JPH09509046A - Transgenic mouse - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ヒト変異タンパク質配列を発現するマウスの製法であって、該方法は、a)酵母の人工的な染色体内に含まれる遺伝子の一部または全体を得、b)相同組み換えによって、該酵母の人工的な染色体内に所定の変異遺伝子配列を導入し、c)トランスジェニック体を利用して、該変異遺伝子を胚幹細胞に挿入し、およびd)該幹細胞を胚盤胞に注入して、該ヒトタンパク質配列を発現するトランスジェニックマウスを誘発する工程を含む。上記方法により製造されるトランスジェニックマウスおよび上記方法によって生成された変異酵母の人工的染色体をも開示する。   (57) [Summary] A method for producing a mouse that expresses a human mutein sequence, which comprises a) obtaining a part or all of a gene contained in an artificial chromosome of a yeast, and b) homologous recombination to artificially transform the yeast. A predetermined mutant gene sequence is introduced into the chromosome, c) the transgenic gene is used to insert the mutant gene into an embryonic stem cell, and d) the stem cell is injected into a blastocyst to obtain the human protein. Inducing transgenic mice that express the sequences. Also disclosed are transgenic mice produced by the above method and the mutant yeast artificial chromosomes produced by the above method.

Description

【発明の詳細な説明】 トランスジェニックマウス 技術分野 本発明は、非ヒトトランスジェニック動物に関し、詳細には、突然変異タンパ ク質配列を発現するマウスの作製方法に関する。 発明の背景 ここ数年にわたって、アルツハイマー病の病因及び病状の解明が進められてき た。最近、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）中の突然変異がアルツハイマ ー病の一因であることが判明した¹。これらの突然変異の１つの作用機序及びア ルツハイマー病及びダウン症候群の予想される一因はβ−アミロイドの過剰生産 であると考えられる^3,4。従って、少なくともこれらの病因によるアルツハイマ ー病においては、特有の病状の全てがＡＰＰミス代謝により誘導されるらしいと 推定することができる^5,6。 トランスジェニックマウスにおいてアルツハイマー病のモデルを治療するよう に設計された実験は、これまでほとんど不成功であった。かかる失敗は、導入遺 伝子の低レベルな発現及び／又は発現の不正確な時間的／空間的パターン及び／ 又は間違ったＡＰＰ誘導転写の発現であると説明されてきた。文献にはｃＤＮＡ トランスジェニックマウスでの病原性変異体の使用の報告はないが、おそらく上 記で論じた同じ理由のために突然変異ＡＰＰ配列を有するｃＤＮＡ導入遺伝子が アルツハイマー病理学を進展させなかったことは広くうわさされている。 上記課題のために、アルツハイマー病のような疾患の発病の理解は、主にこれ らの疾患のトランスジェニックモデルを作ることが困難であることから進行が遅 かった。即ち、かなり効率のよいプロトコールがマウスの遺伝子をノックアウト するために開発されたが⁷、遺伝子に微妙な突然変異を導入することは困難であ り、ミスセンス劣性突然変異の作用又は優性突然変異の作用のモデルを作ること は困難であった。ＥＳ細胞内のマウス遺伝子に微妙な突然変異を挿入するために “ヒットアンドラゾ”方法の使用がわずかに報告されている^8,9。 最近、コピー依存、部位依存方法で発現される酵母人工染色体（ＹＡＣ）導入 遺伝子を使用するトランスジェニックテクノロジーの分野が開発されてきた^{10,1 1,12,13} 。これによれば、ＹＡＣ導入遺伝子は未変性遺伝子の発現に類似してい なければならない。従って、本発明者らは、機能分析において、特に、未変性遺 伝子がノックアウトされた動物だけでなく導入遺伝子としてこれらの遺伝子の潜 在的使用を確認した。 ＹＡＣは、酵母中にクローン化される典型的には１００ｋｂ〜１.５Ｍｂの大 きなＤＮＡセグメントである。ＹＡＣベクターの能力があることから、イントロ ン因子及び遠隔調節因子を有する全遺伝子を含む大きなＤＮＡセグメントをクロ ーン化するために用いられる。従来の導入遺伝子と異なり、ＹＡＣは正しい時間 的、空間的及び転写分配をもって発現する。これは、他のトランスジェニック技 術でプロモーター及び調節因子等として用いられた未変性でない挿入因子とは反 対に、遺伝子が未変性制御因子によって制御されることから達成される。これら の技術は、ＡＰＰ遺伝子²⁴並びにチロシナーゼ遺伝子及び重鎖免疫グロブリン遺 伝子に適用されてきた。 上記の観点から、突然変異タンパク質配列を発現するマウスを作製する方法を 誘導する技術、特に、ＹＡＣ導入遺伝子技術を開発することが望ましい。本発明 者は、突然変異をＹＡＣに挿入してトランスジェニックマウスの開発に使用する ことができる幹細胞を誘導するためにＹＡＣ技術と共に“ポップイン／ポップア ウド”法¹⁶を特に適応させた。かかるマウスは、アルツハイマー病のモデルとし て用いることができる。同様の方法は、他のヒト疾患についても用いられる。更 に、かかるマウスは、アミロイド前駆体タンパク質に関連した病因及び病状を有 する種々の疾患の潜在的薬剤を試験するために用いることができる。 発明の要約 本発明によれば、突然変異タンパク質配列を発現する所定の突然変異を含む部 分的又は全部の遺伝子を得る工程及び酵母人工染色体（ＹＡＣ）トランスジェニ ックマウスを使用して該遺伝子を胚幹細胞に挿入する工程により突然変異タンパ ク質配列を発現するマウスを作製する方法が提供される。突然変異は、相同的組 換えによりＹＡＣに導入される。突然変異タンパク質配列を発現するトランスジ ェニックマウスを誘導するために、幹細胞が胚盤胞に注入される。 本発明は、更に、前述の方法によって作られたトランスジェニックマウスを提 供するものである。 本発明は、更に、突然変異ヒトアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）配列を 発現することを特徴とする表現型を有するトランスジェニックマウスを提供する ものである。 本発明は、また、突然変異タンパク質配列を発現する所定の突然変異を含む部 分的又は全部の遺伝子を得る工程及びＹＡＣトランスジェニックマウスを使用し て遺伝子を胚幹細胞に挿入し、もって、マウスゲノムに突然変異を導入する工程 によって修飾されたマウス胚幹細胞を提供するものである。 本発明によれば、アルツハイマー病に罹患しているヒトに見いだされる突然変 異ＡＰＰを発現することによりアルツハイマー病の動物モデルとして特に使用す ることができるマウスを誘導する方法が提供される。 更に、本発明は、動物モデルの形で或いは当業者に周知の方法に従って形質転 換された細胞の形でさえ、潜在的薬剤を薬理学に関して試験しかつ十分に確認さ れた薬剤を使用してその改変した細胞の生理的及び生化学的パラメーターを試験 するための伝達体として使用することができ、これらの手順の全てがアルツハイ マー病に罹患しているヒトの薬力学をよりよく確認するために使用される。かか る手段は、潜在的治療法を設計、誘導及び試験するために薬理学者等によって用 いられる。 図面の簡単な説明 本発明の他の利点は、本発明が下記の詳細な説明について添付の図面と共に考 えた場合に更によく理解されるようになるので容易に理解されるであろう。 図１は、本発明に従って行われた組込み（ポップイン）及び切除（ポップアウ ト）組換え結果の成果を示す実験の概略である。 図２は、ポップインクローンＣ５及びポップアウトクローンＣ２及びＣ３のＰ ＣＲ分析であり、各プライマーセットに対して２回のＰＣＲ反応が生じ、各２回 のうち１回はＢＣ１Ｉで消化された。 図２Ａは、レーン１〜７ポップインクローンＣ５：レーン１プライマーセット ２（配列番号：３、４）非切断、レーン２、プライマーセット２切断、レーン３ プライマー３Ｒ／２Ｆ（配列番号：６、５）非切断、レーン４、プライマー３Ｒ ／２Ｆ、切断、レーン５、プライマーセット３（配列番号：５、６）非切断、レ ーン６、プライマーセット３切断、レーン７プライマーセット４（配列番号：７ 、８）非切断を示す。 図２Ｂは、レーン８〜１５ポップアウトクローンＣ２（変異体）及び３(野性 型):レーン８クローンＣ２プライマーセット２非切断、レーン９クローンＣ２プ ライマーセット２、切断、レーン１０クローンＣ３プライマーセット２非切断、 レーン１１クローンＣ３プライマーセット２切断、レーン１２クローンＣ２プラ イマー３Ｒ／２Ｆ非切断、レーン１３クローンＣ２プライマー３Ｒ／２Ｆ切断、 レーン１４クローンＣ３プライマー３Ｒ／２Ｆ非切断、レーン１５クローンＣ３ プライマー３Ｒ／２Ｆ切断、レーン１６ １ｋｂラダー（ＢＲＬ）を示す。 図３は、ＹＡＣクローンのサザンブロット分析であり、ポップアウト変異体ク ローンＣ２は改造されたＹＡＣ９及び消化されていない未変性ＹＡＣ（Ｂ１４２ Ｆ９）と共に行われた。 図３Ａは、ＢｓｓＨＩＩで消化されたものである。 図３Ｂは、BioRad サイズマーカー（S.cerevisiae及びλコンカテマー）と比 較した電気泳動を示し、消化されていないＹＡＣが約６５０ｋｂでありかつＢｓ ｓＨＩＩフラグメントが約２００ｋｂであることがわかった。 発明の詳細な説明 本発明は、一般的には、突然変異タンパク質配列を発現するマウス又は他の非 ヒト動物を作製する方法を提供するものである。ヒト発病の動物モデルとして使 用する場合、ヒト病状に密接に類似しかつ薬力学及び潜在的治療法の速度論を予 想することができる哺乳動物が通常選ばれる。更に、かかる動物は疾患の発生並 びに疾患及び疾患制御の他の態様を研究するために使用することができる。本発 明は、好ましくはマウスモデルの作製に関するが、他の動物も用いられる（例え ば、ラット）。 本発明は、更に詳細には、突然変異ヒトタンパク質配列を発現するマウスを作 製する上記方法に関する。用途は、突然変異がヒト病原性タンパク質配列を発現 することができるヒト病原性突然変異であるマウスモデルの発生において本発明 から誘導することができる。好ましくは、本発明は、ＡＰＰミス代謝によって誘 発されたアルツハイマー病に特有の病状に関する。 再配列されていないヒトＡＰＰ（ｈＡＰＰ）遺伝子²⁰において特定の突然変異 の例は、病原性ＡＰＰ突然変異ＡＰＰ６７０／１¹⁷及びＡＰＰ７１７Ｖａｌ＞Ｉ ｌｅ¹⁸である。他の突然変異した遺伝子が、突然変異タンパク質配列を発現する 他のマウス及び他の哺乳動物モデルを誘導するために本発明に従って用いること ができることは当然のことである。例えば、突然変異タンパク質配列を発現する 本発明に従って用いられる他の配列はＡＬＳのモデルとしての突然変異スーパー オキシドジスムターゼ及び嚢胞性線維症のモデルとしての突然変異ＣＦＴＲであ る。もって、突然変異タンパク質配列を発現する所定の突然変異を含むかかる部 分的又は全部の遺伝子を得るか又は発生させることができる。例えば、本発明に よれば、再配列されていないｈＡＰＰ遺伝子は下記で詳述されかつRothstein¹⁶ に述べられているように“ポップイン／ポップアウト”法を用いて突然変異され る。このRothsteinの参考文献に開示された手法を参考として本明細書中に引用 する。 ポップイン／ポップアウト法は、突然変異遺伝子フラグメントをＹＡＣに挿入 するために相同的組換え技術を使用する一例である。次に、ＹＡＣトランスジェ ニックマウスを使用して突然変異ＹＡＣをマウス胚幹細胞に、もってマウスに導 入することができる。 更に詳細には、“ポップイン／ポップアウト”法では、ウラシル原栄養を生じ る組込み結果を選ぶためにＵＲＡ３が用いられた。組換え切除結果は、５−フル オロオロト酸（５−ＦＯＡ）を用いてＵＲＡ３遺伝子に対して負の選択をするこ とにより選ばれる。この方法には、宿主酵母菌株がウラシル依存性であることが 必要である（ＵＲＡ３遺伝子座によってコードされた酵素オロチジン−５′−リ ン酸塩脱炭酸酵素を必要とする）。これには、ベクター内のＵＲＡ３遺伝子が当 業者に既知の改造法により他の選択可能なマーカーで破壊されることが必要であ る¹⁸。“ポップイン／ポップアウト”法は、挿入断片をニワトリグロビン遺伝子 を含む３８ｋｂＹＡＣに入れるために用いられた¹。この手順において、ＵＲＡ ３は正及び負双方の選択可能なマーカーとして用いられる。プロトコールは、図 １に一般的に示されている。ｐＲＳ４０６／ＡＰＰ構築物とＣｅｌＩＩとを線状 化すると、ＹＡＣの相同な位置で組換えを促進する組換え促進端を生じる。効率 のよい相同的組換えは、６００ｐｂ相同領域の３′端から８５ｂｐ及び突然変異 から１１８ｂｐの位置で線状化された領域内で起こることが判明した。構築物を 単一相互乗換えにより組込むと、ＹＡＣ内のエキソン１７領域の重複が生じる。 重複したエキソン１７領域は、相互乗換えの位置によっては突然変異体或いは野 性型エキソンの切除を生じる自然染色体内組換え結果を受けることができる。Ｙ ＡＣ組換え結果を評価するために他の選択系を用いることができることは当然の ことである²⁴。 たいていのＹＡＣライブラリーの構築に用いられるベクター、ｐＹＡＣ４も選 択可能なマーカーとしてＵＲＡ３を使用する。従って、プロトコールの第１段階 は、改造するベクターｐＲＶ１で達成することができるベクターアームでのＵＲ Ａ３遺伝子座の破壊である¹⁸。この手順により、リシン原栄養の選択可能マーカ ーがＵＲＡ３遺伝子座ＹＡＣアームに挿入される。これにより、酵母がウラシル からリシン原栄養に変換される。具体的な方法は、下記実験の項で記載される。 ＡＰＰ６７０／１突然変異を含有及びＡＰＰ７１７突然変異を含有する特定の ｈＡＰＰＹＡＣが作成された。当該技術において既知の方法により、他の突然変 異及びAＰＰ６７０／１とＡＰＰ７１７突然変異との組合わせのような突然変異 の組合わせを取込む他のＹＡＣを作成することもできる。 本発明に従って用いられるＹＡＣの例は、Ｂ１４２Ｆ９である（セントルイス ＹＡＣライブラリーの命名）。ＹＡＣＢ１４２Ｆ９は、以前には全ヒトＡＰＰ遺 伝子を約２００ｋｂの上流配列及び１５０ｋｂの下流配列と共に含むことが示さ れた^14,16。Ｂ１４２Ｆ９は例として用いられるが、大体においてＹＡＣはその ように修飾される。 ヒトＡＰＰ配列を発現することを特徴とする表現型を有するトランスジェニッ クマウスを発生させることに関して、下記プロトコールが用いられる。ベクター アームのｕｒａ３遺伝子は、ＹＡＣ含有酵母をウラシルからリシン原栄養に変換 するために破壊される。コドンＡＰＰ６７０及び６７１に突然変異を含むエキソ ン１６及びＡＰＰ７１７に突然変異を含有するエキソン１７は、Yoshikaiらから 誘導された配列情報を用いてｕｒａ３遺伝子を含有する酵母シャトルベクター中 にクローン化される²⁰。ＹＡＣ含有酵母は線状化構築物で形質転換され、無ウラ シル培地中に選択される（ポップイン結果）。ポップアウト結果は、下記に詳述 されるように、５−ＦＯＡを使用して選択される。突然変異を含みかつ再配列さ れていないＹＡＣが選択される。 本発明に従って行われる具体的な方法は次の通りである。 ＹＡＣ含有酵母は、記載されているように栄養ブイヨン中で発育されパルスフ ィールド電気泳動用に調製される²¹。ＹＡＣ及び他の酵母染色体はパルスフィー ルドゲル電気泳動によって分離される。ＹＡＣはゲルから切断され、ゲルアガロ ースはβ−アガラーゼで消化される。全段階においてＹＡＣが剪断されないよう に注意する。 Ｃ１細胞が用いられ、培養される。用いられる他の幹細胞の例は、ＡＢ１、Ｄ ３、Ｅ１４又は本発明に従って生殖系列に分配することができる他のＥＳ細胞で ある。他の細胞系も当業者によって用いられることは当然のことである。