JPH0787974A - 固定化リパーゼ - Google Patents
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- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2411—Amylases
- C12N9/2428—Glucan 1,4-alpha-glucosidase (3.2.1.3), i.e. glucoamylase
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- C12N9/90—Isomerases (5.)
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 有機溶剤中でのエステル結合の分解，合成お
よび交換反応に優れた触媒作用をおこなうことのできる
固定化リパーゼを得る。 【構成】 低分子量キトサンを酸性水溶液に溶解し、該
溶解液を塩基性溶液中に落下せしめて得た再生粒状多孔
質キトサン担体に対し、脂肪族ポリアルコールのグリシ
ジルエーテルをキトサンのピラノース環残基１モル当た
り０．０１〜０．４モル，総炭素数６〜２０の高級脂肪
酸をキトサンのピラノース環残基１モル当たり０．０５
〜１モル導入し、かつリパーゼが共有結合で固定化され
ている固定化リパーゼで、該固定化リパーゼの乾燥重量
当たりの脂質分解発現活性が０．０１〜２ｕ／ｍｇであ
るところの固定化リパーゼ。
よび交換反応に優れた触媒作用をおこなうことのできる
固定化リパーゼを得る。 【構成】 低分子量キトサンを酸性水溶液に溶解し、該
溶解液を塩基性溶液中に落下せしめて得た再生粒状多孔
質キトサン担体に対し、脂肪族ポリアルコールのグリシ
ジルエーテルをキトサンのピラノース環残基１モル当た
り０．０１〜０．４モル，総炭素数６〜２０の高級脂肪
酸をキトサンのピラノース環残基１モル当たり０．０５
〜１モル導入し、かつリパーゼが共有結合で固定化され
ている固定化リパーゼで、該固定化リパーゼの乾燥重量
当たりの脂質分解発現活性が０．０１〜２ｕ／ｍｇであ
るところの固定化リパーゼ。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、有機溶剤中にて酵素を
用いるエステル結合の分解、合成または交換反応に優れ
た触媒作用を有する固定化リパーゼに関するものであ
り、特に各種エステルの交換反応により有機合成を行う
際に、遊離のリパーゼを反応させるのに比べて、はるか
に高い効率で不斉合成を行うことのできる固定化リパー
ゼを提供するものである。
用いるエステル結合の分解、合成または交換反応に優れ
た触媒作用を有する固定化リパーゼに関するものであ
り、特に各種エステルの交換反応により有機合成を行う
際に、遊離のリパーゼを反応させるのに比べて、はるか
に高い効率で不斉合成を行うことのできる固定化リパー
ゼを提供するものである。
【０００２】
【従来の技術】近年、酵素を利用した有機合成への応用
が活発に研究されている。これは酵素が常温、常圧で反
応するため熱的に不安定な物質の合成が可能な上に、反
応が省エネルギーでクリーンである事、反応の特異性に
優れ、位置選択的、基質選択的反応や不斉合成が可能で
あるという、優れた特徴を有する事による。
が活発に研究されている。これは酵素が常温、常圧で反
応するため熱的に不安定な物質の合成が可能な上に、反
応が省エネルギーでクリーンである事、反応の特異性に
優れ、位置選択的、基質選択的反応や不斉合成が可能で
あるという、優れた特徴を有する事による。
【０００３】特に有機溶剤中での酵素反応は、加水分解
酵素を各種合成反応や転移反応に応用できる事から注目
されている。リパーゼは脂質の加水分解酵素であるが、
他の酵素と比較して有機溶剤に耐性の高いものが多く、
エステル交換，エステル合成反応を高効率で行えるため
多くの検討が行われている。しかし、リパーゼは生産と
精製に多大な労力を必要とするため、これを工業的に利
用する上で、効率の高い固定化リパーゼの開発が重要な
課題であった。
酵素を各種合成反応や転移反応に応用できる事から注目
されている。リパーゼは脂質の加水分解酵素であるが、
他の酵素と比較して有機溶剤に耐性の高いものが多く、
エステル交換，エステル合成反応を高効率で行えるため
多くの検討が行われている。しかし、リパーゼは生産と
精製に多大な労力を必要とするため、これを工業的に利
用する上で、効率の高い固定化リパーゼの開発が重要な
課題であった。
【０００４】リパーゼの固定化に関しては、例えば「ジ
ャーナル オブ アメリカン オイル ケミスツス ソ
サエティ」（Journal of American Oil Chemist's Soci
ety），第６７巻、８９０−９１０（１９９０）に総説
があり、代表的な固定化用担体として、珪藻土やシリ
カ、多孔質ガラス等の無機系担体、各種合成樹脂及び合
成樹脂系イオン交換体、イオン交換基が導入されたセル
ロースや架橋デキストリン等の天然多糖類系担体が例と
してあげられている。この文献によると、これら担体は
親水性担体と疎水性担体に類別され、合成樹脂のような
疎水性担体に固定化されたリパーゼのエステル交換活性
発現率は、親水性担体に固定化されたリパーゼより高い
と報告されている。
ャーナル オブ アメリカン オイル ケミスツス ソ
サエティ」（Journal of American Oil Chemist's Soci
ety），第６７巻、８９０−９１０（１９９０）に総説
があり、代表的な固定化用担体として、珪藻土やシリ
カ、多孔質ガラス等の無機系担体、各種合成樹脂及び合
成樹脂系イオン交換体、イオン交換基が導入されたセル
ロースや架橋デキストリン等の天然多糖類系担体が例と
してあげられている。この文献によると、これら担体は
親水性担体と疎水性担体に類別され、合成樹脂のような
疎水性担体に固定化されたリパーゼのエステル交換活性
発現率は、親水性担体に固定化されたリパーゼより高い
と報告されている。
【０００５】合成樹脂系イオン交換体を用いた固定化リ
パーゼの例としては、特開平４−２８７６８９号公報で
開示されている。これによればアンバーライトＸＡＤ−
２にシュードモナス由来のリパーゼを固定化した場合、
酢酸ビニルモノマーとα−Ｄ，Ｌ−フェニルエチルアル
コールのエステル交換反応の活性を発現するが、この様
な合樹脂系イオン交換体は、担体の疎水性が大きいもの
の、固定化リパーゼの重要な使用法である有機溶剤中で
の酵素反応に供した際に、残存モノマーの溶出や樹脂の
膨潤等が懸念される欠点がある。
パーゼの例としては、特開平４−２８７６８９号公報で
開示されている。これによればアンバーライトＸＡＤ−
２にシュードモナス由来のリパーゼを固定化した場合、
酢酸ビニルモノマーとα−Ｄ，Ｌ−フェニルエチルアル
コールのエステル交換反応の活性を発現するが、この様
な合樹脂系イオン交換体は、担体の疎水性が大きいもの
の、固定化リパーゼの重要な使用法である有機溶剤中で
の酵素反応に供した際に、残存モノマーの溶出や樹脂の
膨潤等が懸念される欠点がある。
【０００６】一方、リパーゼを賦活化させる方法とし
て、リン脂質や脂肪酸によるリパーゼの処理が報告され
ている。リパーゼを固定化する際に、固定化用担体をリ
ン脂質や脂肪酸で処理して高活性を得る方法が特開昭６
２−１３４０９０号公報、特開平１−１５３０９０号公
報、特開平４−３３５８９３号公報に開示されている。
しかし、いずれの方法もリン脂質や脂肪酸が固定化用担
体と吸着または疎水結合によって固定化したものであっ
て、使用中にリン脂質や脂肪酸の脱離が起こり、効果の
低減が生ずる欠点がある。
て、リン脂質や脂肪酸によるリパーゼの処理が報告され
ている。リパーゼを固定化する際に、固定化用担体をリ
ン脂質や脂肪酸で処理して高活性を得る方法が特開昭６
２−１３４０９０号公報、特開平１−１５３０９０号公
報、特開平４−３３５８９３号公報に開示されている。
しかし、いずれの方法もリン脂質や脂肪酸が固定化用担
体と吸着または疎水結合によって固定化したものであっ
て、使用中にリン脂質や脂肪酸の脱離が起こり、効果の
低減が生ずる欠点がある。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、酵素を用い
た有機溶剤中でのエステル結合の分解，合成および交換
反応全般に優れた触媒作用を行うのに適し、特に高い効
率でエステルの交換反応を行うことのできる固定化リパ
ーゼを提供するものである。
た有機溶剤中でのエステル結合の分解，合成および交換
反応全般に優れた触媒作用を行うのに適し、特に高い効
率でエステルの交換反応を行うことのできる固定化リパ
ーゼを提供するものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者等は鋭意研究を
