JPH0753402A - ウイルス安全な血液凝固因子ｘｉｉｉ調製物 - Google Patents

ウイルス安全な血液凝固因子ｘｉｉｉ調製物

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JPH0753402A
JPH0753402A JP6179931A JP17993194A JPH0753402A JP H0753402 A JPH0753402 A JP H0753402A JP 6179931 A JP6179931 A JP 6179931A JP 17993194 A JP17993194 A JP 17993194A JP H0753402 A JPH0753402 A JP H0753402A
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Abstract

(57)【要約】 【構成】 糖、ポリオール、アミノ酸、ペプチドおよび
カルボン酸からなる群から選択される１０％未満の既知
の安定化物質ならびに０.５モル/Ｌ未満の硫酸アンモニ
ウムを含み、少なくとも２Ｕ/mg全タンパク質の比活性
を有する血液凝固因子ＸIIIを含有する水溶液を、感染
性病原体を不活性化するに十分な時間、加熱することに
より得られるウイルス安全な血液凝固因子ＸIII調製物
が提供される。 【効果】 本発明の調製物を用いて、感染性病原体が伝
染する危険のない投与を行うことができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、低い感染危険性を有す
ると同時に高活性を有する、ヒト起源の、ウイルスに対
して安全な血液凝固因子ＸIII調製物に関する。
【０００２】プロ酵素因子ＸIIIは血漿中にａおよびｂ
鎖の形態(a2b2、分子量約３２０,０００Ｄa)で存在す
る。式ａ2で示される因子ＸIII(分子量約１６０,０００
Ｄa)は、例えば胎盤および血小板中に見い出される。因
子ＸIIIの両変異体において、ａ鎖はプロ酵素を正確に
構成し、この酵素からＣa2+イオンの存在下、トロンビ
ンの作用の下で活性な酵素である因子ＸIIIaが生成す
る。
【０００３】因子ＸIIIは血液凝固の最終期に必須の役
割を果たす：トロンビンにより引き起こされるフィブリ
ノーゲンからフィブリンへの変換(凝固)と同時に、因子
ＸIIIはＣa2+イオンの存在下に因子ＸIIIaへと活性化さ
れ、次いでこの因子ＸIIIaは形成されたフィブリン単量
体を共有結合により架橋する。この様にして形成された
高重合体は非架橋フィブリンよりかなり高い機械的強度
を呈し、さらに繊維素溶解分解に比較的耐性であって、
これが有効な止血に決定的に重要である。さらに、因子
ＸIIIの存在は正常な癒傷にとって必要な先行条件であ
る。
【０００４】因子ＸIII欠損患者は、負傷したときに止
血および癒傷において重い障害を受け、これは因子ＸII
I調製物の静脈内投与によってのみ除去することができ
る。さらにフィブリノーゲンおよび因子ＸIIIに基づく
組織接着(「フィブリン接着」)においても、所望の高強度
の接着を得るためならびに有効な止血および良好な癒傷
のために因子ＸIIIの十分な含量が必須である。
【０００５】最後に、医学-診断目的のために標準化さ
れた因子ＸIII調製物に対する必要性が存在する。
【０００６】
【従来の技術】因子ＸIII調製物、特にヒトに投与すべ
き調製物はヒト血漿およびヒト胎盤から得られる。使用
される出発物質の故に、無菌的濾過により除去し得ない
感染性病原体、例えばウイルスを伝染させる危険性が基
本的に存在する。
【０００７】上記の全ての適用のために、患者またはス
タッフのどちらも危険にさらさないように、因子ＸIII
調製物が実際に感染のいかなる危険性も有していてはな
らないという要求が存在する。この必要条件はヒトに投
与すべき調製物に関して特に重要であり、例えば因子Ｘ
III欠損患者に一生を通して定期的な間隔で投与しなけ
ればならない注入調製物に関して最も重要である。感染
性粒子が完全には除去されていない全ての調製物を用い
る場合には、この繰り返し投与は患者においてこれら粒
