JPH0811064B2 - ウシヘルペスウイルス−１のチミジンキナ−ゼ欠失突然変異体 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、チミジンキナーゼ遺伝子（以下「tk」と表
示する場合あり）中の欠失の結果として機能的チミジン
キナーゼまたはチミジンキナーゼタンパク質（以下「T
K」と表示する場合あり）を生産することができないウ
シヘルペスウイルス１型、それを含有する感染性ウシ鼻
気管支炎（rhinotracheitis）に対するワクチン、およ
びその生産法および使用に関する。

発明の背景 Ｉ、感染性ウシ鼻気管支炎 ウシヘルペスウイルス１型（以後「BHV-1」）、より
普通には感染性ウシ鼻気管支炎ウイルス（以後「IBR
V」）として知られている、はウシの呼吸、生殖、腸、
眼、中枢神経系、新生児、***および皮膚の感染に関連
づけられてきた。IBRVと気道の病気との関連の証拠は、
最初に1950年代初期に得られた。それ以来、感染性ウシ
鼻気管支炎（以後「IBR」）は世界中に分布することが
明らかになった。臨床的症候は過温症、食欲欠乏および
抑うつの急激な開始によって特徴づけられる。呼吸器粘
膜の上皮表面の過酷な炎症は、壊死性鼻気管支炎にしば
しば進行する［シュレーダー（Schroeder）,R.J.および
モイス（Moys）,M.D.ジャーナル・オブ・アメリカン・
ベテリナリー・メディカル・アソシエーション（J. Am.
Vet. Med. Assoc.）125:471-472（1954）；マクケルチ
ャー（McKercher）,D.G.,モウルトン（Moulton）,J.E.
およびジャスパー（Jasper）,D.E.,Pro. U.S. Livestoc
k Sanit. Assoc.,58:260-269（1955）：ギップス（Gibb
s）,E.P.J.およびルウェイマム（Rweyemamu）,M.M.,ザ
・ベテリナリー・ブレチン（The Vet. Bull.）,47:317-
343（1977）；カールス（Kahrs）,R.F.,ジャーナル・オ
ブ・アメリカン・ベテリナリー・メディカル・アソシエ
ーション（J. Am. Vet. Med. Assoc.）171:1055-1066
（1977）；ムールシイ（Moorthy）A.R.S.,ベテリナリー
・レコード（Vet. Record）,113:217-218（1983）；グ
イ（Guy）,J.S.,ポトギエター（Potgieter）,L.N.D.,マ
ククラッケン（McCracken）,M.およびマーチン（Marti
n）,W.,アメリカン・ジャーナル・オブ・ベテリナリー
・リサーチ（Am. J. Vet. Res.）45:783-785（1984）；
およびエンジェルス（Engels）,M.,ステック（Steck）,
F.およびワイラー（Wyler）,R.,アーチーブス・オブ・
バイロロジー（Arch. Virol.）67:169-174（1981）参
照］。

呼吸の形態の病気の自然の突発において、おびただし
い***物、結膜の広い範囲の充血および浮腫により発現
される結膜炎はまた顕著である。感染性膿疱性外陰部膣
炎および亀頭***は、また、BHV-1により引き起され、
そして外陰膣およびおよび***粘膜の充血により特徴づ
けられる。これは膿疱の形成およびおよび潰瘍化の導く
ことがある。

自然に妊娠しおよび人工的に妊娠させた畜牛（cattl
e）における病気の広がりは、ことに凍結***を連続的
に広く使用したとき、重大な問題を生じさせる。感染し
た雄牛からのウイルスの再発する脱落は、また、米国に
おける人工的***注入に対しておよびウシ胚形質の世界
中に分布に対して重大な脅威を構成する。BHV-1を不妊
症および生殖不能症を生じさせる卵巣炎および卵管炎の
病理因子とみなすことは、感染の重大性を増大させる。

BHV-1は、流産、死産および不妊症の原因として広く
認識されている。ほとんどの自然に発生する流産は、妊
娠の４〜７か月の間に起こるが、畜牛は妊娠を通じてBH
V-1の感染から流産することがある。呼吸器の病気およ
び結膜炎は、流産の前に観測されること、あるいは観測
されないことがある。

髄膜脳炎はBHV-1の感染の続発症の他のものである。
向神経性症候は生後６か月の子牛において最も頻繁に観
察される。脳炎の割合は特定の動物から群れの大きい部
分にわたって変化することがある。

畜牛以外の種のBHV-1感染は記載された［フルトン（F
ulton）,R.W.,ダウニング（Downing）,M.M.およびハグ
スタッド（Hagstad）,H.V.アメリカン・ジャーナル・オ
ブ・ベテリナリー・リサーチ（Am. J. Vet. Res.）43:1
454-1457（1982）およびルプトン（Lupton）,H.W.,バー
ネス（Barnes）,H.J.およびリード（Reed）,D.E.,コー
ネル・ベテリナリアン（Cornell Vet.）70:77-95（198
0）参照］。自然の感染はブタ、ヤギ、スイギュー、ヌ
ー、フェレットおよびミンクにおいて起こる。BHV-1は
ブタにおける膣炎および亀頭炎の動物流行病について非
難され、そしてBHV-1は生殖の問題の歴史をもつ群れの
中の死産および新産の豚から単離された。血清学の研究
に従い、アイオワ州およびテキサス州の群れからの豚の
血清の約11％はBHV-1抗体の力価を含有する。実験の感
染は豚の胎児、ヤギ、ミュールジカ、フェレットおよび
ウサギにおいて確立された［ジョー（Joo）,H.S.,ディ
ー（Dee）,S.A.,モリター（Molitor）,T.W.およびサッ
カー（Thacker）,B.J.アメリカン・ジャーナル・オブ・
ベテリナリー・メディカル・アソシエーション（Am. J.
Vet. Med. Assoc.）45:1924-1927（1984）参照］。

BHV-1感染から生ずる病気の過酷さは、ウイルスの菌
株および感染した動物の年令に依存する。感染からの回
復後、動物はウイルスへ再暴露せずに再発する病気の臨
床的徴候を示すことがある。再暴露なしに再発する病気
は、ウイルスが休眠してとどまる、すなわち、潜状する
ために、宿主の感覚神経節のノイロンにおいて起こり、
そして長期間後でさえ再活性化されうる［ホウマン（Ho
man）,E.J.およびイースターデイ（Easterday）,B.C.,
ジャーナル・オブ・インフェクシャス・ディジージズ
（J. Infect. Dis.）146:97（1982）；ホウマン（Homa
n）,E.J.およびイースターデイ（Easterday）,B.C.,ア
メリカン・ジャーナル・オブ・ベテリナリー・リサーチ
（Am. J. Vet. Res.）44:309-313（1983）；およびアッ
カーマン（Ackermann）,M.,ペーターハンス（Peterhan
s）,E.およびワイラー（Wyler）,R.,アメリカン・ジャ
ーナル・オブ・ベテリナリー・リサーチ（Am. J. Vet.
Res.）43:36-40（1982）参照］。デクサメタゾーン処置
は、また、活性のIBRの臨床的症候を示すかあるいは示
さないで、ウイルスの鼻の脱落を発生させることがあ
る。これにより示唆されるように、再活性化およびノイ
ロン部位からの開放および、多分、他の組織の持続した
感染は起こることがある［ロッシ（Rossi）,C.R.,キー
セル（Kiesel）,G.K.およびランフ（Rumph）,P.R.,アメ
リカン・ジャーナル・オブ・ベテリナリー・リサーチ
（Am. J. Vet. Res.）43:1440-1442（1982）参照］。

II、既知のIBRワクチン 現在、３つの型のIBRワクチンが用いられている：
（１）殺したウイルスのワクチン、182）サブユニット
のクチン、そして（３）変性生ウイルス（以後「ML
V」）ワクチン［米国特許第3,925,544号、同第4,291,01
9号および同第3,634,587号参照］。殺したIBRワクチン
は、ウイルスを化学薬品、例えば、ホルマリンまたはエ
タノールおよび／または物理的因子、熱または紫外線照
射で処理することによって生産される。サブユニットの
IBRワクチンは、BHV-1感染細胞培養物を非イオン性洗浄
剤で可溶化することによって調製される。早期のMLVワ
クチンは非経口的投与のために案出され、そしてウシ細
胞培養物中の急速な継代培養により減衰されたウイルス
から成っていた。より最近、非経口的に投与されたMLV
ワクチンは、ブタまたはイヌ科の動物の培養物にBHV-1
を適合させることにより、低温（30℃）における細胞培
養物中の生長に適合させることにより、あるいは熱安定
性ウイルス粒子（56℃で40分）を選択することによって
減衰されてきた。MLVワクチンの特殊化された型は鼻内
に投与されるものである。これらのMLVワクチンはウサ
ギ細胞培養物中の系統的継代培養により、あるいはBHV-
1を亜硝酸で処理し、次いで温度感受性突然変異体を選
択することによって減衰される。温度感受性ウイルスは
約32℃〜38℃で効率よく複製するが、約39℃〜41℃で複
製しない［トッド（Todd）,J.D.,ボウレンス（Volenc
e）,F.J.およびペイトン（Paton）,I.M.,ジャーナル・
オブ・アメリカン・ベテリナリー・メディカル・アソシ
エーション（J. Am. Vet. Med. Assoc.）159:1370-1374
（1971）；カース（Kahrs）,R.F.,ヒルマン（Hillma
n）,R.B.およびトッド（Todd）,J.D.,ジャーナル・オブ
・アメリカン・ベテリナリー・メディカル・アソシエー
ション（J. Am. Vet. Med. Assoc.）163:437-441（197
3）；スミス（Smith）,M.W.,ミラー（Miller）,R.B.,ソ
ボボダ（Sovoboda）,I.およびラウソン（Lawson）,K.
F.,カナディアン・ベテリナリー・ジャーナル（Can. Ve
t. J.）19:63-71（1978）；ジグライチ（Zygraich）,
N.,ロブマン（Lobmann）,M.,バスコボイニク（Vascoboi
nic）,E.,バージ（Berge）,E.およびフイゲレン（Huyge
len）,C.,リサーチ・イン・ベテリナリー・サイエンス
（Res. Vet. Sci.）16:328-335（1974）；および米国特
許第3,907,986号および同第4,132,775号参照］。

現在入手可能なIBRワクチンのすべては重大な欠点を
有し、それゆえ、商業的使用において不満足であること
が証明された。さらに詳しくは、殺したIBRワクチンはM
LVワクチンより多少安全と考えられ、すなわち、潜在性
を確立することができず、そしてワクチン接種後の脱落
の問題を排除するが、生産が高価であり、数回投与しな
くてはならず、そして不利なことにはアジュバントを必
要とする。さらに、それらを使用すると、致死の過感作
反応および非致死のじんましんの可能性が存在する。さ
らに、ある感染性ウイルス粒子は殺す過程で生き残るこ
とがあり、こうして病気を引き起こす。その上、殺した
IBRワクチンを接種した畜牛は後にヴィルレントウイル
スで感染し、そしてヴィルレントウイルスを脱落し、こ
れにより群れの中に感染を広げることがある［フレリチ
ス（Frerichs）,G.N.,ウッズ（Woods）,S.B.,ルーカス
（Lucas）,M.H.,サンズ（Sands）,J.J.,ベテリナリー・
レコード（Vet. Record）111:116-122（1982）参照］。
１つの研究において、５成分のアジュバントを使用する
殺したIBRワクチンは免疫性の生成、病気の予防、およ
びヴィルレントウイルスの増殖および再分泌の抑制にお
いて完全に無効であることが発見された［ムソラ（Msol
la）,P.M.,ワイズマン（Wiseman）,A.,セルマン（Selma
n）,I.E.,ピリエ（Pirie）,H.M.およびアレン（Alle
n）,E.M.,ベテリナリー・レコード（Vet. Record）104:
535-536（1979）参照］。すなわち、ヴィルレントウイ
ルスへの対抗暴露後、ワクチン接種した動物はワクチン
接種しない動物と事実上同等の臨床的徴候およびウイル
ス分泌の応答を示した。さらに、自然の感染から回復し
た子牛と顕著に対照的に、これらの子牛はヴィルレント
ウイルスを非接触の対照に移した。こうして、殺したIB
RワクチンはIBRに対して多少の保護を提供できるが、一
般に長期の保護を与えることにおいてMLVワクチンより
も劣る。

サブユニットのワクチンは殺したウイルスのワクチン
よりもしばしば毒性が低いことがあるが、有意の値をも
つことがある新しい免疫原作用を誘導することがある。
サブユニットのワクチンを調製する技術はカプシド蛋白
質の除去し、同時に保護的免疫性を引き出す無傷の抗原
を残すことを包含する。これは自然に感染した動物から
ワクチン接種した動物を区別するために血清学的手順の
開発を潜在性をつくる。さらに、サブユニットのワクチ
ンは抗原性であることがあり、しかも生きているウイル
スを含有せず、こうして、他の動物に移らず、流産を引
き起こさず、あるいは潜状性を確立することができな
い。１つの研究において、サブユニットのワクチンの単
一の投与は対抗感染を顕著に変性し、そして２回の投与
はすべてのワクチン接種した動物において、10⁶PFUの標
準ヴィルレントBHV-1（Cooper）菌株接種で対応後、臨
床的病気およびウイルスの脱落を防止した。しかしなが
ら、潜状感染が確立したという可能性は結論することが
できなかった［ププトン（Lupton）,H.W.およびリード
（Reed）,D.E.,アメリカン・ジャーナル・オブ・ベテリ
ナリー・リサーチ（Am. J. Vet. Res.）41:383-390（19
80）参照］。成体において強い免疫応答を引き出すこと
が前もって分っている他のIBRサブユニットワクチンを
試験すると、このワクチンはより若い動物においてそれ
を引き出すことができず、そして動物を呼吸器の病気に
対して保護しなかった［レ（le）Q.ダーセル（Darce
l）,C.およびジェリチョ（Jericho）,K.,カナディアン
・ジャーナル・オブ・コンパレイティブ・メディシン
（Can. J. Comp. Med.）45:87-91（1981）参照］。サブ
ユニットのワクチンの他の欠点は、精製の高いコストお
よびアジュバントと一緒の数回の注射である。

MLV IBRワクチンは、急速な保護を生成しかつ免疫系
の細胞仲介成分およびホルモン成分を活性化するという
重要な利点を有する。鼻内のワクチン接種の場合におい
て、気道内のヴィルレントBHV-1の後の複製を抑制する
局在化免疫応答は保護に有意に寄与する。局在の免疫応
答は、鼻の分泌物中のインターフェロンおよび抗体の生
成を含む［クセラ（Kucera）,C.J.,ホワイト（White）,
R.G.およびベッケンハウエル（Beckenhauer）,W.H.,ア
メリカン・ジャーナル・オブ・ベテリナリー・リサーチ
（Am. J. Vet. Res.）39:607-610（1978）参照］。

MLB IBRワクチンの広い利用は、IBRの発生の頻度を減
少させた。しかしながら、入手可能なMLV IBRワクチン
はいすれも完全には満足すべきものではない。さらに詳
しくは、ことにワクチンのウイルス自体が潜在性を生成
し、そして脱落しかつ感受性の畜牛に移る場合、それら
の安全性に問題がある。入手可能なMLV調製物を使用す
るワクチン接種は、また、ヴィルレントBHV-1への暴露
後の潜状感染の防止において無効である。例えば、１つ
の研究において、BHV-1をブタ試験細胞中で43回継代培
養し、次いで30℃におけるウシの試験の単層培養物中の
８回の継代培養することにより得られたMLV IBRワクチ
ンを使用して子牛をワクチン接種した［ナリタ（Narit
a）,M.,イヌイ（Inui）,S.,ナンバ（Nanba）,K.および
シミズ（Shimizu）,Y.,アメリカン・ジャーナル・オブ
・ベテリナリー・リサーチ（Am. J. Vet. Res.）41:199
5-1999（1980）参照］。子牛をヴィルレントBHV-1に対
抗暴露後49日に、子牛をデキサメタゾーンで処置し、そ
して潜状ウイルス感染が再発感染の徴候により証明され
た。

筋肉内（以後「IM」）に投与されたMLV IBRワクチン
の最大の利用は、ことにワクチン誘導流産の危険により
阻止された。すなわち、60％程度に高い流産率があるML
V IBRワクチンのIM注射後に報告された［カース（Kahr
s）,R.F.,ジャーナル・オブ・アメリカン・ベテリナリ
ー・メディカル・アソシエーション（J. Am. Vet. Med.
Assoc.）171:1055-1064（1977）およびケンドリック
（Kendrick）,J.W.およびストラウブ（Straub）,O.C.ア
メリカン・ジャーナル・オブ・ベテリナリー・リサーチ
（Am. J. Vet. Res.）28:1269-1282（1967）参照］。さ
らに、現在使用されているMLV IBRワクチンでは、ウイ
ルスへの復帰の危険が存在する。

より安全なMLV IBRワクチンの研究において、特殊化
されたワクチンが開発された［トッド（Tood）,J.D.,ボ
ウレンク（Volenc）,F.J.およびパトン（Paton）,I.M.,
ジャーナル・オブ・アメリカン・ベテリナリー・メディ
カル・アソシエーション（J. Am. Vet. Med. Assoc.）1
59:1370-1374（1971）；カース（Kahrs）,R.F.,ヒルマ
ン（Hillman）,R.B.およびトッド（Tood）,J.D.,ジャー
ナル・オブ・アメリカン・ベテリナリー・メディカル・
アソシエーション（J. Am. Vet. Med. Assoc.）163:427
-441（1973）；スミス（Smith）,M.W.,ミラー（Mille
r）,R.B.,スボボダ（Svoboda）,I.およびラウソン（Law
son）,K.F.,カナディアン・ベテリナリー・ジャーナル
（Can. Vet. J.）19:63-71（1978）；ジグライヒ（Zygr
aich）,N.,ロブマン（Lobmann）,M.,バスコビニク（Vas
coboinic）,E.,バージ（berg）,E.およびフイゲレン（H
uygelen）,C.,リサーチ・イン・ベテリナリー・サイエ
ンス（ Res. Vet. Sci.）16:328-335（1974）；およびク
セラ（Kucera）,C.J.,ホワイト（White）,R.G.およびベ
ッケンハウエル（Beckenhauer）,W.H.,アメリカン・ジ
ャーナル・オブ・ベテリナリー・リサーチ（Am. J. Ve
t. Res.）39:607-610（1978）参照］。これらのワクチ
ンは妊娠した畜牛への鼻内（以後「IN」）接種に対して
免疫原性でありかつ安全であり、そしてヴィルレントBH
V-1に対抗暴露した妊娠した乳牛（cow）における流産を
防止できることがわかった。しかしながら、それらはIN
道筋でのみ投与できるとう欠点を有する。なぜなら、IN
で投与すると、１つのこのようなワクチンは気道の上部
の低い温度において制限された程度に複製するからであ
る。しかしながら、IM投与すると、このワクチンは正常
の体温において複製の程度が劣るか、あるいはまったく
複製しない［ジグライヒ（Zygraich）,N.,ロブマン（Lo
bmann）,M.,バスコボニニク（Vascoboinic）,E.,バージ
（Berge）,E.およびフイゲレン（Huygelen）,C.,リサー
チ・イン・ベテリナリー・サイエンス）Res. Vet. Sc
i.）16:328-335（1974）参照］。他方において、他のIB
Rワクチンは妊娠した動物にへのIM投与のためには不十
分に減衰されているが、IN投与するときは安全である
［トッド（Todd）,J.D.,ジャーナル・オブ・アメリカン
・ベテリナリー・メディカル・アソシエーション（J. A
m. Vet. Med. Assoc.）163:427-441（1973）参照］。さ
らに、ワクチンの菌株のあるものは、IN投与後でさえ、
おだやかなあるいは中程度の呼吸器の病気を生成し、そ
して現場の（field）対抗暴露後にIBRの徴候を防止しな
い［カース（Kahrs）,R.F.,ヒルマン（Hillman）,R.B.
およびトッド（Todd）,J.D.,ジャーナル・オブ・アメリ
カン・ベテリナリー・メディカル・アソシエーション
（J. Am. Vet. Med. Assoc.）163:427-441（1973）参
照］。

したがって、妊娠した乳牛に対して安全ではないIM投
与のMLV IBRワクチンおよびIN投与でなくてはならないM
LV IBRワクチンは、いずれも、現在の管理の実施の多く
に快適に適合しない。すなわち、IN道筋による多数の畜
牛のワクチン接種は、不便でありかつ動物の取扱い者に
とって潜在的に危険である。さらに、免疫化前において
妊娠した動物を同定するためのスクリーニングは、しば
しば望ましくなく、あるいはコストに影響を及ぼす。ス
トレスを受けた飼育用地の畜牛、繁殖用雄牛、およびさ
らには妊娠した乳牛においてINまたはIMのいずれにおい
ても安全に投与できるワクチンの開発は、病気の予防を
促進し、コストにより効果的であり、そして現在の管理
の養生法に適合する。本発明はこれらの要求を満足する
ために開発された。

III、チミジンキナーゼ陰性ヘルペスウイルス突然変異
体の減衰された性質 最近、現在入手可能なワクチンの使用を制限した問題
の多くを克服する、温度耐性、チミジンキナーゼ陰性
（以後「tk^-」）IBRワクチンが開発された［キット（Ki
t）,S.およびクアビ（Qavi）,H.,ウイルス学（Virol.）
130:381-389（1983）および米国特許出願第516,179号、
1983年７月21日提出参照］。このBHV-1突然変異体は、
ウサギ皮膚およびウシ気管またはウシ鼻介骨の細胞中で
39.1℃または34.5℃において等しくよく複製する。対照
的に、温度感受性BHV-1菌株は34.5℃と同じようによく3
9.1℃においてわずかに10^-4〜10^-7だけ複製する。さら
に、この突然変異体は突然変異原誘導突然変異の結果と
して感染した細胞中で機能的チミジンキナーゼ（以後
「tk」）酵素活性を生成する能力に欠ける。これらの２
つの特性、すなわち、温度耐性およびtk^-は、後に詳述
するワクチンとしてこのウイルスの優越性に直接寄与す
る。

温度感受性ウイルスは、特殊化された減衰されたウイ
ルスであり、そしてウイルスの複製に必須の遺伝子中に
突然変異体を含有する。すなわち、それらは「弱化した
（crippled）」ウイルスであり、そして、正常の体温に
おいて、複製したとしても、その程度はわずかである。
したがって、温度感受性の突然変異体をもつIN投与され
るワクチンのウイルスは、より低い温度を有する気道上
部の表面上皮細胞に限定しなくてはならない。さらに、
IN投与されたワクチンのウイルスはIM投与されたワクチ
ンのウイルスよりも鼻の分泌物中により多くのウイルス
を規則的に脱落し、そして正規の非温度感受性ウイルス
と同様に容易に潜状性を生成する。他方において、温度
耐性ウイルスは39.1℃で効率よく複製し、そしてウイル
スの複製に要求される遺伝子中の「弱化する」突然変異
体により減衰されない。さらに、それらは温度感受性ウ
イルスよりも強い免疫応答を生成する。なぜなら、より
高い温度に対する耐性のために、それらは体内のより深
い組織中でかつ熱性の動物中で効率的に複製することが
できるからである。その上、IM、INまたは他の道筋によ
るこれらのウイルスの投与を選択することができる。

ヘルペスウイルス暗号化（encoded）TK酵素は、免疫
学的性質および生化学的性質において宿主細胞のTK酵素
と区別される。ヘルペスウイルスTK酵素は非分割性細胞
中のヘルペスウイルスの複製を促進する。多くのヘルペ
スウイルスは、非分割性細胞中で通常生産的感染かつ潜
状的感染の両者の能力をもつ神経親和性のウイルスであ
るので、tk^-ウイルスの突然変異体は野生型のチミジン
キナーゼ陽性（以後「tk⁺」）菌株よりも神経親和性が
低いであろう。

動物のモデル系を利用する多くの最近の実験は、単純
ヘルペス１型（以後「HSV-1」）tk遺伝子がヴィルレン
スに重要であることを立証している［クレイン（Klei
n）,R.J.,アーチーブス・オブ・バイロロジー（Arch. V
irol.）72:143-160（1982）参照］。これらの研究が示
すように、HSV-1のtk^-突然変異体はマウス、ウサギおよ
びモルモットにおいてヘルペス・エンセファリチス（he
rpes encephalitis）、ヘルペス・ケラチチス（herpes
keratitis）およびヘルペス・ラビアリス（herpes labi
alis）についての病原性を減少した。さらに、tk^-HSV-1
突然変異体は：（ｉ）潜状性から再活性化する蛍光が少
ない；（ii）実験室動物をヴィルレントtk⁺ウイルスか
らの致死の感染に対して保護する；そして（iii）重感
染性ヴィルレントtk⁺ウイルスによる感受性神経節のコ
ロニー化の可能性を減少する。

HSV-2のtk^-突然変異体、ヘルペスウイルス・タマリヌ
ス（Herpesvirus tamarinus）および偽狂犬病ウイルス
は、また、親tk⁺菌株よりもヴィルレンスが低い。さら
に、tk偽狂犬病ウイルス突然変異体をtk遺伝子を暗号化
するDNA断片と組み換えることによりtk⁺機能を回復させ
ると、マウスについてのヴィルレンスが増加し、これに
対して後者の組み換えtk⁺ウイルスのもう一度tk^-突然変
異体に再び転化すると、マウスについてのヴィルレンス
は減少する［キット（Kit）,S.,クアビ（Qavi）,H.,ダ
ッブス（Dubbs）,D.R.およびオウツカ（Otsuka）,H.,ジ
ャーナル・オブ・メディカル・バイロロジー（J. Med.
Virol.）12:25-36（1983）およびキット（Kit）,S.,キ
ット（Kit）,M.およびパートル（Pirtle）,E.C.,アメリ
カン・ジャーナル・オブ・ベテリナリー・リサーチ（A
m. J. Vet. Res.）46:1359-1367（1985）参照］。

