JPH0787974A - 固定化リパーゼ - Google Patents
固定化リパーゼInfo
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Abstract
よび交換反応に優れた触媒作用をおこなうことのできる
固定化リパーゼを得る。 【構成】 低分子量キトサンを酸性水溶液に溶解し、該
溶解液を塩基性溶液中に落下せしめて得た再生粒状多孔
質キトサン担体に対し、脂肪族ポリアルコールのグリシ
ジルエーテルをキトサンのピラノース環残基1モル当た
り0.01〜0.4モル,総炭素数6〜20の高級脂肪
酸をキトサンのピラノース環残基1モル当たり0.05
〜1モル導入し、かつリパーゼが共有結合で固定化され
ている固定化リパーゼで、該固定化リパーゼの乾燥重量
当たりの脂質分解発現活性が0.01〜2u/mgであ
るところの固定化リパーゼ。
Description
用いるエステル結合の分解、合成または交換反応に優れ
た触媒作用を有する固定化リパーゼに関するものであ
り、特に各種エステルの交換反応により有機合成を行う
際に、遊離のリパーゼを反応させるのに比べて、はるか
に高い効率で不斉合成を行うことのできる固定化リパー
ゼを提供するものである。
が活発に研究されている。これは酵素が常温、常圧で反
応するため熱的に不安定な物質の合成が可能な上に、反
応が省エネルギーでクリーンである事、反応の特異性に
優れ、位置選択的、基質選択的反応や不斉合成が可能で
あるという、優れた特徴を有する事による。
酵素を各種合成反応や転移反応に応用できる事から注目
されている。リパーゼは脂質の加水分解酵素であるが、
他の酵素と比較して有機溶剤に耐性の高いものが多く、
エステル交換,エステル合成反応を高効率で行えるため
多くの検討が行われている。しかし、リパーゼは生産と
精製に多大な労力を必要とするため、これを工業的に利
用する上で、効率の高い固定化リパーゼの開発が重要な
課題であった。
ャーナル オブ アメリカン オイル ケミスツス ソ
サエティ」(Journal of American Oil Chemist's Soci
ety),第67巻、890−910(1990)に総説
があり、代表的な固定化用担体として、珪藻土やシリ
カ、多孔質ガラス等の無機系担体、各種合成樹脂及び合
成樹脂系イオン交換体、イオン交換基が導入されたセル
ロースや架橋デキストリン等の天然多糖類系担体が例と
してあげられている。この文献によると、これら担体は
親水性担体と疎水性担体に類別され、合成樹脂のような
疎水性担体に固定化されたリパーゼのエステル交換活性
発現率は、親水性担体に固定化されたリパーゼより高い
と報告されている。
パーゼの例としては、特開平4−287689号公報で
開示されている。これによればアンバーライトXAD−
2にシュードモナス由来のリパーゼを固定化した場合、
酢酸ビニルモノマーとα−D,L−フェニルエチルアル
コールのエステル交換反応の活性を発現するが、この様
な合樹脂系イオン交換体は、担体の疎水性が大きいもの
の、固定化リパーゼの重要な使用法である有機溶剤中で
の酵素反応に供した際に、残存モノマーの溶出や樹脂の
膨潤等が懸念される欠点がある。
て、リン脂質や脂肪酸によるリパーゼの処理が報告され
ている。リパーゼを固定化する際に、固定化用担体をリ
ン脂質や脂肪酸で処理して高活性を得る方法が特開昭6
2−134090号公報、特開平1−153090号公
報、特開平4−335893号公報に開示されている。
しかし、いずれの方法もリン脂質や脂肪酸が固定化用担
体と吸着または疎水結合によって固定化したものであっ
て、使用中にリン脂質や脂肪酸の脱離が起こり、効果の
低減が生ずる欠点がある。
た有機溶剤中でのエステル結合の分解,合成および交換
反応全般に優れた触媒作用を行うのに適し、特に高い効
率でエステルの交換反応を行うことのできる固定化リパ
ーゼを提供するものである。
行い、低分子量キトサンを酸性水溶液に溶解し、該溶解
液を塩基性溶液中に落下せしめて得た再生粒状多孔質キ
トサン担体に対し、脂肪族ポリアルコールのグリシジル
エーテルをキトサンのピラノース環残基1モル当たり
0.01〜0.4モル,総炭素数6〜20の高級脂肪酸
をキトサンのピラノース環残基1モル当たり0.05〜
