JPH0812111B2 - けい光分光光度計のけい光励起スペクトルおよびけい光発光スペクトルの補正方法 - Google Patents

けい光分光光度計のけい光励起スペクトルおよびけい光発光スペクトルの補正方法

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JPH0812111B2
JPH0812111B2 JP1081776A JP8177689A JPH0812111B2 JP H0812111 B2 JPH0812111 B2 JP H0812111B2 JP 1081776 A JP1081776 A JP 1081776A JP 8177689 A JP8177689 A JP 8177689A JP H0812111 B2 JPH0812111 B2 JP H0812111B2
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俊介 小林
裕孟 亀井
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Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、けい光分光光度計のけい光励起スペクト
ルおよびけい光発光スペクトルの補正方法に関するもの
である。
〔従来の技術〕
光源(励起光)の分光特性を測定するには大別して、 1)励起光の光エネルギーをすべて熱エネルギーに変換
して発生する熱量を測る方法……サーモパイル,ボロメ
ータ 2)励起光により光化学反応を起こさせ、その結果生ず
る化学物の量を測定する方法……ケミカルアクチノメー
タ 3)けい光性分子を利用して励起光を特定の波長の光に
変換し、その強度を測る方法……光量子計 などがある。
このうち、3)の光量子計が最も高感度で、かつ取扱
いやすいので、この方法について簡単に説明する。
光量子計は色素のけい光を利用したものであり、原理
は F(λexem)∝Iabs(λex)・ψ(λexem)…
(1) ここに F(λexem):けい光強度 Iabs(λex):光吸収量 ψ(λexem):けい光量子収率 Iabs(λex)=Iex(λex)・(1−10-OD) …(2) ここに Iex(λex):励起光強度 また、OD=∈(λex)・cd ここに ∈(λex):分子吸光係数 c:色素の濃度 d:光路長(色素試料の厚さ) この場合、下記2条件を満足する必要がある。
条件1) 色素溶液の濃度を高め、励起光が試料の表面
近くで全部吸収されてしまうようにすること(完全吸
収) OD=∈cd》1 (1−10-OD)1 したがって、第(2)式は Iabs(λex)Iex(λex) 条件2) けい光量子収率は励起波長λexに依存しない
こと、 上記から F(λexem)∝Iex(λex) つまり、けい光強度は条件1),2)を満足するすべて
の波長において励起光強度に比例する。
次に、けい光励起スペクトルの補正とけい光発光スペ
クトルの補正について説明する。
(i)けい光励起スペクトルの補正 λexを測定試料の吸収波長域を走査し、λemは測定試
料の発光波長に固定しておく、 前記第(1)式において、 F(λex)∝Iabs(λex)・ψ(λex) ∝Iex(λex)・(1−10-OD)ψ(λex) 試料が希薄溶液(OD<0.1以下)の場合は (1−10-OD)OD=∈(λex)cd したがって、 ψ(λex)が励起波長に依存しないと仮定すると、
補正したけい光励起スペクトルF(λex)/Iex(λex
は吸収スペクトルOD(λex)に一致する。
(ii)けい光発光スペクトルの補正 λexを測定試料の吸収波長に固定し、λemを測定試料
の発光波長域を走査する。
ある装置で測定されたみかけのけい光発光スペクトル
Fobs(λem)は、 Fobs(λem)=D(λem)・Mem(λem)・F(λem) ここに D(λem):検出器(光電子増倍管)の分光感度特性 Mem(λem):発光側の分光感度特性F(λem)は真の
けい光発光スペクトル 何らかの方法により補正係数1/D(λem)・M
em(λem)を求め真のけい光発光スペクトルを求める。
補正係数の求め方は分光特性既知の光源を使い検出系
の分光感度特性を較正する。
λex=λem 励起,発光両分光器の波長を同時に走査
励起側からの光Iex(λex)を反射板などを使って発光
側モノクロメータに入射して補正係数を求める。すなわ
ち、 となる。
従来の定常光励起けい光分光光度計の一例を第8図に
示す。この図において、10は光源で、レンズ11を介して
励起側分光器20に光束を入射する。励起側分光器20はス
リットS,平面鏡M1,凹面鏡M2,回折格子G等で構成され、
回折格子Gで分光された光が出射し、レンズ12を介して
試料100に入射する。30は発光側分光器で、スリットS,
平面鏡M1,凹面鏡M2,回折格子G,光電子増倍管Tから構成
される。なお、Bはレンズである。
次に動作について説明する。
試料100として、ローダミンB/エチレングリコールを
例にとる。発光側分光器30の波長を620nmに固定し、励
起側分光器20の波長を250〜600nmで走査する。
