヌクレオチドの調製。
A. N6−ベンゾイル−［２′−デオキシ−２′−シアノ
−５′−Ｏ−（4,4′−ジメトキシトリチル）］アデノ
シン−３′−Ｏ−（N,N−ジイソプロピル−β−シアノ
エチルホスホアミダイト）。
２′−デオキシ−２′−シアノアデノシンは、２′−
デオキシ−２′−ヨード−３′,5′−Ｏ−（ジシロキシ
テトライソプロピル）−N6−ベンゾイルアデノシンの
２′−ヨード基を、K.E.BパークスとK.テイラー、Tetra
hedron Letters 29:2995−2996（1988）によって述べ
られたものと同様な方法に従って、遊離ラジカル置換す
ることにより調製される。２′−デオキシ−２′−ヨー
ドアデノシンは、Tetrahedron Letters 15:1291−129
4（1977）によって述べられた様にしてR.ランガナーサ
ンによって調製され、Nucleic Acid Chemistry、第３
部、pp.222−231、タウンセンド、L.B.;ティプソン、R.
S.編（J.ワイリー・アンド・サン社、ニューヨーク、19
86）においてW.T.マーキヴィッツとM.ヴィウィロフスキ
ーが述べる様にしてジシリク化された。この物質は、ト
ルエン中でヘキサメチルジチン、AIBN及びｔ−ブチルイ
ソシアン酸によって処理され、保護された２′−デオキ
シ−２′−シアノアデノシンが得られた。この物質は選
択的脱保護を行った後、実施例1Aに記載の様に、その
５′−DMT−３′−ホスホアミダイトに転換される。
B. ２′−デオキシ−２′−シアノ−５′−Ｏ−（4,
4′−ジメトキシトリチル）−ウリジン−３′−Ｏ−
（N,N−ジイソプロピル−β−シアノエチルホスホアミ
ダイト）。
上述のように３′,5′−ジシリル化された２′−デオ
キシウリジン（または５−メチルウリジン）は、K.E.B
パークスとK.テイラー、Tetrahedron Letters 29:299
5−2996（1988）に記載のトリフェニルホスホニウム・
メチルヨウ化物によって、２′−ヨード誘導体に転換さ
れた。K.E.BパークスとK.テイラー、Tetrahedron Lett
ers 29:2995−2996（1988）に記載の遊離ラジカル反応
条件の適用により、保護されたヌクレオシドの２′−シ
アノ基が得られる。上述のような、この物質の脱保護と
それに続いての保護された単量体への転換により、所望
の核酸合成機用の材料が提供される。
C. ２′−デオキシ−２′−シアノ−５′−Ｏ−（4,
4′−ジメトキシトリチル）−シチジン−３′−Ｏ−
（N,N−ジイソプロピル−β−シアノエチルホスホアミ
ダイト）。
２′−デオキシ−２′−ヨードシチジンは、従来述ケ
トからアミノ転換により、対応する上述のウリジン化合
物から得られる。
D. ２′−デオキシ−２′−シアノ−５′−Ｏ−（4,
4′−ジメトキシトリチル）−グアノシン−３′−Ｏ−
（N,N−ジイソプロピル−β−シアノエチルホスホアミ
ダイト）。
２′−デオキシ−２′−シアノグアノシンは、３′,
5′−ジシリル化されたN2−イソブチリルグアノシンの
２′−上位（アラビノ糖）におけるトリフレート基置換
によって得られる。標準的な脱保護及びそれに続く再保
護により、表題の単量体が得られる。
実施例３ − ２′−デオキシ−２′−（トリフルオロ
メチル）修飾されたオリゴヌクレオチドの調製。
核酸塩基Ａ、Ｇ、Ｕ（Ｔ）及びＣの所望の２′−デオ
キシ−２′−トリフルオロメチルリボシドは、Q.−Y.チ
エンとS.W.ウーにより、The Journal of Chemical
Society Perkin Transactions 2385−2387（1989）
において述べられた文献の方法の修飾法によって調製さ
れる。実施例1A記載の標準的方法は、以下に挙げた５′
−DMT及び３′−ホスホアミダイトを調製するために用
いられた。
A. N6−ベンゾイル−［２′−デオキシ−２′−トリフ
ルオロメチル−５′−Ｏ−（4,4′−ジメトキシトリチ
ル）］アデノシン−３′−Ｏ−（N,N−ジイソプロピル
−β−シアノエチルホスホアミダイト）。
B. ２′−デオキシ−２′−トリフルオロメチル−５′
−Ｏ−（4,4′−ジメトキシトリチル）ウリジン−３′
−Ｏ−（N,N−ジイソプロピル−β−シアノエチルホス
ホアミダイト）。
C. ２′−デオキシ−２′−トリフルオロメチル−５′
−Ｏ−（4,4′−ジメトキシトリチル）シチジン−３′
−Ｏ−（N,N−ジイソプロピル−β−シアノエチルホス
ホアミダイト）。
D. ２′−デオキシ−２′−トリフルオロメチル−５′
−Ｏ−（4,4′−ジメトキシトリチル）グアノシン−
３′−Ｏ−（N,N−ジイソプロピル−β−シアノエチル
ホスホアミダイト）。
実施例４ − ２′ −デオキシ−２′−（トリフルオ
ロメトキシ）修飾されたオリゴヌクレオチドの調製。
の核酸塩基Ａ、Ｇ、Ｕ（Ｔ）及びＣの所望２′−デオ
キシ−２′−トリフルオロメチルリボシドは、B.S.スプ
ロートら、Nucleic Acid Research 18:41−49（199
0）及びH.イノウエら、Nucleic Acid Research 15:6
131−6148（1987）において述べられた文献の方法の修
飾法によって調製される。実施例1A記載の標準的方法
は、以下に挙げたら５′−DMT及び３′−ホスホアミダ
イトを調製するために用いられた。
A. N6−ベンゾイル−［２′−デオキシ−２′−（トリ
フルオロメトキシ）−５′−Ｏ−（4,4′−ジメトキシ
トリチル）］アデノシン−３′−Ｏ−（N,N−ジイプロ
ピル−β−シアノエチルホスホアミダイト）。
B. ２′−デオキシ−２′−（トリフルオロメトキシ）
−５′−Ｏ−（4,4′−ジメトキシトリチル）ウリジン
−３′−Ｏ−（N,N−ジイソプロピル−β−シアノエチ
ルホスホアミダイト）。
C. ２′−デオキシ−２′−（トリフルオロメトキシ）
−５′−Ｏ−（4,4′−ジメトキシトリチル）シチジン
