JPH0795881A - キモシンの生産方法 - Google Patents
キモシンの生産方法Info
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- JPH0795881A JPH0795881A JP6095496A JP9549694A JPH0795881A JP H0795881 A JPH0795881 A JP H0795881A JP 6095496 A JP6095496 A JP 6095496A JP 9549694 A JP9549694 A JP 9549694A JP H0795881 A JPH0795881 A JP H0795881A
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- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6478—Aspartic endopeptidases (3.4.23)
- C12N9/6481—Pepsins (3.4.23.1; 3.4.23.2; 3.4.23.3)
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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- C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
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Abstract
(57)【要約】
【目的】従来子牛の第4胃から採取していたキモシン
を、遺伝子操作の技術を利用して、工業的においても大
量に生産させることができるキモシンの生産方法を提供
すること。 【構成】メチオニン−プロキモシンの暗号となる遺伝子
をベクターシステムへ導入する。前記ベクターシステム
の遺伝子を形質転換される。該形質転換された宿主有機
体より生成されたメチオニン−プロキモシンを開裂させ
る操作より成るキモシンの生産方法。
を、遺伝子操作の技術を利用して、工業的においても大
量に生産させることができるキモシンの生産方法を提供
すること。 【構成】メチオニン−プロキモシンの暗号となる遺伝子
をベクターシステムへ導入する。前記ベクターシステム
の遺伝子を形質転換される。該形質転換された宿主有機
体より生成されたメチオニン−プロキモシンを開裂させ
る操作より成るキモシンの生産方法。
Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、組換DNAのバイオテ
クノロジーの分野に関するものである。より詳しく言う
と、本発明は、牛乳を凝固させる酵素であるキモシン
を、メチオニン−プロキモシンの開裂により容易に得る
ことができるキモシンの生産方法に関する。
クノロジーの分野に関するものである。より詳しく言う
と、本発明は、牛乳を凝固させる酵素であるキモシン
を、メチオニン−プロキモシンの開裂により容易に得る
ことができるキモシンの生産方法に関する。
【0002】
【従来技術】牛乳は、基本的にはカゼインタンパク質の
コロイド状懸濁液から成っている。子牛の第4胃(皺
胃)にある胃液の抽出物は、このコロイドを不安定化さ
せる効果を持っていることがかなり以前から知られてい
る。カゼイン分子の凝集の結果は、カードということで
通常知られている現象が生じる。このカードは、チーズ
製造の第1段階である。
コロイド状懸濁液から成っている。子牛の第4胃(皺
胃)にある胃液の抽出物は、このコロイドを不安定化さ
せる効果を持っていることがかなり以前から知られてい
る。カゼイン分子の凝集の結果は、カードということで
通常知られている現象が生じる。このカードは、チーズ
製造の第1段階である。
【0003】子牛が生れてからの最初の2,3週間で乳
離れするまでの間、子牛は母親の牛乳を飲み続ける。こ
の牛乳の消化は、子牛の第4胃にある(レンニン又はレ
ンネットと総称されている)酸性プロティナーゼの存在
によって助けられている。レンニンは、タンパク質鎖の
開裂をひき起すことになるタンパク質分解作用を牛乳中
のカッパカゼインに対して持っている。生じたタンパク
質(パラカッパカゼイン)は、コロイド溶液中で安定化
することができず、カードが起きる。
離れするまでの間、子牛は母親の牛乳を飲み続ける。こ
の牛乳の消化は、子牛の第4胃にある(レンニン又はレ
ンネットと総称されている)酸性プロティナーゼの存在
によって助けられている。レンニンは、タンパク質鎖の
開裂をひき起すことになるタンパク質分解作用を牛乳中
のカッパカゼインに対して持っている。生じたタンパク
質(パラカッパカゼイン)は、コロイド溶液中で安定化
することができず、カードが起きる。
【0004】長年に亘り、チーズ製造業にとってレンニ
ンの唯一の供給源は子牛の胃であった。ところが近年、
自然的に得られる供給を上回るようなレンニンに対する
需要が生じてきたチーズ製造業の成長があった。生まれ
てから12週間以内に屠殺するために子牛を繁殖させる
ことは、経済的にみれば自然的なレンニンの大量生産に
は向いていない。とは言っても、代替策を見つけること
は容易なことではなかった。
ンの唯一の供給源は子牛の胃であった。ところが近年、
自然的に得られる供給を上回るようなレンニンに対する
需要が生じてきたチーズ製造業の成長があった。生まれ
てから12週間以内に屠殺するために子牛を繁殖させる
ことは、経済的にみれば自然的なレンニンの大量生産に
は向いていない。とは言っても、代替策を見つけること
は容易なことではなかった。
【0005】自然的なレンニンの代替物を見つけようと
するには、酸性プロティナーゼ又は非常に低いタンパク
質分解活性をもった酸性プロティナーゼの混合物が要求
される。このような条件は、カードの充分な生産量を得
るため、そしてチーズを充分熟成させるために満たされ
なければならない。より強い活性をもったタンパク質分
解酵素は、チーズの製造と熟成の間にカゼインタンパク
質がばらばらになってしまうほど***させてしまうので
ある。このようなことは好ましいことではない。特に不
都合なことは、カゼインタンパク質のより小さな分解成
分が消費者の心にしばしば不快なにおいを連想させる苦
味を最終製品に与えることである。
するには、酸性プロティナーゼ又は非常に低いタンパク
質分解活性をもった酸性プロティナーゼの混合物が要求
される。このような条件は、カードの充分な生産量を得
るため、そしてチーズを充分熟成させるために満たされ
なければならない。より強い活性をもったタンパク質分
解酵素は、チーズの製造と熟成の間にカゼインタンパク
質がばらばらになってしまうほど***させてしまうので
ある。このようなことは好ましいことではない。特に不
都合なことは、カゼインタンパク質のより小さな分解成
分が消費者の心にしばしば不快なにおいを連想させる苦
味を最終製品に与えることである。
【0006】代替物として二つのカード化剤がチーズ製
造業において受けいれられている。その一つは、動物の
酵素に由来するものであり、ウシ属のペプシンと子牛の
レンニンとの混合物から成っている。(ウシ属のペプシ
ンは、成熟した牛の胃にある酵素であり、離乳していな
い子牛のレンニンに代わるタンパク質分解酵素であ
る。)このような構成の自然的に出来るタンパク質分解
酵素は、純粋な子牛レンニンに対する代替物として広く
受け入れられている。
造業において受けいれられている。その一つは、動物の
酵素に由来するものであり、ウシ属のペプシンと子牛の
レンニンとの混合物から成っている。(ウシ属のペプシ
ンは、成熟した牛の胃にある酵素であり、離乳していな
い子牛のレンニンに代わるタンパク質分解酵素であ
る。)このような構成の自然的に出来るタンパク質分解
酵素は、純粋な子牛レンニンに対する代替物として広く
受け入れられている。
【0007】次に、そして恐らくより重要なことには、
菌類からのタンパク質分解酵素が幅広く開発されている
ことである。これらの微生物起源の酵素は、何年か前日
本で開発されたものである。微生物起源の練乳剤の三つ
の主要な供給源は、次のような菌株である。即ち、ムコ
ール・プシラス(mucor pusillous)、ムコール・ミー
ハイ(mucor miehei)それにエンドシア・パラシチカ
(endothia parasitica)である。
菌類からのタンパク質分解酵素が幅広く開発されている
ことである。これらの微生物起源の酵素は、何年か前日
本で開発されたものである。微生物起源の練乳剤の三つ
の主要な供給源は、次のような菌株である。即ち、ムコ
ール・プシラス(mucor pusillous)、ムコール・ミー
ハイ(mucor miehei)それにエンドシア・パラシチカ
(endothia parasitica)である。
【0008】このような菌株から生産されたカード化剤
の欠点は、一般にかなりのタンパク質分解作用を持って
いるということである。上述したように、このことはカ
ードの生産量を減少させ、従ってチーズの生産量も減少
させることになる。また、苦味も生じることがある。こ
のようなことは、長い熟成期間が必要なチーズにおいて
は特に顕著なことである。この理由により、微生物起源
のカード化剤は、短期間の熟成が要求されるチーズにだ
け実際適用できるものである。
の欠点は、一般にかなりのタンパク質分解作用を持って
いるということである。上述したように、このことはカ
ードの生産量を減少させ、従ってチーズの生産量も減少
させることになる。また、苦味も生じることがある。こ
のようなことは、長い熟成期間が必要なチーズにおいて
は特に顕著なことである。この理由により、微生物起源
のカード化剤は、短期間の熟成が要求されるチーズにだ
け実際適用できるものである。
【0009】レンニン中にある主要なタンパク質分解酵
素は、キモシンである。このタンパク質は、子牛の第4
胃(皺胃)から分泌されるプロキモシンと呼ばれる不活
性の前駆体から生産されるものである。キモシンは、近
年の重要な研究課題であった。この研究結果の一つとし
て、酵素前駆体であるプロキモシンの完全なアミノ酸配
列が決定されたことである。(フォルトマンほかProc.
Nat. Acad. Scil. USA77 2321−2334(19
77)とJ. Biol. Chem. 254 8447−8456
(1979)参照。)これらの第1の論文はプロキモシ
ンの完全な365個のアミノ酸配列を発表している。第
2の論文においては、キモシンの主鎖である323個の
アミノ酸残基からなる1本のペプチド鎖の配列が述べら
れている。プロキモシン鎖のアミノ末端から42個のア
ミノ酸を取り除くと酵素の活性化が起きるわけである。
我々は、子牛の胃のプロキモシン遺伝子の主要な翻訳産
物は、プロキモシン部分に対して16個のアミノ酸N末
端を持った前駆体であるプレプロキモシンであることを
発見した。本発明は、組換DNA即ち遺伝子操作の技術
を利用して細菌から子牛の胃のキモシン、プロキモシ
ン、プレプロキモシンを生産するための方法を含むもの
である。プロキモシンは、その後自触媒的、pH依存的
反応によって***し得る。
素は、キモシンである。このタンパク質は、子牛の第4
胃(皺胃)から分泌されるプロキモシンと呼ばれる不活
性の前駆体から生産されるものである。キモシンは、近
年の重要な研究課題であった。この研究結果の一つとし
て、酵素前駆体であるプロキモシンの完全なアミノ酸配
列が決定されたことである。(フォルトマンほかProc.
Nat. Acad. Scil. USA77 2321−2334(19
77)とJ. Biol. Chem. 254 8447−8456
(1979)参照。)これらの第1の論文はプロキモシ
ンの完全な365個のアミノ酸配列を発表している。第
2の論文においては、キモシンの主鎖である323個の
アミノ酸残基からなる1本のペプチド鎖の配列が述べら
れている。プロキモシン鎖のアミノ末端から42個のア
ミノ酸を取り除くと酵素の活性化が起きるわけである。
我々は、子牛の胃のプロキモシン遺伝子の主要な翻訳産
物は、プロキモシン部分に対して16個のアミノ酸N末
端を持った前駆体であるプレプロキモシンであることを
発見した。本発明は、組換DNA即ち遺伝子操作の技術
を利用して細菌から子牛の胃のキモシン、プロキモシ
ン、プレプロキモシンを生産するための方法を含むもの
である。プロキモシンは、その後自触媒的、pH依存的
反応によって***し得る。
【0010】
【課題を解決するための手段】本発明の目的に従って、
我々はメチオニン−プロキモシンの暗号となる遺伝子を
持つベクターシステムでもつて形質転換された宿主有機
体により発現されたメチオニン−プロキモシンを開裂さ
せる手段から成るキモシンの生産方法を提供するもので
ある。1態様において、我々は次のような手段からなる
キモシンの生産方法を提供する。 a)メチオニン−プロキモシンの暗号となる遺伝子のベ
クターシステムへの挿入。 b)ベクターシステムを有する遺伝子による宿主有機体
の形質転換。 c)キモシンを生成させるために、宿主有機体によって
発現されたメチオニン−プロキモシンの開裂。
我々はメチオニン−プロキモシンの暗号となる遺伝子を
持つベクターシステムでもつて形質転換された宿主有機
体により発現されたメチオニン−プロキモシンを開裂さ
せる手段から成るキモシンの生産方法を提供するもので
ある。1態様において、我々は次のような手段からなる
キモシンの生産方法を提供する。 a)メチオニン−プロキモシンの暗号となる遺伝子のベ
クターシステムへの挿入。 b)ベクターシステムを有する遺伝子による宿主有機体
の形質転換。 c)キモシンを生成させるために、宿主有機体によって
発現されたメチオニン−プロキモシンの開裂。
【0011】本発明の他の態様で、我々はポリペプチド
であるメチオニン−プロキモシンを提供する。好ましく
は、これらは、上述した本発明の実施例の方法によって
生産されることである。(我々は、またそれらの方法に
よって生産されたキモシンも提供する。) 本発明の他の態様で我々は、メチオニン−プロキモシン
の暗号となる遺伝子を提供する。本発明の他の態様にお
いては、我々は、メチオニン−プロキモシンの暗号とな
る遺伝子を含むシステムを提供する。ベクターシステム
は、調節可能な発現プロモータ配列を含むことができ
る。一つの好適な態様では、ベクターシステムは細菌の
宿主有機体を形質転換することができ、また形質転換さ
れていない宿主有機体とは異なる形質転換された宿主有
機体に表現型を付与することができる1つ以上のアミノ
酸配列を含むことができる。好ましくは、このベクター
システムは、大腸菌トリプトファンオペロンプロモータ
を含むことである。第2のより望ましい態様では、この
ベクターシステムは、真核宿主有機体を形質転換するこ
とができ、また形質転換していない宿主有機体とは異な
る形質転換した宿主有機体に表現型を付与することがで
きる1以上のアミノ酸配列を含むことができる。好まし
くは、宿主有機体が酵母であることである。より好まし
くは、ベクターシステムが細菌のプラスミドpBR32
2と酵母の2uプラスミドから由来するものである。ま
た、より好ましくは、ベクターシステムが酵母のフォス
フォグリセリン酸キナーゼ(PGK)遺伝子プロモータ
配列を含んでいるものである。
であるメチオニン−プロキモシンを提供する。好ましく
は、これらは、上述した本発明の実施例の方法によって
生産されることである。(我々は、またそれらの方法に
よって生産されたキモシンも提供する。) 本発明の他の態様で我々は、メチオニン−プロキモシン
の暗号となる遺伝子を提供する。本発明の他の態様にお
いては、我々は、メチオニン−プロキモシンの暗号とな
る遺伝子を含むシステムを提供する。ベクターシステム
は、調節可能な発現プロモータ配列を含むことができ
る。一つの好適な態様では、ベクターシステムは細菌の
宿主有機体を形質転換することができ、また形質転換さ
れていない宿主有機体とは異なる形質転換された宿主有
機体に表現型を付与することができる1つ以上のアミノ
酸配列を含むことができる。好ましくは、このベクター
システムは、大腸菌トリプトファンオペロンプロモータ
を含むことである。第2のより望ましい態様では、この
ベクターシステムは、真核宿主有機体を形質転換するこ
とができ、また形質転換していない宿主有機体とは異な
る形質転換した宿主有機体に表現型を付与することがで
きる1以上のアミノ酸配列を含むことができる。好まし
くは、宿主有機体が酵母であることである。より好まし
くは、ベクターシステムが細菌のプラスミドpBR32
2と酵母の2uプラスミドから由来するものである。ま
た、より好ましくは、ベクターシステムが酵母のフォス
フォグリセリン酸キナーゼ(PGK)遺伝子プロモータ
配列を含んでいるものである。
【0012】本発明の他の態様で、我々は上述したベク
ターシステムによって形質転換された宿主有機体を提供
する。好ましくは宿主有機体が細菌であるということで
あり、適当なものは例えばHB101又はRV308の
ような菌株の大腸菌である。代わりのものとしては、宿
主有機体を酵母、適当なものはサッカロミセス・セレビ
シエ(saccharomyces cerevisiae)とすることもでき
る。本発明の他の態様において、我々は次のヌクレオチ
ド配列を含むオリゴヌクレオチドを提供する。 5’ GTT.CAT.CAT.GTT 3’ ここで、Gはグアニン、Tはチミン、Aはアデニンそし
てCはシトシンである。 このオリゴヌクレオチドは交
雑試験用として、キモシンのアミノ酸配列を含むポリペ
プチドの略号となるヌクレオチド配列を含むmRNAの