モルモットにおいて、HSV-2のtk⁺菌株は膣および脊髄
の中で高い力価に複製する。tk⁺ウイルスで膣内感染し
たモルモットは、重い膀胱潰瘍性性器病変、尿の保持、
後足の麻痺、および動物の約25％〜33％の死を示した。
膣のウイルスの複製の開始、大きさおよび期間は、tk⁺H
SV-2の接種後に観測されたものと、tk^-HSV-2接種後にお
いてほぼ同一である。しかしながら、tk^-HSV-2を接種し
たモルモットは死を示さず、臨床的病気をほとんどある
いはまったく示さず、そしてわずかの力価が脊髄のホモ
ジネートの培養物中に検出された［スタンベリー（Stan
berry）,L.R.,キット（Kit）,S.およびマイアース（Mye
rs）,M.G.ウイルス学誌（J.Virol.）55:322-328（198
5）参照］。さらに、tk^-HSV-2によるモルモットのワク
チン接種は引続くtk⁺HSV-2の性器の感染を軽減する。す
なわち、tk⁺HSV-2による再感染は臨床的に明瞭ではな
く、tk⁺HSV-2の膣の複製は減少され、そして神経節の感
染は防止される。

実験動物を使用する前のモデル実験に加えて、自然の
宿主について偽狂犬病ウイルスのtk^-欠失突然変異体の
減衰された性質が立証された［米国特許第4,514,497号
およびキット（Kit）,S.,キット（Kit）,M.およびパー
トル（Pirtle）,E.C.,アメリカン・ジャーナル・オブ・
ベテリナリー・リサーチ（Am. J. Vet. Res.）46:1359-
1367（1985）参照］。

生後５〜６週の豚について実施した予備実験は、偽狂
犬病ウイルスtk^-欠失突然変異体の安全性および効能を
提供した。これらの実験によると、7.5×10⁸PFUの偽狂
犬病ウイルスtk^-欠失突然変異体をIMまたはINワクチン
接種し、次いで非常に高い投与量の６×10⁸PFUの偽狂犬
病ウイルスの高度にヴィルレントのインジアナ−フンッ
クハウゼル（Indiana-Funkhauser）（Ind-F）菌株でIN
対抗暴露した豚は、ワクチン接種後または対抗暴露後に
病気の臨床的徴候を有しなかった。ワクチン接種しない
豚は、究極的に回復する前に、死ぬかあるいは死にかけ
た。テキサス州における隔離したブタの群れについての
他の研究において、700頭より多いグロワー−フィニシ
ャー（grower-finisher）ブタ、224頭の養殖場のブタ、
妊娠のすべての段階における128頭の雌、７頭の雄豚、
および224頭の子豚を悪い反応をもたせないで免疫化し
た［キット（Kit）,S.,キット（Kit）,M.,ラウホーン
（Lawhorn）,B.およびマクコンネル（McConnell）,S.,A
SM・バプリケイション・オン・プロシーディングス・オ
ブ・ザ・1984・ハイ・テクノロジー・ルート・ツ・ウイ
ルス・ワクチン（ASM Publication on Proceedings of
the 1984 High Technology Route to Virus Vaccine
s），アメリカン・ソサイアティ・フォー・マイクロバ
イロジー（American Society for Microbiology），ワ
シントン,D.C.82-99ページ（1985）参照］。最後に、高
度に感受性の子牛および離乳したばかりの子羊を10⁸PFU
より多い偽狂犬病ウイルスのtk^-欠失突然変異体でワク
チン接種したが、病気の徴候は観察されなかった。

温度耐性tk^-突然変異原誘導突然変異体BHV-1ワクチン
のウイルス、すなわち、BHV-1（B8-D53）（ATCC No.VR-
2066）の安全性および効能を評価するために天然の宿主
において２回の予備研究が、また、完結された［キット
（Kit）,S.,クアビ（Qavi）,H.,ガインス（Gaines）,J.
D.,ビリングスレイ（Billingsley）,P.およびマクコン
ネル（McConnel）,S.,アーチーブス・オブ・バイロロジ
ー（Arch. Virol.）86:63-84（1985）参照］。

最初の研究において、19頭のホルシュタイン去勢牛お
よび１頭のフリーマーチン、生後３か月、から成る群の
４つを使用した。群１は７頭の子牛からなり、これらは
２×10⁷PFUのBHV-1（B8-D53）でINまたは静脈内にワク
チン接種させ、そして56日後に1.3×10⁸PFUのBHV-1［ク
ーパー（Cooper）］、すなわち、米国農林省（United S
tates Departomento of Agriculture）の標準の対抗BHV
-1、で対抗するか、あるいは２×10⁷PFUのBHV-1（ロサ
ンジェルス）、すなわち、BHV-1（B8-D53）を誘導した
親菌株で対抗した。群２は上のようにワクチン接種した
が、ヴィルレントBHV-1で対抗暴露しなかった３頭の子
牛から成っていた。群３はワクチン接種しないが、BHV-
1のクーパー菌株またはロサンジェルス菌株でIN対抗暴
露した４頭の子牛から成っていた。群４はワクチン接種
せずかつ対抗暴露しない６頭の対照子牛から成ってい
た。ワクチン接種後91日に、すべての４つの群からの子
牛にデクサメタゾーンの静脈内注射で５日間ストレスを
与えた。ワクチン接種後121日に、デクサメタゾーン処
置を反復した。

ワクチン接種した子牛は中和性の抗体を発現したが、
ヴィルレントBHV-1菌株へのIN対抗暴露後、IBR病気の臨
床的徴候を示さなかった。BHV-1（B8-D53）のワクチン
接種は鼻の粘膜中のヴィルレントBHV-1の増殖を減少さ
せたが、対抗ウイルスによる持続的感染の発現を完全に
は防止しなかった。

第２の研究において、15頭の妊娠した乳牛、BHV-1に
ついて血清陰性、を使用した。

乳牛を２つの群のうちの１つの無作為に割当てた：
（ａ）IMワクチン接種すべき５頭＋２頭の対照；および
（ｂ）IMワクチンすべき３頭の乳牛、膣内にワクチンす
べき３頭の乳牛、および２頭の対照。第１日に、3.0×1
0⁷PFUnoBHV-1（B8-D53）ワクチンウイルスをIM接種によ
りあるいは膣内点滴注入により与えた。

第45日に、乳牛を隔離し、そして研究のヴィルレント
BHV-1（クーパー）Ｔ対抗暴露のセグメントについて再
び無作為に抽出した。２つの群は（ａ）５頭のIMワクチ
ン接種した乳牛および１頭の膣内ワクチン接種した乳牛
＋１頭のワクチン接種せず、非対抗暴露の接触対照乳
牛、および（ｂ）３頭のIMワクチン接種した乳牛および
２頭の膣内ワクチン接種した乳牛、２頭のワクチン接種
せず、対抗暴露した対照乳牛、および１頭のワクチン接
種せず、非対抗暴露の接触対照乳牛から成っていた。

群（ｂ）の乳牛（接触対照を排除する）は、2.8×10⁹
PFUのヴィルレントBHV-1（クーパー）で、第46日にIN対
抗暴露した。

妊娠した乳牛のすべては、BHV-1（B8-D53）のワクチ
ン接種後12日の観察期間を通じて臨床的に正常にとどま
っていた。

ヴィルレントBHV-1（クーパー）にIN対抗暴露後、対
抗ウイルスの複製INは検出されたが、ワクチン接種した
乳牛は熱または病気の臨床的徴候を発生しなかった。ワ
クチンしない対抗対照の乳牛は２〜５日間の熱および呼
吸の苦痛、労働の息づかい、粘膜膿化の鼻の排出、およ
び食物摂取の減少の徴候を示した。

この研究において使用した妊娠した乳牛の15頭のすべ
てに対して生きている子牛が産まれた。初乳前の血清試
料を５頭の乳牛に対して産まれた子牛から得た。これら
の初乳前の試料はBHV-1ウイルス中和性抗体に対して陰
性であり、IMおよび膣内に投与したワクチンのウイルス
およびIN摂取した対抗ウイルスのいずれも胎児に感染し
なかったことを示した。血清陽性の乳牛に対して産まれ
た子牛からの初乳後の試料はは、ウイルス中和性抗体に
対して陽性であった。

結論すると、BHV-1（B8-D53）でワクチン摂取しかつB
HV-1（クーパー）に対抗暴露した妊娠した乳牛中の臨床
的病気の欠如、および新産子牛の初乳前の血清中のBHV-
1抗体の不存在はこのワクチンのウイルスの弱毒性を立
証した。

IV チミジンキナーゼ陰性ヘルペスウイルス突然変異体 TK誘導活性中に欠けるヘルペスウイルス突然変異体の
いくつかの異なる型が知られている。これらの突然変異
体の多くは正常の大きさのTKポリペプチドの合成を誘導
するが、機能的TK活性をもたない。これらの突然変異体
は、ポリペプチドの折りたたみ（folding）を変更す
る、酵素または突然変異体の活性中心におけるアミノ酸
を変化させた。他の突然変異体、すなわち、HSV-1（B20
06）は、多分ポリペプチドのアミノ末端付近のコドンに
おけるナンセンス突然変異の結果として、TKポリペプチ
ドの生産を誘導できない。なお他の突然変異体は、tk遺
伝子の中央における翻訳停止（ナンセンスコドン）のた
めに、不活性の切頭（または短縮）ポリペプチドを誘導
する。この型の突然変異体は「サプレッサーtRNA」で
「抑制（suppress）」されるので、部分的TK活性が回復
される。なお、他の型の突然変異体は、変更されたヌク
レオシド基質特異性をもつTK酵素を誘導する。例えば、
野生型（すなわち、非突然変異体）HSV-1ウイルスは、
チミジン、デオキシシチジン、およびヌクレオシド類似
体、ブロモビニルデオキシウリジン、およびアシクロビ
ル（acyclovir）のホスホリル化を効率よく触媒するTK
酵素を誘導する。しかしながら、変更された基質特異性
をもつHSV-1突然変異体は、減少しているが、有意の、
チミジンホスリル化活性をもつが、なお検出可能なアシ
クロビルホスホリル化活性（またはデオキシシチジンま
たはブロモビニルデオキシウリジンホスホリル化活性）
をもたない、TK活性を誘導する。これらの突然変異体
は、酵素のヌクレオシド結合部位におけるアミノ酸を変
化させた。それゆえ、ヌクレオシド基質に対する親和性
は抽出HSV-1暗号化TK類のそれに比較して減少される。
最後に、tk遺伝子の解読区域内にヌクレオチドの欠失を
もつtk^-突然変異体は機能的TKポリペプチドの生産を誘
導することができない。

ヌクレオチドのみを含有するtk遺伝子中に欠失をもつ
tk^-ヘルペスウイルス類は自発的または突然変異原誘導t
k^-突然変異体より優れる（米国特許出願第516,179号、1
983年７月21日提出、および米国特許第4.514.497号参
照）は、次の３つの理由でtk遺伝子のみを変化させる。

第１に、ヘルペスウイルス欠失突然変異体は、次の理
由でTK誘導活性を絶対にもたない：（ｉ）アミノ酸解読
配列の欠失は、触媒機能が最終的に失われるような方法
で、TK酵素の第３構造および／または基質結合部位を変
化させる；および（ii）３で割れないヌクレオチドの欠
失は、TKポリペプチドを解読するときウイルスの遺伝子
の翻訳リーディングフレームを変化させる。対照的に、
ヌクレオチドを含有する突然変異体は頻度のみを変化さ
せ、部分的TK誘導活性を示す。これは部分的TK活性をも
つ突然変異体がしばしばヴィルレントであるのでウイル
スについて不適当である［ゴードン（Gordon）,Y.,ギル
デン（Gilden）,D.H.,シュトラム（Shtram）、Y.,アッ
シャー（Asher）,Y.,テイバー（Tabor）,E.,ウェリッシ
（Wellish）,M.,デブリン（Devlin）,M.,スニッパー（S
nipper）,D.,ヘイダー（Hadar）,J.およびベッカー（Be
cker），アーチーブス・オブ・バイロロジー（Arch. Vi
rol.）76:39-49（1982）；クレイン（Klein）,R.J.,ア
ーチーブス・オブ・バイロロジー（Arch. Virol.）72:1
43-168（1982）；およびテンサー（Tenser）,R.B.,レッ
セル（Ressel）,S.およびダンスタン（Dunstan）,M.E.
ウイルス学（Virol.）112:328-334（1981）参照］。

第２に、tk遺伝子中に欠失をもつtk^-ヘルペスウイル
ス類はtk⁺に復帰することができない。対照的に、tk遺
伝子中にヌクレオチドの変化のみを含有するtk^-突然変
異体はtk⁺に復帰することができる。tk⁺復帰変異体は回
復したヴィルレンスを有し［キット（Kit）,S.,キット
（Kit）,M.およびパートル（Pirtle）,E.C.,アメリカン
・ジャーナル・オブ・ベテリナリー・リサーチ（Am. J.
Vet. Res.）46:1359-1367（1985）参照］およびtk^-突
然変異体のワーキングプール（working pools）は10^-3
〜10^-5の頻度で自発的tk⁺復帰変異体を含有することが
できる。次いで、これらのtk^-復帰変異体はtk^-突然変異
体よりすぐれた生体内複製についての選択的利点を有す
ることができる。大部分のtk^-ヘルペスウイルス突然変
異体は復帰する潜在性を有するが、なお復帰の頻度は自
発的復帰の頻度より低く、すなわち、約10^-5〜10^-7の程
度であることができる［キャンピオン−ピッカード（Ca
mpione-Piccardo）,J.,ラウルス（Rawls）,W.E.および
バッチェッチ（Bcchetti）,S.ウイルス学誌（J.Viro
l.）31:286-287（1979）参照］。

第３に、tk遺伝子中に欠失をもつtk^-ヘルペスウイル
ス類は、ヴィルレントの現場の（field）遺伝子からお
よび他のワクチンの菌株から、それらのtk^-表現型によ
り、それらの制限エンドヌクレアーゼのパターンにより
およびそれらのサザン法分子交雑パタンーにより区別す
ることができる［キット（Kit）,S.,キット（Kit）,M.
およびパートル（Pirtle）,E.C.,アメリカン・ジャーナ
ル・オブ・ベテリナリー・リサーチ（Am. J. Vet. Re
s.）46:1359-1367（1985）参照］。これらの区別は実際
的重要性を有する。例えば、ワクチン接種した動物が病
気を発現した場合、ワクチンのウイルスがその病気を引
き起こすかどうか、あるいはヴィルレントの現場の菌株
がそれをなしたかどうかを知ることが重要である。

tk遺伝子の解読区域中に欠失をもつヘルペスウイルス
類を得るための一般的アプローチは知られている。これ
らの方法はHSV-1、HSV-2、ヘルペスウイルス・タマリヌ
ス（Herpesvirus tamarinus）、および偽狂犬病ウイル
スのtk^-欠失突然変異体を得るために使用されてきた
［スミレイ（Smiley）,J.R.,ネイチャー（Nature）385:
333-335（1980）；ポスト（Post）,L.E.,マッケム（Mac
kem）,S.,ロイズマン（Roizman）,B.,細胞（Cell）24:5
55-565（1981）；ポスト（Post）,L.E.,ロイズマン（Ro
izman）,B.,細胞（Cell）25:227-232（1981）；マクダ
ーモット（McDermott）,M.R.,スミレイ（Smiley）,J.
R.,レスリイ（Leslie）,P.,ブライス（Brais）.J.,ルズ
ロガ（Rudzroga）,H.E.およびビエネンストック（Biene
nstock）,J.,ウイルス学誌（J.Virol.）51:747-753（19
83）；キット（Kit）,S.,クワビ（Qavi）,H.,ダッブス
（Dubbs）,D.R.およびオーツカ（Otsuka）,H.,ジャーナ
ル・オブ・メディカル・バイロロジー（J. Med. Viro
l.）12:25-36（1983）；米国特許第4,514,497号および
キット（Kit）,S.キット（Kit）,M.およびパートル（Pi
rtle）,E.C.アメリカン・ジャーナル・オブ・ベテリナ
リー・リサーチ（Am. J. Vet. Res.）46:1359-1367（19
85）参照］。

しかしながら、これらのアプローチはIBRVtk^-欠失突
然変異体の調製において直接有用ではない。なぜなら、
次のことがらについての教示または示唆が存在しないか
らである：（ｉ）tk遺伝子を暗号化するIBRV DNA断片の
同一性またはその物質について、IBRVゲノム上のその位
置；（ii）IBRVtk遺伝子の近似の境界；または（iii）
そのヌクレオチド配列。従来、次のことは知られていな
かった：（ｉ）IBRVは約86メガダルトンの二本鎖の線状
DNAゲノム（137キロ塩基対（以後「kb」または「kb
p」））、および全体のモルのグアニン＋約70％のシト
シン含量を有する；（ii）IBRVゲノムは２つの異性体の
型で存在することができるＬ成分およびＳ成分から構成
されている；および（iii）IBRVのクーパー（Cooper）
菌株のDNAゲノムはHindIII、BamRIおよびHpaI制限エン
ドヌクレアーゼにより、それぞれ、15、11、７および７
断片に切離される。これらの断片の大きさおよびIBRV D
NAの物理的地図上のそれらの配置は、また、記載された
［メイフィールド（Mayfield）,J.E.,グッド（Good）,
P.J.,バン・オール（Van O or），キャンベル（Cambel
l）,A.R.およびリード（Reed）,aD.E.,ウイルス学誌
（J.Virol.）47:259-264（1983）参照］。

ヘルペスウイルスtk遺伝子を暗号化するDNA断片を同
定するために、次の方法の１または２以上が従来用いら
れた：（ｉ）分子交雑実験、すなわち、既知のウイルス
tk遺伝子からの標識DNA断片および未知のウイルスから
のDNA断片を交雑して相同ヌクレオチド配列を検出す
る；（ii）突然変異体tk^-細胞（例えば、マウスの線維
芽細胞LM（TK^-））をtk⁺表現型に生化学的に形質転換す
る；（iii）推定上のtk遺伝子を含有する雑種プラスミ
ドをLM（TK^-）細胞またはマウスまたはカエルの卵の中
にトランスフェクションまたはミクロ注入し、次いでTK
酵素活性の一時的発現についてアッセイする；および
（iv）tk^-突然変異体ウイルスおよびtk遺伝子含有雑種
プラスミドからの感染性DNAを使用するマーカー（marke
r）転移実験［スキャンゴス（Scangos）,G.およびラド
ル（Ruddle）,F.H.,遺伝子（Gene）14:1-10（1981）；
ブリンスター（Brinster）,R.L.,チェン（Chen）,H.Y.,
ワレン（Warren）,R.,サーシイ（Sarthy）,A.およびパ
ルミター（Palmiter）,R.D.,ネイチャー（Nature）296:
39-42（1982）；オーツカ（Otsuka）,H.,ヘイゼン（Haz
en）,M.,キット（Kit）,M.,クワビ（Qavi）,H.およびキ
ット（Kit）,S.,ウイルス学（Virol.）113:196-213（19
81）；キット（Kit）,S.,クワビ（Qavi）,H.,ヘイゼン
（Hazen）,M.,タークラ（Trkula）,D.およびオーツカ
（Otsuka）,H.,ウイルス学（Virol.）113:452-464（198
1）キット（Kit）,S.,クワビ（Qavi）,H.ヘイゼン（Haz
en）,M.,タークラ（Trkula）,D.およびオーツカ（Otsuk
a）,H.,ウイルス学（Virol.）113:452-464（1981）;;ウ
ェイアー（Weir）,J.P.,バジスザー（Bajszar）,G.およ
びモス（Moss），プロシーディングス・オブ・ナショナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Proc.Natl.Aca
d.Sci.）USA79:1210-1214（1982）；ダッブス（Dubb
s）,D.R.,オーツカ（Otsuka）,H.クワビ（Qavi）,H.,キ
ット（Kit）,S.,ウイルス学（Virol.）126:408-411（19
83）；オーツカ（Otsuka）,H.クワビ（Qavi）,H.,キッ
ト（Kit）,S.,抗ウイルス研究（Antiviral Res.）2:301
-311（1982）；マクナイト（McKnight）,S.L.およびガ
ビス（Gavis）,E.R.,核酸の研究（Nucl. Acids Res.）
8:5931-5948（1980）；およびケイプチ（Capecchi）,M.
R.,細胞（Cell）22:479-488（1980）参照］。

しかしながら、一般に、これらの方法はIBRVtk遺伝子
を暗号化するDNA断片の同定の適用することができな
い。さらに詳しくは、高い特異的活性の、ニック翻訳ク
ローニングされたHSV、偽狂犬病ウイルス、およびヘル
ペスウイルス・タマリヌス（Herpesvirus tamarinus）t
k遺伝子により作られた³²P標識プローブはIBRV DNA断片
に交雑しない。こうして、分子交雑技術はIBRVに適用す
ることができない。種々のヘルペスウイルス種のtk遺伝
子、すなわち、tk遺伝子のヌクレオチド配列の間に実質
的に相同性は存在せず、そして種々のヘルペスウイルス
種のTK酵素のアミノ酸配列は類似しない。さらに、クロ
ーニングしたIBRV DNA断片をtk^-突然変異体マウス（LM
（TK^-））またはウサギ（RAB（BU））細胞の中にトラン
スフェクションする生化学的形質転換実験は、組み込ま
れたIBRV DNA配列を含有するtk⁺細胞のコロニーを生じ
ない［キット（Kit）,S.,クワビ（Qavi）,H.,ヘイゼン
（Hazen）,M.,タークラ（Trkula）,D.およびオーツカ
（Otsuka）,H.,ウイルス学（Virol.）113:452-464（198
1）；オーツカ（Otsuka）,H.,ヘイゼン（Hazen）,M.,キ
ット（Kit）,M.,クワビ（Qavi）,H.およびキット（Ki
t）,S.,ウイルス学（Virol.）113:196-213（1981）；キ
ット（Kit）,S.,キット（Kit）,M.,クワビ（Qavi）,H.,
タークラ（Trkula）,D.およびオーツカ（Otsuka）,H.,
バイオヒミカ・エト・バイオフィジカ・アクタ（Biochi
m.Biophys.Acta）741:158-170（1983）参照］。同様
に、IBRV DNA断片を含有する雑種プラスミドのRAB（B
U）細胞中へのトランスフェクションはTK活性の一時的
発現に導かないが、TK活性は、HSV-1tk遺伝子を含有す
る雑種プラスミドのトランスフェクションを使用する対
照実験において発現される［オーツカ（Otsuka）,H.,ク
ワビ（Qavi）,H.およびキット（Kit）,S.,抗ウイルス研
究（Antiviral Res.）2:301-311（1982）参照］。

他方において、本発明において、IBRVtk遺伝子を暗号
化するDNA断片をマーカートランスファー実験により同
定できることが発見された。本発明において、tk⁺への
復帰の頻度が低いtk^-IBRV突然変異体、およびIBRVに対
して許容性のtk^-突然変異体宿主を使用する場合、IBRVt
k遺伝子の同定のためのマーカートランスファー実験は
はじめて実施できることが発見されたことを強調すべき
である。後に詳述するように、本発明において、米国特
許出願第516,179号、1983年７月21日提出、に記載され
ているIBRV突然変異体（IBRV（B8-D53））、およびキッ
ト（Kit）,S.およびクワビ（Qavi）,H.,ウイルス学（Vi
rol.）130:381-389（1983）に記載されているRAB（BU）
細胞系統はこれらの要求を満たすことが発見させれた。
すなわち、IBRV（B8-D53）は、ウイルスが復帰変異体に
ついて選択する媒質中の組織培養において増殖する時で
さえ、あるいは子牛中の２回の生体内系統継代培養後に
おて、tk⁺に復帰しないので、きわめてすぐれた出発物
質である。同様に、RAB（BU）細胞はIBRV複製のための
きわめてすぐれた宿主細胞であり、そして非常に低い頻
度で、すなわち、１×10^-7より低い頻度でtk⁺に復帰す
る。

マーカートランスファー実験、および本発明において
記載する生体外転写／翻訳研究は、また、IBRVtk遺伝子
の近似境界の図解を可能とする。こうして、最初に、本
発明において、配列すべきtk遺伝子含有IBRV DNA下位断
片および、また、IBRVtk遺伝子の解読配列を崩壊するよ
うに欠失させることのできる適当なヌクレオチド配列が
同定された。

本発明の１つの目的は、種々の発現においてIBRの病
気の広がりの抑制において有効な、IBRワクチンを提供
することである。

本発明の他の目的は、筋肉内に、鼻内に、あるいは膣
内に安全にかつ効率よく投与できるIBRワクチンを提供
することである。

本発明のなお他の目的は、子牛におよびすべての妊娠
の段階の妊娠した乳牛に安全に投与できるIBRワクチン
を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、（ｉ）tk遺伝子の解読配
列中の欠失、単独、あいるは（ii）欠失の代わりにオリ
ゴヌクレオチドリンカー（linker）配列の挿入と組み合
わせ、の結果として、機能的TK酵素を生産することがで
きないIBRワクチンを提供することである。

本発明のなを他の目的は、ワクチンのウイルス約30℃
〜40℃の温度において効率よく複製できる、すなわち、
温度耐性の突然変異体を含む、IBRVワクチンを提供する
ことである。

本発明の他の目的は、ワクチンのウイルスがtk⁺に復
帰できずかつtk⁺IBRVから容易に単離されるIBRワクチン
を提供することである。

本発明のなお他の目的は、ワクチンのウイルスが現場
の菌株ウイルスおよび他のBHV-1ワクチンのウイルスか
ら区別可能であるIBRウイルスを提供することである。

本発明の他の目的は、ワクチン接種した動物が病原性
の現場の菌株で休止の感染を獲得しない、IBRワクチン
を提供することである。

本発明のなお他の目的は、ワクチンのウイルスがtk⁺
に復帰できない、IBRワクチンの製造法および使用を提
供することである。

本発明の１つの実施態様において、これらの上に記載
した目的は、tk遺伝子中の欠失の結果として機能的TKを
生産することができない高度に減衰したIBRV、および
（１）製薬学的に有効な量の前記ウイルスおよび（２）
製薬学的に許容されうる担体または希釈剤を含んでなる
IBRのためのMLVワクチンによって達成される。