行い、低分子量キトサンを酸性水溶液に溶解し、該溶解
液を塩基性溶液中に落下せしめて得た再生粒状多孔質キ
トサン担体に対し、脂肪族ポリアルコールのグリシジル
エーテルをキトサンのピラノース環残基１モル当たり
０．０１〜０．４モル，総炭素数６〜２０の高級脂肪酸
をキトサンのピラノース環残基１モル当たり０．０５〜
１モル導入し、かつリパーゼが共有結合で固定化されて
いる固定化リパーゼで、該固定化リパーゼの乾燥重量当
たりの脂質分解発現活性が０．０１〜２ｕ／ｍｇである
ところの固定化リパーゼが、前述の課題を解決するのに
好適であることを見いだした。但し、本願発明の脂質分
解発現活性は、実施例で示された如く３００ｍＭのモノ
ラウリンと２％の水を含むアセトン溶液を基質溶液と
し、３７℃で１５分間リパーゼを反応させたときに、１
分間に１μｍｏｌのグリセロールを生成するとき１ｕと
定義する。
行い、低分子量キトサンを酸性水溶液に溶解し、該溶解
液を塩基性溶液中に落下せしめて得た再生粒状多孔質キ
トサン担体に対し、脂肪族ポリアルコールのグリシジル
エーテルをキトサンのピラノース環残基１モル当たり
０．０１〜０．４モル，総炭素数６〜２０の高級脂肪酸
をキトサンのピラノース環残基１モル当たり０．０５〜
１モル導入し、かつリパーゼが共有結合で固定化されて
いる固定化リパーゼで、該固定化リパーゼの乾燥重量当
たりの脂質分解発現活性が０．０１〜２ｕ／ｍｇである
ところの固定化リパーゼが、前述の課題を解決するのに
好適であることを見いだした。但し、本願発明の脂質分
解発現活性は、実施例で示された如く３００ｍＭのモノ
ラウリンと２％の水を含むアセトン溶液を基質溶液と
し、３７℃で１５分間リパーゼを反応させたときに、１
分間に１μｍｏｌのグリセロールを生成するとき１ｕと
定義する。
【０００９】上記の再生粒状多孔質キトサン担体は、酵
素や基質の拡散に優れ、強度が高く、カラムに充填して
使用するのに容易なため、固定化用担体を調整するのに
好適である。再生粒状多孔質キトサン担体は特公平１−
１６４２０号で開示された方法で得られる。即ち、平均
分子量が１０，０００〜２３０，０００の範囲である低
分子量キトサンを酸性水溶液に溶解し、該溶解液を塩基
性溶液中に落下せしめて多孔質キトサンを凝固再生させ
ることによって得られる。
素や基質の拡散に優れ、強度が高く、カラムに充填して
使用するのに容易なため、固定化用担体を調整するのに
好適である。再生粒状多孔質キトサン担体は特公平１−
１６４２０号で開示された方法で得られる。即ち、平均
分子量が１０，０００〜２３０，０００の範囲である低
分子量キトサンを酸性水溶液に溶解し、該溶解液を塩基
性溶液中に落下せしめて多孔質キトサンを凝固再生させ
ることによって得られる。
【００１０】再生粒状多孔質キトサンに対する脂肪族ポ
リアルコールのグリシジルエーテルによる架橋反応、及
び次いで高級脂肪酸の酸ハロゲン化物もしくは酸無水物
との反応は以下に述べる如くである（特願平５−５１５
６５号明細書参照）。
リアルコールのグリシジルエーテルによる架橋反応、及
び次いで高級脂肪酸の酸ハロゲン化物もしくは酸無水物
との反応は以下に述べる如くである（特願平５−５１５
６５号明細書参照）。
【００１１】本発明の架橋反応に用いる架橋剤である脂
肪族ポリアルコールのグリシジルエーテルとしては、例
えばジメチレンエーテルの繰り返し数が１〜２２個のエ
チレングリコールジグリシジルエーテルもしくはポリエ
チレングリコールジグリシジルエーテル，プロピレンエ
ーテルの繰り返し数が１〜６６個のポリプロピレングリ
コールジグリシジルエーテル，グリシジルエーテルの数
が２〜３個のグリセロールポリグリシジルエーテル等で
ある。具体的にはエチレングリコールジグリシジルエー
テル，ジエチレングリコールジグリシジルエーテル等の
ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル，プロピ
レングリコールジグリシジルエーテル，ジプロピレング
リコールジグリシジルエーテル等のポリプロピレングリ
コールジグリシジルエーテル，グリセロールジグリシジ
ルエーテル，グリセロールトリグリシジルエーテル等が
あげられる。
肪族ポリアルコールのグリシジルエーテルとしては、例
えばジメチレンエーテルの繰り返し数が１〜２２個のエ
チレングリコールジグリシジルエーテルもしくはポリエ
チレングリコールジグリシジルエーテル，プロピレンエ
ーテルの繰り返し数が１〜６６個のポリプロピレングリ
コールジグリシジルエーテル，グリシジルエーテルの数
が２〜３個のグリセロールポリグリシジルエーテル等で
ある。具体的にはエチレングリコールジグリシジルエー
テル，ジエチレングリコールジグリシジルエーテル等の
ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル，プロピ
レングリコールジグリシジルエーテル，ジプロピレング
リコールジグリシジルエーテル等のポリプロピレングリ
コールジグリシジルエーテル，グリセロールジグリシジ
ルエーテル，グリセロールトリグリシジルエーテル等が
あげられる。
【００１２】脂肪族ポリアルコールのグリシジルエーテ
ルを再生粒状多孔質キトサン担体に導入する反応におい
て、脂肪族ポリアルコールのグリシジルエーテルの濃度
は０．００５〜２エポキシ当量／Ｌ、液量は担体容積と
等量、反応温度は２０〜９０℃、反応時間は１〜２４時
間でゆるやかに攪拌しながら行われる。
ルを再生粒状多孔質キトサン担体に導入する反応におい
て、脂肪族ポリアルコールのグリシジルエーテルの濃度
は０．００５〜２エポキシ当量／Ｌ、液量は担体容積と
等量、反応温度は２０〜９０℃、反応時間は１〜２４時
間でゆるやかに攪拌しながら行われる。
【００１３】この様にして脂肪族ポリアルコールのグリ
シジルエーテルを該キトサンのピラノース環残基１モル
当たり０．０１〜０．４モル導入する。
シジルエーテルを該キトサンのピラノース環残基１モル
当たり０．０１〜０．４モル導入する。
【００１４】この際、導入量がキトサンのピラノース環
残基１モル当たり０．０１モルより低い場合、固定化リ
パーゼを有機溶剤中で使用するために脱水乾燥を行う時
点で、固定化リパーゼの収縮が著しく、結果としてリパ
ーゼのエステル交換発現活性が低い。一方、導入量をキ
トサンのピラノース環残基１モル当たり０．４モルより
多くする事は困難であり、実用的ではない上に、発現活
性の低下がみられるため、好ましくない。
残基１モル当たり０．０１モルより低い場合、固定化リ
パーゼを有機溶剤中で使用するために脱水乾燥を行う時
点で、固定化リパーゼの収縮が著しく、結果としてリパ
ーゼのエステル交換発現活性が低い。一方、導入量をキ
トサンのピラノース環残基１モル当たり０．４モルより
多くする事は困難であり、実用的ではない上に、発現活
性の低下がみられるため、好ましくない。
【００１５】次に架橋された再生粒状多孔質キトサン担
体に共有結合で高級脂肪酸の酸ハロゲン化物もしくは酸
無水物を導入する。
体に共有結合で高級脂肪酸の酸ハロゲン化物もしくは酸
無水物を導入する。
【００１６】即ち、まず架橋再生粒状多孔質キトサン担
体の含有する水分を、極性有機溶剤で充分に除去する。
極性有機溶剤としては例えばジオキサン，エタノール，
イソプロピルアルコール，ジメチルホルムアミド，ジメ
チルアセトアミド，ジメチルスルホキシド，ピリジン等
があげられる。次に導入反応に際してはこれら極性有機
溶剤とヘキサン，メチレンクロライド，クロロホルム等
の非極性有機溶剤との混合溶剤を用いても良い。これら
溶剤の中から適宜、導入する高級脂肪酸の酸無水物、も
しくは酸ハロゲン化物に対し、不活性な溶剤を選択し使
用する。酸ハロゲン化物の様な反応性の高い物質の場合
は、例えばジオキサン，ジメチルホルムアミド，ジメチ
ルアセトアミドのいずれか、またはその混合物を用いる
のが好ましい。
体の含有する水分を、極性有機溶剤で充分に除去する。
極性有機溶剤としては例えばジオキサン，エタノール，
イソプロピルアルコール，ジメチルホルムアミド，ジメ
チルアセトアミド，ジメチルスルホキシド，ピリジン等
があげられる。次に導入反応に際してはこれら極性有機
溶剤とヘキサン，メチレンクロライド，クロロホルム等
の非極性有機溶剤との混合溶剤を用いても良い。これら
溶剤の中から適宜、導入する高級脂肪酸の酸無水物、も
しくは酸ハロゲン化物に対し、不活性な溶剤を選択し使
用する。酸ハロゲン化物の様な反応性の高い物質の場合
は、例えばジオキサン，ジメチルホルムアミド，ジメチ
ルアセトアミドのいずれか、またはその混合物を用いる
のが好ましい。
【００１７】本発明で使用される高級脂肪酸は、炭化水
素が疎水性を有するとされる程度の炭素数、一般的には
総炭素数が６〜２０の飽和、不飽和脂肪酸が好ましい。
