KR100353579B1

KR100353579B1 - 섬유아세포성장인자의표면고리구조유사체

Info

Publication number: KR100353579B1
Application number: KR1019960701513A
Authority: KR
Inventors: 피터 세돈 앤드류; 루-유안 리; 뵈흘렌 피터; 아이싱거 마그달레나; 야욘 애브너
Original assignee: 아메리칸사이아나미드컴파니; 예다 리서치 앤드 디벨럽먼트 캄파니 리미티드
Priority date: 1993-09-24
Filing date: 1994-09-23
Publication date: 2003-01-10
Also published as: ZA947318B; US5491220A; KR960705042A

Abstract

섬유아세포 성장인자의 구조 유사체는 인자의 아흡번째와 열번째의 베타가닥 또는 아흡번째와 열번째의 베타 가닥을 연결하는 표면고리에 아미노산 서열 대치를 가지고, 분자의 중첩은 심하게 변형되지 않는다. 제출된 유사체는 원래의 인자의 전체적인 2차와 3차 구조를 가지고, 헤파린과 섬유아세포 성장인자족의 구성원들에 높은 친화성을 가지고 결합한다. 어떤 구체적인 표현에서는 대체물은 다른 구조적으로 연관된 섬유아세포 성장인자 또는 인터루킨의 고리 서열 같은 다른 아미노산 서열이다.

Description

섬유아세포 성장 인자의 표면 고리구조 유사체

관련 미국 출원 자료

이 출원은 1993년 9월 24일에 출원되어 심사계류중인 미국 특허 출원 번호 08/226,973의 일부계속 출원이다.

발명의 기술 분야

본 발명은 섬유아세포 성장인자 유사체에 관한 것으로서, 이 유사체는 아홉 번째와 열 번째 β 가닥을 연결하는 표면고리에서 다른 1차구조를 가진다. 이 유사체는 전체적인 2차, 3차의 단백질 구조에 있어서는 원래의 인자와 유사하나, 다른 생물학적 특성과 수용체 결합특이성 프로필을 가지고 있다.

발명의 배경

폴리펩타이드로 된 성장인자는 세포의 증식과 분화에 있어서 호르몬과 유사한 조절물질이다. 성장인자는 발생, 재생, 상처치유 등을 포함하는 다양한 생리적인 과정을 조절하는 책임이 있고, 병태생이적인 과정뿐만 아니라 정상생리과정에도 관련되어 있다. 여러 조직과 세포에서 많은 성장인자가 동정되었고, 이들 인자들에 붙여진 명칭들로는 표피성장인자, 혈소판유래성장인자, 신경성성장인자, 조혈성장인자와 섬유아세포성장인자 등이 포함된다.

섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor; FGF)는 처음에 섬유 아세포와 내피세포에 분열유발을 촉진하는 소의 뇌 또는 뇌하수체에서 유래한 활성물질로서 기술되었다. 나중에 뇌로부터의 일차적인 분열유발인자는 뇌하수체에서 분리된 것과는 다름이 알려졌다. 이들 두 인자는 유사한 생물학적인 활성을 가지지만 등전점이 달라서 각각 산성과 염기성의 섬유아세포 성장인자로 명명되었다. 산성과 염기성의 섬유아세포 성장인자는 약 154개의 아미노산을 가지는 단백질이다. 상기한 2가지 인자 간의 아미노산 서열상동성은 약 55%이다.

산성과 염기성의 섬유아세포 성장인자는 현재 헤파린-결합 성장인자족의 구성원으로 알려져 있는데, 이들은 내피세포, 평활근세포, 부신피질세포, 전립선과 망막의 상피세포, 희돌기교세포, 성상세포, (크론도시이트)chrondocytes, 근원세포와 조골세포같은 중배엽과 신경외배엽 기원을 포함하는 많은 세포형에서 다양한 생물학적 반응을 총체적으로 야기시킨다. 원래의 구성원으로서 산성 및 염기성 FGF는 현재 각각 섬유아세포 성장인자-1(FGF-1)파 섬유아세포 성장인자-2(FGF-2)로 나타내진다. 이 성장인자족에 속하는 다른 7개의 구성원이, 그들의 세포증식과 분화의 조절 및 다른 섬유아세포 성장인자와의 서열 상동성에 근거하여 동정되었다.

섬유아세포성장인자는 세포성장을 자극하는 분열촉진유발성의 반응을 나타내는 것 외에도 비-분열촉진유발 방식으로 반응하는 타입의 많은 세포를 자극할 수 있다. 이러한 활성으로는, 상처부위로 세포가 이동해가는 것을 촉진하는 것(화학주성), 새로운 혈관형성의 개시(혈관형성), 신경재생과 생존의 조절(향신경성), 내분비기능의 조절 및 특이적인 세포성 단백질 발현의 자극 또는 억제, 세포의 기질 생산과 세포 생존 등이 포함된다(Baird, A., A.,and BOhlen, P,, Handbook of Exp. Pharmacol. 95(1); 369-418, Springer, 1990). 이들 특성은 섬유아세포성장인자를상처치료와, 신경재생, 측지혈관형성과 그밖의 것을 촉진하는 치료용의 시도에 사용하기 위한 기초를 제공한다. 예를 들면, 섬유아세포 성장인자가 심장질병과 수술에서 심근층 손상을 최소화시키는 것으로 제안되어졌다(프란코 명의의 미국특허 제4,378,347).

현재의 섬유아세포성장인자-2(FGF-2)와 다른 섬유아세포성장인자들에 대한 연구는 그들의 다양한 생리학적 활성이 발현되는 수용체에 의해 매개된 경로의 분자적인 세부사항에 집증되어져 있는데, 이로써 이들 인자들의 활성을 모방하거나 저해할 수 있는 치료제로 유용한 약제를 고안하기 위한 정보을 얻을 수 있다. 다양한 종류의 기원에서 분리된 섬유아세포 성장인자-2(FGF-2)의 1차 구조가 알려졌고 사람과 소의 섬유아세포 성장인자-2가 클로닝 되어 대장균과 효모에서 발견되었기 때문에, 현재의 관심은 2차와 3차 구조에 집중되어있다.

섬유아세포 성장인자-1과 2의 3차원적 구조가 결정되었다(Eriksson, E.A., et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 88: 3441-3445(1991), Zhang, J., et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 88: 3446-3450(1991), and Zhu, H., et al., Science 251: 90-93(1191). 이들 연구에서 섬유아세포 성장인자-1과 2는 사이토카인인 인터루킨-1α 와 인터루킨-1β(IL-1α 및 IL-1β)에서 관찰된 것과 극히 유사한 단백질 중첩 양상을 나타내는데, 인터루킨-1α와 인터루킨-1β는 항원이나 분열유발물질의 자극에 반응하여 대식세포와 T-세포에서 생산되는 단백질 인자이다. 그러나, 인터루킨-1 폴리펩타이드의 1차구조 중 단지 10% 만이 섬유아세포 성장인자에 상응하는 아미노산 서열을 가진다.

섬유아세포 성장인자-2(FGF-2)의 전체적인 구조는 삼각형의 피라미드로 그려지는데, 각 세 개의 측면은 6개의 역평행 방향의 가닥으로 된 β-시이트를 형성하는 두 개의 β가닥으로 이루어져 있다(Eriksson. E.A., et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 88: 3441-3445(1191)). 피라미드의 기저부는 피라미드의 세 측면으로부터 β시이트의 가까운 한쪽 끝까지 뻗치는 6개의 부가적인 β가닥으로 이루어져, 전체 12개의 β가닥을 이루고 있다 따라서, 3겹의 반복이 폴리펩타이드쇄의 중첩에서 관찰되어지고, 가상의 3겹 축이 분자 기저부의 중앙을 통과하여 피라미드의 정점까지 뻗친다(상기 저널의 같은 페이지에). 섬유아세포인자족의 단백질내에 보존된 아미노산 중 대부분이 섬유 아세포 성장인자-2의 중앙의 β 가닥내에 위치한 것으로서, 이들 각 단백질들이 섬유아세포 성장인자-2와 전체적으로 유사한 3차원적인 구조를 가질 것이라는 예상을 지지한다.

섬유아세포 성장인자의 생물학적인 반응이 특이적인 세포표면 수용체에 대한 황산헤파란-의존성 성장 인자의 결합에 매개되지만(Givol, D., and Yayon, A., FASEB J. 6: 3362-3369 (1992) and Jaye, M., et al., Biochim. Biopys. Acta 1135: 185-199(1992), 섬유아세포 성장인자와 헤파린과 수용체의 분자상호작용과 신호전달경로 과정의 정확한 본질은 알려지지 않았다. 섬유아세포 성장인자 서열에 관련된 합성 펩타이드를 사용한 연구에서 섬유아세포 성장인자-2의 33-77 아미노산 잔기와 106-129 아미노산 잔기가 헤파린과 결합하여, 섬유아세포 성장인자 활성의 분열유발 분석에서 약한 부분적인 효능 물질 및 길항물질로 작용한다(Baird, A., et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85: 2324-2328(1998)). 같은 연구에서 섬유아세포 성장인자-2의 115-124 잔기가 수용체 결합에 관련된 것을 밝힌다. 이 단편은 아흡 번째 β가닥의 중앙에서 시작하여 중첩된 분자의 표면에 다소 열려진 고리를 만들고, 열 번째 β 가닥의 개시부위에서 끝난다. 본래의 단백질에서 118에서 122까지의 서열은, 염기성 표면잔기 집단에 가까운 작은 표면고리를 형성하여, 이것이 헤파린 결합부위를 형성하는 것으로 측정된다.(Zhang, J., et al., Proc. hat. Acad. Sci. USA 88: 3446-3450(1991)).

이 서열은 또한 121번째 잔기에 스레오닌(Thr)을 가지는데 이것은 사이클릭 AMP(CAMP)-의존성 단백질 키나제에 의해 인산화될 수 있다(Feige, J.J., and Baird, A., Proc. Nat, Acad. Scad. Sci. USA 86: 3174-3178(1989); 스레오닌(Thr)-121이 상기 논문에서는 스레오닌-112로 나타나 있는데, 이것은 연구자들이 완전한 생물학적인 활성을 가지지만 일상적인 154 잔기가 아니라 146개의 잔기를 나타내는 N말단이 잘라진 형태의 폴리펩타이드를 사용했기 때문이다. 스레오닌-121의 인산화로 그의 수용체에 결합하는데 있어 방사능 표식된 섬유아세포 성장인자-2와 경쟁하는 능력이 증가된 단백질의 형태를 생성하지만, 인산화된것과 비인산화된 형태의 단백질의 생물학적 특성의 차이는 관찰되지 않았다(상기 인용문헌의 같은 페이지). 섬유 아세포성장인자-2와는 대조적으로 섬유아세포 성장인자-1(FGF-1)은 인산화 효소의 기질이 아니다. 이 결과는 115-124 서열이 수용체 결합에 관련되어 있다는 가설과 일치하지만, 그들은 분자의 완전한 수용체 결합영역을 규명하지 못하며 스레오닌-121잔기의 인산화의 생리학적인 의미를 설명하지 않고 있다.

헤파린과 수용체 결합부위에 부가해서, 섬유아세포 성장인자에는 리간드가 매개된 신호전달에 영향을 미치는 특이적인 서열이 있다는 증거가 있다. 예를 들면, 섬유아세포 성장인자-2의 27-32잔기(타이신-아스파라긴-프롤린-아르기닌-루이신)의 결실 또는 염기성 잔기인 아르기닌-118, 라이신 119, 라이신-128과 아르기닌-129의 돌연변이는, 이 단백질의 분열유발능력에 영향을 끼치지는 않지만 플라스미노젠 활성화 인자의 유전자발헌의 활성화를 제지한다(Eur. Pat. Ap. Pub. No. 363,675 to Bergonzoni, L., et al., and Presta, M., et al., Biochem. Biophys. Res. Com. 185: 1098-1107(1992)).