検出のための操作において使用されることが好ましい。
他の用途では、このオリゴヌクレオチドは転写プライマ
として、キモシンのアミノ酸配列を含むポリペプチドの
暗号となる一本鎖のcDNAの一部分を調製するための
操作において使用されることが好ましい。
ターシステムによって形質転換された宿主有機体を提供
する。好ましくは宿主有機体が細菌であるということで
あり、適当なものは例えばHB101又はRV308の
ような菌株の大腸菌である。代わりのものとしては、宿
主有機体を酵母、適当なものはサッカロミセス・セレビ
シエ(saccharomyces cerevisiae)とすることもでき
る。本発明の他の態様において、我々は次のヌクレオチ
ド配列を含むオリゴヌクレオチドを提供する。 5’ GTT.CAT.CAT.GTT 3’ ここで、Gはグアニン、Tはチミン、Aはアデニンそし
てCはシトシンである。 このオリゴヌクレオチドは交
雑試験用として、キモシンのアミノ酸配列を含むポリペ
プチドの略号となるヌクレオチド配列を含むmRNAの
検出のための操作において使用されることが好ましい。
他の用途では、このオリゴヌクレオチドは転写プライマ
として、キモシンのアミノ酸配列を含むポリペプチドの
暗号となる一本鎖のcDNAの一部分を調製するための
操作において使用されることが好ましい。
【0013】本発明の最後の態様では、我々はミクロ滴
定用プレートのウエールに試料の1つ又は2つ以上の希
釈物が牛乳と一緒に培養される、キモシン活性のための
定量法を提供する。この定量法は次の手段からなること
が好ましい。 a)試料の段階的な希釈物の調製。 b)各希釈物への牛乳の標準試料の添加。 c)所定時間の培養。 d)牛乳試料が凝固するかどうかの観察。 この牛乳は、液状に戻した乾燥スキムミルクであること
が好ましい。
定用プレートのウエールに試料の1つ又は2つ以上の希
釈物が牛乳と一緒に培養される、キモシン活性のための
定量法を提供する。この定量法は次の手段からなること
が好ましい。 a)試料の段階的な希釈物の調製。 b)各希釈物への牛乳の標準試料の添加。 c)所定時間の培養。 d)牛乳試料が凝固するかどうかの観察。 この牛乳は、液状に戻した乾燥スキムミルクであること
が好ましい。
【0014】
【実施例】本発明を充分に説明するため、先ず概括的製
法を説明し、次に一般的調製法の詳細を述べる。本発明
に要求されているような微生物の生産における第1段階
は、所要のタンパク質の暗号となる遺伝子の単離であ
る。プロキモシンの場合、タンパク質の大きさや遺伝暗
号中の余分なものは、このような遺伝子の化学的合成を
面白くないものにしている。クローン化できる遺伝子に
対する一つの研究手段は、子牛の胃の粘膜からプロキモ
シンmRNAを調製することである(内山ほかAgric. B
iol.Chem. 44 1373−1381(1980)参
照)。
法を説明し、次に一般的調製法の詳細を述べる。本発明
に要求されているような微生物の生産における第1段階
は、所要のタンパク質の暗号となる遺伝子の単離であ
る。プロキモシンの場合、タンパク質の大きさや遺伝暗
号中の余分なものは、このような遺伝子の化学的合成を
面白くないものにしている。クローン化できる遺伝子に
対する一つの研究手段は、子牛の胃の粘膜からプロキモ
シンmRNAを調製することである(内山ほかAgric. B
iol.Chem. 44 1373−1381(1980)参
照)。
【0015】mRNAの単離は、幾つかある方法のうち
の一つを用いて行うことができ、例えば全RNA(Enzy
mology Vol XII Academie Press(1968)における
カービイの方法)又はポリソームRNAの抽出(パルミ
ターJ. Biol. Chem. 2482095−2106(19
73))により行うことができる。ポリキモシンmRN
Aの濃度は、例えばオリゴ(dT)セルロースカラムク
ロマトグラフィ又は蔗糖密度勾配遠心法による生成の進
んだ段階で濃くすることができる。プロキモシンmRN
Aのかなり純粋な試料が作られれば、このmRNA調製
物は、その後AMV逆転写酵素でもって転写されること
ができる(エムターゲほかNucl. AcidRes. 6 122
1−1240(1979)参照)。これによって一本鎖
のポリキモシンcDNAができる。この複写物は単離す
ることができ、AMV逆転写酵素又はDNAポリメラー
ゼIによって再び転写することもできる(エストラチア
ジスほかCell. 7 279−288(1976)参
照)。両操作によって、一端にヘアピンループによって
つながった2本鎖の遺伝子をもった二本鎖の全長遺伝子
ができる。このループは、S1エンドヌクレアーゼで切
断することができる(ボクトEur. J. Biochem. 33
192−200(1973)参照)。S1ヌクレアーゼ
の使用は、合成遺伝子の端部から幾つかのヌクレオチド
配列を失うことになるので、代わりの方法が使用され
る。この方法では、末端トランスフェラーゼという酵素
を使用してオリゴデオキシシトジンの短い部位がcDN
Aの最初の鎖の3’部位にくっつけられる(ランドほか
Nucl. Acid Res. 9 2251(1981)参照)。こ
の際オリゴデオキシグアノシンの短いプライマが第2鎖
のcDNA合成を進行させるために使用される。この操
作において、完全なヌクレオチド配列がクローニングの
ために使用できる。cDNAの合成過程の模式図を図1
に示す。(この図において破線はmRNAを表し、実線
はcDNAを表す)。
の一つを用いて行うことができ、例えば全RNA(Enzy
mology Vol XII Academie Press(1968)における
カービイの方法)又はポリソームRNAの抽出(パルミ
ターJ. Biol. Chem. 2482095−2106(19
73))により行うことができる。ポリキモシンmRN
Aの濃度は、例えばオリゴ(dT)セルロースカラムク
ロマトグラフィ又は蔗糖密度勾配遠心法による生成の進
んだ段階で濃くすることができる。プロキモシンmRN
Aのかなり純粋な試料が作られれば、このmRNA調製
物は、その後AMV逆転写酵素でもって転写されること
ができる(エムターゲほかNucl. AcidRes. 6 122
1−1240(1979)参照)。これによって一本鎖
のポリキモシンcDNAができる。この複写物は単離す
ることができ、AMV逆転写酵素又はDNAポリメラー
ゼIによって再び転写することもできる(エストラチア
ジスほかCell. 7 279−288(1976)参
照)。両操作によって、一端にヘアピンループによって
つながった2本鎖の遺伝子をもった二本鎖の全長遺伝子
ができる。このループは、S1エンドヌクレアーゼで切
断することができる(ボクトEur. J. Biochem. 33
192−200(1973)参照)。S1ヌクレアーゼ
の使用は、合成遺伝子の端部から幾つかのヌクレオチド
配列を失うことになるので、代わりの方法が使用され
る。この方法では、末端トランスフェラーゼという酵素
を使用してオリゴデオキシシトジンの短い部位がcDN
Aの最初の鎖の3’部位にくっつけられる(ランドほか
Nucl. Acid Res. 9 2251(1981)参照)。こ
の際オリゴデオキシグアノシンの短いプライマが第2鎖
のcDNA合成を進行させるために使用される。この操
作において、完全なヌクレオチド配列がクローニングの
ために使用できる。cDNAの合成過程の模式図を図1
に示す。(この図において破線はmRNAを表し、実線
はcDNAを表す)。
【0016】得られた全長プロキモシン遺伝子は、例え
ば合成結合剤をプロキモシン遺伝子に結合させることに
よって、適当なプラスミドベクターへの挿入のため調製
される(ポーターほかNature 282 471−477
(1979)参照)。この結合は、例えばT4 DNA
リガーゼを使用して行うことができる。その後この結合
剤は、プロキモシンDNAに互い違いになった結合部位
を作るため適当な制限酵素を用いて切断される。これら
の結合部位はプラスミドベクターへの結合に利用され
る。あるいはプロキモシンDNAは、その端部に結合し
たオリゴデオキシシトジンの短い部位を持つことがで
き、これらはプラスミドベクターの端部に結合したオリ
ゴデオキシグアノシンの相補的部位に対して交雑される
(マクジリブレイほか(1980)Proc .Nat. Acad. S
ci. USA 77 5153−5157)。適当なベクター
が選ばれれば、適当な制限酵素を使用して交差した切れ
目がリング構造に入れられ、そしてプロキモシンDNA
部分がリング中に結合する。最初に使用したベクター
は、単離した遺伝子を発現させる能力を持つことができ
ないものである。発現のため選んだベクターは、挿入さ
れた遺伝子を発現させる強いプロモータを含んでいなけ
ればならず、また、抗体等に対する抵抗性の暗号となる
通常の同一遺伝子も含まなければならない。このように
して作られた組換えプラスミドは、適当な宿主有機体
(例えば大腸菌)を形質転換させるために使われる(コ
ーエンほか(1972)Proc. Nat. Acad. Sci. 69
2110−2114)。
ば合成結合剤をプロキモシン遺伝子に結合させることに
よって、適当なプラスミドベクターへの挿入のため調製
される(ポーターほかNature 282 471−477
(1979)参照)。この結合は、例えばT4 DNA
リガーゼを使用して行うことができる。その後この結合
剤は、プロキモシンDNAに互い違いになった結合部位
を作るため適当な制限酵素を用いて切断される。これら
の結合部位はプラスミドベクターへの結合に利用され
る。あるいはプロキモシンDNAは、その端部に結合し
たオリゴデオキシシトジンの短い部位を持つことがで
き、これらはプラスミドベクターの端部に結合したオリ
ゴデオキシグアノシンの相補的部位に対して交雑される
(マクジリブレイほか(1980)Proc .Nat. Acad. S
ci. USA 77 5153−5157)。適当なベクター
が選ばれれば、適当な制限酵素を使用して交差した切れ
目がリング構造に入れられ、そしてプロキモシンDNA
部分がリング中に結合する。最初に使用したベクター
は、単離した遺伝子を発現させる能力を持つことができ
ないものである。発現のため選んだベクターは、挿入さ
れた遺伝子を発現させる強いプロモータを含んでいなけ
ればならず、また、抗体等に対する抵抗性の暗号となる
通常の同一遺伝子も含まなければならない。このように
して作られた組換えプラスミドは、適当な宿主有機体
(例えば大腸菌)を形質転換させるために使われる(コ
ーエンほか(1972)Proc. Nat. Acad. Sci. 69
2110−2114)。
【0017】この宿主有機体を作る最初の段階において
使用されるプロキモシンmRNAは完全に純粋というわ
けではなく、従ってクローン化されるcDNAは、多種
のうち若干のものだけがプロキモシンに直接関係したD
NA配列を有するものである。そのため、スクリーニン
グ操作は、どのプラスミドがプロキモシンのDNA配列
を持っているかを同定するために不可欠である。これに
は、プロキモシンのアミノ酸配列に部分的に特異的な配
列を持った合成オリゴヌクレオチドを用いた交雑分析を
含む(グルンスタインとホグネス(1975)Proc. Na
t. Acad. Sci.72 3961−3965とフォルトマ
ンほか(1977)Proc. Nat. Acad. Sci. 74 23
21−2334参照)。この操作を用いて、ここまでの
操作で作られた多種のクローンの中からプロキモシン特
異的クローンを検出することができる。全長cDNAの
複写物は、プロキモシン生産に特異的クローンから、ポ
リアクリルアミド ゲル電気泳動を用いて大きさによる
分別を行った後、プラスミドDNAを制限酵素で分解す
ることにより選別することができる(ドウルほか(19
80)Nucl. Acid. Res. 8 4575−4592)。
その後、選別されたプラスミドは、プラスミド調節配列
に関して挿入の正確な配向と調整を行ない、選ばれた発
現ベクターに運ばれる。正しい配置にある全相補的DN
A遺伝子が得られれば、遺伝子の発現は宿主細胞の代謝
の標準的プロセスによりなされ、プロキモシンの生産量
は当該技術分野で知られているタンパク質化学の技術を
使って測定される。我々は、微生物細胞からプロキモシ
ンを単離し、精製するための、タンパク質を酸性pH状
態にすることを含む操作を考案した。プロキモシンは、
酸性pHにすることを含む自触媒的プロセスで活性のキ
モシンに変わり得るということは知られている(アサト
とランド(1977)Biochem. J. 164 429−4
34)。この活性化は、ポリキモシンのアミノ末端から
42個のアミノ酸を取り除くことによって起きる(ピー
ターソンほか(1979)Eur. J. Biochem.94 57
3−580)。
使用されるプロキモシンmRNAは完全に純粋というわ
けではなく、従ってクローン化されるcDNAは、多種
のうち若干のものだけがプロキモシンに直接関係したD
NA配列を有するものである。そのため、スクリーニン
グ操作は、どのプラスミドがプロキモシンのDNA配列
を持っているかを同定するために不可欠である。これに
は、プロキモシンのアミノ酸配列に部分的に特異的な配
列を持った合成オリゴヌクレオチドを用いた交雑分析を
含む(グルンスタインとホグネス(1975)Proc. Na
t. Acad. Sci.72 3961−3965とフォルトマ
ンほか(1977)Proc. Nat. Acad. Sci. 74 23
21−2334参照)。この操作を用いて、ここまでの
操作で作られた多種のクローンの中からプロキモシン特
異的クローンを検出することができる。全長cDNAの
複写物は、プロキモシン生産に特異的クローンから、ポ
リアクリルアミド ゲル電気泳動を用いて大きさによる
分別を行った後、プラスミドDNAを制限酵素で分解す
ることにより選別することができる(ドウルほか(19
80)Nucl. Acid. Res. 8 4575−4592)。
その後、選別されたプラスミドは、プラスミド調節配列
に関して挿入の正確な配向と調整を行ない、選ばれた発
現ベクターに運ばれる。正しい配置にある全相補的DN
A遺伝子が得られれば、遺伝子の発現は宿主細胞の代謝
の標準的プロセスによりなされ、プロキモシンの生産量
は当該技術分野で知られているタンパク質化学の技術を
使って測定される。我々は、微生物細胞からプロキモシ
ンを単離し、精製するための、タンパク質を酸性pH状
態にすることを含む操作を考案した。プロキモシンは、
酸性pHにすることを含む自触媒的プロセスで活性のキ
モシンに変わり得るということは知られている(アサト
とランド(1977)Biochem. J. 164 429−4
34)。この活性化は、ポリキモシンのアミノ末端から
42個のアミノ酸を取り除くことによって起きる(ピー
ターソンほか(1979)Eur. J. Biochem.94 57
3−580)。
【0018】本方法における個々の操作のより詳細な説
明をこれから述べる。特徴的な具体例では、子牛の胃か
らのRNAの調製は次のようにして行われた。屠殺され
たばかりの離乳していない子牛(生後10日)の第4胃
(皺胃)を切開し、等張緩衝液で洗った。赤味を帯びた
粘膜層を小刃で削り取り、0℃に保った。組織は、RN
A調製で直ちに使用し、また−80℃での貯蔵に先だっ
て液体窒素中で凍結した。1つの胃あたり、約50gm
の粘膜を得た。RNAは、主としてカービイの方法(Em
zymology. Vol XII. Academie Press(1968)P.
87)により、下記の方法で皺胃の粘膜から単離した。
削り取った皺胃の粘膜は、均質化する前、鋏で細かく切
り刻んだ。25gmの組織を45mlの1%塩化ナトリ
ウム(w/v)、45mlの6%4−アミノサリチル酸
ナトリウム、45mlのフェノール:クレゾール混合物
(フェノール−500gm、m−クレゾール−70m
l、水−55ml、8−ヒドロキシキノリン−0.5g
m)と混合した。混合物は、6000×g、5℃で30
分間遠心分離する前、20分間室温で振とうした。上層
を取り除き、塩化ナトリウムで3%(w/v)に調製し
た。その後、この層をこの半分の容量のフェノール:m
−クレゾール混合物で室温中で10分間抽出し、次に8
000×g、50℃で15分間遠心分離した。水層を除
き、2倍の容量のエタノールと混ぜ、−20℃で予冷し
た。混合物を0℃で20分間保ち、沈殿したRNAとD
NAを8000×g、5℃で10分間遠心分離した。核
酸のペレットは、pH6.0の100mlの2%(w/
v)酢酸ナトリウム中で静かに再懸濁し、溶液は固体の
添加により塩化ナトリウムで3Mに調製した。それを4
℃で1晩置き、RNAの沈殿物を8000×g、5℃で
15分間遠心分離した。ペレットは、DNAと可溶性R
NAを除くためpH6.0の3M酢酸ナトリウムでしっ
かり洗い、その後酢酸ナトリウムを除くため、70%
(v/v)のエタノールで洗った。次にペレットを乾燥
させ、希薄緩衝液中で再溶解させ、そして−20℃で貯
蔵した。得られたものは、約30〜40mgのDNAで
あった。
明をこれから述べる。特徴的な具体例では、子牛の胃か
らのRNAの調製は次のようにして行われた。屠殺され
たばかりの離乳していない子牛(生後10日)の第4胃
(皺胃)を切開し、等張緩衝液で洗った。赤味を帯びた
粘膜層を小刃で削り取り、0℃に保った。組織は、RN
A調製で直ちに使用し、また−80℃での貯蔵に先だっ
て液体窒素中で凍結した。1つの胃あたり、約50gm
の粘膜を得た。RNAは、主としてカービイの方法(Em
zymology. Vol XII. Academie Press(1968)P.