1モル導入し、かつリパーゼが共有結合で固定化されて
いる固定化リパーゼで、該固定化リパーゼの乾燥重量当
たりの脂質分解発現活性が0.01〜2u/mgである
ところの固定化リパーゼが、前述の課題を解決するのに
好適であることを見いだした。但し、本願発明の脂質分
解発現活性は、実施例で示された如く300mMのモノ
ラウリンと2%の水を含むアセトン溶液を基質溶液と
し、37℃で15分間リパーゼを反応させたときに、1
分間に1μmolのグリセロールを生成するとき1uと
定義する。
素や基質の拡散に優れ、強度が高く、カラムに充填して
使用するのに容易なため、固定化用担体を調整するのに
好適である。再生粒状多孔質キトサン担体は特公平1−
16420号で開示された方法で得られる。即ち、平均
分子量が10,000〜230,000の範囲である低
分子量キトサンを酸性水溶液に溶解し、該溶解液を塩基
性溶液中に落下せしめて多孔質キトサンを凝固再生させ
ることによって得られる。
リアルコールのグリシジルエーテルによる架橋反応、及
び次いで高級脂肪酸の酸ハロゲン化物もしくは酸無水物
との反応は以下に述べる如くである(特願平5−515
65号明細書参照)。
肪族ポリアルコールのグリシジルエーテルとしては、例
えばジメチレンエーテルの繰り返し数が1〜22個のエ
チレングリコールジグリシジルエーテルもしくはポリエ
チレングリコールジグリシジルエーテル,プロピレンエ
ーテルの繰り返し数が1〜66個のポリプロピレングリ
コールジグリシジルエーテル,グリシジルエーテルの数
が2〜3個のグリセロールポリグリシジルエーテル等で
ある。具体的にはエチレングリコールジグリシジルエー
テル,ジエチレングリコールジグリシジルエーテル等の
ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル,プロピ
レングリコールジグリシジルエーテル,ジプロピレング
リコールジグリシジルエーテル等のポリプロピレングリ
コールジグリシジルエーテル,グリセロールジグリシジ
ルエーテル,グリセロールトリグリシジルエーテル等が
あげられる。
ルを再生粒状多孔質キトサン担体に導入する反応におい
て、脂肪族ポリアルコールのグリシジルエーテルの濃度
は0.005〜2エポキシ当量/L、液量は担体容積と
等量、反応温度は20〜90℃、反応時間は1〜24時
間でゆるやかに攪拌しながら行われる。
シジルエーテルを該キトサンのピラノース環残基1モル
当たり0.01〜0.4モル導入する。
残基1モル当たり0.01モルより低い場合、固定化リ
パーゼを有機溶剤中で使用するために脱水乾燥を行う時
点で、固定化リパーゼの収縮が著しく、結果としてリパ
ーゼのエステル交換発現活性が低い。一方、導入量をキ
トサンのピラノース環残基1モル当たり0.4モルより
多くする事は困難であり、実用的ではない上に、発現活
性の低下がみられるため、好ましくない。
体に共有結合で高級脂肪酸の酸ハロゲン化物もしくは酸
無水物を導入する。
体の含有する水分を、極性有機溶剤で充分に除去する。
極性有機溶剤としては例えばジオキサン,エタノール,
イソプロピルアルコール,ジメチルホルムアミド,ジメ
チルアセトアミド,ジメチルスルホキシド,ピリジン等
があげられる。次に導入反応に際してはこれら極性有機
溶剤とヘキサン,メチレンクロライド,クロロホルム等
の非極性有機溶剤との混合溶剤を用いても良い。これら
溶剤の中から適宜、導入する高級脂肪酸の酸無水物、も
しくは酸ハロゲン化物に対し、不活性な溶剤を選択し使
用する。酸ハロゲン化物の様な反応性の高い物質の場合
は、例えばジオキサン,ジメチルホルムアミド,ジメチ
ルアセトアミドのいずれか、またはその混合物を用いる
のが好ましい。
素が疎水性を有するとされる程度の炭素数、一般的には
総炭素数が6〜20の飽和、不飽和脂肪酸が好ましい。
物、もしくは酸塩化物や酸臭化物の様な酸ハロゲン化物
が用いられ、酸無水物としては例えば無水ラウリン酸,
無水ミリスチン酸,無水パルミチン酸,無水ステアリン
酸,無水オレイン酸等、また、酸ハロゲン化物としては
例えば塩化ラウロイル,塩化ミリストイル,塩化パルミ
トイル,塩化ステアロイル,塩化オレイル等の酸塩化物
が好ましく、酸無水物よりも酸ハロゲン化物の方が導入