細胞は 、ネオマイシン線維芽細胞支持細胞層の培養内に維持される²²。ネオマイシン耐 性線維芽細胞系を用いるための論拠は、これらの支持細胞が選択手順を生存する ことである（下記参照）。 幹細胞は、リポフェクション前日に３５mmウェルに移される。８００ngの精製 ＹＡＣＤＮＡを、１２ngｐＰＧＫ−ｎｅｏ（選択可能マーカー）と共にＯｐｔｉ ＭＥＭ^TM（ＢＲＬ）で１００μｌに希釈された１０μg のTransfectam^TM(Promeg a)とプラスチック管中で１時間複合体を形成する。ＹＡＣ／ｐＰＧＤ−ｎｅｏ／ 脂質複合体をＥＳ培地（ＢＲＬ）で１０倍に希釈し、排出されたＥＳ細胞に加え る。これらを一晩インキュベートする。この手順の論拠は、細胞の部分がネオマ イシン耐性を与えるプラスミドとＹＡＣＤＮＡの双方を含むＤＮＡを溶解するこ とである。次に、ネオマイシン耐性細胞が選択される。 次いで、細胞を、G418（ネオマイシン耐性遺伝子がない場合には有害な、ネオ マイシン類似体）の存在下で、２週間成育させる。耐性細胞を収穫し、増殖させ る。これら細胞の殆ど全てが、その内部に組み込まれた該ネオマイシン耐性遺伝 子（pPGK-neoによってコードされる）をもつであろう。該細胞の一部は、その中 に組み込まれた該YAC をももつであろう。次に、これら細胞を、ヒトエキソン17 の存在に関する、PCR スクリーニングによるYAC DNA の組み込みにつきスクリー ニングする。これは効果的なスクリーニングプロトコールであり、このことは、 各コロニーを個別にスクリーニングする必要はなく、従って多くのコロニーを迅 速にスクリーニングすることが可能となることを意味する。次いで、このスクリ ーニングに関して正のコロニーを、前に記載された方法によって、APP の他のエ キソンにつきスクリーニングして、該YAC 全体が該細胞中に組み込まれたか否か を確認する²³。 該YAC の組み込みに関する初期のスクリーニングは、PCR 法によって実施され ており、そこではまず選択されたAPPエキソンおよび該APP プロモータ^8,23のPCR 分析が行われる。また、ALU-PCR(これはヒトDNA の存在下でのみPCR バンドを与 える)を実施し、かつ該幹細胞の該ALU-PCR プロフィールを、元のYAC のプロフ ィールと比較する。該全hAPP遺伝子を含むと考えられる細胞系を、これらが完全 なYAC を含むか否かを知るために(YACベクターアーム(vector arms)をスクリー ニングすることにより）、更に特徴付けする。全ての該hAPPエキソンおよびプロ モーターを含有する細胞系をパルスフィールドゲル電気泳動法にかけて、該遺伝 子を、固定化DNA に対するAPP のハイブリダイゼーションによりマッピングして 、該YAC 中の該遺伝子のマップと比較することができる。 また、これらの細胞系を、以下に記載するように、hAPP695、hAPP751 およびh APP770の、そのマウスの等価物からの識別アッセイ(differential assay)を可能 とする配列を含む、hAPP特異的配列に関するS1ヌクレアーゼ保護アッセイによっ て、該hAPP遺伝子の発現につき検討する。異なるヒトイソ型の相対比を、該マウ スイソ型の該比と比較する。この実験は、該マウス細胞が該マウス転写体をプロ セッシングするのと同様な方法で、該細胞が該hAPP転写体をプロセッシングする か否かを示すある指標を与える。 マウス株C57 胚盤胞を卵管のフラッシング(flushing)によって単離する。該胚 盤胞を幹細胞と共に注入し、かつ標準的な技術²²によって疑似妊娠C57 保育器に 転移させる。外皮の色を、どの動物が該幹細胞由来の細胞を高率でもつかを決定 するための識別子として使用する。というのは、C57 マウスの外皮は黒色である が、該幹細胞が由来とする細胞系は、外皮の色において縞模様状であるからであ る。大量の幹細胞由来の成分をもつと考えられる該マウスを、FVB マウスと交尾 させ、どの動物が該幹細胞由来のものであるかを決定するために、外皮の色を利 用する。該C57 マウスが該トランスジェニック動物の生殖細胞系に寄与しないよ うに、この増殖プロトコールを選択する。というのは、高齢のC57 マウスがその 脳に細胞含有物をもち、これがアミロイド沈着物と誤認される可能性があること が、プライス(Price)等によって示されているからである。 該幹細胞由来の該マウスは、少なくとも以下の方法で解析される。 １）該hAPP遺伝子の完全性は、該幹細胞に関連して上記した如き、PCR および パルスフィールドゲル電気泳動法によって解析される。 ２）hAPPの発現の組織特異的細胞パターンを、S1ヌクレアーゼ保護²⁹およびRT -PCR²⁹により解析する。該hAPP遺伝子の発現を、同一のサンプル中の固有の遺伝 子の発現と比較して、該hAPP遺伝子が該固有遺伝子と同様な方法でプロセッシン グされるか否かを決定する。 ３）これらのマウスを、３カ月、９カ月および18カ月における「ヒト−様」の 神経病理に関する病理につき検査する。 以下の実験は、変異体構築、特異的な「ポップ−イン(pop-in)」、「ポップ− アウト(pop-out)」法を利用したYAC 中におけるかかる構築物の組み込み、およ びかかる形質転換された幹細胞の機能的応答能に関して、本発明の利用可能性を 立証している。 上で詳細に論じた技術を利用することにより、このような幹細胞を、胚盤胞へ の組み込みおよびトランスジェニック動物、例えば上記の特異的方法を利用した 上記のトランスジェニックマウスの誘導のために作成でき、あるいは変異YAC 含 有細胞(例えば、Cos)を、当分野で周知の手順によって、薬力学、薬物動態学お よび薬理学並びに関連するテスト手順のために利用できる。pRS406/APPエキソン17構築物の調製 PCR を利用して、APP 転写物770 のコドン717 のバリン−イソロイシン変異を 担持する発病群(F172)構成員由来のゲノムDNA の一部を増幅した。プライマー群 １（配列表Seq．ID．Nos．1，2）を標準的な100 μｌPCR ミックスで使用して、 以下のように反復した。即ち、90℃にて５分間、94℃にて１分間、54℃にて１分 間、72℃にて１分間、(x35サイクル)、72℃にて10分間。 数回の反応で得たPCR 生成物をプールし、マジックPCR 処方物(Magic^TMPCR pr eps)(プロメガ(Promega))を使用して精製した。該アンプリファイヤーを３時間H ind IIIで消化し、該生成物をマジッククリーンアップ(Magic^TMclean up)カラム 上で精製した。このpRS406ベクターDNA（ストラタジーヌ(Stratagene)）をもHin d IIIで３時間消化し、該反応を65℃にて10分間インキュベーションすることに より終了した。該ベクターのその後のリサーキュラリゼーション(recircularisa tion）を、全体で50分間の37℃でのCIAP処理(プロメガ(Promega))によって阻止 した。ほぼ等量(200 ng)の該ベクターおよび挿入断片を、T4DNA リガーゼレディ ー−ツー−ゴー(Ready-to-Go^TM)キット(Pharmacia))を使用して、16℃にて45分 間連結した。該連結混合物の1/10を、DH５αサブクローニング有効性(subclonin g efficiency)能力細胞(BRL)を形質転換するのに使用し、該全形質転換混合物（ その体積を100μｌまで減少させた）を、アンピシリン(100μg/ml)、Ｘgalおよ びIPTG(プロメガ(Promega))LBを含有するＬ寒天プレート上に展開した。白色の コロニーを、後で利用するために、格子状に分割し、プライマー群２(配列表のS eq．ID．Nos．3，4)を使用して、爪楊枝で取り出したコロニーを直接PCR によっ てスクリーニングした。変異体の存在は、該未精製PCR 生成物のBclI（これは該 生成物を２つの等しいサイズのフラグメントに開裂する）による消化により確認 した。この消化生成物を、2%メタフォア(Metaphor^TM)(FMC)/1% アガロースゲル 上で可視化した。これらの変異体コロニーを、アンピシリン(50 μg/ml)および マジックミニプレプ(Magic^TMminiprep)カラム(プロメガ(Promega))を使用して精 製した該プラスミドDNA を補充したTB中で成育させた。このDNA を、ベーリンガ ーバッファーＨ中で、SalI(プロメガ(Promega))およびCelII（ベーリンガー(Boe hringer)）両者0.5Uによって消化して、該フラグメントの配向を決定し た。 ゲノムDNA を、標準的なフェノール／クロロホルム抽出手順によって、または カラムを使用した方法²⁹を利用することにより調製する。 該変異クローンの一つを、その全長に沿った両方向において配列決定した。そ の二本鎖鋳型DNA を調製²⁵し、シーケンス(Sequence:登録商標)2.0 キット(USB) を使用して配列決定した。この反応の生成物を、6%シーカゲル(Sequagel^TM)ポリ アクリルアミドゲル（ナショナルダイアグノスティックス(National Diagnostic s)）を介しての電気泳動によって分割した。配列決定用プライマー(2μM におけ る)は、第１表に掲載したものである。YAC B142F9のノックアウト(Knockout) B142F9のコロニーを、aAHC-(-ura，-trp)中で３×10⁷細胞／mlの密度にまで成 育させた。スフェロプラスト化細胞を、バーガーズ＆パーシバル²⁶(Burgers and Percival)の方法に従って製造した。100μｌのスフェロプラスト化細胞を、200 ngのpRV1¹⁴および５μgのキャリヤーpBluescript(登録商標)DNA(ストラタジー ヌ(Stratagene))で形質転換し、-lysソルビトールプレート上に展開した。正の コロニーを、-lysプレート上での選別および-uraプレート上でのスクリーニング により同定した。選択された14個のコロニーのうち、３個が正確に改良された(r etrofitted)ように思われた。固有のB142F9酵母DNA と共に、これら３種のコロ ニーのアガロースプラグを調製²⁷し、該酵母染色体を、切替え時間40-70 秒で20 0Vにて24時間に渡る、1%アガロースゲルを通してのパルスフィールド電気泳動（ バイオラドチェフ(BioRad Chef)III^TM）によって分割した。このDNA をハイボン ド(Hybond^TM)N+膜（アマーシャム(Amersham)）に一夜かけて移し、標識したネオ マイシン遺伝子プローブによりハイブリッド形成した。約650 kbのシグナルバン ドが全てのレーンにおいて見られ、これは該YAC が、該形質転換中に大幅な再配 列を生じなかったことを示している。APP 構築物による、改良されたYAC の形質転換 該改良されたYAC(クローン９)の一つを、前に記載した如くスフェロプラスト 化した。このpRS406/APP構築物をCelII で消化することにより線状化し、マジッ ク(Magic^TM)クリーンアップ上で精製した。200 ngの構築DNA ＋５μｇのpBlues cript(登録商標)DNA を使用して、該スフェロプラスト化酵母細胞を形質転換し た。次いで、-uraソルビトールプレート上で選別した。ポップ−インクローンの分析 該APP 構築物の組み込みを行った形質転換体を、前に概説した条件を使用し、 プライマー群２(配列表のSeq．ID Nos．3，4)、３(配列表のSeq．ID Nos．5，6) および４(配列表のSeq．ID Nos．7，8)（第１表）を用いた標準的PCR によって スクリーニングした。未精製のPCR 生成物をBclIで、50℃にて３時間消化し、該 消化物を2%メタフォア(Metaphor^TM)/1%アガロースゲルを介する電気泳動によっ て分離した。ポップ−アウトクローンの製造および分析 ポップ−インクローンC5の飽和培養物100 μｌを、1mg/mlの5-フロロオロチン 酸(5FOA,シグマ(Sigma)²⁸)を補充した-lysプレート上で平板培養した。５個の正 のコロニーを、プライマー群２(配列表のSeq．ID Nos．3，4)および３(配列表の Seq．ID Nos．5，6)を用いたPCR によって分析し、変異体エキソンの保持率およ び該ベクター配列の喪失につきチェックした。１種の正のクローン(C2)の完全性 を以下のようなパルスフィールドマッピングによって評価した。 B142F9のアガロースプラグ、改良されたYAC9および変異体YAC C2を調製（上記 参照）した。該酵母染色体を、切替え時間50-90 秒間、6V/cm にて25時間、14℃ にて、1%ゲルを介するPFGE(バイオラドチェフ(BioRad CHEF)III(登録商標))によ って調製した。このDNA をハイボンド(Hybond^TM)N+ 上にブロッティングし、68 ℃にてクイック−ハイブ(Quick-hyb^TM)(ストラタジーヌ(Stratagene))内で、プ ライマー群２により増幅された精製APP PCR 生成物によって、１時間ハイブリッ ド形成した。このプローブを10分間37℃にて、レディー−ツー−ゴー(Ready-to- Go^TM)DNA標識キット(ファルマーシア(Pharmacia))を使用して、高い特異的活性 にまで標識した。このブロットを、１×SSC(処方は、モレキュラークローニング ：アラボラトリーマニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual),第２ 版，CHS プレス，1989，pg．B.13に与えられている)、0.1%SDS で２度、室温に て15分間、次いで0.1 ×SSC，0.1% SDS 中で１回、60℃にて30分間洗浄した。該 C2 YACを含有するアガロースプラグを、40ＵのBssHIIで消化し、切替え時間15 -45 秒でのPFGEにより11時間分離を行った。前に記載した如く、ブロットを調製 し、かつ該APP プローブを使用してハイブリッド形成した。 配列分析は、ビオチニル化2Rプライマー(Seq．Id．No．4)および標準2F(Seq． Id．No．3)を使用して増幅したPCR 生成物から得た。この生成物を、製造業者の 勧めに従って、ダイナビーズ(Dynabeads)上で精製し、かつ配列決定した。 該YAC の該URA3遺伝子を、前に記載²⁴されたように、pRV1を使用してノックア ウトした。このノックアウト（改良）YAC を-lysプレート上で選別し、次いで-u raプレート上での成育性の欠如につきチェックした。分析した14個のクローンの うち、３種のクローンが正確に改良されていると考えられた。これら３種のクロ ーンをパルスフィールド電気泳動に付し、ブロッティングしおよびネオマイシン 遺伝子プローブを使用してハイブリッド形成して、該YAC が大幅に再配列されて いないことを立証した。これら３種のクローンYAC5、YAC7およびYAC9は全て完全 であると考えられた。 クローニング法の選択には多数の制約があり、該挿入断片中の固有の制限サイ トが該構築物を線状化して、組み込みを促進する必要があり、かつこの組み込み は該変異サイトからある距離隔たっていて、該変異塩基の不適切な修復を防止す る必要がある。相同配列の長さが十分である場合、第１図に示したように、相同 組み換えが生ずる可能性がある。これらの制約のために、本出願人は、第１表に 与えられた配列（プライマー群１，Seq．ID Nos．1,2）を使用して、HindIII を 尾部にもつプライマーで、エキソン17をPCR 増幅することを選択する。得られた 増幅体をHindIII で消化し、pRS406の該HindIII サイトにクローニングした。選 択された形質転換体の82%が、予想されたPCR 生成物を生成した。これら組み換 えクローンのうち、44% が、ヘテロ接合性DNA 集団に対して、該期待された50% 予想値に近かった。該変異クローンの62% が、所定の配向の該APP フラグメント を含んでいた。これらクローンの１種（クローン８）を両配向において配列決定 し、該変異の存在および該配列の完全性を確認した。 改良したYAC9を該線状化した変異APP シャトルベクターで形質転換し、-uraプ レート上で平板培養し、該ベクターの組み込みにつき選別した。更なる分析のた めに６個のコロニーを選択した。該ポップ−イン組み換え事象は、該YAC 内の該 エキソン17フラグメントの複製に導くことが予想され、該変異型および野性型の エキソンは該pRS406ベクター配列により分離されていた。３種のプライマー群（ 第１表）を使用して、該ポップ−イン事象が、第２図に示されたように、予想通 り生じているか否かを確認した。