87)により、下記の方法で皺胃の粘膜から単離した。
削り取った皺胃の粘膜は、均質化する前、鋏で細かく切
り刻んだ。25gmの組織を45mlの1%塩化ナトリ
ウム(w/v)、45mlの6%4−アミノサリチル酸
ナトリウム、45mlのフェノール:クレゾール混合物
(フェノール−500gm、m−クレゾール−70m
l、水−55ml、8−ヒドロキシキノリン−0.5g
m)と混合した。混合物は、6000×g、5℃で30
分間遠心分離する前、20分間室温で振とうした。上層
を取り除き、塩化ナトリウムで3%(w/v)に調製し
た。その後、この層をこの半分の容量のフェノール:m
−クレゾール混合物で室温中で10分間抽出し、次に8
000×g、50℃で15分間遠心分離した。水層を除
き、2倍の容量のエタノールと混ぜ、−20℃で予冷し
た。混合物を0℃で20分間保ち、沈殿したRNAとD
NAを8000×g、5℃で10分間遠心分離した。核
酸のペレットは、pH6.0の100mlの2%(w/
v)酢酸ナトリウム中で静かに再懸濁し、溶液は固体の
添加により塩化ナトリウムで3Mに調製した。それを4
℃で1晩置き、RNAの沈殿物を8000×g、5℃で
15分間遠心分離した。ペレットは、DNAと可溶性R
NAを除くためpH6.0の3M酢酸ナトリウムでしっ
かり洗い、その後酢酸ナトリウムを除くため、70%
(v/v)のエタノールで洗った。次にペレットを乾燥
させ、希薄緩衝液中で再溶解させ、そして−20℃で貯
蔵した。得られたものは、約30〜40mgのDNAで
あった。
【0019】この子牛の胃のRNA抽出物は、下記のク
ロマトグラフィ操作によって更に精製した。精製には、
例えば、蔗糖密度勾配法を用いることも可能であろう。
ロマトグラフィ操作によって更に精製した。精製には、
例えば、蔗糖密度勾配法を用いることも可能であろう。
【0020】15mgの子牛の胃のRNAを0.5M塩
化ナトリウム、20mM HEPES(pH7.5)、
2mM EDTA、0.1%SDS(負荷緩衝剤)を含
む緩衝液で、1mg/mlとなるように調製する。この
溶液を、負荷緩衝液できちんと洗った。2gmのオリゴ
(dT)セルロース(B.R.L. Ltd. Bethosda, Md)を含
む小さなクロマトグラフィカラムにかけた。重力の下に
カラムにかけた後、抽出物の光学濃度が260nmで
0.05以下になるまで、結合していないRNAを負荷
緩衝液で洗い流した。その後、結合しているmRNA部
分は、数カラム容量の20mM HEPES(pH7.
5)、1mM EDTA、0.1%SDSで抽出した。
mRNAは−20℃、2容量の無水エタノールで沈殿さ
せることによって回収し、沈殿物を15,000×g、
4℃で10分間遠心分離した。300〜400マイクロ
グラムmRNA部分を得た。
化ナトリウム、20mM HEPES(pH7.5)、
2mM EDTA、0.1%SDS(負荷緩衝剤)を含
む緩衝液で、1mg/mlとなるように調製する。この
溶液を、負荷緩衝液できちんと洗った。2gmのオリゴ
(dT)セルロース(B.R.L. Ltd. Bethosda, Md)を含
む小さなクロマトグラフィカラムにかけた。重力の下に
カラムにかけた後、抽出物の光学濃度が260nmで
0.05以下になるまで、結合していないRNAを負荷
緩衝液で洗い流した。その後、結合しているmRNA部
分は、数カラム容量の20mM HEPES(pH7.
5)、1mM EDTA、0.1%SDSで抽出した。
mRNAは−20℃、2容量の無水エタノールで沈殿さ
せることによって回収し、沈殿物を15,000×g、
4℃で10分間遠心分離した。300〜400マイクロ
グラムmRNA部分を得た。
【0021】操作の次の段階は、プロキモシンmRNA
から1本鎖cDNAを調製することである。mRNA1
本鎖から全長cDNA1本鎖を作るため、cDNAの転
写を始めることができるmDNAの特定の部位でmRN
Aをプライムさせることが必要である。
から1本鎖cDNAを調製することである。mRNA1
本鎖から全長cDNA1本鎖を作るため、cDNAの転
写を始めることができるmDNAの特定の部位でmRN
Aをプライムさせることが必要である。
【0022】この操作では、2個のプライマを使用し
た。その1つは、オリゴ(dT)12〜18である。こ
のプライマは、一連のチミジン(T)残基からできてい
る。殆んど全部の真核mRNAの特徴は、鎖の一端に一
連のアデニン(A)残基を含んでいることである。上述
のプライマは、このオリゴ(A)グループと交雑するこ
とができ、また一本鎖cDNAの転写のための出発点と
なることができる。以下の方法は、基本的にはエムター
ゲほかの方法によるものである(Nucl. Acid.Res. 6
1221−1240(1979))。混合物には、50
mM Tris.Cl(pH8.3)、10mM塩化マ
グネシウム、32pでラベルした0.5mM dCT
P、5mM DTT 、0.01%トリトン X−10
0、50μg/mlのアクトミオシンD、50mMの塩
化カリウム、10μg/mlのオリゴ(dT)、20−
50μg/mlのmRNA部分、10−60U/mlの
逆転写酵素(IUB Cat.No.E.C.2.7.
7.7.)を含む。37℃、90分間の培養の後、反応
は、溶液を0.2%SDS、20mM EDTAに調製
することにより終了した。溶液は、等量1:1(v/
v)フェノール:クロロホルムと−20℃、2容量の無
水エタノールで沈殿させて濃縮した液層で抽出した。回
収したcDNAは水に溶かし、水酸化ナトリウムで0.
1Mに調整し、そして60℃で30分間培養した。酢酸
で中和した後、試料を50mM塩化ナトリウムと0.1
%SDSを含む緩衝液でセファデクスG−150のカラ
ムよりクロマトグラフィにかけた。空のカラムに溶出す
るラベルした試料を集め、2容量のエタノールで沈殿さ
せた。
た。その1つは、オリゴ(dT)12〜18である。こ
のプライマは、一連のチミジン(T)残基からできてい
る。殆んど全部の真核mRNAの特徴は、鎖の一端に一
連のアデニン(A)残基を含んでいることである。上述
のプライマは、このオリゴ(A)グループと交雑するこ
とができ、また一本鎖cDNAの転写のための出発点と
なることができる。以下の方法は、基本的にはエムター
ゲほかの方法によるものである(Nucl. Acid.Res. 6
1221−1240(1979))。混合物には、50
mM Tris.Cl(pH8.3)、10mM塩化マ
グネシウム、32pでラベルした0.5mM dCT
P、5mM DTT 、0.01%トリトン X−10
0、50μg/mlのアクトミオシンD、50mMの塩
化カリウム、10μg/mlのオリゴ(dT)、20−
50μg/mlのmRNA部分、10−60U/mlの
逆転写酵素(IUB Cat.No.E.C.2.7.
7.7.)を含む。37℃、90分間の培養の後、反応
は、溶液を0.2%SDS、20mM EDTAに調製
することにより終了した。溶液は、等量1:1(v/
v)フェノール:クロロホルムと−20℃、2容量の無
水エタノールで沈殿させて濃縮した液層で抽出した。回
収したcDNAは水に溶かし、水酸化ナトリウムで0.
1Mに調整し、そして60℃で30分間培養した。酢酸
で中和した後、試料を50mM塩化ナトリウムと0.1
%SDSを含む緩衝液でセファデクスG−150のカラ
ムよりクロマトグラフィにかけた。空のカラムに溶出す
るラベルした試料を集め、2容量のエタノールで沈殿さ
せた。
【0023】cDNAの大きさは、90mM Tri
s、90mMホウ酸、2.5mM EDTA(pH8.
3)を含む緩衝液を使用した5%アクリルアミドゲル中
で標準DNA断片を対照として電気泳動法で測定した。
32PでラベルしたcDNAの位置は、フジ−RXフィル
ムを使用したゲルのオートラジオグラフィにより突き止
めた。800個以上の塩基を持つcDNAは切り取ら
れ、0.5M酢酸アンモニウム、0.01M酢酸マグネ
シウム、0.1%SDS、0.1mM EDTAを含む
緩衝液に電気溶出することにより、ゲルから溶出した。
この高分子量cDNAは、二本鎖試料の合成のために使
用した。
s、90mMホウ酸、2.5mM EDTA(pH8.
3)を含む緩衝液を使用した5%アクリルアミドゲル中
で標準DNA断片を対照として電気泳動法で測定した。
32PでラベルしたcDNAの位置は、フジ−RXフィル
ムを使用したゲルのオートラジオグラフィにより突き止
めた。800個以上の塩基を持つcDNAは切り取ら
れ、0.5M酢酸アンモニウム、0.01M酢酸マグネ
シウム、0.1%SDS、0.1mM EDTAを含む
緩衝液に電気溶出することにより、ゲルから溶出した。
この高分子量cDNAは、二本鎖試料の合成のために使
用した。
【0024】cDNAを転写するこの方法の一つの欠点
は、単離したmRNA群に存在するあらゆる種からcD
NAを生産するということ、即ち、cDNAは配列に関
して異質になってしまうということである。これを解決
する一つの方法は、オリゴ(dT)12−18の代わり
に、配列に特異性のあるプライマを使用することであ
る。
は、単離したmRNA群に存在するあらゆる種からcD
NAを生産するということ、即ち、cDNAは配列に関
して異質になってしまうということである。これを解決
する一つの方法は、オリゴ(dT)12−18の代わり
に、配列に特異性のあるプライマを使用することであ
る。
【0025】オリゴ(dT)12−18でプライムされ
たcDNAを使用した場合のもう一つの欠点は、転写が
mRNAの5’部位に達しないで止ってしまうことであ
る。このことは、特異的な第2次構造の特徴又は概して
酵素反応の条件が最善ではないということによるのかも
しれない。mRNAの5’部位に由来する配列がないと
いうことは、クローン化した配列の発現が主目標の場
合、重大な欠点である。cDNA中の5’部位配列を特
異的に得るためには、5’部位の中程又は近くにあるm
RNAと交雑するプライマを使うことができる。
たcDNAを使用した場合のもう一つの欠点は、転写が
mRNAの5’部位に達しないで止ってしまうことであ
る。このことは、特異的な第2次構造の特徴又は概して
酵素反応の条件が最善ではないということによるのかも
しれない。mRNAの5’部位に由来する配列がないと
いうことは、クローン化した配列の発現が主目標の場
合、重大な欠点である。cDNA中の5’部位配列を特
異的に得るためには、5’部位の中程又は近くにあるm
RNAと交雑するプライマを使うことができる。
【0026】これらのうちのどちらかを実施するために
は、遺伝子コードの低い縮重が存在しているプロキモシ
ンタンパク質にあるアミノ酸配列の位置を知る必要があ
る。このことは、特定のアミノ酸配列の暗号となるヌク
レオチド配列の数は全ての可能な組合せを合成できる程
少いものである。我々は、プロキモシンに次のアミノ酸
配列があることがわかった。182 187 asp−asn−met−met−asn−arg このアミノ酸配列のためのメッセンジャーRNAは次の
ようであろう。 5’ (A) 3’ (T) (T) (T) (C) (C) 35 GA .AA .ATG.ATG.AA . G (C) (C) (C) (A) (T) (G) このかたまった配列の中央の4つのコドンは、4重の縮
重しか持っていない。可能なmRNA配列に相補的な一
組のオリゴヌクレオチドは、次のように表わすことがで
きる。5 ’ 3’A TT.CAT.CAT. A TTA TT.CAT.CAT. G TTG TT.CAT.CAT. G TTG TT.CAT.CAT. A TT これらの4つの配列のうちの一つは、自然のmRNA配
列と正確に一致していなければならず、そのためプロキ
モシンmRNAの部位に交雑することになる。同じ部域
に対する他のオリゴヌクレオチドの組としては、次のよ
うになる。5 ’ TT.CAT.CAT. A TT. A TC TT.CAT.CAT. A TT. G TC TT.CAT.CAT. A TT. G TC TT.CAT.CAT. G TT. A TC これらのオリゴヌクレオチドは、常法であるホスホトリ
エステル合成法(シウングほか(1979)Nucl. Aci
d. Res. 6 1371−1385)を使用して合成し、
次にウルトラシルカラム(Altex Limited USA)で高圧
液体クロマトグラフィにかけて精製した。これらの合成
オリゴヌクレオチドは、プロキモシンmRNAの一本鎖
cDNAの転写のため、プライマとして使用した。
は、遺伝子コードの低い縮重が存在しているプロキモシ
ンタンパク質にあるアミノ酸配列の位置を知る必要があ
る。このことは、特定のアミノ酸配列の暗号となるヌク
レオチド配列の数は全ての可能な組合せを合成できる程
少いものである。我々は、プロキモシンに次のアミノ酸
配列があることがわかった。182 187 asp−asn−met−met−asn−arg このアミノ酸配列のためのメッセンジャーRNAは次の
ようであろう。 5’ (A) 3’ (T) (T) (T) (C) (C) 35 GA .AA .ATG.ATG.AA . G (C) (C) (C) (A) (T) (G) このかたまった配列の中央の4つのコドンは、4重の縮
重しか持っていない。可能なmRNA配列に相補的な一
組のオリゴヌクレオチドは、次のように表わすことがで
きる。5 ’ 3’A TT.CAT.CAT. A TTA TT.CAT.CAT. G TTG TT.CAT.CAT. G TTG TT.CAT.CAT. A TT これらの4つの配列のうちの一つは、自然のmRNA配
列と正確に一致していなければならず、そのためプロキ
モシンmRNAの部位に交雑することになる。同じ部域
に対する他のオリゴヌクレオチドの組としては、次のよ
うになる。5 ’ TT.CAT.CAT. A TT. A TC TT.CAT.CAT. A TT. G TC TT.CAT.CAT. A TT. G TC TT.CAT.CAT. G TT. A TC これらのオリゴヌクレオチドは、常法であるホスホトリ
エステル合成法(シウングほか(1979)Nucl. Aci
d. Res. 6 1371−1385)を使用して合成し、
次にウルトラシルカラム(Altex Limited USA)で高圧
液体クロマトグラフィにかけて精製した。これらの合成
オリゴヌクレオチドは、プロキモシンmRNAの一本鎖
cDNAの転写のため、プライマとして使用した。
【0027】2μgの各オリゴヌクレオチドを、T4ポ
リヌクレオチドキナーゼと32P−ATPを用いて、5’
部位に32Pリン酸でラベルした。
リヌクレオチドキナーゼと32P−ATPを用いて、5’
部位に32Pリン酸でラベルした。
【0028】混合物には、0.1−1.0mCiの32P
−ATP、50mMトリス.Cl(pH7.8)、5m
M塩化マグネシウム、10mMβ−メルカプトエタノー
ル、5〜20単位のT4ポリヌクレオチドキナーゼを含
んでいた。37℃で30〜60分培養した後、溶液は等
量の1:1(v/v)フェノール:クロロホルムと一緒
に抽出し、水層は、50mM塩化ナトリウム、20mM
トリス.Cl(pH7.5)、0.1%SDSで平衡に
されたセファデスクG−50カラムに通した。ラベルさ
れたオリゴヌクレオチドを含む除去部分はためた後、2
容量の無水エタノールを添加して沈殿させた。沈殿物
は、15,000×g、4℃で10分間遠心分離して回
収した。
