JPH07508410A - Method for producing transgenic non-human animals having yeast artificial chromosomes - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。 (57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.

Description

【発明の詳細な説明】 酵母人工染色体を有するトランスジェニック非ヒト動物の製造方法 技術分野 本発明は、異種のポリペプチドを発現できるトランスジェニック非ヒト動物、こ のようなトランスジェニック動物の製造のために用いられるトランスジーン、異 種のポリペプチドを発現できるトランスジーン、ヒトタンパク質例えばヒト免疫 グロブリン又はアミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）をエンコードするポリヌク レオチド配列を含む酵母人工染色体（ｙｅａｓｔ　ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｃｈ ｒｏｍｏｓｏｍｅｓ　）　、大きなポリヌクレオチド配列を細胞内へ移入させる ための方法及びトランスジーン、及び細胞内へ不連続ポリヌクレオチド配列をコ リボフエクション（ｃｏ−１ｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ）するための方法に関する。[Detailed description of the invention] Method for producing transgenic non-human animals having yeast artificial chromosomes Technical field The present invention provides a transgenic non-human animal capable of expressing a heterologous polypeptide. Transgenes used for the production of transgenic animals such as Transgenes capable of expressing polypeptides of species, human proteins e.g. Polynucleotides encoding globulin or amyloid precursor protein (APP) Yeast artificial chromosome containing leotide sequence romosomes), import large polynucleotide sequences into cells methods and transgenes for and co-coding discontinuous polynucleotide sequences into cells. The present invention relates to a method for co-lipofection.

発明の背景 細胞内へ異種の遺伝物質を移入させることは、現代の分子生物学の基礎である。Background of the invention Transfer of foreign genetic material into cells is the basis of modern molecular biology.

移入方法の効率、特異性、及び／又は大きさの限界を改善するための新しい方法 の絶え間ない開発が、従来は構築することが現実的でなく又は不可能であったポ リヌクレオチドクローン及び組換え生物の製造を可能にして、研究及び生産開発 の範囲を拡げてきた。特に、リン酸カルシウム沈降法、エレクトロポレーション 、リポフエクション、弾道移入（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ　ｔｒａｎｓｆｅｒ）　、 ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション、マイクロインジェクション及び ウィルスに基づいた移入法が、異質のＤＮＡフラグメントを哺乳動物細胞に導入 するために報告されている。New methods to improve efficiency, specificity, and/or size limitations of transfer methods The continuous development of Research and production development, enabling the production of polynucleotide clones and recombinant organisms has expanded its scope. In particular, calcium phosphate precipitation, electroporation , lipofection, ballistic transfer, DEAE-dextran transfection, microinjection and Virus-based transfer methods introduce foreign DNA fragments into mammalian cells It has been reported to.

また、大きな（５０〜１０００キロベースを越える）クローン化された異種遺伝 子の挿入物（米国特許第４８８９８０６号明細書）を増殖させることができる酵 母人口染色体（“ＹＡＣ”）クローニングベクターも開発された。ＹＡＣクロー ンライブラリーは、哺乳類動物のゲノムＤＮＡの大きなフラグメントを、同定し 、マツピングし、そして増殖するために用いられてきた。ＹＡＣクローニングは 、無傷の遺伝子、特に数十キロベース以上にわたるエキソンを有する大きな遺伝 子、及びエキソン配列から数十キロベース以上上流或いは下流に配置された遠位 調節因子を有する遺伝子を単離するのに特に有用である。ＹＡＣクローニングは 、大きな複合遺伝子座例えば再配置されていない免疫グロブリン遺伝子座、及び ほぼ正しい染色体領域に厳密でなくマツピングされた遺伝子（例えば、ハンチン トン舞踏病遺伝子）を単離するのに特に有利である。ＹＡＣは、相同な標的ベク ターにおいて組換相同領域として有用な大きな近接した配列のクローニングを可 能にするので、ＹＡＣクローニングはまた、哺乳動物細胞中で標的とされた相同 組換を起こすためのベクターを作成するのに適している。更にＹＡＣは、酵母宿 主細胞中で標的とされた相同組換を行うための系を与えて、ＹＡＣ構築物中に新 しい大きなトランスジーン（例えば、大きなミニジーン、直列の遺伝子配列等） を創造でき、該ＹＡＣ構築物は次いで哺乳動物宿主細胞中に移入されることがで きる。Also, large (>50-1000 kilobases) cloned heterologous genes An enzyme capable of propagating the offspring insert (U.S. Pat. No. 4,889,806) Mother population chromosome ("YAC") cloning vectors have also been developed. YAC claw The library identifies large fragments of mammalian genomic DNA. It has been used to map, map, and propagate. YAC cloning is , intact genes, especially large genes with exons spanning tens of kilobases or more progeny, and distal genes located tens of kilobases upstream or downstream from the exon sequence. It is particularly useful for isolating genes with regulatory elements. YAC cloning is , large complex loci such as unrearranged immunoglobulin loci, and Genes that map less precisely to approximately the correct chromosomal region (e.g. huntingtin) It is particularly advantageous for isolating the chorea gene). YAC is a homologous target vector. allows the cloning of large contiguous sequences useful as recombinant homologous regions in YAC cloning also enables targeted homologs in mammalian cells. Suitable for creating vectors for recombination. Furthermore, YAC is a yeast inn. Provides a system for targeted homologous recombination in the principal cell to generate new new large transgenes (e.g. large minigenes, tandem gene sequences, etc.) The YAC construct can then be transferred into a mammalian host cell. Wear.

不運にも、大きなポリヌクレオチドの操作は問題が多い。Unfortunately, manipulation of large polynucleotides is problematic.

大きなポリヌクレオチドは、剪断力によって破壊を受けやすく、そして比較的薄 い濃度ですら高粘度溶液を形成しやすい。そのことはインヒドロの操作を非常に 困難にしている。これらの理由及びその他のために、大きなトランスジーン構築 物或いは相同組換え構築物を構築する方法において、操作されるＹＡＣクローン 及び他の大きなりＮＡフラグメントの量を減少させることが望まれている。Large polynucleotides are susceptible to destruction by shear forces and are relatively thin. Even at low concentrations, high viscosity solutions tend to form. That makes the operation of inhydro very making it difficult. For these reasons and others, large transgene constructs YAC clones to be manipulated in methods of constructing products or homologous recombination constructs It is desirable to reduce the amount of large NA fragments and other large NA fragments.

更なる問題は、大きな無傷のポリヌクレオチドの哺乳動物細胞中への移入は、一 般的に非能率的であるか又は移入されるポリヌクレオチドの大きさが制限される という事実である。例えば、５ｃｈｅｄｌら、１９９２年、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａ ｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、第２０巻、第３０７３頁は、マウス胚の前核インジェクシ ヨンによる３５キロベースのＹＡＣクローンのマウスゲノムへの移入を開示して いる。しかしながら、インジェクションマイクロピペット中に生じる剪断力は、 無傷の状態での、著しく大きなＹＡＣの効率的な移入をほぼ確実に不可能にする 。A further problem is that the transfer of large intact polynucleotides into mammalian cells is difficult. Generally inefficient or limited in size of polynucleotides transferred This is a fact. For example, 5chedl et al., 1992, Nucleic A c1ds Res, vol. 20, p. 3073 describes pronuclear injection in mouse embryos. disclosed the introduction of a 35 kilobase YAC clone into the mouse genome by John There is. However, the shear forces generated during the injection micropipette are almost certainly precludes efficient transfer of significantly larger YACs in an intact state .

現在のマイクロインジェクション法では、多くの大きな遺伝子は、哺乳動物細胞 中へ効率よ（移入されることができないようである。With current microinjection methods, many large genes can be injected into mammalian cells. Efficiency (seems to be unable to be imported).

スフェロプラスト融合が、ＹＡＣＤＮＡを線維芽細胞、胚芽腫細胞、及びＣＨＯ 細胞中への導入に用いられている（　Ｐａｃｈｎｉｅら、１９９０年、Ｐｒｏｃ 、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（Ｕ、Ｓ、Ａ、）。Spheroplast fusion transfers YAC DNA to fibroblasts, embryonoma cells, and CHO used for introduction into cells (Pachnie et al., 1990, Proc. , Natl, Acad, Sci, (U, S, A,).

第８７巻、第５４０９頁、Ｐａｙａｎ　ら、１９９０年、１ｌｏ１．　Ｃｅ１１ ．　Ｂｉｏｌ。Vol. 87, p. 5409, Payan et al., 1990, 1lo1. Ce11 ．． Biol.

第１０巻、第４１６３頁、Ｃｈｉｒｋｅ　ら、１９９１年、ＥＭＢＯＪ、、第１ ０巻、第１６２９頁、Ｄａｖｉｅｓら、１９９２年、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ ｓ　Ｒｅｓ、、第２０巻、第２６９３頁）。別の、トランスフェクション法例え ばリン酸カルシウム沈降法及びリポフエクション法が、哺乳動物細胞中へＹＡＣ ＤＮＡを移入するために用いられている（　Ｅｔｉｃｃｉｒｉら、１９９１年、 Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。Volume 10, page 4163, Chirke et al., 1991, EMBOJ,, No. 1 Volume 0, page 1629, Davies et al., 1992, Nucleic Ac1d Res, Vol. 20, p. 2693). Another example of transfection method Calcium valate precipitation and lipofection methods are used to release YAC into mammalian cells. used to transfer DNA (Eticciri et al., 1991; Proc, Natl, Acad, Sci.

このように、本技術分野においては、最小の操作及びクローニング手順で、トラ ンスジェニック動物を作るために、大きなりＮＡ上セグメントえば大きなＹＡＣ クローンを哺乳動物細胞例えば胚幹細胞中に移入する効率的な方法が必要とされ ている。特に、もし、大きなりローン化された哺乳動物ゲノムフラグメントがＹ ＡＣライブラリーから単離でき（ＹＡＣ酵母配列に連結されているか又はＹＡＣ 酵母配列から精製されている）、そして、それを無傷で、第２のポリヌクレオチ ド配列（例えば、選択マーカー例えばｎｅｏ発現カセット）とともに、追加のク ローニング或いは操作（例えば、配列を互いに連結）なしに嘩乳動物宿主細胞（ 例えば、ＥＳ細胞）中へ移入できれば、それは非常に有利である。このような方 法は、トランスジェニック細胞、トランスジェニック動物及び相同的に標的とさ れる細胞及び動物を効率よく構築することを可能にする。これらのトランスジェ ニック／相同的に標的とされる細胞及び動物は、例えばヒト遺伝病特にハンチン トン舞踏病及びアルツハイマー病等の有用なモデルを提供することができる。Thus, in this technical field, it is possible to create a To create susgenic animals, a large YAC can be segmented on a large NA. Efficient methods of transferring clones into mammalian cells, such as embryonic stem cells, are needed. ing. In particular, if a large loaned mammalian genome fragment is can be isolated from an AC library (linked to YAC yeast sequences or purified from the yeast sequence) and then, leaving it intact, a second polynucleotide. along with a code sequence (e.g. a selectable marker e.g. neo expression cassette) mammalian host cells (e.g., ligating sequences together) without rowing or manipulation (e.g., ligating sequences together). For example, it would be very advantageous if it could be transferred into ES cells). People like this The method uses transgenic cells, transgenic animals and homologously targeted This makes it possible to efficiently construct cells and animals that can be used. These transgenic Nick/homologously targeted cells and animals can be used, for example, for human genetic diseases, especially huntingtin. It can provide a useful model for diseases such as chorea and Alzheimer's disease.

アルツハイマー病 現在、アルツハイマー病（ＡＤ）の様々な形態のための治療法は知られていない 。しかしながら、有効な処置が可能な、アルツハイマー病に関連する痴呆に酷似 している進行性の知能低下を引き起こすいくつかの病状がある。Alzheimer's disease Currently, there are no known treatments for the various forms of Alzheimer's disease (AD) . However, dementia that closely resembles Alzheimer's disease can be effectively treated. There are several medical conditions that cause progressive intellectual decline.

アルツハイマー病は、一般に老人性痴呆として知られている進行性の病気である 。大雑把に言えば、その病気は２つのカテゴリー、すなわち晩期の発病と、早期 の発病に分けることができる。晩期発病（すなわち、老齢（６５才以上）で発病 ）は、通常よりも早い速度でそしてより厳しい程度で起こる脳の自然の委縮によ って引き起こされる。早期発病アルツハイマー病は、はるかにまれであるが、老 年期前（すなわち、３５〜６０才の間）によく発生する脳の委縮を伴った病理学 的にまったく同じ痴呆を示す。このタイプのアルツハイマー病の一つの形態は、 遺伝しそしてそれ故、家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）として知られていると いうことが証明されている。Alzheimer's disease is a progressive disease commonly known as senile dementia . Broadly speaking, the disease can be divided into two categories: late onset and early onset. It can be divided into the onset of the disease. Late onset (i.e., onset of the disease in old age (65 years and older)) ) is due to natural atrophy of the brain that occurs at a faster rate and to a more severe degree than normal. It's triggered. Early-onset Alzheimer's disease is much rarer, but Pathology with brain atrophy that often occurs before age (i.e., between 35 and 60 years of age) They show exactly the same dementia. One form of this type of Alzheimer's disease is is inherited and is therefore known as familial Alzheimer's disease (FAD). That has been proven.

アルツハイマー病のどちらのタイプにおいても病状は同じであるが、その異常は より若い年齢で発病した場合に、より厳しくそしてより広範囲に及ぶ傾向がある 。その病気は、脳における４つのタイプの病変により特徴付けられる。The pathology of both types of Alzheimer's disease is the same, but the abnormalities are tends to be more severe and more widespread when the disease begins at a younger age . The disease is characterized by four types of lesions in the brain.

これらは、ニューロン周辺のアミロイド斑（老人斑）、大脳血管周辺のアミロイ ド沈積物、ニューロン内側の神経細線維のもつれ及びニューロン細胞の死である 。老人斑は、中心に細胞外アミロイド沈積物がある、直径が１５０μｍにも及ぶ 組織が破壊され神経網の領域である。脳血管性アミロイド沈積物は、大脳血管を とり囲むアミロイド物質である。神経細線維のもつれは、２つ１組になって互い に巻きついている２つのフィラメントから成るアミロイドタンパク質の細胞内沈 積物である。These include amyloid plaques around neurons (senile plaques) and amyloid plaques around cerebral blood vessels. Deposits, tangles of neurofibrils inside neurons and death of neuron cells. . Senile plaques have extracellular amyloid deposits in their centers and are up to 150 μm in diameter. The tissue is destroyed in the area of the neuropil. Cerebrovascular amyloid deposits affect cerebral blood vessels. It is surrounded by amyloid material. Nerve fiber tangles form pairs and connect with each other. intracellular precipitation of amyloid protein, which consists of two filaments wrapped around It is a product.

主要なタンパク質サブユニットであるアミロイドβタンパク質は、神経細線維の もつれ及び老人斑の両者のアミロイドフィラメント中に見られ、そして約４．０ ００の相対分子質量の高度に凝集する小さなポリペプチドである。このタンパク 質は、アミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）と呼ばれるはるかに大きな前駆タン パク質の切断生成物である。Amyloid-β protein, a major protein subunit, is a major protein subunit of neurofibrils. Found in amyloid filaments of both tangles and senile plaques, and approximately 4.0 It is a highly aggregated small polypeptide with a relative molecular mass of 0.00. this protein protein is a much larger precursor protein called amyloid precursor protein (APP). It is a protein cleavage product.

ＡＰＰ遺伝子は、ヒト染色体２１番上に配置されていると知られている。家族性 アルツハイマー病を隔離する遺伝子座は、ＡＰＰ遺伝子の近傍の染色体２１番に マツピングされる（　Ｓｔ、　Ｇｅｏｒｇｅ　ＨｙｓＩｏｐ　ら、１９８７年、 ５ｃｉｅｎｃｅ　１第２３５巻、第８８５頁）。ＡＰＰ遺伝子とＡＤ遺伝子座の 間での組み換え体は、既に報告されている（　５ｃｈｅｌ　ｌｅｎｂｅｒｇら、 １９８８年、５ｃｉｅｎｃｅ　、第２４１巻、第１５０７頁、Ｓｃｈｅｌｌｅｎ ｂｅｒｇら、１９９１年、４ｍ、Ｊ、Ｂｕｎ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、、第４８巻、 第５６３頁、５ｃｈｅｌ　Ｉｅｎｂｅｒｇら、１９９１年、Ａｍ、Ｊ、Ｈｕｍ、 Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、第４９巻、第５１１頁、これらは引用することにより本明細 書の一部である）。ＡＤの病因に含まれる根底にある生化学的現象を更に明らか にするために用いることができる、アルツハイマー病の実験モデルの開発が非常 に望まれている。このようなモデルは、アルツハイマー病における退化過程を変 える薬剤をスクリーニングするために、ある用途において、恐らく用いることが できる。例えば、アルツハイマー病のモデル系は、ＡＤの病因を引き起こす又は 促進する環境要因をスクリーニングするために用いることができる。対照的に、 ＡＤの進行を阻害し、防ぎ、又は逆行させる薬剤のスクリーニングのために実験 モデルを用いることもできる。The APP gene is known to be located on human chromosome 21. familial The genetic locus that isolates Alzheimer's disease is located on chromosome 21 near the APP gene. mapped (St, George HysIop et al., 1987, 5science, Vol. 235, p. 885). APP gene and AD locus Recombinants between the two types have already been reported (5chel, lenberg et al., 1988, 5science, Volume 241, Page 1507, Schellen berg et al., 1991, 4m, J. Bun, Genetics, vol. 48, p. 563, 5chel　Ienberg et al., 1991, Am, J., Hum. Genetics, Volume 49, Page 511, incorporated herein by reference. part of the book). Further elucidating the underlying biochemical phenomena involved in the pathogenesis of AD The development of experimental models of Alzheimer's disease that can be used to desired by. Such models may alter the degenerative process in Alzheimer's disease. In some applications, it could possibly be used to screen drugs that can. For example, model systems for Alzheimer's disease that cause AD pathogenesis or It can be used to screen for promoting environmental factors. in contrast, Experiments to screen for drugs that inhibit, prevent, or reverse the progression of AD Models can also be used.

恐らく、このようなモデアルは、ＡＤを防ぎ、その進行を止め、又は逆行させる のに有効な製薬の開発のために用いられることができる。Perhaps such modellings can prevent, halt or reverse the progression of AD. It can be used for the development of effective pharmaceuticals.

不運にも、ヒト及び老齢な非ヒト霊長類のみがＡＤの病理学的な特徴を示す。即 ち、霊長類を用いることは高価で困難であり、そしてＡＤの病状を表すまでに要 求される時間が長いので、このような動物を用いた広範囲の研究は禁止されてい る。層線類動物は、極度に高齢となってもＡＤを発現しない。β−アミロイドタ ンパク質（βＡＰ）又は細胞毒性のβＡＰフラグメントを、層線類動物の脳に注 入すると、細胞の損失を起こし神経細繊維のからみ成分に対する抗原性マーカー を誘引することが報告されている（Ｋｏｖａｌｌら、１９９１年、Ｐｒｏｃ、Ｎ ａｔｌ、＾ｃａｄ、、Ｓｃｉ、（Ｕ、Ｓ、Ａ　）、第８８巻、第７２４７頁）。Unfortunately, only humans and older non-human primates exhibit pathological features of AD. Immediately However, using primates is expensive and difficult, and it is difficult to demonstrate the pathology of AD. Due to the long time required, extensive research using these animals is prohibited. Ru. Stratiformes do not develop AD even at extreme old age. β-amyloid Protein (βAP) or cytotoxic βAP fragments are injected into the brains of stratozoan animals. enters the body, causing cell loss and the formation of antigenic markers for the tangled components of neurofibrils. (Kovall et al., 1991, Proc. N. atl,^cad,,Sci,(U,S,A), vol. 88, p. 7247).

染色体第１６番の部分的三染色体性の結果として、ＡＰＰ遺伝子の余分のコピー を有するマウスは、生まれる前に死ぬ（Ｃｏｙｌｅ　ら、１９８８年、Ｔｒｅｎ ｄｓ　１ｎＮｅｕｒｏｓｃｉ、第１１巻、第３９０頁）。ＡＰＰ遺伝子のクロー ニング以来、ＡＰＰ遺伝子の全て又は一部を含むトランスジーンを用いたＡＤの ためのマウスモデルを作成する試みが成されてきたが、不運にも、それらのマウ スは成育できなかったかＡＤ様の病状を示さなかったので、その研究の多くは発 表されずにいる。２つ発表された報告は、その報告された結果が不規則なので取 り下げられた（　Ｍａｒｘ　Ｊ％５ｃｉｅｎｃｅ、第２５５巻、第１２００頁） 。Extra copies of the APP gene as a result of partial trisomy of chromosome 16 (Coyle et al., 1988, Tren ds 1n Neurosci, Volume 11, Page 390). Cloning of APP gene Since the 2011 research, the use of transgenes containing all or part of the APP gene has been used to treat AD. Attempts have been made to create mouse models for Many of the studies have been focused on developing It remains unrepresented. The two published reports have been excluded because their reported results are irregular. Lowered (Marx J%5science, Volume 255, Page 1200) .

従って、本技術分野においては、無傷なヒ１−ＡＰＰ遺伝子、即ち野生型の対立 遺伝子、病気に付随した対立遺伝子或いはこれらの組み合わせのいずれか、又は ヒトＡＰＰ配列に対応する配列修飾を含む変異した層線動物（例えばマウス）対 立遺伝子を有するトランスジェニック非ヒト動物が必要とされている。このよう なトランスジェニック動物由来の細胞株及び細胞系統（例えば、アストログリア 細胞）はまた、ＡＤ療法を開発するための実験モデルとして、本技術分野におい て広い用途がある。Therefore, there is a need in the art to obtain an intact human 1-APP gene, i.e., the wild-type allele. either the gene, the allele associated with the disease, or a combination thereof, or Mutant stratozoan animals (e.g. mice) containing sequence modifications corresponding to the human APP sequence There is a need for transgenic non-human animals carrying the allele. like this cell lines and cell lines derived from transgenic animals (e.g., astroglial cells) are also used in the field as experimental models to develop AD therapies. It has a wide range of uses.

所定の抗原に結合するヒトモノクローナル抗体を作成することは、選択した抗原 で免疫されたかつ免疫源に対し十分な体液性免疫応答を示すヒトからの生存可能 なリンパ球の供給源を要求するので、困難である。特に、ヒトは一般的には、ヒ ト（自己）抗原の攻撃に応答する十分な抗体を作れない。不運にも多くのこのよ うなヒト抗原は、ヒトモノクローナル抗体を含む治療方法の目標物となる見込み がある。所定のヒト抗原に特異的に反応するヒト抗体を作成する一つのアプロー チは、再配列されていないヒト免疫グロブリントランスジーンを有し、そして内 在性免疫グロブリン遺伝子が機能的に破壊されているトランスジェニックマウス を製造することを含む（ＬｏｎｂｅｒｇとＫａｙ、　Ｔｏ　９２１０３９１８゜ ＫｕＣｈｅｒｌａｐａｔｉ　と　Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ、　Ｔｏ　９１／１０７ ４１）。しかしながら、大きなりＮＡ上セグメントえばヒト免疫グロブリンの軽 鎖又は重鎮の遺伝子座の相当な部分に及ぶＤＮＡセグメントを効率よく移入する ことは、潜在的な障害を与え及び／又はトランスジェニック動物の作成方法の効 率を減少させる。Creating human monoclonal antibodies that bind to a given antigen is viable human immunizations from humans who have been immunized with This is difficult because it requires a source of adequate lymphocytes. In particular, humans generally inability to produce enough antibodies to respond to attack by self-antigens. Unfortunately, many of these Eel human antigen holds promise for therapeutic approaches involving human monoclonal antibodies There is. One approach to creating human antibodies that specifically react with a given human antigen has an unrearranged human immunoglobulin transgene and an endogenous Transgenic mice in which the native immunoglobulin genes are functionally disrupted (Lonberg and Kay, To 92103918° KuCherlapati and Jakobovits, To 91/107 41). However, the large NA segment makes human immunoglobulins lighter. Efficiently transfer DNA segments spanning a significant portion of a strand or stalwart locus This may pose potential harm and/or compromise the effectiveness of the method of creating transgenic animals. Decrease rate.

前記のことより、１以上の大きな無傷のトランスジーン、特にヒトＡＰＰ遺伝子 又はヒト免疫グロブリントランスジーンを有する非ヒト細胞及び非ヒト動物が必 要であることが明らかである。従って、本発明の目的は、大きなトランスジーン 及び大きな相同組み換え構築物（通常はＹＡＣとしてクローン化されている）を 哺乳動物細胞特に胚幹細胞中に移入するための方法及び組成物を提供することで ある。From the foregoing, it is clear that one or more large intact transgenes, particularly the human APP gene. or non-human cells and non-human animals carrying human immunoglobulin transgenes are required. It is clear that this is important. Therefore, it is an object of the present invention to and large homologous recombination constructs (usually cloned as YACs). By providing methods and compositions for transferring mammalian cells, particularly embryonic stem cells. be.

本発明の目的はまた、１以上の本発明のＡＰＰ　トランスジーンを有するトラン スジェニック非ヒト細胞及びトランスジェニック非ヒト動物を提供することであ る。The object of the present invention is also to provide a transgene containing one or more APP transgenes of the present invention. transgenic non-human cells and transgenic non-human animals. Ru.

本明細書中で述べた文献は、本出願の出願日量前の開示のためにのろ提供される ものである。本明細書は、先の発明に基づいて、このような開示よりも日付が先 であるとする権利が発明者にはないということを認めるものであると解釈される ものではない。すべての引用文献は引用することにより、本明細書の一部である 。The documents mentioned herein are provided for disclosure prior to the filing date of the present application. It is something. This specification antedates such disclosure by virtue of prior invention. be interpreted as an admission that the inventor does not have the right to It's not a thing. All cited references are incorporated herein by reference. .

発明の概要 前記目的に従って、本発明の一つの観点において、大きなトランスジーン及び大 きな相同標的構築物（典型的には、ＹＡＣとして増殖され、そして好ましくは少 なくとも一つの完全な転写複合体にまで及ぶ）を哺乳動物細胞例えばＥＳ細胞中 へ移入する方法が提供される。一つの観点において、上記方法は、大きなトラン スジーン及び大きな相同標的構築物を、リボフエクンラン法例えばコリボフエク ションにより動物細胞中に移入することを提供し、そこでは、第２の連結されて いないポリヌクレオチドが大きなトランスーン及び／又は大きな相同標的構築物 とともに哺乳動物細胞中に移入される。好ましくは、第２のポリヌクレオチドは 、選択表現型（例えば、６４１８選択に対する耐性）を、該ポリヌクレオチド配 列を受け取りそして組み込んでいる細胞に与える。通常、大きなトランスジーン 又は相同標的構築物は、ポリヌクレオチド結合に酵母由来のＹＡＣ配列とともに 移入されうる。しかし、酵母由来のＹＡＣ配列は、制限酵素消化及び分離（例え ば、パルスゲル電気泳動）により取り除かれる。大きなトランスジーン及び／又 は相同標的構築物は、一般に、連結されていない第２のポリヌクレオチド（例え ば、選択表現型を与えるｎｅｏＲ発現カセット）と混合され、そして、カチオン 性脂質（例えば、ＤＯＧＳ。Summary of the invention In accordance with the above object, in one aspect of the invention, large transgenes and large a large homologous target construct (typically propagated as a YAC and preferably small at least one complete transcription complex) in mammalian cells, e.g. ES cells. A method is provided to populate the . In one aspect, the above method is suitable for large gene and large homologous target constructs using the Ribofuec-Cunlan method, e.g. tion into animal cells, in which a second linked Large transtones and/or large homologous target constructs with no polynucleotides and into mammalian cells. Preferably, the second polynucleotide is , a selection phenotype (e.g., resistance to 6418 selection) It feeds the cells that receive and incorporate the columns. Usually large transgenes or homologous targeting constructs with yeast-derived YAC sequences for polynucleotide binding. can be imported. However, yeast-derived YAC sequences can be extracted by restriction enzyme digestion and separation (e.g. for example, by pulsed gel electrophoresis). large transgenes and/or Homologous targeting constructs generally include an unlinked second polynucleotide (e.g. for example, a neoR expression cassette that confers a selected phenotype), and the cation sexual lipids (e.g. DOGS).