子の蓄積を導き、このようにして感染の危険性の大きな
増大を導くであろう。
【０００８】従って、この危険性を可能なかぎり最小限
にするための試み、すなわち一方では出発物質を試験す
ることによる、また他方では存在する可能性のあるあら
ゆる感染性病原体を不活性化するための追加的な測定に
よる試みがなされている。しかし、既知でありさらに適
当な試験法が利用可能である感染性病原体(肝炎および
ＨＩウイルス)に対して出発物質を試験することができ
るのみであり、存在するかもしれない他の未知の感染性
病原体に対しては試験することができない。さらに、全
ての試験法の感受性は限られており、ゆえに、既にこの
理由のために絶対的な安全性を期待することができな
い。
【０００９】不安定な生物学的調製物中のウイルスなど
の病原体を不活性化する全ての方法は、この方法がウイ
ルス力価をできるだけ低下させるべきであるが、他方で
は生物学的活性の低下をできるだけ少ない程度にすべき
であるという基本的問題を有する。
【００１０】現在のウイルス不活性化法は、高用量(例
えば、凝固因子調製物中、約１０5ＩＤ/mlの最大可能力
価に対応する)の試験ウイルスと混合した試験調製物に
対して該方法を適用した後に、もはやサンプル中にいか
なるウイルスも検出することができず、こうしてウイル
ス力価が検出限界以下まで低下した場合に有効であると
称される。
【００１１】不活性化の確認としていわゆる「低下係数」
(「ウイルス低下係数」)が知られており、これは、試験ウ
イルスの一回の添加後の最初および最後のウイルス力価
の比の１０の対数から算出される。欧州共同体委員会の
指導的なEC III/8115/898-ENから、さらにいわゆる全低
下係数が知られている。これは個々の続いて行われる不
活性化測定の低下係数の合計から算出される。
【００１２】従って、該方法を実施した後の低下係数
(ＲＩ)または全低下係数(Ｒ)の生物学的残存活性(ＲＡ)
に対する比は、ウイルス不活性化法を確認するのに役立
つ。
【００１３】溶液中の加熱(低温殺菌)により因子ＸIII
調製物中の病原体を不活性化する既知の方法が存在する
[EP-A−0 018 561、EP-A−0 037 078]。因子ＸIIIの生
物学的活性は、既知の安定化物質、例えばアミノ酸、ペ
プチド、糖、ポリオールまたはカルボン酸、いわゆる
「熱安定化物質」(１０％より多く５０％までの量で用い
なければならない)の添加により実質的に保持すること
ができる(シロップ法)。さらに、０.１％より高い濃度
のヒトアルブミンが熱安定化物質として示唆されている
(JP 80960/1988)。また、熱処理前の０.５Ｍより多い硫
酸アンモニウムの添加により血液凝固因子を安定化する
方法が知られている(AT 376 883)。
【００１４】しかし、加熱産物からの高濃縮された熱安
定化物質の必要な除去は厄介である。安定化物質の存在
下での低温殺菌によるウイルス不活性化法は、所望の生
物学的活性と同時にウイルス自体が安定化され、これに
より低下係数の残存活性に対する特に好ましい比(Ｒ／
ＲＡ)が得られないという不利益をさらに有する。
【００１５】これまで、安定化物質を含まない因子ＸII
I含有溶液の液体加熱は専門家の観点から不可能である
と考えられていた；例えば、EP-A−0 037 078における
比較例において、安定化物質を添加せずに因子ＸIIIを
６０℃で１０時間加熱した。この実施において、因子Ｘ
IIIの活性は完全に破壊された。
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、ウイルス安
全な血液凝固因子ＸIII調製物であって、大量の因子ＸI
IIを投与したときでさえ感染性病原体の伝染が排除され
ることを該調製物から予測することができ、それにもか
かわらず高活性を有する調製物を提供するという目的を
有する。さらに本発明は、溶液中で加熱することにより
因子ＸIII含有調製物中の感染性病原体を不活性化する
方法であって、既知の低温殺菌法に固有の不利益を呈し
ない方法を提供する目的を有する。
【００１７】
【課題を解決するための手段】本発明に従い、これら目