Iex(λex)∝F(λex)∝VPM(λex) ここにVPM(λex)は光電子増倍管Tの出力である。
上記従来の光量子計は、色素溶液の調整が簡単であ
り、けい光計配置のままで測定が可能であるという特徴
がある。
〔発明が解決しようとする課題〕
しかし、けい光励起スペクトルは、光源10の分光強度
分布,励起側分光器20の分光特性に依存し、また、けい
光発光スペクトルは、発光側分光器30の分光特性と、検
出器である光電子増倍管Tの分光感度特性に依存する。
したがって、分光感度を装置ごとに補正しなければなら
ない。
けい光分光光度計の分光感度を補正するには、A)分
光強度分布既知の光源か、B)分光感度特性既知の検出
器が必要である。
A)としては、各種標準ランプなどがあり、B)には
熱電堆,光量子計などを必要とするという問題点があっ
た。
標準ランプ,熱電堆などは取扱いが難しく、正確な較
正をするためには熟練を要する。
また、比較的取扱いが容易なため広く利用されている
光量子計においては、使用可能な波長領域が限定され
る。すなわち、600nm以上で使用できるものはほとんど
ない(600nm以上は標準ランプを用いて較正されてい
た)。試料が溶液(液体)であるため、液体のままの保
存はむずかしいばかりでなく、揮発性のため取扱いはや
っかいである。また、光化学反応による劣化があり、色
素の精製が比較的困難であり、濃厚溶液として使用する
ため感度がやや劣る。さらに、完全吸収の仮定が成立し
ないことや、ψ(λex)一定の仮定が成立しないこと
がある等の問題点があった。
この発明は上記従来の問題点を解決するためになされ
たもので、けい光分光光度計に依存している因子を補正
し、装置に依存しない、つまり、どのけい光分光光度計
で測定しても同一なけい光励起スペクトルおよびけい光
発光スペクトルが得られる補正方法を提供することを目
的とする。
〔課題を解決するための手段〕
この発明にかかるけい光分光光度計のけい光励起スペ
クトルの補正方法は、励起側分光器の出力を特性が既知
のフォトダイオードに入射せしめ、このフォトダイオー
ドの出力を用いてけい光励起スペクトルの補正を行うも
のである。
また、この発明にかかるけい光分光光度計のけい光発
光スペクトルの補正方法は、励起側分光器の出力を拡散
板を介して特性が既知のフォトダイオードに入射せしめ
るとともに、同時に発光側分光器に入射せしめ、フォト
ダイオードの出力を用いてけい光発光スペクトルの補正
を行うものである。
〔作用〕
この発明のけい光励起スペクトルの補正方法ならびに
けい光発光スペクトルの補正方法は、ホトダイオードの
感度が高く、ダイナミックレンジが広い、さらに、分光
特性が平坦であるなどの特性により、測定値の補正が正
確に行われる。さらに、ホトダイオードの分光特性は、
通常の条件下では経年劣化はほとんどないため、常に正
確な値を得ることができる。
〔実施例〕
第1図はこの発明にかかるけい光励起スペクトルの補
正方法を実施するための装置を示しており、200はこの
発明において用いたホトダイオードであって、その特性
を第2図に示す。201は増幅器を示し、その他は第8図
と同じである。ただし、この実施例では、レンズ13以下
発光側分光器30は使用しない。
第2図はシリコンフォトダイオード(浜松ホトニック
スS1336−8BQ)をホトダイオード200として用いた場合
の量子効率(光電流/入射光量)の波長依存性の特性図
であり、200nmから1.1μmまで感度を持っている。ホト
ダイオード200は、275nmおよび370nmで感度が減少する
他は、ほぼ一定の高率である。特に、450nmから980nmま
では65〜67%とほぼ一定の値である。
さて、ある波長λemで観測すると、希薄溶液の場合け
い光強度は F(λexem)∝Iexex)・OD(λexexem) となり、ψ(λex)がλexによらず一定であり、I
(λex)が既知であれば、けい光励起スペクトルF(λ
exem)は吸収スペクトルに比例する。
第3図にホトダイオード200で求めたI(λex)の曲
線Iと光量子計で求めたそれとの比を曲線IIで示す。な
お、光量子計としては、ローダミンBのエチレングリコ
ール溶液(8g/)を直角三角セルに入れて用いた。標
準けい光溶液としては、4−ジメチルアミノ4′−ニト
ロスチルベン(DMANS)の0−ジクロルベンゼン溶液を
用いた。励起光は150W Xeショートアークランプからの
光を焦点距離25cmの分光器で分光した。試料からの発光
は励起光に対し直角方向から2枚の石英レンズで集光
し、焦点距離60cmの分光器で分光し、光電子増倍管R943
−02−光子計数器で検出した。
第4図にDMANSの吸収スペクトル曲線Iと、けい光励
起スペクトル(ホトダイオード100で測定した励起光強
度で補正)曲線IIとを示す。両はよく一致している。
第5図はこの発明に係るけい光分光光度計のけい光発
光スペクトル補正方法を実施するための装置を示してお
り、201は増幅器、202は拡散板であり、その他は第1図
と同じである。
ある波長λexで励起したけい光発光スペクトルは F(λem)∝S(λem)・ψ(λem) で、発光検出系(集光光学系−分光器−光電子増倍管)
の分光感度特性を含む見かけのものである。真の発光ス