−ATP、50mMトリス.Cl(pH7.8)、5m
M塩化マグネシウム、10mMβ−メルカプトエタノー
ル、5〜20単位のT4ポリヌクレオチドキナーゼを含
んでいた。37℃で30〜60分培養した後、溶液は等
量の1:1(v/v)フェノール:クロロホルムと一緒
に抽出し、水層は、50mM塩化ナトリウム、20mM
トリス.Cl(pH7.5)、0.1%SDSで平衡に
されたセファデスクG−50カラムに通した。ラベルさ
れたオリゴヌクレオチドを含む除去部分はためた後、2
容量の無水エタノールを添加して沈殿させた。沈殿物
は、15,000×g、4℃で10分間遠心分離して回
収した。
【0029】その後、反応混合物に32P−dCPTが含
まれていない場合を除いて、ラベルされた4つのオリゴ
ヌクレオチドは、オリゴ(dT)12−18のため、上
述したようにcDNA合成のプライマとして使用した。
試験した4つのオリゴヌクレオチドのうちの1つだけ、
即ち5’−GTT.CAT.CAT.GTT−3’配列
を持つものだけが子牛の胃のmRNA群にcDNA合成
をプライムさせることができた。このことは、メチオニ
ンダブレットの部域にあるmRNA配列は、この特定の
オリゴヌクレオチドの配列に対して相補的であることを
はっきり示している。
まれていない場合を除いて、ラベルされた4つのオリゴ
ヌクレオチドは、オリゴ(dT)12−18のため、上
述したようにcDNA合成のプライマとして使用した。
試験した4つのオリゴヌクレオチドのうちの1つだけ、
即ち5’−GTT.CAT.CAT.GTT−3’配列
を持つものだけが子牛の胃のmRNA群にcDNA合成
をプライムさせることができた。このことは、メチオニ
ンダブレットの部域にあるmRNA配列は、この特定の
オリゴヌクレオチドの配列に対して相補的であることを
はっきり示している。
【0030】作られたcDNAは、ゲル電気泳動での測
定によると最大650個の塩基の長さを持ち、これはメ
チオニン−メチオニン配列とmRNAの5’部位間の距
離の予測と一致していた。しかし、それはばらばらの分
子量を持った幾つかの種類のものから成っていた。この
cDNAは1本鎖であり、5’部位に1個の32P−リン
酸塩でラベルした。これらは、マキサムとジルバート
(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 560(197
7))の化学的方法により、DNA鎖を配列させるため
に必要なことである。プライムされたcDNAはこれら
の方法により配列され、プライマヌクレオチド配列を得
たポリキモシンタンパク質の部域の以前から知られてい
たアミノ酸配列に一致しているDNA配列が得られた。
これらの配列方法は、現在多くの研究室で一般的なもの
となっており、Methods in Enzymology 68 499−
560(1980)にはステップバイステップ法が説明
されている。得られた配列は、関連するアミノ酸配列と
制限酵素認識部位と共に図2に示されている。特に興味
深いことは、SmaI ,Eco.RI,HindIII,
Bam HIの酵素に対する認識部位が存在しているこ
とである。プラスミドpAT153には最初のクローニ
ングのために使用されるSmaI部位がなく、他の3つ
の部位も稀である。これらのうちの1つ又は2つ以上の
ものは、プライマオリゴヌクレオチドから作られた特異
的5’cDNAをオリゴ(dT)プライミングから作ら
れた短いcDNAに結合させるための有用な部位を提供
する。
定によると最大650個の塩基の長さを持ち、これはメ
チオニン−メチオニン配列とmRNAの5’部位間の距
離の予測と一致していた。しかし、それはばらばらの分
子量を持った幾つかの種類のものから成っていた。この
cDNAは1本鎖であり、5’部位に1個の32P−リン
酸塩でラベルした。これらは、マキサムとジルバート
(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 560(197
7))の化学的方法により、DNA鎖を配列させるため
に必要なことである。プライムされたcDNAはこれら
の方法により配列され、プライマヌクレオチド配列を得
たポリキモシンタンパク質の部域の以前から知られてい
たアミノ酸配列に一致しているDNA配列が得られた。
これらの配列方法は、現在多くの研究室で一般的なもの
となっており、Methods in Enzymology 68 499−
560(1980)にはステップバイステップ法が説明
されている。得られた配列は、関連するアミノ酸配列と
制限酵素認識部位と共に図2に示されている。特に興味
深いことは、SmaI ,Eco.RI,HindIII,
Bam HIの酵素に対する認識部位が存在しているこ
とである。プラスミドpAT153には最初のクローニ
ングのために使用されるSmaI部位がなく、他の3つ
の部位も稀である。これらのうちの1つ又は2つ以上の
ものは、プライマオリゴヌクレオチドから作られた特異
的5’cDNAをオリゴ(dT)プライミングから作ら
れた短いcDNAに結合させるための有用な部位を提供
する。
【0031】オリゴヌクレオチド5’−GTT.CA
T.CAT.TGG−3’を使って得られたcDNA
は、大きさが不均一であり、且つ読みとれる配列を与え
るための化学的配列反応において分画しなくても使用で
きる、という事実は、このcDNAが実際にある特異的
mRNAのある特異点に交雑することを示している。こ
のことは、オリゴヌクレオチドを使用して作られたcD
NAが、クローニング実験で得られた細菌コロニーのス
クリーニングにおいて、完全に特異的な交雑プローブと
して使用できることを意味している(下記のスクリーニ
ング操作参照)。この伸びたプライマcDNAは、短い
オリゴヌクレオチド自身よりもプラスミドDNAに対し
てより安定した相互作用をし、そのためcDNAの方が
プローブとして好適である。
T.CAT.TGG−3’を使って得られたcDNA
は、大きさが不均一であり、且つ読みとれる配列を与え
るための化学的配列反応において分画しなくても使用で
きる、という事実は、このcDNAが実際にある特異的
mRNAのある特異点に交雑することを示している。こ
のことは、オリゴヌクレオチドを使用して作られたcD
NAが、クローニング実験で得られた細菌コロニーのス
クリーニングにおいて、完全に特異的な交雑プローブと
して使用できることを意味している(下記のスクリーニ
ング操作参照)。この伸びたプライマcDNAは、短い
オリゴヌクレオチド自身よりもプラスミドDNAに対し
てより安定した相互作用をし、そのためcDNAの方が
プローブとして好適である。
【0032】上述した転写の方法によって、3’部位に
DNAの“ヘアピン”構造を持ったDNA分子ができ
る。これは、第2鎖のDNAを作る際使用することがで
きる。又は、1本鎖DNAを作る際の2つの方法に使用
することができる。2つの方法を使用することができ、
1本鎖cDNAは、例えば大腸菌のDNAポリメラーゼ
I、又は正常な状態であれば1本鎖DNAの複写物を作
るのであろうが、ヘアピン構造がプライマとして作用す
るのでこの場合2本鎖cDNAを作ることになるAMV
転写酵素に支配され得る。今説明している調製におい
て、1本鎖cDNAは、50mM Tris.Cl(p
H8.3)、20mM DTT、10mM塩化マグネシ
ウム、0.5mM dGTP、0.5mM dATP、
0.5mMdTTP、0.5mM dCTP、2−10
μg/mlのAMV逆転写酵素を含む混合物中に培養す
ることによって2本鎖型に変えた。45℃で4時間培養
した後、溶液を0.2%SDS、20mM EDTAに
調製し、その後等量の1:1(v/v)フェノール:ク
ロロホルムと一緒に抽出した。水層は、上述したように
セファデクスG−150カラムでクロマトグラフィにか
け、抽出した部分をためた後、2容量の無水エタノール
で沈殿させた。合成DNAの大きさは、90mMTri
s、90mMホウ酸、2.5mM EDTA(pH8.
3)を含む緩衝液を使用したアクリルアミドゲルで、標
準DNA断片を対照としてゲル電気泳動で測定した。ラ
ベルしたDNAの位置は、フジ−RXフィルムを使用し
たゲルのオートラジオグラフィによって突き止めた。8
00個以上の塩基を持つ2本鎖cDNAは切り離し、上
述した1本鎖のものと同じようにゲルから抽出した。こ
の高分子量のものは、クローニング実験のために使用し
た。
DNAの“ヘアピン”構造を持ったDNA分子ができ
る。これは、第2鎖のDNAを作る際使用することがで
きる。又は、1本鎖DNAを作る際の2つの方法に使用
することができる。2つの方法を使用することができ、
1本鎖cDNAは、例えば大腸菌のDNAポリメラーゼ
I、又は正常な状態であれば1本鎖DNAの複写物を作
るのであろうが、ヘアピン構造がプライマとして作用す
るのでこの場合2本鎖cDNAを作ることになるAMV
転写酵素に支配され得る。今説明している調製におい
て、1本鎖cDNAは、50mM Tris.Cl(p
H8.3)、20mM DTT、10mM塩化マグネシ
ウム、0.5mM dGTP、0.5mM dATP、
0.5mMdTTP、0.5mM dCTP、2−10
μg/mlのAMV逆転写酵素を含む混合物中に培養す
ることによって2本鎖型に変えた。45℃で4時間培養
した後、溶液を0.2%SDS、20mM EDTAに
調製し、その後等量の1:1(v/v)フェノール:ク
ロロホルムと一緒に抽出した。水層は、上述したように
セファデクスG−150カラムでクロマトグラフィにか
け、抽出した部分をためた後、2容量の無水エタノール
で沈殿させた。合成DNAの大きさは、90mMTri
s、90mMホウ酸、2.5mM EDTA(pH8.
3)を含む緩衝液を使用したアクリルアミドゲルで、標
準DNA断片を対照としてゲル電気泳動で測定した。ラ
ベルしたDNAの位置は、フジ−RXフィルムを使用し
たゲルのオートラジオグラフィによって突き止めた。8
00個以上の塩基を持つ2本鎖cDNAは切り離し、上
述した1本鎖のものと同じようにゲルから抽出した。こ
の高分子量のものは、クローニング実験のために使用し
た。
【0033】cDNAの一端にあるヘアピンループは、
α−アミラーゼから調製したS1ヌクレアーゼを用いて
分解させることにより取り除いた(ボグト V M Eu
r. J. Biochem. 33 192−220(197
3))。分解は、150mM塩化ナトリウム、25mM
酢酸ナトリウム(pH4.6)、1mM硫酸亜鉛、10
−100μg/mlのcDNA、25−50単位/ml
のS1を含む溶液中で行った。
α−アミラーゼから調製したS1ヌクレアーゼを用いて
分解させることにより取り除いた(ボグト V M Eu
r. J. Biochem. 33 192−220(197
3))。分解は、150mM塩化ナトリウム、25mM
酢酸ナトリウム(pH4.6)、1mM硫酸亜鉛、10
−100μg/mlのcDNA、25−50単位/ml
のS1を含む溶液中で行った。
【0034】2本鎖のcDNAの端部にある残基の“ぼ
ろぼろになったもの”は、cDNAを50mM Tri
s. Cl(pH7.5)、5mM MgCl2、2m
Mメルカプトエタノール、4つのデオキシリボヌクレオ
チドリン酸塩の各0.5mM、2単位のDNAポリメラ
ーゼI(いわゆる“クレノウ断片”)を含む20μlの
混合物中でDNAポリメラーゼI(クレノウ断片)と一
緒に培養して修復する。培養は、15℃で15分間であ
った。cDNA遺伝子の末端におけるヌクレオチド配列
の保持を確実にするため、(ランドほか(1981)Nu
cl. Acid. Res.9 2251)の操作を一部変更した代
わりの方法を使用した。上述のようにして調製された1
本鎖cDNAは、100mM カコジル酸ナトリウム
(pH7.1)、0.1mM DTT、10mM冷dC
TP、1mM CoCl2、250μCi/mlの3H−
dCTP、10μl/mlの末端トランスフェラーゼを
含む反応で3’部位にオリゴデオキシシトジンが伸ばさ
れた。反応は、ラベルしたdCTPの取り込みを計るこ
とにより測定し、デオキシシトジンの平均50〜100
残基を各分子に加えた後、フェノール抽出により終了し
た。この伸びたcDNAへの第2鎖の合成は、10μg
/mlのcDNA、50mM Tris.Cl(pH
8.2)、30mM KCl、10mM MgCl2、
50μg/mlのオリゴdG(12−18)を含む溶液
中で、オリゴデオキシグアノシン(12〜18残基長)
をアニールすることにより行った。混合物は、68℃で
30分間培養し、その後、10mM DTT、0.4m
Mの各4つのデオキシヌクレオシド・トリリン酸塩、4
00単位/ml AMV逆転写酵素を含むように調製す
る前に、60分間をかけて37℃に冷やした。混合物
は、37℃で10分間培養した後、42℃で3時間培養
し、次に上述したようにフェノール抽出と大きさによる
分別を行った。
ろぼろになったもの”は、cDNAを50mM Tri
s. Cl(pH7.5)、5mM MgCl2、2m
Mメルカプトエタノール、4つのデオキシリボヌクレオ
チドリン酸塩の各0.5mM、2単位のDNAポリメラ
ーゼI(いわゆる“クレノウ断片”)を含む20μlの
混合物中でDNAポリメラーゼI(クレノウ断片)と一
緒に培養して修復する。培養は、15℃で15分間であ
った。cDNA遺伝子の末端におけるヌクレオチド配列
の保持を確実にするため、(ランドほか(1981)Nu
cl. Acid. Res.9 2251)の操作を一部変更した代
わりの方法を使用した。上述のようにして調製された1
本鎖cDNAは、100mM カコジル酸ナトリウム
(pH7.1)、0.1mM DTT、10mM冷dC
TP、1mM CoCl2、250μCi/mlの3H−
dCTP、10μl/mlの末端トランスフェラーゼを
含む反応で3’部位にオリゴデオキシシトジンが伸ばさ
れた。反応は、ラベルしたdCTPの取り込みを計るこ
とにより測定し、デオキシシトジンの平均50〜100
残基を各分子に加えた後、フェノール抽出により終了し
た。この伸びたcDNAへの第2鎖の合成は、10μg
/mlのcDNA、50mM Tris.Cl(pH
8.2)、30mM KCl、10mM MgCl2、
50μg/mlのオリゴdG(12−18)を含む溶液
中で、オリゴデオキシグアノシン(12〜18残基長)
をアニールすることにより行った。混合物は、68℃で
30分間培養し、その後、10mM DTT、0.4m
Mの各4つのデオキシヌクレオシド・トリリン酸塩、4
00単位/ml AMV逆転写酵素を含むように調製す
る前に、60分間をかけて37℃に冷やした。混合物
は、37℃で10分間培養した後、42℃で3時間培養
し、次に上述したようにフェノール抽出と大きさによる
分別を行った。
【0035】2本鎖cDNAをプラスミドに導入するた
めのより好ましい方法は、cDNAとプラスミドに付着
したホモポリマオリゴヌクレオチドの“尾”を使用する
ことである(大塚(1981)Gene 13 339−3
46)。末端を整えるため、DNAポリメラーゼI(ク
レノウ断片)と一緒に培養した後、cDNAに、0.5
mM塩化コバルト、0.1〜1mM 3H−dCTPの
存在下に子牛の胸腺からの末端トランスフェラーゼ(E
C 2.7.7.31.)を使用してオリゴデオキシシ
トジンをくっつけた。PstIで切断されたプラスミド
