JPS589687A

JPS589687A - ポリペプチドの生産方法

Info

Publication number: JPS589687A
Application number: JP10467282A
Authority: JP
Inventors: ノ−マン・ヘンリ・ケアリ; マイケル・テレンス・ド−ル; チモシ−・ジヨン・ロイ・ハリス; ピ−タ・アンソニ−・ロウ; ジヨン・スペンサ−・エムテ−ジ
Original assignee: SERUTEKU Ltd
Current assignee: SERUTEKU Ltd
Priority date: 1981-06-17
Filing date: 1982-06-17
Publication date: 1983-01-20

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】発明の技術分野本発明は、組換ＤＮＡのバイオテクノロジーの分野に関
するものである。より詳しく言うと、本発明は、牛乳を
凝固させる酵素であるキモシン、キモシンの酵素前駆体
でＴｏ夛、容易にキモシンに変わヤ得るプロキモシン、
それｌｃプロキモシンの前駆体であるプレプロキモシン
を生産することができる微生物を容易に入手できる材料
から製造するための方法に関する。

発明の技術背景牛乳は、基本的にはカゼインタンパク質のコロイド状懸
濁液から成つている。子牛の第４胃（皺胃）にある胃液
の抽出物は、このコロイドを不安定化させる効果を持つ
ていることがか１１以帥から知られている。カゼイン分
子の凝集の結果は、凝乳ということで通常知られている
現象が生じる。

この凝乳は、チーズ製造の第１段階である。

子牛が生まれてからの最初の２．３週間で、乳離れする
壕での間、子牛は線母親の牛乳を飲み続ける。この牛乳
の消化は、子牛の第４胃にある（レンニン又はレンネツ
トと総称されている）酸性プロテイナーゼの存在によつ
て助けられている。レンニンは、タンパク質鎖の開裂を
ひき起すことになるタンパク質分解作用を牛乳中のカツ
パカゼインに対して持つている。生じたタンパク質（パ
ラカツパカゼイン）は、コロイド溶液中で安定化するこ
とができず、凝乳が起きる。

長年に亘り、チーズ製造業にとつてレンニンの唯一の供
給源は子牛の胃であつた。ところが近年、自然的に得ら
れる供給を上回るようなレンニンに対する需要が生じて
きたチーズ製造業の成長があつた。生まれてから１２週
間以内に屠殺するために子牛を繁殖させることは、経済
的にみれば自然的なレンニンの大量生産には向いていな
い、とは言つても、代替策を見つけることは容易なこと
ではなかつた。

自然的なレンニンの代替物を見つけようとするには、酸
性プロテイナーゼ又は非常に低いタンパク質分解活性を
もつた酸性プロテイナーゼの混合物が要求される。この
ような条件は、カードの充分な生産量を得るため、そし
てチーズを充分熟成させるために満たされなければなら
ない、よ）強い活性をもつたタンパク質分解酵素は、チ
ーズの製造と熟成の間にカゼインタンパク質がばらばら
になつてしまうほど***させてしまうのである。

このようなことは好ましいことではない。特に不都合な
ことは、カゼインタンパク質のより小さな分解成分が消
費者の心にしばしば不快なにおいを連想させる苦味を最
終製品に与えるととである。

代替物として二つの凝乳剤がチーズ製造業において受け
いれられている。

その一つは、動物の酵素に由来するものであ）、ウシ属
のペプシンと子牛のレンニンとの混合物から成つている
。（ウシ属のペプシンは、成熟した牛の胃にある酵素で
あり、離乳していない子牛のレンニンに代わるタンパク
質分解酵素である。）このような構成の自然的に出来る
タンパク質分解酵素は、純粋な子牛レンニンに対する代
替物として広く受は入れられている。

次に、そして恐らくより重要なことには、菌類からのタ
ンパク質分解酵素が幅広く開発されていゐことである。

これらの微生物起源の酵素は、何年か前日本で開発され
たものである。微生物起源の凝乳剤の三つの主要な供給
源は、次のような菌株である。即ち、ムコール・プシラ
ス（ｍｕｅｏｒｐｗｓｌｌｌａｕｍ）、ムコール・ミー
ハイ（ｍｕｅｏｒｍｌ・ｈ＠％）それにエンドシア・パ
ラシチカ（ｅｎｄｏｔｈｉａｐａｒａｓｉｔｉｃｍ）で
ある。

このような菌株から生産された凝乳剤の欠点は、一般に
かなりのタンパク質分解作用を持つているということで
ある。上述したように、このことはカードの生産量を減
少させ、従つてチーズの生産量も減少させることになる
。また、苦味も生じることがある。このようなことは、
長い熟成期間が必要なチーズにおいては特に顕著なこと
である。

この理由により、微生物起源の凝乳剤は、短期間め熟成
が要求されるチーズにだけ実際適用できるものである。

レンニン中にある主要なタンパク質分解酵素は、キモシ
ンである。このタンパク質は、子牛の第４胃（皺胃）か
ら分泌されるプロキモシンと呼ばれる不活性の前駆体か
ら生産されるものである。キモシンは、近年の重要な研
究課題であつた。この研究結果の一つとして、酵素前駆
体であるプロキモシンの完全なアミノ酸配列が決定され
たことがある。（フオルトマンほかＰｒｅｃ．Ｎａｔ、
Ａｃａｄ、Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７２３２１−２３３４（
１９７７）とＪ−Ｂｌｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５４８４４７
−８４５６（１９７９）参照。）これらの第１の論文は
プロキモシンの完全な３６５個のアミノ酸配列を発表し
ている。第２の論文においては、キモシンの主鎖である
３２３個のアミノ酸残基からなる１本のペプチド鎖の配
列が述べられている。プロキモシン鎖のアミノ末端から
４２個のアミノ酸を取り除くと酵素の活性化が起きるわ
けである。我々は、子牛の胃のプロキモシン遺伝子の主
要な翻訳産物は、プロキモシン部分に対して１６個のア
ミノ酸Ｎ末端を持つた前駆体であるプレプロキモシンで
あることを発見した。本発明は、組換ＤＮＡ即ち遺伝子
操作の技術を利用して細菌から子牛の両のキモシン、プ
ロキモシン、プレプロキモシンを生産するための方法を
含むものである。プロキモシンは、その後自触媒的、−
依存的反応によつて***し得る。

本発明の目的に従つて、我々は夫々メチオニン−キモシ
ン、メチオニン−プロキモシン又はプレプロキモシンの
暗号となる遺伝子を持つベクターシステムでもつて形質
転換された宿主有機体によシ発現されたメチオニン−キ
モシン、メチオニン−プロキモシン又はプレプロキモシ
ンを開裂させる手段から成るキモシンの生産方法を提供
するものである。

１態様において、我々は次のような手段からなるキモシ
ンの生産方法を提供する。

ａ）メチオニン−プロキモシンの暗号となる遺伝子のベ
クターシステムへの挿入。

ｂ）ベクターシステムを有する遺伝子による宿主有機体
の形質転換。

ｃ）キモシンを生成させるために、宿主有機体によつて
発現されたメチオニン−プロキモシンの開裂。

本発明の他の態様で、我々拡次のような手段からなるメ
チオニン−プロキモシンの生産方法を提供する。

ｃ）形質転換された宿主有機体によつて発現されたメチ
オニン−プロキモシンの単離。

本発明の他の態様において、我々は下記の手段からなる
プレプロキモシンの生産方法を提供する。

ａ）プレプロキモシンの暗号となる遺伝子のベクターシ
ステムへの挿入。

ｃ）発現させるための宿主有機体の培養。

できれば、この態様において、形質転換された宿主有機
体によつて発現されたプレプロキモシンが単離されるこ
とが望ましい。

本発明の他の態様において、我々は、次の手段からなる
メチオニン−キモシンの生産方法を提供する。

ａ）メチオニン−キモシンの暗号となる遺伝子のベクタ
ーシステムへの挿入。

ｃ）形質転換された宿主有機体によつて発現されたメチ
オニン−キモシンの単離。

本発明の他の態様で、我々は、次の手段からなるプロキ
モシンの生産方法を提供する。

ｅ）プロキモシンを生成させるために形質転換された宿
主有機体によつて発現されたプレプロキモシンの開裂。

本発明の他の態様で我々は、次の手段からなるキモシン
の生産方法を提供する。

ｃ）キモシンを生成させるために形質転換された宿主有
機体によつて発現されたプレプロキモシンの開裂。

本発明の他の態様で、我々はポリペプチドであるメチオ
ニン−プロキモシン、メチオニン−キモシンそれにプレ
プロキモシンを提供する。好ましくは、これらは、上述
した本発明の実施例の方法によつて生産されることであ
る。（我々は、またそれらの方法によつて生産されたキ
モシンも提供する。）本発明の他の態様で我々は、メチ
オニン−プロキモシン、メチオニン−キモシンそれにプ
レプロキモシンの暗号となる遺伝子を提供する。

本発明の他の態様においては、我々はメチオニン−プロ
キモシン、プレプロキモシン又はメチオニン−キモシン
の暗号となる遺伝子を含むシステムを提供する。ベクタ
ーシステムは、調節可能な発現プロルモータ配列を含む
ことができる。一つの好適な態様では、ベクターシステ
ムは細菌の宿主有機体を形質転換することができ、をた
形質転換されていない宿主有機体とは異なる形質転換さ
れた宿主有機体に表現型を付与することができる１つ以
上のアミノ酸配列を含むことができる。好ましくは、こ
のベクターシステムは、大腸菌トリプトフアンオペロン
プロモータを含むことである。第２のよ〕望ましい態
様では、このベクターシステムは、真核宿主有機体を形
質転換することができ、また形質転換していない宿主有
機体とは異なる形質転換した宿主有機体に表現型を付４
することができる１以上のアミノ酸配列を含むことがで
きる。好ましくは、宿主有機体が酵母であることである
。より好ましくは、ベクターシステムが細菌のプラスミ
ドｐＢＲ３２２と酵母の２μプラスミドから由来するも
のである。また、より好ましくは、ベクターシステムが
酵母のフオスフオグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）遺伝
子プロモータ配列を含んでいるものである。

本発明の他の態様で、我々は上述したベクターシステム
によつて形質転換された宿主有機体を提供する。好まし
くは宿主有機体が細菌であるということであり、適当な
もの祉例えばＨＢＩＯＩ又れＲＶ３０８のような菌株の
大腸菌である。

代わりのものとしては、宿主有機体を酵母、適当なもの
はサツカロミセス・セレビシエ（ｓａｅｅｈａ−ｒｏｍ
ｙｅｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）とすることもできる
。