素が疎水性を有するとされる程度の炭素数、一般的には
総炭素数が６〜２０の飽和、不飽和脂肪酸が好ましい。
【００１８】そして導入に際しては高級脂肪酸の酸無水
物、もしくは酸塩化物や酸臭化物の様な酸ハロゲン化物
が用いられ、酸無水物としては例えば無水ラウリン酸，
無水ミリスチン酸，無水パルミチン酸，無水ステアリン
酸，無水オレイン酸等、また、酸ハロゲン化物としては
例えば塩化ラウロイル，塩化ミリストイル，塩化パルミ
トイル，塩化ステアロイル，塩化オレイル等の酸塩化物
が好ましく、酸無水物よりも酸ハロゲン化物の方が導入
量が向上するので好ましい。
物、もしくは酸塩化物や酸臭化物の様な酸ハロゲン化物
が用いられ、酸無水物としては例えば無水ラウリン酸，
無水ミリスチン酸，無水パルミチン酸，無水ステアリン
酸，無水オレイン酸等、また、酸ハロゲン化物としては
例えば塩化ラウロイル，塩化ミリストイル，塩化パルミ
トイル，塩化ステアロイル，塩化オレイル等の酸塩化物
が好ましく、酸無水物よりも酸ハロゲン化物の方が導入
量が向上するので好ましい。
【００１９】高級脂肪酸を導入するときの反応におい
て、例えばその濃度は１０〜５００ｍｍｏｌ／Ｌ、液量
は担体容積と当容量、反応温度は１０〜７０℃、反応時
間は１〜２４時間でゆるやかに攪拌しながら行われる。
て、例えばその濃度は１０〜５００ｍｍｏｌ／Ｌ、液量
は担体容積と当容量、反応温度は１０〜７０℃、反応時
間は１〜２４時間でゆるやかに攪拌しながら行われる。
【００２０】該反応の際に生成する脂肪酸もしくは無機
酸を除去する目的で脱酸剤を添加する場合は、反応溶媒
に溶解する一般的な脱酸剤であれば特に限定されない
が、トリエチルアミンやピリジンが好ましい。この様に
して高級脂肪酸がキトサンのピラノース環残基１モル当
たり０．０５〜１モル導入された該キトサン担体を得
る。
酸を除去する目的で脱酸剤を添加する場合は、反応溶媒
に溶解する一般的な脱酸剤であれば特に限定されない
が、トリエチルアミンやピリジンが好ましい。この様に
して高級脂肪酸がキトサンのピラノース環残基１モル当
たり０．０５〜１モル導入された該キトサン担体を得
る。
【００２１】高級脂肪酸の導入量が０．０５モルより低
いと脂質の分解発現活性とエステル交換発現活性が極端
に低下し、脂質分解発現活性の発現率も小さくなるため
固定化の意義は認められなくなる。高級脂肪酸の導入に
従って発現率は向上するが、１モルより大きい場合は頭
打ちとなり導入量向上の効果が認められなくなる。
いと脂質の分解発現活性とエステル交換発現活性が極端
に低下し、脂質分解発現活性の発現率も小さくなるため
固定化の意義は認められなくなる。高級脂肪酸の導入に
従って発現率は向上するが、１モルより大きい場合は頭
打ちとなり導入量向上の効果が認められなくなる。
【００２２】以下、本発明では脂肪族ポリアルコールの
グリシジルエーテルによる架橋反応をし、次いで高級脂
肪酸の酸ハロゲン化物もしくは酸無水物の導入反応を行
った架橋粒状多孔質キトサンを担体という。
グリシジルエーテルによる架橋反応をし、次いで高級脂
肪酸の酸ハロゲン化物もしくは酸無水物の導入反応を行
った架橋粒状多孔質キトサンを担体という。
【００２３】引き続き、得られた担体にリパーゼの固定
化を行う。リパーゼとしては例えばリゾプス（Rhizopu
s）属，アスペルギルス（Aspergillus ）属，ムコール
（Mucor ）属，シュードモナス（Pseudomonas ）属，ペ
ニシリウム（Penicillium ）属，クロモバクテリウム
（Chromobacterium ）属，キャンディダ（Candida ）属
等の微生物起源のリパーゼ及び膵臓リパーゼ等の動物由
来のリパーゼが用いられ、特に好ましくはクロモバクテ
リウム属やシュードモナス属由来のリパーゼがあげられ
る。
化を行う。リパーゼとしては例えばリゾプス（Rhizopu
s）属，アスペルギルス（Aspergillus ）属，ムコール
（Mucor ）属，シュードモナス（Pseudomonas ）属，ペ
ニシリウム（Penicillium ）属，クロモバクテリウム
（Chromobacterium ）属，キャンディダ（Candida ）属
等の微生物起源のリパーゼ及び膵臓リパーゼ等の動物由
来のリパーゼが用いられ、特に好ましくはクロモバクテ
リウム属やシュードモナス属由来のリパーゼがあげられ
る。
【００２４】このときのリパーゼは高純度であることが
望ましく、少なくとも総蛋白量に対してリパーゼが５０
％以上の純度であることが好ましい。リパーゼの固定化
を行うにあたって、反応温度は失活の起きない範囲であ
ればよく、例えば０〜６０℃、好ましくは５〜４０℃が
よい。また、リパーゼ水溶液のｐＨは酵素の変性が起き
ない範囲であればよく、ｐＨ３〜９が好ましい。
望ましく、少なくとも総蛋白量に対してリパーゼが５０
％以上の純度であることが好ましい。リパーゼの固定化
を行うにあたって、反応温度は失活の起きない範囲であ
ればよく、例えば０〜６０℃、好ましくは５〜４０℃が
よい。また、リパーゼ水溶液のｐＨは酵素の変性が起き
ない範囲であればよく、ｐＨ３〜９が好ましい。
【００２５】固定化されたリパーゼの耐久性を向上させ
る上で、多官能性の架橋試薬による、酵素と担体の共有
結合を行うことが重要である。多官能性の架橋試薬とし
ては例えば、グリオキザール，グルタルアルデヒド，マ
ロンアルデヒド，スクシニルアルデヒド，ビススルフォ
スクシニミジルスベラート，ジメチルスベリミデート，
エチレングリコールビススルフォスクシニミジルスクシ
ネート，ジシクロヘキシルカルボジイミド，ヘキサメチ
レンジイソシアネート等があげられ、例えばリパーゼ分
子１モル当たり１．２〜２倍モル用いればよい。
る上で、多官能性の架橋試薬による、酵素と担体の共有
結合を行うことが重要である。多官能性の架橋試薬とし
ては例えば、グリオキザール，グルタルアルデヒド，マ
ロンアルデヒド，スクシニルアルデヒド，ビススルフォ
スクシニミジルスベラート，ジメチルスベリミデート，
エチレングリコールビススルフォスクシニミジルスクシ
ネート，ジシクロヘキシルカルボジイミド，ヘキサメチ
レンジイソシアネート等があげられ、例えばリパーゼ分
子１モル当たり１．２〜２倍モル用いればよい。
【００２６】これらの多官能性の架橋試薬は、リパーゼ
の固定化に先立ち予め担体と反応させてもよく、または
担体とリパーゼとを疎水結合によって反応させてから架
橋処理を行ってもよい。本発明では以下、担体にリパー
ゼを固定化した固定化酵素を固定化リパーゼという。
の固定化に先立ち予め担体と反応させてもよく、または
担体とリパーゼとを疎水結合によって反応させてから架
橋処理を行ってもよい。本発明では以下、担体にリパー
ゼを固定化した固定化酵素を固定化リパーゼという。
【００２７】一般に水中でリパーゼの加水分解活性を測
定するとき、基質として用いるトリグリセリド脂質は水
に溶解しないため、水と脂質の混合物を激しく撹拌し脂
質を水中に懸濁させるか、界面活性剤を加えエマルジョ
ンを作り脂質を分散させる。固定化リパーゼを水中で反
応させるときは、微粒子状の脂質が担体内部に固定化さ
れたリパーゼと接触できないため、見かけの活性発現率
が大幅に低くなる。従って、脂質を有機溶剤に溶解し、
固定化リパーゼの発現活性の指標とするのが適当であ
る。
定するとき、基質として用いるトリグリセリド脂質は水
に溶解しないため、水と脂質の混合物を激しく撹拌し脂
質を水中に懸濁させるか、界面活性剤を加えエマルジョ
ンを作り脂質を分散させる。固定化リパーゼを水中で反
応させるときは、微粒子状の脂質が担体内部に固定化さ
れたリパーゼと接触できないため、見かけの活性発現率
が大幅に低くなる。従って、脂質を有機溶剤に溶解し、
固定化リパーゼの発現活性の指標とするのが適当であ
る。
【００２８】固定化リパーゼを有機溶剤中で使用すると
きには、固定化リパーゼに含まれている水分を有機溶剤
で除去した後、真空乾燥し乾燥固定化リパーゼとして、
エステル分解，交換，合成反応に供する。なお本発明に
おける乾燥固定化リパーゼの乾燥率としては５％以下の
水分率を意味する。
きには、固定化リパーゼに含まれている水分を有機溶剤
で除去した後、真空乾燥し乾燥固定化リパーゼとして、
エステル分解，交換，合成反応に供する。なお本発明に
おける乾燥固定化リパーゼの乾燥率としては５％以下の
水分率を意味する。
【００２９】本願発明の乾燥固定化リパーゼの脂質分解
発現活性とは、後述の実施例で示された如く、３００ｍ
Ｍのモノラウリンと２％の水を含むアセトン溶液を基質
溶液とし、３７℃で１５分間リパーゼを反応させたとき
に、１分間に１μｍｏｌのグリセロールを生成するとき
１ｕと定義する。
発現活性とは、後述の実施例で示された如く、３００ｍ
Ｍのモノラウリンと２％の水を含むアセトン溶液を基質
溶液とし、３７℃で１５分間リパーゼを反応させたとき