−３′−Ｏ−（N,N−ジイソプロピル−β−シアノエチ
ルホスホアミダイト）。
D. ２′−デオキシ−２′−（トリフルオロメトキシ）
−５′−Ｏ−（4,4′−−ジメトキシトリチル）−グア
ノシン−３′−Ｏ−（N,N−ジイソプロピル−β−シア
ノエチルホスホアミダイト）。
実施例５ − ２′−デオキシ−２′−（１−プロプロ
キシ）修飾されたオリゴヌクレオチドの調製。
核酸塩基Ａ、Ｇ、Ｕ（Ｔ）及びＣの所望の２′−デオ
キシ−２′−Ｏ−プロピル リボシドは、B.S.スプロー
トら、Nucleic Acid Research 18:41−49（1990）及
びH.イノウエら、Nucleic Acid Research 15:6131−
6148（1987）において述べられた文献の方法の修飾法に
よって調製される。実施例1A記載の標準的方法は、以下
に挙げた５′−DMT及び３′−ホスホアミダイトを調製
するために用いられた。
A. N6−ベンゾイル［２′−デオキシ−２′−（１−プ
ロプロキシ）−５′−Ｏ−（4,4′−ジメトキシトリチ
ル）］アデノシン−３′−Ｏ−（N,N−ジイソプロピル
−β−シアノエチルホスホアミダイト）。
B. ２′−デオキシ−２′−（１−プロプロキシ）−
５′−Ｏ−（4,4′−ジメトキシトリチル）ウリジン−
３′−Ｏ（N,N−ジイソプロピル−β−シアノエチルホ
スホアミダイト）。
C. ２′−デオキシ−２′−（１−プロプロキシ）−
５′−Ｏ−（4,4′−ジメトキシトリチル）シチジン−
３′−Ｏ−（N,N−ジイソプロピル−β−シアノエチル
ホスホアミダイト）。
D. ２′−デオキシ−２′−（１−プロプロキシ）−
５′−Ｏ−（4,4′−ジメトキシトリチル）−グアノシ
ン−３′−Ｏ−（N,N−ジイソプロピル−β−シアノエ
チルホスホアミダイト）。
実施例６ − ２′−デオキシ−２′−（ビニロキシ）
修飾されたオリゴヌクレオチドの調製。
核酸塩基Ａ、Ｇ、Ｕ（Ｔ）及びＣの所望の２′−デオ
キシ−２′−Ｏ−ビニルリボシドは、B.S.スプロート
ら、Nucleic Acid Research 18:41−49（1990）及び
H.イノウエら、Nucleic Acid Research 15:6131−61
48（1987）において述べられた文献の方法の修飾法によ
って調製される。この場合、1,2−ジブロモエタンは
２′−水酸基とカップルされ、続くデヒドロブロム化に
より所望のブロックされた２′−ビニルヌクレオシドが
得られる。実施例1A記載の標準的方法は、以下に挙げた
５′−DMT及び３′−ホスホアミダイトを調製するため
に用いられた。
A. N6−ベンゾイル−［２′−デオキシ−２′−（ビニ
ロキシ）−５′−Ｏ−（4,4′−ジメトキシトリチ
ル）］アデノシン−３′−Ｏ−（N,N−ジイソプロピル
−β−シアノエチルホスホアミダイト）。
B. ２′−デオキシ−２′−（ビニロキシ）−５′−Ｏ
−（4,4′−ジメトキシトリチル）ウリジン−３′−Ｏ
−（N,N−ジイソプロピル−β−シアノエチルホスホア
ミダイト）。
C. ２′−デオキシ−２′−（ビニロキシ）−５′−Ｏ
−（4,4′−ジメトキシトリチル）シチジン−３′−Ｏ
−（N,N−ジイソプロピル−β−シアノエチルホスホア
ミダイト）。
D. ２′−デオキシ−２′−（ビニロキシ）−５′−Ｏ
−（4,4′−ジメトキシトリチル）−グアノシン−３′
−Ｏ−（N,N−ジイソプロピル−β−シアノエチルホス
ホアミダイト）。
実施例７ − ２′−デオキシ−２′−（アリロキシ）
修飾されたオリゴヌクレオチドの調製。
核酸塩基Ａ、Ｇ、Ｕ（Ｔ）及びＣの所望の２′−デオ
キシ−２′−Ｏ−アリルリボシドは、B.S.スプロート
ら、Nucleic Acid Research 18:41−49（1990）及び
H.イノウエら、Nucleic Acid Research 15:6131−61
48（1987）において述べられた文献の方法の修飾法によ
って調製される。実施例1A記載の標準的方法は、以下に
挙げた５′−DMT及び３′−ホスホアミダイトを調製す
るために用いられた。
A. N6−ベンゾイル−［２′−デオキシ−２′−（アリ
ロキシ）−５′−Ｏ−（4,4′−ジメトキシトリチ
ル）］アデノシン−３′−Ｏ−（N,N−ジイソプロピル
−β−シアノエチルホスホアミダイト）。
B. ２′−デオキシ−２′−（アリロキシ）−５′−Ｏ
−（4,4′−ジメトキシトリチル）ウリジン−３′−Ｏ
−（N,N−ジイソプロピル−β−シアノエチルホスホア
ミドダイト）。
C. ２′−デオキシ−２′−（アリロキシ）−５′−Ｏ
−（4,4′−ジメトキシトリチル）シチジン−３′−Ｏ
−（N,N−ジイソプロピル−β−シアノエチルホスホア
ミダイト）。
D. ２′−デオキシ−２′−（アリロキシ）−５′−Ｏ
−（4,4′−ジメトキシトリチル）−グアノシン−３′
−Ｏ−（N,N−ジイソプロピル−β−シアノエチルホス
ホアミダイト）。
実施例 ８ − ２′−デオキシ−２′−（メチルチ
オ）、（メチルスルフィニル）及び（メチルスルホニ
ル）修飾されたオリゴヌクレオチドの調製。
A. ２′−デオキシ−２′−メチルチオウリジン 2,2′−無水ウリジン（15.5g、68.2mmol）［ラオ、T.
S.とリーズ、C.B.（1989）J.Chem.Soc.、Chem.Commu
n.、997］、メタンチオール（15.7g、327mmol）、1,1,
3,3−テトラメチルグアニジン（39.2g、341mmol）及び
ジメチルホルムアミド（150ml）が一緒に60℃で加熱さ
れた。12時間後、反応混液は冷却され、減圧下で濃縮さ
れた。残った油性物はシリカゲル（300g）を用いたフラ
ッシュカラムクロマトで精製された。CH2Cl2−MeOH（9:
1、v/v）で溶出された適当な画分を濃縮し、残査を高真
空下で乾燥させると、薄い黄色固体状の２′−デオキシ
−２′−メチルチオウリジン（14.11g、75.4％）が得ら
れた。（イマザワ、M.、ウエダ、T.、及びウキタ、T.