量が向上するので好ましい。
て、例えばその濃度は10〜500mmol/L、液量
は担体容積と当容量、反応温度は10〜70℃、反応時
間は1〜24時間でゆるやかに攪拌しながら行われる。
酸を除去する目的で脱酸剤を添加する場合は、反応溶媒
に溶解する一般的な脱酸剤であれば特に限定されない
が、トリエチルアミンやピリジンが好ましい。この様に
して高級脂肪酸がキトサンのピラノース環残基1モル当
たり0.05〜1モル導入された該キトサン担体を得
る。
いと脂質の分解発現活性とエステル交換発現活性が極端
に低下し、脂質分解発現活性の発現率も小さくなるため
固定化の意義は認められなくなる。高級脂肪酸の導入に
従って発現率は向上するが、1モルより大きい場合は頭
打ちとなり導入量向上の効果が認められなくなる。
グリシジルエーテルによる架橋反応をし、次いで高級脂
肪酸の酸ハロゲン化物もしくは酸無水物の導入反応を行
った架橋粒状多孔質キトサンを担体という。
化を行う。リパーゼとしては例えばリゾプス(Rhizopu
s)属,アスペルギルス(Aspergillus )属,ムコール
(Mucor )属,シュードモナス(Pseudomonas )属,ペ
ニシリウム(Penicillium )属,クロモバクテリウム
(Chromobacterium )属,キャンディダ(Candida )属
等の微生物起源のリパーゼ及び膵臓リパーゼ等の動物由
来のリパーゼが用いられ、特に好ましくはクロモバクテ
リウム属やシュードモナス属由来のリパーゼがあげられ
る。
望ましく、少なくとも総蛋白量に対してリパーゼが50
%以上の純度であることが好ましい。リパーゼの固定化
を行うにあたって、反応温度は失活の起きない範囲であ
ればよく、例えば0〜60℃、好ましくは5〜40℃が
よい。また、リパーゼ水溶液のpHは酵素の変性が起き
ない範囲であればよく、pH3〜9が好ましい。
る上で、多官能性の架橋試薬による、酵素と担体の共有
結合を行うことが重要である。多官能性の架橋試薬とし
ては例えば、グリオキザール,グルタルアルデヒド,マ
ロンアルデヒド,スクシニルアルデヒド,ビススルフォ
スクシニミジルスベラート,ジメチルスベリミデート,
エチレングリコールビススルフォスクシニミジルスクシ
ネート,ジシクロヘキシルカルボジイミド,ヘキサメチ
レンジイソシアネート等があげられ、例えばリパーゼ分
子1モル当たり1.2〜2倍モル用いればよい。
の固定化に先立ち予め担体と反応させてもよく、または
担体とリパーゼとを疎水結合によって反応させてから架
橋処理を行ってもよい。本発明では以下、担体にリパー
ゼを固定化した固定化酵素を固定化リパーゼという。
定するとき、基質として用いるトリグリセリド脂質は水
に溶解しないため、水と脂質の混合物を激しく撹拌し脂
質を水中に懸濁させるか、界面活性剤を加えエマルジョ
ンを作り脂質を分散させる。固定化リパーゼを水中で反
応させるときは、微粒子状の脂質が担体内部に固定化さ
れたリパーゼと接触できないため、見かけの活性発現率
が大幅に低くなる。従って、脂質を有機溶剤に溶解し、
固定化リパーゼの発現活性の指標とするのが適当であ
る。
きには、固定化リパーゼに含まれている水分を有機溶剤
で除去した後、真空乾燥し乾燥固定化リパーゼとして、
エステル分解,交換,合成反応に供する。なお本発明に
おける乾燥固定化リパーゼの乾燥率としては5%以下の
水分率を意味する。
発現活性とは、後述の実施例で示された如く、300m
Mのモノラウリンと2%の水を含むアセトン溶液を基質
溶液とし、37℃で15分間リパーゼを反応させたとき
に、1分間に1μmolのグリセロールを生成するとき
1uと定義する。
解発現活性を指標としたとき、固定化リパーゼの乾燥重
量当たり、0.01〜2u/mgの脂質分解発現活性を
有する固定化リパーゼがエステルの分解,交換及び合成
反応に好適である。固定化されているリパーゼが発現活
性が0.01u/mgより少ない量の場合は、固定化リ
パーゼの安定性が低く、有機溶剤中で保存すると失活
し、保存後に活性測定すると発現活性が著しく低下す
る。また2u/mg以上の活性を得るためにリパーゼの
固定化量を増やすと、発現活性がそれに見合うだけの大
きさにならず、結果として活性発現率が低くなり、酵素
が無駄になる。特に好ましくは脂質分解発現活性が0.