本発明の他の実施態様において、上の目的は、工程： （１）クローニングベクターとIBRVtk遺伝子の実質的に
すべてを含有するIBRVのDNA断片とからなる雑種プラス
ミドを構成し、 （２）tk⁺宿主細胞中において、工程（１）の雑種プラ
スミドをtk^-IBRV突然変異原誘導突然変異体からの感染
性DNAで同時トランスフェクションし、 （３）tk^-宿主細胞中において、工程（２）において生
産されたウイルスからのtk⁺IBRVについて選択し、 （４）実質的にすべてより少ないIBRVtk遺伝子が存在す
るように、工程（１）の雑種プラスミドからDNA配列を
欠失させ、 （５）tk⁺宿主細胞中において、工程（３）において得
られたtk⁺IBRVから誘導されたIBRVtk⁺DNAを、工程
（４）の結果として生ずるtk^-雑種プラスミドで同時ト
ランスフェクションし、そして （６）tk^-宿主細胞中において、tk遺伝子中の欠失の結
果として、機能的TKを生産することができないtk^-IBRV
突然変異体を生産するように、工程（５）において生産
されたウイルスからtk^-IBRVについて選択する、 を含んでなることを特徴とするtk遺伝子中の欠失の結果
として機能的TKを生産することができない高度に減衰さ
れたIBRVを製造する方法によって達成される。

本発明のなお他の実施態様において、オリゴヌクレオ
チドリンカーが工程（４）の欠失されたIBRVのDNAの代
わりに存在し、同時に前記欠失されたIBRV DNA断片の各
側に隣接してIBRVのDNA配列を保持する。

本発明の他の実施態様において、工程（２）における
tk^-IBRV突然変異原誘導突然変異体は温度耐性突然変異
体であり、こうして工程（６）において得られる突然変
異体は温度耐性かつtk^-欠失の突然変異体である。

本発明の追加の実施態様において、前述の目的は、工
程： （１）クローニングベクターとIBRVtk遺伝子の実質的に
すべてを含有するIBRVのDNA断片とからなる雑種プラス
ミドを構成し、 （２）tk⁺宿主細胞中において、工程（１）の雑種プラ
スミドをtk^-IBRV突然変異原誘導突然変異体からの感染
性DNAで同時トランスフェクションし、 （３）tk^-宿主細胞中において、工程（２）において生
産されたウイルスからのtk⁺IBRVについて選択し、 （４）実質的にすべてより少ないIBRVtk遺伝子が存在す
るように、工程（１）の雑種プラスミドからDNA配列を
欠失させ、 （５）tk⁺宿主細胞中において、工程（３）において得
られたtk⁺IBRVから誘導されたIBRVtk⁺DNAを、工程
（４）の結果として生ずるtk^-雑種プラスミドで同時ト
ランスフェクションし、 （６）tk^-宿主細胞中において、tk遺伝子中の欠失の結
果として機能的TKを生産することができないtk^-IBRV突
然変異体を生産するように、工程（５）において生産さ
れたウイルスからtk^-IBRVについて選択し、 （７）温度感受性ウイルスについて非許容性の温度にお
いて工程（６）のtk遺伝子中の欠失の結果として機能的
TKを生産することができない得られるIBRVを増殖し、こ
うしてtk遺伝子中の欠失の結果として機能的TKを生産す
ることができない温度耐性IBRVについて選択しかつそれ
を生産する、 を含んでなることを特徴とする方法によって生産された
tk遺伝子中の欠失の結果として機能的TKを生産すること
ができない高度に減衰されたIBRVを製造する方法によっ
て達成される。

第１図は、IBRV（BHV-1）クーパー（Cooper）HindIII
およびBamHI DNA制限地図を示す。これらの地図は、ロ
サンジェルス菌株を含むIBRVの他の菌株のものに非常に
類似する。DNAの挿入された反復領域および末端の反復
領域は斜線の長方形として示されている。これらの領域
は、IBRVゲノムの短い（Ｓ）セグメント中に存在し、そ
してDNAの短い独特の配列の限界を確定する。IBRV DNA
の長い（Ｌ）セグメントも示されている。IBRVtk遺伝子
中はIBRVゲノム上の約0.47地図単位に位置する、すなわ
ち、HindIII-AおよびBamHI-J断片の範囲内に位置する。
DNA断片は大きさに従って文字が付されており、各線の
上はkbであり、そして分画した地図の距離は各線の下で
ある。

第２図は、機能的本発明tk遺伝子中を含有する雑種プ
ラスミドの制限エンドヌクレアーゼ地図を、一例とし
て、概略的に示す。プラスミドpLAH-AはIBRVのロサンジ
ェルス菌株の21.4kb HindIII-A断片（HindIII制限地図
については第１図を参照）を、4.4Kbpの大きさであるバ
クテリアのプラスミド、pBR322のHindIII制限部位の中
に挿入することによって誘導された。プラスミドpBR322
はテトラサイクリン耐性（tet^R）およびアンピシリン耐
性（amp^R）である。挿入はtet^R遺伝子を不活性化するの
で、amp^R、テトラサイクリン感受性プラスミド、例え
ば、pLAH-A、を単離できる。雑種プラスミドpMAR-Kpnは
pMAR420の誘導体であり、そして独特のKpnIクローニン
グ部位を含有する［オーツカ（Otsuka）,H.,ヘイゼン
（Hazen）M.,キット（Kit）,M.,クアビ（Qavi）,H.,お
よびキット（Kit）,S.,ウイルス学（Virol.）113:196-2
13（1981）参照］。黒色の棒および実線は、それぞれ、
pBR322およびヘルペスウイルス・タマリヌス（Herpesvi
rus tamarinus）のヌクレオチド配列を表わす。雑種プ
ラスミドpLAKは、pLAH-AからのIBRV DNAの6.7Kbp KpnI
断片をpMAR-Kpnの独特KpnI部位に挿入し、これによりク
ローニングしたIBRV DNA配列を14.7Kbpだけ短縮するこ
とによって得られた。

第３図は、本発明において使用する追加のtk⁺およびt
k^-プラスミドの誘導を、一例として、概略的に示す。雑
種プラスミドpLAKは、pLAKのStuIおよびClaI制限ヌクレ
アーゼ切離しおよび切断した5.1KbpのStuI/ClaI断片をp
BR322のClaI/PvuII（2.3kb）断片（これはamp^R遺伝子を
含有する）に結合することによって誘導された。プラス
ミドpLAK dl NdeIはpLATKの1.2kb NdeI配列（4.2〜5.2
地図単位）の欠失によりpLATKから誘導した。プラスミ
ドpLAK dl NdeI dl BgIII/NG/SstIはpLAK dl NdeIから
の次の工程により誘導した：（ｉ）400bp BgIII/SstI配
列（2.3〜2.7地図単位）を欠失させ、次いで（ii）リン
カー（５′‐GATCT-3′（BgIII）および５′‐GAGCT-
3′（SstI）結合端を含有する40bpのオリゴヌクレオチ
ド）をBgIII/SstI切離しpLAK dl NdeIの大きい断片に結
合し、こうして5.8Kbpの閉じた円形の雑種プラスミドを
生成する。プラスミドpLAK dl BgIII/NG/SstIをtk⁺IBRV
DNAを使用するマーカートランスファー実験において使
用して、本発明の一例、すなわち、IBRV（NG） dl TKク
ローン１を得た。

第4A図および第4B図は、IBRVtk遺伝子の解読区域およ
びそのフランキング（flanking）配列を含有する、IBRV
DNA断片のLATK16と表示するヌクレアーゼ配列（2814塩
基）を示し、そして第4A図は第4B図に続いている。第4A
図および第4B図において、この蛋白質の分子量は36902.
5である。この配列はIBRV TKメッセンジャーRNAを生成
するために転写されたDNA鎖の補体である。BgIIIおよび
SacI（SstI）制限部位は、IBRV（NG） dl TKクローン１
から欠失されたヌクレアーゼ配列の限界を確定する。IB
RV TKポリペプチドの予測されたアミノ酸配列は、３文
字のアミノ酸のコード表示で示されている。

本発明は、IBRの病気の予防に安全に表面できる減衰
されたtk^-IBRV突然変異体を単に単離する方法を越える
が、機能的TK活性を生産することができないIBRV欠失突
然変異体およびその製造法および使用に関する。突然変
異体はTKの遺伝情報を指定するDNA配列の部分を欠くの
で、tk⁺への復帰は起こらない。

本発明の１つの実施態様において、本発明によれば、
tk遺伝子中の欠失の結果として機能的TKを生産すること
ができない高度に減衰したIBRV、および（１）製薬学的
に有効な量の前記ウイルスおよび（２）製薬学的に許容
されうる担体または希釈剤を含んでなるIBRのためのMLV
ワクチンが提供される 本発明の他の実施態様において、本発明によれば、工
程： （１）クローニングベクターとIBRVtk遺伝子の実質的に
すべてを含有するIBRVのDNA断片とからなる雑種プラス
ミドを構成し、 （２）tk⁺宿主細胞中において、工程（１）の雑種プラ
スミドをtk^-IBRV突然変異原誘導突然変異体からの感染
性DNAで同時トランスフェクションし、 （３）tk^-宿主細胞中において、工程（２）において生
産されたウイルスからのtk⁺IBRVについて選択し、 （４）実質的にすべてより少ないIBRVtk遺伝子が存在す
るように、工程（１）の雑誌プラスミドからDNA配列を
欠失させ、 （５）tk⁺宿主細胞中において、工程（３）において得
られたtk⁺IBRVから誘導されたIBRVtk⁺DNAを、工程
（４）の結果として生ずるtk^-雑種プラスミドで同時ト
ランスフェクションし、そして （６）tk^-宿主細胞中において、tk遺伝子中の欠失の結
果として機能的TKを生産することができないtk^-IBRV突
然変異体を生産するように、工程（５）において生産さ
れたウイルスからtk^-IBRVについて選択する、 を含んでなることを特徴とするtk遺伝子中の欠失の結果
として機能的TKを生産することができない高度に減衰さ
れたIBRVを製造する方法が提供される 本発明のなお他の実施態様において、オリゴヌクレオ
チドリンカーが工程（４）の欠失されたIBRVのDNAの代
わりに存在し、同時に前記欠失されたIBRV DNA断片の各
側に隣接してIBRVのDNA配列を保持する。

本発明の他の実施態様において、工程（２）における
tk^-IBRV突然変異原誘導突然変異体は温度耐性突然変異
体であり、こうして工程（６）において得られる突然変
異体は温度耐性かつtk^-欠失の突然変異体である。

本発明の追加の実施態様において、本発明によれば、
工程： （１）クローニングベクターとIBRVtk遺伝子の実質的に
すべてを含有するIBRVのDNA断片とからなる雑種プラス
ミドを構成し、 （２）tk⁺宿主細胞中において、工程（１）の雑種プラ
スミドをtk^-IBRV突然変異原誘導突然変異体からの感染
性DNAで同時トランスフェクションし、 （３）tk^-宿主細胞中において、工程（２）において生
産されたウイルスからのtk⁺IBRVについて選択し、 （４）実質的にすべてより少ないIBRVtk遺伝子が存在す
るように、工程（１）の雑種プラスミドからDNA配列を
欠失させ、 （５）tk⁺宿主細胞中において、工程（３）において得
られたtk⁺IBRVから誘導されたIBRVtk⁺DNAを、工程
（４）の結果として生ずるtk^-雑種プラスミドで同時ト
ランスフェクションし、 （６）tk^-宿主細胞中において、tk遺伝子中の欠失の結
果として機能的TKを生産することができないtk^-IBRV突
然変異体を生産するように、工程（５）において生産さ
れたウイルスからtk^-IBRVについて選択し、 （７）温度感受性ウイルスについて非許容性の温度にお
いて工程（６）のtk遺伝子中の欠失の結果として機能的
TKを生産することができない得られるIBRVを増殖し、こ
うしてtk遺伝子中の欠失の結果として機能的TKを生産す
ることができない温度耐性IBRVについて選択しかつそれ
を生産する、 を含んでなることを特徴とする方法によって生産された
tk遺伝子中の欠失の結果として機能的TKを生産すること
ができない高度に減衰されたIBRVを製造する方法が提供
される。

tk遺伝子はほぼ1500bpの大きさである。欠失突然変異
体は、75〜1500bpのDNA断片をtk遺伝子の適当な解読領
域を排除し、こうしてTKの適切な折りたたみ（foldin
g）または基質の結合を防止することによって生成する
ことができる。あるいは、欠失突然変異体は10〜100bp
のDNA断片を排除し、こうしてこの遺伝子の適切なリー
ディングフレームをシフト（shift）させることによっ
て生成することができる。後者の場合において、切頭
（truncated）ポリペプチドを製造することができる。
なぜなら、ポリペフチドの合成はフレームシフト誘導停
止コドンのために短縮されるからである。欠失の好まし
い大きさは約75〜750bpである。

ここで使用するとき、「フランキング（flanking）配
列」は、tk遺伝子解読配列から、上流、下流、あるいは
上流および下流の両者の配列を意味する。上流の配列は
転写制御信号、すなわち、プロモーターおよびエンハン
サーを含有し、ここで下流の配列はtk遺伝子の転写停止
およびポリアデニル化の信号を含有する。

工程（１）の雑種プラスミド中に存在しなくてはなら
ない正確なIBRVtk遺伝子配列は、欠失のために選択した
配列および欠失突然変異体の工学に使用すべき制限エン
ドヌクレアーゼに依存するであろう。

この実施態様において使用するtk^-IBRV突然変異体
は、また、tk遺伝子の解読領域中に１または２以上の突
然変異原誘導点突然変異を含有することができる。した
がって、この場合において、工程（１）において使用す
べき雑種プラスミドは、tk^-IBRV突然変異体中で突然変
異する特定の配列を置換するために、tk⁺IBRV遺伝子配
列を含有しなくてはならない。tk^-IBRV DNAと工程
（１）の雑種プラスミドとの間の組み換え事象は、tk^-I
BRV遺伝子中の突然変異原誘導点突然変異から上流およ
び下流の両方で起こななくてはならない。工程（１）の
雑種プラスミドが突然変異したtk^-IBRV DNAを置換させ
る、クロスオーバー事象、すなわち、マーカー（merke
r）の救済（rescue）は、救済するプラスミドIBRV DNA
が小さい、50〜100bpである、ときでさえ、理論的には
起こることができるが、実際には、このような小さいDN
A断片によるマーカーの救済は起こるように思われな
い。対照的に、マーカーの救済の可能性は、救済するDN
A断片が1.0kbより大きいとき、大きく増加される。後述
するpLAH-A中のIBRV DNAのインサート（insert）は21.4
kbであることに注意すべきである。

工程（４）において要求されるプラスミド中の欠失に
隣接する特定のIBRV DNA配列は、雑種プラスミド中の欠
失の特異性に依存する。一般に、欠失の３′および５′
側の両方に隣接するIBRV DNA配列は少なくとも約400bp
であろう。下に詳述するpLATK dl Ndel dl BgIII/NG/Ss
tIにおいて、欠失の両側の３′および５′配列は長さが
2.3kbおよび1.4kbである。

第２の実施態様において、欠失突然変異体は欠失した
IBRV DNAの代わりにオリゴヌクレオチドリンカーを含有
することができる。オリゴヌクレオチドリンカーは一般
に長さが８〜10ヌクレオチドであるが、これより長く、
約50ヌクレオチドであるか、あるいはこれより短く、例
えば、４、５または７ヌクレオチドであることができ
る。オリゴヌクレオチドリンカーの好ましい長さは、約
20〜40ヌクレオチドの長さである。オリゴヌクレオチド
リンカーのDNA配列は臨界的ではない。

オリゴヌクレオチドをプラスミドDNA中の欠失中に挿
入する方法は、使用するオリゴヌクレオチドリンカーの
タイプに依存するであろう。オリゴヌクレオチド配列中
の１または２以上の制限ヌクレアーゼ部位を含有するパ
リンドームの二本鎖のオリゴヌクレオチドリンカー［ニ
ュー・イングランド・バイロラブス（New England Biol
abs）］は、よく知られた手順により挿入することがで
きる［マニアチス（Maniatis）,T.,フリトシ（Fritsc
h）,E.F.,サンブルーク（Sambrook）,J.,分子クローニ
ング（Molecular Cloning），コールド・スプリング・
ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laborat
ory）（1982）参照］。オリゴヌクレオチドリンカー
は、また、末端トランスフェラーゼを使用する補体のホ
モポリマーで末端をテイリング（tailing）することに
よってプラスミドDNA中の欠失中に挿入することができ
る［マニアチス（Maniatis）,T.,フリトシ（Fritsch）,
E.F.,サンブルーク（Sambrook）J.,分子クローニング
（Molecular Cloning），コールド・スプリング・ハー
バー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laborator
y）（1982）参照］。あるいは、本発明の実施例とし
て、オリゴヌクレオチドリンカーは、末端の相補性を含
有するオリゴヌクレオチドを切離されたプラスミドの
３′−リセスド（ressesed）および３′−突起（protru
ding）結合端にアニーリングすることにより、架橋し、
次いでオリゴヌクレオチド配列に対して相補的なギャッ
プをDNAポリメラーゼ［クレナウ（Klenow）断片］を充
填することによって、プラスミド中の欠失中に挿入する
ことができる。引続いてT4 DNAリガーゼで結合した後、
閉じた円形のDNA分子を再生することができる。オリゴ
ヌクレオチドリンカーの長さを賢明に選択することによ
り、フレームシフトの突然変異体をtk遺伝子中に生成
し、tk遺伝子内の欠失の効果を増強することができる。

IBRVtk遺伝子およびを含有するIBRVのDNA断片および
そのフランキング配列からなる雑種プラスミド構成する
ために本発明において使用する特定のクローニングベク
ターは、それが選択の特性、例えば、薬物耐性の遺伝情
報を指定する遺伝子を含有するかぎり、臨界的ではな
い。このようなクローニングベクターの例は、pBR322お
よびpBR322に基づくベクター［セキグチ，（Sekiguch
i）,T.ニシモト（Nishimoto）,T.カイ（Kai）,R.および
（Sekiguchi）,M.,遺伝子（Gene）21:267-272（1983）
参照］、pMB9、pBR325、pKH47［ベチェスダ・リサーチ
・ラボラトリーズ（Bethesda Reseach Laboratorie
s）］、pBR328、pHC79、ファージシャロン（Charon）28
［ベチェスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Bethesda R
eseach Laboratories）］、pkB11、pKSV-10［P-Lバイオ
ケミカルス（Biochemicals）］、pMAR420［オーツカ（O
tsuka）,H.,ヘイゼン（Hazen）,M.,キット（Kit）,M.,
クアビ（Qavi）,H.およびキット（Kit）,S.,ウイルス学
（Virol.）113:196-213（1981）参照］およびオリゴ（d
G）テイルド（tailed）pBR322［ベチェスダ・リサーチ
・ラボラトリーズ（Bethesda Reseach Laboratorie
s）］を包含する。

pBR322は本発明において使用する好ましいクローニン
グベクターである。なぜなら、IBRV HindIII-A断片は、
IBRVtk遺伝子を含有することがわかり、下を参照、そし
てpBR322は１つのHindIIIクローニング部位のみを有す
るからである。この部位におけるDNA断片の挿入は、ク
ローニングベクターテトラサイクリン遺伝子を不活性化
するが、アンピシリン遺伝子を不活性化しないので、挿
入のためpBR322より大きいテトラサイクリン感受性、ア
ンピシリン耐性雑種プラスミドを容易に単離することが
できる。

本発明において有用な独特のクローニング部位を含有
する他のクローニングベクターは、IBRVtk遺伝子を含有
する断片を生成するHindIII以外の制限ヌクレアーゼの
評価のとき決定することができる。IBRVtk遺伝子を含有
する断片を生成するために使用することができる他の制
限ヌクレアーゼ、こうして本発明において有用であるこ
とができる他のクローニングベクターは、第２図〜第4A
図および第4B図に示すIBRVtk遺伝子および雑種プラスミ
ドから容易に明らかであり、そしてこれらについて下に
詳述する。

例えば、pMB9、pBR325、pKH47、pBR328、pHC79、ファ
ージシャロン（Charon）28は、また、単一のHindIIIク
ローニング部位を有し、そしてIBRVのHindIII-A断片を
使用することができる。あるいは、IBRVの3.4kbのPstI
断片（pLAK dl NdeIの0.2〜3.6地図単位、後述）をpBR3
22またはpBR325のPstI部位に、アンピシリン感受性、テ
トラサイクリン耐性の形質転換したバクテリアを選択し
て、クローニングすることができる。

同様に、オリゴ（dG）テイルド（tailed）pBR322をク
ローニングベクターとして、IBRVのオリゴ（dG）テイル
ド（tailed）HindIII断片とともに使用することができ
る。

本発明のプラスミドを生長させるために使用する特定
の宿主は臨界的ではない。このような宿主の例は、次の
ものを包含する：E. coli K12 RP1［ボリバー（Boliva
r）,F.,ロドリグエズ（Rodriguez）,R.L.,グリーン（Gr
eene）,P.J.,ベトラチ（Betlach）,M.C.,ヘイネカー（H
eyneker）,H.L.,ボイヤー（Boyer）,H.W.,クロサ（Cros
a）,J.H.,およびファルコウ（Falkow）,S.,遺伝子（Gen
e）2:95-113（1977）；E. coli K12 HB101（ATCC No.33
694）；E. coli MM21（ATCC No.36780）；E. coli DH1
（ATCC No.33849）。E. coli K12 RP1は好ましい宿主で
あり、そしてF^-‐hsd R M遺伝子型を有する。

同様に、別のベクター／クローニング系、例えば、E.
coliまたはSaccharomyces cerevisiae、あるいは両者
中で生長するプラスミドベクター、またはB. subtilus
中で生長するプラスミドベクターを使用できるであろう
［ウレ（Ure）,R.,グロスマン（Grossman）,L.およびマ
ルデイブ（Maldave）,K.,メソッズ・イン・エンジモロ
ジー（Methods in Enzymology）「組み換えDNA（Recomb
inat DNA」,vol.101,部C,アカデミック・プレス（Acade
mmic Press），ニューヨーク（1983）参照］。

本発明において使用する特定のtk⁺宿主細胞は、IBRV
の許容性生長を許すかぎり、臨界的ではない。このよう
なtk⁺宿主細胞は、次のものを包含する：tk⁺宿主細胞は
RAB-9（ATCC No.CRL-1414）、一次ウサギ腎細胞、二次
ウサギ腎細胞、ウサギ角膜（SIRC）細胞（ATCC No.CCL-
60）、ウサギ腎（LLC-RK1）細胞（ATCC No.CCL-106）、
胚ウシ気管（EBTR）細胞（ATCC No.CCL-44）、ウシ鼻介
骨（BT）細胞（ATCC No.CRL-1390）ウシ腎（MDBK）細胞
（ATCC No.CCL-22）。アメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクション（American type Culture Collection）
のカタログは、子羊、ヤギ、ネコおよびウマの細胞のあ
るものもIBRV（ロサンジェルス）（ATCC No.VR-188）に
ついて許容されうることを示している。RAB-9は本発明
において使用する好ましいtk⁺宿主細胞である。しかし
ながら、現場（field）において動物のワクチン接種の
ために使用するウイルスの製造のために、米国農林省
（United States Department of Agriculture）が保証
した、好ましくはワクチン接種すべき動物と同一の種
の、かつ他の感染性因子を含まない、IBRVについて許容
される細胞系統を使用すべきである。例えば、適当なウ
シ細胞系統は、保証されたマイコプラズマおよび他のウ
イルスを含まない二倍体の非腫瘍発生性のウシ鼻甲介ま
たは腎細胞系統であろう。

本発明において使用する特定のtk^-宿主細胞は、IBRV
の許容性の生長を許すかぎり、臨界的ではない。IBRVの
許容性の生長を許すtk^-宿主細胞の例はウサギRAB（BU）
細胞系統であり、これはRAB-9細胞から誘導された［キ
ット（Kit）,S.およびクアビ（Qavi）,H.,ウイルス学
（Virol.）130:381-389（1983）参照］。本発明におい
て使用できるウサギまたはウシ由来の他のtk^-宿主細胞
は、例えば、んtk^-マウス、ヒト、およびウサギの細胞
系統を単離するために前に使用された手順に従うことに
よって得ることができる［キット（Kit）,S.,ダッブス
（Dubbs）,D.R.,ピエカルスキ（Piekarski）,L.J.およ
びフス（Hsu）,T.C.,実験的細胞の研究（Exptl. Cell R
es.）31:297-312（1963）；キット（Kit）,S.,ダッブス
（Dubbs）,D.R.およびフリーソン（Freason）,P.M.,イ
ンターナショナル・ジャーナル・オブ・キャンサー（In
t. J. Cancer）1:19-20（1966）；およびキット（Ki
t）,S.およびクアビ（Qavi）,H.,ウイルス学（Virol.）
130:381-389（1983）参照］。RAB（BU）細胞は、tk⁺前
記tk^-の両者のIBRV菌株を高い力価に複製することを可
能にするばからりでなく、また選択的媒質（ハイポキサ
ンチン、10^-4モル；アミノプテリン、10^-6モル；チミジ
ン、４×10^-5モル；およびグリシン、10^-5モル（以後
「HATG媒質」）中でtk⁺へ検出可能に復帰せず、そして
許容性（約34.5℃）および非許容性（約39.1℃）の温度
においてIBRVのプラーク滴定のために使用できるので、
本発明において使用する好ましいtk^-宿主細胞である。t
k^-細胞はHATG媒質中で検出可能にtk⁺に復帰しないこと
が重要である。なぜなら、tk⁺の復帰は、tk⁺ウイルスお
よびtkウイルスの表現型およびそれらの混合物を区別す
るために使用するオートラジヲグラフおよびチミジンプ
ラークオートラジヲグラフのアッセイを妨害するであろ
うからである。