적어도 4종류의 다른 섬유아세포 성장인자 수용체(FGFR)가 동정되었고(Wsrner, S., et al., Mol. Cell. Bio. 12: 82-88(1992), 다른 수용체 형태간의 기능의 차이가 관찰되었다. 동일한 유전자에서 교호성의 스프라이싱(altermative Splicing)을 통해 나온 각기 다른 섬유아세포 성장인자 수용체는 각기 다른 리간드 결합 특성을 가지고, 다른 섬유아세포 성장인자 수용체 유전자로부터 나온 유사한 스프라이스 변이체는 섬유아세포 성장인자족의 다른 구성원들과 결합한다(Johnson, D.E., and Williams, L. T., Adv. Can. Res. 60: 1-41(1993)). 그래서, 섬유아세포 성장인자 수용체는 많은 구조적 변이체를 나타내고, 수용체와 그들의 다양한 리간드 사이의 상당한 교차반응을 나타낸다(Yayon, A., et al., EMBO J. 11: 1885-1890(1992)). 3번째의 면역글로부린-유사 영역의 카르복시 말단부위가 다른 섬유아세포 성장인자 구성원의 특이성을 규정하는 구조 요소로 알려졌지만(Werner, et al., and Yayon, et al., cited above), 섬유아세포성장인자-수용체-헤파린 상호작용의 정확한 성질은 아직 알려지지 않았다.

발명의 요약

본 발명의 목적은, 섬유아세포 성장인자의 새로운 구조 유사체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 약리학적으로 분리된 결합과 생물학적 활성을 가지는 섬유아세포 성장인자 유사체를 제공하는 것이다. 즉, 상기 유사체는 보통 야생형의 FGE인자와 결합하는 수용체와 같거나 혹은 다른 섬유아세포 성장인자 수용체와 결합하거나, 야생형 FGF 인자에서 관찰되는 것과는 다른 생물학적 특성을 나타낸다.

본 발명의 또 다른 보다 구체적인 목적은 표면고리의 일부 또는 전체가 다른 아미노산서열로 치환된 인간의 섬유아세포 성장인자-2(FGF-2)의 구조 유사체 같은 섬유아세포 성장인자의 구조 유사체를 제공하는 것이다.

상기 목적은, 표면고리 또는 표면고리에 인접한 서열에 아미노산 변이를 가져서 폴리펩타이드의 전체적인 2차 및 3차 구조는 심하게 손상받지 않으며 헤파린에 결합하는 섬유아세포 성장인자의 구조 유사체를 제공하는 본 발명에 의해 해결된다. 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다. 본 발명은, 섬유 아세포 성장인자의 아홉 번째 또는 열 번째 β-가닥, 또는 아흡 번째와 열 번째 β-가닥을 연결하는 표면고리에 상응하는 아미노산 서열에서 다른 아미노산 서열로 대체됨으로써 아홉 번재와 열 번째 β-가닥과 이웃하는 가닥과 상호작용이 심하게 손상받지 않고 헤파린에 결합하는, 섬유 아세포 성장인자의 구조 유사체를 제공한다. 본 유사체는 섬유아세포 성장인자 수용체에 결합친화성을 나타낸다. 상응하는 수용체에 대한 이 유사체의 결합특이성은 원래의 인자의 결합특이성과 다른 것이 바람직하다. 본 발명의 한 양태에서는, 이 유사체는 생체내에서의 혈관형성을 촉진한다.

바람직한 섬유아세포 성장인자 구조 유사체는 아홉 번째부터 열 번째 β-가닥까지 뻗치는 표면고리에 아미노산 서열 치환을 가진다. 소정의 양태에서는, 상기한 성장인자에서 아흡 번째부터 열 번재 β-가닥까지 뻗치는 표면고리의 전부 또는 일부분이 다른 아미노산 서열(예를 들면, 연관된 섬유아세포 성장인자 또는 인터루킨 폴리펩타이드로부터 유래한 상응하는 아미노산 서열)과 대체된다.

따라서, 본 발명의 섬유아세포 성장인자 유사체는 하기의 다른 성장인자에 있는 상응하는 고리 서열로 대체하므로써 형성된 유사체를 포함하며, 이에 한정되는 것은 아니다: 섬유아세포성장인자-1 서열 라이신115-라이신116-히스티딘117-알라닌118-글루타민119-라이신120-아스파라긴-121(서열동정 제2번의 아미노산 115-121); 섬유아세포성장인자-2 서열 알기닌118-라이신119-타이로신120-스레오닌121-세린122(서열 동정 제1번의 아미노산 118-122); 섬유아세포성장인자-3 서열 알기닌-루이신-타이로신-알기닌-스레오닌-발린-세린-세린-스레오닌-프롤린-글리신-알라닌-알기긴-알기닌-글루타민-프롤린-세린-세린-알라닌-글루타민-알기닌-루이신(서 열 동정 제4번 의 아미노산 132-152); 심유아세포성장인자-4 서열 타이로신-라이신-타이로신-프롤린-글리신(서열 동정 제5번의 아미노산 172-176); 섬유아세포성장인자-5 서열 알라닌-아이소루이신-히스티딘-알기닌-스레오닌-글로타민산-라이신-스레오닌-글리신-알기닌-글루타민(서열 동정 제6번의 아미노산 176-186); 섬유아세포성장인자-6 서열 아스팔틱산-루이신-타이로신-글루타민-글리신(서열 동정 제7번의 아미노산 174-178); 섬유아세포성장인자-7 서열 알라닌-라이신-트립토판-스레오닌-히스티딘-아스파라긴-글로신-글리신-글루타민(서열 동정 제8번의 아미노산 154-163); 섬유아세포성장인자-8 서열 알라닌-라이신-타이로신-글루타민-글리신(서열 동정 제9번의 아미노산 144-148); 및 섬유아세포성장인자-9 서열 아스파라긴-루이신-타이르신-라이신-히스티딘-발린-아스파르틱산-스레오닌-글리신-알기신-알기닌(서열 동정 제10번의 아미노산 151-161) 이에 상응해서, 본 발명에서는 고리 주변 서열이 변한 유사체 및 고리 서열을 포함하는 펩타이드 단편 유사체가 제공된다.

예를들면, 잔기 112에서 128에서 아미노산 서열이 치환을 가지는 인간의 섬유아세포 성장인자-2 구조 유사체는 섬유아세포 성장인자-2와 전체적으로 2차 및 3차 구조는 같지만 다른 생물학적 특성을 나타낸다. 예를 들면, 섬유아세포 성장인자-2의 고리 서열이 어떤 크기나 조성의 삽입체로 대체된다 다른 유도체는 115에서 124 잔기를 변화시키므로서 제공되며, 다른것은 고리 잔기 118에서 122를 변화시켜 제공된다. 예를 들어, 한 양태에서는 섬유아세포 성장인자-2의 고리가 같은 종이나 다른 종으로부터의 섬유아세포 성장인자-1으로부터 유래한 상응하는 서열과 대체되며; 다른 양태에서는 같은 종이나 다른 종으로부터의 인터루킨-1β 가 사용된다; 또한, 다른 양태에서는 같은 종 혹은 다른 종으로부터의 섬유아세포 성장인자-7의 고리가 사용된다. 위에서 요약한 것과 같이, 이들 유사체들은 해파린 및 원래의 섬유아세포 성장인자 수용체에 결합한다.

본 발명은 또한 섬유아세포 성장인자 유도체를 코딩하는 DNA, 이러한 DNA를포함하는 생물학적 기능을 가진 환상의 플라스미드 또는 바이러성 DNA 벡터를 제공한다. 그리고, 본 발명에서는, 상기 인자를 발현할 수 있도록 상기 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 대장균같은 원핵성 또는 진핵성의 숙주세포를 제공한다.

제1도는 사람 섬유아세포 성장인자-2, 사람 섬유아세포 성장인자-1과 인터루킨-1β의 고리 부위의 아미노산 배열을 나타낸다(하기 서열목록에서 서열 동정 제1번 내지 제3번) 밑줄 친 부위의 서열은 아홉 번째 β가닥의 끝에 위치한 표면고리에 상응한다. 괄호안의 잔기는 소의 아미노산 서열에서 발견되는 잔기들이다.

제2도는¹²⁵I-방사능동위원소로 표식된 섬유아세포 성장인자-2로 배양한 융합성의 어린 헴스터 신장세포의 경쟁적인 수용체 결합을 도시한 것으로서, 경쟁자인 섬유아세포 성장인자-2(○), 구조유사체인 섬유아세포 성장인자-2LI(이하에서 상세히 기술, ■), 그리고 구조윤사체인 섬유아세포 성장인 자-2LA(이하에서 기술, ▲)의 농도를 나타낸 것이다.

제3도는 첨가된 표식화하지 않은 성유아세포 성장인자 단백질의 농도에 따른, NIH 3T3세포주에 존재하는 섬유아세포 성장인자 수용체 1형에 대한 방사능 아이오다인화한 섬유아세포 성장인자-2(■), 섬유아세포 성장인과 -2LA(○), 그리고 섬유아세포 성장인자-2LI(▲)의 결합을 나타낸 것이다.

제4도는 성장한 소의 동맥궁 내피세포에서의 내피세포의 성장을 나타낸 것으로서, 이 세포들은 월(well) 당 8000개씩 넣고 표시된 농도의 섬유아세포성장인자-2(●), 섬유아세포 성장인자-2LI(□), 그리고 섬유아세포 성장인자-2LA(△)를 첨가해서 5일간 배양한 것이다.

제5도는 야생형 또는 변이형 섬유아세포 성장인자-2 (10ng/ml)에 의해 유도된 세포-관련성 유로키나제형 플라스미노젠 활성체의 생산을 나타내는 막대그래프이다.

제6도는 야생형 또는 변이형의 섬유아세포 성장인자-2(10ng/ml)의 시험관내애서의 혈관형성능의 효능을 나타내는 막대그래프인데, 1형의 콜라젠젤에서 배양된 ABAE세포가 튜브-유사 구조의 형성을 유도할 수 있는 능력에 따라 활성이 측정되어졌다. 동일한 조건의 세포 배양이 중복된 구멍(well)에서 유지되는 전형적인 실험으로부터 데이터를 얻었다. 각 구멍의 3군데 혹은 4군데 지역이 영상분석으로 조사되어졌고, 평균치와 표준편차를 얻었다.

제7도는 섬유아세포 성장인자의 9개의 구성원간의 섬유아세포 성장인자-2의 113에서 128 아미노산 잔기에 상응하는 잔기의 비교를 나타낸다(서열 동정 제1번, 섬유아세포 성장인자-1은 서열동정 제2번으로 나타내고, 다른 섬유아세포 성장인자는 차례로 서열 동정 제4번에서 제10번까지로 나타내는데, 단 소에서의 섬유아세포성장인자-1의 121잔기의 히스티딘이 사람 서열에서는 아스파라긴으로 대체되었다). 번호매김체제는 섬유아세포 성장인자-2와 비교한 것이며, 별표는 등일하고 보존된 잔기를 나타낸다. 섬유아세포 성장인자-2의 세린 117 잔기와 트립토판 123잔기 사이에 위치한 잔기는, 다른 섬유아세포 성장인자가 삽입체 또는 변이를 가지는 위치를 표시한다. 아홉 번째와 열 번째 β 가닥과 고리 부위에 있는 상동 서열을 나타내기 위해 도면에서 아미노산에 대해 표준 한글자의 명명을 사용하였다; A, Ala(알라닌); C, Cys(시스테인); D,Asp(아스팔틱산); E,Glu(글루타민산); F,Phe(페닐알라닌); G,Gly(글리신); H,His(히스티딘); I,Ile(아이소루이신); K,Lys(라이신); L,Leu(루이신); M,Met(메티오닌); N,Asn(아스파라긴); P,Pro(프롤린); Q,Gln(글루타민); R,Arg(알기닌); S,Ser(세린); T,Thr(스레오닌); V,Val(발린); W,Trp(트립토판); Y,Tyr(타이르신).

