JPH0787987A - ベンゼノイド前駆体の生物学的転換によるバニリンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 微生物による天然の前駆体の生物学的転換に
よって、簡単に工業化でき、特にＥＥＣ諸国の現行法規
では天然物と考えることができるバニリンを得ることを
可能とするバニリンの製造方法を提供することを目的と
する。 【構成】 培養基中にバニリンを蓄積したままベンゼノ
イド前駆体を分解する代謝能力を有する担子菌(basidio
mycete) のピクノポラス(Pycnoporus)属又はその変種及
び変異体の菌の培養を、バニリンの前記ベンゼノイド前
駆体を添加した培養基中において行ない、該前駆体の生
物学的転換の後に産生されたバニリンを回収して製造す
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ベンゼノイド前駆体の
生物学的転換によって、バニリンを製造する方法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】バニリンは、従来は、化学的合成による
か、又はバニラのさやからの抽出によって天然の状態で
得ていた。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、簡単
に工業化でき、特にＥＥＣ諸国の現行法規では天然物と
考えることができるバニリンを得ることを可能とする、
バニリンの製造方法を提供することにある。これは、微
生物による天然の前駆体の生物学的転換によって得られ
る生成物の場合である。

【０００４】

【課題を解決するための手段】この目的のために、本発
明により、担子菌(basidiomycete) のピクノポラス(Pyc
noporus)属の菌又はその変種及び変異体の培養を、バニ
リンのベンゼノイド前駆体を添加した培養基中において
行ない、該前駆体の生物学的転換の後に産生されたバニ
リンを回収し、前記ピクノポラス属又はその変種及び変
異体の菌株が、前記培養基中にバニリンを蓄積したまま
前記前駆体を分解する代謝能力のために選択されたこと
から成るバニリンの製造方法が提供される。ベンゼノイ
ド前駆体としては、４−ヒドロキシ３−メトキシベンゼ
ンの１位の誘導体例えばバニリン酸又はフエルラ酸が特
に使用される。

【０００５】特に適切な構成において、ピクノポラス・
シンナバリヌス(Pycnoporus cinnabarinus 和名：シュ
タケ) 種の菌、特に、ＣＮＣＭ Ｎｏ．Ｉ−９３７及び
Ｉ−９３８株又はその変種及び変異体であって培地中の
バニリンの蓄積に伴なってバニリンのベンゼノイド前駆
体例えばフエルラ酸の高レベルの分解を生じさせる代謝
能力を備えたものが使用される。

【０００６】有利には、好ましくは前駆体を多量に含有
する天然植物基質に由来する前駆体が使用される。多く
の単子葉類又は双子葉類の細胞膜中、例えば砂糖ビート
パルプ、製糖業の副生物、或いは小麦又は種々の穀物の
糊粉粒の細胞膜中に存在するフエルラ酸が例示される。
従って、フエルラ酸の天然の供給源は比較的潤沢であ
る。本発明の使用可能な天然起源の別のベンゼノイド前
駆体は、イソオイゲノールである。その他に、パラーヒ
ドロキシ安息香酸、パラ−ヒドロキシベンズアルデヒ
ド、バニリルアルコール及び特にスチルベンを使用する
ことができる。

【０００７】本発明の好ましい実施例による製造方法に
よれば、最初に、菌を液体培地中で攪拌培養し、前駆体
の生物学的転換させる最適の酵素能力を備えた大きなバ
イオマスが得られた後においてのみその前駆体を添加す
る。従って、有利には、ピクノポラス・シンナバリヌス
(Pycnoporus cinnabarinus) 菌の培養の場合には、必要
なバイオマスが得られた時に、即ち、以下に詳述するア
ペンディックス２の培地の培養条件の下で３日が経過し
た後に前駆体を添加する。