的はウイルス安全な血液凝固因子ＸIII調製物により達
成され、これは、全タンパク質１mgあたり少なくとも２
Ｕの比活性を有する血液凝固因子ＸIIIを含有する水溶
液であって、糖、ポリオール、アミノ酸、ペプチドおよ
びカルボン酸からなる群から選択される１０％未満の既
知の安定化物質、ならびに０.５モル/Ｌ未満の硫酸アン
モニウムを含む溶液を、感染性病原体を不活性化するに
十分な時間、好ましくは３０分〜１００時間加熱するこ
とにより達成される。
【００１８】さらに本発明は、感染性病原体が加熱によ
り不活性化されるウイルス安全な血液凝固因子ＸIII調
製物を製造する方法であって、糖、ポリオール、アミノ
酸、ペプチドおよびカルボン酸からなる群から選択され
る１０％未満の既知の安定化物質、ならびに０.５モル/
Ｌ未満の硫酸アンモニウムを含み、少なくとも２単位、
好ましくは少なくとも１５単位/mg全タンパク質の比活
性を有する因子ＸIII含有分画の水溶液を、４０〜６５
℃の温度で、感染性病原体を不活性化するに十分な時
間、好ましくは３０分〜１００時間加熱することを特徴
とする方法を包含する。
【００１９】驚くべきことに、因子ＸIII含有溶液を既
知の安定化物質の不在下または低含有量の下で加熱した
場合に、非常に好ましいこれまで達成されなかったウイ
ルス低下係数の因子ＸIII残存活性に対する比が得られ
ることが見い出された。比較アッセイにより、溶液(６
０℃)中で加熱することによるＨＩＶ力価の一定の低下
は、加熱を安定化物質(EP-A−0 018 561に従った５０％
スクロース、２Ｍグリシン)の存在下で行うときには少
なくとも１０倍長い加熱時間を必要とすることが示され
た。
【００２０】因子ＸIII活性が高度に保存されたいう事
実はさらに驚くべきことであった。この理由は、因子Ｘ
IIIを例えばEP-B−0 159 311に従って熱処理に供する場
合には因子ＸIIIが比較的、熱不安定であると考えられ
るからである。
【００２１】本発明による方法を、因子ＸIIIの生物学
的活性の５０％より多くが保存される温度および時間で
行う。
【００２２】本発明の方法の好ましい態様は次の測定を
特徴とする： ・因子ＸIII含有ＣＯＨＮ Ｉ分画を得、 ・因子ＸIIIをＣＯＨＮ Ｉ分画から沈殿させて沈殿物を
分離し、 ・所望なら、因子ＸIII含有沈殿物を溶解および再沈殿
によりさらに精製し、 ・溶解沈殿物を短時間加熱して熱変性フィブリノーゲン
を分離し、 ・所望なら、因子ＸIII含有溶液をさらに精製および濃
縮し、 ・既知の安定化物質を添加せずに４０〜６０℃の温度で
３０分〜２時間、ＸIII含有溶液を加熱する。
【００２３】溶解したＣＯＨＮ Ｉ分画からの因子ＸIII
の沈殿は、例えば硫酸アンモニウム(２０℃で約１０〜
２０％飽和)またはグリシン(約１.５〜３モル/Ｌ)を用
いて行うことができる。また、因子ＸIIIを沈殿させる
(フィブリノーゲンの存在下で)のに適当であることが知
られているさらに別の沈殿化物質を用いてもよい。
【００２４】得られた沈殿物の分離および溶解後に、同
じかまたは異なる沈殿化物質を用いて沈殿を繰り返して
もよい。次いで、沈殿物を溶解して短時間(例えば５６
℃で３分間)加熱し、存在するあらゆるフィブリノーゲ
ンを変性および沈殿させる。加熱沈殿後に得られた上清
は、約０.５〜２.５mg/mlの全タンパク質含量を有し、
約２〜１０Ｕ/mg全タンパク質の比活性を有する因子ＸI
IIを含有する。
【００２５】さらにこの因子ＸIII含有溶液を精製して
もよく、この場合、伴われるタンパク質はポリエチレン
グリコール(例えば、約４℃で約３.５％までの濃度のＰ
ＥＧ４０００)の添加により沈殿および分離される。
【００２６】さらに、１０％までの濃度のＰＥＧ４００
０の添加により因子ＸIIIを沈殿させて、緩衝溶液、例
えば０.１％クエン酸溶液(pＨ７.０)中に溶解して数百
単位/mlの濃度にすることができる。
【００２７】次いで、このようにして得た溶液を、既知
の安定化物質を添加せずに加熱し(例えば、６０℃で２
７時間または５０℃で１２時間)、因子ＸIII活性は実質
的に保存される。
【００２８】好ましい態様において、加熱すべき溶液は