ペクトルを得るためには、S(λem)を決定しなければ
ならない。発光スペクトルが600nm以下の場合は光量子
計によりS(λem)を決定できるが、600nmから近赤外
にかけては、使える光量子計はなく、タングステン標準
ランプなどを用いなければならない。
光量子計を用いる場合、試料位置で光源10の分光特性
を決め、次に散乱板(反射率は波長に依存してはならな
い)202に代え、散乱光により検出系のS(λem)を決
める。この方法では、散乱板202の位置やレンズ13の収
差等、測定上の困難が多いが、ホトダイオード200を用
いたこの発明によれば、散乱板202の反射率は波長に依
存しても構わず、また、素子は小型で高感度であるた
め、任意の場所に容易に設定できる。
本手法の有効さを示すため、700nm付近にけい光発光
スペクトルを有する試料(バクテリオロドプシン)の測
定例を第6図に示す。第6図の曲線Iは未補正の発光ス
ペクトル、曲線IIは補正曲線、曲線IIIは補正を施した
測定曲線である。
標準試料として報告されているDMANSの発光スペクト
ルと比較するためには、スペクトルを波長表示から端数
表示に変換しなければならない。結果を第7図に示す。
求めた発光スペクトル(実線)は報告されている●印と
比較し、低波数側では幾分小さくなっているが、高波数
側ではほぼ一致している。
なお、フォトダイオードの分光特性(分光感度特性)
が既知であれば、この分光感度特性を数値処理で補正し
てやれば分光感度依存性がなくなるので、分光特性が平
坦でないフォトダイオードも使用できる。
〔発明の効果〕
以上詳細に説明したように、この発明にかかるけい光
分光光度計のけい光励起スペクトルの補正方法は、励起
側分光器の出力を特性が既知のフォトダイオードに入射
せしめ、その出力を用いてけい光励起スペクトルの補正
を行うので、また、同じく発光スペクトル補正方法は励
起側分光器の出力を拡散板を介して特性が既知のフォト
ダイオードに入射せしめるとともに、発光側分光器に入
射せしめ、フォトダイオードの出力を用いてけい光発光
スペクトルの補正を行うので、近赤外光領域を含む広い
波長領域で分光特性の補正ができる。また、フォトダイ
オードを使用したことにより、従来のローダミンBエチ
レングリコール溶液光量子計とは異なる電気信号に変換
する機能を追加する必要がなく、また固体素子であるた
め半永久的に使用ができ、しかも取扱が簡単であり、け
い光の補正のために使用できる波長が従来の光量子計が
450〜580nmと限定されているのに対し、200〜1000nmと
広くなり、さらに400〜1000nmでは変換効率が一定であ
り、完全吸収の条件が不要で高感度である等の利点があ
る。
【図面の簡単な説明】
第1図はこの発明に係るけい光励起スペクトル補正方法
の一実施例を説明するための装置の構成略図、第2図は
この発明に用いるシリコンフォトダイオードの特性図、
第3図はホトダイオードで求めたI(λex)の曲線と光
量子計で求めたそれとの比の曲線を示す図、第4図はDM
ANSの吸収スペクトル曲線とけい光励起スペクトル曲線
を示す図、第5図はこの発明にかかるけい光発光スペク
トル補正方法の一実施例を説明するための装置の構成略
図、第6図は求めた分光感度と補正前後のバクテリオロ
ドプシンの発光スペクトルを示す図、第7図は発光スペ
クトルの補正前と補正後の曲線を示す図、第8図は従来
の光量子計の一例を示す構成略図である。 図中、10は光源、11,12,13はレンズ、20は励起側分光
器、30は発光側分光器、200はホトダイオード、201は増
幅器、202は拡散板、Sはスリット、M1は平面鏡、M2
凹面鏡、Gは回折格子、Tは光電子増倍管である。

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】光源からの近赤外光を含む光を励起側分光
    器に入射し、この励起側分光器で分光された所定波長の
    光を試料に照射し、この試料から発したけい光を検出器
    で検出してけい光励起スペクトルを測定するけい光分光
    光度計において、前記励起側分光器の出力を分光特性が
    既知のフォトダイオードに入射せしめ、このフォトダイ
    オードの出力を用いて近赤外光領域を含むけい光励起ス
    ペクトルの補正を行うことを特徴とするけい光分光光度
    計のけい光励起スペクトルの補正方法。
  2. 【請求項2】光源からの近赤外光を含む光を励起側分光
    器に入射し、この励起側分光器で分光された所定波長の
    光を試料に照射し、この試料から発したけい光を発光側
    分光器に入射し、その出力を検出器で検出してけい光発
    光スペクトルを測定するけい光分光光度計において、前
    記励起側分光器の出力を拡散板を介して特性が既知のフ
    ォトダイオードに入射せしめるとともに、同時に前記発
    光側分光器に入射せしめ、前記フォトダイオードの出力
    を用いて近赤外光領域を含むけい光発光スペクトルの補
    正を行うことを特徴とするけい光分光光度計のけい光発
    光スペクトルの補正方法。
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