に、１分間に１μｍｏｌのグリセロールを生成するとき
１ｕと定義する。
【００３０】アセトン中での脂質（モノラウリン）の分
解発現活性を指標としたとき、固定化リパーゼの乾燥重
量当たり、０．０１〜２ｕ／ｍｇの脂質分解発現活性を
有する固定化リパーゼがエステルの分解，交換及び合成
反応に好適である。固定化されているリパーゼが発現活
性が０．０１ｕ／ｍｇより少ない量の場合は、固定化リ
パーゼの安定性が低く、有機溶剤中で保存すると失活
し、保存後に活性測定すると発現活性が著しく低下す
る。また２ｕ／ｍｇ以上の活性を得るためにリパーゼの
固定化量を増やすと、発現活性がそれに見合うだけの大
きさにならず、結果として活性発現率が低くなり、酵素
が無駄になる。特に好ましくは脂質分解発現活性が０．
１ｕ／ｍｇ〜１．５ｕ／ｍｇの範囲である。
解発現活性を指標としたとき、固定化リパーゼの乾燥重
量当たり、０．０１〜２ｕ／ｍｇの脂質分解発現活性を
有する固定化リパーゼがエステルの分解，交換及び合成
反応に好適である。固定化されているリパーゼが発現活
性が０．０１ｕ／ｍｇより少ない量の場合は、固定化リ
パーゼの安定性が低く、有機溶剤中で保存すると失活
し、保存後に活性測定すると発現活性が著しく低下す
る。また２ｕ／ｍｇ以上の活性を得るためにリパーゼの
固定化量を増やすと、発現活性がそれに見合うだけの大
きさにならず、結果として活性発現率が低くなり、酵素
が無駄になる。特に好ましくは脂質分解発現活性が０．
１ｕ／ｍｇ〜１．５ｕ／ｍｇの範囲である。
【００３１】このようにして得られた固定化リパーゼは
水または緩衝液に懸濁せしめた状態の基質液あるいは有
機溶剤に溶解した基質溶液に添加し混合攪拌しながら用
いることもできる。また、固定化リパーゼをカラム等の
容器に予め充填し基質溶液を通液することによりエステ
ルの加水分解，エステル交換，エステル合成反応等を行
うことができる。
水または緩衝液に懸濁せしめた状態の基質液あるいは有
機溶剤に溶解した基質溶液に添加し混合攪拌しながら用
いることもできる。また、固定化リパーゼをカラム等の
容器に予め充填し基質溶液を通液することによりエステ
ルの加水分解，エステル交換，エステル合成反応等を行
うことができる。
【００３２】
【実施例】以下、本発明を実施例をあげて具体的に説明
するが、本発明はこの範囲に限定されるものではない。
尚、各測定値は以下記載の試験方法により求めた。
するが、本発明はこの範囲に限定されるものではない。
尚、各測定値は以下記載の試験方法により求めた。
【００３３】１．再生粒状多孔質キトサン担体に対する
脂肪族ポリアルコールのグリシジルエーテル導入量測定
方法 脂肪族ポリアルコールのグリシジルエーテルを反応さ
せた後、再生粒状多孔質キトサン担体を濾別し反応残液
を回収する。 該キトサン担体に、これと等容積の純水を加え室温で
２０分間攪拌，洗浄する。このキトサン担体を濾別、残
液を回収する。これを４回繰り返す。 回収した反応残液をロータリーエバポレーターで減圧
濃縮し、蒸発乾固するまで水分を充分に除く。 残留した脂肪族ポリアルコールのグリシジルエーテル
をテトラヒドロフランで溶解し、高速液体クロマトグラ
フィーで定量する。同時に反応前の脂肪族ポリアルコー
ルのグリシジルエーテル水溶液を別途調製し、同様の方
法で高速液体クロマトグラフィーにより定量する。 ピラノース環残基当たり導入量値は次式より求める。
脂肪族ポリアルコールのグリシジルエーテル導入量測定
方法 脂肪族ポリアルコールのグリシジルエーテルを反応さ
せた後、再生粒状多孔質キトサン担体を濾別し反応残液
を回収する。 該キトサン担体に、これと等容積の純水を加え室温で
２０分間攪拌，洗浄する。このキトサン担体を濾別、残
液を回収する。これを４回繰り返す。 回収した反応残液をロータリーエバポレーターで減圧
濃縮し、蒸発乾固するまで水分を充分に除く。 残留した脂肪族ポリアルコールのグリシジルエーテル
をテトラヒドロフランで溶解し、高速液体クロマトグラ
フィーで定量する。同時に反応前の脂肪族ポリアルコー
ルのグリシジルエーテル水溶液を別途調製し、同様の方
法で高速液体クロマトグラフィーにより定量する。 ピラノース環残基当たり導入量値は次式より求める。
【００３４】
【数１】
【００３５】２．担体に対する高級脂肪酸導入量測定方法 高級脂肪酸の酸無水物もしくは酸ハロゲン化物を２
０，５０，１００，１５０，３００，５００ｍｍｏｌ／
Ｌ加えて溶剤中で反応させた後、この架橋再生粒状多孔
質キトサン担体を濾別し反応残液を回収する。 高級脂肪酸導入後の架橋再生粒状多孔質キトサン担体
に、これと等容積の反応に用いた溶剤を加え室温で２０
分間撹拌，洗浄する。該架橋再生粒状多孔質キトサン担
体を濾別、残液を回収する。これを２回繰り返す。 次に１，０００ｍｍｏｌ／Ｌのトリエチルアミンを含
む反応溶剤を、架橋再生粒状多孔質キトサン担体と等容
積加え、室温で３０分間撹拌し洗浄後、架橋再生粒状多
孔質キトサン担体を濾別、残液を回収する。 この架橋再生粒状多孔質キトサン担体に、これと等容
積の反応に用いた溶剤を加え室温で２０分間撹拌，洗浄
する。架橋再生粒状多孔質キトサン担体を濾別、残液を
回収する。これを４回繰り返す。 回収した残液中の高級脂肪酸と高級脂肪酸の酸無水物
もしくは酸ハロゲン化物に、メチル化剤として水酸化テ
トラメチルアンモニウムを加え、熱分解装置キューリー
ポイントパイロライザー（日本分析工業 (株) ＪＨＰ−
３）とガスクロマトグラフィー（島津製作所 (株) ＧＣ
ＭＳ−ＱＰ２０００ＧＦ）を使い、熱分解ガスクロ法に
よって未反応の高級脂肪酸の酸無水物もしくは酸ハロゲ
ン化物を定量する。 投入した高級脂肪酸の酸無水物もしくは酸ハロゲン化
物から未反応物を差し引くことにより、導入された高級
脂肪酸量を求める。グルコサミン残基当たり高級脂肪酸
導入量値を次式より求める。
０，５０，１００，１５０，３００，５００ｍｍｏｌ／
Ｌ加えて溶剤中で反応させた後、この架橋再生粒状多孔
質キトサン担体を濾別し反応残液を回収する。 高級脂肪酸導入後の架橋再生粒状多孔質キトサン担体
に、これと等容積の反応に用いた溶剤を加え室温で２０
分間撹拌，洗浄する。該架橋再生粒状多孔質キトサン担
体を濾別、残液を回収する。これを２回繰り返す。 次に１，０００ｍｍｏｌ／Ｌのトリエチルアミンを含
む反応溶剤を、架橋再生粒状多孔質キトサン担体と等容
積加え、室温で３０分間撹拌し洗浄後、架橋再生粒状多
孔質キトサン担体を濾別、残液を回収する。 この架橋再生粒状多孔質キトサン担体に、これと等容
積の反応に用いた溶剤を加え室温で２０分間撹拌，洗浄
する。架橋再生粒状多孔質キトサン担体を濾別、残液を
回収する。これを４回繰り返す。 回収した残液中の高級脂肪酸と高級脂肪酸の酸無水物
もしくは酸ハロゲン化物に、メチル化剤として水酸化テ
トラメチルアンモニウムを加え、熱分解装置キューリー
ポイントパイロライザー（日本分析工業 (株) ＪＨＰ−
３）とガスクロマトグラフィー（島津製作所 (株) ＧＣ
ＭＳ−ＱＰ２０００ＧＦ）を使い、熱分解ガスクロ法に
よって未反応の高級脂肪酸の酸無水物もしくは酸ハロゲ
ン化物を定量する。 投入した高級脂肪酸の酸無水物もしくは酸ハロゲン化
物から未反応物を差し引くことにより、導入された高級
脂肪酸量を求める。グルコサミン残基当たり高級脂肪酸
導入量値を次式より求める。
【００３６】
【数２】
【００３７】この担体を、乾燥，粉砕する。 得られた粉砕物にと同様、メチル化剤として水酸化
テトラメチルアンモニウムを加え、熱分解ガスクロ法に
よって試料に導入されている高級脂肪酸量を定量する。 この結果に基づき、担体中の高級脂肪酸の導入量を熱分
解ガスクロで測定する事により求める。
テトラメチルアンモニウムを加え、熱分解ガスクロ法に
よって試料に導入されている高級脂肪酸量を定量する。 この結果に基づき、担体中の高級脂肪酸の導入量を熱分
解ガスクロで測定する事により求める。
【００３８】３．ＦＴ−ＩＲ測定方法 担体を乾燥，粉砕後、ＫＢｒで希釈して、フーリエ変換
赤外分光光度計（以下ＦＴ−ＩＲと略す。ＪＩＲ−ＤＩ
ＡＭＯＮＤ２０，日本電子 (株) 製）で、２８５０ｃｍ
-1, ２９２５ｃｍ-1でのメチレンの吸収と、１７５０ｃ
ｍ-1でのエステルの吸収の増大からステアロイルの導入
を確認する。
赤外分光光度計（以下ＦＴ−ＩＲと略す。ＪＩＲ−ＤＩ
ＡＭＯＮＤ２０，日本電子 (株) 製）で、２８５０ｃｍ
-1, ２９２５ｃｍ-1でのメチレンの吸収と、１７５０ｃ
ｍ-1でのエステルの吸収の増大からステアロイルの導入
を確認する。
【００３９】４．固定化リパーゼの調製方法 湿潤状態の担体を湿重で１ｇとる。 所定濃度のリパーゼ水溶液１ｍｌ、１Ｍ−リン酸緩衝
液（ｐＨ７．５）を０．５ｍｌ、純水を２３．５ｍｌ混