さらにテンシド(tenside)、好ましくは非イオン性テン
シドを含有する。テンシド濃度は、用いるテンシドの型
により可変的に選択すべきである。加熱工程中にテンシ
ドがさらに抗ウイルス薬的に活性となり、因子ＸIII活
性が実質的に損傷されない濃度が適当である。
【００２９】各々の所望のテンシドに対してこのような
適当な濃度は簡単な実験により決定されるであろう。
【００３０】適当な濃度は、例えばデスオキシコレート
については０.２％(w/v)以下であり、塩化ベンジルトリ
メチルアンモニウムおよび塩化ベンジル-ジメチル-２-
ヒドロキシエチル-アンモニウムについては０.１％(w/
v)以下であり、スルホベタインＳＢ １２(Serva；Ｎ-ド
デシル-Ｎ',Ｎ-ジメチルアンモニオ-１-プロパン-スル
ホネート)については０.３％(w/v)以下であり、Ｎ-オク
チルグルコシドについては１％以下であるが、Tween 80
またはTriton X-100などのテンシドを実質的に比較的高
い濃度(１５％(w/v)およびそれ以上)で用いても良い。
【００３１】驚くべきことに、テンシド存在下の溶液中
で加熱したときに因子ＸIIIの安定性は、テンシド不在
下とおよそ同程度に良好であるが、ウイルス不活性化は
さらに迅速に進行し、これにより概してウイルス低下係
数の因子ＸIII残存活性に対するさらに好ましい比が得
られる。必要ならば、添加されるテンシドを加熱工程後
に本質的に既知の方法、例えば再沈殿またはイオン交換
クロマトグラフィーにより再び除去してもよい。
【００３２】感染性病原体、例えば肝炎またはＡＩＤＳ
ウイルス(ＨＩＶ)の伝染の点でこれまで達成されなかっ
た安全性と同時に存在する酵素の高い比活性のために、
本発明による調製物は、ヒトに対する予防的および治療
的投与のための調製物の製造、組織接着物質の製造なら
びに診断的目的のために適している。
【００３３】ウイルス安全な血液凝固因子ＸIII調製物
の好ましい適用は、既にウイルス不活性化されたフィブ
リノーゲン調製物への因子ＸIIIの添加による、ウイル
ス安全な組織接着調製物の製造から成る。
【００３４】所望の低下係数を得るための本発明による
熱処理の継続時間は、一定量の試験ウイルスが混合され
た因子ＸIIIサンプルについて実験的に決定することが
できる。
【００３５】ウイルス不活性化のために、依然として測
定可能なウイルス力価が得られるまで因子ＸIIIサンプ
ルを特定の温度で熱処理する。時間当たりのウイルス力
価単位の低下から、ウイルス力価の所望の全低下を得る
ために必要な処理時間を計算することが可能である。
【００３６】この様式で計算する場合には、ウイルス不
活性化が、変化しない速度定数を有する一次の反応であ
ることが前提とされる。
【００３７】これは実際に常に起こらないとしても、な
おその時間経過の間に方法の効力の低下(いわゆるテー
リング)が観察されることが多いが、記載される計算の
様式は依然として様々なウイルス不活性化法の効力を互
いに比較する認められた方法である。
【００３８】しかし、熱処理の間に一定量の試験ウイル
スを繰返し加えることもEP 0 519 901の方法に従って可
能であり、各繰返しはウイルス力価が特定の値、好まし
くは検出限界以下まで低下したときにのみ行う。次い
で、全低下係数は個々の低下係数の合計から得られる。
【００３９】本発明の方法を実施するために、高度に精
製された因子ＸIIIを含有している分画が特に適してい
ることが判明した。従って、本発明の方法の好ましい態
様は、熱不活性化の前に、因子ＸIII含有分画を精製し
て、所望なら濃縮して因子ＸIIIの少なくとも１５単位/
mg全タンパク質の比活性を得ることから成る。
【００４０】本発明の方法を実施したときに、調製物の
精製度が高いほど、すなわちその比活性が高ければ高い
ほど因子ＸIIIの安定性が高くなることは驚くべきこと
であった。
【００４１】通常、不安定な酵素は他のタンパク質(既
知の例はアルブミン)の存在により安定化されるから、
全く正反対のことが予想されねばならないであろう。
【００４２】しかし、驚くべきことに、本発明に従った
方法においてはアルブミンは因子ＸIIIに対していかな