【０００８】培養開始時に前駆体を添加した場合にも、
バニリンへの生物学的転換は観察されるが、収率は非常
に低くなる。本発明による製造方法の特別の実施態様に
おいて、培養基に菌を接種するための接種物は、菌糸体
フラグメント又は胞子から成る、或いはこれらの前培養
物(preculture)から成る。培養基１ｍｌ当たり５０ｇま
での量の前駆体を導入することができる。

【０００９】本発明の製造方法によれば、培養基１００
ｍｌ当たり少なくとも１５個の菌糸体フラグメント及び
培養基１ｍｌ当たり１０⁵ ないし１０⁷ 個の胞子が使用
される。培養基ｐＨ値は、２．５ないし６．５とするこ
とができる。培養物の培養温度は、２５〜４０℃とする
ことができる。

【００１０】有利には、前駆体が培養基中において検出
できなくなった時に、そしてバニリルアルコールに生物
学的転換される前に、バニリンを回収する。バニリンを
回収するには、当業者には周知の工程に従って、培養基
からバニリンを溶剤抽出し、その後に蒸留を行なうこと
ができ、また、培養基に対して直接に分別晶出又は予備
的な工業クロマトグラフィーを行うことができる。

【００１１】本発明の製造方法によれば、前駆体は、順
次導入しても、連続的に導入してもよく、バニリンも、
順次回収しても連続的に回収しても良い。後に詳述する
アペンディックス２の培養基の培養条件の下では、前駆
体を導入してから４〜５日後にバニリンを回収する。本
発明の他の特徴及び長所は、以下の説明によって一層明
らかとなるであろう。

【００１２】

【実施例】

Ｉ．生物学的転換のプロトコール １）原則 生物学的転換に必要な酵素能力を備えた大量のバイオマ
スを得るために、また高収率を得るために、攪拌液体培
地中において、フィラメント状の担子菌を予め培養す
る。数日培養を続けた後、滅菌した前駆体を無菌的に添
加する。前駆体（フエルラ酸又はバニリン酸）の消失並
びにバニリンアルコール又はバニリン酸（フエルラ酸の
場合）への生物学的転換をＨＰＬＣ分析によってモニタ
ーする。

【００１３】２）使用菌株 パストウール・インスティテュートのコレクシオン・ナ
シオナル・ド・クルアウール・ド・ミクロオルガニスム
（ＣＮＣＭ）に寄託番号Ｉ−９３７及びＩ−９３８とし
て１９９０年４月１０日に寄託されたピクノポラス・シ
ンナバリヌス種の２つの担子菌を使用した。

【００１４】３）接種物の産生 ３つの形式の接種物、即ち、胞子又は菌糸体フラグメン
ト又はこれらの前培養物が可能である。

【００１５】ａ）胞子の産生 胞子形成培地２５０ｍｌ（組成アペンディックス１参
照）に、寒天培地上の培養物からの菌糸体フラグメント
を、ルー・フラスコ(Roux flask)中において接種する。
３７℃で３週間培養を行なう。この期間中に、寒天の表
面に菌糸体が発育して、分生子（胞子）を産生する。こ
れらの胞子は、滅菌した生理水溶液中に浸漬させたガラ
スビーズと共に攪拌することによって、固体の培養物の
表面から分離させる。このようにして得た胞子懸濁体
は、大きな菌糸体のフラグメントを全て除去するため
に、ガラスウールを介して濾過する。トーマ・セル(Tho
ma cell)上において計算を行なう。次に、この溶液既知
容積の数（アリコート）を用いて、培養物の接種物量を
測ることができる。