（1975）Chem.Pharm.Bull.、23:604によって報告された
ように）エタノール−ヘキサンからのこの固体の結晶化
の試みは失敗し、この材料は吸湿性の泡となった。
1H NMR（Me2SO−d6）δ2.0（3H、ｓ、SCH3）、3.34（1
H、dd,J3′,2′＝54.Hz、２′Ｈ）、3.59（2H、br
ｍ、５′CH2）、3.84（1H、ｍ、４′Ｈ）、4.2（1H、d
d、J3′,4′＝2.2Hz、３′Ｈ）、5.15（1H、ｔ、５′O
H）、5.62（1H、ｔ、３′OH）、5.64（1H、ｄ、JC6,C5
＝8.2Hz）、6.02（1H、ｄ、J1′;2′＝6Hz、１′Ｈ）、
7.82（1H、ｄ、JC5,C6＝8.2Hz、C6H）、11.38（1H、br
ｓ、ＮＨ）。
B. 2,2′−アンヒドロ−５−メチルウリジン ヘキサメチルホスホアミド（175ml）に溶かした５−
メチルウリジン（16.77g、69.2mmol）、ジフェニル炭酸
塩（17.8g、83.1mmol））及び重炭酸ナトリウム（100m
g）の混合物は、CO2の発生が終わるまで（約１時間）攪
拌しながら150℃に加熱された。反応混液は冷却され、
攪拌しながらジメチルエーテル（11）に注がれ、茶色の
ガム状物質ができた。ジメチルエーテルを用いて洗浄を
繰り返す（４×250ml）ことにより、麦わら色の吸湿性
粉末が得られた。この固形物は、シリカゲル（400g）の
ショートカラムクロマトグラフィーによって精製され
た。CH2Cl2−MeOH（85:15、v/v）で溶出された適当な画
分を保存して濃縮すると、226−227℃の融点を持つ長い
針状の結晶がEtOHから結晶化されるところの、麦わら色
の固形状の表題にある化合物が得られまた（12g、77.3
％）。
C. ２′−デオキシ−２′−メチルチオ−５−メチルウ
リジン 2,2′−無水−５−メチルウリジン（17.02g、70.6mmo
l）、メタンチオール（16.3g、339mmol）、1,1,3,3−テ
トラメチルグアニジン（40.6g、353mmol）及びジメチル
ホルムアミド（150ml）は、一緒に60℃で加熱された。1
2時間後、産物は減圧下で冷却及び濃縮された。そこで
残った油性物はシャートシリカゲル（300g）カラムクロ
マトグラフィーで精製された。CH2Cl2−MeOH（93:7、v/
v）で溶出された適当な画分を濃縮すると、表題にある
白色の泡状化合物（15.08g、74.1％）が得られた。Et−
OH−CH2Cl2からの結晶化により白色の針状結晶が得られ
た。
D. ２′−デオキシ−２′−メチルスルフィニルウリジ
ン 攪拌した２′−デオキシ−２′−メチルチオウリジン
（1g、3.65mmol）のエタノール溶液（50ml）に対して、
０℃で45分にわたり、ｍ−塩化過安息香酸（50％、1.26
g、3.65mmolの50ml EtOH溶液）が添加された。この溶
液は真空下で除かれ、残査がショートシリカゲル（30
g）カラムクロマトグラフィーで精製された。CH2Cl2−M
eOH（75:25、v/v）で溶出された適当な画分を濃縮する
と、表題にある白色の固形化合物（0.65g、61.4％）が
得られた。EtOHからの結晶化により、219−221℃の融点
を持つ白色の顆粒が得られた。1 H NMR（Me2SO−d6）δ2.5（3H、ｓ、SCH3）、3.56（2
H、br ｓ、５′CH2）、3.8（1H、ｍ、４′Ｈ）、3.91
（1H、ｍ、２′Ｈ）、4.57（1H、ｍ、３′Ｈ）、5.2（1
H、br ｓ、５′OH）、5.75（1H、ｄ、C5 Ｈ）、6.19（1
H、ｄ、３′ＯＨ）、6.35（1H、ｄ、１′Ｈ）、7.88（1
H、ｄ、C6H）、11.43（1H、br ｓ、ＮＨ）。
E. ２′−デオキシ−２′−メチルスルホニルウリジン 攪拌した２′−デオキシ−２′−メチルチオウリジン
（1g、3.65mmol）のエタノール溶液（50ml）に対して、
ｍ−塩化過安息香酸（50％、3.27g、14.6mmol）が室温
において１回で添加された。２時間後、溶液は白色の沈
澱を集めるために過され、これを洗い（EtOHで２×20
ml、Et2Oで２×20ml）、乾燥することにより227−228℃
の融点を持つ細かい粉末状の、表題にある化合物（0.76
g、68％）が得られた。1 H NMR（Me2SO−d6）δ3.1（3H、ｓ、SO2CH3）、3.58
（2H、ｍ、５′ＣＨ ２）、3.95（1H、ｍ、２′Ｈ）、3.
98（1H、ｍ、４′Ｈ）、4.5（1H、br Ｓ、３′Ｈ）、
5.2（1H、br ｓ、５′OH）、5.75（1H、ｄ、C5 Ｈ）、
6.25（1H、ｄ、３′OH）、6.5（1H、ｄ、１′Ｈ）、7.8
（1H、ｄ、C6 Ｈ）、11.45（1H、br ｓ、ＮＨ）。
F. ２′−デオキシ−５−Ｏ−（4,4′−ジメトキシト
リチル）−２′−メチルチオウリジン 乾燥させたピリジン（10ml）に溶解した２′−デオキ
シ−２′−メチルチオウリジン（1.09g、4mmol）溶液に
対し、攪拌しながら室温で4,4′−ジメトキシトリチル
塩化物（1.69g、5mmol）及び４−ジメチルアミノピリジ
ン（50mg）が添加された。この溶液は12時間攪拌され、
MeOH（1ml）を添加することにより反応が止められた。
反応混液を真空下で濃縮させ、残査はCH2Cl2（100ml）
に溶解して、飽和NaHCO3水溶液（２×50ml）、飽和食塩
水（２×50ml）で洗い、（MgSO4上で）乾燥した。この
溶液は真空下で濃縮され、残査はシリカゲル（30g）カ
ラムクロマトグラフィーで精製された。CH2Cl2:MeOH:ト
リエチルアミン（89:1:1、v/v）による溶出で、均質な
材料として表題にある化合物が得られた。適当な画分を
保存し、濃縮することにより、泡状の５′−Ｏ−DOMTヌ
クレオシド（1.5g、66.5％）が得られた。1 H NMR（MeSO−d6）δ2.02（3H、ｓ、SCＨ ３）、3.15
−3.55（1H、ｍ、２′ＣＨ）、3.75（6H、ｓ、２ OCＨ
３）、3.97（1H、ｍ、４′Ｈ）、4.24（1H、ｍ、３′
Ｈ）、5.48（1H、ｄ、C5 Ｈ）、5.73（1H、ｄ、３′−Ｏ
Ｈ）、6.03（1H、ｄ、１′Ｈ）、6.82−7.4（13H、ｍ、
ArＨ）、6.65（1H、ｄ、C6 Ｈ）、11.4（1H、br、ｓ、Ｎ
Ｈ）。
G. ２′−デオキシ−３′−Ｏ−［（N,N−ジイソプロ
ピル）−Ｏ−β−シアノエチルホスホアミド］−５′−
Ｏ−（4,4′−ジメトキシトリチル）−２−メチルチオ
ウリジン 乾燥させたTHF（25ml）に溶解した２′−デオキシ−
５′−Ｏ−（4,4′−ジメトキシトリチル）−２′−メ
チルチオウリジン（1.5g、2.67mmol）溶液に対し、攪拌
しながらイイソプロピルエチルアミン（1.4ml、8mmol）
を添加し、この溶液を０℃で冷却した.N,N−ジイソプロ
ピル−β−シアノエチルホスホアミジル酸塩化物（1.26
ml、5.34mmol）が、15分にわたって滴下された。次にこ
の反応液を室温で２時間攪拌した。EtOAc（100ml、１％
トリエチルアミンを含む）を添加し、この溶液を飽和食
塩水（２×50ml）で洗い、有機層をMgSO4上で乾燥し
た。溶媒を真空下で除き、残査はショートシリカゲル
（30g）カラムクロマトグラフィーで精製した。CH2Cl2:
MeOH:トリエチルアミン（98:1:1、v/v）による溶出で、
ジアステレオ異性体の混合物として産物が得られた。適
当な画分を蒸発乾燥することにより、泡状の表題にある
化合物が得られた（1.32g、64.7％）。1 H NMR（CDCl3）δ2.0及び2.02（3H、2s、SCH3）、5.3