合して酸素液とし、担体を入れる。 ３７℃で１時間攪拌しリパーゼを担体に吸着させる。 担体を濾別しよく水洗する。 １Ｍ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を０．５ｍｌ、純
水を２４．２５ｍｌ、１％グルタルアルデヒド水溶液を
０．２５ｍｌ混合し固定液とする。 固定液にリパーゼ吸着後の担体を入れ、３７℃で１時
間撹拌し、リパーゼを担体と共有結合で固定化する。 担体を濾別し、よく水洗し、湿潤固定化リパーゼを得
る。 アセトンで固定化リパーゼに含まれる水を十分に除去
脱水し、真空乾燥することにより水分率５％以下の乾燥
固定化リパーゼを得る。
液（ｐＨ７．５）を０．５ｍｌ、純水を２３．５ｍｌ混
合して酸素液とし、担体を入れる。 ３７℃で１時間攪拌しリパーゼを担体に吸着させる。 担体を濾別しよく水洗する。 １Ｍ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を０．５ｍｌ、純
水を２４．２５ｍｌ、１％グルタルアルデヒド水溶液を
０．２５ｍｌ混合し固定液とする。 固定液にリパーゼ吸着後の担体を入れ、３７℃で１時
間撹拌し、リパーゼを担体と共有結合で固定化する。 担体を濾別し、よく水洗し、湿潤固定化リパーゼを得
る。 アセトンで固定化リパーゼに含まれる水を十分に除去
脱水し、真空乾燥することにより水分率５％以下の乾燥
固定化リパーゼを得る。
【００４０】５．遊離リパーゼの脂質分解発現活性測定方法 ３０６ｍＭのモノラウリンを含有するアセトン溶液
４．９ｍｌを調製する。 ２ｍｇ／ｍｌのリパーゼ水溶液０．１ｍｌを加え３７
℃で１５分間反応する（このときのモノラウリンの濃度
は３００ｍＭ、水分濃度は２％である。）。 反応後、この溶液０．５ｍｌと０．５ｍｌの０．２規
定の塩酸を混合し、３７℃で１０分間静置してリパーゼ
を失活させ、脂質分解液を得る。 次の組成からなる試験液を調製する。 ５０ｍＭ−トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５） ０．０５％界面活性剤（トリトンＸ−１００，ローム・
アンド・ハース製） １ｍＭ−ＭｇＣｌ2 １ｍＭ−アデノシン３リン酸 １ｕ／ｍｌグリセロールキナーゼ ５ｕ／ｍｌグリセロフォスフェートオキシダーゼ ０．０３％４−アミノアンチピリン ０．０３％3,5-ジメトキシ -N-エチル-(2-ヒドロキシ -
3-スルフォプロピル)-アニリン，ナトリウム塩 ４．５ｕ／ｍｌパーオキシダーゼ で得られたリパーゼ反応液を２％のトリトンＸ−１
００で１１倍に希釈後、２０μｌとりで示した試験液
０．５ｍｌに添加し３７℃で１０分間発色反応を行う。 ０．５％ソジウムドデシル硫酸を１ｍｌ加えた６００
ｎｍの吸光度を測定する。 脂質分解発現活性値を次式で求める。
４．９ｍｌを調製する。 ２ｍｇ／ｍｌのリパーゼ水溶液０．１ｍｌを加え３７
℃で１５分間反応する（このときのモノラウリンの濃度
は３００ｍＭ、水分濃度は２％である。）。 反応後、この溶液０．５ｍｌと０．５ｍｌの０．２規
定の塩酸を混合し、３７℃で１０分間静置してリパーゼ
を失活させ、脂質分解液を得る。 次の組成からなる試験液を調製する。 ５０ｍＭ−トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５） ０．０５％界面活性剤（トリトンＸ−１００，ローム・
アンド・ハース製） １ｍＭ−ＭｇＣｌ2 １ｍＭ−アデノシン３リン酸 １ｕ／ｍｌグリセロールキナーゼ ５ｕ／ｍｌグリセロフォスフェートオキシダーゼ ０．０３％４−アミノアンチピリン ０．０３％3,5-ジメトキシ -N-エチル-(2-ヒドロキシ -
3-スルフォプロピル)-アニリン，ナトリウム塩 ４．５ｕ／ｍｌパーオキシダーゼ で得られたリパーゼ反応液を２％のトリトンＸ−１
００で１１倍に希釈後、２０μｌとりで示した試験液
０．５ｍｌに添加し３７℃で１０分間発色反応を行う。 ０．５％ソジウムドデシル硫酸を１ｍｌ加えた６００
ｎｍの吸光度を測定する。 脂質分解発現活性値を次式で求める。
【００４１】
【数３】
【００４２】６．乾燥固定化リパーゼの脂質分解発現活性測定方法 ３００ｍＭのモノラウリンと２％の水を含有するアセ
トン溶液５ｍｌに１０ｍｇの乾燥固定化リパーゼを添加
し、３７℃で１５分間撹拌しながら反応を行う。 固定化リパーゼを濾別し脂質分解液を得る。 前記５の遊離リパーゼ脂質分解発現活性測定法のに
記載した方法と同じ方法により測定する。 発現活性値を次式より求める。
トン溶液５ｍｌに１０ｍｇの乾燥固定化リパーゼを添加
し、３７℃で１５分間撹拌しながら反応を行う。 固定化リパーゼを濾別し脂質分解液を得る。 前記５の遊離リパーゼ脂質分解発現活性測定法のに
記載した方法と同じ方法により測定する。 発現活性値を次式より求める。
【００４３】
【数４】
【００４４】７．遊離リパーゼのエステル交換発現活性測定方法 ２．５％のα−Ｄ，Ｌフェニルエチルアルコールと２
％の酢酸ビニルモノマーを含むヘキサン溶液を調製し基
質とする。 加水分解発現活性で５ｕ相当量の重量の粉末リパーゼ
を秤量し、該基質２ｍｌに加え２５℃で３時間撹拌し、
エステル交換反応を行う。 反応終了後、濾過により固定化リパーゼを素早く除き
反応液を−５０℃に冷却し、反応を停止する。 光学分割カラム（キラセルＯＢ，ダイセル化学工業
(株) 製）を用い高速液体クロマトグラフィーにて反応
液の組成を測定し、α−Ｌ−フェニルエチルアルコール
の減少量（μｍｏｌ）を求める。 遊離リパーゼのエステル交換発現活性値は２５℃にて
１分間に１μｍｏｌのα−Ｌ−フェニルエチルアルコー
ルをアシル化するとき１ｕとし、次式より求める。
％の酢酸ビニルモノマーを含むヘキサン溶液を調製し基
質とする。 加水分解発現活性で５ｕ相当量の重量の粉末リパーゼ
を秤量し、該基質２ｍｌに加え２５℃で３時間撹拌し、
エステル交換反応を行う。 反応終了後、濾過により固定化リパーゼを素早く除き
反応液を−５０℃に冷却し、反応を停止する。 光学分割カラム（キラセルＯＢ，ダイセル化学工業
(株) 製）を用い高速液体クロマトグラフィーにて反応
液の組成を測定し、α−Ｌ−フェニルエチルアルコール
の減少量（μｍｏｌ）を求める。 遊離リパーゼのエステル交換発現活性値は２５℃にて
１分間に１μｍｏｌのα−Ｌ−フェニルエチルアルコー
ルをアシル化するとき１ｕとし、次式より求める。
【００４５】
【数５】
【００４６】８．乾燥固定化リパーゼのエステル交換発
現活性測定方法 湿潤固定化リパーゼが含む水分をアセトンで除去後、
真空乾燥しアセトンを除去、乾燥固定化リパーゼを得
る。 ２．５％のα−Ｄ、Ｌ−フェニルエチルアルコールと
２％の酢酸ビニルモノマーを含むヘキサン溶液を調製し
基質とする。 脂質分解発現活性で１０ｕ相当量の重量の乾燥固定化
リパーゼを秤量し、該基質２ｍｌに加え、２５℃で３時
間撹拌し、エステル交換反応を行なう。 反応終了後、濾過により固定化リパーゼを素早く除き
反応を停止する。 光学分割カラム（キラルセルＯＢ，ダイセル化学工業
（株）製）を用い高速液体クロマトグラフィーにて反応
液の組成を測定し、α−Ｌ−フェニルエチルアルコール
の減少量（μｍｏｌ）を求める。 乾燥固定化リパーゼのエステル交換発現活性値は２５
℃にて１分間に１μｍｏｌのα−Ｌ−フェニルエチルア
ルコールをアシル化するとき１ｕとし、次式より求め
る。
現活性測定方法 湿潤固定化リパーゼが含む水分をアセトンで除去後、
真空乾燥しアセトンを除去、乾燥固定化リパーゼを得
る。 ２．５％のα−Ｄ、Ｌ−フェニルエチルアルコールと
２％の酢酸ビニルモノマーを含むヘキサン溶液を調製し
基質とする。 脂質分解発現活性で１０ｕ相当量の重量の乾燥固定化
リパーゼを秤量し、該基質２ｍｌに加え、２５℃で３時
間撹拌し、エステル交換反応を行なう。 反応終了後、濾過により固定化リパーゼを素早く除き
反応を停止する。 光学分割カラム（キラルセルＯＢ，ダイセル化学工業
（株）製）を用い高速液体クロマトグラフィーにて反応
液の組成を測定し、α−Ｌ−フェニルエチルアルコール
の減少量（μｍｏｌ）を求める。 乾燥固定化リパーゼのエステル交換発現活性値は２５
℃にて１分間に１μｍｏｌのα−Ｌ−フェニルエチルア
ルコールをアシル化するとき１ｕとし、次式より求め
る。
【００４７】
【数６】
【００４８】９．リパーゼの固定化率測定方法 オリーブ油（関東化学株式会社製）２０ｇを界面活性
剤（アデカトールＳＯ−１２０，旭電化工業 (株) 製）
２０ｇ、純水６０ｍｌと混ぜ、エマルジョン基質とす
る。 該基質２５ｍｌに純水１０ｍｌを加え３７℃で１０分
間予備加熱する。 固定化操作に使用する酵素水溶液０．１ｍｌを基質に
加え３７℃で５分間反応させる。 アセトンを５０％含むエタノールを８０ｍｌ加え、撹
拌し酵素反応を停止する。 ５０ｍＭのＮａＯＨで酵素反応により遊離した脂肪酸
を滴定し、滴定量を求める。 ブランクとして上記と同様の操作において、の操作