1u/mg〜1.5u/mgの範囲である。
水または緩衝液に懸濁せしめた状態の基質液あるいは有
機溶剤に溶解した基質溶液に添加し混合攪拌しながら用
いることもできる。また、固定化リパーゼをカラム等の
容器に予め充填し基質溶液を通液することによりエステ
ルの加水分解,エステル交換,エステル合成反応等を行
うことができる。
するが、本発明はこの範囲に限定されるものではない。
尚、各測定値は以下記載の試験方法により求めた。
脂肪族ポリアルコールのグリシジルエーテル導入量測定
方法 脂肪族ポリアルコールのグリシジルエーテルを反応さ
せた後、再生粒状多孔質キトサン担体を濾別し反応残液
を回収する。 該キトサン担体に、これと等容積の純水を加え室温で
20分間攪拌,洗浄する。このキトサン担体を濾別、残
液を回収する。これを4回繰り返す。 回収した反応残液をロータリーエバポレーターで減圧
濃縮し、蒸発乾固するまで水分を充分に除く。 残留した脂肪族ポリアルコールのグリシジルエーテル
をテトラヒドロフランで溶解し、高速液体クロマトグラ
フィーで定量する。同時に反応前の脂肪族ポリアルコー
ルのグリシジルエーテル水溶液を別途調製し、同様の方
法で高速液体クロマトグラフィーにより定量する。 ピラノース環残基当たり導入量値は次式より求める。
0,50,100,150,300,500mmol/
L加えて溶剤中で反応させた後、この架橋再生粒状多孔
質キトサン担体を濾別し反応残液を回収する。 高級脂肪酸導入後の架橋再生粒状多孔質キトサン担体
に、これと等容積の反応に用いた溶剤を加え室温で20
分間撹拌,洗浄する。該架橋再生粒状多孔質キトサン担
体を濾別、残液を回収する。これを2回繰り返す。 次に1,000mmol/Lのトリエチルアミンを含
む反応溶剤を、架橋再生粒状多孔質キトサン担体と等容
積加え、室温で30分間撹拌し洗浄後、架橋再生粒状多
孔質キトサン担体を濾別、残液を回収する。 この架橋再生粒状多孔質キトサン担体に、これと等容
積の反応に用いた溶剤を加え室温で20分間撹拌,洗浄
する。架橋再生粒状多孔質キトサン担体を濾別、残液を
回収する。これを4回繰り返す。 回収した残液中の高級脂肪酸と高級脂肪酸の酸無水物
もしくは酸ハロゲン化物に、メチル化剤として水酸化テ
トラメチルアンモニウムを加え、熱分解装置キューリー
ポイントパイロライザー(日本分析工業 (株) JHP−
3)とガスクロマトグラフィー(島津製作所 (株) GC
MS−QP2000GF)を使い、熱分解ガスクロ法に
よって未反応の高級脂肪酸の酸無水物もしくは酸ハロゲ
ン化物を定量する。 投入した高級脂肪酸の酸無水物もしくは酸ハロゲン化
物から未反応物を差し引くことにより、導入された高級
脂肪酸量を求める。グルコサミン残基当たり高級脂肪酸
導入量値を次式より求める。
テトラメチルアンモニウムを加え、熱分解ガスクロ法に
よって試料に導入されている高級脂肪酸量を定量する。 この結果に基づき、担体中の高級脂肪酸の導入量を熱分
解ガスクロで測定する事により求める。
赤外分光光度計(以下FT−IRと略す。JIR−DI
AMOND20,日本電子 (株) 製)で、2850cm
-1, 2925cm-1でのメチレンの吸収と、1750c
m-1でのエステルの吸収の増大からステアロイルの導入
を確認する。
液(pH7.5)を0.5ml、純水を23.5ml混
合して酸素液とし、担体を入れる。 37℃で1時間攪拌しリパーゼを担体に吸着させる。 担体を濾別しよく水洗する。 1M−リン酸緩衝液(pH7.5)を0.5ml、純
水を24.25ml、1%グルタルアルデヒド水溶液を
0.25ml混合し固定液とする。 固定液にリパーゼ吸着後の担体を入れ、37℃で1時
間撹拌し、リパーゼを担体と共有結合で固定化する。 担体を濾別し、よく水洗し、湿潤固定化リパーゼを得