る安定化効果も有さず、さらに他の血漿タンパク質も安
定化物質として作用しないことが見い出されている。
【００４３】因子ＸIII含有分画を血漿から得ることは
都合がよい。その場合因子ＸIIIはａ鎖およびｂ鎖の両
方を含むであろう。
【００４４】本発明に従った方法を実施する前に、存在
する可能性のあるフィブリノーゲンを分離するのは都合
がよい。熱変性されたフィブリノーゲンの存在下で、ウ
イルスの封入も起こるであろう。このような封入ウイル
スは熱作用に関して安定化され、これにより方法の信頼
性は疑わしいものとなるであろう。短時間の加熱(例え
ば、５６℃〜６０℃で数分間)の後に、フィブリノーゲ
ンは変性し、次いで沈殿物として分離することができ
る。
【００４５】本発明に従った方法を、因子ＸIIIが溶液
中に少なくとも２単位/mg全タンパク質の比活性で存在
する血漿分画法のあらゆる段階で行うことができる。
【００４６】以下の実施例において、以下の分析法を適
用した： 全タンパク質：ビウレット法。
【００４７】因子ＸIII：２つの異なるが両方とも同じ
基本的原理、すなわち因子ＸIIIによるフィブリン架橋
に基づく方法に従い測定を行った。
【００４８】方法１：因子ＸIIIを含まないフィブリノ
ーゲン溶液の一部を、測定すべきサンプルの異なる希釈
物およびトロンビン-ＣaＣl2溶液と混合し、３７℃でイ
ンキュベートする。一定のインキュベート時間後に反応
を１％モノクロロ酢酸(ＭＣＡ)の添加により停止させ、
ＭＣＡ中のフィブリン凝塊の溶解性または不溶性を測定
する。プールした十分に凍結させたヒトクエン酸化血漿
を標準とする(定義により血漿１mlが１単位の因子ＸIII
を含有する)。不溶性の凝塊が依然として得られるサン
プルおよび標準の最も高い希釈を、各々、次の式に従
い、未知のサンプル(ｘ)の因子ＸIII含量を算出するた
めに供した：
【数１】ｘ ＝ Ｖx ／ Ｖs [式中、Ｖxは未知のサンプルの希釈であり、そしてＶsは
標準の希釈である]。従ってこの通常の測定法は、最終
的に１％モノクロロ酢酸中の非架橋フィブリンの溶解性
または架橋フィブリンの不溶性に基づく。ゆえに、その
精度はこの溶解性限界の不正確性により制限される。
【００４９】方法２：反応混合物は方法１のものに対応
するが、反応は尿素、Ｎa-ドデシル硫酸(ＳＤＳ)および
β-メルカプトエタノールの混合物の添加により停止さ
れ、タンパク質に含有されるジスルフィド架橋は還元に
より切断される。このようにして得られたサンプル中の
フィブリン-γ-鎖の架橋度は、ＳＤＳゲル電気泳動およ
びクーマシーブルーによる染色後に濃度計により測定す
る。グラフ内挿法により、フィブリン-γ-鎖の架橋が５
０％に達するサンプルおよび標準の希釈が得られる。こ
れら希釈を各々ＶxおよびＶsとしたときに、未知サンプ
ル(ｘ)の因子ＸIII含量は次式に従い方法１のように算
出される：
【数２】ｘ ＝ Ｖx ／ Ｖs その性質により、方法２は(通常の)方法１より正確であ
るが、これははるかに多くの作業を含む。従って方法２
は、因子ＸIII測定の比較的高い正確度が本発明の方法
を説明するために都合がよいかまたは必要であるらしい
場合に用いた。
【００５０】
【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく
説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるもので
はない。実施例１ フィブリノーゲンを含まない因子ＸIII溶液
の調製(熱沈殿上清) 通常のＣＯＨＮ Ｉ沈殿物(フィブリノーゲンおよび因子
ＸIIIを含有する血漿分画からエタノールを用いた沈殿
により得た)を１０倍量のクエン酸含有緩衝溶液(pＨ７.
０)(０.０５Ｍクエン酸、０.５Ｍ ＮaＣl、２０.０００
ＫＩＵアプロチニン／Ｌ)を用いて溶解し、撹拌しなが
ら１６％飽和になるまで(室温で)硫酸アンモニウムと混
合した。直ちにこれを４℃まで冷却し、混合物をさらに
２時間撹拌した。生成した沈殿物を上記緩衝溶液を用い
て溶解し、硫酸アンモニウムを用いて沈殿をもう１度繰
り返した。この沈殿物をクエン酸含有緩衝溶液(pＨ７.