제8도는 토끼 이실(ear chamber) 모델에서 섬유아세포 성장인자-2 (▲)와 섬유아세포 성장인자-2LA(●)에 의해 유도된 신생 혈관형성 정도의 비교를 나타낸다. 섬유아세포 성장인자가 없는 대조군은 ■로 표시되어 있다.

제9A도는, 첨가한 섬유아세포 성장인자-1(○), 섬유아세포 성장인자-2(□), 섬유아세포 성장인자-7(●), 섬유아세포 성장인자-2LA(■)와 섬유아세포 성장인자-2LI(△)의 작용과 첨가해준 방사능-표식되지 않은 섬유아세포 성장인자 단백질의 함수로서의¹²⁵I-FGF-2의 가용성 재조합 섬유아세포 성장인자 수용체 1형에 대한 결합을 도면으로 나타낸 것이다. 제9B도는 가용성의 재조합 섬유아세포 성장인자-2(IIIc)가 사용된 것 외에서는 상기와 유사한 결합 프로필을 나타낸다.

본 발명은 섬유아세포 성장인자의 전체적인 2차와 3차 구조는 변화시키지 않는 방식으로 섬유아세포 성장인자의 표면 고리를 변화시켜, 섬유아세포 성장인자의 효능 물질과 가능한 길항물질을 포함하는 다양하고 원하는 생리학적 특성을 가지는구조 유사체를 만드는 것에 관한 것이다. 고리 서열 또는 고리 서열에 인접한 서열의 변화를 통해 헤파린에 결합하고 원래의 섬유아세포 성장인자 수용체에 대해 결합 친화도를 나타내는 유사체를 만들어낸다.

"길항물질(antagonist)"은 다른 물질의 작용을 무용화하는 물질인데, 예를 들면 생물학적 반응을 나타내지 않고 세포수용체에 결합하는 것이 그 하나이다. 섬유아세포 성장인자에 대해 길항물질로는, 섬유아세포성장인자수용체에 결합하지만 섬유아세포, 내피세포와 대교세포의 증식과 이주를 촉진하지 않는 물질이 포함되며, 이에 한정되는 것은 아니다 반대로, "효능물질(agonist)"은 자연적으로 존재하는 인자에 의해 보통 자극되는 세포수용체에 친화성을 가지고 분열유발능, 혈관형성, 화학주성 등과 같은 생리적인 활성을 자극시키는 물질이다. 여기에서 사용된 용어는 제한적인 의미가 아니며 소정의 단일 인자가 원래의 인자에 의해 매개되는 하나의 생물학적 기능에는 길항작용을 나타내고 다른 기능에 대해서는 효능현상을 나타낼 수 있다. 이러한 경우, 원래의 인자의 생물학적 활성은 약리학적으로 유사체와 분리되어 있다고 말한다.

어떤 단백질이 다른 섬유아세포성장인자족의 다른 구성원들과 상당한 아미노산 서열과 3차 구조의 상동성을 보여주거나, 시험관과 생체 분석에서 섬유아세포 성장인자-유사 활성을 나타내고 헤파린 또는 헤파린-유사 물질에 결함하는 경우, 이러한 단백질은 본원에서는 섬유아세포 성장인자(FGF)로 규정한다 헤파린은 D-글루쿠른산과 D-글루코사민으로 구성된 이종의 황화 음이온성 다당류로서, 프로테오글리칸은 단백질 코아에 결합된 것이고 비당류(aglycan)는 결합되지 않은 형태로있는 것이고, 항응고 특성을 나타내거나 나타내지 않는다. 헤파린-유사 물질은 헤파린과 관련이 있는 올리고당 구조를 가지지만 항응고 작용을 나타내지 않는 물질이다 어떤 유형의 섬유 아세포 성장인자 또는 돌연변이체 또는 유도체도 본 발명에 모두 포함되고, 효능물질 또는 길항물질 또는 둘다의 특성을 나타내는 고리 서열 펩타이드뿐만 아니라 특히 사람 섬유아세포 성장인자를 포함한다.

대체로 말하면, 본 발명의 섬유아세포 성장인자 유사체는 β 가닥 또는 두 개의 β 가닥을 연결하는 고리에 적어도 하나의 아미노산 결실, 삽입 또는 치환을 가져서 이웃하는 가닥은 변형되지 않고, 전체적인 2차와 3차 구조는 유지하는 섬유아세포 성장인자의 구조유사체를 포함한다. 2차와 3차 구조는 헤파린 결합, 섬유아세포 성장인자 수용체에 대한 결합, 분광학(자외선, 가시광선 또는 순환성의 이색광을 이용), X-선 결정학과 생물학적 활성에 의해 결정된다.

특히 바람직한 것은 두 개의 β 가닥을 연결하는 고리(loop)에 있어서 섬유 아세포 성장인자 서열이 대체된 것인데, Hynes, T.R., et al., Nature 339: 73-79(1989)에 의해 효소로 명세된 원래의 형태는 보유하고 구부러진 곳의 구조적 카세트 또는 모들의 대체물과 유사하다. 소정의 양태에서는, 상기한 인자의 아홉 번째 또는 열 번째 β 가닥 또는 아흡 번째와 열 번째의 β 가닥을 연결하는 표면고리(suface loop)에 상응하는 서열이 모든 크기나 조성의 아미노산 서열의 삽입체로 대체되고 분자의 전체 중첩은 심하게 변형되지 않는다.

다른 소정의 양태에서는, 표면고리가 다른인자로부터의 표면고리로 대체된다. 그래서, 본 발명은 특히 구조적으로 연관된 또는 연관되지 않은 서열로 고리와고리 지지구조와 고리고정점을 대체하는 것을 포함하는데, 임의 고리, 좀 더 길거나 짧은 고리 다른 전하를 띤 고리와 그들의 지지구조(stem)와 고정점(anchor)을 포함한다. 또한, 본 발명은 결합연구와 생물학적 분석에서 이들 고리를 모방하는 펩타이드 단편도 포함한다.

아래에서 더욱 자세히 나타낸 바와 같이, 편의상 이 가닥의 아미노산의 번호매김은 FGF-2를 참조하여 이루어졌다. 구조의 변동과 가닥의 인접도가 여기에서 3차원적 이해로 규명되었고 위에서 기술한 바와 같이 측정되어 졌다. 상기 유사체에서 전체적인 중첩(folding)이 유지되었다. 바람직한 유사체는 원래의 FGF족의 구성원이 수용체에 나타내는 친화도보다 FGF수용체에 더욱 높거나, 또는 100배까지 낮은 친화도를 가졌다.

많은 유사체들의 전형적으로 결합하는 수용체로는, 원래의 어린 햄스터 신장세포(BHK) 섬유아세포 성장인자 수용체, NIH 3T3 세포 수용체, 또는 특정 FGF에 특이적인 수용체가 포함된다. 바람직하게는, 결합은 오히려 원래의 인자가 수용체에 결합하는 것보다 실질적으로 유사하거나 더 높은 친화도를 나타낸다. 본 발명의 이점은 유사체에서 고리조작의 결과 고리가 유래한 상응하는 인자의 결합양상과 유사하다는 점이다. 그래서, 본 발명의 어떤 유사체는 원래의 인자가 결합하지 않는 수용체를 표적으로 하는데, 여러 세포 형태에서의 수용체를 포함한다. 예를 들어, 보통은 내피세포수용체에 결합하는 인자가 상피세포수용체 등에 결합할 수 있도록 설계될 수 있다. 아래에 실시예들이 기재되어 있다. 본 발명의 한 양태에서는 생체에서의 혈관형성능을 촉진시킨다.

특히 바람직한 구조유사체는 아홉 번째부터 열 번째의 β 가닥까지 뻗치는 표면고리에 적어도 하나 이상의 아미노산 결실, 부가 또는 치환을 가지고, 위에서 인용한 에릭슨 등에 의한 서술대로 분자가 중첩될 때 표면으로 부터 돌출되고, 전체적으로 원래 인자의 2차와 3차적인 구조를 가지는 것이다. 다른 소정의 양태에서는, 대체물은 다른 섬유아세포 성장인자종 또는 관련 분자로부터 유래한 서열이다. 다른 양태에서는, 대체물들이 다른 섬유아세포 성장인자종과 구조적으로 관련성이 없고 더 많거나 적은 아미노산 또는 다르게 전하를 띤 아미노산을 포함할 수 있다. 그래서, 어떤 아미노산이라도 가닥을 연결하는 고리 서열에서 서열 대체물로서 사용될 수 있다.

예를 들면, 본 발명의 섬유아세포 성장인자의 구조적 유사체는 표면 고리에 적어도 하나의 아미노산 결실, 부가 또는 치환, (특히 아미노산 서열 치환)이 된 유사체를 포함하며, 상기 표면고리는 아래에 열거한 것에만 제한되는 것이 아니고 아래에 열거한 표면고리를 포함한다: 섬유아세포 성장인자-1 서열 112 내지 123, 특히 라이신115-라이신116-히스티딘117-알라닌118-글루타민119-라이신120-아스파라긴121(서열등정 제2번의 아미노산 115-121); 섬유아세포 성장인자-2 서열 115 내지 124(서열동정 제1번의 아미노산 115-124), 특히 알기닌118-라이신119-타이르신120-스레오닌121-세린122; 섬유아세포 성장인자-3 서열 알기닌-루이신-타이로신-알기닌-스레오닌-발린-세린-세린-스레오닌-프롤린-글리신-알라닌-알기닌-알기닌-글루타민-프롤린-세린-알라닌-글루타민-알기닌-루이신(서열동정 제4번의 아미노산 132-152); 섬유아세포 성장인자-4 서열 타이로신-라이신-타이로신-프롤린-글리신(서열동정 제5번의 아미노산 172-176); 섬유아세포 성장인자-5 서열 알라닌-아이소루이신-히스티딘-알기닌-스레오닌-글루타민산-라이신-스레오닌-글리신-알기닌-글루타민산(서열동정 제6번의 아미노산 176-186); 섬유아세포 성장인자-6 서열 아스팔틱산-루이신-타이로신-글루타민-글리신(서열동정 제7번의 아미노산 174-178); 섬유아세포 성장인자-7(각질화세포 서장인자 또는 KGF로도 알려짐) 서열 알라닌-라이신-트립토판-스레오닌-히스티딘-아스파라긴-글리신-글리신-글루타민산(서열동정 제8번의 아미노산 154-162); 섬유아세포 성장인자-8 서열 알라닌-라이신-타이로신-글루타민산-글리신(서열동정 제9번의 아미노산 144-148); 및 섬유아세포 성장인자-9 서열 아스파라긴-루이신-타이로신-라이신-히스티딘-발린-아스팔틱산-스레오닌-글리신-알기닌-알기닌(서열등정 제10번의 아미노산 151-161). 섬유아세포성장인자족의 표면고리 서열의 비교가 제7도에 나타나 있다. 본 발명의 이같은 구현예에서, 구조유사체가 하나의 섬유아세포 성장인자의 표면고리 서열을 다른 인자로부터의 표면고리 서열같은 다른 아미노산 서열로 대체하므로서 만들어졌지만 여기에만 제한되는 것은 아니다.