本発明において使用する特定のtk^-IBRV菌株は、臨界
的でなく、そして非温度耐性菌株または温度耐性菌株で
あることができる。このようなtk^-IBRV菌株の例は、次
のものを包含する:IBRV（P8-2）の非温度耐性、５−ブ
ロモビニルデオキシウリジン耐性IBRV突然変異体［ウェ
インマスター（Weinmaster）,G.A.,ミスラ（Misra）,
V.,マクグアイアー（McGuire）,R.,バビウク（Babiu
k）,J.A.およびデクラーク（DeClercq）,E.,ウイルス学
（Virol.）118:191-301（1982）参照］および温度耐性I
BRV（B8-D53）［キット（Kit）,S.およびクアビ（Qav
i）,H.,ウイルス学（Virol.）130:381-389（1983）およ
び米国特許出願第516,179号、1983年７月21日提出;ATCC
No.VR-2066参照］。IBRV（B8-D53）は次の理由で本発
明において使用するために好ましいtk^-IBRV菌株であ
る。第１に、この突然変異体はウシおよびウサギの細胞
中で突然変異原、すなわち、５−ブロモビニルデオキシ
ウリジンの存在下にIBRVのロサンジェルス（Loa Angele
s）菌株を系統的に継代培養し、こうして多数の遺伝子
の変更がIBRVのゲノム中に蓄積されるようにして得られ
た。結局、このウイルスの病気を引き起こす能力は減少
される。第２に、この菌株は組織培養において生体外
で、あるいは子牛中で生体内でtk⁺に検出可能に復帰し
ない。それゆえ、このウイルスはtk遺伝子の解読区域を
含有するIBRV DNA断片の分析のためのマーカートランス
ファー研究において使用できる。第３に、この菌株は許
容性細胞中で約30℃〜40℃の温度範囲にわたって複製
し、すなわち、温度耐性である。第４に、この菌株する
牛および妊娠した乳牛における予備実験は、その安全性
および効能を立証した。すなわち、前述のように、最近
の研究により、IBRV（B8-D53）が高度に減衰され、筋肉
内、鼻内、または膣内の注射により子牛および妊娠した
乳牛に安全に投与することができ、そして子牛および妊
娠した乳牛をBHV-1の高度にヴィルレントのクーパー菌
株に対抗暴露したとき、これらの動物をIBRから保護す
ることができることが立証された。

本発明において使用する特定のtk⁺IBRV菌株は、臨界
的でなく、そして非温度耐性または温度耐性であること
ができる。このようなtk⁺IBRV菌株の例は次の非温度耐
性菌株を包含する：ロサンジェルス菌株（ATCC No.VR-1
88）、クーパー（Cooper）菌株（ATCC No.VR-864）、IP
V菌株K22［ケンドリック（Kendrick）,J.W.,ギレスピエ
（Gillespie）,J.H.およびマクエンティー（McEntee）,
K.,コーネル・ベテリナリー（Cornel Vet.）48:458-495
（1958）参照］、菌株MO3、MO6、BFN-IH、BFN-IIN、BFN
-IID、Gi 1〜５、Bi、B4、BRV、LAE、V3 415、V3 416、
V3 18、V3 93［グレゲーセン（Gregersen）,J-P.,パウ
リ（Pauli）,G.およびスドウィグ（Ludwig）H.,アーチ
ーブス・オブ・バイロロジー（Arch. Virol.）84:91-10
3（1985）参照］、BFA Wabu菌株［アッカーマン（Acker
mann）,M.およびワイラー（Wyler）,R.,ベテリナリー・
マイクロバイオロジー（Vet. Microbiol.）9:53-63（19
84）参照］、菌株P3-2［ウェインマスター（Weinmaste
r）ら、ウイルス学（Virol.）118:191-201（1982）参
照］、菌株P10、P10およびP34［エンジェルス（Engel
s）,M.,ステック（Steck）,F.およびワイラー（Wyle
r）,R.アーチーブス・オブ・バイロロジー（Arch. Viro
l.）67:169-174（1981）参照］、アルベルタ（Albert
a）［カナダ（Canada）］単離物No.1〜No.122［ミスラ
（Misra）,V.,バビウク（Babiuk）,L.A.およびダーセル
（Darcel）,C.レ（le）Q.,アーチーブス・オブ・バイロ
ロジー（Arch. Virol.）76:341-354（1983）参照］また
は温度耐性菌株、例えば、IBRV（RTK-1B）。本発明にお
いて使用する好ましいtk⁺IBRV菌株はIBRV（RTK-1B）で
ある。下に詳述するように、この菌株は雑種プラスミド
からのtk遺伝子のIBRV（B8-D53）（ATCC No.VR-206
6）、すなわち、多数の突然変異を含有するtk^-IBRV菌
株、にマーカートランスファーすることによって得られ
た。こうして、IBRV（RTK-1B）はIBRV（B8-D53）の多数
の突然変異を保持し、そして温度耐性である。IBRV（RT
K-1B）は機能的TKを発現するが、IBRV（B8-D53）は発現
しないことにおいてのみ、IBRV（RTK-1B）はIBRV（B8-D
53）と異なる。

本発明の関連して、鼻気管支炎ウイルスは非温度感受
性であるウイルスである。こうして、温度耐性ウイルス
は、非許容性温度、すなわち、約38.5℃〜40℃、好まし
くは39.1℃において複製することができ、親ウイルスま
たはIBRVの現場の単離物は許容性温度においてほぼ同様
によく複製する。対照的に、温度感受性IBRV菌株は複製
に必須のウイルス遺伝子中に突然変異を含有し、これに
より機能的遺伝子生成物は許容性温度、すなわち、約32
℃〜37.5℃、好ましくは34.5℃において生成するが、非
許容性温度においては生成しない。したがって、温度感
受性ウイルスにおいて、感染性ウイルス粒子の生成は許
容性温度における生成に比較して非許容性温度のいて４
〜７ログ（log）だけ低い。温度耐性ウイルス菌株で
は、感染性ウイルス粒子の生成は非許容性温度において
許容性温度におけるときとほぼ同一である。

ある温度感受性の呼吸器のウイルス菌株、例えば、IB
RVの温度感受性突然変異体は、従来MLVワクチンとして
使用されてきた［パストレト（Pastoret）,P.P.,サーリ
イ（Thiry）,E.,ブロクフィーア（Brocphier）,B.およ
びダーボベン（Derboven）,G.,Ann. Rech. Vet.13:221-
235（1982）およびチャノック（Chanock），ジャーナル
・オブ・インフェクシャス・ディジージズ（J. Infect.
Dis.）143:364-374（1981）参照］。このような使用の
ための原理は、温度感受性ウイルスが特別に許可された
部位、例えば、気道の上部において制限された複製を行
ない、そして局所的宿主に免疫学的応答を引き出すこと
ができることである。しかしながら、温度感受性ウイル
スは宿主動物のより深い組織における複製が阻害され、
ここで温度はウイルスの複製に対して非許容性である。

温度耐性ウイルスは、MLVワクチンとして、温度感受
性ウイルスより次理由ですぐれる：（１）複製に要求さ
れる弱化するウイルスの遺伝子からよりはむしろ特異的
病原ウイルスにおける変更から減衰が生ずる；そして
（２）温度耐性ウイルスの菌株はIM、INまたは膣内に投
与することができ、そして体に深い組織の中で複製し
て、より完全なかつ延長された免疫学的応答を引き出す
ことができる。

対照的に、温度感受性ウイルスは低い温度の部位、例
えば、気道上部においてのみ複製することができ、こう
してIN投与のみが可能である。

工程（３）および（６）において使用される可能な選
択手段は、この分野においてよく知られている（米国特
許第4,514,497号参照）。例えば、工程（３）におい
て、選択はHATG媒質を使用して実施することができ、そ
して工程（６）選択は５−ブロモデオキシウリジン（以
後「BrdUrd」）、５−ヨウドデオキシウリジン、５−ブ
ロモビニルデオキシウリジンまたはアラビンシルチミン
を使用して実施することができる。

本発明の前述のMLVの製薬学的に有効な量を、製薬学
的に許容されうる担体または希釈剤と一緒に、動物、例
えば、ウシ、ヒツジ、ヤギおよびブタにおけるIBRに対
するワクチンとして使用することができる。

本発明において使用する製薬学的に許容されうる担体
または希釈剤の例は、薬理学的緩衝化媒質、すなわち、
IBRVに対する抗体を含有しない、すなわち、IBRVに対し
て血清反応陰性である約2.5〜15％の血清、を含有す
る、pH約7.0〜7.4の媒質を包含する。無ガンマグロブリ
ン血清は、ガンマグロブリンを含有する血清より好まし
い。本発明において使用する血清の例は、ブタ血清、胎
児子牛血清、ウマ血清および子羊血清を包含する。無ガ
ンマグロブリン子牛血清は、子牛のワクチン接種のため
に好ましい。IBRVについて血清反応陰性の豚からの無ガ
ンマグロブリンブタ血清は、ブタのワクチン接種に好ま
しい。血清蛋白質、例えば、ブタアルブミンまたはウシ
血清アルブミン（以後「BSA」）を、約0.5〜3.0％の量
で、血清のための基質として使用できる。しかしなが
ら、ワクチン接種する動物においてアレルギー性応答を
誘発する異質の蛋白質を担体または希釈剤中に使用する
ことを避けることが望ましい。

ウイルスは、リン酸塩緩衝液、グルタミン酸塩、カシ
トン、およびスクロースまたはソルボースを含有する
か、あるいはリン酸塩緩衝液、ラクトース、デキストリ
ンおよびグルタミン酸塩を含有する、慣用の安定化溶液
のいずれの中にも希釈することができる。

本発明のワクチンのウイルスは少なくとも10⁵〜10⁶PF
U/mlの力価で−70℃〜−90℃において、あるいは凍結乾
燥した状態で２℃〜７℃において貯蔵することができ
る。凍結乾燥したウイルスは、防腐剤、例えば、ゲンタ
マイシンおよびアンホテリシンＢまたはペニシリンおよ
びストレプトマイシンを含有する無菌の蒸留水と一緒に
使用して再構成することができる。

投与に有用な適量は、ワクチン接種する動物の連例、
体重および種、および投与の方法に依存して変化するで
あろう。適当な投与量は例えば、約10^4.5〜10⁷PFU/動
物、好ましくは約10^4.5〜10^5.5PFU/動物であることがで
きる。

本発明のワクチンは、鼻内に、膣内に、あるいは筋肉
内に投与できる。筋肉内投与は好ましい投与法である。

次の実施例は、例示の目的で記載し、そして本発明の
範囲を限定することをいかなる方法での意図するもので
はない。

実施例１ 雑種プラスミドの構成 Ａ、組織培養細胞の生長培地 10％（v/v）の牛胎児血清（以後「BFS」または10％
（v/v）の子羊、20ミリモルの重炭酸ナトリウム＋10ミ
リモルのヘペス（Hepes）（pH7.3）および２ミリモルの
グルタミン＋50μg/mlのネオマイシンを補充したイーグ
ル（Eagle）の最少必須培地（以後「APMEM」）［フロー
・ラボラトリーズ・インコーポレーテッド（Fow Labora
tories,Inc.）］中で、tk⁺宿主（RAB-9）細胞を、温度
制御したCO₂インキュベーター内で増殖させた。この培
地は以後「生長培地」と呼ぶ。tk^-宿主細胞（RAB（B
U））はRAB-9細胞と同一の生長培地中で生長させたが、
この生長培地にはBrdUrd（25μg/ml）を補充し、ただし
各実験の前の継代培養について後述する。

Ｂ、IBRV DNAの精製 IBRV DNAはピグナッチ（Pignatti）らがHSV DNAの調
製について本質的に記載するようにして調製した［ピグ
ナッチ（Pignatti）,P.F.,カッサイ（Cassai）,E.,メネ
グッジ（Meneguzzi）,G.,チェンシナー（Chemciner）,
N.およびミラネシ（Milanesi）,G.,ウイルス学（Viro
l.）93:260-264（1979）参照］。

さらに詳しくは、20mlの生長培地を含有するRAB-9細
胞（約５×10⁶細胞／培養物）27g（８オンス）の規格の
ガラス製びんの単層培養物の20に5PFU/細胞のIBRVの感
染多重度（以後「m.o.i.」）で感染させ、そして34.5℃
で３時間インキュベーションし、その時細胞のDNAの合
成がウイルスの感染により阻害された。次いで、1.0μC
i/mlおよび0.25μg/mlno（³H）チミジンを添加してウイ
ルスのDNAを放射能で標識し、そしてインキュベーショ
ンを34.5℃で17時間さらに続けた。細胞をゴムのポリス
マンで引掻いてガラスから分離して生長培地中に入れ、
600×ｇで遠心し、10μg/mlno非放射性チミジンを含有
する0.14モルのNaCl、0.003モルのKC1、0.001モルのCaC
l₂、0.0005モルのMgCl₂および0.01モルのリン酸塩、pH
7.5からなる氷冷リン酸塩緩衝液塩溶液（以後「PBS」）
で洗浄した。次に、細胞を600×ｇで遠心し、次いでエ
タノール乾燥氷浴中で凍結させた。

融解後、細胞の沈殿物（約0.7ml）を、0.25％（w/v）
のトリトンX-100、10ミリモルのEDTA、10ミリモルのト
リス−HC1、pH7.9からなる溶菌溶液の９体積中に再懸濁
させた。次に、この細胞懸濁液をダウンス（Dounce）ホ
モジナイザーに移し、そして室温で20〜30分間おだやか
に混合しながらインキュベーションした。

次いで、細胞懸濁液をガラスの遠心管に移し、そして
NaClを0.2モルの最終濃度で添加した。次に、この管を
数回倒立させ、そして溶液を1000×ｇおよび４℃で10分
間直ちに遠心した。

選られる上澄みをガラス管中にデカンテーションし、
そして10ミリモルのトリス−HCl、pH7.5、1.0ミリモル
のEDTAからなる緩衝液（以後「TE緩衝液」）中の100μg
/mlのプロテイナーゼＫ［E.M.サイエンス］とともに37
℃で１時間インキュベーションすることにより脱蛋白質
化した。次いで、90％（v/v）の再蒸留したフェノール
の１体積を添加し、この溶液を倒立により混合し、20,0
00×ｇで遠心し、そして水相、すなわち、上相をポリア
ロマー遠心管に移した。次いで、酢酸ナトリウムを4.0
％（w/v）の濃度に添加し、核酸を２体積の氷冷エタノ
ールで沈殿させ、そして−20℃で一夜インキュベーショ
ンした。その後、スピンコ（Spinco）SW25ローター内で
４℃で16,000rpmで遠心し、2.0mlのTE緩衝液中に溶解
し、そして４℃でTE緩衝液に対して透析した。

次いで、得られるDNA溶液をポリアロマー遠心管に移
し、そしてTE緩衝液中のCsClを57％（w/w）（ρ＝1,715
g/cm²）に添加した。次に、DNAをスピンコNo.50 Tiロー
ター内で44,00rpmにおいて2.5℃で46時間遠心した。次
いで、12滴の分画をポリアロマー管の底から集め、そし
て4.0μｌのアリコートを液体シンチレーション分光計
内で計数して、IBRV DNA含有分画を捜した（ρ＝約1,72
7g/cm²）。合計25分画が集められたとき、言班に分画13
〜15はIBRV DNAを含有した。

次いで、IBRV DNA含有分画をプールし、そして数回交
換のTE緩衝液に対して４℃で約24時間透析した。DNAの
濃度は蛍光測定により決定した。IBRV DNAの収量は10⁸
細胞から約25μｇであった。

後述するようにサブマリン（submarine）ゲル装置
［ベチェスダ・リサーチ・ラボラトリーズ・インコーポ
レーテッド（Bethesda Reseach Laboratories,Inc.）］
内で４℃において電気泳動後、得られた制限ヌクレアー
ゼ消化されたIBRV DNA断片のパターンにより、IBRV DNA
の同定を評価した。

より詳しくは、DNAをBamHI、SstI、KpnIまたはHindII
I制限ヌクレアーゼで、製造業者［ニュー・イングラン
ド・バイロラブス・インコーポレーテッド（New Englan
d BioLabs,Inc.）］が推奨する反応条件下に切離した。
次に、0.4％（w/v）のブロモフェノールブルー、125ミ
リモルのEDTAおよび50％（v/v）のグリセロールからな
る溶液の1/10体積を添加して反応を停止させ、次いで65
℃で10分間加熱した。各試料の20μｌのアリコートをア
ガロースゲルの試料ウェル（well）中に適用し、そして
電気泳動を後述するように実施した。

制限ヌクレアーゼ断片の電気泳動は、0.6％（w/v）の
アガローススラブゲル［キット（Kit）,S.,クアビ（Qav
i）,H.,ダッブス（Dubbs）,D.R.T.およびオーツカ（Ots
uka）,H.,ジャーナル・オブ・メディカル・バイロロジ
ー（J. Med. Virol.）12:25-36（1983）参照］上で、30
ミリモルのNaH₂PO₄B、1.0ミリモルのEDTA、40ミリモル
のトリス−塩基、pH8.1からなる電気泳動緩衝液（以後
「電気泳動緩衝液」中で40ボルト、４℃において約16時
間実施した。電気泳動後、DNA断片はゲル0.5μg/mlの臭
化エチジウムを含有する電気泳動緩衝液中でソーキング
し、長波のUV照明装置上で可視化し、そして写真撮影し
た。BHV-1（IBRV）菌株（クーパー）のHindIIIおよびBa
mHI断片を第１図に示す。

この方法で調製したIBRV DNAは、標準トランスフェク
ションアッセイにおいて約100〜1000PFU/μｇのDNAの感
染性を有した。

Ｃ、IBRV DNAのクローニング IBRV（ロサンジェルス）からのDNAのHindIII断片を、
次の手順によりpBR322のHindIII切離し部位でクローニ
ングした。

IBRV（ロサンジェルス）からの4.0μｇのDNAを、50ミ
リモルのNaCl、50ミリモルのトリス−HCl（pH8.0）、10
ミリモルのMgCl₂および100μg/mlのBSAからなる切断緩
衝液（cutting buffer）（以後「HindIII切断緩衝液）
中に溶解した。次いで、DNAを37℃において40単位のHin
dIII酵素［ニュー・イングランド・バイロラブス・イン
コーポレーテッド（New England BioLabs,Inc.）］で１
時間消化する。この反応は等体積の90％（v/v）の再蒸
留フェノールを添加して停止させ、混合し、そして相分
離のために遠心した。水相を１×TE緩衝液に対して透析
した後、酢酸ナトリウムを0.1モルに添加し、２体積の
エタノールを添加し、そしてDNAの沈殿物を−20℃で一
夜貯蔵した。DNAの沈殿物を遠心により集め、そして１
×TE緩衝液中に溶解した。

次いで、制限ヌクレアーゼの断片を次の方法で、Hind
IIIで切離しかつ脱ホスホリル化したpBR322と結合し
た： 4.0μｇのHindIII切離しIBRV（ロサンジェルス）DNA
を、50ミリモルのトリス−HCl（pH7.8）、10ミリモルの
MgCl₂、20ミリモルのジチオスレイトール、1.0ミリモル
のATPおよび50μg/mlのBSAからなる溶液（以後｛結合緩
衝液｝）の0.05ml中の0.5μｇのHindIII消化しかつ脱ホ
スホリル化pBR322 DNA［ニュー・イングランド・バイロ
ラブス・インコーポレーテッド（New England BioLabs,
Inc.）］、および100単位のファージT4 DNAリガーゼ
［ニュー・イングランド・バイロラブス・インコーポレ
ーテッド（New England BioLabs,Inc.）］と混合し、そ
して４℃で一夜インキュベーションした。この反応をED
TAを20ミリモルに添加し、そして65℃で10分間加熱する
ことにより停止した。

雑種プラスミドDNAをTE緩衝液中で希釈し、そして後
述するようにE. coliK12 RR1バクテリアを形質転換する
ために使用した［ボリバー（Bolvar）,F.,ロドリグエズ
（Rodriguez）,R.L.,グリーン（Green）,P.J.,ベトラチ
（Betlach）,M.C.,ヘネカー（Heyneker）,H.L.,ボイア
ー（Boyer）,H.W.,クロサ（Crosa）,J.H.およびファル
コウ（Falkow）,S.,遺伝子（Gene）2:95-113（1977）参
照］。

バクテリアはCaCl₂を使用して形質転換のために準備
した［マンデル（Mandel）,M.およびヒガ（Higa）,A.,
ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J.Mo
l.Biol.）53:159-162（1970）参照］。詳しくは、2.0
（A₆₀₀）のE. coliK12 RR1の密度において一夜のの培養
を用いて、1.0％（w/v）のバクトトリプトン、0.5％（w
/v）の酵母エキスおよび0.5％（w/v）のNaClからなるブ
イヨン（以後「MLブイヨン」）の200mlを0.02（A₆₀₀）
を接種した。約0.5（A₆₀₀）の密度に到達するまで、こ
のバクテリアを約２時間インキュベーションした。次い
で、このバクテリアを遠心により沈殿させ、そして1/4
体積の冷50ミリモルのCaCl₂中に再懸濁した。氷上で５
分間インキュベーションした後、バクテリアを再び沈殿
させ、そして1/4体積の冷50ミリモルのCaCl₂中に再懸濁
した。

次に、TE緩衝液中の0.1mlの雑種プラスミドDNA、約10
〜100ngを、0.2mlのCaCl₂処理バクテリアに添加した。
この混合物を４℃に30分間保持した。次いで、温度を37
℃に５分間上げ、そして0.3mlのMLブイヨンを添加し
た。その後、インキュベーションを37℃で45分間おだや
かに振盪しながら続けた。30μg/mlのアンピシリンを補
充したトリプチカーゼ大豆寒天平板（BBLマイクロバイ
オロジー・システム）上で、試料を平板培養した。

所望の雑種プラスミドDNAのために得られたクローン
の急速スクリーニングを次のようにして実施した： 雑種プラスミドDNA含有バクテリアの一夜の培養物
を、30μg/mlのアンピシリンを含有するMLブイヨンの5.
0ml中に接種し、そして37℃で約1.5（A₆₀₀）の密度にイ
ンキュベーションした。次いで、1mlのこのバクテリア
培養物を1.5mlのエッペンドルフ（Eppendorf）ポリプロ
ピレン管に移し、そしてエッペンドルフ遠心装置内で１
分間室温において遠心してバクテリアを沈殿させた。次
に、2.0mg/mlの多摩簿リゾチーム、50ミリモルのグルコ
ース、10ミリモルのシクロヘキサンジアミン四酢酸塩
（以後「CDTA」）および25ミリモルのトリス−HCl緩衝
液、pH8.0からなるリゾチーム溶液No.1（以後「リゾチ
ーム溶液No.1）の0.1ml中に再懸濁させた。次に、0.1N
のNaOH＋1.0％（w/v）のドデシル硫酸ナトリウムをこの
バクテリアの懸濁液に添加し、そして管を泡形成し、そ
して４℃に５分間保持した。その後、0.15mlの3.0モル
の酢酸ナトリウム、pH4.8を添加し、そしてこの管をお
だやかに倒立させ、その間DNAの「クロット（clot）」
が形成した。DNAを４℃に１時間保持して染色体DNA、蛋
白質および高分子量のRNAを沈殿させた。次に、この沈
殿物をエッペンドルフ遠心装置内で室温で５分間遠心
し、そして組み換えプラスミドDNAを含有する透明上澄
み液、ほぼ0.4ml、を第２のエッペンドルフ管に移し
た。次いで、2.5体積のエタノール（ほぼ1.0ml）を第２
管に添加し、そしてこれを−20℃に30分間配置した。沈
殿した雑種プラスミドDNAをエッペンドルフ遠心装置内
で室温で２分間遠心することによって集めた。次いで、
雑種プラスミドDNAを0.1mlの0.1モルの酢酸ナトリウ
ム、0.05モルののトリス−HCl、pH8.0中に溶解し、エタ
ノールで再沈殿させ、再び遠心により集め、そして最後
にう100μｌの0.1×Ｔ緩衝液中に溶解した。

次いで、雑種プラスミドDNAの10μｌのアリコートを5
0μｌのHindIII切断緩衝液中で希釈し、そして2.0単位
のHindIIIを添加した。37℃で60分の消化期間後、試料
を0.4％（w/v）のグロモフェノールグルー、125ミリモ
ルのEDTAおよび50％（v/v）のグリセロールからなる溶
液の1/10体積と混合し、そして約20μｌを0.6％のアガ
ローススラブゲルに後述するように電気泳動分析のため
に適用した。この分析は雑種プラスミドがHindIIIイン
サートを含有するかどうかを明らかにし、もしそうであ
る場合、大きさ（kb）を明らかにした［バーンボイム
（Birnboim）,H.C.およびドリイ（Doly）,J,核酸の研究
（Nuc1. Acids Res.）7:1513-1523（1973）参照］。

このようにして、21.5KbpのHindIIIインサートを含有
する25.8Kbpのプラスミド、これはアガロースゲル電気
泳動においてHindIII-A断片と一緒に移動する）を単離
し、そしてpLAH-Aと表示する（第２図参照）。