及び5.35（1H、2d、C5 Ｈ）、6.23（1H、ｄ、１′Ｈ）、
7.8及び7.78（1H、2d、C6 Ｈ）及び他のプロトン。31P
NMR（CDCl3）δ151.68及び152.2ppm。
H. ２′−デオキシ−３′−５′−ジ−Ｏ−アセチル−
２′−メチルチオウリジン ２′−デオキシ−２′−メチルチオウリジン（5.0g、
18.24mmol）及び無水酢酸（5.6ml、54.74mmol）は、室
温で12時間、乾燥ピリジン（30ml）中で攪拌された。次
に、この産物を減圧下で濃縮し、得られた残査をショー
トリカゲルクロマトグラフィーで精製した。CH2Cl2:MeO
H（9:1、v/v）で溶出された適当な画分を合わせて減圧
下で蒸発乾燥し、残査をEtOHから結晶化することによ
り、表題にある132℃の融点を持つ白色の針状の産物
（6.0g、91.8％）が得られた。1 H NMR（CDCl3）δ2.17（3H、ｓ、SCＨ ３）、2.20（6
H、ｓ、２ C0CＨ ３）、3.40（1H、ｔ、２′Ｈ）、4.31
−4.40（3H、ｍ、４′,5′Ｈ）5.31（1H、ｍ、３′
Ｈ）、5.80（1H、ｄ、C5 Ｈ）、6.11（1H、ｄ、１′
Ｈ）、7.45（1H、ｄ、C6 Ｈ）、8.7（1H、br ｓ、N
H）。
I. ２′−２デオキシ−３′,5′−ジ−Ｏ−アセチル−
４−（1,2,4−トリアゾール−１−イル）−２′−メチ
ルチオウリジン トリエチルアミン（8.4ml、60.3mmol）及びリン酸塩
化物（1.2ml、12.9mmol）を、CH3CN（50ml）に溶解した
２′−デオキシ−３′,5′−ジ−Ｏ−アセチル−２′−
メチルチオウリジン（4.6g、13mmol）溶液に攪拌しなが
ら添加した。次に、1,2,4−トリアゾール（4.14g、59.9
mmol）を添加し、反応液を室温で攪拌した。16時間後、
この産物にトリエチルアミン−水（6:1、v/v;20ml）に
続き、飽和NaHCO3（100ml）を加え、生じた混合液をCH2
Cl2（２×100ml）で抽出した。有機層を乾燥（MgSO4）
し、減圧下で蒸発乾燥した。この残査をショートシリカ
ゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。CH2Cl2:MeO
H（9:1、v/v）で溶出された適当な画分を減圧下で蒸発
乾燥し、残査をEtOHから結晶化することにより、表題に
ある127−130℃の融点を持つ青白色針状の産物（3.01
g、56.4％）が得られた。1 H NMR（CDCl3）δ2.18（6H、ｓ、COCＨ ３）、2.30（3
H、ｓ、SCＨ ３）、3.67（1H、ｍ、２′Ｈ）、4.38−4.5
0（3H、ｍ、４′,5′Ｈ）5.17（1H、ｔ、３′Ｈ）、6.2
1（1H、ｄ、１′Ｈ）、7.08（1H、ｄ、C5 Ｈ）、8.16（1
H、ｓ、ＣＨ）、8.33（1H、ｄ、C6 Ｈ）、9.25（1H、
ｓ、ＣＨ）。
J. ２′−デオキシ−２′−メチルチオシチジン ２′−デオキシ−３′,5′−ジ−Ｏ−アセチル−４−
（1,2,4−トリアゾール−１−イル）−２′−メチルチ
オウリジン（3.0g、7.5mmol）をMeOHのアンモニア飽和
溶液（70ml）に溶解し、この溶液を圧力容器に入れ、室
温で３日間攪拌した。次にこの産物を減圧下で濃縮し、
残査をEtOH:CH2Cl2から結晶化して201℃の融点を持つ結
晶として、表題にある化合物（1.06g、51.7％）が得ら
れた。1 H NMR（Me2SO−d6）δ1.95（3H、ｓ、SCＨ ３）、3.36
（1H、ｍ、２′Ｈ）、3.55（2H、ｍ、５′ＣＨ ２）、3.
82（1H、ｍ、４′Ｈ）、4.18（1H、dd、３′Ｈ）、5.75
（1H、ｄ、C5 Ｈ）、6.1（1H、ｄ、１′Ｈ）、7.77（1
H、ｄ、C6 Ｈ）。C10H15N3O4Sに関する分析計算値:C、4
3.94;H、5.53;N、15.37;S、11.73。実測値、Ｃ、44.07;
H、5.45;N、15.47;S、11.80。
K. ２′−デオキシ−N4−ベンゾイル−２′−メチルチ
オシチジン 乾燥ピリジン（20ml）に溶かした２′−デオキシ−
２′−メチルチオシチジン（0.86g、3.15mmol）溶液に
対し、トリメチルクロロシラン（2.0ml、15.75mmol）を
攪拌しながら添加した。この溶液にベンゾイル塩化物
（2.18ml、18.9mmol）を添加し、２時間攪拌した。次に
この混合液を氷浴中で冷却し、MeOH（10ml）を添加し
た。５分後、NH4OH′（20ml、30％水溶液）を添加し、
この混合液を30分間攪拌した。次にこの反応混液を真空
下で濃縮し、残査をショートシリカゲル（70g）クロマ
トグラフィーで精製した。CH2Cl2:MeOH（9:1、v/v）で
溶出し、適当な画分を分取して蒸発乾燥することによ
り、表題の化合物が得られ、これはEtOHから193−194℃
の融点を持つ針状結晶として結晶化された。
L. N4−ベンゾイルアミノ−１−［２−デオキシ−５−
（4,4′−ジメトキシトリチル）−２−メチルチオ−β
−Ｄ−リボフラノシル］ピリミジン−３（2H）−オン
（または２′−デオキシ−N4−ベンゾイル−５′−（4,
4′−ジメトキシトリチル）−２′−メチルチオシチジ
ン） 乾燥ピリジン（10ml）に溶かした２′−デオキシ−N4
−ベンゾイル−２′−メチルチオシチジン（0.80g、2.1
2mmol）溶液に、4,4′−ジメトキシトリチル塩化物（1.
16g、3.41mmol）及び４−ジメチルアミノピリジン（10m
g）を室温で攪拌しながら添加した。この溶液を２時間
攪拌し、産物を真空下で濃縮した。この残査CH2Cl2（70
ml）に溶解し、飽和NaHCO3（50ml）、飽和食塩水（２×
50ml）で洗い、（MgSO4上で）乾燥し、減圧下で蒸発乾
燥した。この残査はショートシリカゲル（50g）カラム
クロマトグラフィーで精製した。CH2Cl2:トリエチルア
ミン（99:1、v/v）で溶出し、適当な画分を分取して濃
縮することにより、白色泡状の表題の化合物（1.29g、9
0％）が得られた。1 H NMR（DMSO−d6）δ2.1（3H、ｓ、SCＨ ３）、3.5（1
H、ｍ、２′Ｈ）、3.75（6H、ｓ、OCＨ ３）、4.15（1
H、ｍ、４′Ｈ）、4.4（1H、ｔ、３′Ｈ）、5.74（1H、
br、３′ＯＨ）、6.15（1H、ｄ、Cl′Ｈ）、6.8−8.0
（25H、ｍ、ArＨ及びC5 Ｈ）、8.24（1H、ｄ、C6 Ｈ）、1
1.3（1H、br ｓ、ＮＨ）。
M. ２′−デオキシ−N4−ベンゾイル−３−Ｏ−［（N,
N−ジイソプロピル）−β−シアノエチルホスホアミ
ド］−５′−Ｏ′（4,4′−ジメトキシトリチル）−
２′−メチルチオシチジン ２′−デオキシ−N4-ベンゾイル−５′−（4,4′−ジ
メトキシトリチル）−２′−メチルチオシチジン（1,41
g、2.07mmol）は、上の実施例８−Ｇ記載のようにし
て、乾燥THF（25ml）中でジイソプロピルエチルアミン
（1.4ml、8mol）及びN,N−ジイソプロピル−β−シアノ
エチルホスホアミド塩化物（1.26ml、5.34mmol）で処理
された。この粗産物をショートシリカゲル（50g）クロ
マトグラフィーで精製し、CH2Cl2:ヘキサン：トリエチ
ルアミン（89:10:1、v/v）で溶出することにより、表題
の産物が得られた。適当な画分を混合し、減圧下で蒸発
乾燥することにより、白色泡状の表題の化合物（1.30
g、71％）（ジアステレオ異性体の混合物）が得られ
た。1 H NMR（CDCl3）δ2.31（3H、ｓ、SCＨ ３）、3.45−3.