ＤＯＴＭＡ　、　ＤＯＴＡＰ　）に接触されて、カチオン性脂質−ＤＮＡ複合体 を形成する。複合体は、細胞中へのＤＮＡの取り込みに適した条件（例えば、培 養液、生理的リン酸塩緩衝食塩溶液、無血清ＥＳ培地）で、哺乳動物細胞（例え ば、ＥＳ細胞）と接触させられる。一般に大きなトランスジーン又は大きな相同 標的構築物を有する細胞は付随的に第２のポリヌクレオチドの少なくとも１つの コピーを有し、その結果、第２のポリヌクレオチドを有する細胞を選択すること は、一般的には、大きなトランスジーン又は大きな相同標的構築物の少なくとも １つのコピーを、内在性染色体遺伝子座の組み込まれたか又は相同的に組み換え られたセグメントとして有するかなりの可能性を有する。従って、第２のポリヌ クレオチド（例えば、ｎｅｏＲ発現カセット）の選択はまた、一般的に、リボフ ェクンヨンに先立つ大きなトランスジーン又は大きな相同標的構築物の第２のポ リヌクレオチドへの面倒なポリヌクレオチド結合（例えば、連結反応）をするこ となしに、大きなトランスジーン又は大きな相同標的構築物を有する細胞を選択 することとなる。本発明のコリボフエクション法に従って、選択マーカー遺伝子 の結合及びそれに続くクローニングを要求することなし、異種ＤＮＡの大きなセ グメントが、素早（そして効率良く哺乳動物細胞（例えばネズミＥＳ細胞）中に 移入される。DOTMA, DOTAP), the cationic lipid-DNA complex form. The complex is prepared under conditions suitable for uptake of the DNA into cells, e.g. nutrient solution, physiological phosphate-buffered saline solution, serum-free ES medium), and mammalian cells (e.g. (e.g., ES cells). Generally large transgenes or large homologs Cells having the targeting construct concomitantly contain at least one of the second polynucleotides. selecting cells that have a copy of the second polynucleotide; will generally include at least one of the large transgenes or large homologous targeting constructs. one copy at an integrated or homologously recombinant endochromosomal locus has considerable potential to have as a segment. Therefore, the second polynu The choice of cleotide (e.g., neoR expression cassette) is also generally A second portion of the large transgene or large homologous targeting construct that precedes the Do not perform cumbersome polynucleotide binding (e.g., ligation reactions) to polynucleotides. Select cells with large transgenes or large homologous targeting constructs without and I will do it. According to the colibofection method of the present invention, the selectable marker gene large sections of heterologous DNA without requiring conjugation and subsequent cloning. quickly and efficiently into mammalian cells (e.g. murine ES cells). Populated.

本発明はまた、組み込まれた又は相同的に組み換えられた、酵母由来のＹＡＣ配 列に連結された異種（好ましくは、非相同）哺乳動物ゲノムＤＮＡ配列の少なく とも１つのコピーを有する哺乳動物細胞、好ましくはＥＳ細胞を提供する。大き な異種（好ましくは非相同）＃乳動物ゲノムＤＮＡ配列は、好ましくは完全な構 造遺伝子、更に好ましくは完全な転写単位、及び一つの例としては完全なヒトＡ ＰＰ遺伝子を含む。典型的には、得られたトランスジェニック哺乳動物細胞はま た、連結されていない第２のポリヌクレオチド（例えば、選択マーカー）の少な くとも一つの組み込まれたコピーを含み、該第二のポリヌクレオチドは、非相同 的に、通常は少な（とも一つの染色体遺伝子座中に、時々は大きなトランスジー ン又は大きな相同標的構築物が組み込まれているところとは異なった染色体座（ −カ所又は複数箇所）中に組み込まれる。トランスフェクション工程の間及びそ の直後に、大きな外来ＤＮＡ配列、連結されていない選択マーカー遺伝子及び適 当なカチオン性脂質を有する新しい哺乳動物細胞例えばＥＳ細胞が形成される。The present invention also provides an integrated or homologously recombined YAC sequence derived from yeast. a number of heterologous (preferably non-homologous) mammalian genomic DNA sequences concatenated into sequences; Provided are mammalian cells, preferably ES cells, having one copy of both. big A heterologous (preferably non-homologous) #mammalian genomic DNA sequence is preferably a complete structural a synthetic gene, more preferably a complete transcription unit, and in one example a complete human A Contains the PP gene. Typically, the resulting transgenic mammalian cells are In addition, a small number of unlinked second polynucleotides (e.g., selection markers) may be used. comprising at least one integrated copy, the second polynucleotide comprising a heterologous Generally, there are usually only a few (sometimes large) transgenic genes in one chromosomal locus. or a chromosomal locus different from where the large homologous targeting construct is integrated ( - incorporated in one or more places). During and after the transfection process Immediately following the large foreign DNA sequence, the unlinked selection marker gene and the appropriate New mammalian cells, such as ES cells, are formed with the appropriate cationic lipids.

このような新しい哺乳動物細胞は、本発明の一つの観点である。Such new mammalian cells are one aspect of the present invention.

本発明はまた、組み込まれた又は相同的に組み換えられた、酵母由来のＹＡＣ配 列に連結された大きな異種（好ましくは、非相同）ｇｆＲ乳動物ゲノムＤＮＡ配 列の少なくとも１つのコピーを有するゲノムを含むトランスジェニック非ヒト動 物を提供する。大きな異種（好ましくは非相同）ｌ’ｉｉ乳動物ゲノムＤＮＡ配 列は、好ましくは完全な構造遺伝子、更に好ましくは完全な転写単位、及び一つ の例としては完全なヒトＡＰＰ遺伝子を含む。典型的には、得られたトランスジ ェニック非ヒト晴乳動物はまた、連結されていない第２のポリヌクレオチド（例 えば、選択マーカー）の少なくとも一つの組み込まれたコピーを有するゲノムを 含み、該第二のポリヌクレオチドは、非相同的に、通常は少なくとも一つの染色 体遺伝子座中に、時々は大きなトランスジーン又は大きな相同標的構築物が組み 込まれているところとは異なった染色体座（−カ所又は複数箇所）中に組み込ま れる。好ましくは、非ヒト動物の染色体遺伝子座（−カ所又は複数箇所）中に組 み込まれている大きなトランスジーン又は大きな相同標的構築物が発現され、更 に好ましくは、非ヒト動物種の自然存在する相同遺伝子と同様に発現される（例 えば、同様な組織特異的様式及び／又は発生様式で）。　本発明はまた、コリポ フエクションのための組成物、即ち、少なくとも一つの組み込まれている大きな 外来トランスジーンの少なくとも一つのコピーを有する及び／又は少なくとも一 つの相同的に標的とされる構築物をそのゲノム中に有するトランスジェニック非 ヒト動物を作るために、異種の、典型的には非相同の大きな（例えば５０ｋｂ以 上）ポリヌクレオチドを哺乳動物細胞例えばＥＳ細胞中に移入するためのトラン スジエネシス（ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ）組成物及び相同標的組成物を提供す る。トランスジエネシス組成物は、（１）少なくとも一つの大きなトランスジー ン種、（２）少くとも一つの連結されていない第二のポリヌクレオチド種（例え ば、選択マーカー遺伝子ｎｅｏＲを含む発現カセット）及び（３）少なくとも一 つの適当なカチオン性脂質種を含む。相同標的組成物は、（１）少なくとも一つ の大きな標的構築物種、（２）少なくとも一つの連結されていない第二のポリヌ クレオチド種（例えば、選択マーカー遺伝子ｎｅｏＲを含む発現カセット）及び （３）少なくとも一つの適当なカチオン性脂質種を含む。好ましくは、大きなト ランスジーン又は大きな相同標的構築物は、無傷な転写単位に及ぶ。コリポフエ クション組成物の一つの好ましい実施例は、（１）酵母由来のＹＡＣ配列に連結 されたヒトＡＰＰ遺伝子配列（又は、ヒトＡＰＰ配列に対応する非自然発生的に 生じた配列を有する修飾されたマウス又はラットＡＰＰ遺伝子）　、（２）選択 マーカーをエンコードする発現カセット及び（３）適なカチオン性脂質を含む。The present invention also provides an integrated or homologously recombined YAC sequence derived from yeast. large heterologous (preferably non-homologous) gfR mammalian genomic DNA sequences linked together A transgenic non-human animal comprising a genome having at least one copy of the sequence provide something. Large heterologous (preferably non-homologous) l’ii mammalian genomic DNA sequences The sequence preferably contains a complete structural gene, more preferably a complete transcription unit, and one Examples include the complete human APP gene. Typically, the resulting transducer The genetic non-human mammal also contains an unlinked second polynucleotide (e.g. e.g., a selectable marker). and the second polynucleotide is non-homologously stained, typically at least one stain. Sometimes large transgenes or large homologous targeting constructs are integrated into the somatic locus. It is integrated into a different chromosomal locus (- or multiple locations) than where it is integrated. It will be done. Preferably, it is integrated into a chromosomal locus (- or multiple locations) of a non-human animal. The integrated large transgene or large homologous targeting construct is expressed and updated. are preferably expressed similarly to naturally occurring homologous genes in non-human animal species (e.g. e.g., in a similar tissue-specific and/or developmental manner). The present invention also provides colipo composition for ffection, i.e. incorporating at least one large having at least one copy of a foreign transgene and/or at least one Transgenic non-transgenic genes with two homologously targeted constructs in their genome To create a human animal, a heterologous, typically non-homologous, large (e.g. >50 kb) Top) Transfection for transferring polynucleotides into mammalian cells, such as ES cells. transgenesis compositions and homologous targeting compositions. Ru. The transgenic composition comprises (1) at least one large transgenic composition; (2) at least one unlinked second polynucleotide species (e.g. (e.g., an expression cassette containing the selectable marker gene neoR) and (3) at least one Contains two suitable cationic lipid species. The homologous target composition comprises (1) at least one (2) at least one unlinked second polynucleotide; cleotide species (e.g. an expression cassette containing the selectable marker gene neoR) and (3) Contains at least one suitable cationic lipid species. Preferably a large tow A transgene or large homologous targeting construct spans an intact transcription unit. koripohue One preferred embodiment of the action composition includes: (1) linked to a yeast-derived YAC sequence; human APP gene sequence (or a non-naturally occurring sequence corresponding to the human APP sequence) Modified mouse or rat APP gene with the resulting sequence), (2) Selection an expression cassette encoding a marker and (3) a suitable cationic lipid.

コリポフエクション組成物の他の好ましい実施例は、（１）酵母由来のＹＡＣ配 列に連結されたヒト非再配列免疫グロブリン遺伝子配列（少なくとも二つのＶ遺 伝子の完全なセグメント、少なくとも一つの完全なりセグメント（もし、重鎮遺 伝子であれば）、少な（とも一つの完全なＪセグメント及び少なくとも一つの定 常領域遺伝子を含む重鎮及び軽鎖遺伝子配列）、（２）選択マーカーをエンコー ドする発現カセット及び（３）適当なカチオン性脂質を含む。Other preferred embodiments of the colipofection composition include (1) yeast-derived YAC components; human non-rearranged immunoglobulin gene sequences (at least two V A complete segment of the gene, at least one complete segment (if genes), few (both one complete J segment and at least one constant) heavy chain and light chain gene sequences, including constant region genes), (2) encoding selection markers; (3) an appropriate cationic lipid;

本発明の一つの観点において、連結されていないポリヌクレオチド配列の複数種 が、ネズミ胚幹細胞及び／又は他の哺乳動物細胞中にコリボフエクションされ、 そこでは、少なくとも一つの連結されていないポリヌクレオチド配列の種は、そ れを取り込んでいる細胞に選択表現型を与える選択マーカーを含む。得られた細 胞は、選択マーカーの存在により選択される。このように選択された細胞は、細 胞中に導入されたポリヌクレオチド配列の他の種の少なくとも一つの組み込まれ たコピーを含んでいる可能性が非常に高い。In one aspect of the invention, a plurality of unlinked polynucleotide sequences is colibofectioned into murine embryonic stem cells and/or other mammalian cells, wherein at least one species of unlinked polynucleotide sequence is Contains a selectable marker that confers a selected phenotype on cells that have taken up the cell. The obtained fine Cells are selected by the presence of a selectable marker. The cells selected in this way are the incorporation of at least one other species of polynucleotide sequence introduced into the cell; It is very likely that it contains a copy.

図面の簡単な説明 図に本発明のコリボフェクション複合体を形成するための代表的なカチオン性脂 質の化学構造。Brief description of the drawing The figure shows representative cationic lipids for forming the colibofection complex of the present invention. Chemical structure of quality.

図２．ヒトＡＰＰｈランスジーンでコリボフェクションされたＥＳクローンのＰ ＣＲ分析。陰をつけた円は、用いなかったウェルを示す。横列のプール（Ａ−Ｐ ）は、それぞれ１８クローン（Ａ−Ｅｌ）又は１６クローン（Ｉ−Ｐ）を含んで いた。Figure 2. P of the ES clone coliboffected with the human APPh transgene. CR analysis. Shaded circles indicate wells that were not used. Row pool (A-P ) contained 18 clones (A-El) or 16 clones (I-P), respectively. there was.

縦列の一ル（ＰＩ−ＰＩ８）は、それぞれ１６クローン（ＰＬ−ＰＩ２）又は８ クローン（ＰＩ３−ＰＩ８）を含んでいた。Each column (PI-PI8) has 16 clones (PL-PI2) or 8 clones (PI3-PI8).

図３　ヒトＡＰＰトランスジーンでコリボフエクションされたＥＳクローンのＰ ＣＲ分析。プールＰ３．Ｐ４．Ｐ９、ＰＬＯ，ｐＨ及びＰＩ２、及びプールＧ、 Ｈ，Ｋ。Figure 3 P of ES clone colibofectioned with human APP transgene CR analysis. Pool P3. P4. P9, PLO, pH and PI2, and pool G, H,K.

Ｍ、Ｎ、Ｏ及びＰは、プロモーター配列及びエキラン１フ配列を共に含んでいる クローンの候補であった。M, N, O, and P both contain the promoter sequence and the Ekilan 1 sequence. It was a candidate for cloning.

図４＝ヒトＡＰＰトランスジーンでコリボフエクションされたＥＳクローンのＰ ＣＲ分析。Figure 4 = P of ES clone colibofected with human APP transgene CR analysis.

図５：ヒヒトｌｕ配列プローブを用いたＹＡＣクローンＤＮＡのサザンプロット 分析。Figure 5: Southern plot of YAC clone DNA using human lu sequence probe. analysis.

図６：ヒトＡＰＰ　ＹＡＣの部分的制限消化マツピング。Figure 6: Partial restriction digestion mapping of human APP YAC.

図７・組み込まれたヒトＡＰＰ　トランスジーンから発現されたＲＮＡ転写物の ＰＣＲ分析。Figure 7: RNA transcripts expressed from the integrated human APP transgene PCR analysis.

図８＝ヒトＡＰＰ）ランスジーンからのＡＰＰ　ＲＮＡ転写物を検出するための 定量的ＲＮａｓｅ防護検定。Figure 8 = Human APP) for detecting APP RNA transcripts from transgenes Quantitative RNase protection assay.

定義 特に断りのない限り、本明細書中で用いた全ての技術及び科学用語は、本発明が 属する技術分野の当業者によって通常理解されているのと同じ意味である。本明 細書中に記した方法及び物質と類似か又は等しいものが、本発明の実施及び試験 において用いることができるが、好ましい方法及び物質を記す。本発明の目的に そって、用語を以下のように定義する。definition Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used herein refer to the present invention. It has the same meaning as commonly understood by a person skilled in the art to which it pertains. Honmei Methods and materials similar or equivalent to those described in the specification may be used in the practice or testing of the present invention. Preferred methods and materials are described below. For the purpose of this invention Therefore, the terms are defined as follows.

”一致する”又は“対応する”という用語は、本明細書中で、ポリヌクレオチド 配列が、参照するポリヌクレオチド配列の全て或いは一部に対して相同である（ 即ち、厳密に進化的には関係していないが同一である）、又はポリヌクレオチド 配列が参照するポリヌクレオチド配列と同一であることを意味するものとして用 いられる。対照的に、”相補的”という用語は、本明細書中で、相補的配列が、 参照するポリヌクレオチド配列の全て或いは一部に対して相同であるということ を意味するものとして用いられる。例えば、ヌクレオチド配列”　ＴＡＴＡＣ” は、参照配列”ＴＡＴＡＣ”と一致し、そして参照配列”ＧＴＡＴＡ”と相補的 である。The term "matching" or "corresponding" as used herein refers to polynucleotides. the sequence is homologous to all or part of the referenced polynucleotide sequence ( i.e., identical but not strictly evolutionarily related), or polynucleotides Used to mean that a sequence is identical to a reference polynucleotide sequence. I can stay. In contrast, the term "complementary" is used herein to mean that complementary sequences are Homologous to all or part of the referenced polynucleotide sequence It is used to mean. For example, the nucleotide sequence "TATAC" matches the reference sequence “TATAC” and is complementary to the reference sequence “GTATA” It is.

本明細書中で用いた”実質的に一致”、”実質的に相同”又は”実質的に同一” とは、核酸配列が参照配列と比べて少な（とも７０％の配列同一性、典型的には 少なくとも８５％の配列同一性、そして好ましくは核酸配列が参照配列と比べて 少なくとも９５％の配列同一性を有するところの核酸配列の特徴を示す。配列同 一性の％は、全部合わせても参照配列の２５％未満の、小さな欠失又は付加を除 外して計算する。参照配列は、大きな配列のサブセット、例えば遺伝子或いはフ ランキング配列の一部又は染色体の反復部分でありうる。しかしながら、参照配 列は、少なくとも１８ヌクレオチド長、典型的には少な（とも３０ヌクレオチド 長、そして好ましくは少なくとも５０〜１００ヌクレオチド長である。本明細書 中で用いる”実質的に相補的”とは、参照配列に実質的に一致する配列に相補的 である配列を意味する。As used herein, "substantially matching", "substantially homologous" or "substantially identical" means that a nucleic acid sequence has less sequence identity than a reference sequence (both 70% sequence identity, typically at least 85% sequence identity, and preferably the nucleic acid sequence is compared to the reference sequence. Nucleic acid sequences are characterized as having at least 95% sequence identity. Same sequence Percent identity excludes small deletions or additions that together account for less than 25% of the reference sequence. Remove and calculate. A reference sequence is a subset of a larger sequence, e.g. a gene or gene. It can be part of a ranking sequence or a repetitive part of a chromosome. However, the reference The strings are at least 18 nucleotides long, and typically less than 30 nucleotides long. and preferably at least 50-100 nucleotides in length. Specification "Substantially complementary" as used herein refers to a sequence that is complementary to a sequence that substantially matches a reference sequence. means an array that is .

特異的ハイブリダイゼーションとは、本明細書中では、標的トランスジーン配列 （例えば、置換、欠失及び／又は付加を含みうる本発明のポリヌクレオチド）と 特定の標的ＤＮＡ配列（例えば、ヒトＡＰＰ遺伝子配列又はヒト免疫グロブリン 遺伝子配列）との間のハイブリッドの形成と定義され、そこでは、標識された標 的トランスジーン配列は、標的と優先的に対合して、例えば遺伝子の制限フラグ メントに一致する単一バンドが、プローブである該標識標的トランスジーン配列 を用いて、細胞より調製されたＤＮＡのサザンプロットで同定されうる。最適の ハイブリダイゼーション条件は、標的トランスジーン及び内在性標的の配列組成 及び長さ、及び実験者によって選択された実験方法に依存して変化する。種々の ガイドラインが、適当なハイブリダイゼーション条件を選択するために用いられ つる（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、１９８９年、第２版、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉ ｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎ、Ｙ、、及びＢｅｒｇｅｒとＫｉｍｍｅｌ、　Ｍｅｔ ｈｏｄ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１５２巻、Ｇｕｉｄｅ　ｔ。Specific hybridization, as used herein, refers to target transgene sequences. (e.g. a polynucleotide of the invention which may contain substitutions, deletions and/or additions) and A specific target DNA sequence (e.g., human APP gene sequence or human immunoglobulin sequence) defined as the formation of a hybrid between a labeled target (gene sequence), in which a labeled target The targeted transgene sequences preferentially pair with the target, e.g. A single band matching the target transgene sequence is the probe. can be identified by Southern blotting of DNA prepared from cells. optimal Hybridization conditions are based on the sequence composition of the target transgene and endogenous target. and varies depending on the length and experimental method chosen by the experimenter. various Guidelines are used to select appropriate hybridization conditions. Vine (Maniatis et al., Molecular Cloning: A L laboratory Manual, 1989, 2nd edition, Cold Spri ng Harbor, N.Y., and Berger and Kimmel, Met. hod in Enzymology, Volume 152, Guide t.

Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｒａｎｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　、　１９８７年 、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｉｎｃ、　、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　ＣＡ を参照、これらは引用することにより本明細書の一部でる）。Mo1ecular Craning Techniques, 1987 , Academic Press, Inc., San Diego, CA , which are incorporated herein by reference).

目的物に対して用いる、明細書中で用いる”自然存在する”とは、目的物が自然 に見いだされうるという事実を意味する。例えば、自然の供給源から単離されう る及び実験室でヒトによって意図的に修飾されていない生物（ウィルスを含む） 中に存在するポリペプチド又はポリヌクレオチド配列は、自然存在する、である 。本明細書中においては、古典的な遺伝学に従って選択的に生育されうる層線動 物の実験室系統は、自然存在する動物とみなされる。"Naturally occurring" as used in the specification with respect to the target object means that the target object is naturally occurring. It means the fact that it can be found in For example, isolated from natural sources. living organisms (including viruses) that have not been intentionally modified by humans in the laboratory. The polypeptide or polynucleotide sequence present in is naturally occurring. . In this specification, we describe the layered lineage that can be selectively grown according to classical genetics. Laboratory strains of objects are considered naturally occurring animals.

本明細書中で用いる”同族”とは、種間で進化的及び機能的に関係している遺伝 子配列を意味する。例えば、これには限定されないが、ヒトゲノムにおいてはヒ ト免疫グロブリン重鎮遺伝子座はマウス免疫グロブリン重鎮遺伝子座に対して同 族遺伝子である。なぜならこれら二つの遺伝子の配列及び構造は、それらが非常 に相同であり、かつ両方の遺伝子が共に特異的に抗原に結合するために機能する タンパク質をエンコードする遺伝子であるということを示しているからである。As used herein, "cognate" refers to genes that are evolutionarily and functionally related between species. means child array. For example, but not limited to, in the human genome, The mouse immunoglobulin heavy loci are identical to the mouse immunoglobulin heavy loci. It is a family gene. Because the sequences and structures of these two genes make them very homologous to and both genes function together to specifically bind antigens This is because it indicates that the gene encodes a protein.

本明細書中で用いる”異種の”は、宿種哺乳動物宿主細胞又は非ヒト動物との関 係で定義され、アミノ酸配列又はポリヌクレオチド配列が、それぞれ宿種哺乳動 物宿主細胞又は非ヒト動物の自然存在するゲノムによってエンコードされない又 はゲノム中に存在しないことを意味する。異種ＤＮＡ配列は外来ＤＮＡ配列であ る。即ち、例えばヒトＡＰＰ遺伝子又は免疫グロブリン遺伝子は、ネズミＥＳ細 胞にとっては異種であり、また、例えばヒトすい嚢胞性繊維症関連ＣＦＴＲ対立 遺伝子は、野生型（正常）ＣＦＴＲ対立遺伝子のホモ接合体であるヒト細胞系統 にとっては異種である。従って、（例えば、特定部位の突然変異誘発により）変 異を受けているクローン化されたネズミ核酸配列は、もし変異した配列がネズミ ゲノム中で自然に発生したものでなければ、該配列がそれから由来したところの ネズミゲノムにとっては異種である。As used herein, "heterologous" refers to a host cell in a host mammalian host cell or a non-human animal. the amino acid sequence or polynucleotide sequence, respectively, is defined in the host species mammal. or which is not encoded by the naturally occurring genome of the host cell or non-human animal. means it is not present in the genome. A heterologous DNA sequence is a foreign DNA sequence. Ru. That is, for example, the human APP gene or immunoglobulin gene can be expressed in murine ES cells. For example, human cystic fibrosis-associated CFTR alleles The gene is derived from a human cell line that is homozygous for the wild-type (normal) CFTR allele. It is a different species. Therefore, changes (e.g., by site-directed mutagenesis) A cloned murine nucleic acid sequence that has undergone a mutation is If it does not occur naturally in the genome, then the sequence is derived from It is foreign to the murine genome.

本明細書中で用いる”非相同遺伝子”又は”非相同ポリヌクレオチド配列”は、 そのような遺伝子生成物を作るトランスジェニック非ヒト生物との関係で定義さ れる。非相同ポリペプチド（これはまた、異種ポリペプチドとしても表される） は、該トランスジェニック非ヒト動物ではない生物中に見られる同族遺伝子のそ れと一致するアミノ酸配列又はエンコードするＤＮＡ配列を有するポリヌクレオ チドとして定義される。従って、ヒトＡＰＰ遺伝子を有するトランスジェニック マウスは、非相同ＡＰＰ遺伝子を有すると記述されうる。ヒト免疫グロブリン遺 伝子を有するトランスジェニックマウスは、非相同免疫グロブリン遺伝子を有す ると記述されつる。非相同タンパク質配列をエンコードする種々の遺伝子セグメ ントを含むトランスジーンは、例えば、ハイブリダイゼーション又はＤＮＡ配列 決定により、トランスジェニック動物以外の生物種由来として、容易に同定され つる。例えば、ヒトＡＰＰアミノ酸配列の発現は、ヒトＡＰ遺伝子セグメントに よってエンコードされたヒトＡＰＰエピトープに特異的な抗体を用いて、本発明 のトランスジェニック非ヒト動物中で容易に検出されつる。As used herein, "heterologous gene" or "heterologous polynucleotide sequence" means defined in relation to transgenic non-human organisms that produce such gene products. It will be done. Heterologous polypeptide (also referred to as heterologous polypeptide) is that of the cognate gene found in the transgenic non-human animal. A polynucleotide having an amino acid sequence or a DNA sequence encoding Defined as Chido. Therefore, transgenic cells carrying the human APP gene Mice can be described as having heterologous APP genes. Human immunoglobulin remains Transgenic mice carrying the gene have heterologous immunoglobulin genes. It is described as vine. Different gene segments encoding heterologous protein sequences Transgenes containing nucleotides can be prepared, for example, by hybridization or by DNA sequence analysis. determined to be easily identified as originating from a species other than the transgenic animal. Vine. For example, expression of the human APP amino acid sequence can be expressed in the human AP gene segment. Thus, using antibodies specific for human APP epitopes encoded by the present invention, Vine is easily detected in transgenic non-human animals.

同族非相同遺伝子は、他の種からの一致する遺伝子として表される。従って、も しネズミＡＰＰが参照されれば、ヒトＡＰＰは同族非相同遺伝子である（他の種 からのＡＰ遺伝子に加えて、ブタ、ヒツジ又はラットのＡＰＰも同様である）。Homologous heterologous genes are expressed as matching genes from other species. Therefore, also If mouse APP is referred to, human APP is a homologous heterologous gene (other species (as well as APP from pigs, sheep or rats).

本明細書中で用いる”標的構築物”なる用語は、（１）宿主細胞内在性遺伝子座 中に存在する配列に対して実質的に同−又は実質的に相補的である配列を有する 少なくとも一つの相同領域、及び（２）標的構築物相同領域及び該内在性遺伝子 座配列の間での相同組み換えによって、宿主細胞内在性遺伝子座中に組み込まれ ることになる標的領域、を含むポリヌクレオチドを表す。もし標的構築物が”ヒ ツトアンド　ラン”又は”イン　アンド　アウト”タイプ構築らは引用すること により本細書の一部である）であれば、標的領域は内在性遺伝子座中にほんの一 時的に取り込まれ、そして選択により宿主ゲノムから除去される。標的領域は、 内在性遺伝子配列に対して実質的に相同である配列を含みことができ、及び／又 は非相同配列例えば選択マーカー（例えば、ｎｅｏ　Ｓｔｋ、　ｇｐｔ　）を含 むことができる。”標的構築物”なる用語は、必ずしも、ポリヌクレオチドが宿 主ゲノム中に組み込まれることになる遺伝子を含むことを表すとは限らず、また ポリヌクレオチドが完全な構造遺伝子配列を含むことを表すとも限らない。本技 術分野で用いている”標的構築物”なる用語は、本明細書で用いている”標的ト ランスジーン”なる用語と同義である。As used herein, the term "targeting construct" refers to (1) a host cell endogenous locus; has a sequence that is substantially the same as or substantially complementary to a sequence present in at least one homologous region; and (2) a target construct homologous region and the endogenous gene. It is integrated into host cell endogenous loci by homologous recombination between locus sequences. represents a polynucleotide comprising a target region. If the target construct ``Tut-and-run'' or ``in-and-out'' type constructions should be cited. (hereinafter referred to as part of this document), the target region is only one part of the endogenous locus. It is temporally incorporated and removed from the host genome by selection. The target area is can include sequences that are substantially homologous to endogenous gene sequences; and/or contains non-homologous sequences such as selectable markers (e.g. neo Stk, gpt). You can The term "targeting construct" does not necessarily mean that the polynucleotide is It does not necessarily represent that it contains genes that will be integrated into the main genome, and It does not necessarily represent that a polynucleotide contains a complete structural gene sequence. Main technique The term "targeted construct" as used in the surgical field refers to "targeted construct" as used herein. It is synonymous with the term "Lance Gene".