大規模の雑種プラスミドDNAの調製のため、前述の急
速スクリーニング手順のための雑種プラスミドDNAを生
成するために使用したバクテリアに比較して、200倍の
量のプラスミド形質転換バクテリアを使用し、ただし最
初のエタノール沈殿後、100℃に10分間加熱した、5.0ml
のトリス−HCl、pH8.0、中に1.0mg/mlのRNase Aを含ん
でなる原溶液から0.5mgの膵臓RNase［ワーシントン・バ
イオケミカアル・コーポレーション（Wortington Bioch
emical Corp.）］で試料を37℃において30分間処理し
た。この処理に引続いて、TE緩衝液中の500μｇのプロ
イテナーゼＡ（E.M.サイエンス）を37℃において30分間
添加した。次いで、等体積のフェノールを添加し、そし
て試料を前述のように渦形成し、そして遠心して相分離
した。次いで、水相を取り出し、前述のように、エタノ
ールで沈殿させい、そして遠心により集めた。次いで、
沈殿物を0.2mlのTE緩衝液中に溶解し、そして50ミリモ
ルのNaCl、10ミリモルのトリス−HCl、pH7.5、1.0ミリ
モルのEDTA中の10.4mlの直線の10〜40％（w/v）のスク
ロース勾配上で層状化し、次いでスピンコSW41ローター
内で４℃で20時間24,000rpmで遠心した。ポリアロマー
遠心管の底から15滴の分画を集め、プラスチックのトレ
ーのウェル中に入れた。合計35の分画が得られた。次い
で、前述のようにアガロースゲルの電気泳動を用いるこ
とにより、５μｌのアリコートをスクリーニングした。
雑種プラスミドDNAを含有する分画をプールし、0.1×TE
緩衝液に対して透析し、そしてそれ以上の研究のため４
℃で貯蔵した。

Ｄ、tk遺伝子を暗号化するIBRV断片のマーカートランス
ファーによる同定 精製したウイルスのDNA断片間、あるいはプラスミド
ベクターおよびゲノムウイルスDNA中のクローニングに
より増幅したウイルスDNA断片により、動物中の相同組
み換えを使用して、DNA断片またはウイルスゲノム中の
突然変異体配列を救済（rescue）した。この手順は、
「マーカー救済」または「マーカートランスファー」と
して知られており、自発性突然変異および全体のウイル
スDNA中の突然変異原により誘導された突然変異体をマ
ッピングし、ならびに突然変異を雑種プラスミドからゲ
ノムウイルスDNA中に転位（tansfer）するために使用し
た［マッツ（Matz）,B.,スバクーシャーペ（Subak-Shar
pe）,J.H.およびプレストン（Preston）,V.G.ジャーナ
ル・オブ・ジェネチック・バイロロジー（J. Gen. Viro
l.）64:2261-2270（1983）参照］。

マーカートランスファー手順を使用して、tk遺伝子を
暗号化するIBRV（ロサンジェルス）HindIII断片を同定
した。すなわち、感染性IBRV（B8-D53）とIBRV HindIII
断片を含有する候補の雑種プラスミドとの混合物を、リ
ン酸カルシウム沈殿法によりRAB-9細胞中に同時トラン
スフェクションした［グラハム（Graham）,F.L.および
バン・デル（Van der）Eb.,A.J.,ウイルス学（Virol.）
52:456-467（1973）参照］。詳しくは、次の無菌溶液を
順番に試験管に添加した： （１）TE緩衝液中のIBRV（B8-D53）DNAの100μg/mlの溶
液の0.02ml; （２）0.1×TE緩衝液中に種々のIBRV（ロサンジェル
ス）を含有する組み換えプラスミドの10μg/mlの溶液の
0.4ml; （３）0.25mlの水； （４）TE緩衝液中のキャリアーマウスの線維芽（LM（TK
^-））細胞DNAの100μg/mlの溶液の0.2ml; （５）2.0モルのCsClの0.125ml; （６）280ミリモルのNaCl、1.5ミリモルのNa₂HPO₄、50
ミリモルのヘペス（Hepes）、pH7.12の２×バランスド
（balanced）塩溶液（以後「２×BSS」）の1.0ml。

得られる溶液を倒立により混合し、そして室温に30分
間保持し、その間DNA−リン酸カルシウム沈殿物が形成
した。次いで、沈殿したDNA−リン酸カルシウムを含有
する懸濁液の0.5mlを5.0mlの生長培地に直接添加し、そ
して36時間破約60mlのプラスチックペトリ皿中に接種し
てあるRAB-9細胞上で平板培養した。細胞を37℃で５時
間インキュベーションした。次いで、新鮮な生長培地を
添加し、そして広範な細胞病気作用が起こるまで、34.5
℃で２〜３日間さらにインキュベーションした。ウイル
スの収穫を前述のようにして実施した。

前述のトランスフェクション体の収穫物を、pALH-Aに
よりIBRV（B8-D53）から救済されたtk⁺IBRVの存在およ
び比率について、チミジンプラークオートグラフィーに
より次のように分析した［テンサー（Tenser）,R.B.,ジ
ョンズ（Jones）,J.C.,レッセル（Ressel）,S.J.および
フラリッシ（Fralish）,F.A.,ジャーナル・オブ・クリ
ニカル・マイクロバイオロジー（J. Clin. Microbio
l.）13:122-127（1983）参照］。

100mlのプラスチックの組織培養等級のペトリ皿に、1
0mlのAPMEM＋10％（v/v）BFS中の1.25×10⁶RAB（BU）細
胞を接種し、そして単層が準全面生長するまで（２〜３
日間）湿潤化CO₂インキュベーター内で37℃においてイ
ンキュベーションした。次いで、この培地を吸引により
取り出し、そして生長培地中の0.5mlの融解しかつ超音
波処理したウイルス試料を100〜1000PFU/皿で添加し、
そして単層へ37℃において１時間吸収させる。皿に生長
培地中の0.5％（w/v）のメチルセルロースの10mlを載
せ、そして37℃で３日間インキュベーションした。この
メチルセルオースのオーバーレイを吸引により取り出
し、次いで単層を水の1lにつき8.0gのNaCl、0.4gのKC
l、0.1gのグルコースおよび0.02gのフェノールレッドか
らなる溶液（以後「GKN」と呼ぶ）ですすぎ、次いで３
μCiの（メチル−¹⁴C）チミジン（53〜59）maCi/ミリモ
ル）を含有する生長培地の5.0mlを各皿に添加した。37
℃における６時間のインキュベーションの終りに、この
培地を取り出し、単層をGKNおよびメタノールで洗浄
し、次いでメタノールで室温において１分間固定した。
単層を引続いて２回各５分間10μg/mlの非放射性チミジ
ンを含有する５％（w/v）のトリクロロ酢酸で洗浄し、
３回各回５分間70％（v/v）エタノールで洗浄し、２回
各回５分間90％（v/v）エタノールで洗浄し、そして２
回各回５分間100％（v/v）エタノールで洗浄した。単層
を乾燥し、そして5.0mlの0.1％（w/v）のクリスタルバ
イオレットの水溶液を５分間で添加し、次いで水道水で
すすぎ、そして室温で乾燥した。平板の底を切取り、板
紙の上に取り付け、そしてフジ（Fuji）Ｘ線フィルムの
フォルダー内に配置し、そして−70℃で３日間露出し
た。このフィルムを現像し、そしてtk⁺プラークによる
アイソトープの組込みを表わす暗いリムの円の数を計数
し、そしてクリスタルバイオレットで着色した単層上に
可視の合計のプラークの数と比較した。下表１に示すよ
うに、IBRV（B8-D53）のtk^-突然変異体はIBRV HindIII-
A断片を含有するpLAH-Aにより効率よく救済された。こ
れと対照的に、IBRV HindIII-GおよびHindIII-Bの断片
を含有する雑種プラスミド［その地図はHindIII-A断片
の両側に存在する（第１図参照）］は、IBRV（B8-D53）
のtk^-突然変異体を救済しなかった。これらの結果が立
証するように、HindIII-GおよびHindIII-Bの断片はIBRV
（B8-D53）tk遺伝子上の突然変異部位をカバーする配列
を含有しない。

組み換えtk⁺ウイルスを濃縮するために、pLAK dl Nde
Iを使用するトランスフェクション体の収穫物をRAB（B
U）細胞、すなわち、tk^-細胞［キット（Kit）,S.および
クアビ（Qavi）,H.ウイルス学（Virol.）130:318-389
（1983）参照］中でHARGを含有する生長培地［リトルフ
ィールド（Littlefield）,J.W.,サイエンス（Science）
145:709-710（1964）；リトルフィールド（Littlefiel
d）,J.W.,バイオヒミカ・エト・バイオフィジカ・アク
タ（Biochim.Biophys.Acta）95:14-22（1965）；および
スジバルスカ（Szybalska）,E.H.およびスジバルスキ
（Szybalski）,W.,プロシーディングス・オブ・ナショ
ナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Proc. Natl.
Acad. Sci.）USA48:2026-2043（1962）参照］中で次の
ようにして継代培養した。

RAB-9中のトランスフェクションのウイルス収穫物を
超音波処理し、そしてHATGを含有する生長培地中で1:50
0に希釈し、そしてRAB（BU）の全面生長の単層の培養物
を約0.01のm.o.i.においてウイルスで接種した。37℃で
１時間吸収させた後、HATGを含有する新鮮な生長培地を
添加し、そして感染を34.5℃で48時間進行させ、その時
ウイルスの収穫を再び実施した。第２選択工程を実施同
一の方法で実施し、ただしウイルスを1:5000に希釈し
た。大に選択継代培養から収穫したウイルスをRAB-9細
胞中でプラーク精製した［キット（Kit）,S.およびクア
ビ（Qavi）,H.ウイルス学（Virol.）130:318-389（198
3）およびキット（Kit）,S.,（Qavi）,H.,ダップス（Du
bbs）,D.R.およびオーツカ（Otsuka）,H.,ジャーナル・
オブ・メディカル・バイロロジー（J. Med. Virol.）1
2:25-36（1983）参照］。得られるプラーク精製したウ
イルスを、チミジンプラークオートグラフィーにより分
析してそれらのtk⁺表現型を評価し、そしてIBRV（RTK-1
A）およびIBRV（RTK-1B）と表示した。次いで、ウイル
スのワーキングプール（working pool）をRAB-9細胞中
で調製した。これらのワーキングプールの力価は約５×
10⁷PFU/mlであった。

追加のマーカートランスファー実験を、前述のよう
に、感染性IBRV（B8-D53）DNAおよびプラスミドpLATK
（後述）およびpLATK dl NdeI（後述）を使用して実施
した（第31図参照）。これらの実験が立証するように、
IBRV（B8-D53）はpLATKおよびpLATK dl NdeIの両者によ
り効率よく救済された。これの結果が示すように、IBRV
tk遺伝子の発現のためのヌクレアーゼ配列はpLATK dl N
deIの4.1KbpのIBRV断片中に存在した。

IBRV（RTK-1A）およびIBRV（RTK-1B）が事実IBRV菌株
であることを確認するために、DNAを前述のように準備
し、制限エンドヌクレアーゼで切離し、そしてアガロー
スゲルの電気泳動により分析した。HindIIIおよびBamHI
の制限ヌクレアーゼのパターンはIBRVのロサンジェルス
およびクーパーの菌株を使用して得られたものに類似し
た。

Ｅ、pLAH-Aのサブクローニング:pLAKの構成 pLAH-Aからの6.7KbpのKpnI制限断片を、pMAR-KpnのKp
nI部位の中にクローニングした。pMAR-KpnのKpn（第２
図参照）は、単一のKpnI切離し部位をもつpMAR420から
誘導された6.0kbのプラスミドである［オーツカ（Otsuk
a）,H.,ヘイゼン（Hazen）,M.,（Qavi）,H.およびキッ
ト（Kit）,S.,ウイルス学（Virol.）113:196-213（198
1）参照］。pMAR-KpnはpMAR420から4.3XhoI〜SalI断片
を欠失させることによって得られた（第２図参照）。単
一の切離し部位をもつ他のプラスミド、例えば、pUC18
およびpUC19｛（ベチェスダ・リサーチ・ラボラトリー
ズ（Bethesda Reseach Laboratories）］またはpKB11
［ファーマシア・インコーポレーテッド（Pharmacia,In
c.）］は次の手順において等しく適当であろう。

6.0ミリモルのNaCl、6.0ミリモルのトリス−HCl（pH
7.5）、6.0ミリモルのMgCl₂、1.0ミリモルのジチオスレ
イトール、100μg/mlからなる切断緩衝液中で20単位のK
pnI（以後「KpnI切断緩衝液」）で、37℃における１時
間のインキュベーションの間に、1.0μｇのpLAH-Aおよ
び0.1μｇのpMAR-Kpnを切離すことによって、両者のプ
ラスミドを直線化した。この反応をCDTAの20ミリモルの
最終濃度への添加および65℃の30分間の加熱により停止
させた。酢酸ナトリウムを0.3モルに添加した。次い
で、２体積のエタノールを添加し、そしてこの混合物を
−20℃で一夜貯蔵して、DNAの沈殿を完結させた。DNA沈
殿物を遠心により集めた。KpnI切離しpLAH-AおよびpMAR
-KpnのプラスミドのDNAを結合緩衝液中に溶解し、次い
でT4 DNAリガーゼにより、前述のように、一緒に結合し
た。次いで、E. coli K12菌株RR1を得られたプラスミド
で、前述のように、形質転換し、そして組み換えクロー
ンのプラスミドDNAを前述の急速スクリーニング手順に
より単離した。

候補の組み換え体のプラスミドDNAをKpnI切断緩衝液
中でKpnIDE処理し、そしてHindIIIにてついて前述した
ようにアガロースゲルの電気泳動により分析した。pLAH
-Aから誘導された6.0KbpのpMAR-Kpn断片および6.7Kbpの
KpnI断片をもつ12.7Kbpのプラスミドが得られ、そしてp
LAKと表示した。次いで、プラスミドpLAK DNAの大規模
生産を前述のように実施した。

Ｆ、pLAKのサブクローニング:pLATKの構成 pLAKからの5.1KbpのSstI〜ClaI IBRV DNA断片を、pBR32
2のPvuII〜ClaI切離し部位中にクローニングした（第２
図および第３図参照）。さらに詳しくは、1.0μｇのpLA
Kを、100ミリモルのNaCl、10ミリモルのトリス−HCl（p
H8.0）、10ミリモルのMgCl₂、6.0ミリモルの２−メルカ
プトエタノールおよび100μg/mlのBSAからなる反応緩衝
液へ添加した。DNAを37℃において１時間16単位のStuI
で消化した。この反応をCDTAを20ミリモルに添加し、そ
して65℃に30分間加熱することによって停止させた。酢
酸ナトリウムを0.15モルに添加し、そしてDNAを２体積
のエタノールで沈殿させた。DNA沈殿物を遠心により集
め、次いで50ミリモルのNaCl、6.0ミリモルのトリス−H
Cl（pH7.5）、6.0ミリモルのMgCl₂、100μg/mlのBSAか
らなるClaI切断緩衝液（以後「ClaI切断緩衝液」と呼
ぶ）中に再溶解した。StuI切離しpLAKを８単位のClaIで
37℃において１時間消化した。前述のように、この反応
を停止させ、そしてDNAを遠心により集めた。

60ミリモルのNaCl、6.0ミリモルのトリス−HCl（pH7.
5）、6.0ミリモルのMgCl₂、6.0ミリモルの２−メルカプ
トエタノールおよび100μg/mlのBSAからなる切断緩衝液
へ、0.3μｇのpBR322を添加した。次いで、５単位のPvu
IIを添加し、そしてDNAを37℃で１時間消化した。上の
ようにして、反応を停止させ、そしてDNAをエタノール
沈殿させ、そして集めた。PvuII切離しpBR322をClaI切
断緩衝液中に溶解し、そして４単位のClaIで37℃におい
て１時間消化した。上のように、この反応を停止させ、
そしてDNAをエタノール沈殿させいそして集めた。

ClaIおよびStuI切離しpLAKをPvuIIおよびClaI切離しp
BR322と一緒に、結合緩衝液中において、組み合わせ、1
00単位のT4 DNAリガーゼの添加により、４℃で一夜結合
した。前述のように、反応の停止させ、そしてE. coli
K12 RR1の形質転換を実施した。

前述の急速スクリーニングはプラスミドを同定させ、
そしてこれをpLATKと表示した。これはpBR322のPvuII〜
ClaI部位の中にクローニングされたpLAKの5.0KbpのStuI
〜ClaI断片を有した（第３図参照）。次いで、プラスミ
ドpLATK DNAのワーキングプールを前述のようにして調
製した。

Ｇ、pLATKのサブクローニング:pLATK dl NdeIの構成 150ミリモルのNaCl、10ミリモルのトリス−HCl（pH7.
8）、7.0ミリモルのMgCl₂、6.0ミリモルの２−メルカプ
トエタノールおよび100μg/mlのBSAからなる切断緩衝液
中に0.03μｇのpLATK DNAを混合することによって、pLA
TKの1.2KbpのNedI断片（4.0〜5.2地図単位、第３図参
照）を欠失させた。次いで、DNAを２単位のNdeIで37℃
において１時間消化した。この反応をCDTAの20ミリモル
への添加および65℃における30分の加熱により停止させ
た。酢酸ナトウムを0.1モルに添加し、そして２体積の
エタノールを添加し、次いで−20℃で一夜貯蔵した。DN
Aの沈殿物を遠心により集め、次いで結合緩衝液中に溶
解させた。NdeI切離しpLATKを前述のようにT4 DNAリガ
ーゼで再結合し、次いでE. coli K12菌株RR1を形質転換
し、そして前述のようにプラスミドDNAを急速スクリー
ニングした。候補の欠失組み換え体の雑種のプラスミド
DNAを、NdeI切断緩衝液中でNdeIで処理し、そして前述
のようにアガロースゲルの電気泳動により分析した。１
つのNdeI切離し部位のみを含有する6.2Kbpのプラスミド
を単離し、そしてpLATK dl NdeIと表示した（第３図参
照）。

Ｈ、プラスミドpLATK dl Nde1 dl BgIII/NG/SstIの構成 50ミリモルのトリス−HCl（pH8.0）、10ミリモルのMg
Cl₂、50ミリモルのNaClからなるSstI切断溶液中で37℃
において１時間DNAを８単位のSstIとともにインキュベ
ーションすることにより、pLATK dl NdeIの0.4KbpのBgI
II〜SstI断片を1.0μｇのプラスミドから切断した。次
いで、塩濃度を100ミリモルのNaClの増加し、そして８
単位のBgIIIを添加した。インキュベーションをさらに
１時間連続した。20ミリモルの最終濃度に添加し、そし
てこの混合物を65℃に30分間加熱することによって、こ
の反応を停止させた。前述のように、DNAをエタノール
沈殿させ、そして遠心により集めた。

このプラスミドのBgIII〜SstI端を、次の配列を有す
る40マーのオリゴヌクレオチドリンカーで架橋した： （５′−GATCTATGAATCAGGTCGCAGGCGAGAATGAGTAAGAG C
T-3′）（以後「NGリンカー」）このNGリンカーは、製
造業者の使用説明に従いホスホルアミダイト化学により
合成した。BgIIIおよびSstI切離しpLATK dl NdeIプラス
ミドDNAを、6.6ミリモルのトリス−HCl（pH7.5）、6.6
ミリモルのMgCl₂、1.1ミリモルのジチオスレイトール、
55ミリモルのNaClからなる18μｌの反応混合物中で8.7
μg/mlのNGリンカーに対してして65℃で45分間アニーリ
ングし、次いで４℃に冷蔵庫内でゆっくり冷却した。一
本鎖のオリゴヌクレオチドはプラスミドの結合性のBgII
IおよびSstIの端を架橋した。NGリンカーに対して相補
性のギャップをもつ配列を、dATP,dGTP,TTP、dCTPの各
々の２ミリモルの溶液の1.01、および1.0μｌ（２単
位）のE. coli. DNAポリメラーゼ、クレナウ（Klenow）
断片［ベチェスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Bethes
da Reseach Laboratories）］を添加し、22℃で１時間
インキュベーションし、次いで75℃で５分間熱不活性化
することによって充填した。5.0μｌの100ミリモルのAT
P、25μｌの100ミリモルのトリス、pH7.8、20ミリモル
のMgCl₂、40ミリモルのジチオスレイトール、100μg/ml
のBSAおよび1000単位のT4 DNAリガーゼを添加し、次い
で４℃で一夜インキュベーションすることによって、端
の結合を達成した。この結合反応は3.0μｌの0.25モル
のEDTAを添加し、次いで65℃に30分間加熱することによ
って達成した。

この結合混合物を１×TEで希釈し、そしてE. coli K1
2菌株RR1を前述のようにして形質転換した。アンピシリ
ン耐性のコロニーを抽出し、そしてプラスミドDNAを前
述の急速スクリーニング手順により精製した。得られる
プラスミドは、0.4kbのIBRV BgIII〜SstI断片を欠失し
ており、pLATK dl NdeIより約0.4kbだけ小さく、そして
SstI部位およびBgIIIの存在についてスクリーニングし
た。SstI部位は保存されたが、BgIII部位は予期せざる
ことには失われていた。代表的プラスミドを分析する
と、NGリンカーは³²P標識NGリンカーのプローブをプラ
スミドDNAへ、後述するように、交雑することによって
存在することが確証された。次いで、このプラスミド、
pLATK dl NdeI dl BgIII/NG/SstIと表示する（第３図参
照）、のワーキングプールを調製した。

I.tk遺伝子の解読区域へのヌクレアーゼ配列５′の一部
を除去するためのpLATK dl NdeI誘導体のエキソヌクレ
アーゼ処理 機能的IBRVtk遺伝子の近似の５′境界を描写するため
に、PvuII〜BamHI切離し部位の間のある点に対して下流
のpLATK dl NdeIのClaI部位から伸びるヌクレアーゼの
欠失を使用して、１系列のプラスミドを構成した（第３
図参照、０〜1.6地図単位）。ヘニコッフ（Henikoff）
のエキソヌクレアーゼIII消化の手順［ヘニコッフ（Hen
ikoff）,S.遺伝子（Gene）28:351-359（1984）参照］に
従った。

KpnI切離し部位およびEcoRおよびClaI結合端を含有す
るリンカーを、前述の自動化DNA合成装置で合成した。
このリンカーは、まず15マーのヌクレアーゼ配列（５′
−AATTCGGTACCTCAT-3′）および13マーのヌクレアーゼ
配列（５′−CGATGAGGRACCG-3′）をつくることによっ
て得られた。これらのオリゴヌクレオチドは11の相補的
塩基対を含有する。この相補的オリゴヌクレオチドをア
ニーリングして、４ヌクレアーゼの５′−EcoRI結合
端、２ヌクレアーゼの３′‐ClaI結合端、および二本鎖
領域中のKpnI切離し部位をもつ溶液DNA断片を得た。

このリンカーをpLATK dl NdeIのEcoRI部位とClaI部位
との間に挿入すために、このプラスミドをClaIで消化
し、次いでEcoIで消化し、次いで直線化されたプラスミ
ドをファージT4 DNAリガーゼとともに４℃において一夜
インキュベーションすることにより、EcoRI-KpnI-ClaI
リンカーへ結合した。この修飾されたpLATK dl NdeIプ
ラスミドをpLATK dl NdeI（Eco-Kpn-Cla）と表示した。

pLATK dl NdeI（Eco-Kpn-Cla）中の独特KpnI部位の挿
入は、引続くエキソヌクレアーゼIII欠失手順にとって
重要ではなかった。KpnIの の消化は、３′オーバーハンギング（overhanging）一
本鎖末端を生成し、これはエキソヌクレアーゼIII消化
に対して耐性である。しかしながら、ClaI切離し後、新
しくつくられたClaI末端は処理のエキソヌクレアーゼII
Iの消化に対して感受性である。こうして、KpnIおよびC
laI消化後、pLATK dl NdeI（Eco-Kpn-Cla）は配列を時
計回りの方向に消化するが、プラスミド上の反時計回り
の配列は消化されない。

欠失プラスミドを得るために、プラスミドpLATK dl N
deI（Eco-Kpn-Cla）のエキソヌクレアーゼIII消化を次
のようにして実施した： 100μｌのClaI切断緩衝液中の5.0μｇのpLATK dl Nde
I（Eco-Kpn-Cla）を、20単位のClaI［ニュー・イングラ
ンド・バイロラブス・インコーポレーテッド（New Engl
and BioLabs,Inc.）］で37℃において２時間消化した。
この反応をCDTAを20ミリモルに添加することにより停止
させ、そして酢酸ナトリウムを0.1モルに添加し、次い
で65℃に30分間加熱した。このDNAをエタノールで沈殿
させ、そして前述のように遠心により集めた。

ClaI切離しプラスミドを100μｌのKpnI切断緩衝液中
に再溶解し、次いで20単位のKpnI［ニュー・イングラン
ド・バイロラブス・インコーポレーテッド（New Englan
d BioLabs,Inc.）］の添加により37℃で２時間消化し
た。この反応を、前述のようにして、停止させ、DNAを
エタノールで沈殿させ、そして集めた。

ClaIおよびKpnI切離しプラスミドを66ミリモルのトリ
ス−HCl、pH8.0、0.6ミリモルのMgCl₂中に100μg/mlの
濃度で再溶解し、次いで1/10体積のエキソヌクレアーゼ
III［ベチェスダ・リサーチ・ラボラトリーズ・インコ
ーポレーテッド（Bethesda Reseach Laboratories,In
c.）;65,000単位/ml］を添加し、次いで37℃でインキュ
ベーションした。5.0μｌのアリコートを30秒の間隔で
取り出し、そして0.2モルのNaCl、5.0ミリモルのEDTA、
pH8.0、からなる溶液の15μｌに添加し、そして混合し
た。エキソヌクレアーゼIII活性を70℃で10分間熱不活
性化した後、60μｌのエタノールを添加し、そしてDNA
を−20℃で一夜沈殿させ、そして遠心により集めた。

エキソヌクレアーゼIII消化した分画を0.25モルのNaC
l、30ミリモルの酢酸カリウム（pH4.6）、1.0ミリモル
のZnSO₄、５％（v/v）のグリセロールからなる緩衝液の
50μｌ中に再溶解し、次いで6.8単位のS1ヌクレアーゼ
［ベーリンガー・マンヘイム（Boetinger-Mannheim）］
で室温において30分間消化した。この反応を6.0μｌの
0.5モルのトリス−HCl、0.125モルのEDTAの添加により
停止させた。この反応混合物をフェノールで抽出し、次
いでクロロホルムで抽出し、そして次に、DNAを２体積
のエタノールで沈殿させ、そして遠心により集めた。