０)[０.０２Ｍクエン酸、０.１２Ｍ ＮaＣl、１００Ｋ
ＩＵアプロチニン／ml]に溶解し、５６℃で１０分間加
熱した。生成した沈殿物(変性化フィブリノーゲンから)
を遠心分離した。熱沈殿上清は２.１mg/mlのタンパク質
含量および７.７Ｕ/mlの因子ＸIII含量(方法２による)
を有していた。従って、比活性は因子ＸIII３.７Ｕ/mg
(タンパク質)であった。
【００５１】実施例２ 溶液加熱時の因子ＸIIIの安定
性 実施例１に対応する熱沈殿上清を４０〜６５℃の温度で
安定化物質を添加せずに加熱した。熱処理の一定持続時
間後に、加熱前の活性に基づく因子ＸIIIの残存活性を
測定した。
【表１】 表１：安定化物質の添加を含まない熱沈殿上清の加熱 温度 持続時間(時) 残存活性(％) 測定法 ４０℃ ７ １００ １ ２４ ８０ １ ５０℃ ７ １００ １ ２４ ８０ １ ６０℃ １ ８５ ２ ２ ７３ ２ ４ ５０ ２ ６５℃ ０.５分 ８５ １ １分 ７５ １ ２分 ５５ １
【００５２】実施例３ 溶液中で加熱した場合の因子Ｘ
IIIの比活性および安定性 安定化物質を含まない溶液中で加熱した場合の次の因子
ＸIII溶液の安定性を比較した： Ａ）実施例１の熱沈殿上清 Ｂ）さらに精製するために、実施例１の硫酸アンモニウ
ム沈殿物をクエン酸含有緩衝溶液[０.０２Ｍクエン酸、
０.１２Ｍ ＮaＣl、５０,０００ＫＩＵアプロチニン/
Ｌ]に溶解し、グリシン(１.７５モル/Ｌ)で再沈殿させ
た。沈殿物を同じ緩衝溶液中に溶解し、熱沈殿を実施例
１に従って行った。 Ｃ）実施例１に従った熱沈殿上清を、さらに精製および
濃縮するために以下の様式でさらに処理した。 １）４℃で３.５％(w/v)ＰＥＧ４０００を用いた沈殿に
よる伴われるタンパク質の分離 ２）４℃で１０％(w/v)濃度までのＰＥＧ４０００の添
加による上清からの因子ＸIIIの全沈殿、遠心による沈
殿物の分離および０.１％クエン酸ナトリウム緩衝液(p
Ｈ７.０)の元の容量の１／２５への溶解 熱処理(６０℃で４時間、安定化物質なし)後の３つの溶
液Ａ、Ｂ、Ｃの因子ＸIII残存活性を測定した(方法
２)。
【表２】 表２：様々な純度の因子ＸIII含有溶液の加熱 溶液 比活性(Ｕ/mg全タンパク質) ６０℃で４時間後の残存活性(％) Ａ） ３.７ ５０ Ｂ） １７ ８２ Ｃ） ３５ ９５ 実施例は、安定化物質を含まない溶液中で加熱した場合
に因子ＸIIIの安定性がその純度(比活性)と共に上昇す
ることを示している。
【００５３】実施例４ テンシドの存在下に溶液(安定
化物質を含まない)中で加熱した場合の因子ＸIIIの安定
性 因子ＸIII含有溶液は実施例３、変形Ｃに従い製造し
た。比活性は２１Ｕ因子ＸIII/mg(タンパク質)に達し
た。溶液を分割し、一部を１％(w/v)のTween80と混合し
た。両溶液を６０℃で６時間加熱した。６時間の加熱後
に、因子ＸIII残存活性はテンシドの添加なしで８２
％、テンシドを添加した場合には８４％に達した(方法
２に従い測定)。
【００５４】実施例５ 異なる濃度の様々なテンシドと共に実施例４を繰り返し
た(加熱：６０℃、４時間)。
【表３】 表３：テンシド存在下での因子ＸIII含有溶液の加熱 テンシド 濃度(％(w/v)) 因子ＸIII残存活性(％) Tween 80 １５ ９７ Triton X-100 １５ ９１ Pluronic P 85 １０ ９６ N-オクチルグルコシド ０.３ ８６ Na-デスオキシコレート ０.１ ６７ 塩化ベンジルトリメチル ０.０１ ９７ アンモニウム 塩化ベンジルジメチル-2- ０.０１ ９３ ヒドロキシエチルアンモニウム Sulfobetaine SB 12 ０.０３ ９３ ０.１ ６３ 実施例４および５は、非イオン性、陰イオン性、陽イオ
ン性または両性イオン性テンシドの存在下でもいかなる
問題も伴わず、因子ＸIII活性の大きな損失を受けるこ
となく本発明の方法を行うことができることを示してい
る。以下の実施例６および７は本発明による方法の効果
を示す。
【００５５】実施例６ 変性化フィブリノーゲンの存在