전체분자의 중첩이 변형되지 않는 한, 고리의 지지구조(stem)와 고정 점(anchor point)을 포함하는 고리에 영향을 미치는 주변 부위의 변화도 본 발명은 포함하고 있다. 그래서 본 발명의 유도체는 돌연변이체, 특히 서열 대체물을 가지는 구조를 포함한다. 대체물은 아래와 같다: 섬유아세포 성장인자-1 서열 타이로신112-아이소루이신113-세린114-라이신115-라이신116-히스티딘117-알라닌118-글루타민산119-라이신120-아스파라긴121-트립토판122-페닐알라닌123-라이신124-아스파라긴125(서열동정 제2번의 아미노산112-125), 섬유아세포 성장인자-2 서열 타이로신115-알기닌116-세린117-알기닌118-라이신119-타이로신120-스레오닌121-세린122-트립토판123-타이로신124(서열동정 제1번의 아미노산 115-124), 섬유아세포 성장인자-3 서열 타이로신-알라닌-세린-알기닌-루이신-타이로신-알기닌-스레오닌-발린-세린-세린-스레오닌-프를린-글라이신-알라닌-알기닌-알기닌-글루타민-프롤린-세린-알라닌-글루타딘산-알기닌-루이신-트립토판-타이로신(서열동정 제4번의 아미노산 129-154), 섬유아세포 성장인자-4 서열 타이로신-글루타민산-세린-타이로신-라이신-타이로신-프롤린-글리신-메티오닌-패닐알라닌(서열동정 제5번의 아미노산 169-178), 섬유아세포 성장인자-5 서열 타이로신-알라니세린-알라닌-아소루이신-히스티딘-알기닌-스레오닌-글루타민산-라이신-스레오닌-글라이신-알기닌-글루타민산-트립토판-타이로신(서열동정 제6번의 아미노산 173-188), 섬유아세포 성장인자-6 서열 타이로신-글루타민산-세린-아스팔틱산-루이신-타이로신-글루타민산-글리신-스레오닌-타이로신(서열동정 제7번의 아미노산 171-180), 섬유아세포 성장인자-7 서열 타이로신-알라닌-세린-알라닌-라이신-트립토판-스레오닌-히스티딘-아스파라긴-글리신-글리신-글루타민산-메티오닌-페닐알라닌(서열동정 제8번의 아미노산 151-164), 섬유아세포 성장인자-8 서열 아스파라긴-아스파라긴-타이로신-스레오닌-알라닌-루이신-글루타민-아스파라긴-알라닌-라이신-타이르신-글루타민산-글리신-트립토판-타이로신-메티오닌-알라닌-페닐알라닌-스레오닌-알기닌-라이신(서열동정 제9번), 섬유아세포 성장인자-9 서열 아스파라긴-트립토판-타이로신-아스파라긴-스레오닌-타이로신-세린-세린-아스파라긴-루이신-타이로신-라이신-히스티딘-발린-아스파라긴-스레오닌-글리신-알기닌-알기닌-타이로신-타이로신-발린-알리닌-루이신-아스파라긴-라이신-아스팔틱산(서열동정 제 10번) 또한, 본 발명은 헤파린과 섬유아세포 성장인자 수용체 결합을 나타내는 이들 고리에 상응하는 펩타이드를 포함한다.

소정의 양태에서는 섬유아세포 성장인자-2의 구조 유사체가 바람직하다. "섬유아세포 성장인자-2"(FGF-2)는 처음 분리되고 시퀀싱된 146개 잔기의 폴리펩타이드 및 현재 완전한 길이의 폴리펜타이드로 생각되어지는 154 잔기의 형태, 활성을 가지는 동강난 형태(truncated form), 태반의 섬유아세포 성장인자 같은 신장된 형태(extended form), 논문에 기술된 N말단이 신장된 고분자량의 형태 및 이의 유도체 및 뮤태인을 포함한다. 이 용어는 특별히 대장균이나 효모에서 클론된 DNA로부터 발현되거나 적절한 백터로 곤충이나 포유동물에서 발현시킨 재조합 폴리펩타이드 뿐만아니라 포유동물조직에서 추줄한 자연상태의 섬유아세포 성장인자-2도 포함한다.

많은 양태에서는, 인간의 섬유아세포 성장인자-2가 바람직하다. 인간의 섬유아세포 성장인자-2는 본 발명에 의해 조작된 아홉번째와 열번째의 β가닥을 가지는데, 아미노산의 부가와 치환, 아미노산 혹은 카르복시 말단의 결실을 가지는 섬유아세포 성장인자-2와 다른 단백질의 N또는 C말단에 섬유아세포 성장인자를 가지는 키메라 단백질을 포함하며, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에 의거해 조작될 수 있는 FGF-2의 예로는, 안전성을 증가시키기 위해 제안된, 시스테인이 중성 아미노산(예를 들면, 세린)으로 치환된 것, 또는 아스팔틱산, 아르기닌, 글리신, 세린또는 발린이 기타의 산으로 치환된 것 (참조: Seno 등의 유럽 특허출원공개 제 282,822호); 보다 안정적인 유사체를 얻기위해, 자연상태의 섬유아세포 성장인자-2에서 발견되는 시스테인 잔기를 적어도 하나(보다 바람직하게는 2이상)를 다른 아미노산 잔기로 대체해서 형성된 뮤테인(Arakawa 및 Fox의 유럽특허출원공개 제 320,148호); 활성을 유지하면서 개선된 안전성을 가지도록 제안된, 카르복시 말단이 결여됐거나, 선택적으로 아미노산 치환을 가지는 뮤테인(참조: Seno 등의 유점특허출원공개 제 320,907); Seno등이 기술한 것(Seno, et, al, Eur, J, Biochem. 188: 239-245(1990))처럼, 상당한 부분의 아미노 또는 카르복시 말단이 결여된 변이체 ; 여러 점 돌연변이를 가지거나 N 말단 결실을 가지는 뮤테인(참조: 유럽 특허출원 공개 제 298,723호 to Fiddes, et al.,), 아미노산의 결손이나 치환을 가지는 M1-bFGF에서 H6-bFGF의 뮤테인(참조: Bergonzoni, 유럽 특허출원 공개 제 363,675호); Seddon에 의해 기술된 (Seddon, A.P. et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 638: 98-108(1991)), 재조합 섬유아세포 성장인자의 Ala-3과 Ser-5를 Glu로 대체해서 만들어진 쉽게 발현된 섬유아세포성장인자 및 이의 유사체.

본 발명의 실시에서 본 발명의 사람 성뮤아세포 성장인자-2의 구조 유사체 같은 섬유아세포 성장인자 유도체는, 잔기 112(Try)와 128(Lys) 사이의 서열에서 적어도 한개(더 바람직하게는, 2 이상)의 아미노산을 제거하거나, 부가시키거나 치환시키므로서 제조된다. 소정의 양태에서, 치환은 115(Tyr)와 124(Tyr) 잔기 사이에서 일어난다: 다른 양태에서는 변화가 118(Arg)과 122(Ser) 잔기 사이에서 일어난다. 위에서 규정한대로, 다른 섬유 아세포 성장인자 유사체의 번호매김은 섬유아세포 성장인자-2와 비교하여 이루어진다.

소정의 바람직한 양태에서는, 섬유아세포 성장인자의 구조 유사체는 인자의 아홉번째와 열번째 β가닥이나 아홉번째와 열번째 β 가닥을 연결하는 표면고리에서의 아미노산서열이 대체된 본원에서 아미노산 서열은 적어도 3개의 아미노산(전형적으로는, 적어도 5개)으로 규정된다. 예시적인 아미노산은 위에서 언급되어 있다.

예를 들면, 사람 섬유아세포 성장인자-2 구조 유사체 같은 섬유아세포 성장인자 구조 유사체, 분자의 전체적인 중첩은 크게 변형되지 않는다면, 아홉번째에서 열번째의 β가닥 표면 고리의 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 어떤 길이의 무작위의 아미노산 서열로 대체시켜 제조한다. 그래서, 다른 종으로부터의 섬유아세포 성장인자-2; 인간의 섬유아세포 성장인자 1 또는 3내지 9; 다른 종으로부터의 섬유아세포 성장인자1, 또는 3내지 9; 인간의 인터루킨-1 α또는 β; 또는 다른 종으로부터의 인터루킨-1 α 또는 β; 콩의 트립신 저해제 또는 히스엑토필린 같은 구조적으로 유사한 폴리펩타이드로부터 유래한 서열이 사용되었다. 소정의 양태에서는, 섬유아세포 성장인자-2 유사체가 Thr121잔기에서의 인산화를 제거하기 위해 아미노산이 대체된 것이 바람직하다.

한 구현예에서, 아래에서 더욱 상세히 기술된 원하는 바의 생물학적 특성을 나타내는 본 발명의 구조 유사체는, 서열동정 제1번의 아미노산118 잔기부터 122잔기까지의 표면고리 서열(알기닌 118-라이신119-타이로신120-스레오닌121-세린122)이 인간의 인터루킨-1β로부터의 상응하는 아미노산 서열 115잔기부터 119잔기 (알라닌115-글루타민116-패닐알라닌117-프롤린118-아스파라긴119; 서열동정 제3번의 아미노산 231-235)까지로 대체된 섬유 아세포 성장인자-2유도체를 포함하는데, 이는 하기 실시예에서 FGF-2LI으로 나타냈다. 다른 구현예에서는, 상기 유사체는 서열동정 제1번의 118잔기부터 122잔기의 표면고리 서열(알기닌118-라이신119-타이로신120-스레오닌121-세린122)이 소의 FGF-1으로부터 유래한 상응하는 서열동정 제 2번의 115잔기부터 121 잔기의 아미노산 서열(라이신115-라이신116-히스티딘117-알라닌118-글루타민산119-라이신120-히스티딘121)로 대체된 사람 섬유아세포 성장인자-2 유도체를 포함하는데, 이는 아래의 실시예에서 FGF-2LA(서열등정 제16번)로 나타낸다. 다른 구현예에서는, 상기 유사체는 118에서 122 잔기의 표면고리서열이 FGF-7(각질화세포 성장인자)으로부터의 상응하는 아홉잔기의 서열동정 제8번의 아미노산 고리 서열(알라닌-라이신-트립토판-스레오닌-히스티딘-아스파라긴-글리신-글리신-글루타민산)로 대체된 인간의 섬유아세포 성장인자-2 유도체를 포함한다.

본 발명의 새로운 섬유아세포 성장인자의 구조 유사체는, 점 돌연변이나 서열변화 또는 기술에서 숙련된 것으로 알려진 화학적, 생화학적, 물리적 수단을 사용한 아미노산 조성물 펩타이드로부터의 폴리펩타이드 조합에 의해 제조된다. 또는, 본 발명의 새로운 섬유아세포 성장인자 유사체는, 표면 고리 뮤테인을 코딩한 DNA의 재료, 벡터로 DNA를 삽입, 숙주세포에서 벡터의 발현, 및 거기에서 생산된 변이체 섬유아세포 성장인자의 분리를 포함한 재조합 단백질 합성으로 제조된다.

본 발명의 섬유아세포 성장인자 유사체를 코딩하는 DNA는 섬유아세포 성장인자의 유전자를 표준적인 방법을 사용하여 뉴클레오타이드 결실, 부가 또는 생산된점 돌연변이로 변화시켜 제조된다. 이는 실시예1 및 2에 나타나있다. 유전암호의 변성(Degeneracy) 때문에 다양한 코돈변화 조합이 본 발명의 섬유아세포 성장인자 유도체를 코딩하는 DNA를 형성하기 위해 선별되어 질 수 있어서 고리 변이체 섬유아세포 성장인자를 코딩하는 DNA로 되는 모든 뉴클레오타이드 결실, 부가, 점 돌연변이가 본 발명에 포함된다. 소 정의 유형의 개체에서는 소정의 코튼이 폴리펩타이드 발현을 위해 더욱 효과적이기 때문에, 본 발명의 FGF 뮤테인을 코딩하는 DNA 물질을 생산하기 위한 섬유아세포 유전자 변이의 선별은 재조합벡터의 숙주로 제공되는 개체 형에서 가장 효과적인 발현을 하는 것을 선별하는 것이 바람직하다. 변화된 코든 선별은 또한 벡터제조 고려에 의존한다.