で、酵素水溶液のかわりに純水を０．１ｍｌ加え、滴定
量を求める。 固定化操作前のリパーゼ水溶液のエマルジョン脂質分
解発現活性値Ａ（ｕ／ｍｌ水溶液）を次式より求める。
剤（アデカトールＳＯ−１２０，旭電化工業 (株) 製）
２０ｇ、純水６０ｍｌと混ぜ、エマルジョン基質とす
る。 該基質２５ｍｌに純水１０ｍｌを加え３７℃で１０分
間予備加熱する。 固定化操作に使用する酵素水溶液０．１ｍｌを基質に
加え３７℃で５分間反応させる。 アセトンを５０％含むエタノールを８０ｍｌ加え、撹
拌し酵素反応を停止する。 ５０ｍＭのＮａＯＨで酵素反応により遊離した脂肪酸
を滴定し、滴定量を求める。 ブランクとして上記と同様の操作において、の操作
で、酵素水溶液のかわりに純水を０．１ｍｌ加え、滴定
量を求める。 固定化操作前のリパーゼ水溶液のエマルジョン脂質分
解発現活性値Ａ（ｕ／ｍｌ水溶液）を次式より求める。
【００４９】
【数７】
【００５０】固定化操作後の濾液のエマルジョン脂質
分解発現活性値Ｂ（ｕ／ｍｌ水溶液）を上記と同様に
測定する。 固定化率Ｃはとで求めたＡとＢより次式で求め
る。
分解発現活性値Ｂ（ｕ／ｍｌ水溶液）を上記と同様に
測定する。 固定化率Ｃはとで求めたＡとＢより次式で求め
る。
【００５１】
【数８】
【００５２】１０．活性発現率の測定方法 前記測定方法４の項の固定化に用いたリパーゼの重量
をＤ（ｍｇ）とする。一方、得られる固定化リパーゼの
乾燥重量Ｅ（ｍｇ）を測定する。 前記測定方法５および６で示した方法により求めた遊
離リパーゼの脂質分解発現活性値Ｆ（ｕ／ｍｇ）と固定
化リパーゼの脂質分解活性値Ｇ（ｕ／ｍｇ）とから次式
によって脂質分解発現活性の発現率（％）を算出した。
をＤ（ｍｇ）とする。一方、得られる固定化リパーゼの
乾燥重量Ｅ（ｍｇ）を測定する。 前記測定方法５および６で示した方法により求めた遊
離リパーゼの脂質分解発現活性値Ｆ（ｕ／ｍｇ）と固定
化リパーゼの脂質分解活性値Ｇ（ｕ／ｍｇ）とから次式
によって脂質分解発現活性の発現率（％）を算出した。
【００５３】
【数９】
【００５４】前記測定方法７および８で示した方法に
より求めた遊離リパーゼのエステル交換発現活性値Ｈ
（ｕ／ｍｇ）と固定化リパーゼのエステル交換発現活性
値Ｉ（ｕ／ｍｇ）とから次式によってエステル交換発現
活性の発現率（％）を算出した。
より求めた遊離リパーゼのエステル交換発現活性値Ｈ
（ｕ／ｍｇ）と固定化リパーゼのエステル交換発現活性
値Ｉ（ｕ／ｍｇ）とから次式によってエステル交換発現
活性の発現率（％）を算出した。
【００５５】
【数１０】
【００５６】（実施例１）脱アセチル化度８０％（この
ときのピラノース環残基１個当たりの平均の分子量は１
６９．５である）、平均分子量６０，０００のキトサン
１２００ｇを３．５％酢酸水溶液１８，８００ｇに溶解
した。該水溶液を、７％水酸化ナトリウム，２０％エタ
ノール，７３％水よりなる凝固溶液中に落下し、キトサ
ンを粒状多孔質に凝固再生し、中性になるまで充分水洗
し、平均粒径０．１ｍｍの再生粒状多孔質キトサン担体
１０，０００ｍｌ（湿潤）を得た。得られた再生粒状多
孔質キトサン１００ｍｌを乾燥したところ５．０８６ｇ
であった。従ってこの再生粒状多孔質キトサン１００ｍ
ｌに含まれるピラノース環残基は０．０３００モルであ
った。
ときのピラノース環残基１個当たりの平均の分子量は１
６９．５である）、平均分子量６０，０００のキトサン
１２００ｇを３．５％酢酸水溶液１８，８００ｇに溶解
した。該水溶液を、７％水酸化ナトリウム，２０％エタ
ノール，７３％水よりなる凝固溶液中に落下し、キトサ
ンを粒状多孔質に凝固再生し、中性になるまで充分水洗
し、平均粒径０．１ｍｍの再生粒状多孔質キトサン担体
１０，０００ｍｌ（湿潤）を得た。得られた再生粒状多
孔質キトサン１００ｍｌを乾燥したところ５．０８６ｇ
であった。従ってこの再生粒状多孔質キトサン１００ｍ
ｌに含まれるピラノース環残基は０．０３００モルであ
った。
【００５７】この再生粒状多孔質キトサン担体それぞれ
１００ｍｌに水１００ｍｌと表１に示した分量のエチレ
ングリコールジグリシジルエーテル（エポキシ当量８
７．１３）を加えた６０℃で１時間架橋反応させた。反
応終了後、水洗し、試料Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆの６種
の架橋再生粒状多孔質キトサン担体１００ｍｌを得た。
エチレングリコールジグリシジルエーテルの導入量を測
定し表１にその結果を示す。
１００ｍｌに水１００ｍｌと表１に示した分量のエチレ
ングリコールジグリシジルエーテル（エポキシ当量８
７．１３）を加えた６０℃で１時間架橋反応させた。反
応終了後、水洗し、試料Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆの６種
の架橋再生粒状多孔質キトサン担体１００ｍｌを得た。
エチレングリコールジグリシジルエーテルの導入量を測
定し表１にその結果を示す。
【００５８】
【表１】
【００５９】各々の架橋再生粒状多孔質キトサン担体が
含む水をジメチルアセトアミドで充分に除去した。該架
橋再生粒状多孔質キトサン１００ｍｌにジメチルアセト
アミド１００ｍｌ，１．５２４ｇの塩化ステアロイルと
０．５０６ｇのトリエチルアミンを加えた。このときの
塩化ステアロイルとトリエチルアミンの濃度は、それぞ
れ５０ｍｍｏｌ／Ｌであった。
含む水をジメチルアセトアミドで充分に除去した。該架
橋再生粒状多孔質キトサン１００ｍｌにジメチルアセト
アミド１００ｍｌ，１．５２４ｇの塩化ステアロイルと
０．５０６ｇのトリエチルアミンを加えた。このときの
塩化ステアロイルとトリエチルアミンの濃度は、それぞ
れ５０ｍｍｏｌ／Ｌであった。
【００６０】これを２５℃で攪拌し１８時間反応させ
た。反応残液を除去したのち、ジメチルアセトアミドで
洗浄し、次いでジメチルアセトアミドを純水で除去し担
体Ａ´，Ｂ´，Ｃ´，Ｄ´，Ｅ´，Ｆ´を得た。熱分解
ガスクロマトグラフィーでキトサンのピラノース環残基
１モル当たりのステアリン酸導入量を定量した結果を表
２に示す。
た。反応残液を除去したのち、ジメチルアセトアミドで
洗浄し、次いでジメチルアセトアミドを純水で除去し担
体Ａ´，Ｂ´，Ｃ´，Ｄ´，Ｅ´，Ｆ´を得た。熱分解
ガスクロマトグラフィーでキトサンのピラノース環残基
１モル当たりのステアリン酸導入量を定量した結果を表
２に示す。
【００６１】
【表２】
【００６２】これらの担体それぞれに、フロモバクテリ
ウムビスコスム由来のリパーゼ（旭化成工業（株）製、
Ｔ−０１）を上述の試験方法４の固定化リパーゼの調整
法の所定濃度を２０ｍｇ／ｍｌとして固定化し、固定化
リパーゼＡ″，Ｂ″，Ｃ″，Ｄ″，Ｅ″，Ｆ″６種を得
た。各々のこれらの固定化活性，発現活性，発現率は表
３の通りであった。
ウムビスコスム由来のリパーゼ（旭化成工業（株）製、
Ｔ−０１）を上述の試験方法４の固定化リパーゼの調整
法の所定濃度を２０ｍｇ／ｍｌとして固定化し、固定化
リパーゼＡ″，Ｂ″，Ｃ″，Ｄ″，Ｅ″，Ｆ″６種を得
た。各々のこれらの固定化活性，発現活性，発現率は表
３の通りであった。
【００６３】
【表３】
【００６４】この結果から明らかなように脂肪族ポリア
ルコールのグリシジルエーテル導入量が該キトサン担体
のピラノース環残基１モル当たり０．０１〜０．４モル
のとき、固定化リパーゼの脂質分解発現活性の発現率及
びエステル交換発現活性の発現率が極めて高く好適であ
った。尚、Ａ″は有機溶剤中で使用するとき収縮が見ら
れ使用に適し難い。
ルコールのグリシジルエーテル導入量が該キトサン担体
のピラノース環残基１モル当たり０．０１〜０．４モル
のとき、固定化リパーゼの脂質分解発現活性の発現率及
びエステル交換発現活性の発現率が極めて高く好適であ
った。尚、Ａ″は有機溶剤中で使用するとき収縮が見ら
れ使用に適し難い。
【００６５】（実施例２）実施例１と同様にして得られ
た再生粒状多孔質キトサン担体８００ｍｌに水８００ｍ
ｌとエチレングリコールジグリシジルエーテル４．１８
４ｇを加えて６０℃で１時間架橋反応させた。反応終了
後、水洗し、架橋再生粒状多孔質キトサン担体８００ｍ
ｌを得た。エチレングリコールジグリシジルエーテルの
導入量は０．０７８モルであった。
た再生粒状多孔質キトサン担体８００ｍｌに水８００ｍ
ｌとエチレングリコールジグリシジルエーテル４．１８
４ｇを加えて６０℃で１時間架橋反応させた。反応終了
後、水洗し、架橋再生粒状多孔質キトサン担体８００ｍ
ｌを得た。エチレングリコールジグリシジルエーテルの
導入量は０．０７８モルであった。
【００６６】架橋再生粒状多孔質キトサン担体が含む水
をジメチルアセトアミドで充分に除去した。該架橋再生
粒状多孔質キトサン担体１００ｍｌの８種類の試料Ｇ，