る。 アセトンで固定化リパーゼに含まれる水を十分に除去
脱水し、真空乾燥することにより水分率5%以下の乾燥
固定化リパーゼを得る。
4.9mlを調製する。 2mg/mlのリパーゼ水溶液0.1mlを加え37
℃で15分間反応する(このときのモノラウリンの濃度
は300mM、水分濃度は2%である。)。 反応後、この溶液0.5mlと0.5mlの0.2規
定の塩酸を混合し、37℃で10分間静置してリパーゼ
を失活させ、脂質分解液を得る。 次の組成からなる試験液を調製する。 50mM−トリス塩酸緩衝液(pH7.5) 0.05%界面活性剤(トリトンX−100,ローム・
アンド・ハース製) 1mM−MgCl2 1mM−アデノシン3リン酸 1u/mlグリセロールキナーゼ 5u/mlグリセロフォスフェートオキシダーゼ 0.03%4−アミノアンチピリン 0.03%3,5-ジメトキシ -N-エチル-(2-ヒドロキシ -
3-スルフォプロピル)-アニリン,ナトリウム塩 4.5u/mlパーオキシダーゼ で得られたリパーゼ反応液を2%のトリトンX−1
00で11倍に希釈後、20μlとりで示した試験液
0.5mlに添加し37℃で10分間発色反応を行う。 0.5%ソジウムドデシル硫酸を1ml加えた600
nmの吸光度を測定する。 脂質分解発現活性値を次式で求める。
トン溶液5mlに10mgの乾燥固定化リパーゼを添加
し、37℃で15分間撹拌しながら反応を行う。 固定化リパーゼを濾別し脂質分解液を得る。 前記5の遊離リパーゼ脂質分解発現活性測定法のに
記載した方法と同じ方法により測定する。 発現活性値を次式より求める。
%の酢酸ビニルモノマーを含むヘキサン溶液を調製し基
質とする。 加水分解発現活性で5u相当量の重量の粉末リパーゼ
を秤量し、該基質2mlに加え25℃で3時間撹拌し、
エステル交換反応を行う。 反応終了後、濾過により固定化リパーゼを素早く除き
反応液を−50℃に冷却し、反応を停止する。 光学分割カラム(キラセルOB,ダイセル化学工業
(株) 製)を用い高速液体クロマトグラフィーにて反応
液の組成を測定し、α−L−フェニルエチルアルコール
の減少量(μmol)を求める。 遊離リパーゼのエステル交換発現活性値は25℃にて
1分間に1μmolのα−L−フェニルエチルアルコー
ルをアシル化するとき1uとし、次式より求める。
現活性測定方法 湿潤固定化リパーゼが含む水分をアセトンで除去後、
真空乾燥しアセトンを除去、乾燥固定化リパーゼを得
る。 2.5%のα−D、L−フェニルエチルアルコールと
2%の酢酸ビニルモノマーを含むヘキサン溶液を調製し
基質とする。 脂質分解発現活性で10u相当量の重量の乾燥固定化
リパーゼを秤量し、該基質2mlに加え、25℃で3時
間撹拌し、エステル交換反応を行なう。 反応終了後、濾過により固定化リパーゼを素早く除き
反応を停止する。 光学分割カラム(キラルセルOB,ダイセル化学工業
(株)製)を用い高速液体クロマトグラフィーにて反応
液の組成を測定し、α−L−フェニルエチルアルコール
の減少量(μmol)を求める。 乾燥固定化リパーゼのエステル交換発現活性値は25
℃にて1分間に1μmolのα−L−フェニルエチルア
ルコールをアシル化するとき1uとし、次式より求め
る。
剤(アデカトールSO−120,旭電化工業 (株) 製)
20g、純水60mlと混ぜ、エマルジョン基質とす
る。 該基質25mlに純水10mlを加え37℃で10分
間予備加熱する。 固定化操作に使用する酵素水溶液0.1mlを基質に
加え37℃で5分間反応させる。 アセトンを50%含むエタノールを80ml加え、撹
拌し酵素反応を停止する。 50mMのNaOHで酵素反応により遊離した脂肪酸
を滴定し、滴定量を求める。 ブランクとして上記と同様の操作において、の操作
で、酵素水溶液のかわりに純水を0.1ml加え、滴定