本明細書中で用いる”相同領域”及び”相同クランプ”は、その遺伝子に隣接す る配列を含みうる所定の内在性遺伝子配列に、実質的に一致するか又は実質的に 相補的である配列を有する標的構築物のセグメント（即ち、一部）である。相同 領域は、一般に、少なくとも約１００ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも約 ２５０〜５００ヌクレオチド長、典型的には少なくとも約１０００ヌクレオチド 長或いはれ以上である。相同組み換えを仲介する相同クランプのための理論的な 最小の長さは示されていないが、相同組み換えの効率は、一般に相同クランプの 長さに伴って増加すると信じられている。同様に、相同組み換え効率は、標的構 築物相同領域及び内在性標的配列間の配列相同の程度に伴い増加し、相同クラン プが内在性標的配列と同質であるときに最適組み換え効率となる。”相同クラン プ”及び”相同領域”なる用語とは、本明細書中で互換的に用いられ、そして本 技術分野における似ている言葉の一貫性のない使用を考慮して、明快にすべく代 替的は用語法が提案される。相同クランプは、必ずしも内在性配列と塩基が対合 した７％イブリッド構造の形成を意味するとは限らない。トランスジーン相同領 域に実質的に一致するか又は実質的に相補的である内在性遺伝子配列は、本明細 書中では、”交差標的配列”又は”内在性標的配列”と表される。As used herein, "homologous region" and "homologous clamp" refer to regions adjacent to the gene. substantially match or substantially match a predetermined endogenous gene sequence, which may include sequences that A segment (ie, a portion) of a target construct that has complementary sequences. same The region is generally at least about 100 nucleotides in length, preferably at least about 250-500 nucleotides in length, typically at least about 1000 nucleotides It is longer or wider. Theoretical for homologous clamps to mediate homologous recombination Although no minimum length has been given, the efficiency of homologous recombination generally depends on the length of the homologous clamp. It is believed that it increases with length. Similarly, homologous recombination efficiency The number of homologous clusters increases with the degree of sequence homology between the constructed homologous region and the endogenous target sequence. Optimal recombination efficiency occurs when the sequence is homologous to the endogenous target sequence. “Homologous clan The terms "group" and "homologous region" are used interchangeably herein and Given the inconsistent use of similar terms in the technical field, some substitutions have been made for clarity. Alternative nomenclature is proposed. Homologous clamps do not necessarily match bases with endogenous sequences. This does not necessarily mean the formation of a 7% hybrid structure. transgene homologous region Endogenous gene sequences that substantially match or are substantially complementary to the Referred to in the text as a "crossover target sequence" or "endogenous target sequence."

本明細書中で用いる、”　ミニジーン”又は”　ミニ遺伝子座”なる用語は、遺 伝子の１以上の必須でない遺伝子のセグメントが自然存在する遺伝子との関係で 欠失されているところの非相同遺伝子構築物を意味する。典型的には、欠失され たセグメントは、少なくとも約１００塩基対から数キロベースのイントロン配列 であり、数十キロベース以上にまで及びうる。大きな（即ち、約５０キロベース 以上）の標的構築物の単離及び操作は、しばしば困難であり、標的構築物の宿主 細胞中への移入の効率を減少しうる。従って、しばしば、遺伝子の１以上の必須 でない部分を欠失させることによって標的構築物の大きさを減少させることが望 ましい。典型的には、必須の調節因子を含まないイントロン配列が欠失されうる 。例えば、ヒト免疫グロブリン重鎮ミニジーンは、ヒト重鎮免疫グロブリン遺伝 子遺伝子座のＪ遺伝子セグメント及びμ定常領域エキソン間のイントロンセグメ ントの欠失を含みうる。もし慣用の制限部位がクローン化された遺伝子配列の必 須でないイントロン配列に結合していれば、しばしば、イントロン配列の欠失は 、（１）クローン化されたＤＮＡを適当な制限酵素で消化する、（２）制限フラ グメントを（例えば、電気泳動により）分離する、（３）必須のエキラン及び調 節因子を含む制限フラグメントを単離する、及び（４）単離された制限フラグメ ントを連結して、エキランが、自然存在する遺伝子の生殖細胞系列のコピー中に 存在するのと同じ直線配列であるところのミニジーンを形成する、ことにより製 造されうる。ミニジーンを製造するための別の方法は、本発明の技術分野の当業 者にとって明白である（例えば、必須のエキランを含むがイントロン配列のいく つかの部分を欠いている部分的ゲノムクローンの連結）。更に典型的には、ミニ ジーンを含む遺伝子セグメントは、生殖細胞系列遺伝子中に存在するのと同じ直 線配列で配列される。しかしながら、常にそうだと言う訳ではない。いくつかの 望まし調節因子（例えば、エンハンサ−、サイレンサー）は、比較的位置非感受 性である。従って、調節因子は、対応する生殖細胞系列の遺伝子中における場合 と異なってミニジーン中に位置された場合でさえ正しく機能する。例えば、エン ハンサ−はプロモ−ターから異なった距離で、異なった方向に、及び／又は異な った直線配列で配置されつる。例えば、生殖細胞系列の立体配置においてプロモ ーターに対して３′に配置されているエンハンサ−は、ミニジーンにおいてプロ モーターに対して５°に配置されつる。同様に、いくつかの遺伝子は、ＲＮＡレ ベルにおいて交互的に（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｌｙ）スプライスされるエキラ ンを含みうる。従って、ミニジーンは、対応する生殖細胞系列の遺伝子より少な いエキラン及び／又は異なった直線配列のエキランを含むことができ、依然とし て、機能的遺伝子生成物をエンコードできうる。遺伝子生成物をエンコードする ｃ　ＤＮＡはまたミニジーンを構築するために用いられうる。しかしながら、一 般には、非相同ミニジーンが同族の自然存在する非ヒト遺伝子と同様に発現され るのが望ましいので、ｃ　ＤＮＡミニジーンの転写は、典型的には、自然存在す る遺伝子からの連結された遺伝子プロモーター及びエンハンサ−によって誘導さ れる。As used herein, the term "minigene" or "minilocus" One or more non-essential gene segments of the gene in relation to naturally occurring genes. Refers to a heterologous gene construct in which a deletion has been made. Typically deleted The segment contains at least about 100 base pairs to several kilobases of intronic sequence. and can extend over tens of kilobases. large (i.e. approximately 50 kilobases) Isolation and manipulation of target constructs (above) are often difficult and The efficiency of transfection into cells may be reduced. Therefore, often one or more essential genes It is desirable to reduce the size of the target construct by deleting portions that do not Delicious. Typically, intron sequences that do not contain essential regulatory elements may be deleted . For example, a human immunoglobulin heavyweight minigene is a human immunoglobulin heavyweight minigene. Intron segmentation between J gene segment and μ constant region exon of child locus may contain deletions of components. If conventional restriction sites are required for the cloned gene sequence, Deletion of intronic sequences is often , (1) Digest the cloned DNA with an appropriate restriction enzyme, (2) Digest the cloned DNA with a restriction enzyme. (3) requisite exhaustion and preparation; (4) isolating the restriction fragment containing the node factor; and (4) isolating the isolated restriction fragment. By linking the produced by forming a minigene that is the same linear sequence as the one that exists. can be built. Alternative methods for producing minigenes are known to those skilled in the art of the present invention. (e.g., contains an essential exilan but has some intronic sequences) (Concatenation of partial genomic clones missing some portions). More typically, mini The gene segment containing the gene is the same direct link that exists in the germline gene. Arranged in a line array. However, this is not always the case. Several Desired regulatory elements (e.g. enhancers, silencers) are relatively position insensitive. It is gender. Therefore, the regulatory elements are functions correctly even when placed in a minigene. For example, Hansers are placed at different distances from the promoter, in different directions, and/or in different directions. The vines are arranged in a straight line array. For example, promoters in the germline configuration The enhancer located 3' to the promoter is the promoter in the minigene. The temple is placed at 5° to the motor. Similarly, some genes have RNA Equila alternately spliced in the bell may include Therefore, minigenes contain fewer genes than their corresponding germline genes. can contain different exhirans and/or different linear arrangements of exhirans and still can encode a functional gene product. encode the gene product cDNA can also be used to construct minigenes. However, one In general, heterologous minigenes are expressed similarly to their cognate naturally occurring non-human genes. Transcription of cDNA minigenes is typically induced by a linked gene promoter and enhancer from a gene It will be done.

本明細書中で用いる”大きいトランスジーン”又は７大きい相同標的構築物”と は、一般に５０ｋｂより大きい、通常は１００ｋｂより大きい、しばしば２６０ ｋｂより大きい、場合により５００ｋｂ程度の大きさの、時々は１０００ｋｂ以 上の大きさのポリヌクレオチドを意味する。As used herein, "large transgene" or "large homologous targeting construct" is generally larger than 50kb, usually larger than 100kb, often 260kb Larger than kb, sometimes as large as 500 kb, sometimes larger than 1000 kb means a polynucleotide of the size above.

本明細書中で用いる、”転写単位”又は”転写複合体”なる用語とは、構造遺伝 子（エキラン）、シス作用する連結されたプロモーター及び構造遺伝子の効率的 な転写のために必須の他のシス作用配列、構造配列の適当な組織特異的及び発生 的な転写のために必須の遠位調節因子、及び効率的な転写及び翻訳のために重要 な付加的シス配列（例えば、ポリアデニル化部位、ｍＲＮＡ安定性制御配列）を 含むポリヌクレオチド配列を意味する。As used herein, the term "transcription unit" or "transcription complex" refers to a structural genetic offspring (equilans), cis-acting linked promoters and efficient structural gene Other cis-acting sequences essential for transcription, appropriate tissue-specific and developmental Distal regulators essential for normal transcription and important for efficient transcription and translation additional cis sequences (e.g., polyadenylation sites, mRNA stability control sequences). refers to a polynucleotide sequence containing

本明細書中で用いる１連結された２とは、ポリヌクレオチド連結（すなわち、ホ スホジエステル連結）を意味する。As used herein, 1-linked 2 refers to polynucleotide linkages (i.e., host sulfodiester linkage).

”連結されていない”とは、他のポリヌクレオチド配列に連結されていないこと を意味する。従って、もしそれぞれの配列が遊離の５゛末端及び遊離の３゛末端 を有すれば、２つの配列は連結されいない。"Unlinked" means not linked to other polynucleotide sequences. means. Therefore, if each sequence has a free 5' end and a free 3' end, , the two arrays are not connected.

本発明の詳細な説明 一般に、以下で用いた命名法、細胞培養、分子遺伝学及び核酸化学の実験方法及 び以下に記したハイブリダイゼーションは、本技術分野において当業者に公知の ものでありかつ通常用いられるものである。核酸組み換え法、ポリヌクレオチド 合成、細胞培養及びトランスジーンの取り込み（例えば、リポフエクション法） のために、標準方法を用いた。一般に、酵素反応、オリゴヌクレオチド合成及び 精製工程は、製品仕様書に従って行った。方法及び手順は、一般に、本技術分野 における慣用の方法及び本明細書を通して示された種々の一般の引用に従って行 った。そこに示された手順は、本技術分野においてよく知られており、そして読 者の利便のために示されるものであると信じられる。Detailed description of the invention In general, the nomenclature, cell culture, molecular genetics and nucleic acid chemistry experimental methods and methods used below and the hybridizations described below are performed using methods known to those skilled in the art. It is something that is common and commonly used. Nucleic acid recombination method, polynucleotide Synthesis, cell culture and transgene uptake (e.g. lipofection) For this purpose, standard methods were used. Generally, enzymatic reactions, oligonucleotide synthesis and The purification process was performed according to product specifications. Methods and procedures are generally within the technical field. carried out in accordance with conventional methods and the various general references given throughout this specification. It was. The procedures presented therein are well known in the art and are readable. It is believed that it is presented for the convenience of the public.

そこに含まれる全ての情報は、引用することにより本明細書の一部である。All information contained therein is incorporated herein by reference.

キメラ標的マウスは、Ｂｏｇａｎら、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎ　ｔｈｅ　Ｍｏｕ ｓｅ　Ｅｍｂｒｙｏ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　、Ｃｏ１ｄ 　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、　１９８８年　及び　Ｔ ｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ　ａｎｄ　Ｅｍｂｒｙｏｎｊｃ　５ｔｅｌＩＣ ｅｌｌｓ：＾Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ　、　Ｅ、Ｊ、　Ｒｏｂｅ ｒｔｓｏｎ編、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、　Ｄ、Ｃ，，１９ ８７年（これらは引用することにより本明細書の一部である）に従って作製され た。The chimeric target mouse was produced by Bogan et al., Manipulatin the Mou se Embryo: A Laboratory Manual, Col1d Spring Harbor Laboratory, 1988 and T eratocarcinomas and Embryonjc 5telIC ells: ＾Practical Approach, E, J, Robe rtson, IRL Press, Washington, D.C., 19 87 (which are hereby incorporated by reference) Ta.

胚幹細胞は、発表された方法（Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ　ａｎｄ　Ｅ Ｉｌｂｒｙｏｎｉｃ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅ１ｌｓ：　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐ ｐｒｏａｃｈ　、　Ｅ、Ｊ、　Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、ｆ ａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ、Ｃ，，１９８７年、Ｚｊｉｌｓｔｒａら、Ｎａｔｕｒ ｅ、　第３４２巻、第４３５−４３８頁、１９９８年、Ｓｃｈｖａｒｔｚｂｅｒ ｇら、５ｃｉｅｎｃｅ　ｓ第２４６巻、第７９９〜８０３頁、１９８９年（これ らは引用することによ明細書の一部である）に従って操作された。Embryonic stem cells were obtained using a published method (Teratocarcinomas and E Ilbryonic Stem Ce1ls: A Practical Ap approach, edited by E. J. Robertson, IRL Press, f. ashington, D.C., 1987, Zjilstra et al., Natur. e, Volume 342, Pages 435-438, 1998, Schwartzber g et al., 5science, Vol. 246, pp. 799-803, 1989 (this (incorporated by reference).

オリゴヌクレオチドは、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏ　Ｓｙｓｔｅｍ社のオリゴヌク レオチドシンセサイザーにより、製品仕様書に従い合成されうる。The oligonucleotide was an oligonucleotide from Applied Bio System. It can be synthesized by a leotide synthesizer according to product specifications.

ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａに基ついたトランスジーンは、発現が悪く又は不適当に調節され るということがしばしば観察された。自然存在する遺伝子座の成分及び編成を実 質的に残しているゲノムＤＮＡに基づいたトランスジーン（即ち、クローン化さ れたゲノムＤＮＡ配列から構築された）は、正確に発現される可能性がより高い が、バクテリオファージ及びプラスミド／コスミドベクターのクローニング容量 によって大きさが限定される。酵母人工染色体（ＹＡＣ）は、約２メガベース（ 輩Ｂ）の容量を持つ最近開発されたクローニング伝達体である（　Ｂｕｒｋｅら 、１９８７年、５ｃｉｅｎｃｅ　、第２３６巻、８０６頁）。再現性よくかつ効 率的にＹＡＣをトランスジェニックマウス中に導入する能力は、最近のトランス ジーンの大きさの制限を著しく凌ぐことができる。cDNA-based transgenes may be poorly expressed or inappropriately regulated. It was often observed that Demonstrate the components and organization of naturally occurring genetic loci. A transgene (i.e., a cloned (constructed from derived genomic DNA sequences) are more likely to be correctly expressed. However, the cloning capacity of bacteriophage and plasmid/cosmid vectors The size is limited by Yeast artificial chromosomes (YACs) are approximately 2 megabases ( Burke et al. , 1987, 5science, Vol. 236, p. 806). Good reproducibility and effectiveness The ability to efficiently introduce YAC into transgenic mice has been demonstrated by the recent transgenic Gene size limitations can be significantly exceeded.

概して、本発明は、大きな（即ち、約５０ｋｂより大きい）クローン化されたポ リヌクレオチドが効率的に哺乳動物細胞例えばＥＳ細胞中に移入されることがで き、かつ少なくとも一つの染色体の位置中に取り込まれることができそして染色 体のセグメントとして安定に複製されることができるという予期されない発見に 基づいたものである。更に、完全な転写単位を含む大きなりローン化されたポリ ヌクレオチドは、哺乳動物細胞（例えば、ＥＳ細胞）中に移入され、染色体の位 置中に取り込まれそして転写されて、検出できる濃度の構造遺伝子配列のＲＮ、 Ａ転写物を製造できることが判った。ＹＡＣ中にクローン化された再配列されて いない免疫グロブリン遺伝子が、ＥＳ細胞中に導入され、有効なＶＤＪ再配列が 起こりかつ免疫グロブリン鎖の発現もまた起こるところのトランスジェニック動 物を形成するために発生分化されつるといことも判った。大きなトランスジーン はＹＡＣ中にクローン化されることができ、そして宿主酵母細胞から単離後に、 所望のトランスジーン配列を酵母由来ＹＡＣ配列から前もって分離することなく 哺乳動物細胞（例えば、ＥＳ細胞）中に効率的に移入されうるということ、及び 、このような酵母由来ＹＡＣ配列の存在は、不干渉でありうる（即ち、効果的な トランスジーンの組み込み及びトランスジーン転写単位の転写と共存できる）と いうことも判った。意外なことに、大きなトランスジーンは、連結された酵母由 来のＹＡＣ配列と共に又はなしで、効率的に哺乳動物細胞（例えば、ＥＳ細胞） 中に、選択マーカー例えばｎｅｏＲ発現カセットを含む連結されていないポリヌ クレオチドと共にコトランスフエクトされることができ、そして選択マーカー遺 伝子を有し選択マーカーを発現している細胞を選択することは、コトランスフエ クトされた大きなトランスジーン種をも有する可能性が高く、従って選択マーカ ー遺伝子を前もって連結（及びクローニング）する必要なしに大きなトランスジ ーンＤＮＡ配列を効率的に選択できる、ということがまた判った。大きなりＮＡ 上セグメント例えばＹＡＣクローンとして）を選択マーカー遺伝子と共に効率的 にコリボフエクシ３ンできるという発見は、典型的に操作が困難であった大きな 異種ＤＮＡセグメントを有するトランスジェニック補乳動物細胞及びトランスジ ェニック非ヒト動物の構築を初めて可能とした。従って、大きなポリヌクレオチ ド、典型的には５０〜１００ｋｂの大きさ、しばしば２５０ｋｂを超える大きさ 、場合により約５００ｋｂを超える大きさ、時々１０００ｋｂ以上の大きさのポ リヌクレオチドが、哺乳動物細胞中に効率的に導入されうる。哺乳動物細胞は、 ＥＳ細胞、例えばネズミＥＳ細胞（例えば、ＡＢ−１系統）でありうる。従って 得られたトランスジェニック細胞は胚盤胞中に注入されることができ、好ましく は非ヒトトランスジェニック動物中で発現される大きなりＮＡトランスジーンを 有するトランスジェニック非ヒト動物例えばトランスジェニックマウス又はトラ ンスジェニックラットを作りうる。本発明の方法はまた、体細胞例えば上皮細胞 （例えばケラチン細胞）、内皮細胞、造血細胞及びミオサイトでも行われつる。In general, the present invention provides for large (i.e., greater than about 50 kb) cloned ports. nucleotides can be efficiently transferred into mammalian cells such as ES cells. and can be incorporated into at least one chromosomal location and stained. The unexpected discovery that body segments can be stably replicated It is based on In addition, large roaned polysaccharides containing complete transcription units The nucleotides are introduced into a mammalian cell (e.g., an ES cell) and assigned a chromosomal location. a detectable concentration of structural gene sequences incorporated into and transcribed into the RN; It was found that A transcript could be produced. Rearranged cloned into YAC An immunoglobulin gene that does not exist is introduced into ES cells, and effective VDJ rearrangement occurs. transgenic activity where immunoglobulin chain expression also occurs. It was also discovered that they develop and differentiate in order to form things. big transgene can be cloned into YAC, and after isolation from host yeast cells, without prior separation of desired transgene sequences from yeast-derived YAC sequences. that it can be efficiently transferred into mammalian cells (e.g., ES cells); and , the presence of such yeast-derived YAC sequences may be non-interfering (i.e., effective can coexist with transgene integration and transcription of transgene transcription units) and I also understood what you were saying. Surprisingly, large transgenes are with or without native YAC sequences to efficiently transform mammalian cells (e.g., ES cells). an unlinked polynucleotide containing a selectable marker, e.g. neoR expression cassette. can be cotransfected with cleotides and selectable marker residues. Selecting cells that have the gene and express the selectable marker is a cotransfection method. It is also likely to have large transgene species that have been – large transfection capacity without the need for preligation (and cloning) of genes; It has also been found that target DNA sequences can be efficiently selected. Large NA upper segment (e.g. as a YAC clone) together with a selectable marker gene. The discovery that colibofuexi3 can be used in a large scale, typically difficult to operate, Transgenic mammalian cells and transgenic cells with heterologous DNA segments This made it possible for the first time to construct a genetic non-human animal. Therefore, large polynucleotides typically 50 to 100 kb in size, often over 250 kb in size , sometimes larger than about 500kb, sometimes larger than 1000kb. nucleotides can be efficiently introduced into mammalian cells. mammalian cells are It can be an ES cell, such as a murine ES cell (eg, AB-1 lineage). Therefore The resulting transgenic cells can be injected into blastocysts, preferably is a large NA transgene expressed in non-human transgenic animals. Transgenic non-human animals such as transgenic mice or tigers having It is possible to create susgenic rats. The method of the invention also applies to somatic cells such as epithelial cells. (eg keratinocytes), endothelial cells, hematopoietic cells and myocytes.

胚幹細胞 胚幹（ＥＳ）細胞をトランスジーン宿主として用いれば、組み込まれた標的とさ れたトランスジーンを含む標的とされた遺伝子を有するトランスジェニック動物 を発生させることが可能である。要約すれば、この技術は、非相同組み込み又は 相同組み換えによって、遺伝子を生殖細胞組織に分化できる多能性細胞系列（例 えば、ネズミＥＳ細胞系統）中に導入することを含む。embryonic stem cells Using embryonic stem (ES) cells as transgene hosts, the integrated target and Transgenic animals with targeted genes containing transgenes It is possible to generate In summary, this technique uses non-homologous integration or Pluripotent cell lineages that can differentiate genes into germline tissues by homologous recombination (e.g. e.g., murine ES cell lines).

大きなトランスジーンは、宿主ゲノムの染色体の位置中に非相同的に組み込まれ うる。或いは、生殖細胞系列遺伝子又は異種同族遺伝子（非相同遺伝子を含む） の一部の少な（とも一つの変化したコピーを含む相同標的構築物（これはトラン スジーンを含みうる）は、胚幹細胞のゲノム中に導入されうる。細胞の一部にお いて、導入されたＤＮＡは、非相同的に染色体の位置中に組み込まれるか又はマ ウス遺伝子の内在性（即ち、自然存在する）コピーと相同組み換えをおこして、 それを変化した構築物で置き換える。Large transgenes integrate non-homologously into chromosomal locations in the host genome. sell. or germline genes or heterologous genes (including heterologous genes) Homologous targeting constructs containing some small (and one altered copy) of can be introduced into the genome of the embryonic stem cell. part of the cell The introduced DNA may be non-homologously integrated into a chromosomal location or mapped to a chromosomal location. by homologous recombination with an endogenous (i.e., naturally occurring) copy of the U.S. gene, Replace it with a modified construct.

新しく設計された遺伝子配列を含む細胞を宿主マウス胚盤胞中に注入し、該胚盤 胞を宿主雌牛に再着床させる。これらの胚のいくつかは、部分的に変異細胞系統 由来である生殖細胞の集団を有するキメラマウスへと発生する。それ故、キメラ マウスを繁殖することにより、導入された遺伝的損傷を含むマウスの新しい系統 を得ることができる（　Ｃａｐｅｃｃｈｌ　ら、１９８９年、５ｃｉｅｎｃｅ　 ％第２４４巻、第１２８８頁によってレビューされている。この文献は引用する ことにより本明細書の一部である）。Cells containing the newly designed gene sequence are injected into host mouse blastocysts, and the blastocysts are Reimplant the follicle into the host cow. Some of these embryos are partially mutant cell lineages It develops into a chimeric mouse with a population of germ cells derived from it. Therefore, chimera New strains of mice containing genetic damage introduced by breeding mice can be obtained (Capechl et al., 1989, 5science % Volume 244, Page 1288. cite this document (herein incorporated by reference).

相同標的構築物のための標的効率は、一般に、標的ＤＮＡ（即ち交差標的配列） 中に存在する参照配列に実質的に相補的な標的トランスジーン部分（即ち、相同 領域）の長さに伴って増加する。あるＥＳ細胞クローン中でのリコンビナーゼの 存在は効率的な組み換えに要求される配列の同一性の程度を減少しうると認識さ れているが、一般には、標的効率は同質ＤＮＡの相同領域を用いることで最適化 される。Targeting efficiency for homologous targeting constructs generally depends on the target DNA (i.e., intersecting target sequences) A target transgene portion that is substantially complementary to a reference sequence present in the target transgene (i.e., a homologous area) increases with length. recombinase in certain ES cell clones. It is recognized that the presence of However, targeting efficiency is generally optimized by using homologous regions of homogeneous DNA. be done.

本発明はまた、非ヒト宿主種に対して異種（例えば、非相同）である遺伝子生成 物をエンコードするトランスジーンを提供する。このようなトランスジーンは典 型的には、構造遺伝子配列発現カセット（そこでは、連結されたプロモーター及 び好ましくはエンハンサ−が異種（例えば、非相同）タンパク質をエンコードす る構造配列の発現を誘導する）を含む。例えば、本発明は、哺乳動物エンハンサ −及びヒ１−ＡＰＰタンパク質をエンコードする構造配列に連結された少なくと も一つのヒトＡＰＰプロモーターを含むトランスジーンを提供する。このような トランスジーンを有するトランスジェニックマウスは、ヒトＡＰＰのｍＲＮＡを 発現する。好ましくは、異種（例えば、非相同）タンパク質をエンコードするポ リヌクレオチド配列は、シス作用転写調節領域（例えば、プロモーター、エンハ ンサ−）に作動可能に連結されて、非相同タンパク質が自然存在する非ヒト動物 中の同族内在性遺伝子の発現と同様の様式で発現される。従って、一般に、トラ ンスジーンの構成的なエンコードする配列を、同族内在性遺伝子中或いは近くに 自然に存在する転写調節因子に作動可能に連結するのが好ましい。しかしながら 、非相同タンパク質をエンコードするトランスジーンは、内在性転写調節配列に 隣接する標的とされる相同遺伝子標的構築物を用いることにより標的とされるこ とができ、調節配列への作動可能な連結は、ＥＳ細胞の標的とされる内在性染色 体の位置中へのトランスジーンの組み込み後に起きる。The invention also provides gene production that is heterologous (e.g., non-homologous) to a non-human host species. Provide a transgene that encodes something. Such transgenes are Typically, a structural gene sequence expression cassette (in which a linked promoter and and preferably the enhancer encodes a heterologous (e.g. non-homologous) protein. (inducing the expression of structural sequences). For example, the present invention provides mammalian enhancers - and at least one linked to a structural sequence encoding a human 1-APP protein. also provides a transgene containing a human APP promoter. like this Transgenic mice carrying the transgene contain human APP mRNA. manifest. Preferably, the port encodes a heterologous (e.g., non-homologous) protein. nucleotide sequences include cis-acting transcriptional regulatory regions (e.g., promoters, enhancers, etc.). a non-human animal in which the heterologous protein is naturally present, operably linked to is expressed in a manner similar to that of the cognate endogenous gene in Therefore, in general, The constitutive encoding sequence of the gene is placed in or near the cognate endogenous gene. Preferably, it is operably linked to a naturally occurring transcriptional regulator. however , transgenes encoding heterologous proteins are linked to endogenous transcriptional regulatory sequences. Targeted homologous genes can be targeted by using adjacent targeted homologous gene targeting constructs. and operable linkage to regulatory sequences allows targeted endogenous staining of ES cells. Occurs after integration of a transgene into a location in the body.