본 한명의 FGF유도체를 코팅하는 DNA를 형성하도록 변형되어지는 섬유아세포 성장인자 DNA출발물질은 자연상태의 것이거나 재조합 또는 합성한 것이다. 그래서 DNA물발물질이 조직이나 조직배양으로부터 분리되어지고, 관례적인 방법을 사용하여 올리고뉴클레오타이드로부터 제조되거나, 상업적으로 구하기나, 또는 섬유아세포로부터 FGF를 코딩하고 있는 RNA를 분리해서 준비되어지고, 이 RNA를 상응하는 두가닥의 DNA를 합성하는데 주형으로 사용되는 한 가닥의 cDNA를 합성하기 위해 사용한다.

본 발명을 설명하는 예는 실시예1과 2에서 제조된 것과 같은 인간의 FGF-2 유사체를 규정하는 클론된 상보적 DNA 서열이다 또한, 여기서 기술된 상보적 DNA에 가깝게 연관되어 있거나 상동인 DNA 서열이 포함되는데, 즉, 고빈도의 상보적 염기서열을 가지는 핵산 사이에만 결합하는 특히 엄중한(Stringent)조건하에서 FGF 유사체 cDNA와 거기에 상응하는 RNA와 교잡하는 DNA서열이다. FGF를 코딩하는 서열에 더하여, 본 발명에 포함되는 DNA는 벡터제조 서열에 따라 유전자의 발현을 촉진하는 부가적인 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 FGF 유사체를 코덩하는 DNA 또는 거기에 상응하는 RNA는, 예를 들어 pBR, pUB 또는 pET 플라스미드 같은 백터로 삽입되있고, 이러한 재조합벡터가 미생물 숙주개체를 형질전환시키는데 사용된다. 본 발명에서 유효한 숙주개체는 대장균이나 바실러스 같은 박테리아, 효모 같은 이스트, 쥐의 섬유아세포 같은 포유동물 또는 곤층세포이다. 따라서, 본 발명은 새로운, 생물학적으로 기능적이고 표준적인 수단으로 생성된, FGF유사체를 기술하는 RNA와 DNA서열을 편입하는 바이러스성의 그리고 환상의 플라스미드 RNA와 DNA벡터를 제공한다. 외래 벡터 유래의 DNA 또는 RNA 서열의 대량 배양 발현을 촉진하는 조건하에서 그런 백터로 안정하게 형질전환 또는 바이러스 형질전환된 세포의 배양과, 성장배지, 세포파쇄물, 또는 세포성막 분획으로부터 원하는 폴리펩타이드를 분리하므로서 원하는 산물을 생산한다. 대장균에서 FGF-2뮤테인의 발현의 예가 실시예 3에 기재되어 있다.

본 발명은 FGF-2 고리 변이체를 코딩하는 DNA 서열의 전체 또는 부분적인 제조를 제공하고, 선별된 비포유동물 숙주의 의해 더잘 발현되는 코돈의 혼입, 제한효소에 의해 잘려지는 부위의 제공, 및 잘 발현되는 벡터제조를 촉진시키는 부가적인 개시, 종말 또는 중간의 DNA서열의 제공과 같은 유익한 특성을 포함한다. 상응하여, 본 발명은 여기서 특별히 기술된 통일성 또는 하나 이상의 아미노산 잔기의 위치를 가지는 형태와는 다른 FGF 유사체의 미생물에서의 발현을 코딩하는 DNA 서열을 제조하고(즉, 인간의 FGF-2로 특정화된 모든 잔기보다 적은 잔기를 가지는 결실 유사체, 및 /또는 폴리펩타이드의 말단 부위 또는 중간부위에 한개 이상의 잔기가 부가된 치환 유도체), 이것은 여기에 기술된 FGF-2 유사체의 생물학적 특성을 공유한다.

본 발명의 DNA(RNA) 서열은 원핵세포와 진핵세포에서 적어도 한부분의 1차 구조 형태와 FGF유사체적 생물학적 특성의 하나 이상을 가지는 폴리펩타이드 산물을 확실히 발현시키는데 유용한 모든 서열을 코딩하고, 다음의 것을 포함한다. (a) 본원에서 기술한 FGF-2고리 뮤테인을 코딩하는 DNA 서열 또는 상보적인 가닥; (b) (a)에서 규정한 DNA 서열 또는 거기로부터의 단편에 교잡하는 DNA 서열; 및 (c) 유전부호의 변형없이 (a)와 (b)에서 규정한 DNA 서열에 교잡하는 DNA 서열 그속에 포함된 FGF유사체의 대립유전자 변이형태를 코딩하는 게놈 DNA 서열, 고리 뮤테인 RNA를 코딩하는 서열, 이의 단편, 그리고 RNA 또는 DNA 서열이 비척추동물 숙주에서 전령 RNA 전사 또는 RNA 복제를 촉진시키는 코돈에 편입된 유사체가 특별히 포함된다.

본 발명에서 제공되는 미생물에서 발현되는 폴리펩타이드의 분리와 정제는 관례적인 방법을 사용했는데, 예를 들어,실시예 3에서 나타낸 것과 같은 예비 크로마토그래픽 분리, 모노클론 및 / 또는 폴리클론 항체를 제조포함하는 면역학적 분리를 포함한다.

위에서 요약한 것과 아래의 실시에에서 상세히 기술된 바와 같이, 본 발명의 FGF-2 구조 유사체의 두 예는 FGF-2LA(서열동정 제16번)와 FGF-2LI(서열동정 제15번)인데, FGF-2 서열의 118-122의 고리잔기가 각각 상응하는 소의 FGF-1서열과 인간 인터루킨-β 서열과 대체된 것이 대장균에서 발현되었다. 이 변이는 헤파린 세파로스로부터 단백질을 해리해내기 위해 요구되는 염화나트륨의 농도로 측정된 헤파린 결합이나, 어린 헴스터 신장세포나 NIH 3T3세포주에 있는 FGF 수용체에 결합하는데 있어 방사능아이오다인화한 FGF-2와 경쟁하는 단백질의 능력에서 아무런 명확한 영향을 나타내지 않았다. 고리 유사체는 소의 내피세포 증식 분석에서 분열촉진활성을 가지고 있었다. 양 유사체가 유로키나제형의 플라스미노젠 활성화인자를 유도하는 능력이 상당히 감소함을 나타내었다. 시험관내 혈관형성 분석에서, FGF-2LA는 야생형의 FGF-2에 비교해 모세관-유사관의 형성을 나타내었다. 동일한 시험관내 분석에서, FGF-2LI는 더 작은 모세관-유사 구조를 유도하지만, 생체 분석에서 상당히 혈관형성을 촉진한다.

다른 FGF-1 고리 변이체인 FGF-2LK(실시예 1에서 상세히 기재)는 FGF-7으로부터의 9개의 아미노산 서열을 포함한다. FGF-2는 각질화세포상의 FGF-7수용체에 결합하지 않고, FGF-7은 FGF 수용체 1형에 결합하지 않는다. FGF-2고리서열을 FGF-7으로부터의 서열로 대치하면 헤파린에 대한 단백질의 친화도가 명확히 감소한다. 수용체 결합 실험에서, FGF-2LK단백질은 FGF 수용체 1형에 FGF-2의 결합과 대치하거나 경쟁할 수 없지만, 수용체 2형에 대해서는 FGF-7과 경쟁하는 반면 FGF-2는 결합에 있어서 경쟁하지 않는다. 그래서, 고리서열이 수용체-리간드결합의 특이성을 부여하고 FGF-7에는 결합하지만 FGF-2에는 결합하지 않는 수용체 아형(FGFR III6)에 FGF-2LK가 결합할 수 있게 한다. 반대로, FGF-7으로부터의 고리 서열은 FGF수용체 1형에 단백질이 결합하는 것을 막는다.

전체적인 2차와 3차 구조는 상당히 변화시키지 않고 FGF 표면고리체 새로운 1차 구조 요소를 도입하므로서, 하나의 FGF에서 다른 형까지 변화된 특성이 생기는 FGF구조 유사체의 세트가 제공되어, FGF 단백질의 활성을 변조하는 수단이 되고, 단백질의 생물학적인 활성을 약리학적으로 분리하는 수단이 되고 새로운 활성을 유도하는 수단이 된다 하기 실시예에서 나타낸 바와 같이, FGF 고리 유사체는 원래의 FGF가 결합하는 것과 같은 수용체에 결합하는 구조가 될 수도 있고 또는 다른 수용체 특히 원래의 FGF보다는 고리에 상응하는 수용체에 결합하도록 만들어질 수 있다.

감소된 생물학적 활성을 나타내는 FGF길항물질은 항암 또는 항증식 약제로 유용하다. 혈관형성 저해제로 작용하는 길항물질은 신생혈관형성이 우세한 병변을 가지는 눈의 망막증, 혈관신생성녹내장, 피부질병, 만성염증, 류마티스성 관절염 등의 질병의 치료에 유효하다.

FGF활성의 작용물질인 FGF고리 구조유사체는 혈관형성, 세포성장, 그리고/또는 세포생존을 촉진시켜, 국소빈혈과 심근경색동안 허혈성 조직의 신생혈관형성을 통한 조직회복 뿐만 아니라 상처의 치료, 화상, 골절, 외과적인 찰과상, 위장의 궤양등과 같은 조직회복에 적용된다.

본 발명에서는, 표면고리 아미노산 서열의 데체에 부가해서, 대체된 고리를 흉내내도록 설계된 즉, FGF수용체에서는 결합하지만 고리를 가지는 상응하는 인자에 의해 자극되어지는 섬유아세포와 다른 세포의 증식과 이주를 자극하지 않는 성장인자 펩타이드 길항물질을 추가로 제공한다.

FGF 수용체형의 발현은 세포-특이적이고, 발현된 수용체형이 세포가 어떤 FGF와 반응할지를 결정한다. 위에서 언급했듯이, FGF-2LA에서 보여지듯이 수용치 특이성의 변화는 FCF-2가 내피세포보다는 상피세포 같이 정상적으로는 상호작용하지 않는 세포형을 표적으로해서 설계될 수 있음을 나타낸다.

하기 실시예들은 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

실시예1

본 실시예에서는 표면고리 부분(188-122잔기)를 인터루킨-1베타(IL-1β)유래 아미노산으로 대치시킨 FGF-2LI로 명명된 인간의 FGF-2 구조 유사체(서열동정 제15번)에 대해 설명하고 있다.

Seddon, A.P. 등이 최초로 밝힌 사람 Glu^3.5FGF-2유전자를 T7발현 벡터, pET-3a(M13)에 클로닝하였다. 간단히 설명하면, pUC18에 클로닝된 FGF-2의 155 아미노산을 코딩하는 합성유전자를 British Bio-Technology사(Oxford, UK)로부터 구매한 후, 교환하려고 하는 염기서열(2-49) 부위를 HindIII와 BspMII로 절단하여 pUC18로부터 제거하고 FGF-1의 최초 5' N말단 아미노산들과 내부에 NdeI부위를 가진 합성 단편을 pU18에 클로닝하여 3번과 5번 위치에 글루타민산을 코딩하는 벡터를 만들었다. 다음 pUC18로부터 FGF-2를 코딩하는 cDNA를 NdeI과 BamHI을 사용하여 절단하고 이를 pET-3a 유도체인 발현벡터 pET-3a(M13)의 NdeI과 BamHI 제한효소 부위에 클로닝하였다.

두 개의 단일 제한효소 절단 부위 BstBI과 SplI 앞서와 같은 방법으로 FGF-2의 Ser117-Trp123 단편의 인접위치에 아미노산 배열에 영향을 주지 않고 도입하였다(즉, 잠복 변이)(제1도).