プライマー2F(Seq．ID No．3)および2R(Seq．I D No．4)の配列は、該エキソン内に位置しており、従って鋳型として該変異およ び内在性のエキソン両者を使用して、385 bpのフラグメントを増幅する。該選択 的酵素(BclI)⁹による該PCR 生成物の消化は、該変異型および野性型配列両者が 存在することを示した。しかしながら、この変異はプライマーサイト2Fおよび2R から殆ど等距離であり、かつこの消化によって生成した該２つのフラグメントを 分離することは不可能であった。プライマー3R(Seq．ID No．6）の配列は該変異 構築物の外部に位置し、従って該YAC 中の該APP 配列を識別する。該ベクターに 特異的なプライマー（プライマー3F，Seq．ID No．5)と組み合わせた場合には、 増幅される唯一のフラグメントは、変異エキソン17構築体のものである。このフ ラグメントのBclIによる消化は、この変異の指標となる２つのバンドを生成する 。この結果を、プライマー3R/2F を使用して確認した。これら両PCR 反応におけ るプライマ-3Rの使用は、該変異エキソン（該pRS406ベクターと共に）が該YAC の正確な位置に組み込まれたことを立証する。プライマー群４(Seq．ID Nos．7 ，8)は、該APP プローモータが、依然として該クローン中に存在することを示し た。分析した６個のクローンのうち、ただひとつ(C5)が正確なPCR プロフィール を示した。 該ポップ−アウト事象は自然に発生し、またポップ−インクローンC5を、リジ ンを含まないが、5FOAを含有する寒天上で平板培養することにより直接選別した 。ポップ−アウト（除去事象）した唯一のコロニーは、URA3遺伝子をコードする ベクターを失い、かつ5FOAプレート上で成育できる。５種のこのようなコロニー を、更に分析するために選択した。 このポップ−アウトクローンを、まずプライマー群２（Seq．ID Nos．3，4)で 増幅し、次いで該生成物をBclIで消化することによりスクリーニングした。これ ら５種のクローンのうちの２種は、該APP プライマーによって増幅されなかった が、このことは該エキソン17領域の喪失を示唆する。残りの３種のクローンはプ ライマー群２によるPCR 生成物を生成した。該生成物の消化は、２種のクローン （C1およびC3）が該野性型のエキソンのみを保持し、一方でC2は該変異エキソン のみを保持していることを示した。C1およびC2を、更に以下のプライマー群（第 2B図）で増幅することにより特徴付けした。 これら両クローンはプライマー群３により増幅されなかったが、このことは該 ベクターが欠如していることを示す。群3R/2F により増幅されたPCR 生成物の消 化は、C1が該変異フラグメントを失い、かつC2がこれを保持していることを立証 した。 該変異YAC の完全性を幾つかのレベルにおいて評価した。まず、該元のB142F9 から調製したアガロースプラグおよび該改良クローン９を、該変異YAC C1と並べ て電気泳動処理した。このDNA をブロッティングし、かつAPP エキソン17PCR プ ローブでハイブリッド形成した。約650 kbであると見積もられた、３種のサンプ ル全てにおける等価なサイズをもつ単一のバンドにまで、該プローブをハイブリ ッド化した（第3A図）。第二に、該３種のアガロースプラグをBssHIIで消化し、 かつ上記のように電気泳動させた。該エキソン17プローブを、３種のサンプル全 てにおける約200 kbの単一のバンドにまでハイブリッド化した（第3B図）。第三 に、該変異YAC の直接的PCR 配列決定を実施して、該変異がこの手順中に該YAC 内に挿入された唯一の変化であったことをチェックした。 上記データは、本発明に従って構築された該YAC が、具体的に定義されたよう に、元のYAC とは異なることを示している。遺伝的には、この差異は、コドンAP P717における病原的変異の置換にあるに過ぎない。これらのYAC は、アルツハイ マー疾患のアミロイド沈着の発病性を更に検討するように工夫された、トランス ジェニック実験における有用性が見出される。実際に、本発明による改良が、よ り迅速なアミロイドの沈着に導くYAC を与えるであろうことが、高い確率で予想 できる。というのは、これらの配列がヒトにおける高率での沈着¹をもたらすか らである。トランスジェニック実験におけるB142F9の使用は、このYAC の使用が ヒトAPP mRNA¹⁵およびタンパク質の正確な発現をもたらすことを示す。APP 遺伝 子がノックアウトされているマウス内での、APP 変異YAC の使用は、ヒトの疾患 に対応する正確な動物モデルを得ることを可能とする。 より一般的には、本発明は、公知技術に関連して上で論じた如く、酵母におけ る目的の相同組み換えが実用的かつ比較的迅速な、直接胚の幹細胞を標的とする 遺伝子に対する即効性の代用物である。本発明の手順は迅速（これらの実験は３ カ月以内の短期間で実施された）で、安価（標準的な分子生物学的装置のみを使 用した）で、しかも最小量の配列情報（１kb末満）が各変異サイト近傍で知られ ていることのみを必要とする。これとは対照的に、該ヒットアンドラン(hit and run)プロトコール⁴を使用した哺乳動物細胞中の効果的な相同組み換えに対して は、５kbを越える同質配列情報が必要とされる。これは、通常ヒト遺伝子のマウ ス同族体の単離および特徴付けを必要とする。また、YAC 変異形成は、酵母内で クローニング可能なヒト並びにネズミ遺伝子全てに対して適用できる。本発明の 方法は、また他の哺乳動物遺伝子に対しても利用可能であることが予想される。 同様に注目すべきは、該ヒトゲノムプロジェクトにより、多くの遺伝子由来のYA Cが主として入手可能となっているという事実である。かくして、これらの手順 の実施可能性は、該分子的資源の入手可能性によって制限されない。 上記のような観点から、本発明は、変異タンパク質配列、例えば変異APP を発 現するマウス等の動物を、YAC トランスジェニック法を利用して製造するために 有用な方法を提供する。この方法によって製造したトランスジェニックマウスは 、上記したものであり、これは変異ヒトAPP 配列を発現することにより特徴付け られる表現型をもつ。最後に、上記した本発明は、上記の方法によって変性され たマウス胚幹細胞を与える。 以上本発明を例示的に説明してきたが、使用してきた用語は、限定的というよ りも寧ろ説明上の用語の特徴を意図していることを理解すべきである。 明らかに、本発明の多くの改良並びに変更が、上記の教示に照らして可能であ る。従って、添付した請求の範囲内で、具体的に説明した以外にも本発明を実施 できるものと理解すべきである。 Detailed Description of the Invention                         Transgenic mouse                                 Technical field   The present invention relates to non-human transgenic animals, in particular mutant mutant proteins. The present invention relates to a method for producing a mouse that expresses a protein sequence.                                BACKGROUND OF THE INVENTION   Over the past few years, the etiology and pathology of Alzheimer's disease have been elucidated. Was. Recently, a mutation in the amyloid precursor protein (APP) has been detected in Alzheimer's disease. -It was found to be a cause of the disease¹. One of the mechanisms of action of these mutations and Overproduction of β-amyloid is a possible cause of Luzheimer's disease and Down's syndrome Considered to be^3,4. Therefore, at least due to these etiologies Alzheimer's -In disease, it seems that all of the peculiar medical conditions are induced by APP metabolism. Can be estimated^5,6.   To treat a model of Alzheimer's disease in transgenic mice The experiments designed to have been largely unsuccessful so far. Such failure is due to Low level expression of genes and / or incorrect temporal / spatial patterns of expression and / or Or, it has been described as the expression of wrong APP-induced transcription. CDNA in the literature There are no reports of the use of pathogenic variants in transgenic mice, but the above For the same reason discussed above, a cDNA transgene with a mutated APP sequence is It is widely rumored that it did not advance Alzheimer's pathology.   Due to the above problems, the understanding of the onset of diseases such as Alzheimer's disease is mainly due to this. Slow progression due to difficulty in creating transgenic models for these diseases won. That is, a fairly efficient protocol knocks out mouse genes Was developed to⁷, It is difficult to introduce subtle mutations in the gene To model the effects of missense recessive mutations or dominant mutations Was difficult. To insert subtle mutations in mouse genes in ES cells Slightly reported use of the "hit and razo" method^8,9.   Recently, introduction of yeast artificial chromosome (YAC) expressed by copy-dependent and site-dependent methods The field of transgenic technology using genes has been developed^{10,1 1,12,13} . It shows that the YAC transgene is similar to the expression of the native gene. There must be. Therefore, in the functional analysis, the present inventors have found that Not only the animals whose genes have been knocked out, but also the latent genes for these genes as transgenes. Confirmed indigenous use.   YACs are large, typically 100 kb to 1.5 Mb cloned in yeast. It is a DNA segment. Introducing the ability of YAC vector Of a large DNA segment containing the entire gene containing the activating factor and distant regulator. It is used to convert the material. Unlike traditional transgenes, YAC is the right time It is expressed by physical, spatial and transcriptional partitioning. This is another transgenic technique In contrast to non-native insertion factors used as promoters and regulatory factors in surgery, Pairwise, it is achieved because the gene is regulated by a native regulator. these Technology is the APP gene^{twenty four}And tyrosinase gene and heavy chain immunoglobulin Has been applied to the gene.   From the above viewpoint, a method for producing a mouse expressing a mutein sequence is provided. It would be desirable to develop techniques for induction, especially YAC transgene technology. The present invention Use mutations in YAC to develop transgenic mice In order to induce stem cells that can Udo ”method¹⁶Specifically adapted. Such mice were used as a model for Alzheimer's disease. Can be used. Similar methods are used for other human diseases. Change In addition, such mice have pathogenesis and pathologies associated with amyloid precursor protein. Can be used to test potential drugs for a variety of diseases.                                SUMMARY OF THE INVENTION   According to the invention, the part containing the predetermined mutation that expresses the mutein sequence. Process for obtaining partial or whole gene and yeast artificial chromosome (YAC) transgeny By using the mouse to insert the gene into embryonic stem cells. Methods for producing mice that express the cytoplasmic sequences are provided. Mutation is a homologous set It is introduced into YAC by replacement. Transgene expressing a mutein sequence Stem cells are injected into the blastocyst to induce the mouse.   