量を求める。 固定化操作前のリパーゼ水溶液のエマルジョン脂質分
解発現活性値A(u/ml水溶液)を次式より求める。
分解発現活性値B(u/ml水溶液)を上記と同様に
測定する。 固定化率Cはとで求めたAとBより次式で求め
る。
をD(mg)とする。一方、得られる固定化リパーゼの
乾燥重量E(mg)を測定する。 前記測定方法5および6で示した方法により求めた遊
離リパーゼの脂質分解発現活性値F(u/mg)と固定
化リパーゼの脂質分解活性値G(u/mg)とから次式
によって脂質分解発現活性の発現率(%)を算出した。
より求めた遊離リパーゼのエステル交換発現活性値H
(u/mg)と固定化リパーゼのエステル交換発現活性
値I(u/mg)とから次式によってエステル交換発現
活性の発現率(%)を算出した。
ときのピラノース環残基1個当たりの平均の分子量は1
69.5である)、平均分子量60,000のキトサン
1200gを3.5%酢酸水溶液18,800gに溶解
した。該水溶液を、7%水酸化ナトリウム,20%エタ
ノール,73%水よりなる凝固溶液中に落下し、キトサ
ンを粒状多孔質に凝固再生し、中性になるまで充分水洗
し、平均粒径0.1mmの再生粒状多孔質キトサン担体
10,000ml(湿潤)を得た。得られた再生粒状多
孔質キトサン100mlを乾燥したところ5.086g
であった。従ってこの再生粒状多孔質キトサン100m
lに含まれるピラノース環残基は0.0300モルであ
った。
100mlに水100mlと表1に示した分量のエチレ
ングリコールジグリシジルエーテル(エポキシ当量8
7.13)を加えた60℃で1時間架橋反応させた。反
応終了後、水洗し、試料A,B,C,D,E,Fの6種
の架橋再生粒状多孔質キトサン担体100mlを得た。
エチレングリコールジグリシジルエーテルの導入量を測
定し表1にその結果を示す。
含む水をジメチルアセトアミドで充分に除去した。該架
橋再生粒状多孔質キトサン100mlにジメチルアセト
アミド100ml,1.524gの塩化ステアロイルと
0.506gのトリエチルアミンを加えた。このときの
塩化ステアロイルとトリエチルアミンの濃度は、それぞ
れ50mmol/Lであった。
た。反応残液を除去したのち、ジメチルアセトアミドで
洗浄し、次いでジメチルアセトアミドを純水で除去し担
体A´,B´,C´,D´,E´,F´を得た。熱分解
ガスクロマトグラフィーでキトサンのピラノース環残基
1モル当たりのステアリン酸導入量を定量した結果を表
2に示す。
ウムビスコスム由来のリパーゼ(旭化成工業(株)製、
T−01)を上述の試験方法4の固定化リパーゼの調整
法の所定濃度を20mg/mlとして固定化し、固定化
リパーゼA″,B″,C″,D″,E″,F″6種を得
た。各々のこれらの固定化活性,発現活性,発現率は表
3の通りであった。
ルコールのグリシジルエーテル導入量が該キトサン担体
のピラノース環残基1モル当たり0.01〜0.4モル
のとき、固定化リパーゼの脂質分解発現活性の発現率及
びエステル交換発現活性の発現率が極めて高く好適であ
った。尚、A″は有機溶剤中で使用するとき収縮が見ら
れ使用に適し難い。
た再生粒状多孔質キトサン担体800mlに水800m
lとエチレングリコールジグリシジルエーテル4.18
4gを加えて60℃で1時間架橋反応させた。反応終了
後、水洗し、架橋再生粒状多孔質キトサン担体800m
lを得た。エチレングリコールジグリシジルエーテルの
導入量は0.078モルであった。
をジメチルアセトアミドで充分に除去した。該架橋再生
粒状多孔質キトサン担体100mlの8種類の試料G,
H,I,J,K,L,M,N各々にジメチルアセトアミ
ド100mlと表4に示す分量の塩化ステアロイルとト
リエチルアミンを加え(このときの塩化ステアロイルと