그리하여, FGF-2의 아르기닌118-라이신119-타이로신120-스레오닌121-세린122(서열동정 제1번의 아미노산118-122) 잔기를 구조유사체 IL-1β의 상응하는 고리유래의 알라닌115-글루타민116-페닐알라닌117-프롤린118-아스파라긴119(서열등정 제3번의 아미노산 231-235)로 교체하는데 성공하였다. (제1도) 플라스미드 DNA를 BstBI과 SplI으로 절단하여 아가로스 전기영동으로 큰 DNA 단편을 분리하였다. 분리한 단편은 T4 DNA 리가제를 사용하여 2개의 합성올리고뉴클레오타이드, 5'-CGAACGATTG GAATCTAATA ACTACAATAC GTACCGGECT GCGCAGTTTC CTAACTGGTA TGTGGCACTT AAGC-3'(서열동정 제11번)과 5'-CTACGCTTAA GTGCCACATA CCAGTTAGGA AACTGCGCAG ACCGGTACGT ATTGTAGTTA TTAGATTCCA ATCGTT-3'(서열동정 제12번)를 어닐링(anuealing)하여 얻은 이중나선 DNA에 연결하였다. 이 합성 뉴클레오타이드는 BstBI과 SplI절단에 의해 생성된 단편과 상보적인 말단을 가지고 있다. 연결 생성물은 대장균 DH5α에 형질전환시켰다. 원하는 변형 플라스미드는 새롭게 도입한 Af12제한효소부위(밑줄)의 절단 감수성을 근거로 선별하였으며 유전자 염기서열 결정으로 확인하였다. 대장균내 플라스미드는 ATCC에 등재하고 ATCC등재번호 69417을 받았다.

실시예 2

본 예는 FGF-2LA(서열동정 제16번)로 명명된 인간의 FGF-2구조 유사체의 제조에 관한 설명이다. FGF-2LA는 FGF-2의 표면고리 부위(118-122) 잔기가 FGF-1에서 유래한 아미노산 배열로 치환된 유사체이다(제 1도).

FGF-2의 아르기닌118-세린122 단편을 FGF-1의 표면고리 115-121 잔기에 상응하는 송아지의 라이신115-라이신116-히스티딘117-알라닌118-글루타민산119-라이신120-히스티딘121(서열동정 제2번의 아미노산 115-121; 인간 경우 아스파라긴)로 대치는 아래 합성 변형 올리고 뉴클레오타이드 5'-CGAACGATTG GAATCTAATA ACTACAATAC GTACCGGTCT AAAAAGCATG GTGAAAAACA CTGGTATGTG GCACTTAAGC-3'(서열동정 제13번) 5'-GTACGCTTAA GTGCCACATA CCAGTGTTTT TCAGCATGCT TTTTAGACCG GTACGTATTG TAGTTATTAG ATTCCAATCG TT-3'(서열동정 제14번)를 사용하여 실시예에서 기술한데로 시행하였다. 원하는 변형 블라스미드는 새롭게 도입한 SphI 제한효소부위(밑줄친 부위)의 절단 감수성으로 선별하여 유전자 염기서열결정으로 확인하였다.

실시예 3

실시예 1과 2에서 제조한 FGF-2LA와 FGF-2LI 변이체를 발현시켜 정제하였다.

앞서의 예에서 기술한 FGF-2 고리 변이체를 가진 플라스미드들의 염기서열을 확인한 후, 대장균 BL-21에 형질전환 시켰다. 이를 엠피실린(50㎍/㎖) 과 클로람페니놀(30㎍/㎖)이 포함된 LB배지에 접종한 다음 흡관도가 600nm에서 0.4에 도달할 때까지 37℃에서 배양하였다. 재조합 단백질의 발현은 2mM 아이소프로필티오갈락토사이드의 첨가로 37℃에서 2시간 동안 유도하였다.

1 리터 배양액을 원심분리하여 세포를 수정하고 이를 0.1mM EDTA와 0.6M NaCL이 포함된 50mM Tris-Cl, pH7.5 용액 30㎖로 현탁한 다음 4℃에서 20분간 라이소자임(10㎍/㎖) 처리와 초음파처리(6 ×30초 펄스)로 파쇄하였다. 세포 분쇄물은 원심분리(10,000 ×g ; 20분)하여 침전시키고 상등액에 헤파린 세파로스 수화물(파마시아/LKB사)을 5㎖ 섞어 4℃에서 1시간 동안 일정한 회전을 가하면서 반응시켰다. 세파로스 충전물은 0.8㎛ 필터장치(Nalgene 사)로 여과하여 분리한 후, 0.6M NaCL이 포함된 10mM Tris-Cl, pH7.4 용액으로 세척하고 3 M NaCL이 포함된 Tris 완충액(25 ml)으로 결합된 단백질을 용출시켰다.

3M NaCL 용출액을 Tris 완충액으로 6배 희석한 다음 TSK 헤파린 5PW칼럼(0.21 ×15cm; Nest group, MA)에 가하고, NaCL 직선농도 기울기(0.6에서 2M 까지)로 분당 3㎖의 속도로 90분간 컬럼을 전개하였다. 헤파린 칼럼에서 순수분리정제한 FGF-2 종은 분당 0.7㎖의 유속에서 0.1% 트리플루오로아세틱산/아세토나이트릴 농도구배(28에서 48%의 CH₃CN에서 60분)를 사용하여 역상 고성능 액체 크로마토그래피로 분석하였다. 결합된 물질의 용출은 210nm에서 관찰되어졌다. FGF-2LA와 FGF-2LI 모두 단일 피크를 가지고 균질함이 나타났다. 순도와 분자량 결정은 은염색 검색체재(Phastgel System, Pharmacia, LKM)를 사용하여 만들어졌고, 각단백질은 SDS-PAGE에서 단일의 18KD크기의 은염색된 밴드를 만들었다.

역상분리된 단백질의 N단말 서열이 모델 120A 온라인 페닐티오하이단 토인-유도의 분석기(Applied Biosystems,Forster City, CA)를 갖춘 모델 477A 펄스-액상 시퀸스에서 수행되었다. 분석 결과 서열 알라닌-글루타민산-글리신-글구타민산-아이소루이신-스레오닌-스레오닌-루이신-프롤린-알라닌(87%, 서열동정 제15번의 아미노산 2-11)과 메티오닌-알라닌-글루타민산-글리신-글루타민산-아이소루이신-스레오닌-스레오닌-루이신-프롤린-알라닌(13%, 서열동정 제15번의 아미노산1-11)로 주어졌는데 이는 합성된 단백질의 작은 부분이 N말단의 메티오닌 잔기를 가짐을 나타낸다(성숙된 형태의 단백질을 형성하기 위해 도입됨).

아미노산 조성이 온라인 모델 130A 분리체계(Applied Biosystems)를 갖춘 모델 420 A phsnylisothiocyanate-derivatizer를 사용하여 HCI 가스상 가수분해후 결정되었다. 사랑 FGF-2LA와 FGF-2LI의 전체서열이 뒤에 기재한 서열 목록 부분에 주어졌다(서열동정 제15번과 제16번).

제 7도는 FGF-2에 관한 번호매김 체계를 사용하여 FGF족의 아홉 구성원의 88에서 143잔기 사이의 아미노산 서열 비교를 나타낸다. 별표는 동일하고 보존된 잔기를 나타낸다.

이 단백질을 상기한 7개 이외의 36개의 다른 동일하고 보존된 부위를 나타낸다.

실시예 4

본 예에서는 실시예 3에서 분리정제한 FGF-2변이체를 사용한 결합 및 세포 증식 연구에 대해 설명한다.

FGF-2LA와 FGF-LI의 고정화된 헤파린에 대한 친화력은 1.5 M NaCl 농도하의 TSK-헤파린 컬럼으로부터 용출된 야생형 FGF-2와 동일하였다.

많은 수의 FGF 수용체가 발현되는 어린 헴스터 신장(BHK)세포에서 아이오다인 125-방사능표식된 FGF-2 의 결합에 데한 FGF-2LI와 FGF-2LA의 경쟁능을 조사하였다. 분석방법은 Hoscatelli(J. Cell. Physiol. 131:123-130(1987))가 기술한 방법으로 시행하였다. 간단히 설명하자면, BHK 세포를 24칸 플레이트에서 키우고, 여기에 50 pM¹²⁵I-FGF-2와 FGF-2, FGF-2LI 혹은 FGF-2LA고리 변이체를 넣고 실온에서 1시간 또는 4℃에서 4시간 동안 반응시켰다. 그리고 세포들은 4℃에서 30분간 더 반응시킨후 PBS로 2회 세척하고 2M NaCl을 포함하는 20 mM HEPES, pH 7.5 용액을 처리하여 저친화성 헤파린 셀페이트 결합부위에 결합된¹²⁵I-FGF-2를 제거하였다.¹²⁵I-FGF-2가 결합된 수용체를 세포를 0.1M 소들 포스페이트, pH8.0에 녹인 0.5% Triton-X 100으로 처리하여 회수하고 감마 계측기로 측정하였다. 분석은 2회 실시하였다.

이러한 결합분석 결과를 제 2 도에 나타나 있으며, FGF-2와 FGF-2LA및 FGF-2LI 모두 비슷하게 나타났다. FGF-2 아미노산 배열 118-122에 상응하는 인터루킨-1베타 또는 FGF-1 아미노산 배열로 대체한 것은 BHK 세포에 존재하는 고친화설 세포막 FGF-1수용체에 대한¹²⁵I-FGF-2의 결합에 대해 변이단백질의 경쟁능이 나타나지 않았다. 변이체가 FGF-1과 인터루킨-1베타 아미노산 배열을 포함하고 있기 때문에, BHK 세포에서 FGF- 수용체에 대한 인터루킨-1베타와 FGF-1의 결합분석을 수행하였다. BHK 세포에서 FGF 수용체에 대한 FGF-1의 결합친화력은 FGF-2와 같았으나, hrIL-1β(Biogen사) 경우 어떠한 결합도 측정되지 않았다.

제 3도는 NIH3T3세포에 존재하는 FGF-수용체 1형에 대한 방사능화 요오드 처리된 FGF-2(bFGF)와 FGF-LA, FGF-LI의 결합을 첨가된 미-표식 FGF 단백질의 함수로 보여주고 있다. FGF-1-A와 FGF-LI 에 대한 경쟁 결합 곡선은 FGF-2의 것과 동일하게 나타났다. 이는 FGF-2내 고리 아미노산의 변화가 세포표면 FGF 수용체 1형(FGFR1)에 대한 단백질의 수용체 결합 특성에 별다른 영향을 주지 않는 것으로 증명되었다.

FGF-2, FGF-2LI 및 FGF_2LA의 유사분열활성을 어른 소 대동맥궁 유래의 혈관내피세포를 사용하여 예전에 기술된 방법으로 측정하였다.(Gospardarowicz, D., 등, PNAS 81:6963-6967(1984)) 약술하면, 세포를 DMEM 0.5㎖이 들어있는 24-well 플레이트에 0.8×10⁴개 접종하였다. DMEM 배지 중에서 10% 송아지 혈청(Hyclone, Logan, UT), 페니실린, 스트렙토마신, L- 글루타민이 포함되어 있다 접종 2시간 후, DMEM으로 단계적으로 희석한 FGF-2와 변이체들을 20㎕씩 첨가하였다. 배양 5일 후 2회 반복한 플레이트를 트립신 처리하고 Coulter 계측기로 세포 밀도를 측정하였다.

이러한 세포증식 분석 결과는 제 4 도에 나타내었다 점선은 FGF-2를 첨가하지 않은 상태의 기저 세포의 성장을 나타낸다 "ㅇ FGF-2에 의해 자극된 경우를 나타낸다. FGF-2LI변이체는 "ㅁ"으르 표시하였으며 FGF-2LA 변이체는 "△"으로 표시하였다. FGF-2LI 경우 FGF-2 에 비해 약 5-10배 낮았으며, FGF-2LA는 야생형 인자와 같은 결과를 나타내였다.