The present invention further provides a transgenic mouse produced by the above method. To offer.   The present invention further provides mutant human amyloid precursor protein (APP) sequences. Provide a transgenic mouse having a phenotype characterized by expression Things.   The present invention also includes a moiety containing a predetermined mutation that expresses a mutein sequence. Using the process of obtaining partial or total genes and YAC transgenic mice The gene into the embryonic stem cell, thus introducing a mutation into the mouse genome. The present invention provides a mouse embryonic stem cell modified by.   According to the invention, the sudden changes found in humans suffering from Alzheimer's disease. It is particularly useful as an animal model for Alzheimer's disease by expressing different APP A method of inducing a mouse is provided.   In addition, the present invention provides for transformation in the form of animal models or according to methods well known to those skilled in the art. Even in the form of transformed cells, potential drugs have been tested and well-confirmed for pharmacology. The modified cells to test the physiological and biochemical parameters of the modified cells All of these steps can be used as a vehicle for Used to better confirm the pharmacodynamics of humans suffering from Mar's disease. Scarecrow Means to be used by pharmacologists and others to design, induce and test potential therapeutics. Can be.                             Brief description of the drawings   Another advantage of the present invention is that it will be considered in connection with the following detailed description in conjunction with the accompanying drawings. It will be easier to understand as it will be better understood.   FIG. 1 shows the incorporation (pop-in) and excision (pop-out) performed according to the invention. G) It is an outline of an experiment showing the results of recombination results.   Figure 2 shows the P of pop-in clone C5 and pop-out clones C2 and C3. It is a CR analysis, and PCR was performed twice for each primer set, and each PCR was performed twice. One of them was digested with BC1I.   FIG. 2A shows lanes 1 to 7 pop-in clone C5: lane 1 primer set. 2 (SEQ ID NO: 3, 4) uncut, lane 2, cut primer set 2, lane 3 Primer 3R / 2F (SEQ ID NO: 6, 5) uncut, lane 4, primer 3R / 2F, cleaved, lane 5, primer set 3 (SEQ ID NOS: 5, 6) non-cleaved, Lane 6, cleavage of primer set 3, lane 7 primer set 4 (SEQ ID NO: 7 , 8) indicates uncleaved.   FIG. 2B shows lanes 8-15 popout clones C2 (mutant) and 3 (wild type). Type): Lane 8 clone C2 primer set 2 uncut, Lane 9 clone C2 primer Limer set 2, cut, lane 10 clone C3 primer set 2 uncut, Lane 11 clone C2 primer set 2 cut, lane 12 clone C2 plasmid Immer 3R / 2F uncut, Lane 13 clone C2 primer 3R / 2F cut, Lane 14 clone C3 primer 3R / 2F uncut, lane 15 clone C3 Primer 3R / 2F cleavage, lane 16 1 kb ladder (BRL) is shown.   Figure 3 is a Southern blot analysis of YAC clones showing the pop-out mutant clones. Loan C2 contains modified YAC9 and undigested native YAC (B142 It was done with F9).   FIG. 3A is digested with BssHII.   Figure 3B shows the BioRad size marker (S. cerevisiaeAnd λ concatemers) FIG. 6 shows the electrophoresed by comparison, the undigested YAC is approximately 650 kb and Bs The sHII fragment was found to be approximately 200 kb.                             Detailed Description of the Invention   The present invention is generally directed to mice or other non-expressing mutein sequences. A method for producing a human animal is provided. Used as an animal model for human pathogenesis When applied, it closely resembles human pathology and predicts pharmacodynamics and potential therapeutic kinetics. Mammals that can be envisioned are usually chosen. In addition, such animals are susceptible to the And can be used to study diseases and other aspects of disease control. Departure Ming preferably relates to the generation of mouse models, but other animals are also used (eg. If rat).   The present invention more particularly produces mice that express mutant human protein sequences. To the above method of making. Uses mutations to express human pathogenic protein sequences The present invention in the development of a mouse model of human pathogenic mutations that can Can be derived from Preferably, the present invention is induced by APP miss metabolism. The present invention relates to a specific medical condition of Alzheimer's disease.   Unrearranged human APP (hAPP) gene²⁰Specific mutations in Is an example of the pathogenic APP mutation APP670 / 1¹⁷And APP717Val> I le¹⁸It is. Other mutated genes express mutant protein sequences Use according to the invention to induce other mice and other mammalian models It is natural that you can do it. For example, expressing a mutein sequence Other sequences used in accordance with the invention are mutated super as models of ALS. Mutant CFTR as a model for oxidodismutase and cystic fibrosis You. Thus, such a portion containing a predetermined mutation that expresses a mutein sequence Partial or total genes can be obtained or generated. For example, in the present invention According to Rothstein, the unrearranged hAPP gene is detailed below.¹⁶ Are mutated using the "pop-in / pop-out" method as described in You. Cited herein as a reference to the techniques disclosed in this Rothstein reference I do.   Pop-in / pop-out method inserts mutated gene fragment into YAC Is an example of using homologous recombination technology to Next, YAC Transge Using a nick mouse, the mutant YAC was introduced into mouse embryonic stem cells and thus into the mouse. You can enter.   More specifically, the “pop-in / pop-out” method produces uracil prototrophy. URA3 was used to select the integration results. The result of recombinant excision is 5-full Negative selection for the URA3 gene using orolotate (5-FOA) Selected by and. This method requires that the host yeast strain is uracil-dependent. Required (enzyme orotidine-5'-ly encoded by the URA3 locus) Phosphate decarboxylase is required). This includes the URA3 gene in the vector. Needs to be destroyed with other selectable markers by remodeling methods known to those skilled in the art To¹⁸. The "pop-in / pop-out" method involves inserting the insert into the chicken globin gene. Used to fill a 38 kb YAC containing¹. In this procedure, URA 3 is used as both positive and negative selectable markers. Protocol is figure 1 generally. Linearize pRS406 / APP construct and CelII When generated, recombination-promoting ends that promote recombination at homologous positions in the YAC are generated. efficiency A good homologous recombination was 85bp from the 3'end of the 600pb homology region and a mutation To 118 bp were found to occur in the linearized region. Construct Incorporation by single cross-over results in exon 17 region overlap within the YAC. The overlapping exon 17 region may be a mutant or a region depending on the crossover position. Subject to natural intrachromosomal recombination results that result in excision of the sex-type exon. Y Of course, other selection systems can be used to evaluate AC recombination results. Is that^{twenty four}.   