トリエチルアミンのそれぞれの濃度を表4にあわせて示
した)各々を40℃で攪拌し10時間反応させた。
アミドで洗浄し、次いでジメチルアセトアミドを純水で
除去し担体G´,H´,I´,J´,K´,L´,M
´,N´を得た。各々のFT−IRの測定結果を図1,
2,3,4,5,6,7,8に示した。2849c
m-1,2919cm-1でのメチレンの吸収と、1738
cm-1でのエステルの吸収が増大し、ステアロイルが導
入されていることが確認された。熱分解ガスクロマトグ
ラフィーで測定した該キトサン担体のピラノース環残基
1モル当たりのステアリン酸導入量測定値を表5に示し
た。
ム・ビスコスム由来のリパーゼ(旭化成工業(株)製、
T−01)を、実施例1と同様の方法でリパーゼを固定
化し固定化リパーゼG″,H″,I″,J″,K″,
L″,M″,N″を得た。これらの固定化活性,発現活
性,発現率を測定した結果を表6に示す。
導入量が該キトサン担体のピラノース環残基1モル当た
り0.05から1モルのとき脂質分解発現活性の発現率
及びエステル交換発現活性の発現率が極めて高く好適で
あった。
ol/Lの塩化オクタノイル(総炭素数6),塩化ラウ
ロイル(総炭素数12),塩化ステアロイル(総炭素数
18),塩化パルミトイル(総炭素数16)と濃度にし
て37.5mmol/Lのトリエチルアミンを50ml
のジメチルアセトアミドに溶解(各々重量にして0.6
10g,0.821g,1.136g,1.031gで
ある)し、実施例1と同様の方法で得られた架橋再生粒
状多孔質キトサン50mlの各々に加え、40℃で攪拌
しながら15時間反応させた。濾過により反応残液を除
去し、ジメチルアセトアミドで洗浄し、水洗後担体O,
P,Q,Rをそれぞれ得た。熱分解ガスクロマトグラフ
ィーで測定した該キトサン担体のピラノース環残基1モ
ル当たりの高級脂肪酸導入量測定値を表7に示した。
コスム由来のリパーゼ(旭化成工業(株)製、T−0
1)を、実施例1と同様の方法でリパーゼを固定化し、
固定化リパーゼO´,P´,Q´,R´を得た。各々の
これらの固定化活性、発現活性、発現率は表8の通りで
あった。
総炭素数は6〜20の範囲で脂質分解発現活性,エステ
ル交換発現活性が高く好適であった。
´を得てその5mlに10mMリン酸緩衝液(pH7.
5)25mlに溶解したシュードモナス由来のリパーゼ
(旭化成工業(株)製、、T−18)195,000u
を加え1時間攪拌した。この後、10mMリン酸緩衝液
(pH7.5)で充分洗浄を行った後、、0.2%にな
るようにグルタルアルデヒドを加え37℃で30分間攪
拌し架橋処理を行い、濾過により湿潤固定化リパーゼを
集め実施例1と同様の操作により乾燥固定化リパーゼを
取得した。この固定化活性,脂質分解活性,エステル交
換活性測定値を表9に示した。
由来のリパーゼを用いても優れた脂質分解発現活性,エ
ステル交換発現活性を示すものである。
如く変えて、実施例2と同様にして得られた担体I´の
1g湿重各々に、クロモバクテリウム・ビスコスム由来
のリパーゼ(旭化成工業(株)製、T−01)を実施例
2と同様の操作で固定化した。実施例1と同様の操作で
乾燥固定化リパーゼを調製し、エステル交換反応および
モノラウリン脂質分解反応での発現活性,発現率を測定
し表10に示した。またこの乾燥固定化リパーゼを各々
50mg秤量し、これを2mlのn−ヘキサンに懸濁、
37℃で18時間振とうし、ガラスフィルターで濾過す
ることにより固定化リパーゼを回収した。この後の固定
化リパーゼのエステル交換発現活性値を測定し、次式か
らヘキサン懸濁後の活性残存率値を計算し、その結果を
表10に示した。
で保存しても脂質分解発現活性が0.01u/mg以上
で活性残存率が高く、特に0.1u/mg以上では極め
て安定性の高い固定化リパーゼが得られた。