실시예 5

본 실시예는 상기 실시예 3에서 분리정제한 FGF-2 변이체를 사용하여 시험관내와 상체내에서의 혈관형성을 실행한 것을 설명한다.

FGF변이체에 의한 유도키나제형 플라스미노젠 활설화인자의 유도를 조사하였다. 어른소 대동맥 내피세포(ABAE)를 96well 플레이트에 well 당 20,000개의 세포를 접종하고 10% 송아지 혈청, 페니실린, 스트렙토마이신, L-글구타민이 들어있는 DMEM 배지와 FGF-2 또는 변이체를 다양한 농도로 첨가하여 배양하였다. 24시간 경과후, 세포를 PBS로 세척하고 0.05% Triton X-100이 포함된 60 mM Tris-Cl, pH8.5용액으로 분해하였다. 세포 관련 유로키나제형 플라스미노젠 활성화인자(uPA)활성은 플라스민 색소 생성 기질인 D-norleucy1 -hexahydrotyrosy1- lysine p-nitroanilide acetate(American Diagnostics, Greenwich, CT)를 사용하여 상기에서 인용하였던 Presta등의 방법으로 측정하였다. 세포관련 단백질 농도는 코마시 블루 염색으로 측정하였으며 그 결과는 5도에 나타내었다. FGF-2LI와 FGF-2LA모두 유로키나제형 플라스미노젠 활성화인자의 유도를 유의성있게 감소시켰다.

시험관내 혈관형성 연구는 변이체가 3차인 콜라젠 젤에서 배양한 ABAE 세포에 모세관 유사 구조를 유도하는지의 유무를 조사하므로서 밝혀졌다. 3차원 콜라젠 젤 플레이트(24-well)의 제조는 DMEM과 NaHCO3 로 중성 pH를 조절한 0.7mg/㎖ 냉 쥐-꼬리 1형 콜라젠 용액 0.5 ㎖을 각 well에 가하므로서 이루어졌다. 콜라젠 젠(약 1-2 mm 두께)이 형성된 후, ABAE세로를 well 당 50,000개 접종하였다. 배양은 세포들이 집단화될 때가지 페니실린 1100 유닛＼㎖), 스트렙토마이신(100mg＼㎖ 및 L-글구타민(2mM)을 포함하는 DMEM 배지로 37℃에서 수행하였다. 보통 젤 전체에 세포가 단층을 이루는 데는 5일이 걸린다. 세포 단층이 생기고 나면, 다양한 농도의 FGF-2 또는 변이체가 포함된 신선한 배지로 교환하고 37℃에서 48시간 동안 더 배양한 후 차가운 메탄올(-20℃)로 고정하여 배양을 정지시킨다.

ABAE세포에서 형성된 모세관 유사구조의 양은 Hamamatsu C2400 비데오카메라와 Zeiss Axioshop 현미경이 부착된 Kontron IBAS 영상분석기를 사용하여 분석하였다. 비데오카메라로 얻은 각 부분의 위상화 영상은 이원적 영상으로 바뀌어 모세관-유사 구조를 가진 영역은 회게, 나머지는 검게 나타난다. 그래서 시험관내 혈관혈성 정도는 흰 영역의 백분율로 표시된다. 동일조건의 세포배양은 2회 반복 실시하였다. 각 well의 3-4 영역을 영상분석하여 평균값과 표준편자를 결정하였다. 이와 같은 컴퓨터 연관 정량분석 방법의 결과는 제 6 도에 나타내었다. FGF-2LI에 의한 관형성 유도는 야생형 FGF-2에 비해 훨씬 낮았으나, FGF-2LA의 경우 야생형과 비슷하다.

시험관내 혈관형성 모델에서는 Howdwn과 Silver에 회에 개선된 (Int. Endodontic J. 13: 3-16(1980), 변형된 성장인자 또는 다른 시약들에 의한 성장인자에 의한 유도된 신생혈관 형성 또는 그의 저해를 관찰하는 토끼이실 체계를 사용하여 FGF-2LI를 평가하였다.

근육에 50-70mg/kg의 케타민(ketamine)과 10mg/kg의 자일로진(xylozine)을 투여하여 토끼를 진정시키고 전기 이발기계로 귀를 면도하고 물로 세척 후 베타딘 처리를 하였다. 감염은 위험을 최소화하기 위해 이실을 삽입하기 전에 근육주사로 Benzathine 상표의 페니실린을 체중kg 당 20,000 unit투여하였다. 이실은 주요혈관이 지나가지 않는 약 0.75 cm 부위에 삽입시켰다. 실험기간동안 동물의 이실에 대한 관찰이나 사소한 조작도 Butorphanol 과Acepromzine 각각을 1kg당 lmg씩 섞어 근육주소로 진정시키면서 행하였다. 이실 한쪽에는 FGF-2 도는 FGF-2LI 이 결합된 헤파린-세파로스 bead만 들어 있는 알긴산염 캡슐을 넣었다. 그래서 성장인자와 알긴 산염 캡슐만의 효과를 같은 동물에서 동시에 관찰하였다. FGF-2와 FGF-2LI는 이실당 1, 10, 100ng의 농도로 테스트하였다. 동물을 4-6주간 유지하였으며 신생혈관형성은 육안으로 관찰하였고 1주간격으로 사진촬영을 하였다.

이러한 과정에서 사용한 신생혈관형성을 정도의 평가지수는 다음과 같다.

신생혈관형성 의 평가지수

제 9 도에 나타낸 자료에 의하면 FGF-2LI가 FGF-2보다 혈관형성유도가 더 뛰어난 것으로 보인다. FGF-2와 FGF-2LI모두 대혈관형성을 자극하고 그들의 성장이 이실에 퍼지게하여 혈류량을 갖는 문합협관으로 되었다. 대조적으로, 외부의 성장인자를 첨가하지 않는 알긴산염 헤파린-세파로스 bead 만 포함하는 대조군에서는단지 짧은 모세관만 형성되었다. FGF-2와 FGF2LI의 활성 차이는 정량적으로 정성적이다. FGF-2에 비해 FGF-2LI의 현저한 자극활성은 넓은 범위의 농도에서 관찰되었고, (즉, 0.1-400mg/실)이 자극은 FGF-2의 자극효과를 증지한 시간을 넘어까지 지속되었다.(제 8도)

비록 FGF-2가 운반체만에 비교해서 새로운 혈관형성을 투여량 의존적으로 유도하지만, FGF-2과의 비교활성은 단비 10-100ng 이실 농도에서만 관찰되었으며 이보다 높은 투여량에서는 감소반응을 나타내었다. 흥미 있는 것은 FGF-2의 400 ng/이실에서 혈관형성이 완전히 저해된 반면, 같은 투여량에서 FCF-2LI는 모세관 및 대혈관 형성을 크게 자극하였다. 이로써 FGF-2와 FGF-2LI의 생물학적 활성 차이가 있음을 알 수 있었다.

비록 시험관내 결과에서 FGF-2LI의 혈관형성 활성이 낮은 것으로 나타났지만, 생체 결과는 초효능(Superagonist)-유사 행동을 나타낸다. 어떤 가설에 얽메이는 것은 아니지만, 시험관내 분석은 단일 세포형을 사용한 분리된 체계에서 고리 유사체의 특정 성질을 강조하는 반면, 생체 모델은 혈관 형성에 있어서 대부분 알려지지 않은 FGF와 다른 인자간의 상호작용을 제공하는 복잡한 전후관계의 환경을 제공한다.

예기치 않은 FGF-2LI의 시험관내와 생체 특성의 불일치는 성장인자의 생물학적인 활성은 소정의 고리유사체의 구현예에서는 약리학적으로 분리되어 있음을 나타낸다.

실시예 6

다른 FGF수용체에 대한 FGF 의 결합이 이 실시예에서 방사능-요오드화된 FCF단백질과 여러 표식되지 않은 단백질 간에 다른 형의 FGF수용체 단백질의 결합에 있어서의 경쟁정도를 측정하거나 다양한 수용체 단백질에 방사능요오드화한 FGF 의 직접적인 결합을 측정하므로서 결정되었다. 결합연구는 과다한 표식되지 않는 FGF의 존재 또는 부재시에 방사능-요오드화된 FGF가 가용성의 수용체에 화학적으로 교차결합하는 것으로 확인되었다.

돼지 장점막의 소듐 헤파린(PM 헤파린)이 헤파(Hepar) 산업으로부터 얻어졌다. KGF는 UBI로부터 얻어졌다. 방사능요오드는 에서샴(Buckinghamshire, England)에서 구입했다. FGF는 클로라민 T를 이용하여 요오드화했다. 준비한 표식물의 특이적 활성은 ng FGF당 1.2-1.7 ×10⁶cpm이었고 -70℃에서 3주까지 보관되어졌다. DMEM(1 g glucose/L), 송아지 혈청, 태아 송아지 혈청(FCS), 페니실린과 스트렙토마이신은 Cellgro(Mediatech, Inc.. Herndon, VA)로부터 얻어졌다. 0.05% 트립신을 포함하는 식염수, 0.01 M 소듐 포스페이트와 0.02% EDTA(STV)는 Cellgro에서 얻어졌다. 조직배양접시는 벡톤 디킨슨(Oxford, CA)의 팔콘 랩웨어부분에서 얻어졌다. 4well 조직배양 플레이트는 NUNC 사 (Rosklide, Denmak) 제품이다.

쥐의 FGF 수용체 1(FGFR-1, flg), FGF 수용체 2(FGFR-2; bek) 또는 KGF 수용체(FGFR(IIIb); k-sam)의 세포외 영역을 태반성 알카린 포스파타제(AP)의 분비형을 코딩하는 알카린 포스파타제-tag발현벡테에 클로링 시켜 가용성 FGF 수용체 단백질들을 제조하였다. FGF - 수용체 - 알카린 포스파타제(FRAP) 플라스미드들을 선별성네오마이신 내성 유전자와 함께 NIH3T3에 동시에 형질 감염시켰다. 클론은 G418(600 Mg/㎖)로 선별하고 조건배지에서 AP효소활성으로 스크린하였다. 높은 AP 활성도 (2내지 4 A405 유닛/분1㎖)를 내는 수용체 클론을 결합분석을 위한 조건 배지를 만드는데 이용하였다.

수용체 결합 반응 홉합문의 조성에는 FRAP-조건배지(0.24 OD 유닛/분), 2ng/㎖의 방사는 요오드화된 FGF 및 200 ng/㎖의 헤파린이 포함되어 있다. FGF: 헤파린: FRAP의 3차 혼합물을 단백질 -A(상표명 Sepharose)와 커플링된 항 AP 모노클론항체 슬러리가 1:1 로 된 부유물 20㎕ 로 면역침전시켰다. 모든 구성물은 실온에서 혼합하였다. 전체 부피는 0.1% 송아지 혈정 알부민이 포함된 DMEM 배지의 첨가로 200㎕ 되게 조정하였다. 결합은 24℃에서 1-2시간 진행되었으며 수용체 혼합물 또는 배위자는 결합이 완결된 후 4℃(2,000 ×g에서 10초)에서 원심분리하여 수집하였다. 침전물은 HEPES(20mM), NaCl(150mM), 글리세롤(10%) 및 TTiton X-100 이 포함된 차가운 완충액 500㎕로 2회 세척하고 방사능요오느-표식된 FGF 결합을 감마 계측기로 정량하였다. 또는 FRAP 단백질의 AP 효소 활성은 PBS 50㎕가 들어 있는 마이크로 타이터 플레이트에 헤파린-세파로스에 결합된 FRAP 수용체를 넣어 측정하였다. 반응은 기질(2M 디에한올아민, 1mM Mg Cl2, 20mM 호모아르기닌, 및 12 mM P-니트로페닐 포스페이트를 함유하는 AP 용액 버퍼(×2) 50㎕)의 첨가로 개시하여 실온에서 kinetic Microplate 레코더를 사용하여 405nm에서 측정하였다.