順次の消化により得られた試料の各々について、端を
クレナウ（Klenow）酵素とあわせた。詳しくは、DNAを
6.0ミリモルのトリス、pH7.5、6.0ミリモルMgCl₂、1.0
ミリモルのジチオスレイトール、50ミリモルのNaClから
なる１×緩衝液中に再溶解し、そして10単位/mlのE. co
li DNAポリメラーゼ、クレナウ（Klenow）断片［ベチェ
スダ・リサーチ・ラボラトリーズ・インコーポレーテッ
ド（Bethesda Reseach Laboratories,Inc.）］で37℃に
おいて２分間消化した。次いで、すべての４つのデオキ
シヌクレオシドトリホスフェートを0.1ミリモルに添加
し、そしてインキュベーションをさらに２分間続け、次
いで70℃で５分間加熱し、そしてDNAのエタノール沈殿
および収集を前述のようにして実施した。

プラスミドの各々を、100単位のT4 DNAリガーゼを含
有する標識緩衝液中で４℃において一夜自己結合させる
ことによって再構成した。この反応をEDTAを20ミリモル
に添加しそして65℃に10分間加熱することによって停止
させた。得られる形質転換体を前述の急速スクリーニン
グによりスクリーニングし、そして前述のアガロースゲ
ルの電気泳動により分析した。漸進的欠失を保持したプ
ラスミドを選択し、そして大規模のプラスミドDNAの調
製を前述のように実施した。

プラスミドの２つ、pLATK dl NdeI（Exo36）およびpL
ATK dl NdeI（Exo46）と表示する、を後にファージpS65
誘導体の構成に使用した。これらの誘導体を転写し、そ
して生体外で翻訳して37,000ダルトンのポリペプチドを
得た。これらの研究は、後に詳述するが、IBRVtk遺伝子
の翻訳開始信号および網状赤血球のリボソーム結合部位
が、第４図に示すヌクオチド配列の「36」と標識する部
位に対してちようど下流（３′）に存在することを立証
した。

実施例２ IBRVtk遺伝子のヌクレオチド配列 プラスミドpLATK dl NdeIの断片（第１図参照）を、
ファージM13mp18およびM13mp19の二本鎖の複製形態（R
F）中でサブクローニングした［フ（Hu）,N.T.およびメ
ッシング（Messing）,J.,遺伝子（Gene）17:217-272（1
982）およびメッシング（Messing）,J.およびビエイラ
（Vieira）,J.,遺伝子（Gene）19:269-276（1982）参
照］。これらの２種類のファージの使用は、２つの向き
で小さいオーバーラッピングDNA断片のクローニングを
可能として。次いで、組み換えファージM13誘導体をE.
coli K12 JM103バクテリア［ニュー・イングランド・バ
イロラブス・インコーポレーテッド（New England BioL
abs,Inc.）］中で複製すると、引続く反応において使用
できる一本鎖ファージDNAが合成された。

配列反応を普通のデオキシヌクレオチド鎖の停止方法
により実施した［サンガー（Sanger）,F.,コウルソン
（Coulson）,A.R.,バレル（Barrell）,B.G.,スミス（Sm
ith）,A.J.H.およびロエ（Roe）,B.A.,ジャーナル・オ
ブ・モレキュラー・バイオロジー（J. Mol. Biol.）14
3:161-178（1980）；サンガー（Sanger）,F.,ニックレ
ン（Nicklen）,S.およびゴウルセン（Gulse）,A.R.,プ
ロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンシズ（Proc. Natl. Acad. Sci.）USA74:54
36-5467（1977）参照］。この反応混合物は、鋳型とし
てIBRV DNAの一本鎖ファージM13mp18またはM13mp19のサ
ブクローン、鋳型の各々上でDNAの合成を開始するため
に、M13ペンダデカマープライマー［ニュー・イングラ
ンド・バイロラブス・インコーポレーテッド（New Engl
and BioLabs,Inc.）］または自動化DNA合成装置−ミク
ロシン（Microsyn）［システック・インコーポレーテッ
ド（Systec,Inc.）を使用して作られたIBRV DNAの合成
オリゴヌクレオチドヌクレオチドプライマー、標識基質
として（α−₃₂P）−dTTP、Mg⁺⁺、適当な標識されてい
ないデオキシリゴヌクレオシド、トリホウフェイトおよ
びジデオキシリボヌクレオシドトリホスフェイト、およ
びE. coliDNAポリメラーゼ、クレナウ（Klenow）断片
［ベチェスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Bethesda R
eseach Laboratories）］を含有した。38℃で15分間反
応混合物をインキュベーションした後、非放射性デオキ
シリボヌクレオシドトリホスフェイトを含有するチェイ
ス（chase）溶液を添加した。38℃で10分後、0.3モルの
酢酸ナトリウムおよび200μｇの酵母菌tRNA［シグマ・
ケミカル・カンパニー（Sigma Chemical Co.）］添加す
ることにより、反応を停止させた。反応生成物をエタノ
ールで沈殿させ、90％（v/v）のホルムアミド、30ミリ
モルのNaOH、10ミリモルのEDTA、0.3％（w/v）のブロモ
フェノールブルーおよび0.3％（w/v）のキシレンシアノ
ールからなる溶液の10μｌ中に溶解し、90℃に１分間加
熱し、そして7.6％（w/v）のアクリルアミド、0.4％（w
/v）のビスアクリルアミド、0.003％（v/v）のTEMED、
0.007％（w/v）の過硫酸アンモニウムおよび17％（v/
v）のホルムアミドからなる８％（w/v）のシークエンシ
ング（sequencing）ゲルの中に負荷した。

IBRVtk遺伝子を含有する2814bのXphoI〜SstI断片のヌ
クレオチド配列、LATK16と表示する、を第４図に示す。
第４図に示すヌクレオチド配列は、IBRVtk遺伝子の高い
進展の保存性のために、IBRV（ロサンジェルス）のtk遺
伝子をシークエンシングすることにより得られたが、他
のtk⁺IBRV菌株は、上に例示するように、実質的に同様
なヌクレオチド配列をもつtk遺伝子を有することが期待
され、そして、こうして、後述するように、第４図に示
すヌクレオチド配列は、出発物質としてIBRV（ロサンジ
ェルス）以外のtk⁺IBRV菌株を使用して追加のtk^-IBRV欠
失突然変異体を構成するために使用できる。

第４図において、配列の開始におけるXphoI部位（CTC
GAG）は0.5地図単位におけるpLATK dl NdeI XphoI部位
に相当する（第３図）。次いで、この配列は3.4地図単
位でpLATK dl NdeIのXphoIからSalI部位（GTSGAC）に時
計方向に伸びる。TAに富んだ配列は、転写制御信号の一
部として役立つことができ、ヌクレオチド1127および12
29において下線が引かれている。推定の「CAAT）」長方
形は、同様に、転写制御信号の一部であることができ、
また下線が引かれている。IBRV TKポリペプチドのため
の、推定の翻訳開始信号、すなわち、ATG、はヌクレオ
チド1292に存在する。このATGコドンは最初のATGコドン
であり、ヌクレオチド1127におけるTTAAAAA配列をたど
り、真核生物のリボソームはRNAの５′末端に最も近いA
UGにおいて蛋白質の合成を通常開始するという仮説と一
致する［コザク（Kozak）,M.,核酸の研究（Nucl. Acids
Res.）9:5233-5252（1981）参照］。コザク（Kozak）
は、また、真核生物のmRNAはほとんど常にあATGから−
３あるいはa3においてＧ、あるいは両者の一にプリンを
有することを観察した。配列（GCCATGG）（ヌクレオチ
ド1289〜1295）がこのルールに合致することを理解でき
るであろう。IBRVtk遺伝子のための推定の翻訳停止コド
ン、すなわち、TAA、はヌクレオチド2366に存在する。

第４図のヌクレオチド配列は１つの開いたリーディン
グフレームを含有し、このリーディングフレームは分子
量36,903の358アミノ酸ポリペプチドに翻訳されること
ができる。このポリペプチドの予測したアミノ酸配列
は、生化学の命名法についてのIUPAC-IUB命令（IUPAC-I
UB Commissin on Biochemical Nomenclature）［ユーロ
ピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Eur.
J. Biochem.）5:151-153（1968）参照］。予測したIBR
V TKポリペプチドの大きさは、HSV-1、HSV-2、およびヘ
ルペスウイルス・タマリヌス（Herpesvirus tamarinu
s）TKポリペプチドのそれに類似する［オーツカ（Otsuk
a）,H.およびキット（Kit）,S.,ウイルス学（Virol.）1
35:316-330（1984）およびキット（Kit）,S.,キット（K
it）,M.,クアビ（Qavi）,H.,トルクラ（Trkula）,D.お
よびオーツカ（Otsuka）,H.,バイオヒミカ・エト・バイ
オフィジカ・アクタ（Biochim. Biophys. Acta）741:15
8-170（1983）参照］。さらに、予測されたIBRV TKポリ
ペプチドのアミノ酸残基10〜27は、HSV-1およびHSV-2 T
Kポリペプチドのアミノ酸残基49〜66およびヘルペスウ
イルス・タマリヌス（Herpesvirus tamarinus）TKポリ
ペプチドのアミノ酸残基10〜27の相同であり、これらは
TK酵素の保存されたATP結合ポケットを表わすように思
われる。最後に、この配列から得られた転写体の生体外
翻訳生成物は約37,000の分子量を示し、これはIBRV TK
ポリペプチドの予測された大きさと一致する（詳細につ
いては下を参照）。

第４図に示すIBRV DNAの鎖の他の２つのリーディング
フレームならびに相補性鎖の３つのリーディングフレー
ムは、多くの翻訳停止信号を含有し、そして35,000〜4
0,000の分子量のポリペプチドに翻訳されることができ
ない。

75より多くの異なる制限ヌクレアーゼについての制限
ヌクレアーゼ部位は、第４図に示すヌクレオチド配列か
ら予測される。配列中にわずかに１〜３の切離し部位を
もつ普通の制限ヌクレアーゼのいくつかを、下の表２に
示す。

独特BgIIIおよびSalI（SstI）切離し部位は、それぞ
れ、ヌクレオチド1759および2102に存在することに注意
すべきである。これらの切離し部位により限界を確定さ
れた配列は、プラスミドpLATK dl Ndel dl BgIII/NG/Ss
tIの単離においてpLATK dl NdeIから欠失された（第４
図を参照）。この欠失はIBRVtk遺伝子の解読配列から約
113アミノ酸残基を排除する。さらに、pLATK dl Ndel d
l BgIII/NG/SstIのBgIII/SstI部位におけるNGリンカー
の結合は、また、翻訳リーディングフレームを変化させ
ること、および翻訳定礎信号、すなわち、TGAおよびTAA
をすべての３つのリーディングフレーム中に導入し、こ
れによりBgIII切離し部位を越える配列の翻訳を阻止す
るじちが期待される。

制限ヌクレアーゼ切離し部位の予測は、pLATK dl Nde
Iの制限地図と一致し（第３図参照）そして部位に関す
る正確なデータを提供し、これらのデータはプラスミド
pLATK dl NdeI中の他の欠失突然変異を工学するため
に、こうして、本発明の他のtk^-欠失突然変異体を工学
するために使用することができる。

また、欠失はプラスミドpLATK dl NdeIにおいて、こ
こに詳述する手順を変更することによりつくることがで
きる。例えば、NGリンカーは、プラスミドpLATK dl Nde
Iのエンドヌクレアーゼ切離し後に、BgIII/SstI末端に
結合することは必須ではない。すなわち、切離されたプ
ラスミドはエキソヌクレアーゼで処理して「ブラント末
端（blunt ends）」をつくり、あるいは欠失をギャップ
を広げ、次いでヌクレオチドリンカーの不存在下にファ
ージT4 DNAリガーゼと結合させる。

実施例３ IBRVtk遺伝子の生体外転写および翻訳 3Kbpのベクター、pSP64およびpSP65はよく知られてお
り、そして標準のサブクローニングベクターとしておよ
び高度に効率より生体外転写のための鋳型として便利に
使用するために構成されてきた［メルトン（Melton）,
D.A.ら、核酸の研究（Nucl. Acids Res.）12:7035-7056
（1984）およびプロメガ・バイオテク（Promega Biotec
h）1985/1986カタログおよび適用案内（application gu
ide）参照］。これらのベクターはファージM13ポリリン
カーからすぐ上流において、pUC12誘導プラスミド中に
クローニングされたファージSP6プロモーターを含有
し、これにより広い範囲のクローニング計画が可能とな
る。ポリリンカーに対して独特の11の制限酵素の部位が
存在し、そしてポリンカーの向きは２つのベクターにお
いて逆転される。

試験的にtk遺伝子として同定されたIBRV DNA配列を、
予測されるように（第４図）、37,000タルトンのポリペ
プチドへ生体外に転写しかつ翻訳することができるかど
うかを知るために、IBRV DNAをプラスミドpLATK dl Nde
I（Exo36）およびpLATK dl NdeI（Exo46）からプラスミ
ドpSP65に、下に記載するように、転位した。前者のプ
ラスミドはヌクレオチド1090で開始するpLATK16配列を
含有し、そして後者はヌクレオチド1130で開始するそれ
を含有した（第４図参照）。

１μｇのpSP65 DNAwo1.0μｇのpLATK dl NdeI（Exo3
6）またはpLATK dl NdeI（Exo46）と混合し、そしてま
ず前述の前述のEcoRI切断緩衝液中においてEcoRIで、次
いで、100ミリモルのNaCl、10ミリモルのトリス−HCl、
pH7.4、10ミリモルのMgCl₂および100μg/mlからなるPst
I切断緩衝液中でPstIで20μｌの最終体積において切離
した。この反応をEDTAを20ミリモルの最終濃度に添加
し、そして65℃に20分間加熱することによって停止させ
た。次いで、20μｌのフェノール：クロロホルム（１体
積:1体積）を添加し、この混合物を振盪し、次いでエッ
ペンドルフ遠心装置内で遠心した。水相（上）を他の管
に移し、そして２体積のエタノールを添加して切離され
たDNAを沈殿させた。DNA沈殿物を70％（v/v）のエタノ
ールで洗浄し、真空乾燥し、400単位のT4 DNAリガーゼ
［ニュー・イングランド・バイロラブス・インコーポレ
ーテッド（New England BioLabs,Inc.）］を含有する結
合緩衝液の40μｌ中に再溶解し、そして４℃で一夜イン
キュベーションした。この反応を160μｌのTE緩衝液を
添加することにより停止し、そして65℃で10分間加熱し
た。

次に、CaCl₂活性化E. coli K12 RR1C1を結合したDNA
で転写し、そしてアンピシリン耐性テトラサイクリン感
受性のコロニーを、2KbpのEcoRI/PstIインサートを含有
するpSP65誘導体の存在下にスクリーニングした。これ
らのプラスミド、pSP65（Exo36）およびpSP65（Exo46）
と表示する、の構造は、EcoRI、BamHI、BgIII、SacI、X
phoI、SalIおよびPstIを使用する制限エンドヌクレアー
ゼマッピングにより確証された。

pSP65（Exo36）およびpSP65（Exo46）の転写体を調製
するために、これらのプラスミドをSalIでまず消化し、
次いで、0.01％（v/v）のジエチルピロカーボネート
（以後「DEPC」）で前もって処理してRNase活性を不活
性化した蒸留水中に1.0μg/mlで再懸濁させた。次い
で、次の手順を用いた。

（ａ）生体外転写 無菌のDEPC処理した管に次のものを添加した： （１）19μｌの水（無菌の蒸留水、DEPS処理した） （２）10μｌの５×転写緩衝液（200ミリモルのトリス
−HCl、pH7.5（37℃で測定した）、30ミリモルのMgC
l₂、10ミリモルのスパーミジン、50ミリモルのNaCl） （３）5.0μｌの0.1モルのジチオスレイトール （４）2.0μｌのRNAsin（40単位／μｌ）［プロメガ（P
romega）］ （５）10μｌの５×rNTP（10ミリモルのGTP、10ミリモ
ルのATP、10ミリモルのCTP、10ミリモルのUTP）（プロ
メガ） （６）2.0μｌのDNA（1.0μg/μｌの直線） （７）2.0μｌのSP6 RNAポリメラーゼ［ベチェスダ・リ
サーチ・ラボラトリーズ（Bethesda Reseach Laborator
ies）;5〜10単位／μｇのDNA］ この混合物を40℃で１時間インキュベーションし、1.
0μｌの100μｇ（200単位/100μｌのDNase I）（クーパ
ー・バイオケミカル）;DPRF等級;11,290単位/5.6ml、50
％（v/v）のグリセロール中；−20℃で貯蔵した）を添
加し、次いで1.0μｌのRNAsin（40単位／μｌ（プロメ
ガ））。

この混合物を再び37℃で10分間インキュベーション
し、次いで等体積のフェノール：クロロホルム（１容
量:1容量）で１度抽出した。1/10体積の酢酸カリウム、
pH7.0および2.2体積のエアタオールを添加した。次い
で、この懸濁液を−20℃で少なくとも２時間インキュベ
ーションした。

（ｂ）mRNAのキャッピング エタノールで沈殿させたRNAをエッペンドルフ遠心装
置で５分間遠心し、そして上澄みを吸引により除去し
た。DNAの沈殿物を真空乾燥し、そして17.8μｌの無菌
のDEPC処理した水中に再懸濁させた。

次いで、次の物質を記載する順序で添加した： （１）250ミリモルのトリス−HCl、pH7.9、6.25ミリモ
ルのMgCl₂、30ミリモルのKC1、12.5ミリモルのジチオス
レイトール、500μg/mlのBSAからなるキャッピング（ca
pping）緩衝液×５の60μｌ （２）1.0μｌのRNAsin（40単位／μｌ）（プロメガ） （３）3.0μｌの1.0ミリモルのＳ−アデノシル−メチオ
ニン［シグマ・ケミカル・カンパニー（Sigma Chemical
Co.）］ （４）1.2μｌの1.0ミリモルのGTP（プロメガ） （５）1.0μｌのグアニルトランスフェラーゼ［ベチェ
スダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Bethesda Reseach L
aboratories）］。

この反応混合物、30μｌ、を37℃で45分間インキュベ
ーションし、フェノール：クロロホルム（１容量:1容
量）で抽出し、次いでキャップド（chapped）RNA転写体
を1/10体積の1.0モルの酢酸カリウム、pH7.0、および２
体積のエタノールの添加により沈殿させた。

（ｃ）キャップドmRNAの翻訳 キャップドRNAの転写対の翻訳を、次のように、ヌク
レアーゼ処理したウサギ網状赤血球リゼイト（プロメ
ガ）を使用して実施した： （１）RNAをエッペンドルフ遠心装置内で５分間遠心す
ることによって沈降させ、そして上澄みを吸引により除
去した。

（２）沈殿物をエタノール中で洗浄し、−20℃で30分間
インキュベーションした。遠心工程を反復し、そして沈
殿物を真空乾燥した。

（３）このRNA沈殿物を合計体積50μｌの次の成分の氷
***液に添加した： （ａ）8.0μｌの水（無菌;DEPCで処理した） （ｂ）1.0μｌのRNAsin（40単位／真黒1;プロメガ） （ｃ）5.0μｌの³⁵S−メチオニン（ニュー・イングラン
ド・ニュウクリアー;10μCi/μｌ） （ｄ）1.0μｌの1.0ミリモルのアミノ酸混合物（メチオ
ニンを含まず）（プロメガ） （ｅ）35μｌの網状赤血球リゼイト（プロメガ）。

この反応混合物を30℃で1.5〜２時間インキュベーシ
ョンした。

インキュベーション期間の終りに、翻訳生成物をポリ
アクリルアミドゲルの電気泳動により変性した。

（ｄ）変性手順 水を反応体積（50μｌ）に添加して、最終体積を200
μｌにした。次いで、0.0625モルののトリス、pH6.8、
0.3％（w/v）のドデシル硫酸ナトリウム、5.0（v/v）の
メルカプトエタノール、10％（v/v）のグリセロール、
および0.001％（v/v）のブロモフェノールからなる緩衝
液Ｄの100μｌを添加し、この混合物を２分間沸騰さ
せ、そして使用するまで−80℃で貯蔵した。

（ｅ）蛋白質翻訳生成物のポリアクリルアミドゲルの電
気泳動 ５×電気泳動緩衝液は、次の成分から成っていた： （１）144gのグリシン（カルビオケム） （２）30gのトリズマ（シグマ・ケミカル・カンパンニ
ー） （３）5.0gのドデシル硫酸ナトリウム（ベチェスダ・リ
サーチ・ラボラトリーズ） ポリアクリルアミドゲルは、次のようにしてつくっ
た： （１）3.17mlのH₂O （２）１。25mlのトリス緩衝液（４×0.5モルののトリ
ス−HCl、pH6.8、0.4％（w/v）のドデシル硫酸ナトリウ
ム） （３）0.5mlのアクリルアミド：ビスアクリルアミド（3
0:0.8（w/w）） （４）75μｌの2.0％（w/v）過硫酸アンモニウム （５）5.0μｌのTEMED（シグマ・ケミカル・カンパニ
ー）。

10％の走行するゲルは、次の成分から成っていた： （１）12mlのH₂O （２）7.5mlの低級トリス（４×1.5モルののトリス−HC
l、pH8.8、＋0.4％（w/v）ドデシル硫酸ナトリウム） （３）10mlのアクリルアミド：ビスアクリルアミド（3
0:0.8（w/w）） （５）15μｌのTEMED （６）0.5mlの50％（v/v）のグリセロール。

翻訳生成物の75μｌのアリコートを1.5mmの厚さのラ
エムリ（Laemmli）ゲルに適用し、そして40ボルトの一
定電圧において室温で16時間電気泳動させた。ゲルを固
定し、そして室温において50％（v/v）のメタノール、1
0％（v/v）の酢酸および0.015％（v/v）のクマッシーブ
ルーからなる溶液で30分間着色し、次いで10％（v/v）
の酢酸および10％（v/v）のメタノールからなる溶液で
室温において２時間脱色した。次に、このゲルを乾燥
し、そして−７−前記においてフジ（Fuji）Ｘ線フィル
ムで１日間直接オートラジオグラフィーにかけた。

pSP65（Exco46）およびpSP65（Exco36）プラスミドを
前述のように転写しかつ翻訳したとき、約37,000の分子
量をもつ放射性帯が検出した。RNAの転写が翻訳反応か
ら省略されたとき、帯は検出されなかった。これらの結
果が立証するように、「46」のしるしを付した点（第４
図のヌクレアーゼ1129）からpLATK dl NdeIのPstI部位
（第３図、3.6地図単位）へ伸びるヌクレオチド配列
は、分子量約37,000のポリペプチドに翻訳可能な開いた
リーディングフレームを含有する。

実施例４ tk^-欠失IBRV突然変異体の構成 Ａ、雑種プラスミドおよびtk^-IBRV DNAの組み換え tk^-IBRV菌株、すなわち、IBRV（B8-D53）の無傷のDNA
と、IBRVtk遺伝子の解読区域を含有する雑種プラスミ
ド、すなわち、pLAH-Aとの間の相同組み換えは、組み換
え体ウイルス、IBRV（PTK-B）と表示、中に機能的tk遺
伝子を救済することが、上において示された。

相同組み換えにより、tk遺伝子中にIBRV欠失突然変異
体を得るために、tk⁺IBRVの無傷のDNAとtk遺伝子の解読
区域中に欠失を含有する雑種プラスミドとを使用して出
発することが必要であった。この交差の型に従って得ら
れる子孫のウイルスは、親のtk⁺IBRVを含む。こうし
て、収穫物中にtk^-IBRV組み換え体を濃縮するために
は、BrdUrdを含有する選択的培地を使用した。なぜな
ら、BrdUrdはtk⁺IBRVの複製を阻止し、そしてtk^-IBRVの
外への生長を促進するからである。

IBRVのtk^-欠失突然変異体の構成のために選択した雑
種プラスミドは、pLATK dl Ndel dl BgIII/NG/SstIであ
った。しかしながら、IBRVtk遺伝子の解読区域に隣接し
た大きいあるいは小さいフランキング配列（第４図参
照）またはtk遺伝子の他の部分における大きいあるいは
小さい欠失を含有する他の雑種プラスミドを使用して、
本発明の範囲を逸脱しないで、「欠失」突然変異体をつ
くることができるであろう。

10μｇのpLATK dl Ndel dl BgIII/NG/SstIを20単位の
ClaIを含有するClaI切断緩衝液に添加し、37℃で３時間
消化し、次いで100単位のNdeIを等体積のNdeI切断緩衝
液中に添加し。追加の100ミリモルのNa個を増強し、そ
して37℃で消化することによって、pLATK dl Ndel dl B
gIII/NG/SstIから3.7KbpのClaI〜NdeI断片を切断した。
この反応を等体積の90％（v/v）のフェノールを添加す
ることによって停止させ、混合し、そして遠心して相分
離させた。水相を0.1×TEに対して透析した後、DNAを10
μg/mlに調節し、そして滅菌濾過した。

組み換え工程のために選択したtk⁺IBRV DNAはIBRV（R
TK-1B）であった。IBRV（RTK-1B）は、突然変異厳によ
り誘導される多重突然変異により減衰されたウイルス菌
株である、IBRV（B8-D53）から誘導したので、IBRV（RT
K-1B）は欠失突然変異体の構成のための他のtk^-BRVの現
場の菌株（field strains）よりも好ましいウイルスで
あた。しかしながら、前述のように、他の菌株は本発明
の精神を逸脱しないで等しく適するであろう。