選択マーカー遺伝子 選択マーカー遺伝子発現カセットは、典型的には、標的とされる宿主細胞に選択 表現型を与えるタンパク質又はポリペプチドをエンコードする構造配列に連結し た標的とされる宿主細胞（例えば、ＥＳ細胞）中で作動できるプロモーター、及 びポリアデニル化シグナルを含む。発現カセット中に含まれるプロモーターは、 構成要素であり、細胞タイプ特異的であり、段階特異的であり、及び／又は調節 できる（例えば、ホルモン例えばグルココルチコイドによる、即ち、ＭＭＴＶプ ロモーター）ものでありうるが、選択に先だって及び／又は選択中に発現される 。発現カセットは、場合により１以上のエンハンサ−（典型的には、プロモータ ーの上流の約３〜１０キロベース以内に連結される）を含みうる。しかしながら 、選択マーカーが相同標的構築物中に含まれる場合は、標的とされる内在性部位 の相同組み換えは、機能的内在性プロモーターの下流に選択マーカー構造配列を 置くように選ばれうる。そして標的構築物置換領域は、選択マーカーをエンコー ドするたった一つの構造配列を含み、転写を導く内在性プロモーターを当てにす るこより本明細書の一部である）。同様に、標的とされる内在性部位の近くに配 置されている内在性エンハンサ−を、エンハンサ−のない構築物中の選択マーカ ー遺伝子配列の転写を増強させるために当てにすることができる。好ましい本発 明の発現カセットは、選択薬剤耐性マーカー及び／又はＨ３Ｖチミジンキナーゼ 酵素をエンコードしかつ発現する。適当な薬剤耐性遺伝子は、例えば、ｇｐｔ　 （キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、これはマイコフェ ノール酸で選択されうる）、ｎｅｏ（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、 これはＧ４１８、ヒグロマイシン、又はビューロマイシンで選択されつる）、及 びＤＦＨＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ、これはメトトレキセートにより選択さ れうる（ＭｕｌｌｉｇａｎとＢｅｒｇ、　１９８１年、肱旦−Ｎａｔ１．　Ａｃ ａｄ、Ｓｃｉ、（Ｕ、Ｓ、＾、）、第７８巻、第２０７２頁、５ｏｕｔｈｅｒ頁 、これらは引用することより本明細書の一部である）を含む。他の適当な選択マ ーカーも本技術分野において明らかである。selection marker gene A selectable marker gene expression cassette is typically selected into the targeted host cell. linked to a structural sequence encoding a protein or polypeptide that confers a phenotype. promoters operable in the targeted host cells (e.g. ES cells); and polyadenylation signals. The promoter contained in the expression cassette is component, cell type specific, stage specific, and/or regulatory (e.g. by hormones such as glucocorticoids, i.e. MMTV protein) promoter), expressed prior to and/or during selection . The expression cassette optionally includes one or more enhancers (typically promoters). (linked within about 3 to 10 kilobases upstream of). however , the endogenous site to be targeted if the selectable marker is included in the homologous targeting construct. Homologous recombination places a selectable marker structural sequence downstream of a functional endogenous promoter. Can be chosen to place. and the target construct replacement region encodes a selectable marker. It contains a single structural sequence that encodes the protein and relies on an endogenous promoter to direct transcription. (which is hereby incorporated by reference). Similarly, The endogenous enhancer that has been placed can be used as a selection marker in constructs lacking the enhancer. - can be relied upon to enhance transcription of gene sequences. preferred original The specific expression cassette contains selective drug resistance markers and/or H3V thymidine kinase. Encodes and expresses enzymes. Suitable drug resistance genes include, for example, gpt (xanthine-guanine phosphoribosyltransferase, which is a mycophyte neo (neomycin phosphotransferase, This is selected with G418, hygromycin, or buromycin), and and DFHR (dihydrofolate reductase), which is selected by methotrexate. (Mulligan and Berg, 1981, Nat1. Ac ad, Sci, (U, S, ^,), Volume 78, Page 2072, 5outer page , which are incorporated herein by reference. Other suitable selections Also obvious in the art are:

正しくコリボフエクションされた組み換え体の選択は、一般に、選択マーカー遺 伝子発現カセットが、内在的に組み込まれた発現カセットを有する標的とされた 細胞に選択表現型を与える機能的タンパク質（例えば、ｎｅｏ又はｇｐｔ　）を エンコードし、発現するところの、少なくとも正の選択を用い、従って、選択剤 （たとえばＧ　４１８、ビューロマイシンまたはマイコフェノール酸）を添加す ることにより、このような標的とされた細胞は組み込まれた発現カセットを有し ない細胞に比べ有利に成長し又は生存できる。選択マーカー遺伝子に関する更な る案内は、Ｓｍｊ、ｔｈとＢｅｒｇ、　１９８４年、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　 Ｈａｒｂｏｒ　Ｓｙｍｐ、　Ｑｕａｎｔ、　Ｂｉｏｌ、　、第４９巻、第１７１ 頁、３ｅｄｉｖｙと５ｈａｒｐ　、　１９８９年、Ｐｒｏｃ　、Ｎａｔｌ、Ａｃ ａｄ。Selection of correctly colibofected recombinants is generally performed using selection marker genes. Gene expression cassettes were targeted with endogenously integrated expression cassettes functional proteins that confer a selected phenotype on cells (e.g. neo or gpt) At least positive selection is used to encode and express the selection agent. (e.g. G418, buromycin or mycophenolic acid) By doing so, such targeted cells have an integrated expression cassette. can grow or survive more favorably than cells without. Further information regarding selectable marker genes The guide is Smj, th and Berg, 1984, Co1d Spring. Harbor Symp, Quant, Biol, Volume 49, No. 171 pp. 3edivy and 5harp, 1989, Proc, Natl, Ac. ad.

Ｓｃｉ、　（Ｕ、Ｓ、＾、）、第８６巻、第２２７頁、ＴｈｏｍａｓとＣａｐｅ ｃｃｈｉＳ１９８７年、既に引用（これらは引用することにより本明細書の一部 である）を含むい（つかの文献により可能である。Sci, (U, S, ^,), Volume 86, Page 227, Thomas and Cape cchiS 1987, already cited (these are incorporated herein by reference). This is possible based on some literature.

大きな異種ポリヌクレオチド 大きなポリヌクレオチドは、通常、ＹＡＣベクター中にクローン化される。例え ば、ＹＡＣクローニングベクター中のヒトゲノムＤＮＡライブラリーが、目的の 完全な遺伝子（例えば、ヒトＡＰＰ遺伝子、ヒト免疫グロブリン重鎮遺伝子座又 は軽鎖遺伝子座）又は完全な転写単位を含むこのような遺伝子の大部分に及ぶＹ ＡＣクローンを単離するために（例えば、ＰＣＲ又は標識ポリヌクレオチドプロ ーブハイブリダイゼーションによって）スクリーニングされつる。ＹＡＣライブ ラリーを作り、所望のＹＡＣを単離し、モしてＹＡＣＤＮＡを精製するための方 法は、技術文献（米国特許第４８８９８０６号明細書、Ｂｕｒｋｅら、１９８７ 年、５ｃｉｅ二、第２３６巻、第８０６頁、１ｕｒｒｙら、１９８６年、囲、第 ４５巻、第５２９頁、これらは引用することにより本明細書の一部である）に記 載されている。large heterologous polynucleotides Large polynucleotides are usually cloned into YAC vectors. example For example, a human genomic DNA library in a YAC cloning vector is The complete gene (e.g., human APP gene, human immunoglobulin heavy locus or (light chain locus) or Y that spans the majority of such genes, including the complete transcription unit. To isolate AC clones (e.g., PCR or labeled polynucleotide protein) (by hybridization). YAC live A method for making a slurry, isolating the desired YAC, and then purifying the YAC DNA. The method is described in the technical literature (U.S. Pat. No. 4,889,806, Burke et al., 1987). 5cie 2, vol. 236, p. 806, 1urry et al., 1986, Bo, vol. 45, page 529, which are incorporated herein by reference. It is listed.

いったん所望のＹＡＣクローンが単離され及び好ましくは脱タンパク質化されれ ば、酵母由来のＹＡＣ配列は、場合により、所望のクローン化された大きなトラ ンスジーン配列の外側で切断する１以上の制限酵素で消化することによって完全 に又は部分的に除かれうる。つまり、酵母由来の配列は、例えば、パルスゲル電 気泳動によりクローン化された挿入配列から分離される。好ましくは、本発明の 方法において、完全な再配列されていないＹＡＣクローンが大きなトランスシー ン又は大きな相同標的構築物として用いられる。Once the desired YAC clone has been isolated and preferably deproteinized. For example, yeast-derived YAC sequences may optionally be used in the desired cloned large Completed by digestion with one or more restriction enzymes that cut outside the gene sequence. or may be partially removed. That is, sequences derived from yeast can be Separated from cloned insert sequences by pneumophoresis. Preferably, the present invention In this method, complete unrearranged YAC clones are or as large homologous targeting constructs.

一つの観点において、好ましいＹＡＣクローンは、ヒトＡＰＰ遺伝子、ヒト免疫 グロブリン重鎮遺伝子座、ヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子座、ヒトα１抗トリプ シン遺伝子、デュシエンヌ筋ジストロフィー遺伝子、ハンチントン舞踏症関連遺 伝子、及び他の大きな構造遺伝子好ましくはヒト遺伝子からなる群より選ばれる 構造遺伝子配列に完全に又は部分的に及ぶクローンである。In one aspect, preferred YAC clones include the human APP gene, human immune system Globulin heavy chain locus, human immunoglobulin light chain locus, human α1 antitryp Syn gene, Duchenne muscular dystrophy gene, Huntington's chorea-related genes genes, and other large structural genes, preferably human genes. A clone that completely or partially spans the structural gene sequence.

好ましいＹＡＣクローニングベクターは、修飾されたｐＹ＾Ｃ３ベクター（Ｂｕ ｒｋｅら、１９８７年、既に引用、これは引用することにより本明細書の一部で ある）　、ｐＹＡＣｎｅｏ　（Ｔｒａｖｅｒら、１９８９年、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ ｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、（Ｕ、Ｓ、＾、）、第８６巻、第５８９８頁、これは 引用することにより本明細書の一部であにより本明細書の一部である）である。A preferred YAC cloning vector is the modified pY^C3 vector (Bu rke et al., 1987, previously cited, which is incorporated herein by reference. ), pYACneo (Traver et al., 1989, Proc, Nat l, Acad, Sci, (U, S, ^,), volume 86, page 5898, this is (herein incorporated by reference).

カチオン性脂質 リボフエクション及びその基礎方法論での種々の変法は、公知の技術文献（米国 特許第５０４９３８６．４９４６７８７及び４８９７３５５号明細書）に記載さ れており、リポフエション剤は、現在市販されている（例えば、”Ｔｒａｎｓｆ ｅｃｔａｍ″及び”Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ“）。cationic lipid Various variations on ribofection and its basic methodology are described in the known technical literature (U.S. Patent Nos. 5049386.4946787 and 4897355) Lipofection agents are currently commercially available (for example, “Transf. ectam” and “Lipofectin”).

ＤＮＡの効率的リボフエクシタンに適したカチオン性及び中性脂質は、技術文献 に記載されている。リボフエクションは、Ｆｅｌｇｎｅｒ　（Ｙ０９１／１７４ ２４、これは引用することにより本明細書の一部である）及び／又はカチオン性 脂質化（、１０９１／１６０２４、これは引用することにより本明細書の一部で ある）に従って作られたＤＮＡとの脂質複合体を形成することにより達成されつ る。技術文献に記載されている種々のりボフエクション方法は、本発明に従った コリポフェクションに適用されうる。例えば（限定されるものではないが）、一 般的なりポフェクション方法は以下の文献に記載されている：　Ｂｅｈｒら（１ ９８９）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（Ｕ。Cationic and neutral lipids suitable for efficient ribofexcitanization of DNA are described in the technical literature. It is described in. Ribofection is Felgner (Y091/174 24, which is incorporated herein by reference) and/or cationic Lipidation (1091/16024, herein incorporated by reference) This is achieved by forming a lipid complex with DNA made according to Ru. Various glue effecting methods described in the technical literature can be used according to the present invention. Can be applied to colipofection. For example (but not limited to), General lipofection methods are described in the following literature: Behr et al. 989) Proc, Natl, Acad, Sci, (U.

Ｓ、Ａ、）　８６：　６９８２；　Ｄｅｍｅｎｅｉｘら（１９９１）　Ｉｎｔ、 Ｊ、Ｄｅｖ、Ｂｉｏｌ。S, A,) 86: 6982; Demeneix et al. (1991) Int. J, Dev, Biol.

３５＋　４８１；　Ｌｏｅｆｆｌｅｒら（１９９０）　Ｊ、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ 、５４；　１８１２；　Ｂｅｎｎｅｔｔら（１９９２）Ｍｏ１．　Ｐｈａｒｍａ ｃｏｌ、４１：　１０２３；　Ｂｅｒｔｌｉｎｇら（１９９１）　Ｂｉｏｔｅｃ ｈｎｏｌ、＾ｐｐ１．　Ｂｉｏｃｈｅｉ、１３：　３９０；　Ｆｅｌｇｎｅｒら （１９８７）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（Ｕ、Ｓ、Ａ 、）　８４：　７４１３；　ＦｅｌｇｎｅｒとＲｉｎｇｏｌｄ（１９８９）　Ｎ ａｔｕｒｅ　３３１：　３８７；　Ｇａｒｅｉｓら（１９９１）　Ｃｅ１１、Ｍ ｏ１．　Ｂｉｏｌ、３７．：　１９１；　Ｊａｒｎａｇｉｎら（１９９２）　Ｎ ｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ」胚、翻：　４２０５；　Ｊｉａｏら（１９９２）塾 上エエ駐μ■１月、５：　４００；Ｌｉｍら（１９９１）　Ｃ１ｒｃｕｌａｔｉ ｏｎ　８３：　２００７；　Ｍａｌｏｎｅら（１９８９）　Ｐｒ。35+ 481; Loeffler et al. (1990) J, Neurochem , 54; 1812; Bennett et al. (1992) Mo1. Pharma col, 41: 1023; Bertling et al. (1991) Biotec hnol, ^pp1. Biochei, 13: 390; Felgner et al. (1987) Proc, Natl, Acad, Sci, (U, S, A , ) 84: 7413; Felgner and Ringold (1989) N ture 331: 387; Gareis et al. (1991) Ce11, M o1. Biol, 37. : 191; Jarnagin et al. (1992) N ucleic Ac1ds” embryo, translation: 4205; Jiao et al. (1992) School Kami Etsu μ ■ January, 5: 400; Lim et al. (1991) C1rculati on 83: 2007; Malone et al. (1989) Pr.

本明細書の一部である。Part of this specification.

最近判ったポリカチオン性リポスペルミン化合物は、広範囲の細胞に見られ（Ｂ ｅｈｒら、１９８９年、既に引用）、ＤＮＡはこれらの化合物によって覆われて いる。更に、中性及びカチオン性脂質の組み合わせは、動物細胞のトランスフェ クションにおいて高い効率であることが示され、そして多くの細胞系統において 広範囲の効果が示されている（Ｒ。Recently discovered polycationic lipospermine compounds are found in a wide range of cells (B Ehr et al., 1989, already cited), DNA is coated with these compounds. There is. Furthermore, combinations of neutral and cationic lipids are useful for transfection of animal cells. It has been shown to be highly efficient in many cell lines. A wide range of effects have been shown (R.

ｓｅら、１９９１年、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　、第１０巻、第５２０頁） 。se et al., 1991, BioTechniques, Vol. 10, p. 520) .

リポフエクション複合体（又は、カチオン性の脂質化されたＤＮＡ複合体）は、 適当なカチオン性脂質組成物を１以上のポリヌクレオチド種例えば大きなトラン スジーン及び選択マーカー遺伝子発現カセットと混合することによって作られる 生成物と定義される。このようなコリポフエクション複合体は、適当な条件（例 えば、生理食塩緩衝液又は血清の入っている或いは入っていないＥＳ細胞培地、 ２０〜４５℃）下で哺乳動物細胞と接触させたときに哺乳動物細胞（好ましくは 哺乳動物細胞は、ＥＳ細胞例えばネズミＥＳ細胞である）中へのポリヌクレオチ ドの取り込みを引き起こすコリボフエクション複合体の形成をもたらす、ポリヌ クレオチドと脂質成分の相互作用によって特徴づけられる。The lipofection complex (or cationic lipidated DNA complex) is A suitable cationic lipid composition is combined with one or more polynucleotide species, e.g. made by mixing with a gene expression cassette and a selectable marker gene defined as a product. Such colipofection complexes can be produced under appropriate conditions (e.g. For example, ES cell culture medium with or without saline buffer or serum; 20-45°C). Mammalian cells are ES cells, e.g. murine ES cells). polynucleases, leading to the formation of colibofection complexes that cause the uptake of It is characterized by the interaction of cleotide and lipid components.

種々の適当なカチオン性脂質は、単独で又は１以上の他のカチオン性脂質種或い は中性脂質種と組み合わせて用いられうる。一般に、適当なカチオン性脂質は正 に荷電した頭部基（１以上の荷電）及び共有結合的に結合された脂肪酸尾からな る。適当なカチオン性脂質組成物は、カチオン性脂質−ポリアミンジオクタデシ ルアミドグリシルスペルミジン（ＤＯＧＳ）を含む”Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ” 　（ＰｒｏＭｅｇａ、　Ｍａｄｉｓｏｎ。A variety of suitable cationic lipids can be used alone or in combination with one or more other cationic lipid species. can be used in combination with neutral lipid species. In general, suitable cationic lipids are consisting of a charged head group (one or more charges) and a covalently attached fatty acid tail. Ru. Suitable cationic lipid compositions include cationic lipid-polyamine dioctadecyl "Transfectam" containing Rumidoglycylspermidine (DOGS) (ProMega, Madison.

ＴＩ）である。ＤＯＴＭＡは、Ｎ−（２，３−ジ（９−（Ｚ）−オクタデセニル オキシ））−プロブ−１−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライドとし て知られている好ましい脂質である。Ｄ　Ｎ　Ａ　−ＤＯＴＭＡ複合体は、本質 的にはＤＯＴＭＡ及ＤＮＡから作られる。好ましいカチオン性脂質の他の具体例 は、ジオレオイルフォスファチジルエタノールアミン（ＰｔｄＥｔｎ、　ＤＯＰ Ｅ）　、ジオクタデシルアミドグリシル、Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライ ド、Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルサルフェート、ＤＯＲＩ及びＤＯＲＩ− エーテル（ＤＯＲＩＥ　）である。ＤＯＲＩは、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオ イル）プロピル］−Ｎ、Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムアセ テートであり、ＤＯＲＩＥはＮ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル ］−Ｎ、Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムアセテートである。TI). DOTMA is N-(2,3-di(9-(Z)-octadecenyl) oxy))-probu-1-N,N,N-trimethylammonium chloride It is a preferred lipid known to be The DNA-DOTMA complex is essentially It is made from DOTMA and DNA. Other specific examples of preferred cationic lipids is dioleoylphosphatidylethanolamine (PtdEtn, DOP E), dioctadecylamide glycyl, N-trimethylammonium chloride DO, N-trimethylammonium methyl sulfate, DORI and DORI- It is ether (DORIE). DORI is N-[1-(2,3-dioreo yl)propyl]-N,N-dimethyl-N-hydroxyethylammonium acetate tate and DORIE is N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl ]-N,N-dimethyl-N-hydroxyethylammonium acetate.

ＤＯＴＡＰはＮ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ、Ｎ、 Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルサルフェートであり、この脂質はエーテル結 合ではなくエステル結合を有し、細胞によって代謝されつる。DOTAP is N-[1-(2,3-dioleoyloxy)propyl]-N, N, N-trimethylammonium methyl sulfate, this lipid has an ether linkage. It has an ester bond rather than a bond, and is metabolized by cells.

場合により、１以上のコリビド（ｃｏ−１ｉｐｉｄ）を適当なカチオン性脂質と 組み合わせることができる。場合により用いるコリビドとは、単独でも或いは他 の脂質成分と組み合わせてＤＮＡと安定なりＮＡ−脂質複合体を作りうる構造体 として理解されるべきであり、それは正にも負にも荷電されつるが、好ましくは 中性である。場合により用いられるコリピドの具体例は、ホスホリピド関連物質 例えばレシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リゾレシチン、リゾホスフ ァチジンエタノールアミン、ホスファチジルセリン、フォスファチジルイノシト ール、スフィンゴミエリン、セファリン、カルシオリピン、ホスファチジル酸、 セレブロシド、ジセチルホスフエート、ジオレオイルフォスファチジルコリン（ ＤＯＰＣ）　、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）　、ジオレオ イルフォスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルフォスファチ ジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレイルフオスファチジルエタノールアミン （ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルフォスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、 パルミトイルオレオイルフオスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）及びジ オレオイルフオスファチジルエタノールアミン４−・（Ｎ−マレイミドメチル） −シクロヘキサン−１−カルボキシレーｔ−（ＤＯＰＥ−１１ａｌ）である。追 加的なリンを含まない脂質は、例えば、ステアリルアミン、ドデシルアミン、ヘ キサデシルアミン、アセチルパルミテート、グリセロールリシノーレート、ヘキ サデシルステアレート、イソプロピルミリステート、両性アクリルポリマー、ト リエタノールアミンラウリルスルフェート、アルキルアリールスルフェートポリ エチルオキシル化脂肪酸アミド、ジオクタデシルジメチル臭化アンモニウムなど である。Optionally, one or more co-1ipids are combined with a suitable cationic lipid. Can be combined. Coribid, as used in some cases, may be used alone or in combination with A structure that can be combined with a lipid component to form a stable NA-lipid complex with DNA. It should be understood as a vine that is both positively and negatively charged, but preferably It is neutral. Specific examples of colipids that may be used include phospholipid-related substances. For example lecithin, phosphatidylethanolamine, lysolecithin, lysophosph Atidine ethanolamine, phosphatidylserine, phosphatidylinosite sphingomyelin, cephalin, calciolipin, phosphatidylic acid, Cerebroside, dicetyl phosphate, dioleoylphosphatidylcholine ( DOPC), dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC), dioleo Dolphosphatidylglycerol (DOPG), dipalmitoylphosphati Dylglycerol (DPPG), dioleylphosphatidylethanolamine (DOPE), palmitoyloleoylphosphatidylcholine (POPC), Palmitoyloleoylphosphatidylethanolamine (POPE) and di- Oleoylphosphatidylethanolamine 4- (N-maleimidomethyl) -cyclohexane-1-carboxylate t-(DOPE-11al). Follow up Additional phosphorus-free lipids include, for example, stearylamine, dodecylamine, xadecylamine, acetyl palmitate, glycerol ricinoleate, hexadecylamine sadecyl stearate, isopropyl myristate, amphoteric acrylic polymer, Liethanolamine lauryl sulfate, alkylaryl sulfate poly Ethyloxylated fatty acid amide, dioctadecyldimethyl ammonium bromide, etc. It is.

一般に、リボフエクション複合体を形成するために、−又は複数のポリヌクレオ チドを、文献及び本明細書の技術に従って、適当なカチオン性脂質と、１以上の コリピドの存在下又は不存在下で、約ｐｎ７．４〜？、８．２０〜３０℃で、組 み合わせる。２以上のポリヌクレオチド種をリボフエクション複合体中に組み入 れる場合は、本明細書中ではコリボフエクション複合体と呼ばれる。一般に、コ リボフエクション複合体は、大きなポリヌクレオチド（トランスジーン又は相同 標的構築物）及び選択マーカー遺伝子発現カセットを含む。コリボフエクション 複合体は、技術文献又は本明細書に記したりボフエクション条件下で、細胞培養 物、好ましくはＥＳ細胞に投与される。Generally, one or more polynucleotides are used to form a ribofection complex. tide with a suitable cationic lipid according to the literature and techniques herein. In the presence or absence of colipid, about pn7.4~? , 8. At 20-30℃, Match. Incorporation of two or more polynucleotide species into a ribofection complex When present, it is referred to herein as a colibofection complex. In general, The ribofection complex is a large polynucleotide (transgene or homologue). target construct) and selectable marker gene expression cassette. Coribofection The complexes can be grown in cell culture under bofection conditions as described in the technical literature or herein. ES cells, preferably ES cells.

一般的方法 本発明の好ましい方法は、大きな非相同トランスジーンを含む実質的に無傷のＹ ＡＣクローンを、トランスジェニック非ヒト動物を作るために用いられうる多能 性幹細胞系統中に移入し、次に宿主杯盤中に注入することである。本発明の特に 好ましい実施例は、連結されていない正の（例えば、ｎｅｏ　）選択発現カセッ トと共にコリボフエクションされたヒトＡＰＰ遺伝子標的構築物である。ヒトＡ ＰＰトランスジーンは、コリボフエクションされたＥＳ細胞が引き続き生存する のに適した条件下でマウスＥＳ細胞中に移入される（例えば、ｎｅｏと共にコリ ポフエクションにより）０リポフエクシヨンされたＥＳ細胞は、正の選択の選択 条件（例えば、Ｇ４１８の選択濃度）下で培養される。次いで、選択された細胞 は、本技術分野で公知の標準ＰＣＨに従ったＰＣＲ分析又はサザンプロテイング 法（米国特許第４６８３２０２号明細書、Ｅｒ１ｉｃｈら、１９９１年、５ｃｉ ｅｎｃｅ　、第２５２、第１６４３頁、これらは引用することにより本明細書の 一部である）により、正しく標的されたトランスジーン組み換えを有しているこ とが確かめられる。General method A preferred method of the invention involves the use of a substantially intact Y containing a large heterologous transgene. AC clones are pluripotent that can be used to create transgenic non-human animals. transfer into the sexual stem cell lineage and then inject into the host cup. Particularly of the present invention A preferred embodiment includes an unlinked positive (e.g., neo) selection expression cassette. This is a human APP gene targeting construct colliboffected with a human APP gene. Human A PP transgene ensures continued survival of coliboffected ES cells into mouse ES cells under conditions suitable for 0 lipofectioned ES cells (by lipofection) are selected for positive selection. and cultured under conditions (eg, selective concentrations of G418). Then the selected cells PCR analysis or Southern protein analysis according to standard PCH known in the art. (U.S. Pat. No. 4,683,202, Erlich et al., 1991, 5ci ence, page 252, page 1643, which are incorporated herein by reference. (in some cases) to ensure that you have correctly targeted transgene recombination. It can be confirmed that

次いで、正しく標的されたＥＳ細胞は、本技術分野で公知の方法（Ｃａｐｅｃｃ ｈｉ、　Ｍ、　、１９８９年、丁ＩＧ　、第５巻、第７０頁、Ｃａｐｅｃｃｈｉ 、　Ｍ、、１９８９年、５ｃｉｅｎｃｅ　、第２４４巻、第１２８８頁、これら は引用することにより本明細書の一部である）に従いキメラトランスジェニック 動物を作製するために適当な胚盤胞宿主へと移入される。いくつかの研究は既に 、所望のトランスフェクションされた細胞系統を成功裡に同定するためにＰＣＲ を用いている（　ＺｉｉｍｅｒとＧｒｕｓｓ　、　１９８９８８巻、第４２９４ 頁、これらは引用することにより本明細書の一部である）。この方法は、外来性 の標的トランスジーンを受け取った細胞数が大きいとき（即ち、エレクトロポレ ーシヨン又はリボフエクションを用いたとき）及び処理された細胞集団が大きく なれる場合は、非常に効果的である（　Ｃａｐｅｃｃｈｉ、　Ｍ、、１９８９年 、既に引用、これは引用することにより本明細書の一部である）。Correctly targeted ES cells are then harvested using methods known in the art (Capecc hi, M., 1989, Ding IG, vol. 5, p. 70, Capecchi , M., 1989, 5science, vol. 244, p. 1288, these (herein incorporated by reference) A suitable blastocyst host is transferred to produce animals. Some studies have already , PCR to successfully identify the desired transfected cell line. (Ziimer and Gruss, vol. 198988, no. 4294) pages, which are hereby incorporated by reference). This method is an exogenous when the number of cells that have received the target transgene is large (i.e., when the electroporation (when using fusion or ribofection) and the treated cell population is If you can, it can be very effective (Capecchi, M., 1989) , already cited herein, which is hereby incorporated by reference).

トランスジェニック非ヒト動物（これは、相同的に標的とされる非ヒト動物を含 む）を作るためには、胚幹細胞（ＥＳ細胞）が好ましい。有糸***できない５Ｎ Ｌ７６／７細胞の支持細胞層（ＭｃＭａｈｏｎとＢｒａｄｌｅｙ　、　Ｃｅ１ｌ 、第６２巻、第１０７３〜１０８５頁、１９９０年）上で生育されたネズミＥＳ 細胞例えばＡＢ−１系統（実質的には（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ、　Ｅ、Ｊ、、１９ ８ｅＳＳ　ｓ第７１〜１１２頁）に述べらている）は、相同遺伝子標的のために 用いられうる。他の適当なＥＳ系統は、８１４頁、Ｄ３系統（ＤｏｅｔｓｌＡｎ ａｎら、１９８５年、１．　Ｅｍｂｒｙｏｌ、　Ｅｘ　。Transgenic non-human animals (this includes homologously targeted non-human animals) Embryonic stem cells (ES cells) are preferred. 5N cannot undergo mitosis Feeder layer of L76/7 cells (McMahon and Bradley, Ce1l , Vol. 62, pp. 1073-1085, 1990). cells of the AB-1 lineage (substantially (Robertson, E. J., 1999) 8eSS pages 71-112)) for homologous gene targets. can be used. Other suitable ES lines are listed on page 814, the D3 line (DoetslAn an et al., 1985, 1. Embryol, Ex.

含むが、これには限定されない。う・ノド、）＼ムスター、ウシ及びブタのＥＳ 細胞も、ヒトＡＰＰ遺伝子配列を有する非相同トランスジーン・ンク非ヒト動物 を製造するための技術分野において入手可能である。大きなトランスジーン又は 特に標的とされた遺伝的交代を有するＥＳ細胞力）らのマウス系統の作製の成功 は、ＥＳ細胞の多能性（即ち、宿主胚盤胞に注入された後に、胚形成に参加し、 得られる動物の生殖細胞系統に対する寄与する、それらの能力）ｌこ依存する。Including, but not limited to. U・Nodo、）＼Mustar, cow and pig ES Cells can also contain non-homologous transgenes containing the human APP gene sequence. available in the technical field for manufacturing. large transgene or Successful generation of mouse strains of ES cells with specifically targeted genetic alterations The pluripotency of ES cells (i.e., after being injected into a host blastocyst, they participate in embryogenesis; Their ability to contribute to the germline of the resulting animal depends on their ability to contribute to the germline of the resulting animal.

注入されたＥＳ細胞を含む胚盤胞は、擬妊娠ｌμヒト雌の子宮中で発生を許され 、そしてキメラマウスとして生まれる。得られたトランスジーン・ンクマウス（ ヨ、大きなトランスジーン／相同標的構築物を有する細胞］こつ０てキメラであ り、そして戻し交雑され、子孫の尾の生検でのＤＮＡのＰＣＲ又はサザンプロテ イング分析（こよってトランスジーン及び／又はＹＡＣ配列の存在ｌこつ（１て スフ１ノーニングされて、トランスジーン／相同標的構築物ｌこつ（旭てのトラ ンスジェニックマウスへテロ接合体を同定する。適当な交雑を行うことにより、 複数の大きなトランスジーン／相同組み換え構築物、及び場合により異なったＩ Ｄ相同タンパク質をエンコードするトランスジーン１こつ（１てトランスジェニ ック非ヒト動物ホモ接合体力（製造できる。このようなトランスジェニックヒト 動物は、移入されたトランスジーンと関連した種々の疾患の満足できる実験モデ ルである。Blastocysts containing injected ES cells were allowed to develop in the uterus of pseudopregnant human females. , and is born as a chimera mouse. The obtained transgene mouse ( Cells with large transgene/homologous targeting constructs The progeny were then backcrossed and the tail biopsies of the progeny were tested for DNA by PCR or Southern Protein. analysis (thus determining the presence of transgenes and/or YAC sequences) The transgene/homologous targeting construct was Identify heterozygotes in genetic mice. By performing appropriate crossbreeding, Multiple large transgene/homologous recombination constructs and possibly different I One transgene encoding a D-homologous protein (one transgene homozygous physical fitness of non-human animals (can be produced; such transgenic humans Animals are a satisfactory experimental model for various diseases associated with transferred transgenes. It is le.