pAT153のDNAには、その後10mM塩化マグネ
シウムと3H−dGTPの存在下に末端トランスフェラ
ーゼを使用してオリゴデオキシ−グアノシンをくっつけ
た。反応は、放射能のトリクロロ酢酸沈殿物への取り込
みを計ることにより測定し、反応は、取り込みが平均3
0−40残基の3’部位への付着があったことを示した
後、反応は終了した。混合物は、フェノールとクロロホ
ルムを使用して除タンパクし、尾のついたDNAはエタ
ノールにより沈殿させて回収した。
めのより好ましい方法は、cDNAとプラスミドに付着
したホモポリマオリゴヌクレオチドの“尾”を使用する
ことである(大塚(1981)Gene 13 339−3
46)。末端を整えるため、DNAポリメラーゼI(ク
レノウ断片)と一緒に培養した後、cDNAに、0.5
mM塩化コバルト、0.1〜1mM 3H−dCTPの
存在下に子牛の胸腺からの末端トランスフェラーゼ(E
C 2.7.7.31.)を使用してオリゴデオキシシ
トジンをくっつけた。PstIで切断されたプラスミド
pAT153のDNAには、その後10mM塩化マグネ
シウムと3H−dGTPの存在下に末端トランスフェラ
ーゼを使用してオリゴデオキシ−グアノシンをくっつけ
た。反応は、放射能のトリクロロ酢酸沈殿物への取り込
みを計ることにより測定し、反応は、取り込みが平均3
0−40残基の3’部位への付着があったことを示した
後、反応は終了した。混合物は、フェノールとクロロホ
ルムを使用して除タンパクし、尾のついたDNAはエタ
ノールにより沈殿させて回収した。
【0036】等モル量の2つの尾のついた種類のもの
は、50μlの0.15M塩化ナトリウム、0.01M
Tris.U(pH7.4)、1mM EDTAを含
む混合物中で、68℃、30分間加熱し、その後溶液を
約4時間かけて室温に冷やすことによって一緒にアニー
ルした。アニールされたDNAは、後述するように適当
な微生物細胞を形質転換するために使用した。
は、50μlの0.15M塩化ナトリウム、0.01M
Tris.U(pH7.4)、1mM EDTAを含
む混合物中で、68℃、30分間加熱し、その後溶液を
約4時間かけて室温に冷やすことによって一緒にアニー
ルした。アニールされたDNAは、後述するように適当
な微生物細胞を形質転換するために使用した。
【0037】形質転換された有機体群から、どの有機体
がうまく組換えDNAを取り込むかどうかを決めるた
め、(恐らくテトラサイクリン又はアムプシリンに対す
る感受性に基づくのであろうが)選別を行った。
がうまく組換えDNAを取り込むかどうかを決めるた
め、(恐らくテトラサイクリン又はアムプシリンに対す
る感受性に基づくのであろうが)選別を行った。
【0038】本例では、カツツほか(1972 J. Bact
erial. 144 577−591)の方法を使用し、合
成遺伝子を持つpAT153を用いて大腸菌HB101
(ボイヤ H. W.とロウランド・ドウソイクス D.(19
69) J. Mol. Biol. 41459−472)を形質転
換した。細胞は、アムピシリンを100μg/mgまで
含むL−寒天培養皿(ミラーJ. Experiments In Melecu
lar Genetics. コールド・スプリングハーバー・ラボラ
トリー、ニューヨーク、P433)につけ、37℃で1
6時間培養した。
erial. 144 577−591)の方法を使用し、合
成遺伝子を持つpAT153を用いて大腸菌HB101
(ボイヤ H. W.とロウランド・ドウソイクス D.(19
69) J. Mol. Biol. 41459−472)を形質転
換した。細胞は、アムピシリンを100μg/mgまで
含むL−寒天培養皿(ミラーJ. Experiments In Melecu
lar Genetics. コールド・スプリングハーバー・ラボラ
トリー、ニューヨーク、P433)につけ、37℃で1
6時間培養した。
【0039】クローンは、抗生物質が添加されたL−寒
天培養皿上の試料を画線し、そして独立のコロニーを選
び出すことにより精製した。組換えクローン(即ち、テ
トラサイクリンには抵抗性があるが、アムピシリンには
感受性があるもの)は、32PでラベルしたmRNA断片
を使用した最初の“コロニー交雑”スクリーン(グルン
スタイン M.とホグネス D.(1975)Proc. Nat. A
cad. Sci. (USA) 723961−3965)に影響され
た。個々のクローン化したDNAの交雑をa)キモシン
に特異的な配列が見出された子牛の胃からのmRNAそ
れにb)キモシンに特異的な配列がない子牛の肝臓から
のmRNAと比較することによって、多くのキモシンに
特異的なクローンと思われるものを選び出した。上述し
た特異的プライマから伸びたcDNAを使用した、より
進んだコロニー交雑スクリーンにより陽性のキモシンク
ローンの性質が確認できた。
天培養皿上の試料を画線し、そして独立のコロニーを選
び出すことにより精製した。組換えクローン(即ち、テ
トラサイクリンには抵抗性があるが、アムピシリンには
感受性があるもの)は、32PでラベルしたmRNA断片
を使用した最初の“コロニー交雑”スクリーン(グルン
スタイン M.とホグネス D.(1975)Proc. Nat. A
cad. Sci. (USA) 723961−3965)に影響され
た。個々のクローン化したDNAの交雑をa)キモシン
に特異的な配列が見出された子牛の胃からのmRNAそ
れにb)キモシンに特異的な配列がない子牛の肝臓から
のmRNAと比較することによって、多くのキモシンに
特異的なクローンと思われるものを選び出した。上述し
た特異的プライマから伸びたcDNAを使用した、より
進んだコロニー交雑スクリーンにより陽性のキモシンク
ローンの性質が確認できた。
【0040】幾つかのこのような陽性のコロニーから得
たDNAは、交雑プライミング(上記参照)によるプロ
キモシンmRNAから得たcDNAだとはっきりしてい
る配列と一致している制限酵素の分解パターンを示して
いた。このような2つのクローンからのDNAは、それ
ぞれ完全なプロキモシン遺伝子の半分以上の長さであっ
た。DNAの一部分は、プロキモシンmRNAの3’部
位からプロキモシンmRNAの5’部位直前までの転写
の産物であり、転写は、オリゴ(dT)12〜18でプ
ライムされた。DNAの他の部分は、明らかにプロキモ
シンmRNAの3’部位直後からポリキモシンmRNA
の5’部位までの転写によって得られたものである。こ
れらのDNA片を含むこの2つのクローンは、それぞれ
B18とG1と呼び、クローンB18とG1からのDN
Aの縮尺制限部位地図 図3(a)に示す。この図は、
完全な遺伝子を作るための2つの部分的なプロキモシン
遺伝子を結合させるG1とB18から得たDNAの重な
り部分に存在している多くの制限部位を示している。図
3(a)と(b)において、制限部位は次のように表示
されている。 Pst=P,BamHI=B,KpnI=K,AvaII
=Av,SmaI=S,AluI=A RI=R,Bg
l II=G 118と呼ばれる組換えクローン(図3(b))は、一
般的な制限及び結合の方法を使用し、共通のRI部位を
通してクローンA36の3’部分とクローンG1の5’
部分を結合させることにより構成した。
たDNAは、交雑プライミング(上記参照)によるプロ
キモシンmRNAから得たcDNAだとはっきりしてい
る配列と一致している制限酵素の分解パターンを示して
いた。このような2つのクローンからのDNAは、それ
ぞれ完全なプロキモシン遺伝子の半分以上の長さであっ
た。DNAの一部分は、プロキモシンmRNAの3’部
位からプロキモシンmRNAの5’部位直前までの転写
の産物であり、転写は、オリゴ(dT)12〜18でプ
ライムされた。DNAの他の部分は、明らかにプロキモ
シンmRNAの3’部位直後からポリキモシンmRNA
の5’部位までの転写によって得られたものである。こ
れらのDNA片を含むこの2つのクローンは、それぞれ
B18とG1と呼び、クローンB18とG1からのDN
Aの縮尺制限部位地図 図3(a)に示す。この図は、
完全な遺伝子を作るための2つの部分的なプロキモシン
遺伝子を結合させるG1とB18から得たDNAの重な
り部分に存在している多くの制限部位を示している。図
3(a)と(b)において、制限部位は次のように表示
されている。 Pst=P,BamHI=B,KpnI=K,AvaII
=Av,SmaI=S,AluI=A RI=R,Bg
l II=G 118と呼ばれる組換えクローン(図3(b))は、一
般的な制限及び結合の方法を使用し、共通のRI部位を
通してクローンA36の3’部分とクローンG1の5’
部分を結合させることにより構成した。
【0041】マルクサムとギルバートの技術(Proc. Na
t. Acad. Sci. USA 74 560(1977))は、ク
ローン118の完全なヌクレチオド配列を明らかにする
ために使用されてきた。図3において、矢は、DNAの
配列が行われる部位と方向を示している。破線の矢は、
合成プライマの伸長により得られた配列である。この分
析の結果は、コード鎖の配列と、対応するアミノ酸配列
を示す図4に与えられている。
t. Acad. Sci. USA 74 560(1977))は、ク
ローン118の完全なヌクレチオド配列を明らかにする
ために使用されてきた。図3において、矢は、DNAの
配列が行われる部位と方向を示している。破線の矢は、
合成プライマの伸長により得られた配列である。この分
析の結果は、コード鎖の配列と、対応するアミノ酸配列
を示す図4に与えられている。
【0042】概して、このヌクレオチド配列は、このタ
ンパク質に対して以前に発表されたアミノ酸配列と一致
している。しかし、この発表された配列では、(図4に
星印で示す)アミノ酸202と214はアスパラギン酸
となっている。我々は、これらのアミノ酸は実際にはア
スパラギンであることを示した。アミノ酸を配列させる
普通の化学的技術は、よくアスパラギンをアスパラギン
酸と間違えるが、ヌクレオチド配列を行うことにより、
この混同は除去された。我々はまた、プロキモシンタン
パク質へのアミノ末端付加物の暗号となる短いヌクレオ
チド配列を見出した。このことは、プロキモシンが元は
プレプロキモシンとして作られたことを示唆している。
プロキモシンのこのような前駆体は、今まで報告されて
いなかったが、それは、細胞から出されたものであるこ
のようなタンパク質と関係があると考えられている多種
の他の分泌タンパク質(デイビス B. D. とタイ P−
C(1980)Nature 283 433−438)につ
いて見出された既知の主鎖に類似している。
ンパク質に対して以前に発表されたアミノ酸配列と一致
している。しかし、この発表された配列では、(図4に
星印で示す)アミノ酸202と214はアスパラギン酸
となっている。我々は、これらのアミノ酸は実際にはア
スパラギンであることを示した。アミノ酸を配列させる
普通の化学的技術は、よくアスパラギンをアスパラギン
酸と間違えるが、ヌクレオチド配列を行うことにより、
この混同は除去された。我々はまた、プロキモシンタン
パク質へのアミノ末端付加物の暗号となる短いヌクレオ
チド配列を見出した。このことは、プロキモシンが元は
プレプロキモシンとして作られたことを示唆している。
プロキモシンのこのような前駆体は、今まで報告されて
いなかったが、それは、細胞から出されたものであるこ
のようなタンパク質と関係があると考えられている多種
の他の分泌タンパク質(デイビス B. D. とタイ P−
C(1980)Nature 283 433−438)につ
いて見出された既知の主鎖に類似している。
【0043】組換えクローンから単離された完全なプロ
キモシン遺伝子(又はそれから得られた他のDNA構成
物)は、関連するタンパク質を充分に発現させるように
作られたベクターへ移動することができる。
キモシン遺伝子(又はそれから得られた他のDNA構成
物)は、関連するタンパク質を充分に発現させるように
作られたベクターへ移動することができる。
【0044】構造遺伝子をタンパク質へ翻訳するには、
発現されるべきタンパク質の最初のアミノ酸の暗号とな
るコドンとしての“出発”コドン(ATG)の存在が取
り分け要求される。タンパク質のアミノ酸配列は、コド
ンがATGであるメチオニン残基から始まるので、プレ
プロキモシンの発現は直ちに行なわれる。キモシンとプ
ロキモシンの発現は、引き続いては起り得ない。代わり
に、融合タンパク質が発現されなければならない。N末
端の付加タンパク質は、その最初のアミノ酸としてのメ
チオニングループを持つ小さなタンパク質から成ってい
る。次の例では、ATGコドンはキモシン又はプロキモ
シンに付着しており、その結果生じた発現タンパク質
は、それぞれメチオニン−キモシン(met−chymosin)
又はメチオニン−プロキモシン(met−prochymosin)で
ある。我々は、大腸菌そして酵母(サッカロミセス・セ
レビシエ)にもmet−キモシン、met−プロキモシン又は
プレプロキモシンを発現させるDNA構成物を調製し
た。
発現されるべきタンパク質の最初のアミノ酸の暗号とな
るコドンとしての“出発”コドン(ATG)の存在が取
り分け要求される。タンパク質のアミノ酸配列は、コド
ンがATGであるメチオニン残基から始まるので、プレ
プロキモシンの発現は直ちに行なわれる。キモシンとプ
ロキモシンの発現は、引き続いては起り得ない。代わり
に、融合タンパク質が発現されなければならない。N末
端の付加タンパク質は、その最初のアミノ酸としてのメ
チオニングループを持つ小さなタンパク質から成ってい
る。次の例では、ATGコドンはキモシン又はプロキモ
シンに付着しており、その結果生じた発現タンパク質
は、それぞれメチオニン−キモシン(met−chymosin)
又はメチオニン−プロキモシン(met−prochymosin)で
ある。我々は、大腸菌そして酵母(サッカロミセス・セ
レビシエ)にもmet−キモシン、met−プロキモシン又は
プレプロキモシンを発現させるDNA構成物を調製し
た。
【0045】A.大腸菌の発現プラスミドの構造 1.メチオニン−プロキモシンの発現 プラスミドA36(図3)を酵素PstIを用いで標準
状態で分解し、プロキモシン遺伝子の中央部分をもつク
ローン化された900個の塩基対を挿入した。DNA
は、酵素Bal31を用いた極く短時間(30秒)の分
解で大きく分解され、その結果生じた結合性のない末端
を持った分子と合成HindIII結合分子(C.C.
A.A.G.C.T.T.G.G.)は、T4 DNA
リガーゼを使用した標準状態においてそれらに結合し
た。この物質は、HindIIIで分解し、次に5%アク
リルアミドゲルで分離した。HindIII結合性末端を
持った900bp断片は、破砕と緩衝液における浸漬に
よりゲルから単離し、その後フェノールで抽出し、次に
エタノールで沈殿させた。それから、一般的方法により
HindIIIで切断されたpAT153に再クローン化
し、そして微生物のアルカリ性ホスファターゼで脱リン
酸した。この新しいプラスミドは、C5と命名された。
状態で分解し、プロキモシン遺伝子の中央部分をもつク
ローン化された900個の塩基対を挿入した。DNA
は、酵素Bal31を用いた極く短時間(30秒)の分
解で大きく分解され、その結果生じた結合性のない末端
を持った分子と合成HindIII結合分子(C.C.