本発明の他の態様において、我々は次のヌクレオチド配
列を含むオリがヌクレオチドを提供する。

５’ＧＴＴ、ＣＡＴ、ＣＡＴ、ＧＴＴ３’ここで、Ｇは
グアニン、Ｔｄチミン、ＡはアデニンそしてＣはシトシ
ンである。

このオリがヌクレオチドは交雑試験用として、キモシン
のアミノ酸配列を含むポリペプチドの暗号となるヌクレ
オチド配列を含むｍＲＮＡの検出のための操作において
使用されることが好ましい、他の用途では、このオリゴ
ヌクレオチドは転写グライマとして、キモシンのアミノ
酸配列を含むポリペプチドの暗号となる一本鎖のｃＤＮ
Ａの一部分を調製するための操作において使用されるこ
とが好ましい。

本発明の最後の態様では、我々はミクロ滴定用プレート
のくぼみに試料の１つ又は２つ以上の希釈物が牛乳と一
緒に培養される、キモシン活性のための定量法を提供す
る。この定量法は次の手段からなることが好ましい・ａ）試料の段階的な希釈物の調製。

ｂ）各希釈物への牛乳の標準試料の添加。

ｃ）所定時間の培養。

ｄ）牛乳試料が凝固するかどうかの観察。

この牛乳は、液状に戻した乾燥スキムミルクであること
が好ましい。

実施例の説明本発明を充分に説明するため、先ず概括的製法を説明し
、次に一般的調製法の詳細を述べる。

本発明に要求されているような微生物の生産における第
１段階は、所要のタンパク質の暗号となる遺伝子の単離
である。プロキモシンの場合、タンパク質の大きさや遺
伝暗号中の余分なものは、このような遺伝子の化学的合
成を面白くないものにしている。クローン化できる遺伝
子に対する一つの研究手段は、子牛の胃の粘膜からプロ
キモシンｍＲＮＡを調製することである（内山ほかＡｇ
ｒｉ＊。

Ｂｌｏｌ、Ｃｈｏｍ４４１３７３−１３８１（１９８０
）参照）。

ｍＲＮＡの単離は、幾つかある方法のうちの一つを用い
て行うことができ、例えば全ＲＮＡ（Ｅｎｘｙｍｌｏｇ
ｙＶｏｌ）ｉＡｅａｄ会ｍｉ＊Ｐｒ＠ｓｓ（１９６８）
におけるカービイの方法）又はポリソームＲＮＡＱＤ抽
出（パルミターＪ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈ＠ｍ、２４８２０９
５−２１０６（１９７３））にょ夛行うことができる。

／リキモシンｍＲＮＡの濃度は、例えばオリゴ（ｄＴ）
セルロースカラムクロマトグラフイ又は庶糖密度勾配遠
心法による精製の進んだ段階で濃くすることができる。

プロキモシンｍＲＮＡのかなり純粋な試料が作られれば
、このｍＲＮＡ調製物紘その後ＡＭＶ逆転写酵素でもつ
て転写されることができる（エムターゲほかＮｗｅｌ、
ＡｅｌｄＲ・Ｒｅｓ．μｍ２２１−１２４０（１９７９
）参照）、これによつて一本鎖のポリキモシンｅＤＮＡ
ができる。この複写物は単離することができ、ＡＭＶ逆
転写酵素又はＤＮＡポリメラーゼＩによつて再び転写す
ることもできる（エストラチアジスほかＣｅｌｌ．７２
７９−２８８（１９７６）参照）の両操作によつて、一
端にヘアピンループによつてつながつた２本鎖の遺伝子
をもつた二本鎖の全長遺伝子ができる。このルーダは、
Ｓ１エンドヌクレアーゼで切断することができる（ボク
トＥａｒ、Ｊ、Ｂｉｏｅｈ＠ｍ、３３１９２−２００（
１９７３）参照）＊ｓｉヌクレアーゼの使用は、合成遺
伝子の端部から幾つかのヌクレオチド配列を失うことに
なるので、代わりの方法が使用される。この方法では、
末端トランスフエラーゼという酵素を使用してオリゴデ
オキシシトジンの短い部位がｅＤＮＡの最初の鎖の３′
部位にくつつけられる（ランドはかＮｕｅｌ、Ａｅｉｄ
Ｒａｍ、９２２５１（１９８１）参照）、この際、オリ
ゴデオキシグアノシンの短いグライマが第２鎖のｅＤＮ
Ａ合成を進行させるために使用される。この操作におい
て、完全なヌクレオチド配列がクローニングのために使
用できる。ｅＤＮＡの合成過程の模式図を第１図に示す
。（この図において破線はｍＲＮＡを表し実線はｃＤＮ
Ａを表す）。

得られた全長プロキモシン遺伝子は、例えば合成結合剤
をプロキモシン遺伝子に結合させることによつて、適当
なプラスミドベクターへの挿入のため調製される（ポー
ターほかＮａｔｕｒ＠２Ｂ２４７１−４７７（１９７９
）参照）。この結合は、例えばＴ４ＤＮＡリガーゼを使
用して行うことができる。その後この結合剤は、プロキ
モシンＤＮＡＫ互い違いになつた結合部位を作るため適
当な制限酵素を用いて切断される。これらの結合部位は
プラスミドベクターへの結合に利用される。あるいは、
プロキモシンＤＮＡは、その端部に結合したオリゴデオ
キシシトシンの短い部位を持つことができ、これら紘プ
ラスミドベクターの端部に結合したオリゴデオキシグア
ノシンの相補的部位に対して交雑される（マフジリブレ
イほか（１９８０）Ｐｒｏｗ、Ｎａｔ、Ａｅａｄ、Ｓｅ
ｉ。

ＵＳＡ７７５１５３−５１５７）。適当なベクターが選
ばれれば、適当な制限酵素を使用して交差した切れ目が
リング構造に入れられ、そしてプロキモシンＤＮＡ部分
がリング中に結合する。最初に使用したベクターは、単
離した遺伝子を発現させる能力を持つことができないも
のである。発現のため選んだベクターは、挿入された遺
伝子を発現させる強いプロモータを含んでいなければな
らず、また抗体等に対する抵抗性の暗号となる通常の同
一遺伝子も含まなけれにならない。このようにして作ら
れた組換えプラスミドは、適癌な宿主有機体（例えば大
腸菌）を形質転換させるために使われる（コーエンほか
（１９７２）Ｐｒｏ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｅ１．６９
２１１０−２１１４）。

この宿主有機体を作る最初の段階において使用されるプ
ロキモシンｍＲＮＡは完全に純粋というわけではなく、
従つてクローン化されるｅＤＮＡは、多種のうち若干の
ものだけがプロキモシンに直接関係したＤＮＡ配列を有
するのである。そのため、スクリーニング操作は、どの
プラスミドがプロキモシンのＤＮＡ配列を持つているか
を同定するために不可欠である。これには、プロキモシ
ンのアミノ酸配列に部分的に特異的な配列を持つた合成
オリゴヌクレオチドを用いた交雑分析を含む（グルンス
タインとホグネス（１９７５）Ｐｒｏ１プ、Ｎａｔ、Ａ
ｅａｄ、８ｅｉ。

７２３９６１−３９６５と７オルトマンほか（１９７７
）Ｐｒｏｅ。

Ｎａｔ、Ａｃａｄ、８ｅｉ、７４２３２１−２３３４参
照）、この操作を用いて、ここまでの操作で作られた多
種のクローンの中からプロキモシン特異的クローンを検
出することができる。全長ｅＤＮＡＯ複写物は、プロキ
モシン生産に特異的クローンから、ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動を用いて大きさによる分別を行つた後、プ
ラスミドＤＮＡを制限酵素て分解することにより選別す
ることができる（ドウルほか（１９８０）Ｎｕｃａ１．
Ａｅｉｄ、Ｒｅ１．見４５７５−４５９２）、その後、
選別されたプラスミドは、プラスミド調節配列に関して
挿入の正確な配向と調整を行なう、選ばれた発現ベクタ
ーに運ばれる。正しい配置にある全相補的ＤＮＡ遺伝子
が得られれば、遺伝子の発現は宿主細胞の代謝の標準的
プロセスによりなされ、プロキモシンの生産量は尚該技
術分野で知られているタンパク質化学の技術を使つて測
定される。我々は、微生物細胞からプロキモシンを単離
し、精製するための、タンパク質を酸性ｐＨ状態にする
ことを含む操作を考案した。プロキモシンは、酸性ｐＨ
にすることを含む自触媒的プロセスで活性のキモシンに
変わシ得るということは知られている（アサトとランド
（１９７７）Ｂ１ｏｅｈ＠ｍ、Ｊ−１６４４２９−４３
４）。この活性化は、ポリキモシンのアミノ末端から４
２個のアミノ酸を取り除くことによつて起きる（ピータ
ーソンほか（１９７９）Ｅｕｒ、Ｊ。

Ｂｉｅｃｈ＠ｍ、９４５７３−５８０）。

本方法におゆる個々の操作のより詳細な説明をこれから
述べる。

特徴的な具体例では、子牛の胃からのＲＮＡの調製は次
のようにして行われた。

屠殺されたばかルの離乳していない子牛（生後１０Ｂ）
の第４胃（皺胃）を切開し、等張緩衝液で洗つた。赤味
を帯びた粘膜層を小刃で削り取り、０℃に保つた。組織
は、ＲＮＡｐ製で直ちに使用し、また−８０℃での貯蔵
に先だつて液体窒素中で凍結した。１つの胃あたり、約
５０ｇｍの粘膜を得た。

ＲＮＡは、主としてカービイの方法（Ｅｓｓｙｍｏｌｏ
ｇｙ。

ＶｏｌＭ、ＡｅａｄｓｍｌｅＰｒｅｓｓ（１９６８）Ｐ
、８７）により、下記の方法で皺胃の粘膜から単離した
。削り取つた皺胃の粘膜は、均質化する前、鋏で細かく
切〕刻んだ。２５ｇｍの組織を４５ｍｌの１％塩化ナト
リウム（ｗ／す、４５ｍｌの６％４−アミノサリチル酸
ナトリウム、４５ｍｌのフエノール：クレゾール混合物
（フエノール−５００ｇｍ、ｍ−クレゾール−７０ｍｌ
、水−５５ｍｌ、８−ヒドロキシキノリン−０，５ｇｍ
）と混合した。混合物は、６０００ｃ：＆、５℃で３０
分間遠心分離する前、２０分間室温で振とうした。上層
を取り除き、塩化ナトリウムで３％（ｖ／ｖ）に調製し
た。

その後、この層をこの手分の容量のフエノール：ｍ−ク
レゾール混合物で室温中で１０分間抽出し、次に８００
０×ｇ、５０℃で１５分間遠心分離した。水層を除き、
２倍の容量のエタノールと混ぜ、−２０℃で予冷した。