The vector used to construct most YAC libraries, pYAC4, was also selected. URA3 is used as a selectable marker. Therefore, the first stage of the protocol Is the UR in the vector arm that can be achieved with the modified vector pRV1. Destruction of the A3 locus¹⁸. This procedure allows the selection of lysine prototrophy as a selectable marker. Is inserted into the YAC arm of the URA3 locus. This makes the yeast uracil Is converted to lysine prototrophy. The specific method is described in the experimental section below.   Specific containing the APP670 / 1 mutation and containing the APP717 mutation hAPPYAC was created. Other sudden changes are made by methods known in the art. Mutations such as different and combinations of APP670 / 1 and APP717 mutations Other YACs can be created that incorporate the combination of.   An example of a YAC used in accordance with the present invention is B142F9 (St. Louis YAC library naming). YACB142F9 was previously an all-human APP Shown to contain a gene with an upstream sequence of approximately 200 kb and a downstream sequence of 150 kb. Was^14,16. B142F9 is used as an example, but for the most part YAC Is qualified as   Transgenic gene having a phenotype characterized by expressing human APP sequence The following protocols are used for generating kumas. vector The ura3 gene of the arm converts YAC-containing yeast from uracil to lysine prototrophy To be destroyed. Exo Containing Mutations at Codons APP670 and 671 Exon 17, which contains mutations in protein 16 and APP717, was derived from Yoshikai et al. In a yeast shuttle vector containing the ura3 gene using derived sequence information Cloned into²⁰. YAC-containing yeast was transformed with the linearized construct and Selected in sill medium (pop-in result). Pop-out results detailed below Selected using 5-FOA. Contains mutations and is rearranged Not selected YAC is selected.   The specific method performed according to the present invention is as follows.   YAC-containing yeast are grown in a nutrient broth as described and pulsed. Prepared for field electrophoresis^{twenty one}. YAC and other yeast chromosomes are pulse-fee Separated by cold gel electrophoresis. YAC is cleaved from the gel and gel agaro Sucrose is digested with β-agarase. Prevent YAC from being sheared at all stages Be careful.   C1 cells are used and cultured. Examples of other stem cells used are AB1, D 3, E14 or other ES cells that can be distributed to the germ line according to the present invention is there. Of course, other cell lines may be used by those skilled in the art. Cells , Maintained in culture of neomycin fibroblast feeder layers^{twenty two}. Neomycin resistance The rationale for using the sex fibroblast cell line is that these feeder cells survive the selection procedure That is the case (see below).   Stem cells are transferred to 35 mm wells the day before lipofection. 800 ng purification Optimizing YAC DNA with 12 ngpPGK-neo (selectable marker) MEM^TM10 μg Transfectam diluted to 100 μl with (BRL)^TM(Promeg Form a complex with a) in a plastic tube for 1 hour. YAC / pPGD-neo / The lipid complex was diluted 10-fold with ES medium (BRL) and added to the excreted ES cells. You. Incubate them overnight. The rationale for this procedure is that the part of the cell Lysis of DNA containing both YAC DNA and plasmid conferring isin resistance And. Next, neomycin resistant cells are selected.   The cells were then treated with G418 (which is harmful in the absence of the neomycin resistance gene, (Mycin analog) and allowed to grow for 2 weeks. Harvest and grow resistant cells You. Almost all of these cells have the neomycin resistance gene integrated inside. Will have offspring (encoded by pPGK-neo). Some of the cells Will also have the YAC incorporated into. Next, these cells are transferred to human exon 17 Screen for the incorporation of YAC DNA by PCR screening for the presence of To learn. This is an effective screening protocol, which It is not necessary to screen each colony individually, so many colonies can be This means that screening can be performed quickly. Then this screen Colonies that are positive for learning are then cloned into other APP cells by the method described previously. Whether the entire YAC was integrated into the cell by screening for the exon To confirm^{twenty three}.   Initial screening for the YAC integration was performed by PCR. Where the first selected APP exon and the APP promoter^8,23PCR An analysis is performed. Also, ALU-PCR (which gives a PCR band only in the presence of human DNA) And the ALU-PCR profile of the stem cells was analyzed with the original YAC profile. Compare with the wheel. These cell lines, which are thought to contain the entire hAPP gene, are In order to know whether or not the Further characterization). All the hAPP exons and pros The cell line containing the motor was subjected to pulse field gel electrophoresis to obtain the gene Offspring were mapped by hybridization of APP to immobilized DNA. , Can be compared with the map of the gene in the YAC.   These cell lines were also transformed into hAPP695, hAPP751 and hAPP751 as described below. Allows differential assay of APP770 from its mouse equivalent S1 nuclease protection assay for hAPP-specific sequences, including Then, the expression of the hAPP gene will be examined. The relative ratio of different human isoforms was Compare with the ratio of swiss form. In this experiment, the mouse cells The cell processes the hAPP transcript in a manner similar to that of processing. Gives an index indicating whether or not.   Mouse strain C57 blastocysts are isolated by flushing the oviduct. The embryo Injecting blastocysts with stem cells and standard techniques^{twenty two}Pseudopregnancy by C57 Incubator Transfer. Determine the color of the integument, which animal has a high percentage of the stem cell-derived cells It is used as an identifier for The C57 mouse has a black outer coat. However, the cell line from which the stem cells are derived has a striped pattern in the color of the outer skin. You. The mice, which are thought to have a large amount of stem cell-derived components, were mated with FVB mice. And the color of the integument was used to determine which animal was derived from the stem cells. To use. The C57 mouse does not contribute to the germline of the transgenic animal This growth protocol is selected. Because the old C57 mouse Having cell inclusions in the brain that can be mistaken for amyloid deposits Is indicated by the price or the like.   The stem cell-derived mouse is analyzed by at least the following method.   1) The integrity of the hAPP gene is determined by PCR and PCR as described above in connection with the stem cells. It is analyzed by pulse field gel electrophoresis.   2) S1 nuclease protection of the tissue-specific cell pattern of hAPP expression²⁹And RT -PCR²⁹Analyze by. The expression of the hAPP gene is determined by the unique inheritance in the same sample. The hAPP gene is processed in the same manner as the native gene in comparison with the expression in the offspring. Determine whether or not   3) These mice were tested for "human-like" at 3, 9 and 18 months. Check for pathology related to neuropathology.   