Ｈ，Ｉ，Ｊ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｎ各々にジメチルアセトアミ
ド１００ｍｌと表４に示す分量の塩化ステアロイルとト
リエチルアミンを加え（このときの塩化ステアロイルと
トリエチルアミンのそれぞれの濃度を表４にあわせて示
した）各々を４０℃で攪拌し１０時間反応させた。
をジメチルアセトアミドで充分に除去した。該架橋再生
粒状多孔質キトサン担体１００ｍｌの８種類の試料Ｇ，
Ｈ，Ｉ，Ｊ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｎ各々にジメチルアセトアミ
ド１００ｍｌと表４に示す分量の塩化ステアロイルとト
リエチルアミンを加え（このときの塩化ステアロイルと
トリエチルアミンのそれぞれの濃度を表４にあわせて示
した）各々を４０℃で攪拌し１０時間反応させた。
【００６７】
【表４】
【００６８】反応残液を除去したのち、ジメチルホルム
アミドで洗浄し、次いでジメチルアセトアミドを純水で
除去し担体Ｇ´，Ｈ´，Ｉ´，Ｊ´，Ｋ´，Ｌ´，Ｍ
´，Ｎ´を得た。各々のＦＴ−ＩＲの測定結果を図１，
２，３，４，５，６，７，８に示した。２８４９ｃ
ｍ-1，２９１９ｃｍ-1でのメチレンの吸収と、１７３８
ｃｍ-1でのエステルの吸収が増大し、ステアロイルが導
入されていることが確認された。熱分解ガスクロマトグ
ラフィーで測定した該キトサン担体のピラノース環残基
１モル当たりのステアリン酸導入量測定値を表５に示し
た。
アミドで洗浄し、次いでジメチルアセトアミドを純水で
除去し担体Ｇ´，Ｈ´，Ｉ´，Ｊ´，Ｋ´，Ｌ´，Ｍ
´，Ｎ´を得た。各々のＦＴ−ＩＲの測定結果を図１，
２，３，４，５，６，７，８に示した。２８４９ｃ
ｍ-1，２９１９ｃｍ-1でのメチレンの吸収と、１７３８
ｃｍ-1でのエステルの吸収が増大し、ステアロイルが導
入されていることが確認された。熱分解ガスクロマトグ
ラフィーで測定した該キトサン担体のピラノース環残基
１モル当たりのステアリン酸導入量測定値を表５に示し
た。
【００６９】
【表５】
【００７０】各々の担体それぞれに、クロモバクテリウ
ム・ビスコスム由来のリパーゼ（旭化成工業（株）製、
Ｔ−０１）を、実施例１と同様の方法でリパーゼを固定
化し固定化リパーゼＧ″，Ｈ″，Ｉ″，Ｊ″，Ｋ″，
Ｌ″，Ｍ″，Ｎ″を得た。これらの固定化活性，発現活
性，発現率を測定した結果を表６に示す。
ム・ビスコスム由来のリパーゼ（旭化成工業（株）製、
Ｔ−０１）を、実施例１と同様の方法でリパーゼを固定
化し固定化リパーゼＧ″，Ｈ″，Ｉ″，Ｊ″，Ｋ″，
Ｌ″，Ｍ″，Ｎ″を得た。これらの固定化活性，発現活
性，発現率を測定した結果を表６に示す。
【００７１】
【表６】
【００７２】この結果から明らかなように高級脂肪酸の
導入量が該キトサン担体のピラノース環残基１モル当た
り０．０５から１モルのとき脂質分解発現活性の発現率
及びエステル交換発現活性の発現率が極めて高く好適で
あった。
導入量が該キトサン担体のピラノース環残基１モル当た
り０．０５から１モルのとき脂質分解発現活性の発現率
及びエステル交換発現活性の発現率が極めて高く好適で
あった。
【００７３】（実施例３）濃度にして各々３７．５ｍｍ
ｏｌ／Ｌの塩化オクタノイル（総炭素数６），塩化ラウ
ロイル（総炭素数１２），塩化ステアロイル（総炭素数
１８），塩化パルミトイル（総炭素数１６）と濃度にし
て３７．５ｍｍｏｌ／Ｌのトリエチルアミンを５０ｍｌ
のジメチルアセトアミドに溶解（各々重量にして０．６
１０ｇ，０．８２１ｇ，１．１３６ｇ，１．０３１ｇで
ある）し、実施例１と同様の方法で得られた架橋再生粒
状多孔質キトサン５０ｍｌの各々に加え、４０℃で攪拌
しながら１５時間反応させた。濾過により反応残液を除
去し、ジメチルアセトアミドで洗浄し、水洗後担体Ｏ，
Ｐ，Ｑ，Ｒをそれぞれ得た。熱分解ガスクロマトグラフ
ィーで測定した該キトサン担体のピラノース環残基１モ
ル当たりの高級脂肪酸導入量測定値を表７に示した。
ｏｌ／Ｌの塩化オクタノイル（総炭素数６），塩化ラウ
ロイル（総炭素数１２），塩化ステアロイル（総炭素数
１８），塩化パルミトイル（総炭素数１６）と濃度にし
て３７．５ｍｍｏｌ／Ｌのトリエチルアミンを５０ｍｌ
のジメチルアセトアミドに溶解（各々重量にして０．６
１０ｇ，０．８２１ｇ，１．１３６ｇ，１．０３１ｇで
ある）し、実施例１と同様の方法で得られた架橋再生粒
状多孔質キトサン５０ｍｌの各々に加え、４０℃で攪拌
しながら１５時間反応させた。濾過により反応残液を除
去し、ジメチルアセトアミドで洗浄し、水洗後担体Ｏ，
Ｐ，Ｑ，Ｒをそれぞれ得た。熱分解ガスクロマトグラフ
ィーで測定した該キトサン担体のピラノース環残基１モ
ル当たりの高級脂肪酸導入量測定値を表７に示した。
【００７４】
【表７】
【００７５】これら担体に、クロモバクテリウム・ビス
コスム由来のリパーゼ（旭化成工業（株）製、Ｔ−０
１）を、実施例１と同様の方法でリパーゼを固定化し、
固定化リパーゼＯ´，Ｐ´，Ｑ´，Ｒ´を得た。各々の
これらの固定化活性、発現活性、発現率は表８の通りで
あった。
コスム由来のリパーゼ（旭化成工業（株）製、Ｔ−０
１）を、実施例１と同様の方法でリパーゼを固定化し、
固定化リパーゼＯ´，Ｐ´，Ｑ´，Ｒ´を得た。各々の
これらの固定化活性、発現活性、発現率は表８の通りで
あった。
【００７６】
【表８】
【００７７】この結果から明らかなように高級脂肪酸の
総炭素数は６〜２０の範囲で脂質分解発現活性，エステ
ル交換発現活性が高く好適であった。
総炭素数は６〜２０の範囲で脂質分解発現活性，エステ
ル交換発現活性が高く好適であった。
【００７８】（実施例４）実施例２と同様にして担体Ｉ
´を得てその５ｍｌに１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．
５）２５ｍｌに溶解したシュードモナス由来のリパーゼ
（旭化成工業（株）製、、Ｔ−１８）１９５，０００ｕ
を加え１時間攪拌した。この後、１０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７．５）で充分洗浄を行った後、、０．２％にな
るようにグルタルアルデヒドを加え３７℃で３０分間攪
拌し架橋処理を行い、濾過により湿潤固定化リパーゼを
集め実施例１と同様の操作により乾燥固定化リパーゼを
取得した。この固定化活性，脂質分解活性，エステル交
換活性測定値を表９に示した。
´を得てその５ｍｌに１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．
５）２５ｍｌに溶解したシュードモナス由来のリパーゼ
（旭化成工業（株）製、、Ｔ−１８）１９５，０００ｕ
を加え１時間攪拌した。この後、１０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７．５）で充分洗浄を行った後、、０．２％にな
るようにグルタルアルデヒドを加え３７℃で３０分間攪
拌し架橋処理を行い、濾過により湿潤固定化リパーゼを
集め実施例１と同様の操作により乾燥固定化リパーゼを
取得した。この固定化活性，脂質分解活性，エステル交
換活性測定値を表９に示した。
【００７９】
【表９】
【００８０】この結果から明らかな様にシュウドモナス
由来のリパーゼを用いても優れた脂質分解発現活性，エ
ステル交換発現活性を示すものである。
由来のリパーゼを用いても優れた脂質分解発現活性，エ
ステル交換発現活性を示すものである。
【００８１】（実施例５）リパーゼ濃度を表１０に示す
如く変えて、実施例２と同様にして得られた担体Ｉ´の
１ｇ湿重各々に、クロモバクテリウム・ビスコスム由来
のリパーゼ（旭化成工業（株）製、Ｔ−０１）を実施例
２と同様の操作で固定化した。実施例１と同様の操作で
乾燥固定化リパーゼを調製し、エステル交換反応および
モノラウリン脂質分解反応での発現活性，発現率を測定
し表１０に示した。またこの乾燥固定化リパーゼを各々
５０ｍｇ秤量し、これを２ｍｌのｎ−ヘキサンに懸濁、
３７℃で１８時間振とうし、ガラスフィルターで濾過す
ることにより固定化リパーゼを回収した。この後の固定
化リパーゼのエステル交換発現活性値を測定し、次式か
らヘキサン懸濁後の活性残存率値を計算し、その結果を
表１０に示した。
如く変えて、実施例２と同様にして得られた担体Ｉ´の
１ｇ湿重各々に、クロモバクテリウム・ビスコスム由来
のリパーゼ（旭化成工業（株）製、Ｔ−０１）を実施例
２と同様の操作で固定化した。実施例１と同様の操作で
乾燥固定化リパーゼを調製し、エステル交換反応および
モノラウリン脂質分解反応での発現活性，発現率を測定
し表１０に示した。またこの乾燥固定化リパーゼを各々
５０ｍｇ秤量し、これを２ｍｌのｎ−ヘキサンに懸濁、
３７℃で１８時間振とうし、ガラスフィルターで濾過す