混合物を０℃で２０分間保ち、沈澱したＲＮＡとＤＮＡ
を８０００×ｇ、５℃で１０分間遠心分離した。核酸の
ペレツトは、ｐＨ６，０の１００ｍｌの２％（ｗ／ｖ）
酢酸ナトリウム中で静かに再懸濁し、溶液は固体の添加
によル塩化ナトリウムで３Ｍに調製した。それを４℃で
１晩置き、ＲＮＡの沈澱物を８０００×ｇ、５℃で１５
分間遠心分離した。ペレツトは、ＤＮＡと可溶性ＲＮＡ
を除くためｐＨ６，０の３Ｍ酢酸ナトリウムでしつかル
洗い、その後酢酸ナトリウムを除くため、７０％（ｖ／
ｖ）のエタノールで洗つた。次にペレツトを乾燥させ、
希薄緩衝液中で再溶解させ、そして−２０℃で貯蔵した
。得られたものは、約３０−４０ｍｇのＲＮＡであつた
。

この子牛の胃のＲＮＡ抽出物は、下記のクロマトグフイ
操作によつて更に精製した。精製には、例えば、蔗糖密
度勾配法を用いることも可能であろう・１５■の子牛の胃のＲＮＡを０．５Ｍ塩化ナトリウム、
２０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、２蘭ＥＤＴＡ、０
．１％ＳＤＳ（負荷緩衝剤）を含む緩衝液で、１ｍｇ／
ｍｌとなるように調製する。この溶液を、負荷緩衝液で
きちんと洗つた２ｇｍのオリゴ（ｄＴ）セルロース（Ｂ
、Ｒ，Ｌ。

Ｌｔｄ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ）を含む小さなクロマ
トグラフイカラムにかけた。重力の下にカラムにかけた
後、抽出物の光学濃度が２６０ｎｍで０．０５以下にな
るまで、結合していないＲＮＡを負荷緩衝液で洗い流し
た。

その後、結合しているｍＲＮＡ部分は、数カラム容量の
２０ｍＭＨＥＰＥｓ（ｐ）１７．５）、１ｍＭＥＤＴＡ
、０．１％ＢＤＢで抽出した。ｍＲＮＡは一２０℃、２
容量の無水エタノールで沈澱させることによつて回収し
、沈澱物を１５，０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離
した。３００−４００マイクログラムのｍＲＮＡ部分を
得た。

操作の次の段階は、プロキモシンｍＲＮＡから１本鎖ｅ
ＤＮＡを調製することである。ｍＲＮＡ１本鎖から全長
ｅＤＮＡ１本鎖を作るため、ｃＤＮＡの転写を始めるこ
とができるｍＲＮＡの特定の部位でｍＲＮＡをグライム
させることが必要である。

この作業では、２個のグライマを使用した。その１つは
、オリゴ（ｄＴ）１２−１８である。このグライマは、
一連のチミジン（Ｔ）残基からできている。

殆んど全部の真核ｍＲＮＡの特徴は、鎖の一端に一連の
アデニン（Ａ）残基を含んでいることである。

上述のグライマは、このオリゴ（Ａ）グループと交維す
ることができ、また一本鎖ｅＤＮＡの転写のための出発
点となることができる。以下の方法は、基本的にはエム
ターゲほかの方法によるものである（ＮｕｅＡ、Ａｃ１
ｄ、Ｒ＠１．６１２２１−１２４０、（１９７９）。混
合物には、５０ｍＭＴｒｉｓ．Ｃｌ（ｐＨ８，３）、１
０ｍＭ塩化マグネシウム、３２ｐでラベルした０、５ｍ
ＭｄＣＴＰ、５ｍＭＤＴＴ、０．０１％トリトンＸ−１
００，５０ｄｇ／ｍｌのアクトミオシンＤ、５０ｒｎＭ
の塩化カリウム、１０μｗ／ｍｌのオリゴ（ｄＴ）、２
０−５０ｕｇ／ｍｌのｍＲＮＡ部分、１０−６０Ｕ／ｍ
ｌの逆転写酵素（ＩＵＢＣａｔ、Ｎｏ、Ｅ、Ｃ。

２、７．７．７）を含む、３７℃、９０分間の培養の後
、反応は、溶液を０．２％ＳＤＳ、２０ｍＭＥＤＴＡに
調製することにより終了した。溶液は、等量の１：１（
ｖ／ｖ）フエノール：クロロホルムと−２０℃、２容量
の無水エタノールで沈澱させて濃縮した液層で抽出した
。回収したｃＤＮＡは水に溶かし、水酸化ナトリウムで
０．１Ｍに調整し、そして６０℃で３０分間培養した。

酢酸で中和した後、試料を５０ｍＭ塩化ナトリウムと０
．１１８Ｄ８を含む緩衝液でセフアデクスＧ−１５０の
カラムによりクロマトグラフイにかけた。空のカラムに
溶出するラベルした試料を集め、２容量のエタノールで
沈澱させた。

＠ＤＮＡの大きさは、９０ｍＭＴｒｉｍ、９０ｍＭホウ
酸、２．５ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８，３）を含む緩衝液を
使用した５％アクリルアミドゲル中で標準ＤＮＡ断片を
対照として電気泳動法で測定した。ＰでラベルしたｅＤ
ＮＡの位置は、フジ−ＲＸフイルムを使用したゲルのオ
ートラジオグラフイにより突き止めた。８００個以上の
塩基を持つｅＤＮＡは切り、０．５Ｍ酢酸アンモニウム
、９．０１Ｍ酢酸マグネシウム、０．１％ＳＤＳ、０．
１ｍＭＥＤＴＡを含む緩衝液に電気抽出することにより
、ゲルから抽出した。この高分子量ｅＤＮＡは、二本鎖
試料の合成のために使用した。

ｃＤＮＡを転写するこの方法の一つの欠点は、単離した
ｍＲＮＡ群に存在するあらゆる種からｅＤＮＡを生産す
るということ、即ちｅＤＮＡは配列に関して異質になつ
てしまうということである。これを解決する一つの方法
は、オリゴ（ｄＴ）１２−１８の代わりに、配列に特異
性のあるプライマを使用することである。

オリゴ（ｄＴ）１２−１８でプライムされたｃＤＮＡを
使用した場合のもう一つの欠点は、転写がｍＲＮＡの５
′部位に達しないで止つてしまうことである。このこと
は、特異的な第２次構造の特徴又は概して酵素反応の条
件が最善ではないということによるのかもしれない。ｍ
ＲＮＡの５部位に由来する配列がないということは、ク
ローン化した配列の発現が主目標の場合、重大な欠点で
ある。ｅＤＮＡ中の５′部位配列を特異的に得るために
は、５′部位の中程又は近くにあるｍＲＮＡと交雑する
プライマを使うことができる。

これらのうちのどちらかを実施するためには、遺伝子コ
ードの低い縮重が存在しているプロキモシンタンパク質
にあるアミノ酸配列の位置を知る必要がある。このこと
は、特定のアミノ酸配列の暗号となるヌクレオチド配列
の数は全ての可能な組合せを合成できる程少いものであ
る。我々は、プロキモシンに次のアミノ酸配列があゐこ
とがわかつた。

このアミノ酸配列のための伝令ＲＮＡは次のようであろ
う。

このかたまつた配列の中央の４つのコードンは、４重の
縮重しか持つていない、可能なｍＲＮＡ配列に相補的な
一組のオリゴヌクレオチドは、次のように表わすことが
できる。

これらの４つ配列のうちの一つは、自然のｍＲＮＡ配列
と正確に一致していなければならず、そのためプロキモ
シンｍＲＮＡの部位に交雑することになる。

同じ部域に対する他のオリがヌクレオチドの組としては
、次のようになる。

れらのオリがヌクレオチドは、常法であるホスホトリエ
ステル合成法（シウングほか（１９７９）ＮｕｃＡ、Ａ
ｃ１ｄ、Ｒ＠１．６１３７１−１３８５）を使用して合
成し、次にウルトラシルカラム（Ａｌｔ＠ｘＬ１ｍｉｔ
＠ｄＵＳＡ）で高圧液体クロマトグラフイにかけて精製
した。これらの合成オリゴヌクレオチドは、プロキモシ
ンｍＲＮＡからの一本鎖ｅＤＮＡの転写のため、プライ
マとして使用した。

２μｇの各オリゴヌクレオチドを、Ｔ４ポリヌクレオチ
ドキナーゼと５２Ｐ−ＡＴＰを用いて、５′部位に３２
Ｐリン酸でラベルした。

混合物には、０．１−１，０ｍＣ１のＰ−ＡＴＰ、５０
ｍＭトリス、Ｃｌ（ｐＨ７，８）、５ｍＭ塩化マグネシ
ウム、１０−β−メルカプトエタノール、５−２０単位
のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを含んでいた。３７℃
で３０−６０分培養した後、溶液は等量の１；１（ｖ／
ｖ）フエノール：クロロホルムと一緒に抽出し、水層は
、５０−塩化ナトリーム、２０ｍＭトリス、Ｃｌ（ｐＨ
７．５）、０．１％ＳＤＢで平衡にされたセフアデクス
Ｇ−５０カラムに通した。ラベルされたオリゴヌクレオ
チドを含む除去部分はためた後、２容量の無水エタノー
ルを添加して沈澱させた。沈澱物は、１５．０００×ｇ
、４℃で１０分関連心分離して回収した。

その後、反応混合物にＰ−ｄＣＰＴが含まれていない場
合を除いて、ラベルされた４つのオリゴヌクレオチドは
、オリゴ（ａＴ）１ｚ−１ｓのため、上述したようにｅ
ＤＮＡ合成のプライマとして使用した。試験した４つの
オリゴヌクレオチドのうちの１つだけ、即ち５’−ＧＴ
Ｔ、ＣＡＴ、ＣＡＴ、ＧＴＴ−３’配列を持つものだけ
が子牛の胃のｍＲＮＡ群にｅＤＮＡ合成をプライムさせ
ることができた。このことは、メチオニンダブレツトの
部域にあるｍＲＮＡ配列は、この特定のオリゴヌクレオ
チドの配列に対して相補的であることをはつきり示して
いる。

作られたｃＤＮＡは、ゲル電気泳動での測定によると最
大６５０個の塩基の長さを持ち、これはメチオニン−メ
チオニン配列とｍＲＮＡの５′部位間の距離の予測と一
致していた。しかし、それはばらばらの分子量を持つた
幾つかの種類のものから成つていた。このｅＤＮＡは１
本鎖であり、５’部位に１個の５２Ｐ−リン酸塩でラベ
ルした。これらは、マキサムとシルバード（Ｐｒｏ、Ｎ
ａｔｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃ１．ＵＳＡ７４５６０（１９７
７））の化学的方法によ、９、ＤＮＡ鎖を配列させるた
めに必要なことである。プライムされたｅＤＮＡはこれ
らの方法により、配列され、プライマヌクレオチド配列
を得たポリキモシンタンパク質の部域の以前から知られ
ていたアミノ酸配列に一致しているＤＮＡ配列が得られ
た。これらの配列方法は、現在多くの研究室で一般的な
ものとなつており、Ｍ＠ｔｈｏｄｓＩｎｇｎｉｙｍｏｌ
ｏｇｙ６８４９９−５６０（１９８０）にはステツプバ
イステツプ法が説明されている。