A.A.G.C.T.T.G.G.)は、T4 DNA
リガーゼを使用した標準状態においてそれらに結合し
た。この物質は、HindIIIで分解し、次に5%アク
リルアミドゲルで分離した。HindIII結合性末端を
持った900bp断片は、破砕と緩衝液における浸漬に
よりゲルから単離し、その後フェノールで抽出し、次に
エタノールで沈殿させた。それから、一般的方法により
HindIIIで切断されたpAT153に再クローン化
し、そして微生物のアルカリ性ホスファターゼで脱リン
酸した。この新しいプラスミドは、C5と命名された。
【0046】C5 DNAを、HindIIIで分解し、
アルカリ性ホスファターゼで脱リン酸し、そしてRIで
分解すると、RI結合性部位に5’−リン酸塩とHin
dIII結合性部位に5’−水酸基を持つ断片(フラグメ
ントI)が生じた。
アルカリ性ホスファターゼで脱リン酸し、そしてRIで
分解すると、RI結合性部位に5’−リン酸塩とHin
dIII結合性部位に5’−水酸基を持つ断片(フラグメ
ントI)が生じた。
【0047】プラスミドB31(図3)をBam HI
で切断し、その結合性部位に2つの化学的に合成したオ
リゴヌクレオチド、1つは5’−水酸基末端を持ったも
の、もう1つは5’−リン酸末端を持ったもの、を結合
させた。これらは、前に合成cDNAプライマの合成の
ための方法として示した方法によって合成した。 OH−G.C.T.G.A.A.A.T.C.A,C.T.C.G. C.G.A.C.T.T.T,A.G.T.G.A.G.C.C.T.A.G−OP この結合により、プロキモシン遺伝子(図4)のヌクレ
オチド14を切断するBam HI分解によって除かれ
てなくなった配列が回復する。結合されたDNAはRI
で切断され、5’−水酸基を持った結合性のない部位と
5’−リン酸を持ったRI結合性部位があるポリキモシ
ンのアミノ末端部分を有する小さな断片(フラグメント
2)ができた。
で切断し、その結合性部位に2つの化学的に合成したオ
リゴヌクレオチド、1つは5’−水酸基末端を持ったも
の、もう1つは5’−リン酸末端を持ったもの、を結合
させた。これらは、前に合成cDNAプライマの合成の
ための方法として示した方法によって合成した。 OH−G.C.T.G.A.A.A.T.C.A,C.T.C.G. C.G.A.C.T.T.T,A.G.T.G.A.G.C.C.T.A.G−OP この結合により、プロキモシン遺伝子(図4)のヌクレ
オチド14を切断するBam HI分解によって除かれ
てなくなった配列が回復する。結合されたDNAはRI
で切断され、5’−水酸基を持った結合性のない部位と
5’−リン酸を持ったRI結合性部位があるポリキモシ
ンのアミノ末端部分を有する小さな断片(フラグメント
2)ができた。
【0048】フラグメント1(500ng)とフラグメ
ント2(280ng)は、T4 DNAリガーゼを使っ
て結合し、できたものは5%アクリルアミドゲルで溶解
した。1+2に対応する断片を切断し、前述したように
ゲルから抽出した。
ント2(280ng)は、T4 DNAリガーゼを使っ
て結合し、できたものは5%アクリルアミドゲルで溶解
した。1+2に対応する断片を切断し、前述したように
ゲルから抽出した。
【0049】この断片は、次にpCT54と呼ばれるプ
ラスミドにクローン化した(図5の制限地図参照)。こ
のプラスミドは、pAT153からそこに大腸菌trp
プロモータ/オペレータ断片と相T7転写終結断片を当
該技術分野ではよく知られていた技術を使用してクロー
ン化することにより得られる。それには、開始コドンと
リボソーム結合に重要ないわゆる“シャインとデルガー
ノ(Shine and Delgarno)断片”を含んでいる。開始部
位周辺にあるこのプラスミドのヌクレオチド配列は、以
下の通りである。
ラスミドにクローン化した(図5の制限地図参照)。こ
のプラスミドは、pAT153からそこに大腸菌trp
プロモータ/オペレータ断片と相T7転写終結断片を当
該技術分野ではよく知られていた技術を使用してクロー
ン化することにより得られる。それには、開始コドンと
リボソーム結合に重要ないわゆる“シャインとデルガー
ノ(Shine and Delgarno)断片”を含んでいる。開始部
位周辺にあるこのプラスミドのヌクレオチド配列は、以
下の通りである。
【0050】
【化1】
【0051】SD配列とATG間の制限酵素部位によっ
て、発現率を最大にする重要な要素であるATG−SD
距離の調節ができることになる。このプラスミドはま
た、丁度RI部位の3’辺りまでHindIII制限部位
を持っている。pCT54をRIで切断し、次にS1ヌ
クレアーゼで分解すると結合性のない末端ができる。1
0gのDNAを、0.3M NaCl、0.025M
NaAc(pH4.6)、0.001M ZnSO4を
含む緩衝液中、20℃で30分間、300単位のS1ヌ
クレアーゼを用いて分解した。溶液からフェノールを用
いてタンパク質を除去し、DNAはフェノールにより沈
殿させて回収した。
て、発現率を最大にする重要な要素であるATG−SD
距離の調節ができることになる。このプラスミドはま
た、丁度RI部位の3’辺りまでHindIII制限部位
を持っている。pCT54をRIで切断し、次にS1ヌ
クレアーゼで分解すると結合性のない末端ができる。1
0gのDNAを、0.3M NaCl、0.025M
NaAc(pH4.6)、0.001M ZnSO4を
含む緩衝液中、20℃で30分間、300単位のS1ヌ
クレアーゼを用いて分解した。溶液からフェノールを用
いてタンパク質を除去し、DNAはフェノールにより沈
殿させて回収した。
【0052】生じた結合性のない部位を持つ分子をSa
lIを用いて切断したら、上述したようなアクリルアミ
ドゲルから単離された短い結合性のない部分−SalI
断片ができた。更に、pCTをHindIIIとSalI
で切断すると大きなHindIII−SalI断片がで
き、これもアクリルアミドゲルから単離した。大きなH
indIII−SalI断片(90ng)、小さな結合性
のない部分−SalI断片(30ng)と再構成された
プロキモシン断片(1+2)は、T4 DNAリガーゼ
を用いて結合し、できたDNAを標準的な操作により大
腸菌HB101に形質転換した。8個のプロキモシンの
クローンを単離し、ATGコドン周辺を前述の方法によ
り配列させたとき、それらは、次のような全て同じヌク
レオチド配列を持っていることがわかった。
lIを用いて切断したら、上述したようなアクリルアミ
ドゲルから単離された短い結合性のない部分−SalI
断片ができた。更に、pCTをHindIIIとSalI
で切断すると大きなHindIII−SalI断片がで
き、これもアクリルアミドゲルから単離した。大きなH
indIII−SalI断片(90ng)、小さな結合性
のない部分−SalI断片(30ng)と再構成された
プロキモシン断片(1+2)は、T4 DNAリガーゼ
を用いて結合し、できたDNAを標準的な操作により大
腸菌HB101に形質転換した。8個のプロキモシンの
クローンを単離し、ATGコドン周辺を前述の方法によ
り配列させたとき、それらは、次のような全て同じヌク
レオチド配列を持っていることがわかった。
【0053】
【化2】
【0054】プラスミドはこのように、アミノ末端に付
加的メチオニン残基を持ったプロキモシンの完全なアミ
ノ酸配列の暗号となる配列を含んでいる。しかし、SD
とATG配列間の距離は大きすぎて、いい発現は得られ
ない。この距離は、上述したようなS1ヌクレアーゼを
用いた分解による、ClaI部位でのDNAの切断と結
合性のない種類のものを作ることにより減少させた。こ
のDNAは、T4 DNAとの再結合と大腸菌HB10
1への形質転換でpCT70と呼ばれるプラスミドがで
きた(図5の制限地図参照)。ATG周辺におけるこの
プラスミドDNA配列は次の通りである。
加的メチオニン残基を持ったプロキモシンの完全なアミ
ノ酸配列の暗号となる配列を含んでいる。しかし、SD
とATG配列間の距離は大きすぎて、いい発現は得られ
ない。この距離は、上述したようなS1ヌクレアーゼを
用いた分解による、ClaI部位でのDNAの切断と結
合性のない種類のものを作ることにより減少させた。こ
のDNAは、T4 DNAとの再結合と大腸菌HB10
1への形質転換でpCT70と呼ばれるプラスミドがで
きた(図5の制限地図参照)。ATG周辺におけるこの
プラスミドDNA配列は次の通りである。
【0055】
【化3】
【0056】pCT70からのmet.プロキモシンの
発現は、下記の通りである。2.メチオニン−キモシンの発現 キモシン発現ベクターの組み立ては、上述のプロキモシ
ンプラスミドpCT70から始まった。pCT70 D
NAは、DNAの切断が完全ではなく、また全長の線状
分子が主生成物であるという条件下で、BclIを用い
て分解した。これらの切断は、pCT70におけるどち
らのBclI部位においてもできたのである。引き続い
て最大断片の分別と単離を行うことになる、RIを用い
たDNAの分解により、得た種類のものがmet−プロキ
モシン遺伝子周辺にあるRI部位から遺伝子の出発点に
一番近いBclI部位まで伸びていることが確実になっ
た。met−キモシン遺伝子を完全なものにするのに必要
な小さな断片は、プロキモシン遺伝子をRI部位へ(位
置14にあるBam部位から3’部位へ)次のような化
学的に合成した結合剤を使用して挿入することにより、
pCT54から得たプラスミドpCT57(図5)から
得た。
発現は、下記の通りである。2.メチオニン−キモシンの発現 キモシン発現ベクターの組み立ては、上述のプロキモシ
ンプラスミドpCT70から始まった。pCT70 D
NAは、DNAの切断が完全ではなく、また全長の線状
分子が主生成物であるという条件下で、BclIを用い
て分解した。これらの切断は、pCT70におけるどち
らのBclI部位においてもできたのである。引き続い
て最大断片の分別と単離を行うことになる、RIを用い
たDNAの分解により、得た種類のものがmet−プロキ
モシン遺伝子周辺にあるRI部位から遺伝子の出発点に
一番近いBclI部位まで伸びていることが確実になっ
た。met−キモシン遺伝子を完全なものにするのに必要
な小さな断片は、プロキモシン遺伝子をRI部位へ(位
置14にあるBam部位から3’部位へ)次のような化
学的に合成した結合剤を使用して挿入することにより、
pCT54から得たプラスミドpCT57(図5)から
得た。
【0057】(5')A.A.T.T.C.T.A.T.C.A.C.T.C.G. G.A.T.A.G.T.G.A.G.C.C.T.A.G.(5') この結合剤は、N末端に自然のアミノ酸配列とは異なる
3個のアミノ酸配列(即ち、擬似プロキモシン)を与え
る。pCT57プラスミドDNAをBalIで制限し、
次のような化学的に合成した結合剤分子をT4 DNA
リガーゼを用いて、断片の結合性のないBalI部分に
結合させた。
3個のアミノ酸配列(即ち、擬似プロキモシン)を与え
る。pCT57プラスミドDNAをBalIで制限し、
次のような化学的に合成した結合剤分子をT4 DNA
リガーゼを用いて、断片の結合性のないBalI部分に
結合させた。
【0058】 OH−G.A.T.C.A.A.T.G.G.G.T.G.A.A.G.T.A.G. T.T.A.C.C.C.A.C.T.T.C.A.T.C.−OP 新しい断片の5’−G.A.T.C 部分は、Bam
HI又はBclI又はBglII分解からの結合性のある
部分に結合させることができる。DNAは、RIを用い
て更に制限され、次のような断片が生じた。
HI又はBclI又はBglII分解からの結合性のある
部分に結合させることができる。DNAは、RIを用い
て更に制限され、次のような断片が生じた。
【0059】
【化4】
【0060】これには開始ATGとRI部位までのキモ
シン配列の暗号となるヌクレオチドを含んでいる。この
断片は、アクリルアミドゲルから単離した。pCT70
(90ng)の大きなRI−BclI断片と小さなRI
−GATC断片(10ng)を一緒に結合させるとBc
lIと関連するpCT86とよばれるプラスミドが出来
た。このSDからATG部域にあるDNA配列は、一般
的な方法により次のように決定された。
シン配列の暗号となるヌクレオチドを含んでいる。この
断片は、アクリルアミドゲルから単離した。pCT70
(90ng)の大きなRI−BclI断片と小さなRI
−GATC断片(10ng)を一緒に結合させるとBc
lIと関連するpCT86とよばれるプラスミドが出来
た。このSDからATG部域にあるDNA配列は、一般
的な方法により次のように決定された。
【0061】
【化5】
【0062】3.プレプロキモシンの発現 118(図3)と呼ばれるプラスミドは標準状態におい
てAvaIIにより分解した。これにより断片上の−14
から+242(図4)までのヌクレオチドからプレプロ
キモシン配列の5’末端が離れる。この断片の末端は次
の通り相補的である。 G.A.C.C.C. Bgl II T.C.G. G.G. A.G.C.C.T.G. 化学的に合成された結合剤分子(PG.T.C.T.
G.A.T.C.A.)はこの分子の一端にT4 DN
Aで結合し、次の構造をもった断片ができた。
てAvaIIにより分解した。これにより断片上の−14
から+242(図4)までのヌクレオチドからプレプロ
キモシン配列の5’末端が離れる。この断片の末端は次
の通り相補的である。 G.A.C.C.C. Bgl II T.C.G. G.G. A.G.C.C.T.G. 化学的に合成された結合剤分子(PG.T.C.T.
G.A.T.C.A.)はこの分子の一端にT4 DN
Aで結合し、次の構造をもった断片ができた。
【0063】この断片は、DNAポリメラーゼIにより
処理されて結合性末端を充填し次にBclI及びBgl
IIを以て切断されて両末端に5’G.A.T.C.末端
を具えた260bp切断を生じた。pCT57 DNA
は部分的分解の条件のもとでBclIで切断され、次に
該全長直線状分子はBglIIで完全に分解された。1個
だけのBglII部位周辺から該ATGの近くのBclI
部位まで続く大きい断片は前述のように、ゲルから分離
された。この大きい断片(100ng)は結合により小
さい260bp断片(100ng)に結合されてプレプ
ロキモシンの暗号となるのに必要なすべての配列を含む
pCT82と呼ばれるプラスミドができる。断片260
bpは大きいBclI−BglII断片へ両方向から結合
することができるが、正しい配向によれば、BclI及
びBglIIの両部位が再生するが、間違った配向によれ
ば何れも再生しない。このように、正しい配向は制限地
図をつくることによって容易に選び出すことができる。
pCT82は該再生部位の両方を含むことが判明した
が、開始部位の周りのヌクレオチド配列は次の通りであ
ることが判明した:
処理されて結合性末端を充填し次にBclI及びBgl
IIを以て切断されて両末端に5’G.A.T.C.末端
を具えた260bp切断を生じた。pCT57 DNA
は部分的分解の条件のもとでBclIで切断され、次に
該全長直線状分子はBglIIで完全に分解された。1個
だけのBglII部位周辺から該ATGの近くのBclI
部位まで続く大きい断片は前述のように、ゲルから分離
された。この大きい断片(100ng)は結合により小
さい260bp断片(100ng)に結合されてプレプ
ロキモシンの暗号となるのに必要なすべての配列を含む
pCT82と呼ばれるプラスミドができる。断片260
bpは大きいBclI−BglII断片へ両方向から結合
することができるが、正しい配向によれば、BclI及
びBglIIの両部位が再生するが、間違った配向によれ
ば何れも再生しない。このように、正しい配向は制限地
図をつくることによって容易に選び出すことができる。
pCT82は該再生部位の両方を含むことが判明した
が、開始部位の周りのヌクレオチド配列は次の通りであ
ることが判明した:
【0064】
【化6】
【0065】該構造の中のSDからATCまでの距離に
は28個の塩基がある。これは該分子をBcl I部位
で切断し、次いでBal 31ヌクレアーゼによる短時
間の分解で数個の塩基を取り除くことにより減少した。
この酵素を両方向から分解すると、結合性のない末端が
できたが、これは種々な値のSDからATGの距離をも
った種類のものを作るために再結合した。
は28個の塩基がある。これは該分子をBcl I部位
で切断し、次いでBal 31ヌクレアーゼによる短時
間の分解で数個の塩基を取り除くことにより減少した。
この酵素を両方向から分解すると、結合性のない末端が
できたが、これは種々な値のSDからATGの距離をも
った種類のものを作るために再結合した。
【0066】B. 酵母の発現プラスミドの構造 酵母中で発現に使用されるプラスミド(サッカロミセス
・セレビシエ)は、pBR 322及び酵母2ミクロン
プラスミドに基づいている。それらは同時に係属してい
る英国特許出願第8125934号の主題であり、一般
的なベクターの部分制限地図を図6に示す。酵母ホスホ
グリセリン酸キナーゼ遺伝子(PGK)は転写開始に必
要な5’配列を与え、遺伝子の挿入は1個のBam H
I部位で行うことができる。大腸菌のすべてのDNA構
造が、遺伝子全体がBcl I−Bcl I断片のよう
に切断し得るようにつくられたのはこの理由によるもの
であり、この断片はBam HI部位に適合できる5’
−G.A.T.C.末端をもつ。met.キモシン、m
et.プロキモシン及びプレプロキモシンの遺伝子は、
pCT 86,pCT 70及びpCT 82からBc
l I分解によってそれぞれ切り取られ、そしてpMA
278又はpMA 230に結合される。これら2つ
のプラスミドにおける挿入部位の周りのDNA配列は図
7に示す。
・セレビシエ)は、pBR 322及び酵母2ミクロン
プラスミドに基づいている。それらは同時に係属してい
る英国特許出願第8125934号の主題であり、一般
的なベクターの部分制限地図を図6に示す。酵母ホスホ
グリセリン酸キナーゼ遺伝子(PGK)は転写開始に必
要な5’配列を与え、遺伝子の挿入は1個のBam H
I部位で行うことができる。大腸菌のすべてのDNA構
造が、遺伝子全体がBcl I−Bcl I断片のよう
に切断し得るようにつくられたのはこの理由によるもの
であり、この断片はBam HI部位に適合できる5’
−G.A.T.C.末端をもつ。met.キモシン、m
et.プロキモシン及びプレプロキモシンの遺伝子は、
pCT 86,pCT 70及びpCT 82からBc
l I分解によってそれぞれ切り取られ、そしてpMA
278又はpMA 230に結合される。これら2つ
のプラスミドにおける挿入部位の周りのDNA配列は図
7に示す。
【0067】1. 大腸菌における発現 プロトコール 各種の遺伝子の発現に対するプロトコールは、使用され