または不在下での本発明の方法によるモデルウイルスの
不活性化 実施例１による因子ＸIII含有分画のサンプルについ
て、Ａ）熱沈殿およびフィブリノーゲンの分離前に、ま
たはＢ）熱沈殿分離後の沈殿物をシンドビス、ワクシニ
ア、ポリオまたは水疱性口内炎(ＶＳ)ウイルスの１０容
量％の懸濁物と混合して６０℃で加熱し、ウイルス力価
を異なる加熱時間の後に測定し、６０分の加熱時間に基
づいて低下係数(Ｒ)を算出した。変形Ａ)においては、
ウイルス力価測定を加熱中に形成した熱沈殿上清由来の
Ｂ)と同様に行った。結果を表４に挙げる。
【表４】 表４：変性化フィブリノーゲンの存在または不在下での因子ＸIII含有 溶液中のウイルス力価の低下(各々、変形ＡまたはＢ) ６０℃での以下の加熱時間後のウイルス力価(log10) ウイルス 変形 0 5 10 15 20 30 45 60 R シンドビス Ａ 6.5 - ≦0.5 - ≦0.5 ≦0.5 ≦0.5 ≦0.5 ≧36 ワクシニア 6.2 - 2.5 - 0.7 ≦0.5 ≦0.5 ≦0.5 16.5 ポリオ 7.0 - ≦0.5 - ≦0.5 ≦0.5 ≦0.5 ≦0.5 ≧39 シンドビス Ｂ 6.5 - ≦0.5 - ≦0.5 ≦0.5 ≦0.5 ≦0.5 ≧36 シンドビス 6.4 1.2 ≦0.5 ≦0.5 - ≦0.5 - ≦0.5 62 ワクシニア 6.2 - 1.0 - ≦0.5 ≦0.5 ≦0.5 ≦0.5 31.2 ポリオ 7.0 - ≦0.5 - ≦0.5 ≦0.5 ≦0.5 ≦0.5 ≧39 ＶＳＶ 7.0 0.7 ≦0.5 ≦0.5 - ≦0.5 - ≦0.5 54 結果は、最もこれに類似している既知の方法、すなわち
安定化物質の存在下での低温殺菌と比較したときに本法
の優れた効力を示す。この既知の方法の効力は、例え
ば、R.MaulerおよびJ.Hilfenaus[Arzneim.Forsch./Drug
Res. 34, 1524-1527 (1984), Table 2, p.1526]より知
られている。
【００５６】ポリオおよびワクシニアウイルスに対する
各低下係数(６０℃、１時間)を計算し、その後にウイル
ス力価の１０5の低下が発生する(Ｒ＝５)加熱時間(６０
℃)を決定した(グラフ内挿法により)場合に、結果とし
て以下の比較が得られる(表５)：
【表５】 表５：本発明の方法および従来技術の方法のウイルス不活性化能力の比較 方法 ウイルス Ｒ(６０℃、１時間) 加熱時間(６０℃)(Ｒ＝５) 従来技術 ポリオ １.２ ４時間１０分 (Maulerら) ワクシニア １.７５ ２時間５２分 本発明による ポリオ ≧３９ ≦８分 方法 ワクシニア ３１ １０分 結果(表４)はさらに、ワクシニアウイルスの例により、
沈殿した変性化タンパク質を除去することは都合がよい
ことを示している。
【００５７】実施例７ テンシド存在下または不在下の
本発明の方法によるモデルウイルス(シンドビス)の不活
性化 実施例３、変形Ｃに従った因子ＸIII含有溶液を分割
し、一部を０.３％(w/v)Ｎ-オクチルグルコシドと混合
した。両溶液を６０℃で加熱し、１０容量％のシンドビ
スウイルス懸濁物と混合し(ウイルス不活性化反応の開
始)、さらに６０℃でインキュベートした。一定の時間
間隔で、サンプルを採取し、ウイルス力価を測定した。
結果を以下の表６に挙げる。
【表６】 表６：６０℃でテンシド含有および不含の因子ＸIII含有溶液における ウイルス不活性化 ウイルス力価(log10) ６０℃での加熱の持続時間(分) テンシド不含 テンシド含有 ０ ８.１ ８.１ ０.５ ５.７５ １.８８ １ ５.０ ≦１.５ １.５ ４.２５ ≦１.５ ２ ３.８８ ≦１.５ ２.５ ３.７５ ≦１.５ ３ ３.２５ ≦１.５ ３.５ ２.７５ ≦１.５ ４ ２.６３ ≦１.５ ４.５ ２.５ ≦１.５ ５ ２.３８ ≦１.５ ６ １.８８ ≦１.５ ７ ２.１ ≦１.５ ８、１０、１５、２０、３０ ≦１.５ ≦１.５ 本実施例は、本発明の方法がテンシドの存在下で行われ