得られた配列は、関連するアミノ酸配列と制限酵素認識
部位と共に第２図に示されている。特に興味深いことは
、８ｍｍｌ、Ｅｅｏ、ＲＩ、ＨｌｎｄＩＩＩ、ＢａｎＭ
ｌの酵素に対する認識部位が存在していることである。

プラスミドｐＡＴ１５３には最初のクローニングのため
に使用されるＳｍｍ１部位がなく、他の３つの部位も稀
である。これらのうちの１つ又は２つ以上のものは、プ
ライマオリゴヌクレオチドから作られた特異的５’ｅＤ
ＮＡをオリゴ（ｄＴ）プライミングから作られた短かい
ｅＤＮＡに結合させるための有用な部位を提供する。

オリがヌクレオチド５’−ＧＴＴ、ＣＡＴ、ＣＡＴ、Ｔ
ＧＧ−１を使つて得られたｅＤＮＡは、大きさが不均一
であり、且つ読みとれる配列を与えるための化学的配列
反応において分画しなくても使用できる、という事実は
、とのｅＤＮＡが実際にある特異的ｍＲＮＡのある特異
点に交雑することを示している。このことは、オリゴヌ
クレオチドを使用して作られたｅＤＮＡが、クローニン
グ実験で得られた細菌コロニーのスクリーニングにおい
て、完全に特異的な交雑プローブとして使用できること
を意味している（下記のスクリーニング操作参照）、こ
の伸びたプライマｅＤＮＡは、短いオリゴヌクレオチド
自身よりもプラスミドＤＮＡに対してよ多安定した相互
作用をし、そのためｅＤＮＡの方がプローブとして好適
である。

上述した転写の方法によつて、３′部位にＤＮＡの“ヘ
アピン”構造を持つたＤＮＡ分子ができる。これは、第
２鎖のＤＮＡを作る際使用することができる。又は、１
本鎖ＤＮＡを作る際の２つの方法に使用することができ
る。２つの方法を使用することができ、１重鎖ｅＤＮＡ
は、例えば大腸菌のＤＮＡポリメラーゼ１、又は正常な
状態であれば１本鎖ＤＮＡの複写物を作るのであろうが
、ヘアピン構造がプライマとして作用するのでこの場合
２本鎖ｅＤＮＡを作ることになるＡＭＶ転写酵素に支配
され得る。

今説明している調整において、１本鎖ｅＤＮＡは、５０
ｍＭＴｒｉｍ、Ｃ１（ｐ）（８，３）、２０ｍＭＤＴＴ
、１０ｍＭ塩化マグネシウム、０．５ｍＭｄＧＴＰ、０
．５ｍＭｄＡＴＰ１０．５ｍＭｄＴＴＰ、０．５ｍＭｄ
ｃＴＰ、２−１０μｇ／ｍｌのＡＭＶ逆転写酵素を含む
混合物中に培養することによつて２本鎖型に変えた。４
５℃で４時間培養し良後、溶液を０．２％ＳＤＳ、２０
ｍＭＥＤＴＡに調製し、その後等量の１：１（ｖ／ｖ）
フエノール：クロロホルムと一緒に抽出した。水層は、
上述したようにセフアデクスＧ−１５０カラムでクロマ
トグラフイにかけ、抽出した部分をためた後、２容量の
無水エタノールで沈澱させた。合成りＮＡの大きさ社、
９０ｍＭＴｒｌｓ、９０ｍＭホウ酸、２．５ｍＭＩＤＴ
Ａｓ（ｐＨ８，３）を含む緩衝液を使用した５％アクリ
ルアミドゲルで、標準ＤＮＡ断片を対照としてグル電気
泳動で測定した。

ラベルしたＤＮＡの位置線、フジ−ＲＸフイルムを使用
したゲルのオートラジオグラフイによつて突き止めた。

８００個以上の塩基を持つ２本鎖ｅＤＮＡは切り離し、
上述した１本鎖のものと同じようにゲルから抽出した。

この高分子量のものは、クローニング実験のために使用
した。

ｅＤＮＡの一端にあるヘアピンループは、α−アミ。

ラーゼから調製したＳ１ヌクレアーゼを用いて分解させ
ることにより取り除いた（ボグトＶ’ＭＥｕｒ、Ｊ、Ｂ
ｌｏｃｈ＠ｍ３３１９２−２２０（１９７３））＊分解
は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、２５吐酢酸ナトリウム
（ｐＨ４．６）、１ｍＭ硫酸亜鉛、１０−１００μｍ１
／ｍｌのｃＤＮＡ、２５−５０単位／ｍｌのＳ１を含む
溶液中で行つた。

２本鎖ｃＤＮＡの端部にある残基の“ぼろぼろになつた
もの”は、ｅＤＮＡを５０ｍＭＴｒｉｓ、Ｃｌ（ｐＨ７
，５）、５ｍＭＭｇＣｌ２，２ｍＭメルカプトエタノー
ル、４つのデオキシリボヌクレオチドリン酸塩の各０．
５ｍＭ。

２単位のＤＮＡポリメラーゼＩ（いわゆる“クレノウ断
片”）を含む２０μｌの混合物中でＤＮＡポリメラーゼ
■（フレノウ断片）と一緒に培養して修復する。培養は
、１５℃で１５分間であつた。ｅＤＮＡ遺伝子の末端に
おけるヌクレオチド配列の保持を確実にするため、（ラ
ンドほか（１９８１）ＮｕｅＬ、Ａｃ１ｄ。

Ｒ＠１．９２２５１）の操作を一部変更した代わりの方
法を使用した。上述のようにして調製された１本鎖ｅＤ
ＮＡは、１００ｍＭカコジル酸ナトリウム（ｐＨ７，１
）、０．１ｍＭＤＴＴ、１０ｍＭ冷ｄＣＴＰ、１ｍＭＣ
ｏＣｌＡ、２５０ｕＣｉ／ｍｌのｓＨ−ｄＣＴＰ、１０
ｕｌ／ｍｌの末端トランスフエラーゼを含む反応で、１
部位にオリゴデオキシシトジンが伸ばされた。反応は、
ラベルしたｄＣＴＰの取り込みを計ることにより測定し
、デオキシシトシンの平均５Ｇ−１００残基を各分子に
加えた後、フエノール抽出により終了した。この伸びた
ｅＤＮＡへの第２鎖の合成ｕ、１０ｓｌ／ｍｌのｅＤＮ
Ａ、５０ｍＭＴｒＬｍ、ＣＬ（ｐＨ８，２）、３０ｍＭ
ＫＣｔｌｌｏｍＭＭｇＣｌ２．５０μｌ／−のオリゴｄ
Ｇ（１２−１８）を含む溶液中で、オリゴデオキシグア
ノシン（１２−１８残基長）をアニールすることにより
行つた。混合物は、６８℃で３０分間培養し、その後、
１０ｍＭＤＴＴ１０．４ｍＭの各４つのデオキシヌクレ
オシド・トリリン酸塩、４００単位／ｍｌＡＭＶ逆転写
酵素を含むように調製する前に、６０分間をかけて３７
℃に冷やした。混合物は、３７℃で１０分間培養した後
、４２℃で３時間培養し、次に上述したようにフエノー
ル抽出と大きさによる分別を行つた。

２重鎖ｃＤＮＡをプラスミドに導入するためのより好ま
しい方法は、ｅＤＮＡとプラスミドに付着したホモポリ
マオリプヌクレオチドの１尾”を使用することである（
大塚（１９８１）、Ｇｓｎ＠ｕ３３９＝３４６）。末端
を整えるため、ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウ断片）
と一緒に培養した後、ｅＤＮＡに、０．５−塩化コバル
ト、０．１−１ｍＭ’Ｈ−ｄＣＴＰＯｈ在下に子牛の胸
腺からの末端トランスフエラーゼ（ＥＣ２，７，７，３
１）を使用してオリゴデオキシシトシンをくつつけた。

Ｐａｔ１で切断されたプラスミドｐＡ’ｒ１５３のＤＮ
Ａには、その後１０ｍＭ塩化マグネシウムとｓＨ−ｄＧ
ＴＰの存在下に末端トランスフエラーゼを使用してオー
グアノシンをくつつけた。反応は、放打能のトリクロロ酢酸沈澱物への取り込みを計ること
により測定し、反応は、取ル込みが平均３０−４０残基
の３′部位への付着があつたことを示した後、反応は終
了した。混合物は、フエノールとクロロホルムを使用し
て除タンパクし、尾のついたＤＮＡはエタノータにより
沈澱させて回収した。

等モル量の２つの尾のついた種類のものは、５０ｓｔの
０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１ＭＴｒｉｍ、Ｕ（
ｐ）１７．４）、１ｍＭＥＤＴＡを含む混合物中で、６
８℃、３０分間加熱し、その後湯浴を約４時間かけて室
温に冷やすことによつて一緒にアニールした。アニール
されたＤＮＡは、後述するように適当な微生物細胞を形
質転換するために使用した。

形質転換された有機体群から、どの有機体がうまく組換
えＤＮＡを取り込むがどうかを決めるため、（恐らくテ
トラサイクリン又はアムプシリンに対する感受性に基づ
くのであろうが）選別を行つた。

本例では、カツツほか（１９７２Ｊ、Ｂａａｔ＠ｒｉｏ
ｌ。

１４４５７７−５９１）の方法を使用し、合成遺伝子を
持つｐＡＴ１５３を用いて大腸菌ＨＢＩＯＩ（ボイヤＨ
，Ｗ。

とロウランド・ドウソイクスＤ、（１９６９）Ｊ、Ｍ６
１゜８ｉｏ１．４１４５９−４７２）を形質転換した。

細胞は、アムピシリンを１００ｕｇ／ｍｇまで含むＬ−
寒天培養皿（ミラーＪ、ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｉｎＭ
ｏｌ＠ｃｕｌａｒＧｅｎ＠ｔｉｃｍ。