The following experiments demonstrate mutant construction, specific "pop-in", "pop-in" Incorporation of such constructs in YAC using the "pop-out" method, and And the functional responsiveness of such transformed stem cells. Proven.   By utilizing the techniques discussed in detail above, these stem cells can be transformed into blastocysts. Integrated and transgenic animals, for example utilizing the specific method described above It can be prepared for the induction of the transgenic mice described above, or it may contain mutant YACs. Cells (e.g., Cos) can be treated with pharmacodynamics, pharmacokinetics and pharmacokinetics by procedures well known in the art. And for pharmacology and related test procedures.Preparation of pRS406 / APP exon 17 construct   Using PCR, the valine-isoleucine mutation at codon 717 of APP transcript 770 was deleted. A part of the genomic DNA derived from the member carrying the disease group (F172) was amplified. Primer group 1 (Seq. ID. Nos. 1, 2 in the Sequence Listing) was used in a standard 100 μl PCR mix to Repeated as follows. That is, 5 minutes at 90 ℃, 1 minute at 94 ℃, 1 minute at 54 ℃ In the meantime, 1 minute at 72 ℃, (x35 cycles), 10 minutes at 72 ℃.   PCR products from several reactions were pooled and stored in a Magic PCR formulation (Magic PCR^TMPCR pr eps) (Promega). H for the amplifier for 3 hours Digested with ind III and Magic Cleanup the product.^TMclean up) column Purified above. This pRS406 vector DNA (Stratagene) is also by digesting with dIII for 3 hours and incubating the reaction at 65 ° C for 10 minutes Finished more. Subsequent recircularization of the vector is blocked by CIAP treatment (Promega) at 37 ° C for a total of 50 minutes. did. Approximately equal amounts (200 ng) of the vector and insert were taken into T4 DNA ligase ready Ready-to-Go^TM) Kit (Pharmacia)) for 45 minutes at 16 ° C Connected. One-tenth of the ligation mixture was treated with DH5α subcloning efficacy (subclonin g efficiency) used to transform competent cells (BRL) and the total transformation mixture ( The volume was reduced to 100 μl), ampicillin (100 μg / ml), Xgal and And IPTG (Promega) LB on L agar plates. White Colonies were divided into a grid pattern for use later, and primer group 2 (S eq. ID. Nos. Colonies that were picked with a toothpick by direct PCR. Screened. The presence of the variant indicates that the BclI of the crude PCR product (which is Confirmed by digestion of product with cleavage into two equally sized fragments) did. This digestion product was mixed with 2% Metaphor^TM) (FMC) / 1% agarose gel Visualized above. These mutant colonies were treated with ampicillin (50 μg / ml) and Magic Mini Prep^TMMiniprep column (Promega) The cells were grown in TB supplemented with the prepared plasmid DNA. This DNA is the Boehringer -In buffer H, SalI (Promega) and CelII (Boehringer (Boeinger) hringer)) Both digested with 0.5 U to determine the orientation of the fragment Was.   Genomic DNA by standard phenol / chloroform extraction procedures, or Column-based method²⁹It prepares by utilizing.   One of the mutant clones was sequenced in both directions along its length. So Of double-stranded template DNA^{twenty five}Sequence (registered trademark) 2.0 Kit (USB) Was sequenced using. The product of this reaction was converted to 6% Sequagel (Sequagel).^TM) Poly Acrylamide gel (National Diagnostic s)) and resolved by electrophoresis through. Sequencing primer (at 2 μM Are listed in Table 1.Knockout of YAC B142F9   3 colonies of B142F9 in aAHC-(-ura, -trp)⁷Grow to a density of cells / ml I was raised. Spheroplasted cells, Burgers & Percival²⁶(Burgers and  Percival) method. 100 μl of spheroplast cells were added to 200  ng pRV1¹⁴And 5 μg of carrier pBluescript® DNA (Strategie (Stratagene) and spread on -lys sorbitol plates. Positive Select colonies on -lys plates and screen on -ura plates Identified by Of the 14 selected colonies, 3 were correctly improved (r etrofitted). These three species, along with the unique B142F9 yeast DNA Prepare knee agarose plug²⁷The yeast chromosomes for 20-70 seconds with a switching time of 40-70 seconds. Pulsed field electrophoresis through a 1% agarose gel for 24 hours at 0 V ( Bio Rad Chef III^TM) Divided by. This DNA is Hibon Do (Hybond^TM) N + membranes (Amersham) transferred overnight and labeled with neo Hybridized with a mycin gene probe. Approximately 650 kb signal van Is seen in all lanes, which indicates that the YAC has undergone a significant redistribution during the transformation. It indicates that no row was produced.Improved YAC transformation with APP constructs   One of the improved YACs (clone 9) was transformed into spheroplasts as previously described. It has become. This pRS406 / APP construct was linearized by digestion with CelII and Ku (Magic^TM) Purified on cleanup. 200 ng constructed DNA + 5 μg pBlues Cript® DNA was used to transform the spheroplast-yeast cells. Was. It was then sorted on -ura sorbitol plates.Pop-in clone analysis   Transformants with the integration of the APP construct using the conditions outlined above, Primer group 2 (Seq. ID Nos. 3, 4 in the sequence listing), 3 (Seq. ID Nos. 5, 6 in the sequence listing) And 4 (Seq. ID Nos. 7, 8 of the sequence listing) (Table 1) by standard PCR Screened. The unpurified PCR product was digested with BclI for 3 hours at 50 ° C. Digested 2% Metaphor^TM) / 1% by agarose gel electrophoresis Separated.Pop-out clone production and analysis   100 μl of a saturated culture of pop-in clone C5 was treated with 1 mg / ml of 5-fluoroorotene. Acid (5FOA, Sigma)²⁸) -Plated on lys plates. 5 positive Colonies of primer groups 2 (Seq. ID Nos. 3, 4 in the sequence listing) and 3 (sequence listing) Seq. ID Nos. 5, 6) and analyzed by PCR to determine the retention and And the loss of the vector sequence was checked. Completeness of one positive clone (C2) Was evaluated by pulse field mapping as follows.   Prepare B142F9 agarose plug, improved YAC9 and mutant YAC C2 (above Referenced. The yeast chromosome was switched at 50-90 seconds, 6 V / cm for 25 hours at 14 ° C. At 1% gel through PFGE (BioRad CHEF III (registered trademark)). Was prepared. This DNA is Hybond^TM) Blot onto N +, 68 At ° C Quick-hyb^TM) (Stratagene) Hybridized for 1 hour with purified APP PCR product amplified by Limer Group 2. Formed. This probe was ready-to-go at 37 ° C for 10 minutes. Go^TM) High specific activity using DNA labeling kit (Pharmacia) Labeled up to. These blots were 1 × SSC (prescribed by molecular cloning : A Laboratory Manual (Molecular Cloning: A Laboratory Manual), No. 2 Edition, CHS Press, 1989, pg. B.13), 0.1% SDS twice at room temperature For 15 minutes, then once in 0.1 x SSC, 0.1% SDS for 30 minutes at 60 ° C. The Agarose plug containing C2 YAC was digested with 40 U of BssHII and switching time 15 Separation was performed for 11 hours by PFGE at -45 seconds. Prepare blots as described previously And hybridized using the APP probe.   Sequence analysis included biotinylated 2R primers (Seq. Id. No. 4) and standard 2F (Seq. Id. No. Obtained from PCR products amplified using 3). This product is Purified and sequenced on Dynabeads as recommended.   