ある種の研究を行うためには、ヒトＡＰＰ配列を有しかつ発現するトランスジェ ニックラットが好ましいであろう。For certain types of research, transgenic cells containing and expressing human APP sequences may be used. Nick rats would be preferred.

毒性レベル、最適ＤＮＡ　：脂質比等を決定するための試行実験を、ｐＵＣ中の ２ｋｂ　ＰＧＫｎｅｏカセットを用いて、及びｐＹＰＰＮ　（無動原体腕中の５ Ｖ４０−ｎｅｏカセットの代りにＰ　Ｇ　Ｋ　ｎ　ｅ○カセ・ノドを含んで０る 修飾されたｐＹＡＣｎｅｏ）を用いて行なった。Trial experiments were conducted to determine the toxicity level, optimal DNA:lipid ratio, etc. using a 2 kb PGKneo cassette and pYPPN (5 kb in the acentric arm Contains PGKn e○ case and throat instead of V40-neo cassette. The experiment was carried out using modified pYACneo).

これらの検量実験に用いたＹＡＣは、８５ｋｂのヒトＴｇＨ遺伝子フラグメント が、修飾されたｐＹＡＣｎｅｏベクター（クローニング部位をＥｃｏＲＩ　−＞ Ｎｏ　ｔｌに変更）中にクローン化されたものであった。従って、ＹＡＣｌｉ、 ベクター腕を含む１００ｋｂ長であった。The YAC used in these calibration experiments was an 85 kb human TgH gene fragment. is a modified pYACneo vector (cloning site EcoRI-> It was cloned during the period (changed to Notl). Therefore, YACli, It was 100 kb long, including the vector arm.

Ｄ　ＯＴ　ＭＡ　（ＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎＳＢ　ＲＬ、　ＢｅｔｈｅｓｄａＳＭ Ｄ）及びＤ　ＯＧ　Ｓ　（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ、　ＰｒｏＭｅｇａ、　）ｌ ａｄｉｓｏｎ、　Ｗ　Ｉ　）をカチオン性脂質としてテストした。図１に、コリ ポフエクション複合体を形成するために用いることができる代表的な、カチオン 性脂質の化学構造を示す。ＥＳ細胞毒性カーブ１よ、それぞれについて行なわれ た。毒性効果は、ＤＯＴＭＡでは、３０ｇｇ／ｍｌのレベルで見られた。ＤＯＧ Ｓは、６０ｊｇ／ｍｌのレベルで毒性効果を示さなかった。D OT MA (LipofectinSB RL, BethesdaSM D) and D OG S (Transfectam, ProMega,)l adison, WI) was tested as a cationic lipid. In Figure 1, Cori Typical cations that can be used to form pofection complexes shows the chemical structure of sex lipids. ES cytotoxicity curve 1, performed for each Ta. Toxic effects were seen with DOTMA at a level of 30 gg/ml. DOG S showed no toxic effects at a level of 60 jg/ml.

最適ＤＮＡ　：脂質比は、受容体としてｐＧＫｎｅｏを用いて両方の脂質につい て決定した。ＤＯＴＭＡ及びＤＯＧＳの最適値は、それぞれ１：１０及び１：５ ０（ＤＮＡ：脂質、重量二重量）であった。The optimal DNA:lipid ratio was determined for both lipids using pGKneo as the acceptor. It was decided that The optimal values of DOTMA and DOGS are 1:10 and 1:5, respectively. 0 (DNA:lipid, weight double amount).

それぞれの脂質について最適ＥＳ細胞数を決定した。最適温置時間及び条件を決 定した（どれ位の長さ及びいかなる緩衝液中が、両方のＤＮＡ　：脂質複合体に ついて最高のトランスフェクションを与えるか）。試行実験によると、無血清Ｄ ＭＥＭ中に、３７℃にて、３〜４時間ＤＮＡ　：　Ｄ。The optimal ES cell number was determined for each lipid. Determine the optimal incubation time and conditions. determined (how long and in what buffer should both DNA:lipid complexes (which gives the best transfection results). According to trial experiments, serum-free D DNA: D in MEM at 37°C for 3-4 hours.

ＧＳの１：５０の混合液とともに、温室した３〜５ＸＩＱ６のＥＳ細胞が、トラ ンスフェクシントの最大数を生じることが示された。これらの条件を、日常実験 的に、ＹＡＣリボフエクション実験のために用いた。Greenhoused 3-5XIQ6 ES cells were incubated with a 1:50 mixture of GS. was shown to produce the greatest number of transfectants. These conditions are used in daily experiments. was used for YAC ribofection experiments.

コリボフエクション手順において、ＰＧＫｎｅｏカセット、ｅｅｍ又はｐＹＰＮ Ｎのいずれかを有する連結されていないプラスミドにより、ｎｅｏ　が提供され た。ＤＮＡ　ニブラスミドモル比は、１４〜１：２０の間を変化した。キャリア ーＤＮＡ　（剪断されたニシン***）の等重量をまた添加した。In the colibofection procedure, the PGKneo cassette, eem or pYPN Neo is provided by an unligated plasmid with either N Ta. The DNA to niblasmid molar ratio varied between 14 and 1:20. career -An equal weight of DNA (sheared herring sperm) was also added.

酵母ブロックを、０．６７％低融点アガロース中にて、３，５×１０９細胞／ｍ ｌに調製した。ＹＡＣをＰＦＧＥによって単離した。外側のレーンをＥｔＢｒを 用いて染色し、染色されていない部分と並べた。ＹＡＣを含む薄い切片を、プレ イン（ｂｒａｉｎ）ナイフを用いて分離した。約１ｐｇのＹＡＣが、約１０ｍ１ のゲルから回収された。ゲルを、多量のゲラーゼ緩衝液（４０℃１Ｍ　ｂｉｓ４ ｒｉｓ　ｐＨ６，０，１＠麗ＥＤＴ＾、４０ｍＭ　ＮａＣ１）中で洗い、７０℃ で溶融し、４０℃に冷却し、そして、ＩＯＵのゲラーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ　 Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、　Ｍａｄｉｓｏｎ、　ＷＩ）とともに１晩温置した 。Yeast blocks were grown at 3,5 x 109 cells/m in 0.67% low melting point agarose. It was prepared to l. YACs were isolated by PFGE. EtBr on the outside lane The cells were stained with the same dye and lined up with the unstained parts. Thin sections containing YAC are pre-prepared. Separation was performed using a brain knife. Approximately 1 pg of YAC is approximately 10 m1 was recovered from the gel. The gel was soaked in a large amount of gelase buffer (40°C, 1M bis4 Wash in ris pH 6,0,1 @Rei EDT^, 40mM NaCl) and store at 70°C. Melt at 40°C, cool to 40°C, and add IOU of gelase (Epicentre Technologies, Madison, WI) overnight. .

消化後、ｐＹＰＮＮ又はピセンター（ｐｉｃｅｎｔｅｒ）を、典型的なモル比１ ：４（ＹＡＣニブラスミド）で加えた。当重量の剪断されたニシン***ＤＮＡを キャリアーとして添加した。約１１００ＩＩのＹＡＣを含んでいるアガロース消 化混合物を、すぐに、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍを用いて、最適ＤＮＡ　：脂質比 にて、３０分間、室温で温室した。ポリアミンは、添加しなかった。After digestion, pYPNN or picenter was prepared in a typical molar ratio of 1 :4 (YAC Niblasmid). Equal weight of sheared herring sperm DNA Added as a carrier. Agarose quencher containing about 1100 II YAC Immediately convert the mixture using Transfectam to the optimal DNA:lipid ratio. The cells were incubated for 30 minutes at room temperature in a greenhouse. No polyamine was added.

ＥＳ細胞を洗浄し、トリプシン処理し、そして無血清ＤＭＥＭ中に再懸濁した。ES cells were washed, trypsinized, and resuspended in serum-free DMEM.

３Ｘ１０６のＥＳ細胞（及び約１０５の支持細胞）を含んでいる９ｍＭの細胞懸 濁液を、６０ｎｍペトリ皿（組織培養プラスチックではない）上に塗布した。約 １ｍｌのＤＮＡ−脂質混合物をＤＭＥＭ中の細胞に加えて、３７℃で３〜４時間 温置した。次いで細胞をＤＭＥＭ＋ＦＢＳ中に集め、１００ｍｍ組織培養皿当た り１０６で塗布した。０４１８選択を２４時間後に行い、約１０日後にコロニー をつった。9mM cell suspension containing 3X106 ES cells (and approximately 105 feeder cells) The suspension was plated onto 60 nm Petri dishes (not tissue culture plastic). about Add 1 ml of DNA-lipid mixture to cells in DMEM for 3-4 hours at 37°C. Incubated. Cells were then collected in DMEM+FBS and plated in a 100 mm tissue culture dish. It was coated with 106 ml. 0418 selection was performed 24 hours later, and colonies were grown after approximately 10 days. I picked it up.

典型的には、１〜２１１ｇのＹＡＣを実験毎に用いた。従って、約１０〜２０の 別々のりボフエクションを、１回の日程で行った。一般に、数百の６４１８耐性 クローンがつりあげられ、それらの少なくとも１〜２％は特定のＹＡＣ由未配列 を含んでいた。これらのうち、約１０％が、全ＹＡＣ挿入をカバーしているプロ ーブを用いた微細構造サザンブロツティング、ＰＦＧＥサザン分析及びＰＣＲ分 析によると、無傷のＹＡＣを有していた。Typically, 1-211 g of YAC was used per experiment. Therefore, about 10-20 Separate Noribo exhibitions were held on one day. Generally, hundreds of 6418-resistant Clones are picked and at least 1-2% of them have a specific YAC origin sequence. It contained. Of these, approximately 10% are programs that cover all YAC insertions. Microstructural Southern blotting using a probe, PFGE Southern analysis, and PCR analysis Analysis showed that it had intact YAC.

実施例２ ヒトアミロイド前駆タンパク質をエンコードするＹＡＣを有するマウスの製造 ＡＰＰ　ＹＡＣＤＮＡの調製、完全な長さのＡＰＰ遺伝子を含む６５０ｋｂのヒ トゲノムフラグメントを、Ｙａｓｈｉｎｇｔ。Example 2 Production of mice with YACs encoding human amyloid precursor protein Preparation of APP YAC DNA, a 650 kb human gene containing the full length APP gene. The genome fragment was prepared by Yashingt.

ｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｙ　Ａ　Ｃライブライ−（Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　 Ｇｅｎｅｔｉｃｓｉｎ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　Ｌｉｂｒａｒｉａｎ、　Ｙａｓｈｉ ｒ＋ｇｔｏｎ　Ｌｌｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　５ｃｈｏｏｌｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ 、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　Ｍｉｓｓｏｕｒｉから入手）から酵母宿主株（クロ ーン＃Ｂ１４２Ｆ９）中の酵母人工染色体（ＹＡＣ）として単離した。酵母株を 、ＡＨＣ培地中で後期対数期まで生育し、０．６７％の低融点アガロース（Ｓｅ ａＰｌａｑｕｅ、　ＦＭＣＣｏｒｐ、　）中に３．５ｘ　１０”　ｃｅｌｌｓ／ ｉｌｌ：　テ懸１５Ｌ、ソシテ、フロック形成器（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）中にて冷却 した。無傷の酵母染色体ＤＮＡを以下のようにして調製した。３０の２５ｈｌの Ｂ１４２Ｆ９細胞のブロックを、５０ｍ１のＹ　Ｓ　Ｓ　（Ｙ　Ｓ　Ｓ　；　４ ｍｇ／ｍｌ　Ｎｏｖｏｚｙｍｅ　２３４（Ｎｏｖｏ　Ｎｏｒｄｉｓｋ）、Ｉ　Ｍ ソルビトール、１００ｍ１ｌ　ＥＤＴＡ、　５０ｍＭ　リン酸カリウム、ｐＨ１ ５，５）を含む１５０ｍ１のペトリ皿中で、３７℃で、３０分間ぐるぐるかき混 ぜた。ブロックを、Ｔ　Ｅ　（ＩＯＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ７，５，１ｍＭ　ＥＤＴ Ａ）中で１回洗い、５０ｍ１のＬＤＳ　（ＬＤＳ・１％リチウムドデシルスルフ ェート、１％サルコンル、１００ｍＭ　ＥＤＴＡ）中で、３０〜６０分間、３７ ℃でぐるぐるかき混ぜた。ＬＤＳを５０ｍ１の滅菌ピペットで除き、そしてブロ ックを、新鮮な、ＬＤＳ５０１１１中で、１晩ぐるぐるかき混ぜた。ブロックを 数回５０１Ｍ　ＥＤＴＡ中でさっと洗い、５０ｍＭ　ＥＤＴＡ中に４℃で保存し た。調製したブロックの１００μｌの部分を、０．２５倍のＴＢＥ中の１％低融 点アガロースの各ウェル（１４Ｘ　２５ｃｍＣＨＥ　Ｆゲル、１０ウエルゲル櫛 、Ｂｉｏ・［ｉ。n University Y A C Live Live (Center for Geneticsin Medicine Librarian, Yashi r+gton Llniversity 5choolof Medicine , St. Louis, Missouri) to a yeast host strain (Clo. It was isolated as a yeast artificial chromosome (YAC) in the cell strain #B142F9). yeast strain , grown to late logarithmic phase in AHC medium, grown on 0.67% low melting point agarose (Se aPlaque, FMCCorp, ) 3.5x 10” cells/ ill: Hang 15L, cool in flocculation machine (Bio-Rad) did. Intact yeast chromosomal DNA was prepared as follows. 30 25hl A block of B142F9 cells was added to 50 ml of YSS (YSS; 4 mg/ml Novozyme 234 (Novo Nordisk), IM Sorbitol, 100ml EDTA, 50mM potassium phosphate, pH 1 Stir the mixture for 30 minutes at 37℃ in a 150ml Petri dish containing 5,5). Zeta. Block the block with TE (IOM Tris pH 7, 5, 1mM EDT) A) Wash once in 50ml of LDS (LDS・1% lithium dodecyl sulfate) for 30-60 minutes, 37 Stir at ℃. Remove the LDS with a 50 ml sterile pipette and The stock was stirred overnight in fresh LDS50111. block Wash briefly in 501M EDTA several times and store in 50mM EDTA at 4°C. Ta. A 100 μl aliquot of the prepared block was added to a 1% low-melt solution in 0.25x TBE. Point each well of agarose (14X 25cm CHE F gel, 10 well gel comb , Bio・[i.

ｄ）にのせた。酵母染色体をパルス場ゲル電気泳動（ＣＨＥ　Ｆ　−Ｄ　ＲＩ　 ＬＳＢｉｏＲａｄ）によってスイッチ時間６０分、２００Ｖ、　１４℃、４８時 間の条件にて、分離した。ゲルの先端のレーンを除き、０．５ｐｇ／ｍｌの臭化 エチジウム中にて２時間染色し、ＵＶｌ−ランスミツターで分離された染色体を 見えるようにした。これらの条件下で、６５０ｋｂのＹＡＣが、最も近い内在性 酵母染色体から３〜５＋Ｉｎの距離で分離された。d). Yeast chromosomes were subjected to pulse field gel electrophoresis (CHEF-DRI) LSBioRad) switch time 60 minutes, 200V, 14℃, 48 hours Separation occurred under conditions between the two. Except for the front lane of the gel, 0.5 pg/ml bromide Chromosomes were stained in ethidium for 2 hours and separated using a UVl-transmitter. I made it visible. Under these conditions, the 650 kb YAC is the closest endogenous It was separated from the yeast chromosome by a distance of 3-5+In.

ゲルの部分に刻み目をつけて、６５０ｋｂのＹＡＣの位置を示し、そして、それ らの部分をゲルの残りと再び並べた。６５０ｋｂのＹＡＣを含んでいるゲルの２ ｍＭ巾のスライスを、プレインナイフ（Ｒｏｂｏｚ　Ｓｕｒｇｉｃａｌ　Ｉｎ５ ｔｒｕｉｎｅｔ　Ｃｏ）を用いて単離し、５０ｎ＋ｊｌ　ＥＤＴＡ中にて４℃に て保存した。約５μｇのＹＡＣＤＮＡが、約１０＋ａｌのゲル中に単離された。Mark a section of gel to indicate the position of the 650 kb YAC, and These sections were re-aligned with the rest of the gel. 2 of the gel containing a 650 kb YAC. Slice mm width with a plain knife (Roboz Surgical In5 truninet Co) and incubated in 50n+jl EDTA at 4°C. I saved it. Approximately 5 μg of YAC DNA was isolated in approximately 10+ al gel.

ＹＡＣＤＮＡを含むアガローススライスを、ゲラーゼ緩衝液（４０ｍＭ　ｂｉｓ −Ｔｒｉｓ　ｐＨ６，０，１ｍＭ　ＥＤＴＡ、　４（ｌｎＭ　ＮａＣ１）中にて 平衡化し、完全に溶液となるまで７０℃で２０分間溶融し、そして４５℃まで冷 却した。ゲラーゼ（２５Ｕ　５Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ 、　Ｍａｄｉｓｏｎ、　ＩＩＩ　）を加え、溶融されたアガロース混合液を４５ ℃で９０分間温温置て、ＤＮＡ−アガロース混合物を液化した。Agarose slices containing YAC DNA were soaked in gelase buffer (40mM bis - in Tris pH 6, 0, 1mM EDTA, 4 (lnM NaCl) Equilibrate and melt at 70°C for 20 minutes until completely in solution, then cool to 45°C. Rejected. Gelase (25U 5Epicentre Technologies , Madison, III) and add the melted agarose mixture to 45 The DNA-agarose mixture was liquefied by incubation at 0C for 90 minutes.

ＡＰＰ　ＹＡＣのＥＳ細胞中への導入 胚幹細胞（ＡＢ−１）をＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理し、そして無血清ＥＳ 培地（ＤＭＥＭ、　１倍量のグルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシン、１ １１Ｍ２−メルカプトエタノール、１倍量のＮＥＡＡ）中に懸濁した。９ｍｌの 無血清ＥＳ細胞懸濁液中の約５Ｘ１０６細胞を６０％ｍのペトリ（組織培養処理 をしていない）皿のそれぞれに塗布した。選択マーカー　（Ｐ（ＪｎｅｏＡ＋Ｒ 、ネオマイシン耐性遺伝子に融合したＰ（Ｊプロモーターを含む、Ｒｕｄｎｉｃ ｋｉら、１９８８年、Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、、第８巻、第４０６頁 、Ｒｕｄｎｉｃｋｉら、１９８９年、Ｂｉｏｃｈｅｍ。Introduction of APP YAC into ES cells Embryonic stem cells (AB-1) were washed with PBS, trypsinized, and serum-free ES Medium (DMEM, 1 volume of glutamine, penicillin/streptomycin, 1 11M 2-mercaptoethanol, 1 volume of NEAA). 9ml Approximately 5X106 cells in serum-free ES cell suspension were cultured in 60% m Petri (tissue culture treated (not applied) to each of the dishes. Selection marker (P(JneoA+R , P(J promoter fused to the neomycin resistance gene, Rudnic ki et al., 1988, Mo1. Ce11. Biol, Volume 8, Page 406 , Rudnicki et al., 1989, Biochem.

Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、、第６７巻、第５９０頁、これらは引用することにより 本明細書の一部である）を含む直線化したプラスミドを、１ｍｌのゲラーゼ処理 したＹＡＣＤＮＡに、２．１（プラスミド・ＹＡＣ）のモルにて加えた。カチオ ン性脂質（丁ｒａｎｓｆｅｃｔａｎ、　ＰｒｏＭｅｇａ、　Ｍａｄｉｓｏｎ、　 ＴＩ　）を、５０：１　（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ　：　Ｄ　Ｎ　Ａ　）の重量 １重量比にて加え、混合液を穏やかに一回ひっくり返して混合し、そして室温に て約３０分間温室した。次いでＤＮＡ　：脂質混合液のｌｌ１ｌを、それぞれＥ Ｓ細胞の６０ｍｍの皿に加え、３７℃の００２インキユベーター中にて４時間温 室した。次いで、細胞を滅菌した２５０１１１のボトルに移し、等体積のＥＳ培 地（上記と同じ、但し１５％のウシ胎児血清を含んでいる）を加えた。細胞を穏 やかなピペッティングで皿から取り出し、１５％のウシ胎児血清を含む等体積の ＥＳ培地と合わせた。この細胞懸濁液を、１５１１１ずつ、有糸***活性を有さ ない５ＮＬ７６／７繊維芽細胞の支持細胞（ｌｌｃＭａｈｏｎ　（！：　Ｂｒａ ｄｌｅｙ　、１９９０年、囲、第６２巻、第１０７３頁、これは引用することに より本明細書の一部である）を含んだ１００■の組織培養プレートに移し、そし て組織培養インキュベーターに戻し２４時間装いた。２４時間後、培地を、１０ ％ウシ胎児血清及び４００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＥＳ培地に代えた。４８ 時間ごとに培地を代えた。Ce11. Biol, vol. 67, p. 590, these are cited by reference. 1 ml of gelase treatment. It was added to the prepared YAC DNA at a mole of 2.1 (plasmid/YAC). Catio transfectan, ProMega, Madison, TI) to 50:1 (Transfectam:DNA) weight 1 weight ratio, mix by gently inverting the mixture once, and bring to room temperature. and kept in the greenhouse for about 30 minutes. Next, 1111 of the DNA:lipid mixture was added to E Add S cells to a 60 mm dish and incubate for 4 hours in a 002 incubator at 37°C. I left the room. The cells were then transferred to a sterile 250111 bottle and added with an equal volume of ES medium. (same as above, but containing 15% fetal bovine serum) was added. calm the cells Remove from the dish by gentle pipetting and add an equal volume containing 15% fetal bovine serum. Combined with ES medium. This cell suspension was divided into 15111 cells each having mitotic activity. No 5NL76/7 fibroblast supporting cells (llcMahon (!: Bra dley, 1990, Volume 62, p. 1073, which is quoted here. (herein incorporated by reference) into a 100 μg tissue culture plate containing The cells were then returned to the tissue culture incubator for 24 hours. After 24 hours, the medium was divided into 10 % fetal bovine serum and 400 μg/ml G418. 48 The medium was changed every hour.

７日後に、全部で３６６の０４１８耐性コロニーが測定された。２４０コロニー のそれぞれを、別々に、０．２５％のトリプシンの入った、カルシウム無し一マ グネシウム無しＰＢＳの５０μｌを含む９６ウエルマイクロタイターデイシユの ウェルに移した。１５分後、血清を含む培地を５０μｌ加え、粉砕によりコロニ ーを解離した。そして、細胞懸濁液を、培地及び支持細胞（上記）を含む９６ウ エルプレートに重複して移した。４〜５日後、１連のディシュを慣用の方法に従 って凍結した（　Ｒａｍ１ｒｅｚ−３ｏｉ　ｌｉｓら、Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｔｅ ｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｉｎ　Ｍｏｕｓｅ　Ｄｅｖｅｌｏｐｅｎｅｎｔ　、　１９９ ２年、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｊ、ｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ。A total of 366 0418-resistant colonies were determined after 7 days. 240 colonies Separately, each of in a 96-well microtiter dish containing 50 μl of PBS without magnesium. Transferred to well. After 15 minutes, add 50 μl of serum-containing medium and crush the colonies. - dissociated. The cell suspension was then transferred to 96 cells containing medium and feeder cells (described above). Duplicate transfers were made to El Plate. After 4-5 days, remove one series of dishes according to conventional methods. (Ram1rez-3oilis et al., Guide to Te chniques in Mouse Developent, 199 2nd year, Methods j, n Enzymology.

これは引用することによ本明細書の一部である）。細胞を、５０μｌのトリプシ ン中で解離し、５０μｌの凍培地（２０％ＤＭＳｏ、　２０％ウシ飴児血清を含 むＤＭＥＭ）と混合した。１００μｍの滅菌シリコーン油を、それぞれのウェル 中の細胞懸濁液の上に重層し、そしてプレートを、５ｔｙｒｏｆｏａｎコンテナ 中に置き、−８０℃で凍結した。(which is incorporated herein by reference). Cells were treated with 50 μl of trypsin. Dissociate in a tube and add 50 μl of freezing medium (containing 20% DMSo, 20% bovine baby serum). DMEM). Add 100 μm of sterile silicone oil to each well. layer on top of the cell suspension in a 5 tyrofoan container. and frozen at -80°C.

ＡＰＰ配列を含むＥＳクローンの同定 リボフェクタントＥＳクローンを含む他の一連のマイクロタイターディシュを、 ＰＣＲ分析のためのＤＮＡを調製するために用いた。５０μｌの溶解緩衝液（５ ０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ８゜０、２００ｍＭ　ＮａＣ１，２５ｍＭ　ＥＤＴＡ、 　０．２％ＳＤＳ、１ｍｇ／ｍｌ　プロティンキナーゼＫ）をそれぞれのウェル に加えた（　Ｒａｍ１ｒｅｚ−３゜ｌｉｓ　ら、１９９２年、Ａｎａｌ、　Ｂｉ ｏｃｈｅｍ、、第２０１巻、第３３１頁、これは引用することにより本明細書の 一部である）。−晩５５℃で温室後、それぞれのウェルに５μｌの２．５Ｍ　Ｎ ａＣ１及び９５μｍの１００％エタノールを加えた。ディシュを穏やかに室温で ６０分間ぐるぐると回してＤＮＡを沈降させた。次いで、ウェルを５回、７０％ エタノールでさっと洗い、そして３７℃で乾燥させた。ＤＮＡを、加湿インキュ ベーター中で、３７℃にて、１００　μｍのＨ２０に、−晩かけて、再び懸濁し た。Identification of ES clones containing APP sequences A series of other microtiter dishes containing ribofectant ES clones Used to prepare DNA for PCR analysis. 50 μl lysis buffer (50 μl) 0mM Tris pH 8°0, 200mM NaCl, 25mM EDTA, Add 0.2% SDS, 1mg/ml protein kinase K) to each well. (Ram1rez-3°lis et al., 1992, Anal, Bi ochem, Volume 201, Page 331, which is incorporated herein by reference. (partially). - 5 μl of 2.5 M N in each well after the night in a greenhouse at 55°C. aC1 and 95 μM of 100% ethanol were added. Warm the dish gently at room temperature. The DNA was precipitated by spinning for 60 minutes. The wells were then diluted 5 times to 70% It was washed briefly with ethanol and dried at 37°C. DNA in a humidified incubator Resuspend overnight in 100 μm H20 at 37°C in a beta Ta.

個々のＤＮＡ試料を、ＰＣＲのために、縦及び横について集め（図２）、そして 集めたもの（プール）を、以下のプライマーを用いてＰＣＲによりＡＰＰ配列に ついて分析した（　Ｆｉｄａｎｉら、Ｈｕｍａｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎ ｅｔｉｃｓ、第１巻、第１６５〜１６８頁、１９９２年の方法を改変した）。Individual DNA samples were collected vertically and horizontally for PCR (Figure 2), and The collected material (pool) was converted into APP sequence by PCR using the following primers. (Fidani et al., Human Molecular Gen 1, pp. 165-168, 1992).

ＡＰ　Ｐ−ＰＡ　：　５’−ＧＣＴ　ＴＴＴ　ＧＡＣＧＴＴ　ＧＧＧ　ＧＧＴ　 ＴＡ−３’ＡＰＰ−ＰＢ２・　５°−ＴＴＣＧＴＧ　ＡＡＣＡＧＴ　ＧＧＧ　Ａ ＧＧ　ＧＡ−３’ＡＰＰ−１７Ａ：　５°−ＡＴＡ　ＡＣＣＴＣＡ　ＴＣＣＡＡ Ａ　ＴＧＴ　ＣＣＣＣ−３′ ＡＰＰ−１７８：　５’−ＧＴＡ　ＡＣＣＣＡＡ　ＧＣＡ　ＴＣＡ　ＴＧＧ　Ａ ＡＧ　Ｃ−３゜ ＡＰＰ−ＰＡ／ＰＢ２は、ヒトＡＰＰ遺伝子のプロモーター領域に特異的なプラ イマーを表し、ＡＰＰ７Ａ／７Ｂは、エキラン７に特異的であり、ＡＰＰ１７Ａ ／１７Ｂはエキラン１７に特異的である。AP P-PA: 5’-GCT TTT GACGTT GGG GGT TA-3'APP-PB2・5°-TTCGTG AACAGT GGG A GG GA-3'APP-17A: 5°-ATA ACCTCA TCCAA A TGT CCCC-3' APP-178: 5'-GTA ACCCAA GCA TCA TGG A AG　C-3゜ APP-PA/PB2 is a protein specific to the promoter region of the human APP gene. APP7A/7B is specific for Echilan 7 and APP17A /17B is specific for Echilan-17.

−ｊ−ルのＰｃＲ分析は、４２クローンがプロモーター及びエキフン１フ配列を 共に有している可能性を示した（図３）。４２クロ一ン個々のＰＣＲ分析により 、６クローン（番号２３．２４．１７６、２１３．２１９．２３０　）がプロモ ーター及びエキフン１フ配列を共に有していることが示された（図４）。PcR analysis of -j-le revealed that 42 clones contained the promoter and exfun1 sequence. This shows the possibility that both of them have the same effect (Fig. 3). By individual PCR analysis of 42 clones. , 6 clones (numbers 23.24.176, 213.219.230) are promoted It was shown that it has both the ter and exfun1 sequences (Fig. 4).