コールド・スプリングハーバ−・ラポラトリー、ニユー
ヨーク、Ｐ４３３）につけ、３７℃で１６時間培養した
。

クローンは、抗生物質が添加されたＬ−寒天培養皿上の
試料を画線し、そして独立のコロニーを選び出すことに
より精製した。組換えクローン（即ち、テトラサイクリ
ンには抵抗性があるが、アムピシリンには感受性がある
もの）は、５２ＰでラベルしたｍＲＮＡ断片を使用した
最初の“コロニー交雑”スクリーン（グルンスタインＭ
、とホグネスＤ、（１９７５）Ｐｒｏｅ、Ｎａｔ、Ａｅ
ａｄ、Ｓｅ１．（ＵＳＡ）７２３９６１−３９６５）に
影響された。個々のクローン化したＤＮＡの交雑をａ）
キモシンに特異的な配列が見出された子牛の胃からのｍ
ＲＮＡそれにｂ）キモシンに特異的な配列がない子牛の
肝臓からのｍＲＮＡと比較することによつて、多くのキ
モシンに特異的なクローンと思われるものを選び出した
。上述した特異的プライマから伸びたｃＤＮＡを使用し
た、より進んだコロニー交雑スクリーンにより陽性のキ
モシンクローンの性質が確認できた。

幾つかのこのような陽性のコロニーから得たＤＮＡは、
交雑プライミング（上記参照）によるプロキモシンｍＲ
ＮＡから得たａＤＮＡだとはつきりしている配列と一致
している制限酵素の分解パターンを示していた。このよ
うな２つのクローンからのＤＮＡは、それぞれ完全なプ
ロキモシン遺伝子の半分以上の長さであつた。ＤＮＡの
一部分は、プロキモシンｍＲＮＡの３′部位からプロキ
モシンｍＲＮＡの５′部位置前までの転写の産物であり
、転写は、オリゴ（ｄＴ）１２−１８でプライムされた
。ＤＮＡの他の部分は、明らかにポリキモシンｍＲＮＡ
の３′部位置後からポリキモシンｍＲＮＡの５′部位ま
での転写によつて得られたものである。これらのＤＮＡ
片を含むこの２つのクローンは、それぞれ８１８と０１
と呼び、クローンＢ１８とＧｌからのＤＮＡの縮尺制限
部位地図は第３図（１）に示す。この図は、完全な遺伝
子を作るための２つの部分的なプロキモシン遺伝子を結
合させるＧ１と８１８から得たＤＮＡの重なり部分に存
在している多くの制限部位を示している。第３図３（ａ
）と３（ｂ）はおいて、制限部位は次のように表示され
ている。

Ｐａｔ＝Ｐ、ＢａｍＨＩ＝Ｂ、ＫｐｎＩ＝Ｋ、Ａｖａ■
＝Ａｖ、ＳｍａＩｗＳ，Ａ１ｕＩｖｍＡ％ＲＩ＝Ｒ，Ｂ
ｇ＋１１プｍ１１８と呼ばれる組換えクローン（第３図
ｂ）は、一般的な制限及び結合の方法を使用し、共通の
ＲＩ部位を通してクローンＡ３６の３′部分とクローン
Ｇｌの５′部分を結合させることにより構成した。

マルクサムとギルバートの技術（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａ
ｅａｄ、Ｓｃｌ、Ｕ８Ａ７４５６０（１９７７））は、
クローンｌ１８の完全なヌクレオチド配列を明らかにす
るために使用されてきた。第３図において、矢は、ＤＮ
Ａの配列が行なわれる部位と方向を示している。破線の
矢は、合成プライマの伸長により得られた配列である。

この分析の結果は、コード鎖の配列と、対応するアミノ
酸配列を示す第４図に与えられている。

櫃して、このヌクレオチド配列は、このタンパク質に対
して以前に発表されたアミノ酸配列と一致している。し
かし、この発表された配列では、（第４図に星印で示す
）アミノ酸２０２と２１４はアスパラギン酸となつてい
る。我々は、これらのアミノ酸は実際にはアスパラギン
であることを示した。アミノ酸を配列させる普通の化学
的技術は、よくアスパラギンをアスパラギン酸と間違え
るが、ヌクレオチド配列を行うことにより、この混同は
除去された。我々はまた、プロキモシンタンパク質への
アミノ末端付加物の暗号となる短いヌクレオチド配列を
見出した。このことは、プロキモシンが元はプレプロキ
モシンとして作られたことを示唆している。プロキモシ
ンのこのような前駆体は、今まで報告されていなかつた
が、それは、細胞から出されたものであるこのようなタ
ンパク質と関係があると考えられている多種の他の分泌
タンパク質（デイビスＢ、Ｄ、とタイＰ−Ｃ（１９８０
）Ｎａｔｕｒ＠２８３４３３−４３８）について見出さ
れた既知の主鎖に類似している。

組換えクローンから単離された完全なプロキモシン遺伝
子（又はそれから得られた他のＤＮＡ構成物）は、関連
するタンパク質を充分に発現させるように作られたベク
ターへ移動することができる。

構造遺伝子をタンパク質へ■訳するには、発現されるべ
き一タンパク質の最初のアミノ酸の暗号となるコードン
としての１出発”コードン（ＡＴＣ）の存在が取り分け
要求される。タンパク質のアミノ酸配列は、コードンが
ＡＴＧであるメチオニン残基から始まるので、プレプロ
キモシンの発現は直ちに行なわれる。キモシンとプロキ
モシンの発現は、引き続いては起り得ない。代わりに、
融合タンパク質が発現されなければならない。Ｎ末端の
付加タンパク質は、その最初のアミノ酸としてのメチオ
ニングループを持つ小さなタンパク質から成つている。

次の例では、ＡＴＧコードンはキモシン又はプロキモシ
ンに付着しており、その結果生じた発現タンパク質は、
それぞれメチオニン−キモシン（ｍｅｔ−ｅｈｙｍｏｓ
ｉｎ）又はメチオニン−プロキモシン（ｍｓｔ−ｐｒｏ
ｃｈｙｍｏａｉｎ）である。我々は、大腸菌そして酵母
（サツカロミセス・セレビシエ）にもｍｅｔ−キモシン
、ｍｅｔ−プロキモシン又はプレプロキモシンを発現さ
せるＤＮＡ構成物を調製した。

Ａ、大腸菌の発現シラスミドの構造１、メチオニン−プロキモシンの発現プラスミドＡ３６（第３図）を酵素Ｐａｔ■を用いて標
準状態で分解し、プロキモシン遺伝子の中央部分をもつ
クローン化された９００個の塩基対を挿入した。ＤＮＡ
は、酵素Ｂａｌ３１を用いた極く短時間（３０秒）の分
解で大きく分解され、その結果生じた結合性のない末端
を持つた分子と合成Ｈ１ｎｄｍ結合分子（Ｃ，Ｃ，Ａ、
Ａ、Ｇ、Ｃ，Ｔ、Ｔ、Ｇ、Ｇ、）は、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼを使用した標準状態においてそれらに結合した。この
物質は、ＨｌｎｄＩＩで分解し、次に５％アクリルアミ
ドゲルで分離した。Ｈｌｔｔｄ’ｍ結合性末端をを持つ
た９００ｂｐ断片は、破砕と緩衝液における浸漬により
グルから単離し、その後フエノールで抽出し、次にエタ
ノールで沈殿させた。それから、一般的方法によりＨｌ
ｎｄ■で切断されたｐＡＴ１５３に再クローン化し、そ
して微生物のアルカリ性ホスフアターゼで脱リン酸した
。この新しいプラスミドは、Ｃ５と命名された。

Ｃ５ＤＮＡを、Ｈｌｎｄ■で分解し、アルカリ性ホスフ
アターゼで脱リン酸し、そしてＲＩで分解すると、Ｒ１
結合性部位に５′−リン酸塩とＨＩＮＤＩＩＩ結合性部
位に５′−水酸基を持つ断片（フラグメントＩ）が生じ
た。

プラスミドＢ５１（第３図）をＢａｍＩＩで切断し、そ
の結合性部位に２つの化学的に合成したオリゴヌクレオ
チド、１つは５′−水酸基末端を持つたもの、もう１つ
は５′−リン酸末端を持つたもの、を結合させた。これ
らは、前に合成ｃＤＮＡプライマの合成のための方法と
して示した方法によつて合成した。

この結合により、プロキモシン遺伝子（第４図）のヌク
レオチド１４を切断するＢａｍＨＩ分解によつて除かれ
てなくなつた配列が回復する。結合されたＤＮＡはＲＩ
で切断され、５′−水酸基を持つた結合性のない部位と
５′−リン酸を持つたＲＩ結合性部位があるポリキモシ
ンのアミノ末端部分を有する小さな断片（フラグメント
２）ができた。、フラグメント１（５００ｎｇ）とフラ
グメント２（２８０ｎｇ）は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使
つて結合し、できたものは５％アクリルアミドゲルで溶
解した。

１＋２に対応する断片を切断し、前述したようにゲルか
ら抽出した。

この断片は、次にｐＣＴβ４と呼ばれるプラスミドにク
ローン化した（第５図の制限地図参照）。このプラスミ
ドは、ｐＡＴ１５３からそこに大腸菌ｔｒｐプロモータ
／オペレータ断片と相Ｔ７転写終結断片を当該技術分野
ではよく知られた技術を使用してクローン化することに
より得られる。それには、開始コードンとリゲソーム結
合に重要ないわゆる“シヤインとデルガーノ（５ｈｌｎ
＠ａｎｄＤ＊１ｇａｒｎｏ）断片”を含んでいる。開始
部位周辺にあるこのプラスミドのヌクレオチド配列は、
以下の通りである。

ＳＤ配列とＡＴＯ間の制限酵素部位によつて、発現率を
最大にする重要な要素であるＡＴＯ−８０距離の調節が
できることになる。このプラスミドはまた、丁度ＲＩ部
位の３′辺りまでＢｉｎｄｌ制限部位を持つている。ｐ
ｃ’ｒ５４をＲＩで切断し、次に８１ヌクレアーゼで分
解すると結合性のない末端ができる。１０ｇのＤＮＡを
、０．３ＭＮａＣｌ、０．０２５ＭＮｍＡｅ（ｐＨ４，
６）、０．００１ＭＺＳＯ４を含む緩衝液中、２０℃で
３０分間、３００単位のＳｌヌクレアーゼを用いて分解
した。溶液からフエノールを用いてタンパク質を除去し
、ＤＮＡはフエノールにより沈殿させて回収した。

生じた結合性のない部位を持つ分子をＳａｌＩを用いて
切断したら、上述したようなアクリルアミドゲルから単
離された短い結合性のない部分−ＳａＡＩ断片ができた
。更に、ｐＣＴをＨｌｎｄｌとＢａｌｌで切断すると大
きなりｉｎｄｌ−Ｓａｌ■断片ができ、これもアクリル
アミドグルから単離した。