るすべてのプラスミドベクターのそれと同じである。研
究中のプラスミドを含有する大腸菌(HB 101又は
RV 308)の1晩培養したばかりの10mlの培養
物をL−培養基で(ミラー.J. H. (1972) Experim
ente in Molecular Genetics. コールドスプリングハー
バーラボラトリ,ニューヨーク,p.433)アムピシ
リンを100μg/mlまで補充して培養した。この培
養物の1:100稀釈物がカサミノ酸、グルコース、ビ
タミンB1及びアムピシリンを補充したM9培地(ミラ
ー.J. H. (1972))へ入れられる“抑制”培地は
40〜100g/mlのL−トリプトファンを含み、そ
して“誘導”培地は特異的トリプトファン誘導物質−9
0分の培養の後に加えられた特異的なインドールアクリ
ル酸の10g/mlを含有する。該培養物には37℃で
振動を与え、全培養時間は3〜4時間であった。この時
間経過後に、細胞は遠心分離により収集し、10%(w
/v)グリセリン、3%(w/v)SDS、5%(w/
v)メルカプトエタノールを含有する60mM tris p
H 6.8の緩衝液の中で沸騰させて溶解した。分離され
たタンパク質は、12.5%アクリルアミド/SDSゲ
ル上で分析した。(Laemmli. 英国(1979).NATUR
E 227(680〜685))。該ゲルはタンパク質帯
を目視するためにクーマッシブリリアントブルーで着色
した。或る実験においては、新規に合成されたタンパク
質が35S−メチオニンでラベルされた。このために、該
ラベルされたアミノ酸が最終濃度が20〜30μC1/
mlとなるよう3時間半の培養の後に加えられ、該細胞
が回収され溶解されるまで更に15〜30分間培養は続
けられた。ラベルされたタンパク質はアクリルアミドゲ
ルの上で、オートラジオグラフィによりフジ−RXフィ
ルム上に検出された。
るすべてのプラスミドベクターのそれと同じである。研
究中のプラスミドを含有する大腸菌(HB 101又は
RV 308)の1晩培養したばかりの10mlの培養
物をL−培養基で(ミラー.J. H. (1972) Experim
ente in Molecular Genetics. コールドスプリングハー
バーラボラトリ,ニューヨーク,p.433)アムピシ
リンを100μg/mlまで補充して培養した。この培
養物の1:100稀釈物がカサミノ酸、グルコース、ビ
タミンB1及びアムピシリンを補充したM9培地(ミラ
ー.J. H. (1972))へ入れられる“抑制”培地は
40〜100g/mlのL−トリプトファンを含み、そ
して“誘導”培地は特異的トリプトファン誘導物質−9
0分の培養の後に加えられた特異的なインドールアクリ
ル酸の10g/mlを含有する。該培養物には37℃で
振動を与え、全培養時間は3〜4時間であった。この時
間経過後に、細胞は遠心分離により収集し、10%(w
/v)グリセリン、3%(w/v)SDS、5%(w/
v)メルカプトエタノールを含有する60mM tris p
H 6.8の緩衝液の中で沸騰させて溶解した。分離され
たタンパク質は、12.5%アクリルアミド/SDSゲ
ル上で分析した。(Laemmli. 英国(1979).NATUR
E 227(680〜685))。該ゲルはタンパク質帯
を目視するためにクーマッシブリリアントブルーで着色
した。或る実験においては、新規に合成されたタンパク
質が35S−メチオニンでラベルされた。このために、該
ラベルされたアミノ酸が最終濃度が20〜30μC1/
mlとなるよう3時間半の培養の後に加えられ、該細胞
が回収され溶解されるまで更に15〜30分間培養は続
けられた。ラベルされたタンパク質はアクリルアミドゲ
ルの上で、オートラジオグラフィによりフジ−RXフィ
ルム上に検出された。
【0068】2. 発現実験 組み換えプラスミドから得られた発現のレベル及び使用
した精製方法のレベルはメチオニンプロキモシンを発現
するプラスミドpCT 70の場合を考慮して実証して
よい。pCT 70を含有するHB 101細胞は上記
した如く誘導条件のもとで育成され、合成されたタンパ
ク質はSDS/アクリルアミドゲルの上で検査された。
該培養物は振動フラスコ(図8)又は10リットル発酵
容器(図9)の中で育成された。図8には0〜5時間発
酵の間にpCT 70により生産された全大腸菌タンパ
ク質のTris−SDSゲルを示す。細胞は5時間後に
はM9培地の中でOD600=1.0にまで生長した。
“S”行は本物の子牛のプロキモシン2μgを含有する
コントロールである。図9には、図8の媒質中で24時
間の発酵期間pCT 70により生産された全大腸菌の
Tris−SDSゲルを示す。発酵は溶解酸素制御50
%(±10%)自動発泡制御、37℃、5リットル容積
でpH=7.2において行われた。9時間後にはOD
600=2.7に達した。“S”行は本物の子牛のプロキ
モシン2μgを含有するコントロールである。両実験
中、本物の子牛のプロキモシンの位置に移動するタンパ
ク質バンドは容易に判る。pCT 70を含有する細胞
及びpCT 54(親プラスミド)を含有する細胞から
のタンパク質産物は、同様に2元ゲルエレクトロフォレ
シス(ビー・エイチ・オッファレル(1975)J. Bio
l. Chem. 250 4007〜4021)により検査し
た。図10参照。図10において、矢印した点“A”は
pCT 70及びpCT 54の両方に共通の標識タン
パク質スポットを指示する。 EPC70(pCT 70
により大腸菌中で生産されたプロキモシン)に対応する
点を図10a中に矢印で示す。破線は図10a中のゲル
に加えられたラベルされていない本物の子牛のプロキモ
シンの位置をあらわす。小さい培養物は35S−メチオニ
ンでラベルされ、全タンパク質は記載した如く分析され
た。pCT 70を担持する細胞の中には明らかに見え
る余分のタンパク質があり、これが細胞外から加えられ
たラベルされていない子牛のプロキモシンと共に移動す
ることが示された。該ゲル分析から我々は、全大腸菌タ
ンパク質の約5%がこれらの細胞の中でメチオニンプロ
キモシンとして発現されたものと概算する。生産物の同
定は、本物の子牛のキモシン及びプロキモシンに対して
調製されたポリクローナル抗血清を使用して、更に抗体
沈澱により行なわれた。35S−メチオニンでラベルされ
たHB 101/pCT 70からの全タンパク質抽出
物は、これらの抗血清で処理され、そして免疫的に沈澱
したタンパク質はアクリルアミド/SDSゲル上で検査
された。図11はこの沈澱実験の結果を示す。図におい
てゲル上のトラックは次の通りである: a)〔35S〕メチオニンでラベルされた全pCTタンパ
ク質; b)〔35S〕メチオニンでラベルされた全pCTタンパ
ク質からアンチプロキモシンポリクローナル抗体により
沈澱したタンパク質; c)b)と同様で、余分の本物の子牛のプロキモシン
(Ac PC)の存在する場合: d)ラベルされない本物の子牛のプロキモシン(Ac
PC)の移動位置。 上記pCT抽出物中の余分のタンパク質は、両抗血清に
より選択的に沈澱され、該沈澱は過剰の本物の子牛のキ
モシンを加えることによって除去することができた。か
ように、この新しいタンパク質は、その分子量、荷重的
特徴及び免疫的決定部位について本物の子牛のプロキモ
シンと差別できない。
した精製方法のレベルはメチオニンプロキモシンを発現
するプラスミドpCT 70の場合を考慮して実証して
よい。pCT 70を含有するHB 101細胞は上記
した如く誘導条件のもとで育成され、合成されたタンパ
ク質はSDS/アクリルアミドゲルの上で検査された。
該培養物は振動フラスコ(図8)又は10リットル発酵
容器(図9)の中で育成された。図8には0〜5時間発
酵の間にpCT 70により生産された全大腸菌タンパ
ク質のTris−SDSゲルを示す。細胞は5時間後に
はM9培地の中でOD600=1.0にまで生長した。
“S”行は本物の子牛のプロキモシン2μgを含有する
コントロールである。図9には、図8の媒質中で24時
間の発酵期間pCT 70により生産された全大腸菌の
Tris−SDSゲルを示す。発酵は溶解酸素制御50
%(±10%)自動発泡制御、37℃、5リットル容積
でpH=7.2において行われた。9時間後にはOD
600=2.7に達した。“S”行は本物の子牛のプロキ
モシン2μgを含有するコントロールである。両実験
中、本物の子牛のプロキモシンの位置に移動するタンパ
ク質バンドは容易に判る。pCT 70を含有する細胞
及びpCT 54(親プラスミド)を含有する細胞から
のタンパク質産物は、同様に2元ゲルエレクトロフォレ
シス(ビー・エイチ・オッファレル(1975)J. Bio
l. Chem. 250 4007〜4021)により検査し
た。図10参照。図10において、矢印した点“A”は
pCT 70及びpCT 54の両方に共通の標識タン
パク質スポットを指示する。 EPC70(pCT 70
により大腸菌中で生産されたプロキモシン)に対応する
点を図10a中に矢印で示す。破線は図10a中のゲル
に加えられたラベルされていない本物の子牛のプロキモ
シンの位置をあらわす。小さい培養物は35S−メチオニ
ンでラベルされ、全タンパク質は記載した如く分析され
た。pCT 70を担持する細胞の中には明らかに見え
る余分のタンパク質があり、これが細胞外から加えられ
たラベルされていない子牛のプロキモシンと共に移動す
ることが示された。該ゲル分析から我々は、全大腸菌タ
ンパク質の約5%がこれらの細胞の中でメチオニンプロ
キモシンとして発現されたものと概算する。生産物の同
定は、本物の子牛のキモシン及びプロキモシンに対して
調製されたポリクローナル抗血清を使用して、更に抗体
沈澱により行なわれた。35S−メチオニンでラベルされ
たHB 101/pCT 70からの全タンパク質抽出
物は、これらの抗血清で処理され、そして免疫的に沈澱
したタンパク質はアクリルアミド/SDSゲル上で検査
された。図11はこの沈澱実験の結果を示す。図におい
てゲル上のトラックは次の通りである: a)〔35S〕メチオニンでラベルされた全pCTタンパ
ク質; b)〔35S〕メチオニンでラベルされた全pCTタンパ
ク質からアンチプロキモシンポリクローナル抗体により
沈澱したタンパク質; c)b)と同様で、余分の本物の子牛のプロキモシン
(Ac PC)の存在する場合: d)ラベルされない本物の子牛のプロキモシン(Ac
PC)の移動位置。 上記pCT抽出物中の余分のタンパク質は、両抗血清に
より選択的に沈澱され、該沈澱は過剰の本物の子牛のキ
モシンを加えることによって除去することができた。か
ように、この新しいタンパク質は、その分子量、荷重的
特徴及び免疫的決定部位について本物の子牛のプロキモ
シンと差別できない。
【0069】3. 精 製 我々は大腸菌からメチオニンプロキモシンを分解する単
純な精製方法を考案化した。誘導条件下で育成した凍結
大腸菌/pCT 70細胞は、その重量の3倍の0.0
5M tris−HCl pH8, 1mM EDT
A, 0.23MNaCl, 130μg/mlのリゾ
チームを含有する10%グリセリン(v/v)の中に懸
濁し、該懸濁液を4℃で20分間培養した。ジオキシ塩
化ナトリウムを最終濃度0.05%となるまで加え、そ
してDNAアーゼI(牛類の膵臓)10μgを大腸菌開
始材料1gにつき加えた。該溶液を15℃で30分間培
養し、その時間により該溶液の粘度は顕著に減少した。
0.01M tris pH8, 0.1mM EDT
A, 5%グリセリンを含有する溶液を等量加え、該抽
出物は45分間、4℃において10000gで遠心分離
した。上記の如く更に遠心分離を行った後、上澄み液を
除去し、ペレットを室温において、8M尿素又は6Mグ
アニジンハイドロクロライド,0.05M HCl p
H8, 1mM EDTA及び0.1M NaClを含
有する緩衝液の中で急速に溶解した。次に終夜4℃にお
いて200倍溶積の0.01M tris. HCl
pH8, 1mM EDTA, 0.1M NaCl及
び10%グリセリンに対して透析を行った。重い沈澱物
が形成され(大腸菌タンパク質に不溶)が、これを遠心
分離により除いて約75%の純度のメチオニンプロキモ
シンの溶液を残した。図12は精製の初期の工程におけ
る種々な分画のTris−SDSゲルを示す。4個のト
ラックは: a)本物の子牛のプロキモシン(Ac PC): b)大腸菌pCT 70の細胞ペレット部分に存在する
タンパク質: c)大腸菌の中でpCT 70により作られたプロキモ
シン(EPC70)の細胞断片ペレット分画の中で発見さ
れた不溶性タンパク質(変性/変性よりもとへ戻した
後): d)大腸菌の中でpCT 70により作られたプロキモ
シン(EPC70)の細胞断片ペレット分画の中で発見さ
れた可溶性タンパク質。
純な精製方法を考案化した。誘導条件下で育成した凍結
大腸菌/pCT 70細胞は、その重量の3倍の0.0
5M tris−HCl pH8, 1mM EDT
A, 0.23MNaCl, 130μg/mlのリゾ
チームを含有する10%グリセリン(v/v)の中に懸
濁し、該懸濁液を4℃で20分間培養した。ジオキシ塩
化ナトリウムを最終濃度0.05%となるまで加え、そ
してDNAアーゼI(牛類の膵臓)10μgを大腸菌開
始材料1gにつき加えた。該溶液を15℃で30分間培
養し、その時間により該溶液の粘度は顕著に減少した。
0.01M tris pH8, 0.1mM EDT
A, 5%グリセリンを含有する溶液を等量加え、該抽
出物は45分間、4℃において10000gで遠心分離
した。上記の如く更に遠心分離を行った後、上澄み液を
除去し、ペレットを室温において、8M尿素又は6Mグ
アニジンハイドロクロライド,0.05M HCl p
H8, 1mM EDTA及び0.1M NaClを含
有する緩衝液の中で急速に溶解した。次に終夜4℃にお
いて200倍溶積の0.01M tris. HCl
pH8, 1mM EDTA, 0.1M NaCl及
び10%グリセリンに対して透析を行った。重い沈澱物
が形成され(大腸菌タンパク質に不溶)が、これを遠心
分離により除いて約75%の純度のメチオニンプロキモ
シンの溶液を残した。図12は精製の初期の工程におけ
る種々な分画のTris−SDSゲルを示す。4個のト
ラックは: a)本物の子牛のプロキモシン(Ac PC): b)大腸菌pCT 70の細胞ペレット部分に存在する
タンパク質: c)大腸菌の中でpCT 70により作られたプロキモ
シン(EPC70)の細胞断片ペレット分画の中で発見さ
れた不溶性タンパク質(変性/変性よりもとへ戻した
後): d)大腸菌の中でpCT 70により作られたプロキモ
シン(EPC70)の細胞断片ペレット分画の中で発見さ
れた可溶性タンパク質。
【0070】残りの不純物は、DEAE−セルロース上
のクロマトグラフィにより又はUltrogel AcA 54上の
ゲル濾過によって除去してよい。
のクロマトグラフィにより又はUltrogel AcA 54上の
ゲル濾過によって除去してよい。
【0071】4. 活性化 プロキモシンは大腸菌抽出物の存在のもとに活性pHに
さらすことによって活性キモシンへと活性化することが
できる。該抽出物は20℃において1M塩酸を加えてp
H2とし、その混合物を静かに1時間撹拌する。重い沈
澱物が形成され、これは低速で遠心分離して除去する。
澄んだ上澄み液は20℃において、2Mtris pH
8を追加してpH6に調整する。ブラッドフォード法
(Anal.Biochem. (1976)72 248)によるタ
ンパク質決定は、該酸処理は抽出物中の大腸菌タンパク
質の90%を除去することを示す。ある実験において
は、本物の子牛のプロキモシン4mgを大腸菌K12の澄
ました原抽出物の2.4mlと混合した。この混合物を
酸性化し、遠心分離し、そして中和した。次にそれを
0.025M NaP, 0.1M NaCP pH6
で平衡されたUltrogel AcA 54の2.4×83cmカ
ラムに、4℃において15ml/hrの速度で使用し
た。2.5mlの部分を収集し且つキモシン活性及び吸
収について試験を行った。260nm及び280nmに
おける吸収は収集した各部分に対して行なわれた。吸収
測定の結果は、図13にグラフで示す。該グラフはキモ
シン部分(マークした)の異物質部分からの良好な分離
を示す。該キモシン活性測定(図示せず)はキモシンに
対する吸収のピークに対応する。キモシンの凝固活性に
対する回復は40%であった。
さらすことによって活性キモシンへと活性化することが
できる。該抽出物は20℃において1M塩酸を加えてp
H2とし、その混合物を静かに1時間撹拌する。重い沈
澱物が形成され、これは低速で遠心分離して除去する。
澄んだ上澄み液は20℃において、2Mtris pH
8を追加してpH6に調整する。ブラッドフォード法
(Anal.Biochem. (1976)72 248)によるタ
ンパク質決定は、該酸処理は抽出物中の大腸菌タンパク
質の90%を除去することを示す。ある実験において
は、本物の子牛のプロキモシン4mgを大腸菌K12の澄
ました原抽出物の2.4mlと混合した。この混合物を
酸性化し、遠心分離し、そして中和した。次にそれを
0.025M NaP, 0.1M NaCP pH6
で平衡されたUltrogel AcA 54の2.4×83cmカ
ラムに、4℃において15ml/hrの速度で使用し
た。2.5mlの部分を収集し且つキモシン活性及び吸
収について試験を行った。260nm及び280nmに
おける吸収は収集した各部分に対して行なわれた。吸収
測定の結果は、図13にグラフで示す。該グラフはキモ
シン部分(マークした)の異物質部分からの良好な分離
を示す。該キモシン活性測定(図示せず)はキモシンに
対する吸収のピークに対応する。キモシンの凝固活性に
対する回復は40%であった。
【0072】5. 試験手続 我々は、マイクロ滴定プレート内で一定時間培養を行う
ことになるキモシンの活性試験に対する迅速なマイクロ
方法を考案した。乾燥したスキムミルク12gを100
mlの20mM塩化カルシウムの中に溶解し、室温で6
0分間放置する。燐酸ナトリウムのpH6.3の緩衝液
50μlをマイクロ滴定プレートの各ウエールに入れ、
各種サンプル50μlを第1列のウエールに入れ、プレ
ートを横切って一連の稀釈を行う。該ミルクの溶液と該
稀釈したサンプルを含有するマイクロ滴定プレートを3
7℃において培養する;ミルクの溶液50μlを各ウエ
ールに加えてプレートを培養器に戻す。15分後、該プ
レートを取り出してシンクの上にくつがえすと、液体の
ミルクは流れ落ちて凝固したウエールがそのままのこ
る。一連の稀釈における凝固したウエールの数が原溶液
中のキモシン活性の分量を示す。凝固したマイクロ滴定
プレートは複写機でコピーして試験の記録を保存する。
この記録では15分間の培養においてキモシン24ナノ
グラムの検出が可能である。もっと低い量はこの培養時