高くなるに従い大きくなった。特に脂質分解発現活性が
0.01〜1.5u/mgの範囲では、リパーゼ固定化
量に比例して増大し、発現率はほぼ一定であった。しか
し脂質分解発現活性が1.6u/mg以上では発現活性
がリパーゼ固定化量に比例せず、発現率は減少した。
2u/mgの範囲が好適であり、特に好ましくは0.1
〜1.5u/mgの範囲で、固定化リパーゼの活性収率
と活性残存率は極めて優れていることが明らかである。
リアルコールのグリシジルエーテルをキトサンのピラノ
ース環残基1モル当たり0.01〜0.4モル、総炭素
数6〜20の高級脂肪酸の酸ハロゲン化物もしくは酸無
水物をキトサンのピラノース環残基1モル当たり0.0
5〜1モル導入し、かつリパーゼが共有結合で固定化さ
れている固定化リパーゼで、該固定化リパーゼの乾燥重
量当たりの脂質分解発現活性が0.01〜2u/mgで
ある固定化リパーゼは、有機溶剤中でのエステル結合の
分解,合成および交換反応に優れた触媒作用を有するも
のであり、特に各種エステルの交換反応で有機合成を行
う際に、遊離の酵素粉末や従来の固定化リパーゼと比較
して、著しく高い効率で不斉合成を行うことのできる優
れた効果のある固定化リパーゼである。
換赤外分光光度計による測定結果を示す。
換赤外分光光度計による測定結果を示す。
換赤外分光光度計による測定結果を示す。
換赤外分光光度計による測定結果を示す。
換赤外分光光度計による測定結果を示す。
換赤外分光光度計による測定結果を示す。
換赤外分光光度計による測定結果を示す。
換赤外分光光度計による測定結果を示す。
方法 306mMのモノラウリンを含有するアセトン溶液
4.9mlを調製する。 2mg/mlのリパーゼ水溶液0.1mlを加え37
℃で15分間反応する(このときのモノラウリンの濃度
は300mM、水分濃度は2%である。)。 反応後、この溶液0.5mlと0.5mlの0.2規
定の塩酸を混合し、50℃で10分間静置してリパーゼ
を失活させ、脂質分解液を得る。 次の組成からなる試験液を調製する。 50mM−トリス塩酸緩衝液(pH7.5) 0.05%界面活性剤(トリトンX−100,ローム・
アンド・ハース製) 1mM−MgCl2 1mM−アデノシン3リン酸 1u/mlグリセロールキナーゼ 5u/mlグリセロフォスフェートオキシダーゼ 0.03%4−アミノアンチピリン 0.03%3,5−ジメトキシ−N−エチル−(2−ヒ
ドロキシ−3−スルフォプロピル)−アニリン,ナトリ
ウム塩 4.5u/mlパーオキシダーゼ で得られたリパーゼ反応液を2%のトリトンX−1
00で11倍に希釈後、20μlとりで示した試験液
0.5mlに添加し37℃で10分間発色反応を行う。 0.5%ソジウムドデシル硫酸を1ml加えた600
nmの吸光度を測定する。 脂質分解発現活性値を次式で求める。
Claims (1)
- 【請求項1】 再生粒状多孔質キトサン担体に、脂肪族
ポリアルコールのグリシジルエーテルがキトサンのピラ
ノース環残基1モル当たり0.01〜0.4モル、総炭
素数6〜20の高級脂肪酸の酸ハロゲン化物もしくは酸
無水物がキトサンのピラノース環残基1モル当たり0.
05〜1モル導入され、かつリパーゼが共有結合で固定
化されている固定化リパーゼであり、該固定化リパーゼ
の乾燥重量当たりの脂質分解発現活性が0.01〜2u
/mgであることを特徴とする固定化リパーゼ。(但
し、乾燥固定化リパーゼの脂質分解発現活性は、300
mMのモノラウリンと2%の水を含むアセトン溶液を基
質溶液とし、37℃で15分間リパーゼを反応させたと
きに、1分間に1μmolのグリセロールを生成すると
き1uと定義する。)
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