大きなＨｌｎｄ■−８ａｔＥ断片（９０ｎｇ）、小さ々
結合性のない部分−ＳａｌＩ断片（３０ａｇ）と再構成
されたプロキモシン断片（１＋２）は、Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼを用いて結合し、できたＤＮＡを標準的な操作によ
大腸菌ＨＢ１０１に形質転換した。８個のプロキモシン
のクローンを単離し、ＡＴＧコードン周辺を前述の方法
により配列させたとき、それらは、次のような全て同じ
ヌクレオチド配列を持つていることがわかつた。

プラスミドはこのように、アミノ末端に付加的メチオニ
ン残基を持つたプロキモシンの完全なアミノ酸配列の暗
号となる配列を含んでいる。しかし、ＳＤとＡＴＧ配列
間の距離は大きすぎて、いい発現は得られない。この距
離は、上述したよりな８１ヌクレアーゼを用いた分解に
よる、Ｃｌａ１部位でのＤＮＡの切断と結合性のない種
類のものを作ることにより減少させた。このＤＮＡは、
Ｔ４ＤＮＡとの再結合と大腸菌ＨＢＩＯＩへの形質転換
で、ｐＣＴ７０と呼ばれるプラスミドができた（第５図
の制限地図参照）。ＡＴＧ周辺におけるこのプラスミド
ＤＮＡ配列は次の通りである。

ｐＣＴ７０からのｍｅｔ、プロキモシンの発現は、下記
の通りである。

２、メチオニン−キモシンの発現キモシン発現ベクターの組み立ては、上述のプロキモシ
ンプラスミドｐＣＴ７０から始まつた。ｐＣＴ７０ＤＮ
Ａは、ＤＮＡの切断が完全ではなく、また全長の線状分
子が主生成物であるという条件下で、ＢｅＬｌを用いて
分解した。これらの切断は、ｐＣＴ７０におけるどちら
のＢｃｌＩ部位においてもできたのである。引き続いて
最大断片の分別と単離を行うことになる、Ｒ１を用いた
ＤＮＡの分解により、得た種類のものがｍｅｔ−プロキ
モシン遺伝子周辺にあるＲ１部位から遺伝子の出発点に
一番近いＢｅＬＩ部位まで伸びていることが確実になつ
た。ｍｅｔ−キモシン遺伝子を完全力もＯＫするのに必
要な小さな断片は、プロキモシン遺伝子をＲ１部位へ（
位置１４にあるＢａｍ部位からｙ部位へ）次のような化
学的に合成した結合剤を使用して挿入することにより、
ｐＣＴ５４から得たプラスミドｐＣＴ５７（第５図）か
ら得た。

この結合剤は、Ｎ末端に自然のアミノ酸配列とは異る３
個のアミノ酸配列（即ち、擬似プロキモシン）を与える
。ｐｃ’ｒ５７プラスミドＤＮＡをＢａｔ１で制限し、
次のような化学的に合成した結合剤分子をＴ４ＤＮＡリ
ガーゼを用いて、断片の縮合性のないＢａＬ１部分に結
合させた。

新しい断片の５’−Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃ部分は、ＢａｍＨｌ
又はＢａｔ１又はＢｇｔＩ分解からの結合性のある部分
に結合させることができる。ＤＮＡは、Ｒ１を用いて更
に制限され、次のような断片が生じた。

これには開始ＡＴＧとＲ１部位までのキモシン配列の暗
号となるヌクレオチドを含んでいる。この断片は、アク
リルアミドグルから単離した。ｐｃ’ｒ７０（９０ｎｇ
）の大きなＲ１−Ｂｅｌ＼Ｉ断片と小さなＲ１−ＧＡＴ
Ｃ断片（１０ｍｇ）を一緒に結合させると、ＢｅｔＩと
関連するｐＣＴ８６と呼とれるプラスミドが出来た。こ
のプラスミドのＳＤからＡＴＧ部域にあるＤＮＡ配列は
、一般的な方法により次のように決定された。

３、プレプロキモシンの発現１１８（第３図）と呼ばれるプラスミドは標準状態にお
いてＡｖａｌにより分解した。これＫより、断片上の−
１４から＋２４２１でのヌクレオチドからプレプロキモ
シン配列の５′末端が離れる。この断片の末端は次の通
り相補的である：化学的に合成された結合剤分子（ＰＧ、Ｔ、Ｃ，Ｔ、Ｇ
、Ａ。

Ｔ、Ｃ，Ａ、）はこの分子の一端にＴＡＤＮＡで結合し
、次の構造をもつた断片ができた。

この断片は、ＤＮＡポリメラーゼＩにより処理されて結
合性末端を充填し次にＢｅｔｌ及びＢｇｔｌを以て切断
されて両末端に５’Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃ，末端を具えた２６
０ｂｐ断片を生じた。

ｐＣＴ５７ＤＮＡは部分的分解の条件のもとでＢｃＬｌ
で切断され、次に該全長直線状分子はＢｇｔＩで完全に
分解された。１個だけのＢｇｌＨ部位周辺から該ＡＴＧ
の近くのＢｅｌ１部位まで続く大きい断片は前述のよう
に、ゲルから分離された。この大きい断片（１００ｎｇ
）は結合により小さい２６０ｂｐ断片（１００ｎｇ）Ｋ
結合されてプレプロキモシンの暗号となるのに必要なす
べての配列を含むｐＣＴ８２と呼ばれるプラスミドがで
きる。断片２６０ｂｐは大きいＢｅＬａ|ＢｇＬｌ［断
片へ両方向から結合することができるが、正しめ配向に
よれば、Ｂｅ１ｌ及びＢｇｔ１１の両部位が再生するが
、間違つた配向によれば何れも再生しない、このように
、正しい配向は制限地図をつくることによつて容易に選
び出すことができる。ｐＣＴ８２は該再生部位の両方を
含むことが判明したが、開始部位の周りのヌクレオ該構
造の中のＳＤからＡＴＣまでの距離には２８個の塩基が
ある。これは該分子をＢｅＬｇ部位で切断し、次いでＢ
ｅＬ３１ヌクレアーゼによる短時間の分解で数個の塩基
を取り除くことにより減少した。

この酵素を両方向から゛分解すると、結合性のない末端
ができたが、これは種々な値のＳＤからＡＴＧの距離を
もつた種類のものを作るために再結合した。

Ｂ、酵母の発現プラスミドの構造酵母中で発現に使用さ五るプラスミド（サツカロミセス
・セレビシエ）は、ｐＢＲ３２２及Ｑ［母２１クロンプ
ラスミドに基づいている。それらは同時に係属している
英国特許出願第８１２５９３４号の主題であり、一般的
なベクターの部分制限地図を第６図に示す、酵母ホスホ
グリセリン酸キナーゼ遺伝子（ＰＧＫ）は転写開始に必
要な５′配列を与え、遺伝子の挿入は１個のＢａｎＩＩ
部位で行うことができる。大腸菌のすべてのＤＮＡ構造
が、遺伝子全体がＢｅｔｌ−ＢｅＬｌ断片のように切断
し得るようにつくられたのはこの理由によるものであり
、この断片はＢａｍＨＩ部位に適合できる５’−Ｇ、Ａ
、Ｔ、Ｃ，末端をもつ。

ｍｅｔ．キモシン、ｍｃｔ．プロキモシン及びプレプロ
キモシンの遺伝子は、ｐＣＴ８６、ｐＣＴ７０及びｐＣ
Ｔ８２からＢｅｌ１分解によつてそれぞれ切り取られそ
してｐＭＡ２７８又はｐＭＡ２３０に結合される。

これら２つのプラスミドにおける、挿入部位の周シのＤ
ＮＡ配列は第７図に示す。

１、大腸菌における発現プロトコール各種の遺伝子の発現に対するプロトコールは、使用され
るすべてのシラスミドベクターのそれと同じである。

研究中のプラスミドを含有する大腸菌（ＥＢｌｏｌ又は
ＲＶ３０８）の１晩培養したばかりの１０ｍｌの培養物
をＬ−培養基で（ミラー、Ｊ、Ｈ，（１９７２）Ｅｘｐ
ｅｒ１ｍｅｎｔｓｉｎＭｏｌｅｕｌａｒＧｅｎｅｔ
ｌｅｓ、コールドスプリングバーパーラポラトリ、ニユ
ーヨーク。

ｐ、４３３）アムピシリンを１００ｕｇ／ｍｌまで補充
して培養した。

この培養物の１：１００稀釈物がカサミノ酸、グルコー
ス、ビタミンＢ、及びアムピシリンを補充したＭ、培地
（ミラー、Ｊ、Ｈ，（１９７２））へ入れられる。

“抑制”培地は４０−１００ｇ／ｍｌのＬ−トリプトフ
アンを含み、そして“誘導”培地は特異的トリプトフア
ン誘導物質−９０分の培養の後に加えられた特異的なイ
ンドールアクリル酸の１０ｇ／ｍｌを含有する。該培養
物には３７℃で振動を与え、全培養時間は３−４時間で
あつた。この時間経過後に、細胞は遠心分離により収集
し、１０％（ｗ／ｖ）グリセリン、３％（ｗ／ｖ）ＳＤ
Ｓ、５％（ｗ／ｖ）メルカプトエタノールを含有する６
０ｍＭｔｒｉｎｐＨ６，８の緩衝液の中で沸騰させて溶
解した。分離されたタンパク質は、１２．５％アクリル
アミド／ＳＤＳゲル上で分析した。

（Ｌａｓｍｍｌｌ英国（１９７９）、ＮＡＴＵＲＥ２２
７（６８０−６８５）ｅ該ゲルはタンパク質帯を目視す
るためにクーマツシブリリアントブルーで着色した。成
る実験においては、新規に合成されたタンパク質が３５
８−メチオニンでラベルされた。このために、該ラベル
されたアミノ酸が最終濃度が２０−３０ｕＣ１／ｍｌと
なるよう３時間半の培養の後に加えられ、該細胞が回収
され溶解されるまで更に１５−３０分間培養は続けられ
た。ラベルされたタンパク質はアクリルアミドゲルの上
で、オートラジオグラフイによりフジ−ＲＸフイルム上
に検出された。

２、発現実験組み換えプラスミドから得られた発現のレベル及び使用
した精裏方法のレベルはメチオニンプロキモシンを発現
するプラスミドｐＣＴ７０の場合を考慮して実証してよ
い、ｐｃ’ｒ７０を含有するＨＢ１０１細胞は上記した
如く誘導条件のもとで育成され、合成されたタンパク質
はＳＯ８／アクリルアミドゲルの上で検査された。該培
養物は振動フラスコ（第８図）又は１０を発酵容器（第
９図）の中で育成された。第８図には０−５時間発酵の
間にｐｃＴ７０により生産された全大腸菌タンパク質の
Ｔｒｉｍ−８ＤＳゲルを示す。細胞は５時間後にはＭ９
培地の中でＯＤ＝ｉ、０にまで生長したＪ”行は本物の
子牛のプロキモシン２ｕｇを含有するコントロールであ
る。第９図には、第８図の媒質中で２４時間の発酵期間
ｐＣＴ７０により生産された全大腸菌のＴｒｌｍ−ＳＤ
Ｓゲルを示す。発酵は溶解酸素制御５０％（１１０％）
自動発泡制御、３７℃、５ｌ容積でｐＨ＝７．２におい
て行われた。９時間後にはＯＤ６ｏ。