7（3H、ｍ、２′Ｈ及び５′ＣＨ ２）、3.83（6H、ｓ、O
CＨ ３）、4.27−4.35（1H、ｍ、４′Ｈ）、4.6−4.8（1
H、ｍ、３′Ｈ）、6.35（1H、2d、１′Ｈ）、6.82−7.8
（25H、ｍ、ArＨ及びC5 Ｈ）、8.38及び8.45（1H、2d、C
6 Ｈ）及び他のプロトン。31PNMR δ151.03及び151.08p
pm。
N. ２′−デオキシ−２′−メチルスルフィニルシチジ
ン 実施例８−Ｊの２′−デオキシ−２′−メチルチオシチ
ジンを実施例８−Ｄの方法で処理することにより、複雑
な1H NMRスペクトルを有するジアステレオ異性体混合
物として表題の化合物が得られた。
O. ２′−デオキシ−２′−メチルスルホニルシチジン 実施例８−Ｊの２′−デオキシ−２′−メチルチオシ
チジンを実施例８−Ｅの方法によって処理することによ
り、表題の化合物が得られた。
P. N6−ベンゾイル−３′,5′−ジ−Ｏ−［テトラヒド
ロピラン−２−イル］−２′−デオキシ−２′−メチル
チオアデノシン 実施例１−Ｄ由来のN6−ベンゾイル−９−［２′−Ｏ
−トリフルオロメチルスルホニル−３′,5′−ジ−Ｏ−
（テトラヒドロピラン−２−イル）−β−Ｄ−アラビノ
フラノシル］アデニンは、表題の化合物を得るために、
テトラメチルグアニジン存在下でメタンチオールにより
処理することにより調製された。
Q. N6−ベンゾイル−２′−デオキシ−２′−メチルチ
オアデノシン 実施例８−Ｐ由来のN6−ベゾイル−３′,5′−ジ−Ｏ
−（テトラヒドロピラン−２−イル）−２′−デオキシ
−２′−メチルチオアデノシンは実施例１−Ｆによって
処理され、表題の化合物が得られた。
R. N6−ベンゾイル−２′−デオキシ−２′−メチルス
ルフィニルアデノシン 実施例８−Ｑ由来のN6−ベンゾイル−２′−デオキシ
−２′−メチルチオアデノシンは、実施例８−Ｄの方法
により処理され、表題の化合物が得られた。
S. N6−ベンゾイル−２′−デオキシ−２′−メチルス
ルホニルアデノシン 実施例８−Ｑ由来のN6−ベンゾイル−２′−デオキシ
−２′−メチルチオアデノシンは実施例８−Ｅの方法に
より処理され、表題の化合物が得られた。
T. N2イソブチリル−３′,5′−ジ−Ｏ−（テトラヒド
ロピラン−２−イル）−２′−デオキシ−２′−メチル
チオグアノシン 実施例１−Ｐ由来のN2−イソブチリル−９−（３′,
5′−ジ−Ｏ−［テトラヒドロピラン−２−イル］−
２′−Ｏ−トリフルオロメチルスルホニル−β−Ｄ−ア
ラビノフラノシル）グアニンは、1,1,3,3,−テトラメチ
ルグアニジン存在下でメタンチオールと処理することに
より、表題の化合物が得られた。
U. N2−イソブチリル−２′−デオキシ−２′−メチル
チオグアノシン N2−イソブチリル−３′,5′−ジ−Ｏ−（テトラヒド
ロピラン−２−イル）−２′−デオキシ−２′−メチル
チオグアノシンは、実施例１−Ｒにより処理されて表題
の化合物が得られた。
V. N2−イソブチリル−２′−デオキシ−２′−メチル
スルフィニルグアノシン 実施例８−Ｕ由来のN2−イソブチリル−２′−デオキ
シ−２′−メチルチオグアノシンは実施例８−Ｄの方法
により処理され、表題の化合物が得られた。
W. N2−イソブチリル−２′−デオキシ−２′−メチル
スルホニルグアノシン 実施例８−Ｕ由来のN2−イソブチリル−２′−デオキ
シ−２′−メチルチオグアノシンは実施例８−Ｅの方法
により処理され、表題の化合物が得られた。
X. ２′−デオキシ−５−Ｏ−（4,4′−ジメトキシト
リチル）−２′−メチルスルフィニルウリジン 実施例８−Ｄ由来の２′−デオキシ−２′−メチルス
ルフィニルウリジンは実施例８−Ｆの方法により処理さ
れ、表題の化合物が得られた。
Y. ２′−デオキシ−３′−Ｏ−［（N,N−ジイソプロ
ピル）−Ｏ−β−シアノエチルホスホアミド］−５′−
Ｏ−（4,4′−ジメトキシトリチル）−２′−メチルス
ルフィニルウリジン ２′−デオキシ−５′−Ｏ−（4,4′−ジメトキシト
リチル）−２′−メチルスルフィニルウリジンは、実施
例８−Ｇの方法により処理され、表題の化合物が得られ
た。
Z. N6−ベンゾイル−２′−デオキシ−５−Ｏ−（4,
4′−ジメトキシトリチル）−２′−メチルチオアデノ
シン 上述の実施例８−Ｑ由来のN6−ベンゾイル−２′−デ
オキシ−２′−メチルチオアデノシンは実施例８−Ｆに
より処理され、表題の化合物が得られた。
AA. N6−ベンゾイル−２′−デオキシ−３′−Ｏ−
［（N,N−ジイソプロピル）−Ｏ−β−シアノエチルホ
スホアミド］−５′−Ｏ−（4,4′−ジメトキシトリチ
ル）−２′−メチルチオアデノシン N6−ベンゾイル−２′−デオキシ−５′−Ｏ−（4,
4′−ジメトキシトリチル）−２′−メチルチオアデノ
シンは、実施例８−Ｇの処理により処理され、表題の化
合物が得られた。
BB. ２′−デオキシ−N2−イソブチリル−５−Ｏ−
（4,4′−ジメトキシトリチル）−２′−メチルチオグ
アノシン 上述の実施例８−Ｕ由来の２′−デオキシ−N2−イソ
ブチリル−２′−メチルオグアノシンは、実施例８−Ｆ
により処理され、表題の化合物が得られた。
CC. ２′−デオキシ−N2−イソブチリル−３′−Ｏ−
［（N,N−ジイソプロピル）−Ｏ−β−シアノエチルホ
スホアミド］−５′−Ｏ−（4,4′−ジメトキシトリチ
ル）−２′−メチルチオグアノシン ２′−デオキシ−N2−イソブチリル−５′−Ｏ−（4,
4′−ジメチルトリチル）−２′−メチルチオグアノシ
ンは、実施例８−Ｇにより処理され、表題の化合物が得
られた。
DD. ２′−デオキシ−５−Ｏ−（4,4′−ジメトキシト
リチル）−２′−メチルスルホニルウリジン 上述の実施例８−Ｅ由来の２′−デオキシ−２′−メ
チルスルホニルウリジンは、実施例８−Ｆにより処理さ
れ、表題の化合物が得られた。
EE. ２′−デオキシ−３′−Ｏ−［（N,N−ジイソプロ
ピル）−Ｏ−β−シアノエチルホスホアミド）−５′−
Ｏ−（4,4′−ジメトキシトリチル）−２′−メチルス
ルフィニルウリジン ２′−デオキシ−５−Ｏ−（4,4′−ジメチルトリチ
ル）−２′−メチルスルホニルウリジンは、実施例８−
Ｇによって処理され、表題の化合物が得られた。
実施例９− チミンまたはシトシン（ピリミジン型塩
基）のそのβ−Ｄ−２′−デオキシ−２′−置換エリト
ロ−ペントフラノシル ヌクレオシドへの化学的変換;
2′−置換リボシル化） チミンまたはシトシン型の類似体を、ヘキサメチルジ
シラザン（HMDS）および酸触媒（すなわち、塩化アンモ
ニウム）のような標準滴な条件下でトリメチルシリル化
し、次に、ルイス酸触媒（すなわち塩化第二スズ、ヨウ
素、テトラフルオロホウ酸ホウ素、など）の存在におい
て塩化3,5−Ｏ−ジトルオイル−２−デオキシ−２−置
換−α−Ｄ−エリトロ−ペントフラノシルで処理する。
特異的な手順が、最近、ジェイ・エヌ・フレスコス（J.