ることにより固定化リパーゼを回収した。この後の固定
化リパーゼのエステル交換発現活性値を測定し、次式か
らヘキサン懸濁後の活性残存率値を計算し、その結果を
表１０に示した。
【００８２】
【数１１】
【００８３】
【表１０】
【００８４】この結果より明らかなように、有機溶剤中
で保存しても脂質分解発現活性が０．０１ｕ／ｍｇ以上
で活性残存率が高く、特に０．１ｕ／ｍｇ以上では極め
て安定性の高い固定化リパーゼが得られた。
で保存しても脂質分解発現活性が０．０１ｕ／ｍｇ以上
で活性残存率が高く、特に０．１ｕ／ｍｇ以上では極め
て安定性の高い固定化リパーゼが得られた。
【００８５】また、発現活性はリパーゼの固定化活性が
高くなるに従い大きくなった。特に脂質分解発現活性が
０．０１〜１．５ｕ／ｍｇの範囲では、リパーゼ固定化
量に比例して増大し、発現率はほぼ一定であった。しか
し脂質分解発現活性が１．６ｕ／ｍｇ以上では発現活性
がリパーゼ固定化量に比例せず、発現率は減少した。
高くなるに従い大きくなった。特に脂質分解発現活性が
０．０１〜１．５ｕ／ｍｇの範囲では、リパーゼ固定化
量に比例して増大し、発現率はほぼ一定であった。しか
し脂質分解発現活性が１．６ｕ／ｍｇ以上では発現活性
がリパーゼ固定化量に比例せず、発現率は減少した。
【００８６】以上より、脂質分解発現活性で０．０１〜
２ｕ／ｍｇの範囲が好適であり、特に好ましくは０．１
〜１．５ｕ／ｍｇの範囲で、固定化リパーゼの活性収率
と活性残存率は極めて優れていることが明らかである。
２ｕ／ｍｇの範囲が好適であり、特に好ましくは０．１
〜１．５ｕ／ｍｇの範囲で、固定化リパーゼの活性収率
と活性残存率は極めて優れていることが明らかである。
【００８７】
【発明の効果】再生粒状多孔質キトサン担体に脂肪族ポ
リアルコールのグリシジルエーテルをキトサンのピラノ
ース環残基１モル当たり０．０１〜０．４モル、総炭素
数６〜２０の高級脂肪酸の酸ハロゲン化物もしくは酸無
水物をキトサンのピラノース環残基１モル当たり０．０
５〜１モル導入し、かつリパーゼが共有結合で固定化さ
れている固定化リパーゼで、該固定化リパーゼの乾燥重
量当たりの脂質分解発現活性が０．０１〜２ｕ／ｍｇで
ある固定化リパーゼは、有機溶剤中でのエステル結合の
分解，合成および交換反応に優れた触媒作用を有するも
のであり、特に各種エステルの交換反応で有機合成を行
う際に、遊離の酵素粉末や従来の固定化リパーゼと比較
して、著しく高い効率で不斉合成を行うことのできる優
れた効果のある固定化リパーゼである。
リアルコールのグリシジルエーテルをキトサンのピラノ
ース環残基１モル当たり０．０１〜０．４モル、総炭素
数６〜２０の高級脂肪酸の酸ハロゲン化物もしくは酸無
水物をキトサンのピラノース環残基１モル当たり０．０
５〜１モル導入し、かつリパーゼが共有結合で固定化さ
れている固定化リパーゼで、該固定化リパーゼの乾燥重
量当たりの脂質分解発現活性が０．０１〜２ｕ／ｍｇで
ある固定化リパーゼは、有機溶剤中でのエステル結合の
分解，合成および交換反応に優れた触媒作用を有するも
のであり、特に各種エステルの交換反応で有機合成を行
う際に、遊離の酵素粉末や従来の固定化リパーゼと比較
して、著しく高い効率で不斉合成を行うことのできる優
れた効果のある固定化リパーゼである。
【図１】本発明におけるキトサン担体Ｇ´のフーリエ変
換赤外分光光度計による測定結果を示す。
換赤外分光光度計による測定結果を示す。
【図２】本発明におけるキトサン担体Ｈ´のフーリエ変
換赤外分光光度計による測定結果を示す。
換赤外分光光度計による測定結果を示す。
【図３】本発明におけるキトサン担体Ｉ´のフーリエ変
換赤外分光光度計による測定結果を示す。
換赤外分光光度計による測定結果を示す。
【図４】本発明におけるキトサン担体Ｊ´のフーリエ変
換赤外分光光度計による測定結果を示す。
換赤外分光光度計による測定結果を示す。
【図５】本発明におけるキトサン担体Ｋ´のフーリエ変
換赤外分光光度計による測定結果を示す。
換赤外分光光度計による測定結果を示す。
【図６】本発明におけるキトサン担体Ｌ´のフーリエ変
換赤外分光光度計による測定結果を示す。
換赤外分光光度計による測定結果を示す。
【図７】本発明におけるキトサン担体Ｍ´のフーリエ変
換赤外分光光度計による測定結果を示す。
換赤外分光光度計による測定結果を示す。
【図８】本発明におけるキトサン担体Ｎ´のフーリエ変
換赤外分光光度計による測定結果を示す。
換赤外分光光度計による測定結果を示す。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成６年４月５日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４０】５．遊離リパーゼの脂質分解発現活性測定
方法 ３０６ｍＭのモノラウリンを含有するアセトン溶液
４．９ｍｌを調製する。 ２ｍｇ／ｍｌのリパーゼ水溶液０．１ｍｌを加え３７
℃で１５分間反応する（このときのモノラウリンの濃度
は３００ｍＭ、水分濃度は２％である。）。 反応後、この溶液０．５ｍｌと０．５ｍｌの０．２規
定の塩酸を混合し、５０℃で１０分間静置してリパーゼ
を失活させ、脂質分解液を得る。 次の組成からなる試験液を調製する。 ５０ｍＭ−トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５） ０．０５％界面活性剤（トリトンＸ−１００，ローム・
アンド・ハース製） １ｍＭ−ＭｇＣｌ２ １ｍＭ−アデノシン３リン酸 １ｕ／ｍｌグリセロールキナーゼ ５ｕ／ｍｌグリセロフォスフェートオキシダーゼ ０．０３％４−アミノアンチピリン ０．０３％３，５−ジメトキシ−Ｎ−エチル−（２−ヒ
ドロキシ−３−スルフォプロピル）−アニリン，ナトリ
ウム塩 ４．５ｕ／ｍｌパーオキシダーゼ で得られたリパーゼ反応液を２％のトリトンＸ−１
００で１１倍に希釈後、２０μｌとりで示した試験液
０．５ｍｌに添加し３７℃で１０分間発色反応を行う。 ０．５％ソジウムドデシル硫酸を１ｍｌ加えた６００
ｎｍの吸光度を測定する。 脂質分解発現活性値を次式で求める。
方法 ３０６ｍＭのモノラウリンを含有するアセトン溶液
４．９ｍｌを調製する。 ２ｍｇ／ｍｌのリパーゼ水溶液０．１ｍｌを加え３７
℃で１５分間反応する（このときのモノラウリンの濃度
は３００ｍＭ、水分濃度は２％である。）。 反応後、この溶液０．５ｍｌと０．５ｍｌの０．２規
定の塩酸を混合し、５０℃で１０分間静置してリパーゼ
を失活させ、脂質分解液を得る。 次の組成からなる試験液を調製する。 ５０ｍＭ−トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５） ０．０５％界面活性剤（トリトンＸ−１００，ローム・
アンド・ハース製） １ｍＭ−ＭｇＣｌ２ １ｍＭ−アデノシン３リン酸 １ｕ／ｍｌグリセロールキナーゼ ５ｕ／ｍｌグリセロフォスフェートオキシダーゼ ０．０３％４−アミノアンチピリン ０．０３％３，５−ジメトキシ−Ｎ−エチル−（２−ヒ
ドロキシ−３−スルフォプロピル）−アニリン，ナトリ
ウム塩 ４．５ｕ／ｍｌパーオキシダーゼ で得られたリパーゼ反応液を２％のトリトンＸ−１
００で１１倍に希釈後、２０μｌとりで示した試験液
０．５ｍｌに添加し３７℃で１０分間発色反応を行う。 ０．５％ソジウムドデシル硫酸を１ｍｌ加えた６００
ｎｍの吸光度を測定する。 脂質分解発現活性値を次式で求める。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４１】
【数３】
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４３】
【数４】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 谷邊 博昭 静岡県駿東郡小山町藤曲146−３
Claims (1)
- 【請求項１】 再生粒状多孔質キトサン担体に、脂肪族
ポリアルコールのグリシジルエーテルがキトサンのピラ
ノース環残基１モル当たり０．０１〜０．４モル、総炭
素数６〜２０の高級脂肪酸の酸ハロゲン化物もしくは酸
無水物がキトサンのピラノース環残基１モル当たり０．
０５〜１モル導入され、かつリパーゼが共有結合で固定
化されている固定化リパーゼであり、該固定化リパーゼ
の乾燥重量当たりの脂質分解発現活性が０．０１〜２ｕ
／ｍｇであることを特徴とする固定化リパーゼ。（但
し、乾燥固定化リパーゼの脂質分解発現活性は、３００
ｍＭのモノラウリンと２％の水を含むアセトン溶液を基
質溶液とし、３７℃で１５分間リパーゼを反応させたと
きに、１分間に１μｍｏｌのグリセロールを生成すると
き１ｕと定義する。）
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