＝２．７に達した。′Ｓ″行は本物の子牛のプロキモシ
ン２μｇを含有するコントロールである。

両実験中、本物の子牛のプロキモシンの位置に審動する
タンパク質バンドは容易に判る。

ｐＣＴ７０を含有する細胞及びＰＯＴ５４（親プラスミ
ド）を含有する細胞からのタンパク質意物は、同様に２
元ゲルエレクトロフオレシス（ピー・エイチ・オツフア
レル（１９７５）Ｊ、Ｂｌｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５０４０
０７−４０２１）により検査した。第１０図参照。第１
０図において、矢印した点“Ａ”はｐＣＴ７０及びｐＣ
Ｔ５４の両方に共通の標識タンパク質スポツトを指示す
る。ＥＰＣ（ｐＣＴ７０により大腸菌中で生産されたプ
ロキモシン）に対応する点を第１０ｍ図中に矢印で示す
。破線は第、１０ａ図示のゲルに加えられたラベルされ
ていない本物の子牛のプロキモシンの位置をあられす。

小さい培養物は５５Ｂ−メチオニンでラベルされ、全タ
ンパク質は記載した如く分析された。ｐＣＴ７０を担持
する細胞の中には明らかに見える余分のタンパク質があ
り、これが細胞外から加えられたラベルされてない子牛
のプロキモシンと共に移動することが示された。該ゲル
分析から我々は、全大腸菌タンパク質の約５チがこれら
の細胞の中でメチオニンプロキモシンとして発現された
ものと概算する。生産物の同定は、本物の子牛のキモシ
ン及びプロキモシンに対して調製されたポリクローナル
抗血清を使用して、更に抗体沈殿により行なわれた。３
５８−メチオニンでラベルされたＨＢ１０１／ｐＣＴ７
０からの全タンパク質抽出物は、これらの抗血清で処理
され、そして免疫的に沈澱したタンパク質はアクリルア
ミド／ＳＤＳゲル上で検査された。第１１図はこの沈澱
実験の結果を示す。図においてゲル上のトラツクは次の
通りである：ａ）［”８］メチオニンでラベルされた全ｐＣＴタンパ
ク質；ｂ）［ｓｓ８］メチオニンでラベルされた全ｐＣＴタン
パク質からアンチプロキモシンポリクローナル抗体によ
り沈澱したタンパク質；ｃ）ｂ）と同様で、余分の本物の子牛のプロキモシン（
ＡｅＰＣ）の存在する場合；ｄ）ラベルされない本物の子牛のプロキモシン（ＡｃＰ
Ｃ）の移動位置。

上記ｐＣＴ抽出物中の余分のタンパク質は、両抗血清に
より選択的に沈澱され、該沈澱は過剰の本物の子牛のキ
モシンを加えることによつて除去することができた。か
ように、この新しいタンパク質は、その分子量、荷重的
特徴及び免疫的決定部位について本物の子牛のプロキモ
シンと差別できない。

３、精製我々は大腸菌からメチオニンプロキモシンを分解する単
純な精製方法を考案化した。誘導条件下で育成した凍結
大腸菌／ｐＣＴ７０細胞は、その重量の３倍の０．０５
Ｍｔｒｌｓ−ＨＣｊｐＨ８、１ｉｎＭｍＴＡ。

０．２３ＭＮａＣｊ、１３０ｕｇ／ｍｌのリゾチームを
含有する１０％グリセリン（ｖ／ｖ）の中に懸濁し、該
懸濁液を４℃で２０分間培養した。ソジウムジオキシク
ロレートを最終濃度０．０５％となるまで加え、そして
ＤＮＡアーゼＸ（牛類の膵臓）１０μｇを大腸菌開始材
料１ｇにつき加えた。該溶液を１５℃で３０分間培養し
、その時間により該溶液の粘度は顕著に減少したｅ０．
０１ＭｔｒｌａHＨ８１，０，１ｍＭＩＤＴＡ。

５％グリセリンを含有する溶液を等量加え、該抽出物は
４５分間、４℃において１００００ｇで遠心分離した。

上記の如く更に遠心分離を行つた後、上澄み液を除去し
、ペレツトを室温において、８Ｍ尿素又は６Ｍグクアニ
ジンハイドロクロライド。

０、０５ＭＨＣｔｐＨ８、１ｍＭＩＤＴＡ及び０．１Ｍ
ＮａＣｊを含有する緩衝液の中で急速に溶解した。次に
終夜４℃において２００倍容積の０．０１Ｍｔｒｌｍ、
・ＨＣＬＰＨ８１”ＥＤＴＡｍｏ、ＩＭＮａＣＬ及び１
０−グリセリンに対して透析を行つた。重い沈澱物が形
成され（大腸菌タンパク質に不溶）が、これを遠心分離
により除いて約７５優の純度のメチオニンプロキモシン
の溶液を残した。第１２図は精製の初期の工程における
種々な分画のＴｒｉｍ−ＳＤＳゲルを示す。４個のトラ
ツクは：ａ）本物の仔牛のプロキモシン（ＡｃＰＣ）：ｂ）大腸
菌ｐＣＴ７０の細胞ペレツト部分に存在するタンパク質
；ｅ）大腸菌の中でｐＣＴ７０により作られたプロキモシ
ン（ＥＰＣ）の細胞断片ペレツト分画の中で発見された
不溶性タンパク質（変性／変性よりもとへ戻した後）；ｄ）大腸菌の中でｐＣＴ７０により作られたプロキモシ
ン（ＥＰＣ）の細胞断片ペレツト分画の中で発見された
可溶性タンパク質。

残りの不純物は、ＤＥＡＥ−セルローズ上のクロマトグ
ラフイにより又はＵｌｔｒｏｇｅｌＡｅＡ５４上のゲル
ろ過によつて除去してよい。

４、活性化プロキモシンは大腸菌抽出物の存在のもとに酸性ｐＨに
さらすことＫよつて活性キモシンへと活性化することが
できる。該抽出物は２０℃において１Ｍ塩酸を加えてｐ
Ｈ２としその混合物を静かに１時間攪拌する。重い沈澱
物が形成され、これは低速で遠心分離して除去する。澄
んだ上澄み液は２０℃において、２ＭＴｒｌｓｐＨ８を
追加してｐＨ６に調整する。ブラツドフオード法（Ａｎ
ａｌ、Ｂｌｏｃｈｓｍ。

（１９７６）７２２４８）によるタンパク質決定は、核
酸処理は抽出物中の大腸菌タンパク質の９０％を除去す
ることを示す。

ある実験においては、本物の修生のプロキモシン４ｍｇ
を大腸菌Ｋ１２の澄ました原抽出物の２．４ｍｇと混合
した。この混合物を酸性化し、遠心分離しそして中和し
た。次にそれを０．０２５ＭＮａＰ。

０．１ＭＮａ’ＣＰｐＨ６で平衡されたＵｌｔｒｏｇｅ
ｌＡＣＡ５４の２．４×８３ｃｍカラムに、４℃におい
て１５ｍｌ／ｈｒの速度で適用した。２．５１の部分を
収集し且つキモシン活性及び吸収について試験を行つた
。２６０ｎｍ及び２８０ｎｍにおける吸収は収集した各
部分に対して行なわれた。吸収測定の結果は、第１３図
にグラフで示す。該グラフはキモシン部分（マークした
）の異物質部分からの良好な分離を示す、該キモシン活
性測定（図示せず）はキモシンに対する吸収のピークに
対応する。キモシンの凝固活性に対する回復は４０％で
あつた。

５、試験手続我々は、マイクロ滴定プレート内で一定時間培養を行う
ことになるキモシンの活性試験に対する迅速なマイクロ
方法を考案した。乾燥したスキムミルク１２ｇを１００
ｍｌの２０ｍＭ塩化カルシウムの中に溶解し、室温で６
０分間放置する。燐酸ナトリウムのＰＨ６，３の緩衝液
５０μｔをマイクロ滴定プレートの各くぼみに入れ、各
種サンプル５０μｔを第１列のくぼみに入れ、プレート
を横切つて一連の稀釈を行う。該ミルクの溶液と該稀釈
したサンプルを含有するマイクロ滴定プレートを３７℃
において培養する；ミルクの溶液５０μｔを各くぼみに
加えてプレートを培養器に戻す。１５分後、該プレート
を取り出してシンクの上にくつがえすと、液体のミルク
は流れ落ちて凝固したくぼみがそのままのこる。

一連の稀釈における凝固したくぼみの数が原溶液中のキ
モシン活性の分量を示す。凝固したマイクロ滴定プレー
トは複写機でコピーして試験の記録を保存する。この記
録では１５分間の培養においてキモシン２４ナノグラム
の検出が可能である。もつと低−量はこの培養時間を増
加することによつて検出することができる。大腸菌抽出
物はミルクを凝固させないし又凝固を抑制することもし
ない。

該試験はＥＤＴＡ（〈５ｍＭ）、ＤＴＴ（＜１０ｍＭ）
−グリセリン（＜１２．５チマ／ｖ）、’テトラーＮ−
プチルアンモニウムハイドロオキサイド（（０，２Ｍ）
を含有する大ていの共通の緩衝コンポーネントに対して
は鋭敏ではない。しかしながら、若手の溶剤、Ｔｗｓｓ
ｎ８０（すべての濃度）、Ｎａｎ１ｄｅｔＮＰ−４０（
０，０８％ｖ／ｖにおいて５０％活性）、ソジウムジオ
キシクロレート（０，０６％ｖ／ｖに対し俊敏）、５Ｄ
Ｓ（０，０１悌に対し鋭敏）、に対しては非常に鋭敏で
ある。該試験は０．０１５Ｍ（ＮａＣＡ）が塩類の最適
条件であり、且つｐＨの５−６．８０間の変動に対して
は鋭敏ではない。