N.Freskos）,Nucleosides ＆ Nucleotides 8:1075−
1076（1989）によって開示されたが、この方法では沃化
銅（Ｉ）が使用される触媒である。
実施例10− アデニンまたはグアニン（プリン型塩基）
の、そのβ−Ｄ−２′−デオキシ−２′−置換−エリト
ロ−ペントフラノシル ヌクレオシドへの化学的変換;
2′−置換リボシル化） 保護されたプリン型類似体を、アセトニトリル中の水
素化ナトリウムによってそのナトリウム塩に変え、次に
周囲温度で塩化3,5−Ｏ−ジトルオイル−２−デオキシ
−２−置換−α−Ｄ−エリトロ−ペントフラノシルで処
理する。特異的な手順が最近、アール・ケイ・ロビンス
（R.K.Robins）ら、Journal of American Chemical
Society 106:6379（1984）によって開示された。
実施例11− ２′−デオキシ−２−置換チミジンの、相
当する２′−デオキシ−２′−置換シチジンへの変換
（ピリミジン型４−ケト基の４−アミノ基への化学的変
換） ２′修飾ヌクレオシド型の３′,5′−糖ヒドロキシル
基を、酸の塩化物または無水物およびピリジン／ジメチ
ルアミノピリジン溶媒および触媒の標準条件を用いてト
リオイル、ベンゾイル、ｐ−ニトロベンゾイル、アセチ
ル、イソブトリル、トリフルオロアセチルなどのような
アシル基によって保護する。保護されたヌクレオシドを
今度は、ピリジンまたはその他の適当な塩基性溶媒中の
塩化チオニルまたは塩化ホスホリルで塩素化する。ピリ
ミジン型４−クロロ基を、ここでメタノール中のアンモ
ニウムで置換する。糖ヒドロキシル基の脱保護も起こ
る。このアミノ基を標準２段階完全ベンジル化法によっ
てベンゾイル化し（糖ヒドロキシルおよびアミノ基）、
水酸化ナトリウム水溶液によってアシルを選択的に除去
する。
別法として、最初の、糖ヒドロキシルを後続のアシル
化から保護するためのヌクレオシドのクロロトリメチル
シランおよび塩基によるin situ処理法を使用すること
ができる。ケイ・ケイ・オギルビー（K.K.Ogilvie）,Ca
n.J.Chem.67:831−839（1989）。もう一つの変換方法
は、ピリミジン型４−クロロ基を、1,2,4−トリアゾロ
基によって置換することであり、この基はDNA合成装置
でのオリゴヌクレオチド合成中、無傷のままであり、CP
G支持体からオリゴヌクレオチドを除去する水酸化アン
モニウム段階および複素環の脱保護中にアンモニウムに
よって置換される。さらに、多くの場合に、ピリミジン
型４−クロロ基は、ここに記載するように利用され、オ
リゴヌクレオチド合成の終わりに置換されることができ
る。
実施例12− CPG支持体に結合したヌクレオシドの５′
−ヒドロキシルへの２′−デオキシ−２′−置換５′−
ジメトキシトリフェニルメチルリボヌクレオシドの結合
法 特定のアンチセンスオリゴヌクレオチドの末端３′−
位にあるであろう２′−デオキシ−２′−置換ヌクレオ
シドをその５′−DMTとして保護し（シトシンおよびア
デニン環外アミノ基をベンゾイル化し、グアニン アミ
ノをイソブチリル化する）、ピリジンおよびジメチルア
ミノピリジン中のトリフルオロ−酢酸／ブロモ酢酸混合
無水物で、50℃で５時間処理する。この溶液を減圧、蒸
発させて薄いシロップにし、これを酢酸エチルに溶解さ
せ、シリカゲルのカラムを通過させる。均一な分画を集
めて、蒸発乾燥させた。アセトニトリル10ml、３′−Ｏ
−ブロモメチルエステル修飾したピリミジン ヌクレオ
シド10マイクロモル、およびピリジン／ジメチルアミノ
ピリジン（1:1）1mlの溶液をシリンジでゆっくり（60な
いし90秒）CPGチミジンの１マイクロモルのカラム［ア
プライド・バイオシステムズ社（Applied Biosystems,
Inc）］に注入する（カラムは遊離の５′−ヒドロキシ
ル基を得るための標準条件に従って前もって酸で処理し
た）。その他のヌクレオシドが結合したカラムを使用す
ることができた。溶出液を集めて再びシリンジで注入し
てこのカラムを通す。この工程を３回くり返す。CPGカ
ラムをアセトニトリル10mlでゆっくり洗浄した後、ABI
380B核酸合成装置にとりつける。オリゴヌクレオチド
合成が今開始される。CPG支持体からチミジエステル結
合を開裂させる濃水酸化アンモニウム脱保護の標準的な
条件また、ピリミジン修飾したヌクレオシドを、最初に
CPGヌクレオシドに結合されたチミジンに連結させてい
る３′,5′エステル結合をも開裂させる。このようにし
て、すべての２′−置換ヌクレオシドまたは一般的に複
素環および／または糖中に修飾をもつすべてのヌクレオ
シドを、オリゴヌクレオチド配列のまさに３′−末端に
結合させることができる。
実施例13− ２′−デオキシ−２′−置換リボヌクレオ
シド−５′−DMT−３′−ホスホアミダイトのオリゴヌ
クレオチドへの変換方法 ２′−修飾オリゴヌクレオチドを製造するために、ビ
ー・エス・スプロート（B.S.Sproat）外、Nucleic Aci
ds Research17:3373−3386（1989）のポリリボヌクレ
オチド固相合成法を用いる。
２′−デオキシ−２′−フルオロ置換基ヌクレオチド
を有する配列CGA CTA TGC AAG TACのオリゴヌクレ
オチドは、この配列内の種々の位置に組み入れられた。
第一のオリゴヌクレオチドにおいては、位置3,6,10,11
および14（５′から３′方向に数えた）のアデノシンヌ
クレオチドの各々を、２′−デオキシ−２′−フルオロ
部分を包含するように修飾した。別のオリゴヌクレオチ
ドでは、位置3,5,6,7,10,11,13および14のアデノシンお
よびウリジンヌクレオチドをこのように修飾した。さら
に別のオリゴヌクレオチドでは、位置1,3,4,5,6,7,9,1
0,11,13および14のアデノシン、ウリジンおよびシチジ
ヌクレオチドをこのように修飾し、さらに別のオリゴヌ
クレオチドでは、すべての位置のヌクレオチド（アデノ
シン、ウリジン、シチジンおよびグアノシン）をこのよ
うに修飾した。さらに、位置1,2,3,5,6,7,8,9,10,11,1
2,15および16に、２′−デオキシ−２′−フルオロ置換
基成分を含むように修飾もされたアデノシン、ウリジン
およびシチジヌクレオチドを有する、配列CTC GTA CC
T TCC GGT CCを有するオリゴヌクレオチドが製造さ
れた。
２′−デオキシ−２′−メチルチオ置換基を有するヌ
クレオチドを組み入れた種々のオリゴヌクレオチドを製
造した。２′−デオキシ−２′−メチルチオを有するヌ
クレオチドのオリゴヌクレオチド内への結合効率を確か
めるために三量体TCCおよび四量体TUU Ｕを合成した。
三量体TCCでは、中央のシチジンヌクレオチド（２番目
のヌクレオチド）が２′−デオキシ−２′−メチルチオ
置換基を包含していた。四量体では、ウリジンヌクレオ
チドの各々が、２′−デオキシ−２′−メチルチオ置換