た場合に一層有効であることを示す：さらに迅速で一層
広範囲なウイルス不活性化が、因子ＸIII活性の大きな
損失を受けることなく達成される(実施例５を参照)。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 47/42 Ｊ

Claims (14)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 少なくとも２Ｕ/mg全タンパク質の比活
    性を有する血液凝固因子ＸIIIを含有し、糖、ポリオー
    ル、アミノ酸、ペプチドおよびカルボン酸からなる群か
    ら選択される１０％未満の既知の安定化物質ならびに
    ０.５モル/Ｌ未満の硫酸アンモニウムを含む水溶液を、
    感染性病原体を不活性化するに十分な時間、加熱するこ
    とにより得られるウイルス安全な血液凝固因子ＸIII調
    製物。
  2. 【請求項２】 加熱を３０分〜１００時間行う請求項１
    に記載のウイルス安全な血液凝固因子ＸIII調製物。
  3. 【請求項３】 加熱をテンシドの存在下で行う請求項１
    に記載のウイルス安全な血液凝固因子ＸIII調製物。
  4. 【請求項４】 テンシドが非イオン性テンシドである請
    求項３に記載のウイルス安全な血液凝固因子ＸIII調製
    物。
  5. 【請求項５】 溶液が既知の安定化物質を実質的に含ま
    ない請求項１に記載のウイルス安全な血液凝固因子ＸII
    I調製物。
  6. 【請求項６】 感染性病原体を加熱により不活性化しな
    がらウイルス安全な血液凝固因子ＸIII調製物を製造す
    るための方法であって、以下の工程からなる方法： ・糖、ポリオール、アミノ酸、ペプチドおよびカルボン
    酸からなる群から選択される１０％未満の既知の安定化
    物質ならびに０.５モル/Ｌ未満の硫酸アンモニウムを含
    有する溶液を含み、少なくとも２Ｕ/mg全タンパク質の
    比活性を有する因子ＸIIIの水溶液を調製し、そして ・該水溶液を４０〜６５℃の温度で、感染性病原体を不
    活性化するに十分な時間加熱する。
  7. 【請求項７】 加熱を３０分〜１００時間行う請求項６
    に記載の方法。
  8. 【請求項８】 加熱をテンシドの存在下で行う請求項６
    に記載の方法。
  9. 【請求項９】 テンシドが非イオン性テンシドである請
    求項８に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 溶液が既知の安定化物質を実質的に含
    まない請求項６に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 因子ＸIIIの生物学的活性の５０％よ
    り多くを保持するに適当な温度および時間で加熱を行う
    請求項６に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 以下の組み合わせからなる請求項６に
    記載の方法： ・因子ＸIII含有ＣＯＨＮ-Ｉ分画を得、 ・該ＣＯＨＮ-Ｉ分画から因子ＸIIIを沈殿させて沈殿物
    を生成させ、該沈殿物を分離し、 ・溶解した沈殿物を短時間加熱し、変性したフィブリノ
    ーゲンを分離し、そして ・安定化物質を添加せずに該因子ＸIII含有溶液を４０
    〜６０℃で３０分〜２時間加熱する。
  13. 【請求項１３】 治療的および予防的適用、組織接着物
    質の製造、ならびに診断目的を意図した調製物を製造す
    るための請求項１に記載の血液凝固因子ＸIII調製物の
    使用。
  14. 【請求項１４】 既にウイルス不活性化したフィブリノ
    ーゲン調製物への添加物としてウイルス安全な組織接着
    物質調製物を製造するための請求項１に記載のウイルス
    安全な血液凝固因子ＸIII調製物の使用。
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