以上の説明において、本発明の種々の実施例は添付図面
を参照しながら説明されている。

【図面の簡単な説明】

第１図は、組換えキモシン、プロキモシン、グレプロキ
モシン、プラスミドベクターの構成を示す模式図である
。第２図は、合成オリゴヌクレオチドの特異的プライマを
用いたｍＲＮ人の転写によつて得られたａＤＮＡのヌク
レオチド配列を示すものである。第３図は、（ａ）に得られた幾つかのクローンの制限酵
素の地図を示し、（ｂ）にクローン１１８の制限酵素の
地図を示すものである。第４図は、（プロキモシンｍＲＮＡとキモシンｍＲＮＡ
の配列を含んだ）プレプロキモシンｍＲＮ人の完全なヌ
クレオチド配列を示すものである。第５図は、大腸菌におけるメチオニン−キモシン、メチ
オニン−プロキモシンそれにプレプロキモシンの発現の
ために構成されたプラスミドベクターの制限地図を示す
ものである。第６図は、酵母におけるメチオニン−キモシン、メチオ
ニン−プロキモシンそれにプレプロキモシンの発現に使
用されるプラスミドベクターの模式第７図は、酵母にお
ける発現に使用される、プラスミドにあるＢａｎＩＩ挿
入部位周辺のＤＮＡ配列を示すものである。第８図は、しんとうフラスコによる発酵の後。ＨＢＩＯＩ中でｐｃＴ７Ｇによつて生産された全大腸菌
タンパク質のＴｒｌｍ−ＳＤＳゲルクロマトグラフイを
示すものである。第９図は、１０Ｌ発酵器で発酵させた後ｐｃＴ７０によ
つて生産された全大腸菌タンパク質のＴｒｉｍ−ＳＤＳ
ゲルクロマトグラフイを示すものである。第１０図は、（ａ）にｐＣＴ７０からの３５Ｓ−メチオ
ニンでラベルした全大腸菌タンパク質の等電集束／Ｔｒ
ｉｓ−ＳＤＳゲルクロマトグラフイを示すものである。第１１図は、本物でない子牛のプロキモシンのポリクロ
ーン化した抗血清によつて大腸菌の中のｐＣＴ７０によ
り生産されたプロキモシンの沈殿を伴つた実験のＴｒｌ
ｍ−ＳＤＳゲルクロマトグラフイを示すものである。第１２図は、大腸菌の中のｐｃＴ７０によつて生産され
たプロキモシンの精製の初期段階における種々の分画の
Ｔｒｉｍ−ＳＤＳゲルクロマトグラフイを示すものであ
る。第１３図は、アルトロゲル（ｕｌｔｒｏｇｇｌ）ＡｃＡ
３４を用いたゲル浸透クロマトグラフイによつて、大腸
菌の酸性粗抽出物に存在する物質からの真性の子牛キモ
シンの分離状態を示したものである。代理人伊藤唱ａｂｃｄａｂｅｄ第１頁の続き優先権主張［相］１９８１年１１月１１日■イギリス（
ＧＢ）■や８１３３９９８ ■１９８１年１２月１日■イギリス（ＧＢ）■８１３６１８５ ■１９８２年２月１０日争イギリス（ＧＢ）■ｐ８２０３９０７０発明者マイケル・テレンス・ドールイギリス連合王国パツキンガムシア・スタドレー・グリーン・マイコーンブ・ロード・ウツドベリ（番地なり）ヴ■発明者チ士シー・ジョン・ロイ・ハリスイギリス連合王国バークシア・ブラツクネル・ビンフイールド・レツド・ローズ５４０発明者ピーク・アンソニー・ロウイギリス連合王国バークシア・リーデイング・メルローズ・アヴエニュー９［相］Ｒ明者ジョン・スペンサー・エムテージイギリス連合王国パツキンガムシア・ハイ・マイコーンブ・アマージャム・ヒル・ベンジャミン・ハウス１２１コ □」：手続補正書１、°１ν件の表示昭和５７年特許願第１０４６７２号２、発明の名称ポリペプチドの生産方法３、補止をする
者６、抽＋Ｅにより増ＩＪＩ＋する発明の数７、補正の月
象図面１：・・：′ ８、補正の内容

Claims

【特許請求の範囲】１、夫々メチオニン−キモシン、メチオニン−プロキモ
シン又はプレプロキモシンの暗号となる遺伝子を有する
ベクターシステムで形質転換された宿主有機体により発
現されたメチオニン−キモシン、メチオニン−プロキモ
シン又はプレプロキモシンを開裂させる操作よ）成るキ
モシンの生産方法。２、次の操作よ）成るキモシンの生産方法。ａ）メチオニン−プロキモシンの暗号となる遺伝子のベ
クターシステムへの挿入。ｂ）ベクターシステムを有する遺伝子による宿主有、機
体の形質転換。ｃ）キモシンを生成させるために、宿主有機体によつて
発現されたメチオニン−プロキモシンの開裂。３、次の操作より成るメチオニン−プロキモシンの生産
方法。ａ）メチオニン−プロキモシンの暗号となる遺伝子のベ
クターシステムへの挿入。ｂ）ベクターシステムを有する遺伝子による宿主有機体
の形質転換。ｃ）形質転換された宿主有機体によつて発現されたメチ
オニン−プロキモシンの単離。４、次の操作より成るプレプロキモシンの生産方法。ａ）プレプロキモシンの暗号となる遺伝子のベクターシ
ステムへの挿入。ｂ）ベクターシステムを有する遺伝子による宿主有機体
の形質転換。ｃ）発現させるための宿主有機体の培養。５、形質転換された宿主有機体によつて発現されたプレ
プロキモシンが単離される特許請求の範囲第４項記載の
操作。６、次の操作より成るメチオニン−キモシンの生産方法
。ａ）メチオエンーキモシ／の暗号となる遺伝子のベクタ
ーシステムへの挿入。ｂ）ベクターシステムを有する遺伝子による宿主有機体
の形質転換。ｃ）形質転換された宿主有機体によつて発現されたメチ
オニン−キモシンの単離。７、次の操作より成るプロキモシンの生産方法。ａ）プレプロキモシンの暗号となる遺伝子のベクターシ
ステムへの挿入。ｂ）ベクターシステムを有する遺伝子による宿主有機体
の形質転換。ｃ）プロキモシンを生成させるために形質転換された宿
主有機体によつて発現されたプレプロキモシンの開裂。８、次の操作より成るキモシンの生産方法。ａ）プレプロキモシンの暗号となる遺伝子のベクターシ
ステムへの挿入。ｂ）ベクターシステムを有する遺伝子による宿主有機体
の形質転換。ｃ）キモシンを生成させるために形質転換された宿主有
機体によつて発現されたプレプロキモシンの開裂。９、特許請求の範囲第１項、第２項又は第８項記載の方
法により生産されたキモシン。１０、メチオニン−プロキモシン。１１、特許請求の範囲第１項又は第３項記載の方法によ
り生産されたメチオニン−プロキモシン。１２、プレプロキモシン。１３、特許請求の範囲第１項、第４項又は第５項のいず
れか１項記載の操作により生産されたプレプロキモシン
。１４、前記した通シのプレプロキモシンの暗号となる遺
伝子。１５、前記した通シのメチオニン−プロキモシンの暗号
となる遺伝子。１６、前記した通シのメチオニン−キモシンの暗号とな
る遺伝子。１７、メチオニン−プロキモシンの暗号となる遺伝子を
含むベクターシステム。１８、プレプロキモシンの暗号となる遺伝子を含むベク
ターシステム。１９、メチオニン−キモシンの暗号となる遺伝子を含む
ベクターシステム。２０、調節可能な発現プロモータ配列を含む特許請求の
範囲第１７項から第１９項のいずれか１項記載のベクタ
ーシステム。２１、微生物宿主有機体を形質転換することができ、ま
た形質転換されていない宿主有機体の表現型とは異る形
質転換された宿主有機体に表現型を付与することができ
る１つ又はそれ以上の配列を含む特許請求の範囲第１７
項から第２０項のいずれか１項記載のベクターシステム
。２２、大腸菌トリプトフアン・オペロン・プロモータの
配列を含む特許請求の範囲第２１項記載のベクターシス
テム。２３、真核宿主有機体を形質転換することができ、また
形質転換されていない宿主有機体の表現型とは異る形質
転換された宿主有機体に表現型を付与することができる
１つ又はそれ以上の配列を含む特許請求の範囲第１７項
から第２０項のいずれか１項記載のベクターシステム。２４、宿主有機体が酵母である特許請求の範囲第２３項
記載のベクターシステム。２５、微生物プラスミドｐＢＲ３２２と酵母２μプラス
ミドから得た特許請求の範囲第２４項記載のベクターシ
ステム。２６、酵母ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）遺伝
子プロモータ配列を含む特許請求の範囲第２３項から第
２５項のいずれか１項記載のベクターシステム。２７、特許請求の範囲第１７項から第２６項のいずれか
１項記載のベクターシステムによつて形質転換された宿
主有機体。２８、特許請求の範囲第１７項から第２２項のいずれか
１項記載のベクターシステムによつて形質転換された微
生物。２、特許請求の範囲第１７項から第２２項のいずれか１
項記載のベクターシステムによつて形質転換された大腸
菌。３０、菌株がＲＶ３０８である特許請求の範囲第２９項
記載の大腸菌。３１、菌株がＲＶ３０８である特許請求の範囲第２９項
記載の大腸菌。３２、特許請求の範囲第１７項、第１８項、第１９項、
第２０項、第２３項、第２４項、第２５項、第２６項の
いずれか１項記載のベクターシステムによつて形質転換
された酵母。３３、特許請求の範囲第１７項、第１８項、第１９項、
第２０項、第２３項、第２４項、第２５項、第２６項の
いずれか１項記載のベクターシステムによつて形質転換
されたサツカロミセス・セレペシエ（口ｅｅｈａｒｏｍ
ｙｅａｅｒｖ１ｍｌａ＠）。３４、５’ＧＴＴ、ＣＡＴ、ＣＡＴ、ＧＴＴ３’のヌク
レオチド配列を含むオリゴヌクレオチド、ここで、Ｇは
グアニン、Ｔはチミン、Ａはアデニン、Ｃはシトシンで
ある。３５、特許請求の範囲第３４項のオリジヌクレオチドが
交雑プローブとして使用されている、キモシンのアミノ
酸配列を含むポリペプチドの暗号となるヌクレオチド配
列を含むｍＲＮＡの検出方法。３６、特許請求の範囲第３４項のオリジヌクレオチドが
転写プライマとして使用されている、キモシンのアミノ
酸配列を含むポリペプチドの暗号となる１本鎖ｅＤＮＡ
の一部分を調製するための方法。３７、試料の１つ又はそれ以上の希釈液が牛乳と一緒に
培養されるキモシン活性の検定法。３８、次の操作から成る特許請求の範囲第３３項記載の
キモシンの検定法。ａ）試料の段階的希釈物の調製。ｂ）各希釈液への牛乳の標準試料の添加。ｃ）所定時間の培養。ｄ）牛乳試料が凝固するがどうかの観察。３９、牛乳が水に溶かして元に戻した乾燥スキムミルク
である特許請求の範囲第３７項又は第３８順記載の検定
法。