これらのクローンは培養により増やされ、そしてバイアル中にて液体窒素中で凍 結された。これらの細胞を、ＰＦＧＥ分析のためにアガロースブロック中に充填 し、そしてＲＮＡ単離のために収集した。These clones are expanded by culture and frozen in liquid nitrogen in vials. tied. These cells were loaded into agarose blocks for PFGE analysis. and collected for RNA isolation.

ＡＰＰ配列を含むＥＳクローンの構造分析ＥＳクローンにより運ばれたＡＰＰ　 ＹＡＣの組み込み率は、まず以下に示すレアカッター（ｒａｒｅ　ｃｕｔｔｅｒ 　）フィンガープリント技術を用いて推定された。ヒトＤＮＡを鍼灸に切断しな い制限酵素をヒトａｌｕフラグメントプローブに対合するフラグメントのパター ンを決定するために用いた。レアカッターは、しばしば、ジヌクレオチドＣｐＧ を含んでおり、哺乳動物細胞はしばしばＣｐＧジヌクレオチドをメチル化するこ とにより、それらを含む殆どの制限部位を消化に対して耐性にする。しかしなが ら、酵母細胞は、ＣｐＧをメチル化できない。従って、所与のフラグメント中の ＣｐＧを含む制限部位のパターンは、酵母中又は哺乳動物細胞中のいずれかでフ ラグメントがＹＡＣとして増殖されるかに依存する。従って、認識配列中にＣｐ Ｇがないレアカッターのみが、ＹＡＣからのａｌｕ含有フラグメントの消化パタ ーンを作るために用いられる。Structural analysis of ES clones containing APP sequences APP carried by ES clones The YAC incorporation rate is first determined by the rare cutter shown below. ) Estimated using fingerprint technology. Do not cut human DNA with acupuncture Fragment pattern for pairing a restriction enzyme with a human alu fragment probe was used to determine the Rare cutters are often dinucleotide CpG contain CpG dinucleotides, and mammalian cells often methylate CpG dinucleotides. This makes most restriction sites containing them resistant to digestion. But long Yeast cells cannot methylate CpGs. Therefore, in a given fragment CpG-containing restriction site patterns can be found in either yeast or mammalian cells. It depends on whether the fragment is propagated as a YAC. Therefore, Cp in the recognition sequence Only the rare cutter lacking G shows the digestion pattern of alu-containing fragments from YAC. used to create a tone.

Ｂ１４２Ｆ９アガロースブロツクを、制限酵素Ｓｆｉ　Ｉ　、Ｐａｃ　Ｉ、Ｓｖ ａ　Ｉ　、　Ｐｉｅ　Ｉ及びＡｐａ　Ｉを用いて完全に消化し、Ａｌｕフラグメ ントに対するプローブとして全ヒトＤＮＡを用いてＰＦＧＥサザンブロッティン グにより分析した（図５）。B142F9 agarose block was treated with restriction enzymes Sfi I, Pac I, Sv a I, Pie I and Apa I to complete digestion and Alu fragment PFGE Southern blotting using total human DNA as a probe for (Figure 5).

Ｓｆｉ　Ｉ消化によって生じたバンドのパターンは、３０ｋｂ〜２２０ｋｂの間 に均一に分布するバンドを生じるので、参照パターンとして用いた。もしＹＡＣ が、ＥＳ細胞中に無傷で組み込まれていれば、Ｓｆｉ　Ｉ消化は、末端フラグメ ントを除いて、同様のバンドのパターンを生じると期待される。末端フラグメン トは、Ｓｆｉ　Ｉ消化物をｐＢＲ３２２をプローブとして再び調べることにより 容易に同定されつる。この場合は、フラグメントの完全なセットが部分的消化マ ツピングにより配列される。要約すれば、Ｂ１４２Ｆ９ブロツクは、一連の範囲 のＳｆｉ　Ｉ濃度で消化され、ＰＦＧＥで分離され、そしてｐＢＲ３２２の２． ５ｋｂ　（ｔｒｐ腕特異的）又は１．６ｋｂ　（ｕｒａ腕特異的）　ＢａｍＥ　 Ｉ−Ｐｖｕｎラグメントでプローブして探査される。The band pattern generated by Sfi I digestion is between 30 kb and 220 kb. It was used as a reference pattern because it produced a uniformly distributed band. If YAC is integrated intact into the ES cells, SfiI digestion will remove the terminal fragment. is expected to produce a similar pattern of bands, with the exception of the terminal fragment By reexamining the Sfi I digest using pBR322 as a probe, Easily identified vine. In this case, the complete set of fragments is Arranged by tuping. In summary, the B142F9 block has a range of pBR322 was digested with an SfiI concentration of 2. 5kb (trp arm specific) or 1.6kb (ura arm specific) BamE probed with the I-Pvun fragment.

従って、部分的消化の特定のレベルにおいて、バンドの梯子が生じた。それぞれ のバンドは、隣接するＳｆｉ　Ｉ部位への距離により、最近傍のものと異なる。Thus, at certain levels of partial digestion, a ladder of bands occurred. Each The band differs from its nearest neighbor by its distance to the adjacent Sfi I site.

６のＥＳ細胞系統を、Ｓｆｉ　Ｉにより完全に消化し、非常に厳しい条件下で、 全ヒトＤＮＡをプローブとして探査した。６の系統の内、たった３つ（２４，１ ７６，２３０）が、ＡＰＰ　ＹＡＣからの参照パターンに一致するバンドのパタ ーンを示した。レアカッターフィンガープリント方法は、ＹＡＣ中にクローン化 されたフラグメントの配列が判らな（とも良いので、ヒトＤＮＡを含むいずれの ＹＡＣの分析にも適用できる。更に、標的哺乳動物細胞系統中に見いだされない 他の種からの繰り返し因子を探査するのであれば、この方法は他の哺乳動物細胞 系統中に他の外来ＤＮＡを含んだＹＡＣの構造を分析するために用いられうる。The 6 ES cell line was completely digested with SfiI under very harsh conditions. Total human DNA was probed as a probe. Only 3 out of 6 lineages (24, 1 76, 230) is the band pattern that matches the reference pattern from APP YAC. showed the tone. Rare cutter fingerprint method cloned into YAC The sequence of the resulting fragment is unknown It can also be applied to YAC analysis. Furthermore, it is not found in the target mammalian cell line. If you want to explore repeat elements from other species, this method can be used in other mammalian cells. It can be used to analyze the structure of YACs that contain other foreign DNA in their lineages.

ＡＰＰ　ＹＡＣを含んだＥＳクローンの転写分析６のＥＳ系統を、ＰＣＨにより 転写について分析した。Transcription analysis of ES clones containing APP YAC The 6 ES line was analyzed by PCH. Transcription was analyzed.

全ＲＮＡを標準グアニジンイソチオシアネート／塩化リチウム法（５ａｎｂｒＯ Ｏｋら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　）により、それぞれの細胞系統 から調製した。相補的ＤＮＡをオリゴ−ｄＴプライマーを用いて調製し、そして ｃ　ＤＮＡを、ＰＣＲにより、以下に描いたエキタン６及びエキラン９由来のＰ ＣＲプライマーを用いてヒトＡＰＰ遺伝子のスプライス生成物について分析した （Ｇｏｌｄｅら、Ｎｅｕｒｏｎ、第４巻、第２５３〜２６７頁、１９９０を改変 ）。マウスＡＰＰ　ｃＤＮＡの不適当な増幅を排除するために、それぞれのオリ ゴマーの３′末端ヌクレオチドを、ヒトｃＤＮＡ配列に特異的であるが、マウス のｃＤＮＡ配列には一致しないように選択した。マウスＡＰＰ　ｃＤＮＡに特異 的なＰＣＲオリゴマーもまた、調製した。Total RNA was purified using the standard guanidine isothiocyanate/lithium chloride method (5 anbrO Ok et al., Molecular Cloning), each cell line Prepared from. Complementary DNA was prepared using oligo-dT primers and c DNA was converted into P derived from Equilan 6 and Equilan 9 drawn below by PCR. The splice product of the human APP gene was analyzed using CR primers. (Modified from Golde et al., Neuron, Vol. 4, pp. 253-267, 1990) ). To eliminate inappropriate amplification of mouse APP cDNA, each ori- The 3' terminal nucleotide of the gomer is specific for the human cDNA sequence, but not for the mouse cDNA sequence. cDNA sequence was selected so as not to match the cDNA sequence of . Mouse APP cDNA specific Standard PCR oligomers were also prepared.

ヒトＡＰＰ特異的オリゴマー ＡＰＰ−ＨＡＳＩ・　５’　−ＣＡＧ　ＧＡＡ　ＴＴＣＣＡＣＣＡＣＡＧＡ　Ｇ ＴＣＴＧＴ　ＧＧＡ　Ａ−３゜ ＡＰＰ−ＨＡＳ２：　５°−ＣＡＧ　ＧＡＴ　ＣＣＧ　ＴＧＴ　ＣＴＣＧＡＧ　 ＡＴＡ　ＣＴＴ　ＧＴＣＡ−３’ マウスＡＰＰ特異的オリゴマー ＡＰＰ−ＭＡＳＩ・　５’　−ＣＡＧ　ＧＡＡ　ＴＴＣＣＡＣＣＡＣＴＧＡ　Ｇ ＴＣＣＧＴ　ＧＧＡ　Ｇ−３゜ ＡＰＰ−ＭＡＳ２・　５’　−ＣＡＧ　ＧＡＴ　ＣＣＧ　ＴＧＴ　ＣＴＣＣＡＧ 　ＧＴＡ　ＣＴＴ　ＧＴＣＧ−３’ クローン２４．１７６及び２３０においては、タン／＜り質の７７０．７５１及 び６９５アミノ酸の形をエンコードする交互的；こスプライスされたヒトＡＰＰ 転写物を示す予期されたＰＣＲ／＜ンドを示した（図７）。クローン２３．２１ ３及び２１９（よ、ＰＣＲで検出できる転写物を含んでいなかったので、ヒトＡ ＰＰ特異的オリゴマーがＥＳ細胞系統に対して内在性のマウスＡＰＰ転写物から のバンドを増幅しな（１ことを示す負の対照として用いられる。更に、ＲＴ−Ｐ ＣＲ分析（よ、クローン２４．１７６及び２３０が無傷のＹＡＣを含んでおり一 方クローン２３．２１３及び２１９が含まないと予測したレア力・ツタ−フィン ガープリント分析の結果を確認し、証明した。Human APP specific oligomer APP-HASI・5’-CAG GAA TTCCACCACAGA G TCTGT GGA A-3゜ APP-HAS2: 5°-CAG GAT CCG TGT CTCGAG ATA CTT GTCA-3' Mouse APP specific oligomer APP-MASI・　5’-CAG　GAA　TTCCACCACTGA　G TCCGT GGA G-3゜ APP-MAS2・5’-CAG GAT CCG TGT CTCCAG GTA CTT GTCG-3' In clones 24.176 and 230, tan/< 770.751 and and 695 amino acids; this spliced human APP The expected PCR index representing the transcript was shown (Figure 7). clone 23.21 3 and 219 (yes, human A PP-specific oligomers are derived from endogenous mouse APP transcripts to ES cell lines. This band is used as a negative control to show that the RT-P band is not amplified (1). CR analysis (Clones 24.176 and 230 contain intact YACs) A rare force predicted not to include clones 23.213 and 219: Tsutafin The results of Garprint analysis were confirmed and verified.

ＥＳ細胞中のＡＰＰ転写物の定量分析 ＲＴ−ＰＣＲ分析は定量的であるので、ＲＮａｓｅ防護は分析がＥＳ系統中の交 互的にスプライスされたヒトＡＰＰ転写物の定量のために用いられる。ＲＮａｓ ｅプローブは、ベクターｐｓＰ７２中に３１０ｋｂＲＴ　−Ｐ　ＣＲ生成物をＥ ｃｏＲｌ　−ＢａｍＢ　Ｉフラメントとしてクローニングすること（こよって作 られた（図８）。得られたプラスミド、ｐＨ１ＡＰＰ　ｉｔ、ＵｐａＩ部位で直 線化され、そしてアンチセンス転写物力＜ＳＰ６ブモーターから作られた。ＲＮ ａｓｅ防護分析は、標準方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌ ｏｎｉｎｇ）に従って行われた。Quantitative analysis of APP transcripts in ES cells Since RT-PCR analysis is quantitative, RNase protection is important because the analysis Used for quantification of reciprocally spliced human APP transcripts. RNas The e probe carries the 310 kb RT-P CR product into the vector psP72. Cloning as a coRl-BamB I fragment (thus creating (Figure 8). The obtained plasmid, pH1APPit, was directly inserted at the UpaI site. was linearized and an antisense transcript was generated from the SP6 motor. R.N. Ase protection analysis was performed using standard methods (Sambrook et al., Molecular Cl oning).

或いは、Ｓ１ヌクレア一ゼ防護分析を、転写物の定量のために用いた。ｐＨ１Ａ ＰＰは、Ｘｈｏ　Ｉ及び１ｌｐａ　Ｉで消化され、４４６ｔ）ｐのフラグメント を遊離する。二本鎖ラグメントはフレノウを用いて末端標識され、変性され、ヒ トＡＰＰ配列を有するＥＳ系統からのＲＮＡ試料に対合され、そして８１分析を 標準方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　）に従 って行われた。Alternatively, S1 nuclease protection assay was used for transcript quantification. pH1A PP was digested with XhoI and 1lpaI to produce a fragment of 446t)p. release. Double-stranded fragments were end-labeled using Flenow, denatured, and RNA samples from ES lines with the APP sequence were paired and 81 analyzed. According to standard methods (Sambrook et al., Molecular Cloning) It was held.

更に、ヒトＡＰＰタンパク質の発現は、ＥＳ細胞系統及びトランスジェニック動 物の組織からのヒトＡＰＰタンパク質に特異的な抗体を用いたヒトＡＰＰの免疫 沈降により決定されつる。このような抗体は、標準的な組織切片の免疫組織化学 分析により直接にヒトＡＰＰを検出できる。Furthermore, expression of human APP protein can be expressed in ES cell lines and transgenic animals. Immunization of human APP using antibodies specific for human APP protein from human tissues Vine determined by sedimentation. Such antibodies can be used for standard tissue section immunohistochemistry. Human APP can be directly detected by analysis.

トランスジェニックマウス中でのヒトＡＰＰ発現の分析上記の定量及び定性分析 はまた、これらのＥＳ系統由来のトランスジェニックマウスの組織中のヒトＡＰ Ｐ遺伝子の分析にも適用できる。Analysis of human APP expression in transgenic mice Quantitative and qualitative analysis as described above also showed that human AP in the tissues of transgenic mice derived from these ES lines It can also be applied to analysis of the P gene.

クローン２３．２１３及び２１９は、（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編、Ｔｅｒａｔｏｃ ａｒｃｉｎｏｍａｓ　ａｎｄ　Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅ１ｌｓ）に 記載の通りにしてキメラ始祖を作るために胚盤胞中へ注入された。始祖は、野生 型マウスへと繁殖され、ＡＰＰ　ＹＡＣを有するＦ１動物を生み出す。Clones 23.213 and 219 are available in (Robertson, ed., Teratoc arcinomas and Embryonic Stem Ce1ls) were injected into blastocysts to generate chimeric progenitors as described. The ancestor is wild type mice, producing F1 animals with APP YAC.

アルツハイマー病のマウスモデル 野生型ヒト（又はマウス）ＡＰＰタンパク質の過発現は、神経細繊維の絡み形成 、斑形成及び神経系の機能不全を含むアルツハイマー病の表現型の特徴をもたら しつる。その目的に向かって、ＡＰＰ　ＹＡＣを発現する種々のマウス系統が、 ヒトＡＰＰ遺伝子の数及びその結果の発現を増やすために交配される。Mouse model of Alzheimer's disease Overexpression of wild-type human (or mouse) APP protein induces neurofilament tangle formation. , resulting in phenotypic features of Alzheimer's disease, including plaque formation and nervous system dysfunction. Shitsuru. Towards that end, various mouse strains expressing APP YAC have been developed. Crossbred to increase the number and consequent expression of the human APP gene.

或いは、家族制アルツハイマー病（コドン　７１７：Ｖ−Ｉ、Ｆ又はＧ）及び／ 又は遺伝性のアミロイド−シスに伴う脳出血、Ｄｕｔｃｈタイプ（ｎｃｎｖ＾− Ｄ１コドン　６９３：ｇｌｕ　−ｇｉｎ　）に関連すると同定された変異は、標 準の酵母分子遺伝学技術例えば変異を含むＡＰＰ遺伝子のサブクローン化された フラグメントを有するプラスミドの挿入／取り出しを用いて、又は酵母のオリゴ ヌクレオチド指揮形質転換（ＧｕｔｈｒｉｅとＦｉｎｋＳＧｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｙ ｅａｓｔ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ａｎｄ　１ｉｏｌｅｃｕｌ ａ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）により、ＹＡＣ上に含まれるヒトＡＰＰ遺伝子に導入され つる。これらの変異したＡＰＰ遺伝子を有するＹＡＣは、上記の方法を用いてト ランスジェニックマウス中に導入されつる。他の自然存在するヒトＡＰＰ病の対 立遺伝子配列もまた用いられつる。これらは、コドン６９２　（Ａｌａ　→Ｇｌ ｙ　）　、：Ｉトン６９２　（Ｇｌｕ　→Ｇｌｎ又はＧｌｙ　）　、及びコドン ７１３　（Ａｌａ　−Ｖａｌ　）及び頁、ｉｌｕ　ｌ　Ｌａｎら、１９９２年、 Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔ、　、第１巻、第５０５頁、Ｌｅｖｙら、１９９０年 、５ｃｉｅｎｃｅ、第２４８巻、第１１２４頁、これらは引用することにより本 明細書の一部である）に記載されているその他を含むが、これらには限定されな い。Alternatively, familial Alzheimer's disease (codon 717: VI, F or G) and/or or cerebral hemorrhage associated with hereditary amyloidosis, Dutch type (ncnv^- The mutation identified as being associated with D1 codon 693:glu-gin) is Associated yeast molecular genetic techniques e.g. subcloning of the APP gene containing mutations using plasmid insertion/extraction with fragments or yeast oligos Nucleotide-directed transformation (Guthrie and FinkSGide to Y east Mo1ecular Genetics and 1iolecul a　Biology), it is introduced into the human APP gene contained on YAC. Vine. YACs with these mutated APP genes can be isolated using the above method. vines introduced into transgenic mice. Other naturally occurring human APP disease pairs Orthogenetic sequences may also be used. These are codon 692 (Ala → Gl y), :Iton692 (Glu → Gln or Gly), and codon 713 (Ala-Val) and pages, ilu l Lan et al., 1992, Nature Genet, Volume 1, Page 505, Levy et al., 1990 , 5science, Volume 248, Page 1124, which are hereby incorporated by reference. (which is part of the specification), including but not limited to: stomach.

実施例３ 酵母人工染色体中にクローン化されたヒト免疫グロブリン遺伝子を発現するトラ ンスジェニックマウスヒト重鎮免疫グロブリン遺伝子の８５ｋｂフラグメントが 、ＹＡＣとしてクローン化され、実質的に無傷の組込まれたＹＡＣを有する胚幹 細胞系列がＹＡＣ及び連結されていない選択マーカーのコリボフエクションによ り誘導された。Example 3 A tiger expressing human immunoglobulin genes cloned into a yeast artificial chromosome. An 85kb fragment of the human heavy immunoglobulin gene , an embryonic stem cloned as a YAC and with a substantially intact integrated YAC Cell lineage is determined by colibofection of YAC and unlinked selection markers. was induced.

キメラ祖先動物は、胚盤胞インジェクションにより作られ、ＹＡＣクローンにつ いてトランスジェニックな子孫が得られた。これら子孫からの血清の、ヒト重鎮 の存在についての分析は、ＹＡＣに運ばれる免疫プロプリン遺伝子フラグメント の発現を示した。酵母スフェロプラストと哺乳動物細胞との融合と違って、酵母 染色体ＤＮＡは、コリボフエクンヨン法によって導入される必要がない。なぜな ら、ＹＡＣは典型的にはまず、パルス場（フィールド）ゲル電気泳動（Ｐ　Ｆ　 Ｇ　Ｅ）のような分離法により酵母染色体から分離されるからである。ＹＡＣは 、連結されていない選択マーカープラスミドと共にコボリフエクションによりＥ Ｓ細胞中に導入された。このコボリフエクション戦略は、レトロフイテイング（ ｒｅｔｒｏｆｉｔｔｉｎｇ）ベクターが再構築される又はＹＡＣ中に組み換えら れる必要がなく、組み換え欠陥宿主中に有されるＹＡＣを用いつる点で、修飾さ れたＹＡＣのリポフェクトンと異なる。マイクロインジェクションによるアプロ ーチと対照的に、無傷のＹＡＣＤＮＡの精製における技術的ハードの故に及びマ イクロインジェクションの間にＤＮＡに与えられる高剪断力の故に、マイクロイ ンジェクションに比べてコリポフエクションによって、より大きなＹＡＣを導入 できる。更に、酵母スフェロプラストと哺乳動物細胞の融合（そこでは酵母染色 体のいくつかがＹＡＣ５°６と一体化する）と違って、酵母染色体ＤＮＡはコリ ボフエクション中で導入されない。なぜなら、ＹＡＣは初めに、パルス場ゲル電 気泳動により単離されるからである。Chimeric ancestral animals are created by blastocyst injection and are linked to YAC clones. transgenic offspring were obtained. Serum from these progeny, a human stalwart Analysis for the presence of immunopropurine gene fragments carried in YACs showed the expression of Unlike the fusion of yeast spheroplasts and mammalian cells, yeast Chromosomal DNA does not need to be introduced by the Kolibofuekyong method. Why , YACs are typically first subjected to pulsed field gel electrophoresis (PF). This is because it can be separated from yeast chromosomes by a separation method such as GE). YAC is , by cobolyfection with an unligated selection marker plasmid. introduced into S cells. This coborefaction strategy is called retrofitting ( (retrofitting) vector is reconstituted or recombined into YAC. modified in that it uses YAC present in the recombinant defective host without the need for It is different from the YAC lipofecton. Approximately by microinjection In contrast to the Due to the high shear forces imparted to the DNA during microinjection, microinjection Larger YACs are introduced by colipofection compared to injection. can. Additionally, fusion of yeast spheroplasts and mammalian cells (where yeast staining Unlike yeast (some of which are integrated with YAC5°6), yeast chromosomal DNA is Not introduced during Boffection. This is because YAC initially uses a pulsed field gel electric field. This is because it is isolated by pneumophoresis.

無傷のＹＡＣを有するＥＳ細胞の胚盤胞インジェクションにより、トランスジェ ニックマウスが作られた。ＹＡＣは、生殖細胞系列を通して無傷のまま保たれ、 ヒト重鎖抗体サブユニットがトランスジェニック子孫の血清中で検出再配置され ていないヒト免疫グロブリン重鎮座の８５ｋｂＳｐｅ！フラグメントが単離され た。ヒト重鎮免疫グロブリン（Ｈ）鎖遺伝子の８５ｋｂＳｐｅ　Ｉフラグメント は、ヒトＩｇＭ重鎖分子の正しい再配置及び発現のために必要な各因子の少なヒ ト重鎮免疫グロブリン遺伝子の８５ｋｂＳｐｅｌ制限フラグメントは、ｖ６、機 能多様性（Ｄ）セグメント、６つすべての結合（Ｊ）セグメント、及びＣμ定常 領域セグメントを５ｈｉｎら（１９９１）ＥＭＢＯＪ、第１０巻第３６４１頁） 。新鮮なヒト***を採取し、ゲノムＤＮＡが５ｔｒａｕｓｓら（１９９２）Ｍａ ｉｍ、　Ｇｅｎｏｍｅ第２巻第１５０頁）に記載されるようにアガロースブロッ ク中に調製された。サイズ選択された（５０〜１００ｋｂ）　５ｐｅｌ完全消化 物ＹＡＣライブラリーが、クローニング部位として動原体近くのＳｐｅ　１部位 を用いて、酵母宿主株ＡＢ１３８０において、ｐＹＡＣｎｅＯＲ中に調製された 。サイズ選択された（５０〜１００ｋｂ）　５ｐｅｌ完全消化物ＹＡＣライブラ リーが、ＹＡＣベクターｐＹＡＣｎｅｏＲ中に作られ、ヒトＣμに対し特異的な プローブとのコロニーハイブリダイゼーション（コロニ一対合）によりスクリー ンされた（　Ｔｒａｖｅｒら（１９８９）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ ｉ、（Ｕ、Ｓ、Ａ））第８６巻第５８９８頁）。Transfection is achieved by blastocyst injection of ES cells with intact YAC. Nick Mouse was created. YACs remain intact throughout the germline; Human heavy chain antibody subunits are rearranged and detected in the serum of transgenic progeny. 85kbSpe of human immunoglobulin heavyweight! the fragment is isolated Ta. 85kb Spe I fragment of human heavy immunoglobulin (H) chain gene It contains a small amount of each factor necessary for the correct rearrangement and expression of human IgM heavy chain molecules. The 85kb Spel restriction fragment of the heavyweight immunoglobulin gene was Diversity (D) segment, all six joining (J) segments, and Cμ constant (1991) EMBOJ, Vol. 10, p. 3641) . Fresh human semen was collected, and the genomic DNA was analyzed by Trauss et al. (1992). agarose block as described in Genome Vol. 2, p. 150). prepared during cooking. Size selected (50-100kb) 5pels completely digested The YAC library uses the Spe1 site near the centromere as a cloning site. was prepared in pYACneOR in yeast host strain AB1380 using . Size selected (50-100kb) 5pel complete digest YAC library was created in the YAC vector pYACneoR and specific for human Cμ. Screening is performed by colony hybridization (one colony pairing) with the probe. (Traver et al. (1989) Proc, Natl, Acad, Sc i, (U, S, A)) Vol. 86, p. 5898).

約１８．０００の主たる形質転換体のうち、１つの陽性クローン（Ｊｌ）が同定 された。酵母ミトコンドリアＤＮＡがしばしば、パルス場ゲル電気泳動において ＹＡＣをおおいに隠すので、ミトコンドリアＤＮＡを欠（ｒ’　ブチシト突然変 異体がＥｔＢｒ処理により選択され、Ｊｌ、３Ｐと名付けられた。１つのサブク ローン、Ｊｌ、３Ｐが３．５Ｘ１０９細胞／１でアガロースブロック中に乗せら れ、無傷の酵母染色体ＤＮＡが調製された（　Ｓｍ１ｔｈら（１９９０）Ｐｒｏ ｃ、　Ｎａｔｌ、人ｃａｄ、　Ｓｃｉ。One positive clone (Jl) was identified among approximately 18,000 main transformants. It was done. Yeast mitochondrial DNA is often analyzed in pulsed field gel electrophoresis. Since it largely hides YAC, it lacks mitochondrial DNA (r'). A variant was selected by EtBr treatment and named Jl,3P. one sub Lorne, Jl, 3P were plated in agarose block at 3.5X109 cells/1. and intact yeast chromosomal DNA was prepared (Smlth et al. (1990) Pro c, Natl, Human cad, Sci.

（Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　）第８７巻第８２４２頁）。ＹＡＣＤＮＡが、低融点の準 備したＣＨＥＦゲル（Ｂｉｏｒａｄ）から３〜４　ｍｕ輻幅ゲルスライス中単離 された。ゲルスライスは、ｂ−アガロース緩衝液中で平衡化され、７０℃で２０ 分間溶融され、４５℃に冷却され、１０単位のアガラーゼにより４５℃で一夜消 化された。(U, S, A, Volume 87, page 8242). YAC DNA has a low melting point Isolation in 3-4 mu radial width gel slices from prepared CHEF gel (Biorad) It was done. Gel slices were equilibrated in b-agarose buffer and incubated at 70 °C for 20 Melt for minutes, cool to 45°C and quench with 10 units of agarase at 45°C overnight. was made into

ＹＡＣＪｌ、３Ｐの特性づけ Ｊｌ、３Ｐインサートの信憑性が、制限マツピング及びサザン分析により決定さ れた。ｐＹＡＣｎｅｏの動原体及び無動原体腕（アーム）におけるバクテリア選 択マーカーを用いて、インサートの端をサブクーロン化した。末端フラグメント の微細構造制限分析は、領域の発表されているマツプ及び配列と完全に一致しく 　Ｆａｘら、酵母ミトコンドリア遺伝子の分析と操作、酵母遺伝学及び分子生物 学へのガイド（１９９１）Ｇｕｔｈｒｉｅ　ＣとＦｉｎｋ　Ｇ編、Ａｃａｄｅｍ ｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、サンジエゴ、カリフォールニアＨＴｏｒｄら（１９８９）　 Ｉｎｔ、　Ｉ＋ｉ＋ａｕｎｏｌ。Characterization of YACJl, 3P Jl, the authenticity of the 3P insert was determined by restriction mapping and Southern analysis. It was. Bacterial selection in centromeric and acentric arms of pYACneo The edges of the insert were subcloned using a selective marker. terminal fragment Microstructural restriction analysis of the region is in complete agreement with published maps and sequences of the region. Fax et al., Analysis and manipulation of yeast mitochondrial genes, yeast genetics and molecular biology Guide to Science (1991) Edited by Guthrie C and Fink G, Academ ic Press, San Diego, California HTord et al. (1989) Int, I+i+aunol.