The URA3 gene of the YAC has been previously described^{twenty four}Knocked out using pRV1 as I went out. This knockout (improved) YAC is sorted on the -lys plate and then -u Checked for lack of growth on ra plates. Of the 14 clones analyzed Of these, three clones were considered to have been improved accurately. These three types of black Was subjected to pulse field electrophoresis, blotted and neomycin Hybridizing using a gene probe, the YAC was significantly rearranged Proved that there is no. All three clones YAC5, YAC7 and YAC9 are complete Was thought to be.   There are a number of constraints on the choice of cloning method, including the unique restriction sites in the insert. Must linearize the construct to facilitate integration, and this integration Are some distance from the mutation site and prevent inappropriate repair of the mutant base Need to be If the length of the homologous sequence is sufficient, as shown in FIG. Recombination may occur. Because of these constraints, Applicants have Use the provided sequence (primer group 1, Seq. ID Nos. 1, 2) to set HindIII Choose to PCR amplify exon 17 with a tailed primer. Got The amplificate was digested with HindIII and cloned into the HindIII site of pRS406. Selection 82% of the selected transformants produced the expected PCR product. Recombination of these 44% of the clones were the expected 50% of the heterozygous DNA population. It was close to the expected value. 62% of the mutant clones were the APP fragment in the given orientation Was included. Sequencing of one of these clones (clone 8) in both orientations The presence of the mutation and the integrity of the sequence was confirmed.   The modified YAC9 was transformed with the linearized mutant APP shuttle vector, Plated on plates and screened for integration of the vector. For further analysis Six colonies were selected for this purpose. The pop-in recombination event is generated in the YAC. It is expected to lead to replication of the exon 17 fragment, Exons were separated by the pRS406 vector sequence. Three primer groups ( (Table 1), the pop-in event is predicted as shown in FIG. It has been confirmed whether or not it has occurred. Primers 2F (Seq. ID No. 3) and 2R (Seq. I. D No. The sequence of 4) is located within the exon, and thus the mutation and And the endogenous exons are used to amplify a 385 bp fragment. The choice Enzyme (BclI)⁹Digestion of the PCR product with It was shown to exist. However, this mutation resulted in primer sites 2F and 2R And the two fragments produced by this digestion are almost equidistant from It was impossible to separate. The sequence of primer 3R (Seq. ID No. 6) is the mutation It is located outside the construct and thus identifies the APP sequence in the YAC. To the vector When combined with a specific primer (primer 3F, Seq. ID No. 5), The only fragment amplified is that of the mutant exon 17 construct. This Digestion of Lagment with BclI produces two bands indicative of this mutation . This result was confirmed using primers 3R / 2F. In both of these PCR reactions Primer-3R is used when the mutant exon (along with the pRS406 vector) is Prove that it was installed in the correct position. Primer group 4 (Seq. ID Nos. 7 , 8) show that the APP promoter is still present in the clone. Was. Only one of the 6 clones analyzed (C5) had an accurate PCR profile showed that.   The pop-out event occurs spontaneously and the pop-in clone C5 is Direct selection by plating on agar containing 5FOA . The only colony that popped out (elimination event) encodes the URA3 gene You lose the vector and can grow on 5FOA plates. 5 such colonies Were selected for further analysis.   This pop-out clone was first labeled with primer group 2 (Seq. ID Nos. 3, 4). Amplified and then screened by digesting the product with BclI. this 2 of these 5 clones were not amplified by the APP primer However, this suggests the loss of the exon 17 region. The remaining three clones are A PCR product with the Limer Group 2 was produced. Digestion of the product yields two clones (C1 and C3) retain only the wild-type exon, while C2 is the mutant exon. Showed that you are holding only. Add C1 and C2 to the following primer group ( 2B) and characterized by amplification.   Both of these clones were not amplified by primer group 3, which Indicates lack of vector. Elimination of PCR products amplified by group 3R / 2F Shows that C1 has lost the mutant fragment and C2 retains it. did.   The integrity of the mutant YAC was evaluated at several levels. First, the original B142F9 The agarose plug prepared from E. coli and the improved clone 9 were aligned with the mutant YAC C1. And electrophoresed. Blot this DNA and use the APP exon 17 PCR Hybridized with lobes. Three sumps estimated to be about 650 kb Hybridize the probe to a single band of equivalent size in all (Fig. 3A). Second, digest the three agarose plugs with BssHII, And electrophoresed as above. The exon 17 probe was used for all three samples. Hybridized to a single band of approximately 200 kb (Fig. 3B). Third Then, direct PCR sequencing of the mutant YAC was performed, and the mutation was detected during the procedure. Checked that it was the only change inserted within.   The above data show that the YAC constructed in accordance with the present invention was specifically defined. Shows that it is different from the original YAC. Genetically, this difference is due to the codon AP It is only a replacement for a pathogenic mutation in P717. These YACs are Trans, devised to further investigate the pathogenicity of amyloid deposits in Marr's disease It finds utility in transgenic experiments. In fact, the improvement according to the invention is More likely to give YAC that leads to faster amyloid deposition it can. Because these sequences have a high deposition rate in humans.¹Or bring It is. The use of B142F9 in transgenic experiments depends on the use of this YAC. Human APP mRNA^FifteenAnd results in accurate expression of the protein. APP inheritance The use of APP-mutated YACs in mice whose pups have been knocked out is associated with human disease. It is possible to obtain an accurate animal model corresponding to.   More generally, the present invention relates to yeast, as discussed above in connection with the known art. Direct and targeted embryonic stem cells for which targeted homologous recombination is practical and relatively rapid It is a fast-acting substitute for genes. The procedure of the present invention is rapid (three of these experiments It was performed within a short period of less than a month and is inexpensive (using only standard molecular biology equipment). Used, and the minimum amount of sequence information (1 kb Suemitsu) is known near each mutation site. Need only be. In contrast, the hit and run  run) protocol^FourFor effective homologous recombination in mammalian cells using Requires more than 5 kb of homologous sequence information. This is usually the human gene It requires isolation and characterization of the Homologs. In addition, YAC mutagenesis Applicable to all human and murine genes that can be cloned. Of the present invention It is anticipated that the method will also be applicable to other mammalian genes. Equally noteworthy is that the Human Genome Project allows YA from many genes to be derived. The fact is that C is largely available. Thus, these steps Feasibility of is not limited by the availability of the molecular resource.   