수용체 결합은 수용체로부터 표식된 FGF 의 방출량을 정량하므로서 측정하였다. 약술하면, 헤파린 셀페이트 저친화 부위에 결합된 FGF는 1.6M NaCl, 20mMHEPES, pH7.4 가 포함된 냉용액으로 5분 반응 시킴으로서 세포표면에 방출되어 나오며 방출되는 방사능양을 감마계측기로 측정한다. 고친화 부위에 결합된 FGF는 2M NaCl (20mM 아세테이트 완충액)추출에 의해 떨어져 나오며 이때 방출되는 방사능양을 측정한다.

화학적 교차 결합실험은 실온에서 실리콘 처리된 0.5㎖ 마이크로센트 리퓨지 관에 ㎕ 용적에서 수행하였다. 반응혼합문에서는 단백질 A- 세파로스/ 항-AP 단일항체에 고정화된 FGF 수용체와 200ng/m2의 헤파린, 2ng/㎖의 방사능요오드 표식된- bFGF, 20mM 인산완충액(pH7.4), 140mM NaCl 등이 포함된다. 90분 반응후, dimethy1 sulfoxids에 녹인 disuccinimidy1 기질 용액 1 ㎖을 첨가 후 농도가 0.15mM되게 첨가하고 3분동안 더 반응시켰다. 반응은 200mM 에타놀라민-HC1(pH8.0)을 1㎖을 첨가하고 30분 동안 방치하므로 중지시켰다. 반응혼합물을 2 X SDS-polyacrylamide 젤 전기영동 시료 안충액으로 1:1 희석하여 12% SDS-Polyacrylamide 젤에서 전기영동하였다. FGF수용체에 대한 FGF의 교차연결은 코닥 XAR필름에 감광시켜 확인하였다.

FGF-2의 표면고리 위치는 다양한 삽입이 일어난 FGF계열 단백질들의 다양한 아미노산 배열 영역과 일치하였다. 이 영역은 배위자-수용체의 결합특이성을 결정짓는 부위일 가능성 때문에 FGFRI(flg)와 FGFR2 아형 IIIb(FGF-7측은 KGF 수용체)-FGF-2와 결합하지는 않음- 에 대한 고리 변이체 LA와 LI의 결합 영역을 측정하였다. 도 9A와 9B는 FGF-1, FGF-2, FGF-7 및 고리 변이체에 대한 FGFR1과 FGFR(IIIb)의 수용성 차원에서 경쟁 결합 곡선과 수용성 수용체로부터 방사능 표식이 FGF-2와 FGF-7의 치환을 각각 보여준다. FGF-1, FGF-2, FGF-2LA 및 FGF-2LI는 FGFR1에 동등하게 잘 결합하나 FGF-7 의 결합은 확인되지 않았다.(제 9A도)

FGFR2(IIIb)에 결합하는 다양한 FGF단백질들의 결합 내역(제 9B도)을 보면 FGF-7과 FGF-1은 같은 친화력으로 결합하나 FGF-2와 FGF-2LI 변이체는 이 수용체형에 결합하지 않는다.; 그런데 FGFR2(IIIb)에 대한 LA 변이체의 결합은 FGF-7 혹은 FGF-1에 비해 약 5배 정도만 낮다. FGF-2LA의 결합내역이 FGF-1 의 것을 반영하며 FGF-1고리 숙주 단백질인 FGF-2와는 다른 것을 수용체-리간드 특이성 결정에 이러한 표면고리가 연관되는 것과 일치한다.

방사능 표식된 FGF 단백질과 고리 변이체의 다양한 수용성 FGF 수용체에 대한 결합 특이성은 표식이 안된 FGF의 존재 또는 부재하에서 인자들의 화학적 교차결합으로 확인하였다. FGF-1, FGF-2, FGF-2LA 및 FGF-2LI는 FGFR1에 결합하고 과잉의 표식안된 FGF첨가로 방사능요오드 표식된 FGF의 교차 결합이 제거되었다. FGFR1 에 대한 방사능 요오드 표식된 FGF-7 교차결합은 측정되지 않았다. 수용성 FGF-2 수용체를 사용하여 반복한 실험에서도 동일한 교차결합 내역을 얻었다 FGFR2(IIIb) 에 대한 교차 결합 내역의 경우 FGF-1, FGF-7 및 FGF-2LA 만이 수용체에 결합하고 FGF-2와 FGF-2LI 변이체는 결합에서 제외되었다. 교차결합 연구는 도 2, 3, 8 에 나타낸 결합 결과와 일치하였다.

실시예 7

FGF-7 고리 아미노산 배열을 FGF-2에 도입하여 이 실험에서 새로운 FGF-2 고리 변이체의 특성을 조사하였다.

FGF-2LK라 명명한 FGF-2 고리 변이체는 FGF-7 유래의 9개 잔기 고리배열(서열동정 번호 제8번의 잔기 154-162)을 가지고 있으며 상기 실시예1 과 2에서 기술한 과정을 이용하여 제조하였다.

FGF-2LK는 헤파린에 대한 친화력이 명백히 감소했다. 헤파린-세파로스에서 NaC1 용출은 약 0.7 M 이었으며 이는 야생형 단백질의 1.4 M 과 비교된다. LK 변이체를 용출시키는데 요구되는 NaC1 의 물농도는 FGF-7 용출시 요구되는 농도와 비슷하였다. 헤파린에 대한 FGF-2LK 변이체의 저친화력은 비록 헤파린에 대한 결합에 직접 연관되어 있지는 않지만 헤파린에 대한 단백질의 친화력을 변형시킬 수 있음을 보여준다.

상기 실시예6에서 설명한 것은 수용체 결합 실험에서 FGF-2LK 단백질은 FGF 수용체 1형에 대한 방사능요오드로 표식된FGF-2 의 결합화 치환 혹은 경쟁할 수 없었으나, FGF 수용체 2형(IIIb) 에 대한 방사능요오드 표식된 FGF-7 결합과는 경쟁하였다. 반면, FGF-2는 결합에 경쟁하지 않았다. 비록 FGF-2LK가 표힉안한 FGF-7을 사용한 경쟁보다 약 100배 정도 약한 강도를 보였지만 수용체-배위자간 결합 내역에서 분명한 변화가 확인되었다.

이상의 결과로 FGF-7유래의 고리 배열은 수용체-배위자 특이성을 나타내며, FGF-2KL 변이체가 FGF-7과 결합하는 수용체 아형과는 결합하도록 허용하나 FGF-2 와 결합하는 수용체 아형과는 결합을 허용하지 않는다는 사실을 보여주고 있다. 역으로, FGF-2 숙주 분자내에 존재하는 FGF-7 유래 고리 배열을 FGF 수용체 1형과 단백질의 결합을 차단한다 상호반응의 친화력이 100배로 감소하는 것은 FGF-7 내 다른 구성인자가 수용체에 대한 배위자의 결합친화력에 관여하는 것을 의미한다. 이결과는 또한 고리 배열이 헤파린에 대한 결합을 변경시킬 수 있음을 의미한다.

위에서 설명한 것은 통상의 지식을 가진자에서 본 발명을 어떻게 실용화하는지를 가르치기 위함이고, 당업자에 대해서는 모든 명백한 변형예 및 변경예를 상세히 기술하지 않았음을 잘 알 것이다. 그러나 이러한 모든 명백한 변형에 및 변경예가 첨부한 특허청구의 범위에서 정의된 본 발명의 범위에 포함된다.

Claims

서열동정 제1번의 섬유아세포 성장인자-2(FGF-2) 아미노산 115 내지 124에 상응하는 아미노산이 하기 (a) 내지 (j)로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산으로 대체된 것을 특징으로 하는 섬유아세포 성장인자-2의 구조 유사체:

(a) 서열동정 제2번의 FGF-1 아미노산 112-125;

(b) 서열동정 제2번의 FGF-1 아미노산 112-125 (단, His121이 Asn121로 대체);

(c) 서열동정 제4번의 FGF-3 아미노산 129-154;

(d) 서열동정 제5번의 FGF-4 아미노산 169-178;

(e) 서열동정 제6번의 FGF-5 아미노산 173-188;

(f) 서열동정 제7번의 FGF-6 아미노산 171-180;

(g) 서열동정 제8번의 FGF-7 아미노산 151-164;

(h) 서열동정 제9번의 FGF-8 아미노산 136-156;

(i) 서열동정 제10번의 FGF-9 아미노산 143-169; 및

(j) 서열동정 제3번의 인터루킨-1β 아미노산 231-235.
제1항에 있어서, 서열동정 제1번의 아미노산 115 내지 124에 상응하는 아미노산이 하기 (a) 내지 (c)로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열로 대체된 것을 특징으로 하는 유사체:

(a) 서열동정 제2번의 FGF-1 아미노산 112-125;

(b) 서열동정 제8번의 FGF-7 아미노산 151-164; 및(c) 서열동정 제3번의 인터루킨-1β 아미노산 231-235.
서열동정 제1번의 섬유아세포 성장인자-2(FGF-2) 아미노산 118-112에 상응하는 아미노산이 하기 (a) 내지 (l)로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열로 대체된 것을 특징으로 하는 섬유아세포 성장인자-2의 구조 유사체:

(a) 서열동정 제2번의 FGF-1 아미노산 112-123;

(b) 서열동정 제2번의 FGF-1 아미노산 112-123 (단, His121이 Asu121로 대체);

(c) 서열동정 제2번의 FGF-1 아미노산 115-121;

(d) 서열동정 제2번의 FGF-1 아미노산 115-121 (단, His121이 Asn121로 대체);

(e) 서열등정 제4번의 FGF-3 아미노산 132-152;

(f) 서열동정 제5번의 FGF-4 아미노산 172-176;

(g) 서열동정 제6번의 FGF-5 아미노산 176-186;

(h) 서열동정 제7번의 FGF-6 아미노산 174-178;

(i) 서열동정 제8번의 FGF-7 아미노산 154-162;

(j) 서열동정 제9번의 FGF-8 아미노산 144-148;

(k) 서열동정 제10번의 FGF-9 아미노산 151-161; 및

(l) 서열동정 제3번의 인터루킨-1β 아미노산 231-235.
제6항에 있어서, 서열동정 제1번의 FGF-2의 아미노산 118-112에 상응하는 아미노산이 하기 (a) 내지 (c)로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열로 대체된 것을 특징으로 하는 유사체:

(a) 서열동정 제2번의 FGF-1 아미노산 115-121;

(b) 서열동정 제8번의 FGF-7 아미노산 154-162; 및

(c) 서열등정 제3번의 인터루킨-1β 아미노산 231-235.
서열동정 제1번의 섬유아세포 성장인자-2(FGF-2) 아미노산 115-124에 상응하는 아미노산이 하기 (a) 내지 (h)로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열로 대체된 것을 특징으로 하는 섬유아세포 성장인자-2의 구조 유사체:

(a) 섬유아세포 성장인자-1 서열

(b) 섬유아세포 성장인자-3 서열

(c) 섬유아세포 성장인자-4 서열

(d) 섬유아세포 성장인자-5 서열

(e) 섬유아세포 성장인자-6 서열

(f) 섬유아세포 성장인자-7 서열

(g) 섬유아세포 성장인자-8 서열

(h) 섬유아세포 성장인자-9 서열
서열동정 제15번의 서열을 포함하는 섬유아세포 성장인자-2의 구조 유사체.
서열동정 제16번의 서열을 포함하는 섬유아세포 성장인자-2의 구조 유사체.
제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,

헤파린과 결합할 수 있는 능력을 보유하며, 천연의 섬유아세포 성장인자 수용체에 대해 결합 친화성을 가지는 것을 특징으로 하는, 섬유아세포 성장인자-2의 구조 유사체.