【００１６】 アペンディックス１ 固体胞子形成培地の組成 酵母エキス ３ｇ／ｌ 麦芽エキス ３ｇ／ｌ バクト・ペプトン ５ｇ／ｌ グルコース １０ｇ／ｌ 寒天 １５ｇ／ｌ ビチオン ０．００１％無菌溶液１リットル当り ０．５ｍｌ 塩溶液(1) ２０ｍｌ／ｌ (1) 塩溶液 クエン酸Ｎａ₃ ・２Ｈ₂ Ｏ １２５ｇ／ｌ ＫＨ₂ ＰＯ₄ （無水物） ２５０ｇ／ｌ ＮＨ₄ ＮＯ₃ （無水物） １００ｇ／ｌ ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ １０ｇ／ｌ 微量要素溶液(2) ５ｍｌ／ｌ (2) 微量要素の溶液 クエン酸・Ｈ₂ Ｏ ５０ｇ／ｌ 硝酸亜鉛 ５０ｇ／ｌ 硫酸銅 ２．５ｇ／ｌ 硫酸マンガン ０．５ｇ／ｌ ホウ酸 ０．５ｇ／ｌ Ｎａ₂ Ｍ₀ Ｏ₄ ・２Ｈ₂ Ｏ ０．５ｇ／ｌ Ｆｅ（ＮＨ₄ ）₂ （ＳＯ₄ ）₂ ・６Ｈ₂ Ｏ １０ｇ／ｌ

【００１７】ｂ）菌糸体フラグメントの産生 ペトリ皿中の固体培地（麦芽エキス２０ｇ／ｌ，寒天１
５ｇ／ｌ及び酵母エキス２ｇ／ｌ）の中心部に、寒天培
地上の培養物からの菌糸体のフラグメントを接種する。
菌糸体が表面を完全に覆うまで３７℃において培養を行
なう。この菌糸体のフラグメントを、直径約４ｍｍの中
空ポンチを用いて菌糸体のフラグメントを切開し、接種
物として使用する。

【００１８】ｃ）菌糸体の前培養物の作製 或る量の培養基（培養物の最終容積の５−１０％）中に
おいて、胞子又は菌糸体のフラグメントを培養して接種
物として使用する。

【００１９】４）培養の実施 特に動物性又は植物性の炭素源、無機塩及びビタミンを
慣例的に含有する培地１００ｍｌ（この培地の詳細な組
成についてはアペンディックス２参照）を、５００ｍｌ
の容量のエルレンマイヤーフラスコ中において使用す
る。菌糸体のフラグメント（１培養物当り１５−３０
個）又は胞子（培地１ｍｌ当り胞子数２×１０⁵ 個）に
よって接種を行なう。培養物を３７℃で、振幅６ｃｍ，
回転数１２０ｒｐｍで振盪培養を行なう。

【００２０】 アペンディックス２ 培養基の組成 麦芽糖 ２０ｇ／ｌ 酒石酸二アンモニウム １．８４１５ｇ／ｌ ＫＨ₂ ＰＯ₄ ０．２ｇ／ｌ ＣａＣｌ₂ ・２Ｈ₂ Ｏ ０．０１３２ｇ／ｌ ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ ０．５ｇ／ｌ 酵母エキス ０．５ｇ／ｌ 塩化チアミン ２．５ｇ／ｌ オートクレーブによる滅菌…１２０℃，１２分間

【００２１】５）培養物への前駆体の添加 ７２時間培養を行なった後、培養物１リットル当り０．
３ｇの比率で、滅菌フエルラ酸もしくは滅菌バニリン酸
を添加する。このフエルール酸及びバニリン酸は、 −オートクレーブ処理した結晶の形で、又は −濾過（多孔度、０．２μｍ）によって滅菌した水中塩
（例えばＮａ⁺,Ｋ⁺ もしくはＮＨ₄ ⁺塩）の形で、使用す
る。

【００２２】６）培養物の転換率のモニター ａ）サンプリング 毎日、培養物に前駆体を添加するごとに、各々の培養物
１．５ｍｌを無菌状態下で収出する。このアリコート
を、メタノールで予処理したハイドロプローグ膜（多孔
度、０．２μｍ）によって濾過し、濾液のＨＰＬＣ分析
を行なう。

【００２３】ｂ）ＨＰＬＣ分析 −反転相：ボンダパック Ｃ１８カラム −溶剤：Ｈ₂ Ｏ／メタノール中 ０．０１％ＣＨ₃ ＣＯ
ＯＨ −波長２８０ｎｍにおいて紫外線検出 −注入サンプル量：１０−５０μｌ被分析化合物の保持時間 −バニリルアルコール：１０分 −バニリン酸 ：１４分 −バニリン ：１６分 −フエルラ酸 ：１８分

【００２４】 ７）バイオマスの測定（「擬似反応速度」） この測定では、培養物を「犠牲」にすることが必要とな
る。尚、これらの条件下で得た結果は、同一の培養物が
研究を通じてモニタされるのではないため、反応速度の
真の像には対応していない。予め重量（風袋重量ないし
は機材重量）を測定したガラス繊維膜によって、培養物
１００ｍｌを濾過する。収集したバイオマスを２４時間
１００℃に保持する。対応する乾量（重量）を測定す
る。

【００２５】II．結果 菌株Ｎｏ．Ｉ−９３７を用いた例（菌株Ｉ−９３８を用
いても同一の結果が得られた）

【００２６】１）バニリン酸の生物学的転換 ａ）バイオマスの測定結果（擬似反応速度）

【００２７】図１は接種中に添加されたバニリン酸の生
物学的転換を示す線図である。図に示す通り、３〜４日
培養した後に、バニリン酸のすみやかで完全な消費が認
められた。微生物のバイオマスは分析の最終日まで増大
する。バニリン合成は２日目以降検出され、バニリンの
蓄積量は、研究の最終日まで増大する。バニリンへの最
高モル収率は低く、３．８％である。

【００２８】

【００２９】図２は培養の３日目に添加されたバニリン
酸の生物学的転換を示す線図である。図に示す通り、バ
ニリンの消費は、上例よりも迅速である。２日目には前
駆体の濃度は０ｍｇ／ｌに降下した。微生物のバイオマ
スは、バニリン酸の導入時の後はほとんど増大しない。
バニリン合成は、ほぼ即時的に行なわれ、最大含量は、
添加の２日後に達せられる。この点以降ではバニリンは
非常に迅速に培地から消失する。この場合は、バニリン
への転換の最大モル収率は、上例よりも相当に高く、３
５．１％となる。

【００３０】ｂ）バニリンアルコールの検定による、真
の反応速度を表わす結果

【００３１】図３はバニリン及びバニリンアルコールへ
のバニリン酸の生物学的転換を示す線図である。生物学
的転換の条件は上例と同一である。従って、バニリン酸
の濃度とバニリンの濃度とは同じであり、バニリン濃度
は、前駆体濃度が０ｍｇ／ｌに降下した時に最大とな
る。図に示す通り、バニリルアルコールの検定の結果
は、バニリンがそのアルコールに転換されたことを示し
ている。実際に、アルコールの現出は、バニリンの現出
に比べて約２４時間遅延し、アルコールの濃度は、バニ
リンが培養基から消失した時に相当増大する。生成の最
適化手段の１つは、バニリンの損失においてバニリルア
ルコールを生成をもたらすこの減少を阻止することであ
ろう。バニリンの転換の最大モル収率は、上例とほぼ同
じ３１％である。

【００３２】２）フエルラ酸の生物学的転換

【００３３】図４は接種物を添加したフエルラ酸の生物
学的転換を示す線図である。図に示す通り、接種時にバ
ニリン酸を添加した場合と同様に、バイオマスは、研究
の最終日まで相当に増大する。フエルラ酸の分解、４〜
５日後に完成する。バニリン酸とバニリンとの合成は認
められるが、収率は相当低い（バニリンへの転換の最大
モル収率は０．２％）。

【００３４】

【００３５】図５は培養の３日目に添加したしたフエル
ラ酸の生物学的転換を示す線図である。図に示す通り、
このように培養の３日目に添加すると、フエルラ酸は、
３日後には、培地から完全に消失する。バニリン酸及び
バニリンの同時合成が観察される。バニリンの量は、バ
ニリン酸と同様に、前駆体濃度が０となると最大にな
る。バニリンへの転換の最大モル収率は２０．５％であ
る。

【００３６】

【発明の効果】本発明は以上説明したとおり、簡単に工
業化でき、特にＥＥＣ諸国の現行法規では天然物と考え
ることができるバニリンを得ることを可能とする、バニ
リンの製造方法を得ることができるという効果がある。

【図面の簡単な説明】

【図１】接種中に添加されたバニリン酸の生物学的転換
を示す線図である。

【図２】培養の３日目に添加されたバニリン酸の生物学
的転換を示す線図である。

【図３】バニリン及びバニリンアルコールへのバニリン
酸の生物学的転換を示す線図である。

【図４】接種物を添加したフエルラ酸の生物学的転換を
示す線図である。

【図５】培養の３日目に添加したしたフエルラ酸の生物
学的転換を示す線図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 マルセル・アステル フランス国、78310 モールパ、アレ・ド ソワ １ (72)発明者 ジョルジュ・コリエ フランス国、78220 ヴィロフレ、アベニ ュ デ・コンバタン ２ (72)発明者 パスカル・ブルヌリ フランス国、94100 サン・モール、アヴ ェニュド・ジェネラル ルクルル 18

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 担子菌類(basidiomycete) のピクノポラ
   ス(Pycnoporus)属の又はその変種及び変異体の菌を、バ
   ニリンのベンゼノイド前駆体を添加した培養基中におい
   て培養し、 該前駆体の生物学的転換によって産生したバニリンを回
   収し、 前記ピクノポラス属又はその変種及び変異体の菌株が、
   前記培養基中にバニリンを蓄積したまま前記前駆体を分
   解する代謝能力のために選択されたことからなるベンゼ
   ノイド前駆体の生物学的転換によるバニリンの製造方
   法。
2. 【請求項２】 前記菌が、ピクノポラス・シンナバリヌ
   ス(Pycnopous cinnabarinns)種に属する請求項１に記載
   の製造方法。
3. 【請求項３】 前記前駆体が天然植物基質に由来する請
   求項１又は２に記載の製造方法。
4. 【請求項４】 ベンゼノイド前駆体がフエルニ酸である
   請求項１又は２に記載の製造方法。
5. 【請求項５】 最初に、攪拌された液体培地中で前記菌
   を培養し、前記前駆体の生物学的転換させるための最適
   の酵素能力を備えた大きなバイオマスが得られた後にの
   み前記前駆体を添加する請求項１〜４の何れか１項に記
   載の製造方法。
6. 【請求項６】 ピクノポラス・シンナバリヌスの培養の
   少なくとも３日後にに前記前駆体を前記培養基に添加す
   る請求項５に記載の製造方法。
7. 【請求項７】 菌糸体のフラグメント又は胞子から成る
   接種物を介して、又はこれらの接種物の前培養物によっ
   て、前記菌を前記培養基に接種する請求項１〜６の何れ
   か１項に記載の製造方法。
8. 【請求項８】 前記前駆体が培養基中において検出でき
   なくなった時に、且つバニリンがバニリルアルコールに
   生物学的転換される前にバニリンを回収する請求項１〜
   ７の何れか１項に記載の製造方法。
9. 【請求項９】 前記前駆体の導入とバニリンの回収とを
   順次又は連続的に行なう請求項１〜８の何れか１項に記
   載の製造方法。
10. 【請求項１０】 培地中のバニリンの蓄積に伴なってバ
    ニリンのベンゼノイド前駆体例えばフエルラ酸を分解す
    る代謝能力を備えたピクノポラス・シンナバリヌス菌Ｃ
    ＮＣＭ Ｎｏ．Ｉ−９３７及びＣＮＣＭ Ｎｏ．Ｉ−９
    ３８の菌株を使用する請求項１〜９の何れか１項に記載
    の製造方法。