IBRV（RTK-1B）の組み換えtk^-欠失突然変異体の構成
を、次のようにして実施した： RAB-9細胞を60mmのペトリ皿中接種し（0.2×10⁶細胞
／皿）そして37℃で48時間インキュベーションした。次
いで、次の無菌溶液を順番に試験管に添加した： （１）0.02mlの50μl/mlのTE緩衝液中のIBRV（RTK-1B）
DNA溶液； （２）0.2mlのClaIおよびNdeIで切離した雑種プラスミ
ドpLATK dl Ndel dl BgIII/NG/SstIの10μg/mlの溶液； （３）0.65mlの水； （４）1.0mlの２×ヘペス（Hepes）緩衝液中のサケ***
DNAの20μg/mlの誘導；前記緩衝液は16g/lのNa細胞、0.
74g/lのKCl、0.25g/lのNa₂HPO₄・2H₂O、2.0g/lのグルコ
ース,10g/lのヘペス、pH7.05からなっていた（以後「２
×ヘペス緩衝液」） （５）0.13mlの2.0モルのCaCl₂ 得られた溶液を転倒により混合し、そして室温に30分
間保持し、その間DNA−リン酸カルシウム沈殿が形成し
た。次いで、DNAのリン酸カルシウム沈殿を含有する懸
濁液の0.5mlを、5.0の生長培地に直接添加し、そして、
前もって60mmのペトリ皿中に接種してあるRAB-9細胞上
に配置した。細胞を37℃で５時間インキュベーションし
た。次いで、培地を吸引し、そして単層を5.0mlの新し
い生長培地ですすぎ、次いで1.0mlの１×ヘペス緩衝液
＋15％（v/v）のグリセロールの溶液を添加した。室温
で３分後、この溶液吸引し、単層を再び培地ですすぎ、
そして新鮮な生長培地を添加した。この培養物を、34.5
℃で広範な細胞毒性作用が置こるまで、３日間インキュ
ベーションした。ウイルスの収穫を前述のようにして行
ない、そして−80℃で貯蔵した。次いで、ウイルスの収
穫物をRAB-9細胞中で寒天のオーバーレイ（overlay）の
下で滴定した。

同時トランスフェクションからのウイルスの収穫物を
融解し、超音波処理し、そして50μg/mlのBrdUrdを補充
した生長培地中で希釈した。tk^-IBRVの欠失突然変異体
を濃縮するために、収穫したウイルスを0.1PFU/細胞の
入力多重度に希釈し、そして50μg/mlのBrdUrdを補充し
た生長培地中で227g（８オンス）の規定のびん内でRAB
（BU）細胞を全面生長の単層培養物において継代培養し
た。37℃で１時間吸収させた後、感染した単層培養物を
GKNで３回洗浄した。次いで、50μg/mlのBrdUrdを含有
する生長培地を添加し、インキュベーションを34.5℃で
48時間続け、そしてバクテリアの収穫物を得た。

第１選択工程の収穫物を滴定し、そして第２選択工程
のを前のように実施した。第２選択工程の収穫物をRAB-
9細胞中で滴定し、IBRVの候補のtk^-欠失突然変異体のプ
ラークから無作為にピックアップし、そしてウイルスの
プールを調製した。このようにして、96のtk^-IBRV欠失
突然変異体の候補を得た。

B.分子ハイブリッド形成のためのプローブの製造 tk-IBRV欠失突然変異体候補（tk^-IBRV deletion muta
nt candidates）のtk遺伝子において、NGリンカーの存
在と共に、欠失があることを証明するために、³²P標識
プローブとの分子ハイブリッド形成実験を行った： （１）BglII/SacI（SstI）プローブの製造： このプローブは、ファージM13mp19にpLATK dl NdeIの
BglII-SacI（SstI）ヌクレオチド配列を挿入することに
よって製造されたファージM13mp19（BglII/SacI）のRF
型のニックトランスレーションによって製造された［下
記に詳細に説明された、ヤニシューペロン，シー.,ビエ
イラ，ジエイ及びメッシング，ジエイ.,ジェネ 33:103
-119（1985）（Yanisch-Perron,C.,Vieira,J.,andMssi
g,J.,Gene 33:103-119（1985））参照］（第４図、ヌク
レオチド1759-2102からのLATK16配列、も参照）。

M13mp19（BglII/SacI）は下記の如くして構成され
た。先ず、ファージM13mp19のRF型とpLATK dl NdeIの混
合物をBamHI及びSacIで切断した。反応生成物をファー
ジT4DNAリガーゼで連結し、CaCl₂で活性化されたE.coli
JM105バクテリアを形質転換するために使用し、そして
629 bp BamHI-BglII-SacIインサート（第４図、LATK16
のヌクレオチド1473-2102、参照）を含有する形質転換
体（transformants）をスクリーニングした。このよう
にして得られたM13mp19組換え体はファージ19-301と名
付けた。

ファージ19-301のRF型を製造し、そしてBamHI及びBgl
IIで引き続いて切断し、ファージT4DNAリガーゼで連結
し、CaCl₂で活性化されたE.coil JM105バクテリアを形
質転換するために使用した。BglII及びBamHIで切断され
たDNAsは同じ付着端を有しているので、この形質転換か
ら得られた組換え体ファージの大部分は、ファージ19-3
01の286 bp BamHI-BglII断片及びヌクレオチド1473-175
9のLATK16配列（第４図参照）を欠失していたが、ヌク
レオチド1759-2102のLATK16配列（第４図参照）を保持
していた。RFファージDNAは候補組換え体ファージ（can
didates recombinant phage）から製造され；次いでM13
mp19（BglII/SacI）と名付けられたファージの構造は制
限ヌクレアーゼマッピングにより確かめられた。³²p標
識プローブは下記の如くして、M13mp19（BglII/Sac）の
RF型のニックトランスレーションにより製造された。あ
るいは、M13mp19（BglII/SacI）のRF型を先ずSacI及びP
stIで切断し（PstIはIBRV/M13mp19インサートのBglII/B
amHI接合部から上流のM13mp19のポリリンカークローニ
ング領域（polylinker cloning region）のクローニン
グ部位である）［ニューイングランド バイオラボラト
リーズ’（New England Biolabs'）1985/1986カタログ,
47ページ、参照］、そして、SacI-PstI断片を10−40％
スクロースグラジエント（sucrose gradient）において
39,000rpmで20時間遠心分離によって精製しそしてニッ
クトランスレーションした。

6.0μmolのPBS、pH7.4;1.8nmolのdATP;1.8 nmol dGT
P;0.1mCi（α‐³²P）dTTP（400Ci/mmole）;0.1mCi（α
‐³²P）dCTP（400Ci/mmole）［アマーソン社（Amerson
Corporation）］を含有する反応混合物25μｌに、約1.0
μｌのプラスミドDNAを加えた。DNアーゼＩ（ワシント
ン バイオケミカル社）1.0μｌ中の1.33ngを加え、そ
して反応混合物を室温で１分間放置した。次ぎに、反応
混合物をE.coliDNAポリメラーゼＩ［ベーリンガー マ
ンハイム バイオケミカルス（Boehringer-Mannheim Bi
ochemicals）］1.0μｌ中の5.0単位と共に14℃でインキ
ュベーションした。特異的活性が２×10⁸cpm/μgDNAよ
り高く成ったとき、即ち、３時間して、0.25M EDTA（pH
7.4）10μｌを加えそして68℃で10分間加熱することに
よって反応を終了させた。次いで、キャリヤーとして、
TE緩衝液中の音波処理したさけの***DNA5.0mg/mlを含
有して成る溶液50μｌを混合物に加え、そして、ニック
トランスレーションされたDNAを、セファデックスG50
（微細）カラムクロマトグラフィーにより、溶出緩衝液
としてNaCl10mM、トリス−HCl10mM、pH7.5、EDTA2.0mM
を使用して精製した。

得られる³²Pで標識されニックトランスレーションさ
れたDNAは、水浴中で20分間煮沸しそして氷上で迅速に
冷却して一本鎖DNAを形成した後DNA-DNAハイブリッド形
成実験のプローブとして使用された。［リグビー，ピ
ー．ダブリュ．ジエー.,ディックマン，エム.,ローデ
ス，ジー.,及びバーグ，ピー.,ジャーナル オブ モレ
キュラー バイオロジー.113:237-251（1977）（Rigby,
P.W.J.,Dickman,M.,Rhodes,G.,andBerg,P.,J.Mol.Biol.
113:237-251（1977）参照］。

（２）pLATK dl NdeIプローブ： このプローブはプラスミドpLATK dl NdeIのニックト
ランスレーションにより製造された（第３図参照）。

（３）NGプローブリンカー： NGリンカーの剛性は前記した。プローブを製造するた
めに、NGリンカーは下記の如くして³²Pで標識された： 150μCiγ‐³²PATP、70mMトリス−HCl（pH7.6）、10m
MMgCl₂、5.0mMジチオスレイトール及びT4ポリヌクレオ
チドキナーゼ５単位（ニュー イングランド バイオラ
ボラトリーズ社）を含有して成る反応混合物にNGリンカ
ー50ピコモルを加えた。混合物を37℃で１時間インキュ
ベーションし、そして、EDTAを20mMになるように加える
ことにより反応を終了させ、続いて、ゲルP4［バイオ−
ラッド社（Bio-Rad,Inc）］によるゲルろ過により標識
されたNGリンカーを精製して未反応のγ−³²PATPを除去
した。溶出緩衝液は前記したセファデックスG-50クロマ
トグラフィーに使用したものと同じであった。プローブ
は既に一本鎖になっていたので、使用前に熱処理しなか
った。

C.分子ハイブリッド形成によるIBRV（RTK-1B）の組換え
体tk^-IBRV欠失突然変異体の同定 前記した候補組換え体から製造されたウイルスDNAsを
ドットブロット法（dod blot method）［ブランズマ，
ジェー．及びミラー，ジー.,プロシーディングス オブ
ザ ナショナルアカデミー オブ サイエンス． ユ
ーエスエー.77:6851-6855（1980）（Brandsma,J.and M
iller,G.,Proc.Nat.Acad.Sei.USA 77:6851-6855（198
0））参照］により分析して0.4 Kbb BglII-SstI IBRV t
k遺伝子断片を欠失しているウイルスを同定した。特定
的には、RAB-9細胞の集密的単層を含有する24ウエルの
マルチウエル組織培養トレーを希釈されていない候補ウ
イルス0.05mlで感染させそして34.5℃で８時間インキュ
ベーションした。ウイルス接種物を吸引し、ウエルをGK
N1.0mlで洗浄し、0.5NNaOH0.2mlの各ウエルに加えて細
胞を溶解してDNAを放出させた。室温で一夜貯蔵した
後、ウエル当たり1.0Mトリス−HCl（pH7.5）0.3mlと、N
aCl3.0M、クエン酸ナトリウム0.3Mを含有して成る20×S
SC緩衝液、pH7.0（以後“20×SSC"と呼ぶ）を加えた。
ドットブロット分析のために、96ウエルのシュライヘル
アンドシュエルろ過装置（Schleicher and Schuell fil
tration apparatus）においてニトロセルロースフィル
ターを使用した。フィルターをDNA試料を加える前に水
及び１×SSCで洗浄した。DNA試料をフィルターにベーキ
ングする（bake）ために、ニトロセルロースフィルター
を乾燥し、真空乾燥器中で60℃で一夜加熱し、次いで80
℃で２時間加熱した。フィルターを、３×SSC50ml、0.0
2％（w/v）フィコール（Ficoll）、0.02％（w/v）BSA、
0.02％（w/v）ポリビニルピロリドン、煮沸され且つア
ルカリ変性されたさけの***DNA［以後変性されたデン
ハーツの溶液（“modified Denhardt's solution）と呼
ぶ］50μg/ml、10μg/mlポリ（Ａ）を含有するプラスチ
ックのシール可能な袋に入れ、そして振とうしながら60
℃で一夜インキュベーションした。0.2NNaOH10ml中にさ
けの***DNA50mlを溶解し、100℃で20分間加熱して変性
しそしてDNAに剪断力をかけて約0.4kb断片とし、次いで
10NHC10.2mlで中和することにより調製された約5.0mg/m
lのストック溶液からアルカリ性さけ***DNAを加えた。

変性されたデンハーツの溶液を、次いで、50％（v/
v）ホルムアミド、0.6MNaCl、0.2Mトリス−HCl、pH8.
0、0.02MEDTA、0.1％（w/v）ドデシル硫酸ナトリウム、
アルカリ変性されたさけ***DNA50μg/ml及び10μg/ml
ポリ（Ａ）を含有して成るハイブリッド形成緩衝液（以
後“ハイブリッド形成緩衝液”と呼ぶ）50mlで置換し
た。次いで気泡をバッグから絞り出し、バッグは次いで
オスター タッチーアーマチック バッグシーラー（Os
ter Touch-a-Matic Bag Sealer）を使用してシールしそ
してシェーカー上で37℃で１時間インキュベーションし
た。

しかる後、前記の如くして得られた、一本鎖（³²P）
ニックトランスレーションされたBglII/SacIプローブ約
10⁷cpm及び50ngを含有する約1.0mlを、バッグの側部を
コーナーで突き通すことにより3.0ml注射器によりバッ
グに加えた。次いで、バッグを再シールし、そしてシェ
ーカー上で37℃で48時間までインキュベーションしてハ
イブリッド形成させた。

ハイブリッド形成が終了した後、バッグを切りそして
溶液をデカンテーションした。次いでフィルターを注意
深く除去し、そして最初の洗浄のみに対して変性された
さけ***DNA50μg/mlを含有するがどの洗浄においても
ポリ（Ａ）は含有しないハイブリッド形成緩衝液約100m
lを含有するトレーに入れた。フィルターを穏やかに振
とうさせながら37℃で30分間５回洗浄した。次ぎに、フ
ィルターを0.3×SSCで37℃で30分間洗浄し、次いでろ紙
上に置いて一夜室温で乾燥した。

オートラジオグラフィーのために、フィルターをサラ
ンラップで覆われたカードボートの薄片の上に置き、−
70℃で５時間乃至２日の期間強化スクリーン（intensif
ying screen）を有するフジＸ線フィルム（Fugi X-ray
film）に露出した。96の候補のウイルスの内約35はBglI
I/SacIプローブに対してハイブリッド形成をせず、これ
らのクローンはIBRV tk遺伝子のBglII/SacI（SstI）配
列における欠失を有することを示している。更に分析す
るために２種のクローンを貯蔵しそしてIBRV（NG）dlTK
クローン１及びIBRV（NG）d1TKクローン５と名付けた。

高純度のウイルスDNAが前記の如くして製造された。
候補欠失突然変異体（candidate deletion mutants）の
各からのウイルスDNA0.5μｇを制限ヌクレアーゼ、Hind
III、BamHI、KpnI及びSalIにより、ニューイングランド
バイオラボラトリーズにより指示された条件下に切断
し、そして断片を0.6％（w/v）アガロース上で35ボルト
（一定電圧）で４℃にて16時間電気泳動により分離し
た。電気泳動緩衝液は0.04Mトリズマ塩基（Trizma bas
e）、pH8.1、0.03MNaH₂PO₄及び0.001MEDTAであった。親
IBRV（RTK-1B）の制限ヌクレアーゼ断片及びファージラ
ムダDNA（phage lambda DNA）のHindIIIダイジェスチョ
ン（digestion）及びファージφX174RF DNAのHaeIIIダ
イジェスチョンにより得られたマーカー断片も電気泳動
にかけた。ゲルはエチジウムブロミドで染色され、そし
てDNA断片を示すために前記の如くして写真撮影され
た。

得られた結果はIBRV（RTK-1B）の6.7Kbp KpnI及び2.8
Kbp SalI断片（第２図、プラスミド pLAKマップユニッ
ト1.6-8.3及び第３図、プラスミドpLATK dl NdeIマップ
ユニット0.6-3.4参照）は特異的に変化させられたこ
と、及び新しい更に遠く移動する（より小さい）断片が
欠失突然変異体に存在していることを示した。これはIB
RVtk遺伝子からのほぼ0.4BglII/SacIの欠失と一致して
いる。予期される如く、移動度シストは欠失突然変異体
のHindIII-A断片には現れなかった。その理由は小さな
欠失はHindIII-A断片の大きい寸法（21.4Kbp）により不
明瞭にされるからである。同様に、IBRV（RTK-1B）の1.
1KbpBamHI断片（BamHI-J断片）（第３図、プラスミドpL
ATK dl NdeIマップユニット2.0-3.0）はIBRV（RTK-1B）
のBamHI断片におけるよりは欠失突然変異体DNA断片にお
いて約0.4kbより小さかった。

電気泳動の後、アガロースゲルにおいて分離されたDN
A制限断片（restriction fragments）は下記の方法によ
る分子ハイブリッド形成実験のためにニトロセルロース
フィルター（シュライヘルアンドシュウエル）に移され
た：アガロースゲルを1.0MKOHを含有するガラスベーキ
ングトレーに室温で30分間入れ、次いで1.0Mトリス−HC
l、pH7.0及び0.6MNaClを含有するガラスベーキングトレ
ーに室温で30分間入れた。次いで処理したゲルをブロッ
ト装置［ベセスダ リサーチ ラボラトリース（Bethsd
a Research Laboratories）］に移した。

ニトロセルロースフィルターを水中で10分間及び20×
SSC中で５分間予備湿潤させた。次ぎにフィルターをゲ
ル上に置いた。輸送流体てして20×SSCを使用して、ブ
ロッティング（blotting）を約24時間進行させた。付着
性ゲルをニトロセルロースフィルターから除去し、そし
てフィルターを６×SSCで洗浄し、室温で数時間乾燥
市、次いで真空デシケーター中で60℃で一夜乾燥した。
この後80℃で２時間ベーキングを行った。ニトロセルロ
ースフィルターをデシケータから除去しそしてダゼイシ
ール−ア−ミール クッキングバッグ（Dazey Seal-a-M
eal cooking bags）［サウザーン，イー．エム.,ジャー
ナル オブ モレキュラー バイオロジー.98:503-513
（1975）（Southern,E.M.,J.Mol.Biol.98:503-513（197
5）参照］に入れた。

フィルターを先ず変性されたデンハーツの溶液50mlに
より60℃で一夜予備処理し、次いで前記した如く37℃で
ハイブリッド形成緩衝液で処理した。

３つの別々のゲルからニトロセルロースフィルターを
次ぎに３つの別々の³²P標識プローブ：（ｉ）BglII/Sst
Iプローブ；（ii）pLATK dl NdeIプローブ；及び（ii
i）NGリンカープローブに対してハイブリッド形成させ
た。ニトロセルロースフィルターに対するプローブの分
子ハイブリッド形成方法及び洗浄工程は、³²P標識され
たNGリンカープローブの場合に、ハイブリッド形成反応
を35％（v/v）ホルムアルデヒド、0.6MNaCl、20mMEDT
A、0.2Mトリス、pH8.0、0.1％（w/w）ドデシル硫酸ナト
リウム溶液中で行いそして最終洗浄は６×SSCにより行
ったことを除いては、前記したのと同じであった。

この結果は、BglII/SstIプローブは特異的にIBRV（RT
K-1B）DNAの21.4kbのHindIIIフラグメント、1.1kbのBam
HIフラグメント、6.7kbのKpnIフラグメント及び2.8kbの
SalIフラグメントとハイブリッドを形成し、どのHindII
I-、BamHI-、KpnI-又はSalI-切断されたIBRV（NG）dlTK
クローン１及び5DNAのフラグメントともハイブリッドを
形成しないことを示していた。

更に、この結果は、pLATKdlNdeIプローブは特異的
に、（１）IBRV（RTK-1B）DNAのおよそ21kbのHindIIIフ
ラグメント及びIBRV（NG）dlTkクローン１及び5DNAの21
kbのHindIII;（２）IBRV（RTK-1B）DNAの17.3kb、15.7k
b及び1.1kbのBamHIフラグメント、及びIBRV（NG）dlTK
クローン１及び5DNAの17.3kb、15.7kb及び0.7kbのBamH
I;（３）IBRV（RTK-1B）DNAの6.7kbのKpnI及びIBRV（N
G）dlTKクローン１及び5DNAの6.3kbのKpnIフラグメン
ト；及び（４）IBRV（RTK-1B）DNAの0.8kbのSalIフラグ
メント及びIBRV（NG）dlTKクローンおよび5DNAの2.4kb
及び0.8kbのSalIフラグメント、とハイブリッドを形成
することを示した。tk遺伝子を含有するIBRV（RTK-1B）
DNAの1.1kbのBamHI、6.7kbのKpnI及び2.8kbのSalIフラ
グメントは、IBRV（NG）dlTKクローン１および5DNAの対
応するフラグメントより0.4kbだけ長かった。即ち、Bam
HIフラグメントは0.7kb、KpnIフラグメントは6.3kb及び
SalIフラグメントは2.4kbであった。導入された欠失に
比べてHindIII-Aフラグメントが大きかったので、IBRV
（NG）dlTKクローン１および5DNAの約21kbのHindIIIフ
ラグメントにおいては明白な変化はなかった。

更に、この結果は、NGリンカープルーブは特異的にIB
RV（NG）dlTKクローン１および5DNAの約21kbのHindII
I、0.7kbのBamHI、6.3kbのKpnI及び2.4kbのSalIフラグ
メントとハイブリッドを形成するが、IBRV（RTK-1B）DN
Aのフラグメントとはハイブリッドを形成しないことを
示した。

これらの実験は終結的に、IBRV（NG）dlTKクローン１
および５遺伝子は約0.4kbのBglII/SstI欠失を有し、IBR
Vtk遺伝子へのNGリンカーの挿入を有することを示す。I
BRV（NG）dlTKクローン１はATCC No.VR-2112下のアメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクション（American T
ype Culture Collection）に寄託されている。

実施例５ IBRV株の活性 欠失突然変異体IBRV（NG）dlTKクローン１が機能的な
TK活性を誘導する能力を欠いていることを証明するため
に、TK誘導実験を実施した。より明確には、RAB（BU）
細胞の亜集密的細胞単層（subconfluent monolayer）
培養物をIBRV（ロスアンジェルス）又はIBRV（NG）dlTK
クローン１で７時間偽感染（mock-infect）又は感染さ
せた。細胞質ゾルフラクションを調製し、TK活性につい
て検定した（米国特許第4,514,497号及びキット、エス
（Kit、S.）及びクアビ、エイチ（Qavi、H.）、バイロ
ロジー（Virol.）130:381〜389（1983））。得られた結
果を下記の表３に示す。

上記表３は以下のことを示す：（ｉ）RAB（BU）細
胞、すなわちtk^-ラビット皮膚細胞、はごくわずかなTK
活性を有する；（ii）RAB（BU）細胞はtk⁺IBRV（ロスア
ンジェルス）による感染後にTK活性を得るが、tk^-欠失
突然変異体、IBRV（NG）dlTKクローン１は感染後もTK活
性を得ない。このように、IBRVtk遺伝子からのBglII/Sa
cIフラグメントが欠失はTK誘導活性の全体的な損失に帰
着する。

実施例６ IBRV株の温度耐性 RAB-9細胞の同型の、亜集密的細胞単層の培養物をIBR
V（NG）dlTKクローン１で、約0.01PFU/細胞の投入多重
度（input mult iplicity）で感染させ、CO²インキュベ
ーター中、30℃、34.5℃及び39.1℃でインキュベートし
た。ウイルス収穫物を34.5℃で感染後４時間で調製した
投入ウイルスの吸収及び侵入の直後に存在する感染ウイ
ルスの量、及び30℃、34.5℃及び39.1℃でそれぞれ10日
間、４日間及び３日間インキュベートした後に存在する
感染ウイルスの量、を測定した。ウイルス収穫物を、米
国特許第4,514,497号に記載されているように、RAB-9
中、34.5℃及び39.1℃でプラーク滴定（plaque titrat
e）した。下記の表４にその結果を示す。

表４は、IBRV（NG）dlTKクローン１は34.5℃で４日間
インキュベートした後、約10²PFU/mlから約２×10⁷PFU/
mlに増殖し、この滴定量はプラーク滴定が34.5℃で行な
われるか又は39.1℃で行なわれるかには関係なく得られ
たことを示す。これは、該ウイルスが温度耐性であるこ
とを明らかに示している。表４は、それぞれ30℃又は3
9.1℃で10日間及び３日間で収穫物をつくる時にはそれ
ぞれ約10⁶及び10⁷PFU/mlの滴定量が得られたことをも示
している。再び、プラーク滴定が34.5℃で行なわれたか
又は39.1℃で行なわれたかには関係なく同様な滴定量が
形成された。従って、このウイルスは、広範囲な温度、
特に30℃から39.1℃又はそれ以上にわたって、高滴定量
まで成長できることが明らかである。

本発明はその特定の具体例に関して詳細に記述されて
いるが、その精神及び範囲をはずれることなく種々変化
させ及び変更できることは当業者には明白であろう。

【図面の簡単な説明】

第１図は、IBRV（BHV-1）クーパー（Cooper）HindIIIお
よびBamHI DNA制限地図を示す。 第２図は、機能的本発明tk遺伝子を含有する雑種プラス
ミドの制限エンドヌクレアーゼ地図を、一例として、概
略的に示す。 第３図は、本発明において使用する追加のtk⁺およびtk^-
プラスミドの誘導を、一例として、概略的に示す。 第4A図および第4B図は、IBRVtk遺伝子の解読区域および
そのフランキング（flanking）配列を含有する、IBRV D
NA断片のLATK16と表示するヌクレアーゼ配列（2814塩
基）を示し、そして第4A図は第4B図に続く。第4A図およ
び第4B図において、この蛋白質の分子量は36902.5であ
る。

フロントページの続き (72)発明者 ソール・キツト アメリカ合衆国テキサス州77024ヒユース トン・ウインクドライブ 11935 (56)参考文献 特開 昭60−221081（ＪＰ，Ａ) 欧州特許出願公開119025（1984)