基を包含していた。別のオリゴヌクレオチドでは、２′
−デオキシ−２′−メチルチオ置換基を有するヌクレオ
チドが選択された配列の位置でオリゴヌクレオチド配列
内に組み入れられた。残る配列位置にある各ヌクレオチ
ドは、そのヌクレオチド上に２′−Ｏ−メチル置換基を
組み入れた。この結果、オリゴヌクレオチド内のすべて
のヌクレオチドがその上に置換基、２′−デオキシ−
２′−メチルチオ置換基または２′−Ｏ−メチル置換基
のいずれか、を含んでいた。これらのオリゴヌクレオチ
ドは次のものである：位置4,5,6,7および８に２′−デ
オキシ−２′−メチルチオ置換基を有するGAG CUC CC
A GGC;位置1,4,5,7,9および13に２′−デオキシ−２′
−メチルチオ置換基を有するCGA CUA UGC AAG UAC;
位置1,2,3,7,9,10,11および14に２′−デオキシ−２′
−メチルチオ置換基を有するUCC AGG UGU CCG AUC;
位置10,11および12に２′−デオキシ−２′−メチルチ
オ置換基を有するTCC AGG CCG UUU C;および位置1
0,11および12に２′−デオキシ−２′−メチルチオ置換
基を有するTCC AGG TGT CCC Ｃ。
実施例14− ２′−デオキシ−２′−フルオロ修飾ホス
ホロチオエートオリゴヌクレオチドの製造 実施例１−７に記載したようにして製造した２′−デ
オキシ−２′−置換５′−DMTヌクレオシド３′−ホス
ホアミダイトを、エス・ビューケイジ（S.Beaucage）
他、Journal of American Chemical Society 112:
1253−1255（1990）およびビー・エス・スプロート（B.
S.Sproat）他、Nucleic Acids Research 17:3373−3
386（1989）によって開示されたようにして配列−特異
性オリゴヌクレオチドホスホロチオエート内に挿入し
た。
ホスホロチオエート主鎖結合および２′−デオキシ−
２′−フルオロ置換基ヌクレオチドを有する配列CGA C
TA TGC AAG TACのオリゴヌクレオチドを、この配列
内の種々の位置に組み入れた。第一のオリゴヌクレオチ
ドでは、各主鎖結合は、ホスホロチオエート結合であ
り、位置1,3,4,5,6,7,9,10,11,13および14（５′から
３′方向に数えた）のアデノシン、ウリジンおよびシチ
ジンヌクレオチドの各々は、２′−デオキシ−２′−フ
ルネロ部分を含むように修飾された。別のオリゴヌクレ
オチドでは、各主鎖結合はホスホロチオエート結合であ
り、すべての位置のオリゴヌクレオチド（アデノシン、
ウリジン、シチジンおよびグアノシン）は２′−デオキ
シ−２′−フルオロ部分を含むように修飾された。
実施例15− ２′−デオキシ−２′−フルオロ修飾され
た酸メチル化オリゴヌクレオチドの製造 the Journal of Organic Chemistry 54:1657−1
664（1989）にエル・エイチ・クーレ（L.H.Koole）他に
よって配設された保護、塩化トシルに仲介されるメタノ
リシス、および穏やかな脱保護を、２′−置換オリゴヌ
クレオチドに適用して、リン酸メチル化２′−置換オリ
ゴヌクレオチドを得る。
実施例16− ハイブリッド形成分析 A.2′−修飾オリゴヌクレオチドのハイブリッド形成の
熱力学の評価 ２′−修飾オリゴヌクレオチドがそれらの相補的RNA
またはDNA配列にハイブリッド形成する能力を、熱溶融
分析によって決定した。RNA相補体は、T7 RNAポリメラ
ーゼ及びアプライド・バイオシステムズ社（Applied B
iosystems,Inc.）380Bを用いて合成したDNAのテンプレ
ート−プロモーターから合成した。RNA種はFPLC［エル
・ケイ・ビー・ファーマシア社（LKB Pharmacia,In
c.）］を用いるイオン交換によって精製した。天然のア
ンチセンス オリゴヌクレオチドまたは特定位置に２′
−修飾を含むアンチセンス オリゴヌクレオチドをRNA
またはDNA相補体に化学量論的濃度で加えて、ランダム
コイル転移に対する二重らせんに関する吸光度（260n
m）深色性を、ギルフォード・レスポンス（Gilford Re
sponse）II分光光度計を用いて監視した。これらの測定
は、10mMリン酸ナトリウム、pH7.4、0.1mM EDTA、およ
び10種類の0.1Mまたは1.0Mのイオン強度を得るためのNa
Clの緩衝液中で実施した。データは、1/Tm対In［ct］の
図示によって分析したがここで［ct］は総オオリゴヌク
レオチド濃度であった。この分析から、熱力学パラメー
ターを決定した。形成されたヘテロ二重らせんの二重ら
せんの安定性に関連して得た情報に基づいて、２′−デ
オキシ−２′−置換基を含むヌクレオチドのオリゴヌク
レオチド中への配置をそのらせん安定性に関する効果に
ついて評価した。ハイブリッドの安定性を激烈に変える
修飾は自由エネルギー（デルタＧ）の減少を示し、それ
らのアンチセンスオリゴヌクレオチドとしての有用性に
関する決定が行なわれた。
下の表１に示すように、２′−デオキシ−２′−フル
オロヌクレオチドのオリゴヌクレオチド中への組み入れ
は、結果として修飾されたオリゴヌクレオチド鎖（アン
チセンス鎖）およびその相補的RNA鎖（センス鎖）の二
重らせん安定性の有意の増大をもたらした。ホスホジエ
ステル主鎖およびホスホロチオエート主鎖オリゴヌクレ
オチドの両方において、二重らせんの安定性は、アンチ
センス鎖中の２′−デオキシ−２′−フルオロ含有ヌク
レオチドの数が増加するとともに増大した。表１から明
らかな通り、例外なく、２′−デオキ−２′−フルオロ
を有するヌクレオチドの付加は、個々の置換基を有する
ヌクレオチドに関係なくまたはオリゴヌクレオチド配列
中にそのヌクレオチドの位置に関係なく、二重らせん安
定性の増大という結果をもたらした。
表１では、下線をひいたヌクレオチドは、２′−デオ
キシ−２′−フルオロ置換基を含むヌクレオチドを表わ
す。下線のないヌクレオチドは、正常なヌクレオチドで
ある。表示“ps"を前置きするオリゴヌクレオチドは、
ホスホロチオエート主鎖を有している。標準していない
オリゴヌクレオチドは、正常なホスホジエステル主鎖オ
リゴヌクレオチドである。
表１から明らかなように、RNAと２′−デオキシ−
２′−フルオロ置換されたヌクレオチドを含むオリゴヌ
クレオチドとの間で形成された二重らせんは、ハイブリ
ッド形成熱力学的安定性によって測定したとき、増大し
た結合安定性を示した。20℃より大きなデルタTmが測定
された。主鎖をホスホチオエート主鎖に修飾することに
よってさらに大きなデルタTmが観察された。この場合に
は、31℃より大きなデルタTmが測定された。これらのフ
ルオロ置換されたオリゴヌクレオチドは、RNAを用いて
形成された二重らせんの熱力学的安定性のばらつきのな
い付加的な増大を示した。我々は理論によっおて束縛さ
れたくないけれども、現在のところ２′−フルオロ置換