第１巻第２９６頁）、ベクターアームに対するインサートのオリエンテーション を定義した。該オリエンテーションは更に、ｖＦｉ６配列のための無動原体イン サートのＰＣＲ分析、及び動原体インサートのＣμプローブとのハイブリダイゼ ーシヨン（対合）によって検証された。Ｃμ領領域サザン分析は、発表されてい るマツプ及び制限分析と一致した（　Ｈｏｆｋｅｒら、（１９８９）ＰｒｏＣ， Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（Ｕ、Ｓ、Ａ、）第８６巻第５５８７頁）。ヒト 重鎮の機能多様性セグメントは、Ｄセグメントの４倍の多形繰返しを含む３５ｋ ｂスパン中に含まれている。Ｊｌ、３ＰＹＡＣのサザン分析は、Ｄ領域の「制限 フラグメント指紋」を作り、その中でＹＡＣ中のＤ特異的バンドのすべてがヒト ゲノムＤＮＡ中に存在した。Vol. 1, p. 296), orientation of the insert relative to the vector arm defined. The orientation further includes an acentric orientation for the vFi6 sequence. PCR analysis of inserts and hybridization of centromeric inserts with Cμ probe Verified by pairing. Southern analysis of the Cμ region has not been published. map and restriction analysis (Hofker et al. (1989) ProC, Natl, Acad, Sci, (U, S, A,) Vol. 86, p. 5587). human The stalwart functional diversity segment is 35k containing four times as many polymorphic repeats as the D segment. Included in the b span. Southern analysis of Jl, 3PYAC revealed that the “restriction” of the D region A "fragment fingerprint" is created in which all the D-specific bands in YAC are human. It was present in the genomic DNA.

ＥＳ細胞中へのＪｌ、３Ｐ　ＹＡＣのコリポフエクションＪ１．３Ｐ　ＹＡＣが 、マウスＰＧＫプロモーターにより作動されるｎｅｏｒ遺伝子を有する連結され て０なｌ、１線形化されたプラスミドと共にコリポフエクションされた（Ｓｏｒ ｉａｎｏら（１９９１）Ｃｅｌｌ第６４巻第８９３頁）。Collipofection of Jl, 3P YAC into ES cells J1.3P YAC , a linked gene with the neor gene driven by the mouse PGK promoter. Colipofection was carried out with 1 linearized plasmid (Sor iano et al. (1991) Cell Vol. 64, p. 893).

選択マーカープラスミド プラスミドは、マウスホスホグリセラードキナーゼ−１プロモーター、及びＰＧ Ｋ−１ポリ（Ａ）部位の転写コントロール下のｎｅｏ遺伝子より成る発現カセ・ シトを含む５ｋｂプラスミドである（Ｔｙｂｕｌｅｗｉｃｚら（１９９１）Ｃｅ １１第４０巻第２７１頁）。プラスミドｐＹＰＮＮは、ＳＶ４０プロモーター− ｎｅｏｒカセットの代りにＰＧＫｎ　ｅ　ｏカセ・シトを含むｐＹＡＣｎｅｏの 突然変異体であり、ＹＡＣｎ　ｅ　ｏの４．５ｋｂ　Ｓａ１１Ａｐａ１７ラグメ ントを、ＰＧＫプロモーター、ｎｅ。selectable marker plasmid The plasmid contains the mouse phosphoglyceride kinase-1 promoter and PG An expression case consisting of the neo gene under the transcriptional control of the K-1 poly(A) site. It is a 5kb plasmid containing Cyto (Tybulewicz et al. (1991)) 11, Vol. 40, p. 271). Plasmid pYPNN is SV40 promoter- pYACneo containing PGKneo cassette instead of neor cassette It is a mutant and has a 4.5kb Sa11Apa17 lag of YACneo. the PGK promoter, ne.

コーディング領域及びＰ　Ｇ　Ｋ　ｐ　（Ａ）シグナルを含む１．５ｋｂｓａｌ １人ｐａｌフラグメントで交換して構築される。プラスミドは、５ａｉｌ（ａ） 又はＮｏｔｌ（ｐＹＰＮＮ）により線形化された。1.5kbsal including coding region and PGKp(A) signal Constructed by replacing one pal fragment. The plasmid is 5ail(a) or linearized by Notl (pYPNN).

ＥＳ細胞中へのＹＡＣＤＮＡのリボフエクション消化されたアガロース／ＤＮＡ 混合物は、ポリスチレン管（Ｆａｌｃｏｎ）中の１ｍ１（約１０１００ｎ部分へ と分けられ、１１００ｎ又は２０ｎｇのｐＹＰＮＮ、及び１μｇの剪断されたニ シン***Ｄ　Ｎ　Ａ（Ｓｉｇｍａ）を容管に加え、次にカチオン性月旨質（Ｔｒ ａｎｓｆｅｃｔａｍ、　ＰｒｏＭｅｇａ）を１０．１の比（重量比）で加え、お たやかにＤＮＡ溶液中に混合した。混合物を室温で３０分間温買置てＤ　Ｎ　Ａ −脂質複合体の形成を許した。***的薯こ不活性化されたＳ　Ｎ　Ｌ　７６／７ 線維芽支持細胞層上のＡＢ−１胚幹（Ｅ　Ｓ）細胞の迅速に成長する密集する培 養物をト１ノブシン処理して、単一の細胞懸物を得て、血清含有培地で洗い、そ して無血清Ｄ　Ｍ　Ｅ　Ｍ　（Ｇｉｂｃｏ）中に再懸濁した。Ribofection of YAC DNA into ES cells Digested agarose/DNA The mixture was poured into 1 ml (approx. 1100 n or 20 ng of pYPNN, and 1 μg of sheared Ni Add synsperm DNA (Sigma) to the tube, then add cationic lunate (Tr) ansfectam, ProMega) at a ratio of 10.1 (weight ratio) and Mixed quickly into the DNA solution. Let the mixture stand at room temperature for 30 minutes. -Allowed the formation of lipid complexes. Schizophrenic Inactivated SNL 76/7 Rapidly growing confluent culture of AB-1 embryonic stem (ES) cells on a fibroblast feeder layer Cultures were treated with tolinobcin to obtain single cell suspensions, washed with serum-containing medium, and then and resuspended in serum-free DEM (Gibco).

各リポフェクションに対して、３　Ｘ　１０６Ｅ　Ｓ細胞及び約１×１０５支持 細胞を含む細胞懸濁物９ｍｌをＤＮＡ−脂質混合物１ａ＋１と６０ｍｒＡペトリ 皿（Ｆａｌｃｏｎ　１００７；　Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）中で混合 し、加湿した５％Ｃｏ２雰囲気中で３７℃で４時間温室した。細胞付着を最小に するために、部属の間、皿をゆっくりと回転させた。温室の後、細胞を血清含有 ＥＳ細胞培地で希釈し、ゆっくりと分散させ、そして支持層を含む１００ｍｍ培 養皿上に１×１０６で塗布した。細胞を、塗布の２４時間後から始めて９〜１２ 日間、Ｇ　４１８　（４００ａｇ／ｍｌパワー、Ｇｉｂｃｏ）中で選択した。２ つの異なるプラスミド、すなわちｐＹＰＮＮ　（ＳＶ４０−　ｎ　ｅ　ｏカセッ トの代りにＰＧＫｎｅＯカセットを有するｐＹＡＣｎｅｏの１２ｋｂ突然変異体 ）及び１ｃｋｅｎｓｉａｎ　（同じＰＧＫｎｅｏカセットを有する５ｋｂプラス ミド）をテストした。ＹＡＣニブラスミドのモル比は、ｐＹＰＮＮの場合には１ ８．１ｃｋｅｎｓｉａｎの場合には１：４であった。２つのカチオン性脂質処方 、すなわちＤＯＧＳ　（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ、　ＰｒｏＭｅｇａ）及びＤ　 ＯＴ　Ｍ　Ａ　（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ。For each lipofection, 3 x 106E S cells and approximately 1 x 105 support 9 ml of cell suspension containing cells was added to DNA-lipid mixture 1a+1 and 60 mrA Petri. Mix in a dish (Falcon 1007; Becton Dickinson) and greenhouse at 37° C. for 4 hours in a humidified 5% CO2 atmosphere. Minimize cell attachment To do this, the plate was rotated slowly between sections. Serum-containing cells after greenhouse Dilute in ES cell medium, slowly disperse, and add to 100 mm culture medium containing support layer. It was coated at 1 x 106 on a culture plate. Cells were harvested for 9 to 12 hours starting 24 hours after application. The cells were selected in G418 (400ag/ml power, Gibco) for days. 2 Two different plasmids, namely pYPNN (SV40-neo cassette A 12kb mutant of pYACneo with a PGKneO cassette instead of ) and 1ckensian (5kb plus with the same PGKneo cassette Mid) was tested. The molar ratio of YAC niblasmid is 1 for pYPNN. In the case of 8.1ckensian, it was 1:4. Two cationic lipid formulations , namely DOGS (Transfectam, ProMega) and D OT M A (Lipofectin.

ＢＲＬ）をテストした。類似のトランスフェクション効率が、線形化プラスミド を用いてＤＯＧＳ及びＤＯＴＭＡに対して得られたが、結局はＤＯＧＳがＹＡＣ 実験のために選択された。これは、そのカチオン性部はスペルミンであり、ＤＮ Ａ保護体としてスペルミンを外から加える必要性をなくすこと、及びＤＯＧＳは 用いられた濃度でＥＳ細胞に対して毒性でないことの故である。トランスフェク ション効率に対してＤＮＡ：脂質比が重要であると見い出され、そしてＹＡＣＤ ＮＡ濃度の正確な測定が困難である故に、ＤＮＡの基本濃度を与えるために各リ ポフェクシジンは、推定１０倍過剰（１μｇ）の剪断されたニシン***キャリア ーＤＮＡを含んだ。BRL) was tested. Similar transfection efficiency but linearized plasmid was obtained for DOGS and DOTMA using selected for the experiment. This is because its cationic part is spermine and DN Eliminating the need to externally add spermine as an A protector and DOGS This is because it is not toxic to ES cells at the concentrations used. Transfection DNA:lipid ratio was found to be important for sorption efficiency, and YACD Because accurate measurement of NA concentration is difficult, each sample was tested to give the base concentration of DNA. Pofexidine was administered in an estimated 10-fold excess (1 μg) to sheared herring sperm carriers. - Contains DNA.

ＥＳクローンの分析 Ｇ４１８耐性クローンがトリプシンにより分散され、各クローンからの細胞が９ ６ウエル（くぼみ）のプレートの一つのウェルに分けられ凍結され、第２の９６ ウエル又は２４ウエルのプレートがサザン分析によるスクリーニングのためのＤ ＮＡの調製のためのために用いられた。陽性のクローンが解凍され、皿なる分析 のために増殖された。Analysis of ES clones G418-resistant clones were dispersed with trypsin, and cells from each clone were separated into 9 Divide into one well of a 6-well plate and freeze; D wells or 24-well plates for screening by Southern analysis. It was used for the preparation of NA. Positive clones will be thawed and analyzed. bred for.

サザンブロットハイプリダイゼーション及びＰＣＲゲノムＤＮＡが、ＥＳ細胞及 び迅速調製法（Ｌａｉｒｄら（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ 、第１９巻第４２９３頁）による尾生体組織鏡検から調製され、標孕法によるサ ザン分析に付された。Southern blot hybridization and PCR genomic DNA was isolated from ES cells and and rapid preparation method (Laird et al. (1991) Nucleic Ac1ds Res , Vol. 19, p. 4293), prepared from microscopic examination of the tail tissue, and was subjected to Xan analysis.

パルス場ゲル電気泳動のために、ＥＳ細胞が１０７細胞／ｍｌでアガロースブロ ック中に埋め込まれ、制限消化のために準備され、そして５ｐｅｌにより１夜消 化された。パルス場ゲルのサザン分析のために、ＤＮＡは酸−ニックされ、次に 変性化溶液（０，４Ｎ　ＮａＯＨ，１，５Ｍ　ＮａＣＩ）中のＧｅｎｅＳｃｒｅ ｅｎ　Ｐｌｕｓ（Ｄｕ　Ｐｏｎｔ）に移された。ｖＢ６領域のＰＣＲ増幅に適す るオリゴヌクレオチドは、発表されている配列から調製された。用いられたプラ イマーは、５’　ＣＡＧＧＴＡＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＴＣＡ３′及び ５’　ＴＣＣＧＧＡＧＴＣＡＣＡＧＡＧＴＴＣＡＧＣ３’であり、これらは診断 の２７５ｂ生成物を増幅した。For pulsed field gel electrophoresis, ES cells were plated in agarose broth at 107 cells/ml. prepared for restriction digestion and quenched overnight with 5pel. was made into For Southern analysis of pulsed field gels, the DNA was acid-nicked and then GeneScre in denaturing solution (0,4N NaOH, 1,5M NaCI) Transferred to en Plus (DuPont). Suitable for PCR amplification of vB6 region Oligonucleotides were prepared from published sequences. plastic used The timer is 5' CAGGTACAGCTGCAGCAGTCA3' and 5'TCCGGAGTCACAGAGTTCAGC3', these are diagnostic 275b product was amplified.

トランスジェニックマウスの製造及び分析キメラ祖先動物を作るために無傷のＹ ＡＣ配列を含むクローンが胚盤胞中にインジェクトされ、これはＣ５７ＢＬ／６ 野生タイプマウス及びＪ「マウス（マウス重鎮遺伝子の両コピーの標的とされる 不活性化を有する）で繁殖された。トランスジェニック子孫からの胸腺細胞が、 無傷のＹＡＣの伝達を確認するために、パルス場ゲル電気泳動及びサザン分析の ためにアガロースブロック中に置かれた。Production and analysis of transgenic mice Intact Y to create chimeric ancestral animals A clone containing the AC sequence was injected into blastocysts, which were C57BL/6 Wild-type mice and J' mice (targeted by both copies of key mouse genes) bred with inactivation). Thymocytes from transgenic offspring Pulsed field gel electrophoresis and Southern analysis to confirm intact YAC delivery. placed in an agarose block for the purpose.

ＥＬＩＳＡ分析 ヒトμ鎖が、２部位ＥＬＩＳＡアッセイにより検出された。ポリ塩化ビニルマイ クロタイタープレートが１００ｊｌＰＢＳ中の１．２５μｇ／１１のマウスモノ クローナル抗ヒトＩｇＭクローンＣＨ６（Ｔｈｅ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　５ｉｔｅ、 サンジエゴ、カリフォールニア）により、４℃での１夜温置によって被覆された 。プレートを、ＰＢＳ中５％チキン血ｆｆ１（ＪＲＨ，レキサナ、カンサス）と の１時間温置によりブロックした。ＰＢＳで６回洗った後、０．５％Ｔｖｅｅｎ ２０ｓ血清サンプル及ヒ標準ヲ、１１０ｐｌＰＢＳ、０．５％Ｔｗｅｅｍ２０ｓ 　５％チキン血清（ＰＴＣ３）中に希釈し、ウェル中で室温で１時間温置した。ELISA analysis Human μ chain was detected by a two-site ELISA assay. polyvinyl chloride my Clot titer plate containing 1.25μg/11 mouse mono in 100jl PBS Clonal anti-human IgM clone CH6 (The Binding 5ite, San Diego, California) by overnight incubation at 4°C. . Plates were treated with 5% chicken blood ff1 (JRH, Lexana, Kansas) in PBS. Blocked by incubation for 1 hour. After washing 6 times with PBS, 0.5% Tveen 20s serum sample and standard, 110pl PBS, 0.5% Tweem20s Diluted in 5% chicken serum (PTC3) and incubated in wells for 1 hour at room temperature.

標準として、精製されたヒトミニローマ由来ＩｇＭｆｉ度（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅ ｍ。As a standard, purified human miniroma-derived IgMfi (Calbioche m.

ラ　ジヨウ、カリフォールニア）を用いた。次にプレートを、ＰＢＳ、０．５％ Ｔｗｅｅ１２ｏテロ回洗い、１００ＩＩＩＰ　Ｔ　ＣＳ　’Ｔ：１０００倍希釈 された、ベルオキシダーゼとコンジュゲートされたラビット抗ヒトＩｇＭ、　Ｆ ｃ５ｕフラグメント特異性抗体を加えた。室温でさらに１時間温置の後、ウェル を６回洗い、１００１１１ＡＢＴＳ基質（Ｓｉｇｍａ）で０．５時間発育した。Radius, California) was used. The plate was then washed with PBS, 0.5% Twee12o wash twice, 100IIIP TCS’T: 1000 times diluted Rabbit anti-human IgM conjugated with peroxidase, F A c5u fragment specific antibody was added. After an additional hour of incubation at room temperature, the wells were washed six times and grown for 0.5 h in 100111ABTS substrate (Sigma).

アッセイプレートを、ｖ　ｍ　ａＸ　？イクロプレートリーダー上（Ｍｏｌｅｃ ｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ、メン口　パーク、カリフォールニア）で４１５〜４ ９０ｎｍで読み、ＩｇＭｆｉ度は標準値の４パラメ一タロジステイタ曲線適合か ら決定された。血清サンプル中の４．８９ｎｇ／ｍｌのレベルがこのアッセイい において、ルーチン的に検出され、少な（とも３標準偏差により背景とは区別さ れる。Transfer the assay plate to vm aX? on a microplate reader (Molec ular Devices, Menguchi Park, California) 415-4 Read at 90nm, IgMfi degree is a standard value of 4 parameters, and does it fit the tarogistra curve? It was decided that A level of 4.89 ng/ml in the serum sample was detected in this assay. are routinely detected in It will be done.

結果 約８μｇのＪｌ、３ＰＹＡＣＤＮＡが、８つの別々の実験においてリポフエクト された（表１）。スクリーンされた１２２１のＧ４１８耐性クローンのうち、１ ５が２つの診断のＥｃｏＲＩ　Ｃμフラグメントを含んだ（表２）。クローンの ２つの（＃　１９５及び５５３）が２つのＣμバンドの１つのみを含み、これは 失われたＥｃｏＲＩフラグメント中におけるＹＡＣのフラグメント化から生じた かもしれない（表２）。result Approximately 8 μg of Jl,3PYAC DNA was lipofected in eight separate experiments. (Table 1). Of the 1221 G418-resistant clones screened, 1 5 contained two diagnostic EcoRI Cμ fragments (Table 2). clone's Two (#195 and 553) contain only one of the two Cμ bands, which is resulting from fragmentation of the YAC in the missing EcoRI fragment. (Table 2).

２つの選択マーカプラスミド（ｐＹＰＮＮとａｃｅ）は夫々、１０の被トランス フェクション細胞当り０．５及び１３．５のＧ４１８耐性クローンの頻度を作っ た。ｐＹＰＮＮ選択の効率は、それがａＣｅの２倍のモル１度で用いられたにも がかわらず、はるかに低かった。なぜプラスミドは異なったのか不明である。な ぜなら、それらは共に、同じｎｅｏ’カセットを含んでいたからである。しかし 、それは、プラスミドとベクターアームとの間の配列相同性の程度又は２つのプ ラスミドからのｎｅｏ　発現の効率の違いの結果であるかも知れない。Two selection marker plasmids (pYPNN and ace) each contain 10 transfectants. The frequencies of G418-resistant clones were made to be 0.5 and 13.5 per infected cell. Ta. The efficiency of pYPNN selection was even greater when it was used at twice the molar concentration of aCe. was still much lower. It is unclear why the plasmids were different. Na since they both contained the same neo' cassette. but , it is the degree of sequence homology between the plasmid and the vector arm or the This may be the result of differences in the efficiency of neo expression from lasmids.

表ＩＪ１．３ＰＹＡＣリボフエクションのまとめ実験番号　選択　ＹＡＣ：ｎｅ ｏ　リボフェクンヨン　Ｇ４１８ｒ　ａＣｅ　クローノ番号プラス、ド　モル比 　の番号　クローン＃　陽　性１　ｐＹＰＮＮ　１：８　８　２４　３　１４， １８．２１２　ｐＹＰＮＮ　１：８　９　１９　１　１２３　ｐＹＰＮＮ　１： ８　９　１２　０４　ｐＹＰＮＮ　１：８　９　８　０ ５　ｐＹＰＮＮ　１：８　９　１０　０６　ｍｐｔ　１：４　４　４４　０ ７　ａｔ　１：４　１６　４８０　３　８６，２６６．４８０８　ａｔ　１：４ 　１８　６２４　１０　２５．３５．１６４゜表１．Ｊ１．３ＰＹＡＣＤＮＡの 、選択マーカープラスミドとのコリボフエクション。約１１００ｎのＹＡＣＪｌ 、３がＰＧＫｎ　ｅ　ｏ含有プラスミドｐＹＰＮＮ又はａｔ及びキャリアーＤＮ Ａと一緒にされた。各実験は、ＤＮＡ／脂質複合体の同じ溶液を用いて、夫々１ ０１００ｎ　Ａ　ＣＤ　Ｎ　Ａの４〜１８回の別々のりポフエクションより成っ た。ヒトＣａプローブが、クローンの初めのスクリーニングのために用いられた 。Table IJ1.3 PYAC Ribofection Summary Experiment Number Selection YAC:ne o Ribofekunyon G418r aCe Chrono number plus, do mole ratio Number Clone # Positive 1 pYPNN 1:8 8 24 3 14, 18.212 pYPNN 1:8 9 19 1 123 pYPNN 1: 8 9 12 04 pYPNN 1:8 9 8 0 5 pYPNN 1:8 9 10 06 mpt 1:4 4 44 0 7 at 1:4 16 480 3 86,266.4808 at 1:4 18 624 10 25.35.164゜Table 1. J1.3PYAC DNA , colibofection with a selectable marker plasmid. YACJl of about 1100n , 3 is PGKneo-containing plasmid pYPNN or at and carrier DN I was put together with A. Each experiment was performed using the same solution of DNA/lipid complexes, each with 1 0100n　A　CD　N　Consists of 4 to 18 separate paste-fections of A. Ta. A human Ca probe was used for initial screening of clones. .

マ　ｃ８１：＋Ｉ：Ｉ： 表２において、Ｃμプローブに対し陽性であったＥＳクローンが、ｖ■６配列に ついてＰＣＲで、Ｄ領域組込みについてサザンプロットで、そして３′末端組込 みについてサザンプロットにより分析された。ｖＨ６分析における「＋」は、ｖ Ｂ６特異性プライマーを用いる、診断の２７５ｂｐＰ　ＣＲ生成物の増幅を示す 。Ｄ領域フィンガープリントにおける「＋」は、完全に親のバンドパターンを示 す。Ｃμ分析における「＋」は、プローブとハイブリッドされたとき、２つの診 断のバンドが存在したことを示し、一方、「−」は単一のバンドの存在を示す。Ma c81:+I:I: In Table 2, the ES clones that were positive for the Cμ probe had a v■6 sequence. PCR for D region integration, Southern blot for D region integration, and 3' end integration. were analyzed by Southern plot. “+” in vH6 analysis means v Amplification of the diagnostic 275 bp P CR product using B6 specific primers is shown. . The “+” in the D-region fingerprint completely indicates the parent band pattern. vinegar. “+” in Cμ analysis means that when hybridized with the probe, the two diagnostics Indicates that a single band was present, while "-" indicates the presence of a single band.

３′末端分析における「＋」は、Ｘｈｏｌ／５ｐｅｌ二重消化物におけるフラン キングＸｈｏ　ｌバンドのサイズの４．　ｌｋｂへの減少ならびに画情化物にお ける４、５ｋｂ内部Ｘｈｏ　ｌバンドの存在を示す。パルス場ゲル電気泳動分析 における「＋」は、Ｄ領域プローブで調べられたとき、単一の８５ｋｂＳｐｅｌ バンドの存在を示す。ｒｎｄＪは測定されなかったことを示す。無傷のＹＡＣイ ンサートを有するクローンは、太線で印される。　クローン１２．１４．１８及 び２１は、プローブとして２７５ｋｂＰ　ＣＲ生成物ＤＮＡを用いてＡｐａｌ及 びＥｃｏＲｌ消化物を調べることによってＶｎ６について分析された。クローン １８のみが、診断のｖＢ６バンドについて陽性であった。The “+” in the 3′ end analysis represents the furan in the Xhol/5pel double digest. King Xho l band size 4. The decrease to lkb and the image monster This shows the presence of a 4-5 kb internal XhoI band. Pulsed field gel electrophoresis analysis '+' in is a single 85kb Spel when probed with the D region probe. Indicates the presence of a band. rndJ indicates not measured. Intact YAC Clones with inserts are marked with bold lines. Clone 12.14.18 and and 21 used Apal and 275 kbP CR product DNA as a probe. and EcoRl digests were analyzed for Vn6. clone Only 18 were positive for the diagnostic vB6 band.

ＥＳ細胞中のＹＡＣ構造の分析 ｐＹＰＮＮコポリフエクションからの４つのＣμ　クローン（番号１２．１４． １８．２１）を、上記の制限フラグメント指紋アッセイによりＤ領域構造につい て分析した。クローンのうち、クロン１８のみが親ＹＡＣの指紋を保持した。ク ローン１４と２１は、親よりも少ないバンドを含んだ。これは、ＹＡＣ配列が失 われたことを示唆する。一方、クローン１２は、い（つかの追加バンドを含み、 このＥＳ系列におけるＹＡＣの１より多いコピーの組込みと符合ｒる。Analysis of YAC structures in ES cells Four Cμ clones from pYPNN copolyfection (numbers 12.14. 18.21) for D region structure by restriction fragment fingerprint assay as described above. It was analyzed. Among the clones, only clone 18 retained the parental YAC fingerprint. nine Loans 14 and 21 contained fewer bands than their parents. This means that the YAC array is lost. suggests that it was done. On the other hand, clone 12 contains some additional bands, This is consistent with the incorporation of more than one copy of YAC in the ES series.

４つのＥＳ系列におけるインサート領域の３′末端の組込みは、プローブとして ベクター再環化により単離された１０．５ｋｂ　ＮｄｅｉＳｐｅｌ末端フラグメ ントを用いるサザン分析により評価された。３つのバンドが、親ＹＡＣのＸｈｏ 　ｌ消化物から予期される。すなわち、非常に大きいＤ−Ｊ−Ｃμバンド（＞　 ３０ｋｂ）　、４．５ｋｂＣμｍＣδバンド、及び８．９ｋｂＣδ−ベクターバ ンドである。Ｘｈｏｌ及びＳｐｅ　Ｉによる二重消化は、８、９ｋｂバンドのサ イズを４．　ｌｋｂに減少すると予期される。４゜５ｋｂ及び８．９ｋｂバント がＸｈｏ　ｌ消化物中に存在し、一方、４，５ｋｂ及び４．１ｋｂバントが親Ｙ ＡＣのＸｈｏ　ｌ　Ｓｐｅ　ｌ消化物中に存在する。４つのＥＳ系列のうち、系 列１８のみが、無傷の３′末端の指標である親ＹＡＣバンドパターンを含んだ。Integration of the 3' end of the insert region in the four ES lines was used as a probe. 10.5kb NdeiSpel terminal fragment isolated by vector recircularization It was evaluated by Southern analysis using a sample. Three bands are parent YAC Xho expected from the digested product. In other words, the very large D-J-Cμ band (> 30kb), 4.5kbCμmCδ band, and 8.9kbCδ-vector band. It is Double digestion with Xhol and Spe Is 4. It is expected that it will decrease to lkb. 4°5kb and 8.9kb bunt is present in the Xhol digest, while 4.5 kb and 4.1 kb bunts are present in the parental Y It is present in the Xho l Spe l digest of AC. Of the four ES series, Only row 18 contained the parental YAC band pattern indicative of an intact 3' end.

８，９ｋｂバンドの存在は、ＥＳ系列におけるベクターアームＸｈｏ　１部位の 保持と符号し、テロマー領域の非常に少しがこのクローンにおいて失われている ことを示唆する。ＹＡＣ末端配列の喪失は、異常なＸｈｏ　ｌバンドを結果する と予期されるであろう。他の３つのＥＳ系列のうち、クローン１４は４，５ｋｂ Ｘｈｏ　ｌバンドを欠き、一方、クローン１２及び２１は異常に短いＸｈｏ　ｌ バンドを含み、これらＥＳクローンにおける再配置された又は除去された３′末 端領域を示している。５′末端組込みの同様な分析は、領域における繰返す因子 の故に可能でなかった。しかし、ＰＣＲ分析及びプローブとしてＶＢ６ＰＣＲ生 成物を用いるサザン分析は、クローン１８がｖＨ６配列を含み、一方、クローン １４．１２及び２１は含まないことを示した（表２）。The presence of the 8,9 kb band indicates that the vector arm Xho 1 site in the ES series. Consistent with retention, very little of the telomeric region is lost in this clone. suggests that. Loss of YAC terminal sequences results in aberrant Xhol bands would be expected. Among the other three ES lines, clone 14 is 4.5kb clones 12 and 21 lack an Xhol band, whereas clones 12 and 21 have abnormally short Xhol bands. including bands and rearranged or removed 3' ends in these ES clones. The edge area is shown. A similar analysis of 5'-terminus incorporation reveals that repeating factors in the region It was not possible because of this. However, PCR analysis and VB6 PCR production as a probe Southern analysis using the constructs revealed that clone 18 contained the vH6 sequence, whereas clone 18 contained the vH6 sequence; 14, 12 and 21 were not included (Table 2).