Claims (78)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】感染性ウシ鼻気管支炎ウイルス（IBRV）の
   下記DNA配列に示されるチミジンキナーゼ遺伝子（tk）
   中のDNA配列が欠失した結果として、機能的チミジンキ
   ナーゼタンパク質（TK）を生産することができない感染
   性ウシ鼻気管支炎ウイルス。
2. 【請求項２】前記欠失が約10〜1500bpの大きさである特
   許請求の範囲第１項記載の感染性ウシ鼻気管支炎ウイル
   ス。
3. 【請求項３】前記欠失が約75〜750bpの大きさである特
   許請求の範囲第２項記載の感染性ウシ鼻気管支炎ウイル
   ス。
4. 【請求項４】前記ウイルスが温度耐性である特許請求の
   範囲第１項記載の感染性ウシ鼻気管支炎ウイルス。
5. 【請求項５】オリゴヌクレオチドリンカーがtk遺伝子の
   欠失部位中に存在する特許請求の範囲第１項記載の感染
   性ウシ鼻気管支炎ウイルス。
6. 【請求項６】前記リンカーが約７〜50ヌクレオチドの長
   さである特許請求の範囲第１項記載の感染性ウシ鼻気管
   支炎ウイルス。
7. 【請求項７】前記ウイルスがIBRV（NG）dlTKクローン１
   （ATCC No.VR-2112）である特許請求の範囲第１項記載
   の感染性ウシ鼻気管支炎ウイルス。
8. 【請求項８】前記ウイルスが凍結乾燥されている特許請
   求の範囲第１項記載の感染性ウシ鼻気管支炎ウイルス。
9. 【請求項９】（１）クローニングベクターとIBRVtk遺伝
   子の実質的にすべてを含有するIBRVのDNA断片とからな
   る雑種プラスミドを構成し、 （２）tk⁺宿主細胞中において、工程（１）の雑種プラ
   スミドをtk^-IBRV突然変異原誘導突然変異体からの感染
   性DNAで同時トランスフェクションし、 （３）tk^-宿主細胞中において、工程（２）において生
   産されたウイルスからのtk⁺IBRVについて選択し、 （４）実質的にすべてより少ないIBRVtk遺伝子が存在す
   るように、工程（１）の雑種プラスミドからDNA配列を
   欠失させ、 （５）tk⁺宿主細胞中において、工程（３）において得
   られたtk⁺IBRVから誘導されたIBRVtk⁺DNAを、工程
   （４）の結果として生ずるtk^-雑種プラスミドで同時ト
   ランスフェクションし、そして （６）tk^-宿主細胞中において、tk遺伝子中の欠失の結
   果として機能的TKを生産することができないtk-IBRV突
   然変異体を生産するように、工程（５）において生産さ
   れたウイルスからtk^-IBRVについて選択する、 工程を含んでなることを特徴とする方法によって生産さ
   れた特許請求の範囲第１項記載の感染性ウシ鼻気管支炎
   ウイルス。
10. 【請求項１０】前記欠失が約10〜1500bpの大きさである
    特許請求の範囲第９項記載の感染性ウシ鼻気管支炎ウイ
    ルス。
11. 【請求項１１】前記欠失が約75〜750bpの大きさである
    特許請求の範囲第10項記載の感染性ウシ鼻気管支炎ウイ
    ルス。
12. 【請求項１２】工程（２）におけるtk^-IBRV突然変異原
    誘導突然変異体が、工程（６）において得られる突然変
    異体は温度耐性でかつtk^-欠失の突然変異体であるよう
    な温度耐性突然変異体である特許請求の範囲第９項記載
    の感染性ウシ鼻気管支炎ウイルス。
13. 【請求項１３】（７）温度感受性ウイルスについて非許
    容性の温度において、工程（６）のtk遺伝子中の欠失の
    結果として機能的TKを生産することができない得られる
    IBRVを増殖し、こうしてtk遺伝子中の欠失の結果として
    機能的TKを生産することができない温度耐性IBRVについ
    て選択しかつそれを生産する、 工程をさらに含む特許請求の範囲第９項記載の感染性ウ
    シ鼻気管支炎ウイルス。
14. 【請求項１４】オリゴヌクレオチドリンカーが工程
    （４）のIBRVのDNAの欠失部位中に存在し、同時に前記
    欠失部位の各側に隣接してIBRVのDNA配列を保持する特
    許請求の範囲第９項記載の感染性ウシ鼻気管支炎ウイル
    ス。
15. 【請求項１５】前記リンカーが約７〜50ヌクレオチドの
    長さである特許請求の範囲第14項記載の感染性ウシ鼻気
    管支炎ウイルス。
16. 【請求項１６】前記ウイルスが凍結乾燥されている特許
    請求の範囲第９項記載の感染性ウシ鼻気管支炎ウイル
    ス。
17. 【請求項１７】前記クローニングベクターがpBR322、pM
    B9、pBR325、pKH47、pBR328、pHC79、ファージシヤロン
    28、pkB11、pKSV-10、pMAR420およびオリゴ（dG）テイ
    ルドpBR322から成る群より選択される特許請求の範囲第
    ９項記載の感染性ウシ鼻気管支炎ウイルス。
18. 【請求項１８】前記クローニングベクターがpBR322であ
    る特許請求の範囲第17項記載の感染性ウシ鼻気管支炎ウ
    イルス。
19. 【請求項１９】工程（１）の前記雑種プラスミドがpLAT
    K dl NdeIである特許請求の範囲第９項記載の感染性ウ
    シ鼻気管支炎ウイルス。
20. 【請求項２０】工程（４）において欠失の各側に隣接す
    るIBRVのDNA配列が、少なくとも400bpの大きさである特
    許請求の範囲第９項記載の感染性ウシ鼻気管支炎ウイル
    ス。
21. 【請求項２１】工程（４）の結果として生じる雑種プラ
    スミドがpLATK dl Ndel BgII/NG/SstIである特許請求の
    範囲第９項記載の感染性ウシ鼻気管支炎ウイルス。
22. 【請求項２２】前記tk⁺宿主細胞がRAB-9（ATCC No.CRL-
    1414）、一次ウサギ腎細胞、二次ウサギ腎細胞、ウサギ
    角膜（SIRC）細胞（ATCC No.CCL-60）、ウサギ腎（LLC-
    RK1）細胞（ATCC No.CCL-106）、胚ウシ気管（EBTR）細
    胞（ATCC No.CCL-44）、ウシ鼻介骨（BT）細胞（ATCC N
    o.CRL-1390）ウシ腎（MDBK）細胞（ATCC No.CCL-22）か
    ら成る群より選択される特許請求の範囲第９項記載の感
    染性ウシ鼻気管支炎ウイルス。
23. 【請求項２３】前記tk⁺宿主細胞がRAB-9である特許請求
    の範囲第22項記載の感染性ウシ鼻気管支炎ウイルス。
24. 【請求項２４】tk^-IBRV突然変異原誘導突然変異体がIBR
    V（P8-2）の非温度耐性ブロモビニルデオキシウリジン
    耐性IBRV突然変異体および温度耐性IBRV（B8-D53）（AT
    CC No.VR-2066）から成る群より選択される特許請求の
    範囲第９項記載の感染性ウシ鼻気管支炎ウイルス。
25. 【請求項２５】tk^-IBRV突然変異原誘導突然変異体が温
    度耐性IBRV（B8-D53）（ATCC No.VR-2066）である特許
    請求の範囲第24項記載の感染性ウシ鼻気管支炎ウイル
    ス。
26. 【請求項２６】成分： （１）感染性ウシ鼻気管支炎ウイルス（IBRV）の下記DN
    A配列に示されるチミジンキナーゼ遺伝子（tk）中のDNA
    配列が欠失した結果として、機能的チミジンキナーゼタ
    ンパク質（TK）を生産することができない感染性ウシ鼻
    気管支炎ウイルスの製薬学的に有効な量、および （２）製薬学的に許容されうる担体または希釈剤、 を含んでなることを特徴とする感染性ウシ鼻気管支炎ウ
    イルスのための変性生ウイルスワクチン。
27. 【請求項２７】前記欠失が約10〜1500bpの大きさである
    特許請求の範囲第26項記載の感染性ウシ鼻気管支炎ウイ
    ルスのための変性生ウイルスワクチン。
28. 【請求項２８】前記欠失が約75〜750bpの大きさである
    特許請求の範囲第27項記載の感染性ウシ鼻気管支炎ウイ
    ルスのための変性生ウイルスワクチン。
29. 【請求項２９】前記ウイルスが温度耐性である特許請求
    の範囲第26項記載の感染性ウシ鼻気管支炎ウイルスのた
    めの変性生ウイルスワクチン。
30. 【請求項３０】オリゴヌクレオチドリンカーがtk遺伝子
    の欠失部位中に存在する特許請求の範囲第26項記載の感
    染性ウシ鼻気管支炎ウイルスのための変性生ウイルスワ
    クチン。
31. 【請求項３１】前記リンカーが約７〜50ヌクレオチドの
    長さである特許請求の範囲第30項記載の感染性ウシ鼻気
    管支炎ウイルスのための変性生ウイルスワクチン。
32. 【請求項３２】前記ウイルスがIBRV（NG）dlTKクローン
    １（ATCC No.VR-2112）に同定特性を有する特許請求の
    範囲第26項記載の感染性ウシ鼻気管支炎ウイルスのため
    の変性生ウイルスワクチン。
33. 【請求項３３】前記製薬学的に許容されうる担体または
    希釈剤がIBRVに対する抗体を含有しない血清を約2.5〜1
    5％の濃度で含有する生理学的緩衝化媒体である特許請
    求の範囲第26項記載の感染性ウシ鼻気管支炎ウイルスの
    ための変性生ウイルスワクチン。
34. 【請求項３４】前記血清がブタ血清、ウシ胎児血清、ウ
    マ血清および子羊血清から成る群より選択される特許請
    求の範囲第33項記載の感染性ウシ鼻気管支炎ウイルスの
    ための変性生ウイルスワクチン。
35. 【請求項３５】前記製薬学的に有効な量が約10^4.5〜10⁷
    PFUである特許請求の範囲第26項記載の感染性ウシ鼻気
    管支炎ウイルスのための変性生ウイルスワクチン。
36. 【請求項３６】前記製薬学的に有効な量が約10^4.5〜10
    ^5.5PFUである特許請求の範囲第35項記載の感染性ウシ鼻
    気管支炎ウイルスのための変性生ウイルスワクチン。
37. 【請求項３７】成分： （１）前記tk遺伝子中の欠失の結果として機能的TKを生
    産することができない感染性ウシ鼻気管支炎ウイルスの
    製薬学的に有効な量、前記ウイルスであって、 （ａ）クローニングベクターとIBRVtk遺伝子の実質的に
    すべてを含有するIBRVのDNA断片とからなる雑種プラス
    ミドを構成し、 （ｂ）tk⁺宿主細胞中において、工程（ａ）の雑種プラ
    スミドをtk^-IBRV突然変異原誘導突然変異体からの感染
    性DNAで同時トランスフェクションし、 （ｃ）tk^-宿主細胞中において、工程（ｂ）において生
    産されたウイルスからのtk⁺IBRVについて選択し、 （ｄ）実質的にすべてより少ないIBRVtk遺伝子が存在す
    るように、工程（ａ）の雑種プラスミドからDNA配列を
    欠失させ、 （ｅ）tk⁺宿主細胞中において、工程（ｃ）において得
    られたtk⁺IBRVから誘導されたIBRVtk⁺DNAを、工程
    （ｄ）の結果として生ずるtk^-雑種プラスミドで同時ト
    ランスフェクションし、そして （ｆ）tk^-宿主細胞中において、tk遺伝子中の欠失の結
    果として機能的TKを生産することができないtk^-IBRV突
    然変異体を生産するように、工程（ｅ）において生産さ
    れたウイルスからtk^-IBRVについて選択する、 工程を含んでなる方法によって生産されたウイルス、お
    よび （２）製薬学的に許容されうる担体または希釈剤、 を含んでなることを特徴とする特許請求の範囲第26項記
    載の感染性ウシ鼻気管支炎ウイルスのための変性生ウイ
    ルスワクチン。
38. 【請求項３８】前記欠失が約10〜1500bpの大きさである
    特許請求の範囲第37項記載の感染性ウシ鼻気管支炎ウイ
    ルスのための変性生ウイルスワクチン。
39. 【請求項３９】前記欠失が約75〜750bpの大きさである
    特許請求の範囲第38項記載の感染性ウシ鼻気管支炎ウイ
    ルスのための変性生ウイルスワクチン。
40. 【請求項４０】工程（ｂ）におけるtk^-IBRV突然変異原
    誘導突然変異体が、工程（ｆ）において得られる突然変
    異体が温度耐性でかつtk^-欠失の突然変異体であるよう
    に温度耐性突然変異体である特許請求の範囲第37項記載
    の感染性ウシ鼻気管支炎ウイルスのための変性生ウイル
    スワクチン。
41. 【請求項４１】（ｇ）温度感受性ウイルスについて非許
    容性の温度において工程（ｆ）のtk遺伝子中の欠失の結
    果として機能的TKを生産することができない得られるIB
    RVを増殖し、こうしてtk遺伝子中の欠失の結果として機
    能的TKを生産することができない温度耐性IBRVについて
    選択しかつそれを生産する、 工程（ｇ）をさらに含む特許請求の範囲第37項記載の感
    染性ウシ鼻気管支炎ウイルスのための変性生ウイルスワ
    クチン。
42. 【請求項４２】オリゴヌクレオチドリンカーが工程
    （ｄ）のIBRVのDNAの欠失部位中に存在し、同時に前記
    欠失部位の各側に隣接してIBRVのDNA配列を保持する特
    許請求の範囲第37項記載の感染性ウシ鼻気管支炎ウイル
    スのための変性生ウイルスワクチン。
43. 【請求項４３】前記リンカーが約７〜40ヌクレオチドの
    長さである特許請求の範囲第37項記載の感染性ウシ鼻気
    管支炎ウイルスのための変性生ウイルスワクチン。
44. 【請求項４４】前記クローニングベクターがpBR322、pM
    B9、pBR325、pKH47、pBR328、pHC79、ファージシヤロン
    28、pkB11、pKSV-10、pMAR420およびオリゴ（dG）テイ
    ルドpBR322から成る群より選択される特許請求の範囲第
    37項記載の感染性ウシ鼻気管支炎ウイルスのための変性
    生ウイルスワクチン。
45. 【請求項４５】前記クローニングベクターがpBR322であ
    る特許請求の範囲第44項記載の感染性ウシ鼻気管支炎ウ
    イルスのための変性生ウイルスワクチン。
46. 【請求項４６】工程（ａ）の前記雑種プラスミドがpLAT
    K dl NdeIである特許請求の範囲第37項記載の感染性ウ
    シ鼻気管支炎ウイルスのための変性生ウイルスワクチ
    ン。
47. 【請求項４７】工程（ｄ）において欠失の各側に隣接す
    るIBRVのDNA配列が少なくとも400bpの大きさである特許
    請求の範囲第37項記載の感染性ウシ鼻気管支炎ウイルス
    のための変性生ウイルスワクチン。
48. 【請求項４８】工程（ｄ）において得られる雑種プラス
    ミドがpLATK dl NdeI dl BgII/NG/SstIである特許請求
    の範囲第37項記載の感染性ウシ鼻気管支炎ウイルスのた
    めの変性生ウイルスワクチン。
49. 【請求項４９】前記tk⁺宿主細胞がRAB-9（ATCC No.CRL-
    1414）、一次ウサギ腎細胞、二次ウサギ腎細胞、ウサギ
    角膜（SIRC）細胞（ATCC No.CCL-60）、ウサギ腎（LLC-
    RK1）細胞（ATCC No.CCL-106）、胚ウシ気管（EBTR）細
    胞（ATCC No.CCL-44）、ウシ鼻介骨（BT）細胞（ATCC N
    o.CRL-1390）ウシ腎（MDBK）細胞（ATCC No.CCL-22）か
    ら成る群より選択される特許請求の範囲第37項記載の感
    染性ウシ鼻気管支炎ウイルスのための変性生ウイルスワ
    クチン。
50. 【請求項５０】前記tk⁺宿主細胞がRAB-9である特許請求
    の範囲第49項記載の感染性ウシ鼻気管支炎ウイルスのた
    めの変性生ウイルスワクチン。
51. 【請求項５１】tk-IBRV突然変異原誘導突然変異体がIBR
    V（P8-2）の非温度耐性ブロモビニルデオキシウリジン
    耐性IBRV突然変異体および温度耐性IBRV（B8-D53）（AT
    CC No.VR-2066）から成る群より選択される特許請求の
    範囲第37項記載の感染性ウシ鼻気管支炎ウイルスのため
    の変性生ウイルスワクチン。
52. 【請求項５２】tk^-IBRV突然変異原誘導突然変異体が温
    度耐性IBRV（B8-D53）（ATCC No.VR-2066）である特許
    請求の範囲第51項記載の感染性ウシ鼻気管支炎ウイルス
    のための変性性ウイルスワクチン。
53. 【請求項５３】前記製薬学的に許容されうる担体または
    希釈剤がIBRVに対する抗体を含有しない血清を約2.5〜1
    5％の濃度で含有する生理学的緩衝化媒体である特許請
    求の範囲第37項記載の感染性ウシ鼻気管支炎ウイルスの
    ための変性生ウイルスワクチン。
54. 【請求項５４】前記血清がブタ血清、ウシ胎児血清、ウ
    マ血清および子羊血清から成る群より選択され特許請求
    の範囲第53項記載の感染性ウシ鼻気管支炎ウイルスのた
    めの変性生ウイルスワクチン。
55. 【請求項５５】前記製薬学的に有効な量が約10^4.5〜10⁷
    PFUである特許請求の範囲第37項記載の感染性ウシ鼻気
    管支炎ウイルスのための変性生ウイルスワクチン。
56. 【請求項５６】前記製薬学的に有効な量が約10^4.5〜10
    ^5.5PFUである特許請求の範囲第55項記載の感染性ウシ鼻
    気管支炎ウイルスのための変性生ウイルスワクチン。
57. 【請求項５７】感染性ウシ鼻気管支炎に対してヒト以外
    の哺乳動物を免疫化する方法であって、感染性ウシ鼻気
    管支炎ウイルス（IBRV）の下記DNA配列に示されるチミ
    ジンキナーゼ遺伝子（tk）中のDNA配列が欠失した結果
    として、機能的チミジンキナーゼタンパク質（TK）を生
    産することができない感染性ウシ鼻気管支炎ウイルスを
    前記動物に投与することを含んでなり、前記ウイルスが （１）クローニングベクターとIBRVtk遺伝子の実質的に
    すべてを含有するIBRVのDNA断片とからなる雑種プラス
    ミドを構成し、 （２）tk⁺宿主細胞中において、工程（１）の雑種プラ
    スミドをtk^-IBRV突然変異原誘導突然変異体からの感染
    性DNAで同時トランスフェクションし、 （３）tk−宿主細胞中において、工程（２）において生
    産されたウイルスからのtk⁺IBRVについて選択し、 （４）実質的にすべてより少ないIBRVtk遺伝子が存在す
    るように、工程（１）の雑種プラスミドからDNA配列を
    欠失させ、 （５）tk⁺宿主細胞中において、工程（３）において得
    られたtk⁺IBRVから誘導されたIBRVtk⁺DNAを、工程
    （４）の結果として生ずるtk^-雑種プラスミドで同時ト
    ランスフェクションし、そして （６）tk^-宿主細胞中において、tk遺伝子中の欠失の結
    果として機能的TKを生産することができないtk^-IBRV突
    然変異体を生産するように、工程（５）において生産さ
    れたウイルスからtk^-IBRVについて選択する、 工程を含んでなる方法によって生産されたウイルスであ
    ることを特徴とする感染性ウシ鼻気管支炎に対してヒト
    以外の哺乳動物を免疫化する方法。
58. 【請求項５８】前記欠失が約10〜1500bpの大きさである
    特許請求の範囲第57項記載の感染性ウシ鼻気管支炎に対
    してヒト以外の哺乳動物を免疫化する方法。
59. 【請求項５９】前記欠失が約75〜750bpの大きさである
    特許請求の範囲第58項記載の感染性ウシ鼻気管支炎に対
    してヒト以外の哺乳動物を免疫化する方法。
60. 【請求項６０】工程（２）におけるtk^-IBRV突然変異原
    誘導突然変異体が工程（６）において得られる突然変異
    体が温度耐性でかつtk^-欠失の突然変異体であるような
    温度耐性突然変異体である特許請求の範囲第57項記載の
    感染性ウシ鼻気管支炎に対してヒト以外の哺乳動物を免
    疫化する方法。
61. 【請求項６１】（７）温度感受性ウイルスについて非許
    容性の温度において、工程（６）のtk遺伝子中の欠失の
    結果として機能的TKを生産することができない得られる
    IBRVを増殖し、こうしてtk遺伝子中の欠失の結果として
    機能的TKを生産することができない温度耐性IBRVについ
    て選択しかつそれを生産する工程（７）、 をさらに含む特許請求の範囲第57項記載の感染性ウシ鼻
    気管支炎に対してヒト以外の哺乳動物を免疫化する方
    法。
62. 【請求項６２】オリゴヌクレオチドリンカーが工程
    （４）のIBRVのDNAの欠失部位中に存在し、同時に前記
    欠失部位の各側に隣接してIBRVのDNA配列を保持する特
    許請求の範囲第57項記載の感染性ウシ鼻気管支炎に対し
    てヒト以外の哺乳動物を免疫化する方法。
63. 【請求項６３】前記リンカーが約７〜40bpの長さである
    特許請求の範囲第62項記載の感染性ウシ鼻気管支炎に対
    してヒト以外の哺乳動物を免疫化する方法。
64. 【請求項６４】前記クローニングベクターがpBR322、pM
    B9、pBR325、pKH47、pBR328、pHC79、ファージシヤロン
    28、pkB11、pKSV-10、pMAR420およびオリゴ（dG）テイ
    ルドpBR322から成る群より選択される特許請求の範囲第
    57項記載の感染性ウシ鼻気管支炎に対してヒト以外の哺
    乳動物を免疫化する方法。
65. 【請求項６５】前記クローニングベクターがpBR322であ
    る特許請求の範囲第64項記載の感染性ウシ鼻気管支炎に
    対してヒト以外の哺乳動物を免疫化する方法。
66. 【請求項６６】工程（１）の前記雑種プラスミドがpLAT
    K dl NdeIである特許請求の範囲第57項記載の感染性ウ
    シ鼻気管支炎に対してヒト以外の哺乳動物を免疫化する
    方法。
67. 【請求項６７】工程（４）において欠失の各側に隣接す
    るIBRVのDNA配列が少なくとも400bpの大きさである特許
    請求の範囲第57項記載の感染性ウシ鼻気管支炎に対して
    ヒト以外の哺乳動物を免疫化する方法。
68. 【請求項６８】工程（４）の得られる雑種プラスミドが
    pLATK dl NdeI dl BgII/NG/SstIである特許請求の範囲
    第57項記載の感染性ウシ鼻気管支炎に対してヒト以外の
    哺乳動物を免疫化する方法。
69. 【請求項６９】前記tk⁺宿主細胞がRAB-9（ATCC No.CRL-
    1414）、一次ウサギ腎細胞、二次ウサギ腎細胞、ウサギ
    角膜（SIRC）細胞（ATCC No.CCL-60）、ウサギ腎（LLC-
    RK1）細胞（ATCC No.CCL-106）、胚ウシ気管（EBTR）細
    胞（ATCC No.CCL-44）、ウシ鼻介骨（BT）細胞（ATCC N
    o.CRL-1390）ウシ腎（MDBK）細胞（ATCC No.CCL-22）か
    ら成る群より選択される特許請求の範囲第57項記載の感
    染性ウシ鼻気管支炎に対してヒト以外の哺乳動物を免疫
    化する方法。
70. 【請求項７０】前記tk⁺宿主細胞がRAB-9である特許請求
    の範囲第69項記載の感染性ウシ鼻気管支炎に対してヒト
    以外の哺乳動物を免疫化する方法。
71. 【請求項７１】tk^-IBRV突然変異原誘導突然変異体がIBR
    V（P8-2）の非温度耐性ブロモビニルデオキシウリジン
    耐性IBRV突然変異体および温度耐性IBRV（B8-D53）（AT
    CC No.VR-2066）から成る群より選択される特許請求の
    範囲第57項記載の感染性ウシ鼻気管支炎に対してヒト以
    外の哺乳動物を免疫化する方法。
72. 【請求項７２】tk^-IBRV突然変異原誘導突然変異体が温
    度耐性IBRV（B8-D53）（ATCC No.VR-2066）である特許
    請求の範囲第71項記載の感染性ウシ鼻気管支炎に対して
    ヒト以外の哺乳動物を免疫化する方法。
73. 【請求項７３】前記製薬学的に有効な量が約10^4.5〜10⁷
    PFUである特許請求の範囲第57項記載の感染性ウシ鼻気
    管支炎に対してヒト以外の哺乳動物を免疫化する方法。
74. 【請求項７４】前記製薬学的に有効な量が約10^4.5〜10
    ^5.5PFUである特許請求の範囲第73項記載の感染性ウシ鼻
    気管支炎に対してヒト以外の哺乳動物を免疫化する方
    法。
75. 【請求項７５】前記投与が鼻内、筋肉内または皮下に実
    施する特許請求の範囲第57項記載の感染性ウシ鼻気管支
    炎に対してヒト以外の哺乳動物を免疫化する方法。
76. 【請求項７６】前記動物がウシ、ブタ、ヤギおよびシカ
    から成る群より選択される特許請求の範囲第57項記載の
    感染性ウシ鼻気管支炎に対してヒト以外の哺乳動物を免
    疫化する方法。
77. 【請求項７７】前記動物がウシである特許請求の範囲第
    76項記載の感染性ウシ鼻気管支炎に対してヒト以外の哺
    乳動物を免疫化する方法。
78. 【請求項７８】前記ウイルスがIBRV（NG） dl TKクロー
    ン１（ATCC No.VR-2112）の同定特性を有する特許請求
    の範囲第57項記載の感染性ウシ鼻気管支炎に対してヒト
    以外の哺乳動物を免疫化する方法。