基の存在の結果、２′−フルオロ置換されたヌクレオチ
ドの糖成分が事実上３′−エンド配座をとり、そしてこ
の結果オリゴヌクレオチド−RNA二重らせんがＡ−型ら
せん状配座をとることになると考えられる。
B.2′−修飾されたオリゴヌクレオチドのハイブリッド
形成の忠実度 ２′−修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドが標的mR
NAに対する絶対特異性をもってハイブリッド形成する能
力は、全細胞RNAの存在における精製された標的RNAのノ
ーザンブロット分析によって示された。標的mRNAは、T7
RNAポリメラーゼプロモーターから下流に位置する標的m
RNAに対するcDNAを含むベクターから合成された。合成
されたmRNAを、アガロースゲル中で電気泳動させ、適当
な支持体膜（すなわちニトロセルロース）に移動させ
た。この支持体膜をブロックして、［32P］−標識した
アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いてプローブとし
た。緊縮性を、レプリカブロットおよび高温または低下
したイオン強度の洗浄緩衝液中での洗浄によって決定し
た。ヘテロ二重らせん形成の存在を評価するためにオー
トラジオグラフィーを行ない、オートラジオグラムをレ
ーザーデンシトメトリー［エル・ケイ・ビー・ファーマ
シア社（LKB Pharmacia,Inc.）］によって定量した。
ハイブリッド形成の特異性を、標準技術による全細胞RN
Aの単離およびアガロース電気泳動、膜移動および標識
した２′−修飾オリゴヌクレオチドを用いてプローブと
することによるその分析によって決定した。緊縮性を、
未修飾のアンチセンス オリゴヌクレオチドについて前
もって決定して、特に標的としたmRNAだけが２′−修飾
オリゴヌクレオチドとヘテロ二重らせんを形成すること
ができるような条件を使用した。
C.オリゴヌクレオチドおよびRNAの塩基対特異性 ２−デオキシ−２′−フルオロ修飾されたオリゴヌク
レオチドとRNA相補体（“Ｙ鎖”）との塩基対特異性
を、単一塩基対誤対合およびバルジを起こさせることに
よって決定した。これらの決定の結果は表２に示されて
いる。２′−デオキシ−２′−フルオロ置換基を有する
14アデノシン、ウリジンおよびシチジンヌクレオチドを
含む18量体“Ｘ鎖”オリゴヌクレオチドを、10位が変化
しているRNA相補体“Ｙ鎖”とハイブリッド形成させ
た。表２中、下線をひいたヌクレオチドは２′−デオキ
シ−２′−フルオロ置換基を含むヌクレオチドを表わ
す。
表２から明らかなように、２′−デオキシ−２′−フ
ルオロ修飾されたオリゴヌクレオチドは類似の配列をも
つ未修飾オリゴヌクレオチドより大きな特異性をもっ
た、RNA相補体との二重らせんを形成した。
実施例17− ヌクレアーゼ耐性 A.2′−修飾オリゴヌクレオチドの血清および細胞質ヌ
クレアーゼに対する耐性の評価 天然のホスホロチオエート、および２−修飾オリゴヌ
クレオチドを、これらの血清ヌクレアーゼに対する耐性
について、種々の濃度の胎児の子ウシ血清または成人の
ヒト血清を含有する培地におけるオリゴヌクレオチドの
インキュベーションによって評価した。標識したオリゴ
ヌクレオチドを種々の時間インキュベーションし、プロ
テアーゼＫで処理してから、20％ポリアクリルアミド−
尿素変性ゲルに関するゲル電気泳動およびそれに続くオ
ートラジオグラフィーによって分析した。オートラジオ
グラムはレーザーデンシトメトリーによって定量した。
修飾の位置および公知のオリゴヌクレオチドの長さに基
づいて、その特定の２′−修飾によるヌクレアーゼ分解
への効果を決定することが可能であった。細胞質ヌクレ
アーゼ用には、HL60細胞系を使用した。ポスト−ミトコ
ンドリアル上澄を分画遠心法によって調製し、標識した
オリゴヌクレオチドを種々の時間、この上澄中でインキ
ュベーションした。インキュベーションのあと、オリゴ
ヌクレオチドを、血清核酸溶解分解について上に概略を
示したように、分解について評価した。オートラジオグ
ラフィーの結果を、未修飾、ホスホロチオエート、およ
び２′−修飾のオリゴヌクレオチドの比較のために定量
した。
これらの試験系を利用して、位置12および14の２−デ
オキシ−２′−フルオロ置換されたヌクレオチド、およ
びホスホロチオエート主鎖、を有する15量体オリゴヌク
レオチドの安定性を研究した。対照として、未置換ホス
ホジエステルオリゴヌクレオチドは、１時間以内に50％
分解し、20時間内に100％分解した。ホスホロチオエー
ト主鎖を有する２′−デオキシ−２′−フルオロ置換オ
リゴヌクレオチドについて比較すると、分解は20時間後
に10％未満に限定された。
B.2′−修飾オリゴヌクレオチドの特定エンド−および
エキソ−ヌクレアーゼに対する耐性の評価 天然ならびに２′−修飾オリゴヌクレオチドの、特定
のヌクレアーゼ（すなわち、エンドヌクレアーゼ、
３′,5′−エキソ、および５′,3′−エキソヌクレアー
ゼ）に対する耐性の評価を行なって、分解に関する修飾
の正確な効果を決定した。修飾オリゴヌクレオチドを、
種々の選択されたヌクレアーゼに特異的な限定された反
応緩衝液中でインキュベーションした。生成物をプロテ
ィナーゼＫで処理した後、尿素を加え、尿素を含む20％
ポリ−アクリルアミドゲルについての分析を行なった。
ゲル生物を、ステインズ・オール（Stains All）［シ
グマ・ケミカル社（Sigma Chemical Co.）］を用いる
染色によって目に見えるようにした。レーザーデンシト
メトリーを使用して分解の程度を定量した。２′−修飾
の効果を特定のヌクレアーゼに対して決定して、血清お
よび細胞質系から得た結果と比較した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ ｓ．，17（1989）Ｐ．239−252

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】RNAまたはDNAとハイブリダイズするヌクレ
    アーゼ耐性化合物であって、それぞれリボースまたはデ
    オキシリボース糖部分および塩基部分を含む、共有結合
    により結合した複数のヌクレオシドを含み； 前記ヌクレオシドは前記ヌクレオシドの塩基部分がRNA
    塩基配列またはDNA塩基配列に相補的な混合塩基配列を
    形成するようにヌクレオシド間結合により互いに連結し
    ており；かつ 少なくとも２つの前記ヌクレオシドは２′−デオキシ−
    ２′−フルオロフラノシル部分を含む ことを特徴とする化合物。
  2. 【請求項２】少なくとも１つの２′−デオキシ−２′−
    フルオロリボフラノシル部分を有する、請求項１記載の
    ヌクレアーゼ耐性化合物。
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