間を増加することによって検出することができる。大腸
菌抽出物はミルクを凝固させないし又凝固を抑制するこ
ともしない。該試験はEDTA(<5mM),DTT
(<10mM),グリセリン(<1.25% v/
v),テトラ−N−ブチルアンモニウムハイドロオキサ
イド(<0.2M)を含有する大ていの共通の緩衝コン
ポーネントに対しては鋭敏ではない。しかしながら、若
干の溶剤、Tween80(すべての濃度),Nanidet NP
−40(0.08% v/vにおいて50%活性)、
ジオキシ塩化ナトリウム(0.06% v/vに対し鋭
敏)、SDS(0.01%に対し鋭敏)、に対しては非
常に鋭敏である。該試験は0.015M(NaCl)が
塩類の最適条件であり、且つpHの5〜6.80間の変
動に対しては鋭敏ではない。
ことになるキモシンの活性試験に対する迅速なマイクロ
方法を考案した。乾燥したスキムミルク12gを100
mlの20mM塩化カルシウムの中に溶解し、室温で6
0分間放置する。燐酸ナトリウムのpH6.3の緩衝液
50μlをマイクロ滴定プレートの各ウエールに入れ、
各種サンプル50μlを第1列のウエールに入れ、プレ
ートを横切って一連の稀釈を行う。該ミルクの溶液と該
稀釈したサンプルを含有するマイクロ滴定プレートを3
7℃において培養する;ミルクの溶液50μlを各ウエ
ールに加えてプレートを培養器に戻す。15分後、該プ
レートを取り出してシンクの上にくつがえすと、液体の
ミルクは流れ落ちて凝固したウエールがそのままのこ
る。一連の稀釈における凝固したウエールの数が原溶液
中のキモシン活性の分量を示す。凝固したマイクロ滴定
プレートは複写機でコピーして試験の記録を保存する。
この記録では15分間の培養においてキモシン24ナノ
グラムの検出が可能である。もっと低い量はこの培養時
間を増加することによって検出することができる。大腸
菌抽出物はミルクを凝固させないし又凝固を抑制するこ
ともしない。該試験はEDTA(<5mM),DTT
(<10mM),グリセリン(<1.25% v/
v),テトラ−N−ブチルアンモニウムハイドロオキサ
イド(<0.2M)を含有する大ていの共通の緩衝コン
ポーネントに対しては鋭敏ではない。しかしながら、若
干の溶剤、Tween80(すべての濃度),Nanidet NP
−40(0.08% v/vにおいて50%活性)、
ジオキシ塩化ナトリウム(0.06% v/vに対し鋭
敏)、SDS(0.01%に対し鋭敏)、に対しては非
常に鋭敏である。該試験は0.015M(NaCl)が
塩類の最適条件であり、且つpHの5〜6.80間の変
動に対しては鋭敏ではない。
【0073】本発明に用いるメチオニン−プロキモシン
の暗号となる遺伝子は、プロキモシン、プレプロキモシ
ン、メチオニン−キモシンの暗号となる遺伝子に比べて
形質転換における活性が高く、キモシン生成のために開
裂させるべきメチオニン−プロキモシンを遺伝子工学的
に得ることができる。
の暗号となる遺伝子は、プロキモシン、プレプロキモシ
ン、メチオニン−キモシンの暗号となる遺伝子に比べて
形質転換における活性が高く、キモシン生成のために開
裂させるべきメチオニン−プロキモシンを遺伝子工学的
に得ることができる。
【図1】図1は、組換えキモシン、プロキモシン、プレ
プロキモシン、プラスミドベクターの構成を示す模式図
である。
プロキモシン、プラスミドベクターの構成を示す模式図
である。
【図2】図2は、合成オリゴヌクレオチドの特異的プラ
イマを用いたmRNAの転写によって得られたcDNA
のヌクレオチド配列を示すものである。
イマを用いたmRNAの転写によって得られたcDNA
のヌクレオチド配列を示すものである。
【図3】図3は、(a)に得られた幾つかのクローンの
制限酵素の地図を示し、(b)にクローン118の制限
酵素の地図を示すものである。
制限酵素の地図を示し、(b)にクローン118の制限
酵素の地図を示すものである。
【図4】図4は、(プロキモシンmRNAとキモシンm
RNAの配列を含んだ)プレプロキモシンmRNAの完
全なヌクレオチド配列を示すものである。
RNAの配列を含んだ)プレプロキモシンmRNAの完
全なヌクレオチド配列を示すものである。
【図5】図5は、大腸菌におけるメチオニン−キモシ
ン、メチオニン−プロキモシンそれにプレプロキモシン
の発現のために構成されたプラスミドベクターの制限地
図を示すものである。
ン、メチオニン−プロキモシンそれにプレプロキモシン
の発現のために構成されたプラスミドベクターの制限地
図を示すものである。
【図6】図6は、酵母におけるメチオニン−キモシン、
メチオニン−プロキモシンそれにプレプロキモシンの発
現に使用されるプラスミドベクターの模式図である。
メチオニン−プロキモシンそれにプレプロキモシンの発
現に使用されるプラスミドベクターの模式図である。
【図7】図7は、酵母における発現に使用される、プラ
スミドにあるBam HI挿入部位周辺のDNA配列を
示すものである。
スミドにあるBam HI挿入部位周辺のDNA配列を
示すものである。
【図8】図8は、しんとうフラスコによる発酵の後、H
B101中でpCT70によって生産された全大腸菌タ
ンパク質のTris−SDSゲルクロマトグラフィを示
すものである。
B101中でpCT70によって生産された全大腸菌タ
ンパク質のTris−SDSゲルクロマトグラフィを示
すものである。
【図9】図9は、10リットル発酵器で発酵させた後p
CT70によって生産された全大腸菌タンパク質のTr
is−SDSゲルクロマトグラフィを示すものである。
CT70によって生産された全大腸菌タンパク質のTr
is−SDSゲルクロマトグラフィを示すものである。
【図10】図10は、(a)にpCT70からの35S−
メチオニンでラベルした全大腸菌タンパク質の等電集束
/Tris−SDSゲルクロマトグラフィを、また
(b)にはpCT54からの35S−メチオニンでラベル
した全大腸菌タンパク質の等電集束/Tris−SDS
ゲルクロマトグラフィを示すものである。
メチオニンでラベルした全大腸菌タンパク質の等電集束
/Tris−SDSゲルクロマトグラフィを、また
(b)にはpCT54からの35S−メチオニンでラベル
した全大腸菌タンパク質の等電集束/Tris−SDS
ゲルクロマトグラフィを示すものである。
【図11】図11は、抗子牛プロキモシンポリクローン
化抗血清によって大腸菌の中のpCT70により生産さ
れたプロキモシンの沈殿を伴った実験のTris−SD
Sゲルクロマトグラフィを示すものである。
化抗血清によって大腸菌の中のpCT70により生産さ
れたプロキモシンの沈殿を伴った実験のTris−SD
Sゲルクロマトグラフィを示すものである。
【図12】図12は、大腸菌の中のpCT70によって
生産されたプロキモシンの精製の初期段階における種々
の分画のTris−SDSゲルクロマトグラフィを示す
ものである。
生産されたプロキモシンの精製の初期段階における種々
の分画のTris−SDSゲルクロマトグラフィを示す
ものである。
【図13】図13は、アルトロゲル(ultrogel)AcA
54を用いたゲル浸透クロマトグラフィによって、大腸
菌の酸性粗抽出物に存在する物質からの真性の子牛キモ
シンの分離状態を示したものである。
54を用いたゲル浸透クロマトグラフィによって、大腸
菌の酸性粗抽出物に存在する物質からの真性の子牛キモ
シンの分離状態を示したものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C12R 1:865) (31)優先権主張番号 8203907 (32)優先日 1982年2月10日 (33)優先権主張国 イギリス(GB) (72)発明者 チモシー ジョン ロイ ハリス イギリス連合王国,バークシァ,ブラック ネル,ビンフィールド,レッド ローズ 54 (72)発明者 ピータ アンソニー ロウ イギリス連合王国,バークシァ,リーディ ング,メルローズ アヴェニュー 9 (72)発明者 ジョン スペンサー エムテージ イギリス連合王国,バッキンガムシァ,ハ イ マイコーンブ アマーシャム ヒル, ベンジャミン ハウス 12
Claims (3)
- 【請求項1】 メチオニン−プロキモシンの暗号となる
遺伝子を有するベクターシステムで形質転換された宿主
有機体より生成されたメチオニン−プロキモシンを開裂
させる操作より成るキモシンの生産方法。 - 【請求項2】 次の操作を含む請求項1記載のキモシン
の生産方法 a)メチオニン−プロキモシンの暗号となる遺伝子のベ
クターシステムへの挿入 b)ベクターシステムを有する遺伝子による宿主有機体
の形質転換 c)キモシンを生成させるために、宿主有機体によって
生成されたメチオニン−プロキモシンの開裂。 - 【請求項3】 宿主有機体が微生物宿主有機体である請
求項1又は2記載の生産方法。
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US4512922A (en) * | 1982-12-22 | 1985-04-23 | Genentech, Inc. | Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins |
US4518526A (en) * | 1982-12-22 | 1985-05-21 | Genentech, Inc. | Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins |
EP0116201B1 (en) * | 1983-01-12 | 1992-04-22 | Chiron Corporation | Secretory expression in eukaryotes |
JPS59166086A (ja) * | 1983-03-09 | 1984-09-19 | Teruhiko Beppu | 新規な発現型プラスミドとそれらを用いて仔牛プロキモシン遺伝子を大腸菌内で発現させる方法 |
ATE107356T1 (de) * | 1983-03-25 | 1994-07-15 | Celltech Ltd | Verfahren zur herstellung eines proteins. |
ATE46361T1 (de) | 1983-03-25 | 1989-09-15 | Celltech Ltd | Verfahren zur herstellung eines proteins. |
US5340926A (en) * | 1983-03-25 | 1994-08-23 | Celltech, Limited | Process for the recovery of recombinantly produced protein from insoluble aggregate |
FI841288A (fi) * | 1983-03-31 | 1984-10-01 | Codon Genetic Eng Lab | Rekombinant-dna-kod foer uttryckning av polypeptid. |
IL71991A (en) | 1983-06-06 | 1994-05-30 | Genentech Inc | Preparation of human FGI and FGE in their processed form through recombinant AND tranology in prokaryotes |
US5624829A (en) * | 1984-07-03 | 1997-04-29 | Gist-Brocades, B.V. | Transformed industrial bacillus strains and methods for making and using them |
AU3036684A (en) * | 1983-07-07 | 1985-01-10 | Genex Corp. | Production of bovine calf chymosin |
US4870008A (en) * | 1983-08-12 | 1989-09-26 | Chiron Corporation | Secretory expression in eukaryotes |
US4721673A (en) * | 1983-09-01 | 1988-01-26 | Genex Corporation | Recovery and activation process for microbially produced calf prochymosin |
ATE66251T1 (de) * | 1983-12-23 | 1991-08-15 | Pfizer | Expressionsplasmide fuer die herstellung eines heterologen proteins in bakterien. |
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DK18884D0 (da) * | 1984-01-16 | 1984-01-16 | Hansens Lab | Fremgangsmade til fremstilling af ost |
JPS60188077A (ja) * | 1984-03-09 | 1985-09-25 | Teruhiko Beppu | 仔牛プロキモシンcDΝAの全配列を有する新規な発現プラスミド |
WO1985005377A1 (en) * | 1984-05-11 | 1985-12-05 | Codon Genetic Engineering Laboratories | An efficient process for producing active chymosin from a precursor protein synthesized in bacteria |
US5082775A (en) * | 1984-05-11 | 1992-01-21 | Berlex Laboratories, Inc. | Efficient process for isolating insoluble heterologous protein using non-ionic detergents |
GB8414354D0 (en) * | 1984-06-05 | 1984-07-11 | Biogen Nv | Purifying protein |
US4748234A (en) * | 1985-06-26 | 1988-05-31 | Cetus Corporation | Process for recovering refractile bodies containing heterologous proteins from microbial hosts |
US4875487A (en) * | 1986-05-02 | 1989-10-24 | Varian Associates, Inc. | Compressional wave hyperthermia treating method and apparatus |
GB2200118A (en) * | 1987-01-23 | 1988-07-27 | Allelix Inc | Synthetic chymosin-and prochymosin-encoding DNA segments |
US4961969A (en) * | 1987-05-11 | 1990-10-09 | Cetus Corporation | Process for recovering microbially produced interferon-β |
AU1789288A (en) | 1987-05-15 | 1988-12-06 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Improved ceramic compositions and methods employing same |
GB9408466D0 (en) * | 1994-04-27 | 1994-06-22 | Univ Nottingham | Cloning and functional expression of neurotoxins |
WO2005089040A2 (en) * | 2004-03-23 | 2005-09-29 | Chr. Hansen A/S | Method of producing chymosin c and uses thereof |
WO2008016328A1 (en) * | 2006-08-03 | 2008-02-07 | Enno Solutions Pte. Ltd. | Cargo pallet having two decks joined by projections on the surfaces |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS57141287A (en) * | 1981-01-16 | 1982-09-01 | Koraborateibu Research Inc | Rennin, preprorennin or prorennin gene obtained from recombined dna material and live cell containing gene |
-
1982
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- 1982-06-11 GB GB08217096A patent/GB2100737B/en not_active Expired
- 1982-06-16 DK DK271482A patent/DK271482A/da not_active Application Discontinuation
-
1986
- 1986-12-30 MY MY8600116A patent/MY8600116A/xx unknown
-
1994
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Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS57141287A (en) * | 1981-01-16 | 1982-09-01 | Koraborateibu Research Inc | Rennin, preprorennin or prorennin gene obtained from recombined dna material and live cell containing gene |
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