ｄコリポフエクションからの１３のＣμ　ＥＳ細胞系列のうち、１つがクローン 増大の間に失われ、１つ（＃２６６）がｖＨ６配列を欠く故に除去された。残り は、Ｄ領域構造、３′末端組込み及び／またはＶ　ｎ　５配列について分析され た（表２）。Ｄ領域指紋について分析された１１系列のうち、６つ（番号８６． １９１．２２０．３７１．４６３．５６７）が無傷のＤ領域を示し、５つが異常 なパターンを有した。無傷のＤ領域を持つ６つの系列のうち５つの３′末端分析 は、１つ（番号２２ｏ）を除くすべてが無傷の３′末端を含んだことを示した。Of the 13 Cμ ES cell lines from d-colipofection, one was cloned. was lost during expansion and one (#266) was removed as it lacked the vH6 sequence. rest were analyzed for D region structure, 3' end integration and/or Vn5 sequence. (Table 2). Of the 11 sequences analyzed for D-area fingerprints, 6 (number 86. 191.220.371.463.567) indicate an intact D region, and 5 are abnormal. It had a similar pattern. 3′-end analysis of 5 of 6 lines with intact D regions showed that all but one (number 22o) contained an intact 3' end.

ＰＣＲ分析は、無傷のＤ領域を持つ６つの系列のうち５つ（番号８６．２２０． ３７１．４６３．５６７）がｖＨ６配列を含み、無傷（７）Ｄ領域を持たない５ 系列のうち１つのみ（番号５５）がｖＨ６配列を持ったことを示した。PCR analysis revealed that five of the six series (numbered 86.220. 371.463.567) contains the vH6 sequence and does not have an intact (7) D region. Only one of the series (number 55) was shown to have the vH6 sequence.

１０のＥＳ細胞系列が、Ｄ領域又はＣμプローブを用いるパルス場すザン分析に より、全長インサートについて調べられた（表２）。クローン１８．３７１及び ４６３のみが、全長インサートを示す８５ｋｂ　５ｐｅｌフラグメントを含んだ 。他のクローンのすべては、より小さいＳｐｅ　Ｉフラグメントを持った。Ten ES cell lines were subjected to pulsed field Susan analysis using D-region or Cμ probes. (Table 2). Clone 18.371 and Only 463 contained an 85kb 5pel fragment representing a full-length insert. . All other clones had smaller SpeI fragments.

クローン１８のＳｐｅ　ｌ消化物は、Ｄ及びＣμプローブ、及びＶ■６のための プローブによりスクリーンされた。３つのすべてのプローブが、８５ｋｂの単一 バンドにハイブリダイズした。The Spel digest of clone 18 was used for the D and Cμ probes, and for V6. Screened by probe. All three probes are 85kb single hybridized to the band.

パルス場すザン分析をＤ領域、３′末端及びＶ８６詳細構造分析と併せ考えると 、ＹＡＣインサートが３つの系列、番号１８．３７１及び４６３において無傷で 移入されたことを示している。高程度の内部再配置、除去又はフラグメント化が 、破壊されたＹＡＣ配列を有するＥＳ系列において一般に見られ、しかし構造の わずかの変化もまた検出された（たとえば番号５６７）。総じて、無傷のＹＡＣ 移入の頻度は低く、４００の６４１８クローンのうち１つ（３／１２２１）であ る。しかし、クローンＤＮＡの単離及びＣμ配列のための一次的スクリーン（１ ２２１のクローンのうち１２０６を更なる分析から除く）は、方法論に記載され るマイクロタイタープレートプロトコールを用いて迅速に行われた。すなわち、 ゎずが１５のクローンが、徹底的分析を必要とした（表２）。Considering pulse field Susann analysis together with detailed structural analysis of D region, 3' end and V86. , YAC inserts are intact in three series, numbers 18.371 and 463. It shows that it has been imported. High degree of internal rearrangement, removal or fragmentation , commonly found in ES series with disrupted YAC sequences, but structural Minor changes were also detected (eg number 567). Overall, an intact YAC The frequency of transfer was low, with 1 out of 400 6418 clones (3/1221). Ru. However, isolation of cloned DNA and primary screen for Cμ sequences (1 1206 out of 221 clones were excluded from further analysis) as described in the methodology. It was performed rapidly using a microtiter plate protocol. That is, Fifteen clones required thorough analysis (Table 2).

ＥＳ細胞中のＹＡＣ構造の分子分析は、ＹＡＣの小さい、好ましくは単一のコピ ーにより大いに容易にされる。ＥＳ系列のＤ領域、パルス場ゲル分析及び３′末 端分析は、ＹＡＣの少ない又は単一コピ１組込みと符合する。診断の３′末端フ ランキングバンドについてのクローン１８．３７１及び４６３の分析は、クロー ン１８及び３７１がＹＡＣインサートの単一コピーを有し、一方、４６３は追加 の無傷の又は部分的に無傷のコピーを有するかも知れないことを示した。Molecular analysis of YAC structures in ES cells involves small, preferably single copies of YACs. - greatly facilitated by D region of ES series, pulsed field gel analysis and 3' end End analysis is consistent with low or single copy 1 incorporation of YAC. Diagnostic 3' end Analysis of clones 18.371 and 463 for ranking bands 18 and 371 have a single copy of the YAC insert, while 463 has an additional showed that they may have an intact or partially intact copy of.

キメラの製造及びＹＡＣの生殖細胞系列伝達胚盤胞が、ＥＳ系統１８．３７１及 び４６３を用いてインジエク浄誓（内容に変更なし） トされた。色を覆うために１０〜９５％のＥＳ細胞寄与の範囲であるキメラ先祖 動物が、３つすべての系統から導かれた。Production of chimeras and germline transmission of YAC blastocysts were produced using ES lines 18.371 and 18.371. Injiek purification vow using 463 and 463 (no change in content) It was written. Chimeric progenitors range from 10-95% ES cell contribution to cover color Animals were derived from all three strains.

最も高齢の動物（ＥＳ系統１８から導かれた４０％キメラオス）は、７３の子の うち２０にＥＳ細胞遺伝子型を伝達した。２０のアゲ−ティの子のうち１１が無 傷り領域指紋について陽性であり、これは単価接合体ＹＡＣｈランスジーン対立 遺伝子のメンプリアン分離と符合する。加えて、Ｄ領域プローブを用いたパルス 場すザン分析は、トランスジェニック子における単一の８５ｋｂＳｐｅｌバンド を示し、これはＹＡＣが生殖細胞系列を通して安定に維持されたことを示す。す なわち、ＥＳ細胞中へのＹＡＣのコリボフエクンヨンは、ＥＳ細胞の全型発育能 を駄目にしない。The oldest animal (a 40% chimeric male derived from ES line 18) had 73 offspring. The ES cell genotype was transferred to 20 of them. 11 of the 20 Ageti children were born. positive for wound area fingerprints, indicating that the monozygous YACh transgene allele This is consistent with Memprian segregation of genes. In addition, pulses using the D-region probe Field analysis revealed a single 85kb Spel band in the transgenic offspring. , indicating that YAC was stably maintained throughout the germline. vinegar In other words, the introduction of YAC into ES cells increases the overall developmental ability of ES cells. Don't spoil it.

コリポフェクンヨンされた選択マーカーについての組込み部位のサザン分析は、 ２〜１０のプラスミドコピーの組込みを示した。マーカープラスミドが複数座で インサートされたなら、それらは突然変異の原因でありうるので、プラスミドの 組込み部位が、プラスミド配列のサザン分析により追跡された。ｐＹＰＮＮ及び ＹＡＣベクターアームはＥｃｏＲＩ部位を欠き、ｐ　Ｂ　Ｒ３２２配列を含むの で、ＰＢＲ３２２プローブにハイブリダイズされた夫々のＥｃｏＲＩバンドは、 ｐＹＰＮＮ又はＹＡＣベクターアームの別々の無傷の又はフラグメント化された コピーの組込みを示す。ＥＳ細胞クローン１８Ｄ　Ｎ　Ａの分析は、５．５〜２ ０ＫＢの大きさの８つのＥｃｏＲＩバンドを現し、非トランスジェニック配偶体 で繁殖された単価接合体トランスジェニック動物の子は、浄書（内容に変更なし ） ＥｃｏＲＩバンドの分離について分析された。１４の子のうチスべて８のＥｃｏ ＲＩバンドが９つのトランスジェニック子の尾ＤＮＡ中で検出され、５つの非ト ランスジェニック子の尾ＤＮＡでは何も検出されなかった。すなわち、すべての 検出しうるマーカープラスミドがＹＡＣを用いて分離され、このことは、それら がＹＡＣ組込み部位に又は近傍に挿入されたことを示す。種々のＤ　Ｎ　Ａのコ リボフエクンヨンが、接合子のマイクロインジェクションにより作られたトラン スジェニックマウスにおいて観察され、プラスミドＤＮＡの共組込みは、接合子 マイクロインジェクションよりもコリボフエクションについて、より突然変異源 性であることはないことが予期される。ニシン***キャリアＤＮＡもまたＹＡＣ と共組込みされた。おそらくサザン分析におけるＥｃｏＲＩ部位の源でありうる 。共組込みされたキャリアーＤＮＡは、ＹＡＣＩ−ランスシーン機能に潜在的に 悪影響しうるので、キャリアーＤＮＡを排除することがしばしば望ましい。６５ ０ｋｂＹ　Ａ　Ｃを用いる予備実験は、ＥＳ細胞中への無傷のＹＡＣの効率的リ ボフエクションのためにキャリアーＤＮＡは必要でないことを示す。この予備的 実験はまた、ＥＳ細胞中に成功裡にコリボフエクンヨンされることができるＹＡ Ｃのサイズの制限は、少なくとも６５０ｋｂであることを示唆する。Southern analysis of the integration site for selected markers Integration of 2-10 plasmid copies was shown. Marker plasmid at multiple loci If inserted, they can be a source of mutations, so Integration sites were traced by Southern analysis of plasmid sequences. pYPNN and The YAC vector arm lacks the EcoRI site and contains the pBR322 sequence. Each EcoRI band hybridized to the PBR322 probe is Separate intact or fragmented pYPNN or YAC vector arms Indicates copy inclusion. Analysis of ES cell clone 18D NA was performed at 5.5-2 The non-transgenic gametophyte revealed eight EcoRI bands of 0 KB size. Offspring of monozygotic transgenic animals bred with ) The separation of EcoRI bands was analyzed. All 14 children have 8 Eco RI bands were detected in the tail DNA of nine transgenic pups and five non-transgenic pups. Nothing was detected in the tail DNA of the transgenic offspring. i.e. all Detectable marker plasmids were isolated using YAC, indicating that they is inserted at or near the YAC integration site. Various DN A components Ribohue kungyong is a transcript made by microinjection of zygotes. co-integration of plasmid DNA was observed in transgenic mice, and co-integration of plasmid DNA was observed in zygotic More mutagenic for colibofection than microinjection It is expected that it will not be sexual. Herring sperm carrier DNA is also a YAC co-incorporated with. Possibly the source of the EcoRI site in Southern analysis . Co-integrated carrier DNA potentially contributes to YACI-Lanceen function. It is often desirable to eliminate carrier DNA, as it can have deleterious effects. 65 Preliminary experiments using 0 kb YAC demonstrated the efficient relocation of intact YAC into ES cells. Shows that carrier DNA is not required for boffection. This preliminary The experiment also shows that YA can be successfully transduced into ES cells. The size limit for C is suggested to be at least 650kb.

系統１８のトランスジェニックマウスが、血清中における浄書（内容に変更ない ヒトμ鎖についてＥＬＩＳＡにより検定された。ヒトμ重鎖は、トランスジェニ ックな子の血清中で検出された（表３）。トランスジェニック体におけるヒトμ 血清レベルは、検出範囲内に明らかにあったが、それらは内在性マウスＩｇＭの 血清レベルに比べて非常に低かった。トランスジーン発現の低いレベルは、内在 性重鎮遺伝子からの競争に部分的に起因する。トランスジーンが、内在性重鎮対 立遺伝子が不活性化されているパックグララウンド中に導入され、そしてこのマ ウスにおいてヒトμ血清レベルは約１０倍高められた（表３）。Transgenic mice of strain 18 showed no change in serum content (no change in content). Assayed by ELISA for human μ chain. Human μ heavy chain is transgenic was detected in the serum of young children (Table 3). Human μ in transgenic bodies Although serum levels were clearly within the detection range, they were It was very low compared to serum levels. Low levels of transgene expression are due to endogenous Partly due to competition from sex heavyweight genes. Transgene vs. endogenous heavyweight is introduced during the pack-ground in which the allele is inactivated, and this Human μ serum levels were increased approximately 10-fold in mice (Table 3).

浄書（内容に変更なし） 表３　ＥＬＩＳＡによる血清ヒトＩｇＭの検出ゲッタイブ　性　検定時の齢（週 ）　ヒトＩｇＭＹＡＣ１８＋　Ｆ　３，９．２０　＜５　ｎｇ／ｍ１ＹＡＣ１８ ＋　Ｍ　１？　１２．２ｎｇ／ｍ１ＹＡＣ１８十　Ｆ　１０　２７．０ｎｇ／ｍ １ＹＡＣ１８＋　Ｆ　６．１７　＜５　ｎｇ／ｍ１ＹＡＣ１８＋　Ｆ　４　５． ８ｎｇ／ｍ１ＹＡＣ１８＋　Ｆ　６　１０．５ｎｇ／ｍ１ＹＡＣ１８＋Ｍ６　１ ０．４ｎｇ／ｍ１ＹＡＣ１８＋／ＪＨ−Ｍ　５，８　１６５　ｎｇ／ｍｌ野生タ イプ　Ｆ　６　＜５　ｎｇ／ｍ１野生タイプ　Ｆ　６　＜５　ｎｇ／ｍｌ野生タ イプ　Ｆ　６　＜５　ｎｇ／＠ｌ野生タイプ　Ｍ　６　＜５ｎｇ／ｍｌ 野生タイプ　Ｆ　３４　＜５　ｎｇ／ｍｌ野生タイプ　Ｆ　３４　＜５　ｎｇ／ ｍｌ野生タイプ　Ｍ　３４　＜５ｎｇ／ａｌ野生タイプ　Ｍ　３４　＜５ｎｇ／ ｍ１表３．トランスジェニック動物及び対照からの血サンプルを、表示した齢に おいてヒトＩｇＭについてＥＬＩＳＡにより分析した。トランスジェニック動物 のすべては、単一クローン１８の祖先キメラに由来し、ＹＡＣについて単価接合 体であった（ＹＡＣ１Ｂ＋）。野生タイプノ＜・ツクグランド浄ＩＦ（内容に変 更なし） における７つの動物のうち５つは、その血清中に検出しつるヒトＩｇＭを有した 。ＥＬＩＳＡの検出のレベルは、５ｎｇヒトＩｇ）ｌ／ｍｌ血清であった。ＹＡ Ｃトランスジーンが、機能的内在性マウス重鎮遺伝子を欠くバックグラウンド（ ＹＡは約１０倍高められた。Engraving (no changes to the content) Table 3 Detection of serum human IgM by ELISA Gender Age at time of assay (weeks ) Human Ig MYAC18+ F 3,9.20 <5 ng/ml YAC18 +M1? 12.2ng/m1 YAC180F 10 27.0ng/m 1YAC18+F 6.17<5 ng/m1YAC18+F 4 5. 8ng/m1YAC18+F6 10.5ng/m1YAC18+M6 1 0.4ng/ml YAC18+/JH-M 5,8 165 ng/ml Wild Ta Type F 6 <5 ng/ml wild type F 6 <5 ng/ml wild type Type F 6 <5 ng/@l Wild type M 6 <5 ng/ml Wild type F 34 <5 ng/ml Wild type F 34 <5 ng/ ml wild type M 34 <5 ng/al wild type M 34 <5 ng/ m1 table 3. Blood samples from transgenic animals and controls were collected at the indicated ages. were analyzed for human IgM by ELISA. transgenic animals All were derived from a single clone 18 ancestral chimera and were monovalent matings for YAC. (YAC1B+). Wild Typeno (no change) Five of the seven animals in the study had detectable human IgM in their serum. . The level of detection for the ELISA was 5 ng human Ig) l/ml serum. YA The C transgene was generated in a background lacking functional endogenous mouse key genes ( YA was increased approximately 10 times.

蛍光活性化された細胞のソーティング（ＦＡＣ３）分析が、８５ｋｂ重鎖遺伝子 フラグメントを含むＹＡＣについて陽性であり、かつ相同遺伝子標的（ターゲテ ィング）によるＪｎ領域の破壊によって機能的に破壊された（ノックアウトされ た）内在性マウス免疫グロブリン重鎮遺伝子について同型接合であるマウスにお いて実施された。マウスは、ＹＡＣトランスジーンの単一コピーを有し、機能的 マウス重鎮対立遺伝子を欠いた。ＦＡＣ３分析は、とりわけヒトＵ　＠を検出す るための抗体を使用し、マウスからの合計１０゜０００の末梢リンパ細胞当り約 ６０の細胞がヒトμ鎖免疫グロブリンを発現したことを示した。このレベルは、 野生タイプ（非トランスジェニック／非ノツクアウト）マウス牌臓においてマウ スμ鎖を発現する細胞の数の約１〜２％である。Fluorescence-activated cell sorting (FAC3) analysis revealed that the 85kb heavy chain gene positive for YAC containing fragments and homologous gene target (target The Jn region was functionally destroyed (knocked out) by destruction of the Jn region by ) in mice homozygous for the endogenous mouse immunoglobulin heavyweight gene. It was carried out. Mice carry a single copy of the YAC transgene and are functional Mice lacked the heavyweight allele. FAC3 analysis specifically detects human U@ per 10 000 total peripheral lymphocytes from mice. It was shown that 60 cells expressed human μ chain immunoglobulin. This level is In the wild type (non-transgenic/non-knockout) mouse spleen, Approximately 1-2% of the number of cells express the μ chain.

ＦＡＣ３は、ＹＡＣ＋／Ｊ　−マウスの牌臓及び腹膜腔か■ ら得られた細胞におけるヒトμ鎖発現を検出した。FAC3 was obtained from the spleen and peritoneal cavity of YAC+/J- mice. Human μ chain expression was detected in the cells obtained.

上述の本発明は、理解の明瞭のために例示及び実施例により詳しく説明されてい るが、本発明の請求の範囲内にお浄書（内容に変更なし） いて変更及び修飾が行われうろこと（よ明白であろう。The invention described above has been described in detail by way of illustration and example for clarity of understanding. However, the engraving is within the scope of the claims of the present invention (no change in content). Changes and modifications may be made (as will be obvious).

ＩＧ　ｌ くの口０ＬＬＩ―■＝　−−３に一χｚＯ乙○○Ｏ○○○○○　○○○○○○０ Ｏ ＱＱＱＯＯ■００　ＱＯ００００００ ○○○○００００　００００００００ ＦＩＧ、５゜ ＡＰＰ　了了Ｏｎ丁ニテ：ゴ］Ｄ　−３１０ｂｐＡＰＰ　７５１　ｒ口＝エコ　 −２５５　ｂ。IG l Kunoguchi 0LLI - ■ = - - 3 to 1 χzO Otsu○○O○○○○○○○○○○○0 O QQQOO■00 QO000000 ○○○○0000 00000000 FIG, 5° APP Finished On Ding: Go] D -310bp APP 751 r mouth = eco -255 b.

ＡＰＰ　７１４０１コ　□１４４　ｂｐアローフパ ＦＩＧ　８゜ 手続補正書 平成７年２月２日APP　71401　□144　bp Arrowhupa FIG 8゜ Procedural amendment February 2, 1995

Claims (31)

【特許請求の範囲】[Claims] １．カチオン性脂質、第一のポリヌクレオチド、及び選択マーカー遺伝子発現カ セットを含む連結されていない第二のポリヌクレオチドを含むコリポフェクショ ン複合体を形成する工程、 該第一のポリヌクレオチド及び咳第二のポリヌクレオチドが同一の細胞中に導入 されそしてゲノム中に組み込まれる条件下で、哺乳動物細胞を該コリボフェクシ ョン複合体と接触させる工程、 を含む、取り込まれた複数の非相同ＤＮＡ種を有するコリポフェクションされた 哺乳動物細胞を製造する方法。1. A cationic lipid, a first polynucleotide, and a selectable marker gene expression factor. colipofection containing an unlinked second polynucleotide containing the set forming a complex; the first polynucleotide and the second polynucleotide are introduced into the same cell mammalian cells under conditions where the colibofexi contacting the ion complex; colipofected with multiple heterologous DNA species incorporated, including A method of producing mammalian cells. ２．該カチオン性脂質が、Ｎ［１−（２、３−ジオレオイルオキシル）プロピル ］−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド、Ｎ［１−（２、３−ジオ レオイルオキシル）プロピル］−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルス ルフェート、Ｎ−（２、３−ジ（９−（Ｚ）−オクタデセニルオキシ））−プロ プ−１−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルァンモニウムクロライド、ジオレオイルフォス ファチジルエタノールアミン（ＰｔｄＥｔｎ、ＤＯＰＥ）及びジオクタデシルア ミドグリシルスペルミジンからなる群より選ばれる請求の範囲第１項の方法。2. The cationic lipid is N[1-(2,3-dioleoyloxyl)propyl ]-N,N,N-trimethylammonium chloride, N[1-(2,3-dio leoyloxyl)propyl]-N,N,N-trimethylammoniummethyls sulfate, N-(2,3-di(9-(Z)-octadecenyloxy))-pro P-1-N,N,N-trimethylammonium chloride, dioleoyl phos Fatidylethanolamine (PtdEtn, DOPE) and dioctadecyla The method of claim 1, wherein the method is selected from the group consisting of midoglycylspermidine. ３．第一のポリヌクレオチドが、少なくとも５００ｋｂである請求の範囲第１項 の方法。3. Claim 1, wherein the first polynucleotide is at least 500 kb. the method of. ４．該選択マーカーの少なくとも一つが薬剤耐性遺伝子である請求の範囲第１項 の方法。4. Claim 1, wherein at least one of the selection markers is a drug resistance gene. the method of. ５．咳選択マーカーがネオマイシン耐性をエンコードする遺伝子である請求の範 囲第４項の方法。5. Claims wherein the cough selection marker is a gene encoding neomycin resistance The method in Section 4. ６．咳選択性マーカーを有する細胞の選択工程を更に含む請求の範囲第１項の方 法。6. The method according to claim 1, further comprising a step of selecting cells having a cough-selective marker. Law. ７．該哺乳動物細胞が非ヒト肺幹細胞である請求の範囲第１項の方法。7. 2. The method of claim 1, wherein said mammalian cells are non-human lung stem cells. ８．該非ヒト胚幹細胞がマウスＥＳ細胞である請求の範囲第７項の方法。8. 8. The method of claim 7, wherein the non-human embryonic stem cells are mouse ES cells. ９．該カチオン性脂質がジオクタデシルアミドグリシルスペルミジン（ＤＯＧＳ ）であり、該第一のポリヌクレオチドがヒトＡＰＰ遺伝子配列を含み、かつ咳連 結されていない第二のポリヌクレオチドがネオマイシン耐性遺伝子を含む、請求 の範囲第８項の方法。9. The cationic lipid is dioctadecylamide glycylspermidine (DOGS ), the first polynucleotide comprises a human APP gene sequence, and The unlinked second polynucleotide comprises a neomycin resistance gene. The method of item 8 within the scope of １０．咳第一のポリヌクレオチドが酵母由来ＹＡＣ配列を含む、請求の範囲第１ 項の方法。10. Claim 1, wherein the cough first polynucleotide comprises a yeast-derived YAC sequence. Section method. １１．ＹＡＣクローンＤＮＡを含む第一のＤＮＡ及び選択マーカーをエンコード する遺伝子を含む第二のＤＮＡに、非共有結合的に結合されたカチオン性脂質を 含むコリポフェクション複合体。11. First DNA containing YAC clone DNA and encoding a selection marker A cationic lipid non-covalently bound to a second DNA containing a gene for colipofection complex containing. １２．カチオン性脂質が、Ｎ［１−（２、３−ジオレオイルオキシル）プロピル ］−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド、Ｎ［１−（２、３−ジオ レオイルオキシル）プロピル］−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルス ルフェート及びジオクタデシルアミドグリシルスペルミジンからなる群より選ば れる、請求の範囲第１１項のコリポフェクション複合体。12. The cationic lipid is N[1-(2,3-dioleoyloxyl)propyl ]-N,N,N-trimethylammonium chloride, N[1-(2,3-dio leoyloxyl)propyl]-N,N,N-trimethylammoniummethyls selected from the group consisting of sulfate and dioctadecylamide glycylspermidine 12. The colipofection complex of claim 11. １３．ＹＡＣＤＮＡがヒトＡＰＰ遺伝子配列又はヒト免疫グロブリン遺伝子配列 を含む、請求の範囲第１１項のコリポフェクション複合体。13. YAC DNA is human APP gene sequence or human immunoglobulin gene sequence The colipofection complex of claim 11, comprising: １４．該カチオン性脂質がジオクタデシルアミドグリシルスペルミジンである、 請求の範囲第１３項のコリポフェクション複合体。 Ｒ14. the cationic lipid is dioctadecylamide glycylspermidine; The colipofection complex according to claim 13. R １５．該選択マーカー選任子がｎｅｏＲである請求の範囲第１４項のコリポフェ クション複合体。15. The collipofe of claim 14, wherein the selection marker selector is neoR. ction complex. １６．少なくとも５０ｋｂのポリヌクレオチド、連結されていない選択マーカー 遺伝子発現カセット、及びＮ［１−（２、３−ジオレオイルオキシル）プロピル ］−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルァンモニウムクロライド、Ｎ［１−（２、３−ジオ レオイルオキシル）プロピル］−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルス ルフェート及びジオクタデシルアミドグリシルスペルミジンからなる群より選ば れるカチオン性脂質を含むコリポフェクション複合体。16. A polynucleotide of at least 50 kb, unlinked selectable marker gene expression cassette, and N[1-(2,3-dioleoyloxyl)propyl ]-N,N,N-trimethylammonium chloride, N[1-(2,3-dio leoyloxyl)propyl]-N,N,N-trimethylammoniummethyls selected from the group consisting of sulfate and dioctadecylamide glycylspermidine A colipofection complex containing cationic lipids. １７．哺乳動物細胞及び請求の範囲第１６項のコリポフェクション複合体を含む 組成物。17. comprising a mammalian cell and the colipofection complex of claim 16. Composition. １８．哺乳動物細胞が非ヒト胚幹細胞である請求の範囲第１７項の組成物。18. 18. The composition of claim 17, wherein the mammalian cells are non-human embryonic stem cells. １９．非ヒト胚幹細胞がマウスＥＳ細胞である請求の範囲第１７項の組成物。19. 18. The composition of claim 17, wherein the non-human embryonic stem cells are mouse ES cells. ２０．請求の範囲第１項の方法によって製造されたコトランスフェクトされた置 市乳動物細胞。20. A co-transfected device produced by the method of claim 1. City mammalian cells. ２１．請求の範囲第１０項の方法によって製造されたコトランスフェクトされた 哺乳動物細胞。21. A co-transfected product produced by the method of claim 10 mammalian cells. ２２．請求の範囲第１項の方法によって製造されたキメラトランスジェニック非 ヒト動物。22. A chimeric transgenic non-chimeric product produced by the method of claim 1. human animal. ２３．請求の範囲第９項の方法によって製造されたトランスジェニック非ヒト動 物。23. Transgenic non-human animal produced by the method of claim 9 thing. ２４．酵母由来ＹＡＣ配列に連結された少なくとも５０ｋｂの異種ポリヌクレオ チド配列を含む生殖細胞系列ゲノムを含むトランスジェニックマウス。24. A heterologous polynucleotide of at least 50 kb linked to a yeast-derived YAC sequence A transgenic mouse containing a germline genome containing the tide sequence. ２５．異種ポリヌクレオチドが少なくとも約５００ｋｂである、請求の範囲第２ ４項のトランスジェニックマウス。25. Claim 2, wherein the heterologous polynucleotide is at least about 500 kb. Section 4 transgenic mouse. ２６．異種ポリヌクレオチド配列がヒトＡＰＰタンパク質又はヒト免疫グロブリ ンをエンコードする、請求の範囲第２５項のトランスジェニックマウス。26. The heterologous polynucleotide sequence is a human APP protein or a human immunoglobulin. 26. The transgenic mouse of claim 25, encoding a transgenic mouse. ２７．更にｎｅｏＲ遺伝子発現カセットを含む請求の範囲第２６項のトランスジ ェニックマウス。27. The transducer of claim 26 further comprising a neoR gene expression cassette. genic mouse. ２８．８５ｋｂのＳｐｅＩフラグメントを含む再配列されていないヒト免疫グロ ブリン遺伝子、選択マーカー及びカチオン性脂質を含むＹＡＣを含むコリポフェ クション複合体。Unrearranged human immunoglobulin containing the 28.85 kb SpeI fragment. Colipophecontaining YAC containing the bulin gene, selection marker and cationic lipid ction complex. ２９．少なくとも一つのＶ領域遺伝子、少なくとも一つのＪ領域遺伝子及び少な くとも一つの定常領域遺伝子を有する再配列されていないヒト免疫グロブリン遺 伝子を含むＹＡＣを含むトランスジェニックマウス。29. at least one V region gene, at least one J region gene and at least one Unrearranged human immunoglobulin genes with at least one constant region gene Transgenic mouse containing YAC containing gene. ３０．トランスジェニックマウスがヒト免疫グロブリン鎖を発現する、請求の範 囲第２９項のトランスジェニックマウス。30. The claimed transgenic mouse expresses human immunoglobulin chains. Transgenic mouse of item 29. ３１．ＹＡＣがヒト重鎖の遺伝子座の８５ｋｂのＳｐｅＩフラグメントを含む、 請求の範囲第２９項のトランスジェニックマウス。31. the YAC contains an 85 kb SpeI fragment of the human heavy chain locus, The transgenic mouse of claim 29.