In view of the above, the present invention provides mutant protein sequences, such as mutant APP. To produce animals such as emerging mice using the YAC transgenic method Provide a useful method. The transgenic mice produced by this method are , As described above, characterized by expressing mutant human APP sequences. Have a phenotype that Finally, the invention described above is modified by the above method. Give mouse embryonic stem cells.   Although the present invention has been exemplarily described above, the terms used are limited. It should be understood that rather the intent of the terminology in the description is intended.   Obviously, many modifications and variations of the present invention are possible in light of the above teachings. You. Therefore, within the scope of the appended claims, the invention may be practiced other than as specifically described. It should be understood as possible.

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．変異遺伝子を発現する動物を製造するのに使用できるように、相同組み換え によって、酵母の人工的染色体内に該変異を挿入する方法。 ２．病原性変異をクローニングするために、発病したヒト由来のDNA を使用する 請求の範囲第１項に記載の方法。 ３．ヒト変異タンパク質配列を発現するマウスの製法であって、 ａ）酵母の人工的な染色体内に含まれる遺伝子の一部または全体を得、 ｂ）相同組み換えによって、該酵母の人工的な染色体内に所定の変異遺伝子配 列を導入し、 ｃ）トランスジェニック体を利用して、該変異遺伝子を胚幹細胞に挿入し、お よび ｄ）該幹細胞を胚盤胞に注入して、該ヒトタンパク質配列を発現するトランス ジェニックマウスを誘発する、 ことを特徴とする上記方法。 ４．該変異体が、ヒト病原性タンパク質配列を発現する、請求の範囲第３項に記 載の方法。 ５．該変異が、ヒト病原性タンパク質配列を発現できる、ヒト病原性変異である 請求の範囲第４項に記載の方法。 ６．YAC トランスジェニック体を利用する上記工程が、更に「ポップ−イン／ポ ップ−アウト」法を使用して、該所定の変異を該YAC 内に挿入し、次いで該YAC をマウスゲノム内に導入する工程として規定される、請求の範囲第３項に記載の 方法。 ７．ヒトAPP 含有YAC を、そのura 遺伝子の破壊によりウラシル依存性とし、機 能性URA3遺伝子をもつ該所定の変異を挿入するためのベクターを使用して、該YA C をウラシル栄養素要求体に転化し；該所定の変異を含む少なくとも一つのエキ ソンを、ura3を含む酵母シャトルベクター内でクローニングし；該YAC 含有酵母 を、線状化された構築物で形質転換し、かつウラシルを含まない培地中で選別を 行い、これにより該「ポップ−イン」事象を誘発し；該形質転換された酵母を、 5-フロロ−オロチン酸(5-FOA)を含有する培地または栄養物上で成 育させて、該「ポップアウト」事象を誘発させ；および該変異を含むYAC につい てスクリーニングする、請求の範囲第６項に記載の方法。 ８．該所定の変異が、ヒトタンパク質配列を発現する、請求の範囲第７項に記載 の方法。 ９．該変異がヒト病原性タンパク質配列を発現できるヒト病原性変異である、請 求の範囲第７項に記載の方法。 10．APP7171 を含有するエキソン16を、該酵母シャトルベクターpYAC4 内でクロ ーニングする、請求の範囲第６または７項に記載の方法。 11．該YAC が本質的にB142F9、B142F9r、B142F9r670/1、B142F9r717およびB142F 9r670/671/717からなる群から選ばれる、請求の範囲第３項に記載の方法。 12．該幹細胞がC1細胞である、請求の範囲第３項に記載の方法。 13．変異タンパク質配列を発現するマウスを得る方法によって製造されるトラン スジェニックマウスであって、該方法が、 ａ）変異タンパク質配列を発現する所定の変異を含む遺伝子の一部または全体 を得、 ｂ）酵母の人工的な染色体(YAC)トランスジェニックを利用して、該遺伝子を 胚幹細胞に挿入し、これにより該変異を該ES細胞ゲノム内に導入し、 ｃ）該幹細胞を胚盤胞に注入して、該変異タンパク質配列を発現するトランス ジェニックマウスを発生させる、 工程を含むことを特徴とする上記方法トランスジェニックマウス。 14．変異ヒトアミロイドプリカーサタンパク質(APP)配列を発現することにより 特徴付けられる表現型をもつ、トランスジェニックマウス。 15．該表現型が、変異形成されたヒト配列を含み、該変異ヒトAPP 配列をコード する導入遺伝子により与えられる、請求の範囲第14項に記載のマウス。 16．該導入遺伝子が、全APP 遺伝子を含むヒト−由来のYAC に挿入された、APP7 171 変異を含む、請求の範囲第15項に記載のマウス。 17．ａ）酵母の人工的染色体(YAC)中に含まれる遺伝子の一部または全部を得、 かつ相同組み換えによって、変異タンパク質配列を発現する所定の変異を導入す る工程、および ｂ）トランスジェニック体を使用して、該変異YAC 遺伝子を、マウス胚幹細胞 内に挿入し、それによって該変異を該マウスゲノムに導入する工程、 を含む方法により修飾されたマウス胚幹細胞。[Claims] 1. Homologous recombination so that it can be used to produce animals expressing the mutant gene The method of inserting the mutation into the artificial chromosome of yeast according to. 2. Use DNA from diseased humans to clone pathogenic variants The method according to claim 1. 3. A method for producing a mouse that expresses a human mutein sequence, comprising:   a) obtaining some or all of the genes contained within the artificial chromosome of yeast,   b) By homologous recombination, a predetermined mutant gene is placed in the artificial chromosome of the yeast. Introduce columns,   c) Using the transgenic body, insert the mutant gene into embryonic stem cells, And   d) A trans that injects the stem cells into a blastocyst and expresses the human protein sequence. Induce transgenic mice,   The above method characterized by the above. 4. The method of claim 3 wherein the variant expresses a human pathogenic protein sequence. How to list. 5. The mutation is a human pathogenic mutation capable of expressing a human pathogenic protein sequence The method according to claim 4. 6. The above-mentioned process using the YAC transgenic body is further performed in "pop-in / po Using the "up-out" method, the desired mutation is inserted into the YAC and then the YAC The method according to claim 3, which is defined as a step of introducing into the mouse genome. Method. 7. Human APP-containing YAC was made uracil-dependent by disrupting its ura gene, Using the vector for inserting the predetermined mutation having the competent URA3 gene, the YA Convert C into uracil auxotrophs; at least one exciton containing the predetermined mutation Cloned into a yeast shuttle vector containing ura3; the YAC-containing yeast Were transformed with the linearized construct and selected in uracil-free medium. Is carried out, thereby inducing the "pop-in" event; Growth on media or nutrients containing 5-fluoro-orotic acid (5-FOA) And induce the "pop out" event; and the YAC containing the mutation. 7. The method according to claim 6, wherein the screening is performed. 8. The method of claim 7, wherein the predetermined mutation expresses a human protein sequence. the method of. 9. The mutation is a human pathogenic mutation capable of expressing a human pathogenic protein sequence. The method according to claim 7 Ten. Exon 16 containing APP7171 was cloned into the yeast shuttle vector pYAC4. The method according to claim 6 or 7, comprising: 11. The YAC is essentially B142F9, B142F9r, B142F9r670 / 1, B142F9r717 and B142F. The method according to claim 3, which is selected from the group consisting of 9r670 / 671/717. 12. The method according to claim 3, wherein the stem cells are C1 cells. 13. Tran produced by the method for obtaining a mouse expressing a mutant protein sequence A transgenic mouse, the method comprising:   a) A part or whole of a gene containing a predetermined mutation that expresses a mutant protein sequence Get   b) Utilizing an artificial chromosome (YAC) transgenic of yeast, Inserted into embryonic stem cells, thereby introducing the mutation into the ES cell genome,   c) A trans that injects the stem cell into a blastocyst and expresses the mutant protein sequence Generate a transgenic mouse,   The transgenic mouse of the above method, which comprises the steps of: 14. By expressing a mutant human amyloid precursor protein (APP) sequence Transgenic mice with a characterized phenotype. 15． The phenotype comprises a mutated human sequence and encodes the mutated human APP sequence. 15. The mouse according to claim 14, which is provided by the transgene. 16. The transgene was inserted into human-derived YAC containing all APP genes, APP7 16. The mouse according to claim 15, which comprises the 171 mutation. 17． a) obtaining some or all of the genes contained in the artificial chromosome (YAC) of yeast, And by homologous recombination, introducing a predetermined mutation that expresses the mutant protein sequence. Process, and   b) The transgenic YAC gene was transferred to a mouse embryonic stem cell using a transgenic body. Inserting into the mouse genome, thereby introducing the mutation into the mouse genome,   A mouse embryonic stem cell modified by a method comprising: