JPH07503792A - 細胞溶解処理条件下で異種細胞集団を正確に計数し，感受性に関する格付けを行う方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 細胞溶解処理条件下で異種細胞集団を正確に計数し、感受性に関する格付けを行 う方法 」」旦！ 本発明は、一般的には、細胞学、および細胞懸濁物に存在する特定の細胞の型の 正確な分類および計数を可能とする自動装置の使用に関する。また、本発明は、 細胞懸濁物に存在する細胞の型の厳密な機能上の同定および特徴付けを特徴とす る特に、本発明は、他の意味では望ましいサンプル処理条件下である跳躍的な方 法で不安定と考えられる、細胞集団の正確な分類、特徴付け、同定および計数を 可能とする方法に関する。そのような細胞集団としては、異常な細胞条件の結果 、または強力な細胞溶解処理剤および条件の使用の結果（またはそのような因子 の相互作用により）、突然大きな変化を受ける、壊れやすくて溶解感受性を有す る血液細胞が挙げられる。

発明の背景 混合細胞懸濁物の細胞集団の有無およびそのサンプルに存在する細胞の特定の型 の数に関する定量的情報が分析可能であることは、先の研究者らにより認められ ている。この情報は、病気の診断および特定の病状の治療の有効性をモニターす るのに有用である。先の研究者らはさらに、混合細胞懸濁物に課した条件に対す る細胞集団反応における検出可能な差異を利用すると、特定の細胞集団の有無を 有利に示すことができることを認めている。また、これらの検出可能な示差反応 を使用すると、単一の細胞集団に特有の信号を発生させることができ、その細胞 集団を計数することが可能である。示差反応技術が研究されている混合細胞系と しては、血液、血漿、骨髄、***および臓器の細胞懸濁物などの生理的流体なら びに植物細胞懸濁物などの細胞培地が挙げられる。そのような反応技術は、添加 色素の存在下での細胞の分集法から、極端な温度、ｐＨ，毒性または化学的ミク ロ環境に短時間または長時間さらすなどのストレスを課して１個以上の細胞集団 の生存を停止させるものまでに及ぶ。

混合細胞懸濁物から示差反応を発生させるために課する条件の選択は、典型的に は、歩み寄った中間的なものである。細胞懸濁物に存在する細胞集団同士の固有 の類似性により、標的としない細胞集団からもいくつかの部分的な反応が起こる ことが避けられず、これが、そのような全ての種類の示差反応技術で得られる情 報の質に悪影響を及ぼしている。

哺乳類の血液は、より完全に研究された混合細胞懸濁物の一つであり、示差的細 抱集団生存反応などの種々の示差反応技術を利用して分析される。全血に存在す る細胞集団は、哺乳類での濃度が数百刃側／μｌである赤血球（Ｅ）；哺乳類で の濃度が一般に数万〜数十刃側／μｍである核のない血小板（Ｔ）：および哺乳 類での濃度が一般に数百〜数刃側／μｍであり、それを超える場合もある（白血 球のサブ集団の場合）核のある白血球である。正常な哺乳類の末梢血の白血球は さらに、５種類の主要な型、すなわち小さいリンパ球（Ｌ）、大きい好中球（Ｎ ｅ）、好酸球（ＥＯ）、好塩基球（Ｂ　ａ）および単球（Ｍｏ）のサブ集団に分 類される。

これらの血球集団を図１に示すが、好中球、好酸球および好塩基球はまとめて顆 粒球（Ｇ）として示す。白血球の主要な５種類全部のサブ集団は図６に示す。

赤血球と白血球との主要な差異の一つは、健康な場合、赤血球を選択的に破壊（ または溶解）し、一方、典型的な白血球は実質的にそのままにしてお（溶血剤の 選定が比較的簡単であることである。この異なる生存反応は、細胞質構造が大き く相違することにより説明される。白血球集団の溶液を、全血サンプル中の全赤 血球がこの臨界溶血閾値を超える物理化学的条件で存在させると、全血サンプル 中のこれらの赤血球は、主に浸透現象、腫張現象および表面膜現象の相互作用で ある急速な細胞溶解性崩壊プロセスにより溶解されてしまう。そして、一般的に は、白血球の全サブ集団も、それ自身の溶解性崩壊プロセスを開始すると予想さ れる。しかし、成熟赤血球と違って、白血球（血小板を含む）は、容易に補充可 能な余分の内在化細胞膜を多く有している。適切な条件下では、この膜物質が外 在化し、その結果、白血球はふくらんでいく石鹸の泡と特徴を多く共有する。さ らにふくらむことができるそれらの石鹸の泡は、容易に補充可能な予備（非表面 ）の石鹸分子をまだ残している。網条赤血球以上に成熟した赤血球は、もはや余 分の表面物質をもっていない。その結果、白血球集団がその臨界溶血閾値に達す る速度は赤血球と比較して一般に遅く、従って、制限時間内の分析条件下では、 多くは白血球集団を実質上溶解耐性を有するものとみなすことができる。

一世紀以上にわたって、この相異なる細胞生存反応は、全血サンプルに存在する 白血球の分類および計数を行うために無神経に利用されてきた。もし、赤血球が 簡単に溶解され、白血球および血小板が保存されるならば、数の少ない白血球サ ブ集団の各構成要素ごとに１万個以上もの赤血球を処理する必要がないことは、 図１から明らかである。この処理負担の軽減により、全血サンプルの分析時間（ およびコスト）がかなり短縮される。

しかし、この相異なる細胞生存反応を１世紀前の方法の溶解剤に適用すると、非 常に現実的な制限を受ける。完全な溶血を行う溶血性の強い条件の使用（いくつ かの白血球が犠牲にされる）と白血球に影響を及ぼさないためのあまり溶血性の 強くない条件の使用（妨げとなる未溶解の赤血球の存在のために白血球の計数が 損なわれる）との間で妥協案を打ち出さなければならない。ここ１５０年以上、 健康なヒトと病気のヒトの両方でこれらの相反する反応を同時に処理する最適な 妥協条件は見出されていない。

その結果、ヒトおよび獣医の臨床用途における自動化に有益な、費用効果を有す る迅速な溶血方法も、本質的には白血球溶解性（白血球・血小板溶解性）である 。従って、白血球サブ集団の正確な分類および計数は妥協されることになる。溶 血に伴う白血球溶解活性は、計数の正確度を大幅に低下させ、白血球サブ集団の 臨床上の分類および計数の質を下げる。従って、本発明の目的は、通常使用され る溶血剤および溶血条件に固有な白血球溶解活性について説明がつく　（そして 、計数の補正がなされる）白血球サブ集団の分類・計数法を提供することである 。

壊れやすいリンパ球 白血球サブ集団の分類・計数法の臨床上の価値は、健康な体および病気の体の血 液中を循環する赤血球および白血球に存在する異常を同定し、格付けする際の有 用性に直接関係する。例えば、ごくまれな、しかし非常に重要な臨床上の疾患で は、循環している特定の白血球サブ集団が極めて溶解感受性の高い要素を含んで いる可能性がある。この状況の例としては、特定のケースの慢性リンパ性白血病 および感染性単核球症におけるような「壊れやすいリンパ球」がある。そのよう な臨床状態において、前世紀の形態学者たちは、血液膜の顕微鏡分析で「グンブ レヒト影」を認めた。Ｈ９ＢＢｅｍｇＩ、１．　Ｒ＊［ｅｌｌｅ＋、　＾１１１ ｏｆ　Ｃｌ１ｎｉｃｉｌ　Ｈｅ＠５１ｏｌｏ（７，第４版１９８９．　ｐ、　２ ２７（Ｓｐ＋目Ｈｅｒ−Ｖｅ＋ｌＢ）参照。今日の化学技術者は、よごれ細胞ｒ ＋ｍｅ＊＋　ｅｅｌｌ＋　Ｊ　（＋、　Ｃ＋ｏｓ＋ＥＢｌｓｎｄ、　Ｃ，Ａ、　 Ｓｌ＋ｔＢｅ。

”Ｅｒ「ｏｎｃｏＩＯ＋ｌｂｏ　ＥＬＴ　８ＧＱｌＷＳ　ＷＢＣｉｎ　ｃｈｒｏ Ｉｌｉｃ　ｌＹｍｐｂｘｌｉｅｌｅｗｋｉｅｓ目”、Ｃｌ１ａ、Ｌｌｂ、ＩＩｅ ＋ｕｌｏ１．　１９ｇ７．　９．　３７１−３７５）　またはｒ＋ｓｗｄＢ　ｃ ｅｌ＋ｔＪ　（Ｎｓｔｉｏａｓｌ　Ｃｏ＋＋ｓ口ｌｅｔ　Ｉｏｒ　Ｃ１１ａｉＣ １１Ｌｓｂｏ＋婁１ｏ＋！　Ｓｌｉｎｄｇ＋ｄｓ、Ｒｅｆｅｒｅｎｃ＠　Ｌｃｗ ｋｏｅ７１ｅ　ＤｉｌｌｅｒｅｅｌｉｔｌＣｏｒａｌ　（Ｐ＋ａｐｏ＋ｌｉｏ　 ■ｌｌ　ｓａｄ　Ｅ　マ５ｌｉｉｌｉｏ　Ｉｌ　ｏｌ　１ｉｓｌ＋ｗ　■ｅｌｉ １Ｍｅｌｈｏｄ、Ａｐｐ＋ｏｗｓｄ　５ＩｘａｄＩ＋ｄ、ＮＣＣＬＳ　Ｄｏｅｗ ｍｅａｌ　８２０−＾　１９９２（Ｙｉｌｌｘｎｏマｓ、　Ｐｇ、］を認めてい る。影響を受けた白血球細胞集団は、非常に壊れやすいため、膜形成プロセスの ストレスを細胞に課する前に血液の小滴に高濃度のコロイド（アルブミンなど） を添加しなければ、血液膜中に保持することすらできない細胞を含んでいる可能 性がある。ＮＣＣＬＳ　ＤＯｃａｄｅ１８２Ｇ−＾；　Ｄｅ＋＋５ｌｏｒｅ。

Ｃ，Ｍ、”ＥｌｉｍｉｗｓｌｉＢ　ｄ口１ｎｌｅ（＋ｔｔｅｄ　ｃｅｌｌ＋　ｏ ｓ　ｂｅｍＩｌｏｌｏｌｉｃｌｌｌｌ“　Ｌｌｂ、　Ｍｔｄ、１２・６４Ｇ−４ １，１９８１゜これらの細胞の余分の内膜物質は全て高度に分散した状態にある ため、極めて大きいコロイド活性（ｏｎＣａｌｉｅ　ｘｃｌｉｂｉ１７）を有し 、浸透圧の低いストレス条件下では容易に回復できない。これらの細胞は、（後 述する）図２の溶解前の球状体に類似する。希釈物中のコロイドのコロラド侵透 圧が高いと、これらの溶解前のリンパ球の球面指数が減少する。このため、血液 膜傷害過程（ｂｌｏｏｄ　ｌｉｔ■＋ｓｅｌ＋ｉＢ　ｐ＋ｏｃ＋ｓ＋ｌの剪断圧 縮下であっても、それらの細胞はもはや破裂することはない。

また、そのような非常に壊れやすい白血球細胞は、血液をかなり希釈して、いわ ゆる流動細胞計測の自動血液細胞カウンター中で激しく処理する場合、細胞維持 が困難である。このことは、希釈物が、妨害する多くの赤血球を溶解するよりも 維持することを目的とする、明らかに平衡化された（蛋白質を含まない）生理食 塩水溶液である場合ですら当てはまる。従って、これらの壊れやすい白血球がサ ンプル中に存在すると、循環している白血球の濃度（または白血球の全数）およ び白血球サブ集団の計数値を正しく知ることが本質的に不可能である場合がある 。１．　Ｃｒｏｓｓ、Ｃ，Ａ、３１１１１ｇ（“Ｅ＋ｒｏｉｓｏｗｇ　Ｏ目ｋｏ 　ＥＬＴ　８００／１３ＷｆｌＣｉｎ　ｃｈｒｏｎｉｃ　１７ｍｐｌｕｌｉｃ　 ｌｅｗｋｔ＠ｍｉｔ”　、Ｃｌ１ｎ、Ｌｓｂ、　Ｒｔｍ＊ｌｏｌ。

１９８７、　９．　３７１−７６：１．　Ｂ、Ｄｉｔｏａら、”Ｅｌｅｃｌ＋ｏ ｓｉｃＣｏ■１ｉｅＨｏｌ　Ｄｏ（Ｌｅｗｋｏｅ７１ｅ＋　Ｄｉ＋ｃ＋ｅｐＩｃ ｉｅｔ＾ｒｉｓｉＢ　Ｆ＋ｏｓＣｓｌｉｂ＋ｇｌｉｏｃ　Ｗｉｔｈ　Ｃｏｗｌｌ ＋＋　５ｌｓｎｄｓｒｄ　４Ｃ■ｄ　Ｗｉｔｈ　＋ｈｅ　Ｈｅｍｏｃ７１ｏ＋ｕ ｌｅ＋　”　、Ｒｅｓ、　Ｖｅｌ、Ｓｅｉ、３１（２）、１９８１．２４９−２ ５ｆ！；　Ｊ、　Ｍ。

ＥＢｌＩｄ　ら、”Ａ＋＋　ｚｔｓｅ＋ｓｍｅｌ　ｏｆ　ｌｈｅ　Ｏ＋ｌｈａ　 ＥＬＴＪ’　。

Ｃ１１ｎ、Ｌｔｂ、　Ｗｃｍ＊ｌｏ１．、　１９８２．　４．　ｌＮ−９９゜本 発明は、そのような壊れやすい細胞の存在を確認し、循環総数を恐らく過少評価 してしまうような他の計数法により白血球を計数している実験室に警告を与える ような方法を提供する。

また、白血球サブ集団の正確な分類および計数を行い、それにより全白血球の計 数を行う方法も提供する。これらの目的は、分析のデータ収集中の意図しない白 血球溶解により生じる白血球の計数誤差を、上置厳密に補正することにより果た すことができる。本発明は、細胞の型を定性的に識別または分類する定量的デー タを使用することを可能にする。

溶解耐性赤血球 本発明方法によってうま（処理することができた別の重要な臨床上のジレンマは 、いわゆる溶解耐性赤血球を含む全血サンプルに関する。溶解により耐える赤血 球を生じる周知の条件の一部には、赤血球自体が、通常のヒトサンプルに適用可 能な方法では溶解困難と思われる、例えば錐状赤血球症、胎児および新生児の血 球、ならびに他の非定型で異常生理学的な哺乳類の赤血球集団がある。他の条件 または障害では、溶解を妨げる妨害物質の存在により、通常のヒトサンプルに有 効な溶血条件下での赤血球の溶解が困難になる。例えば、異常に高濃度の血液蛋 白は、溶血剤の一部を中和し、溶血剤の物理的接近の一部をコロラド的に妨害す る傾向にある。＾、　Ｂ＋ｅｖ＋＋ｅｌ（ｔｓ＋ｄ、Ｉ。

Ｎ７１ｓ＋ｄ、“ｌ１ｅｒｌｅｒｅＩｌｅｅ　ｂ７　ＣＢｏ（ｌｏｂｗｌｉｅｚ 　ｖｉｌｈ　Ｗｈｉｌｅ　ＢｌｏｏｄＣｅｌｌ　Ｍｅ＊＋ｍ＋ｃｍ！ｎｌ＋　ｏ ｎ　Ｃｏｗｌｌｅ＋　ＣｏｕＩｌｔｅｒ”　、Ｓｃ＊ｓｄ、１．　Ｃｌ１１１゜ １＋ｂ、Ｉｎｔｅ＋１．５１５．　１９９１．４８９−４９２　ｏ非経口輸液、 ある種の血液脂質障害および治療薬も、単独または他の物質と併用して、または 異常赤血球とともに赤血球保護条件を作り出すように作用する可能性がある。

溶解耐性赤血球問題の結果、溶血しなかったり、溶血が部分的であったりすると 、その影響を受けたサンプルについては白血球の計数処理全体が無効になる可能 性がある。溶解せず残存する赤血球は白血球の視覚化を妨げる。ヒトの血液１μ ｍに対して５００万個存在する赤血球の１％が溶血しないと、５万個の非溶解赤 血球が残存し、１μＩのヒト血液に５千個の有核白血球をおおい隠すことになる 。残留する赤血球が０．１％と少ないサンプルでさえ、それらを正常な血液サン プルと区別する識別信号を出す装置があり、これらのサンプル中の白血球の計数 には他の方法を使用しなければならない。場合によっては計数を手動で行わなけ ればならないが、所要時間、装置、研究室の空間、直接の作業、そして何よりも 、研究室の専門的技術およびこれら問題サンプルの処理のために開発・維持・品 質管理しなければならない複雑な手順のため、常に高コストで計数が行われる。

ジレンマは、溶血性の大きい物質または条件を使用して溶血を完全に行い、溶解 耐性赤血球の数を減少させると、白血球溶解が非常に増加するということである 。従って、現在は危険な妥協が存在するが、これでは、単一の費用効果のある血 液分析器で、日常的に信頼性のある溶血と白血球保護を両立させ得ない。

例えば、完全自動ＣＥＬＬ−ＤＹＮ■１６００血液分析器は、有核白血球を簡単 な「弱溶解　（Ｉｏｌｌ　ｌｙ＋ｅ）Ｊにより大雑把にリンパ球、単球および好 中球に分類し、少量の好酸球および好塩基球は溶解変性したこれらの主要な白血 球サブ集団の間に分散させるものである。ＣＥＬＬ−ＤＹＮ■１６００は一次元 のインピーダンス変換器を使用しており、その白血球測定は、溶解耐性赤血球が 非常に多いと無効となる。これらの問題サンプルの場合は、「弱溶解」条件下で は、目的とする有核白血球の粗サブ分類も、また全有核白血球の計数すらも得ら れない。その結果、先天的に溶解耐性赤血球を含む多くの新生児血液のサンプル を処理しなければならない研究室では、新生児の全赤血球を効果的に破壊するた めに１強溶解　（ｋｘｒｄ　Ｉｙ＋ｅ）Ｊを利用する第二の自動血液分析器を購 入しなければならないことが多い。

必然的に、「強溶解」は、有核白血球の細胞質も全て破壊し、実質的に均質の白 血球の核のみが図１のＥビークと非常に類似した、しかし６６　ｆ　Ｉ　（ＬＥ ＥＶ）の周りに位置する単一のピークとして残る。これらの核の分析により全有 核白血球の正しい計数値を得ることができるが、これらの細胞型のサブ分類を行 って、溶解変性しているが全く有用な、図１に示すようないわゆる示差的な白血 球のプロフィールを得ることはもはやできない。

この「強溶解」分析器が、典型的なヒト血液サンプルに適する「弱溶解」用に設 計されたＣＥＬＬ−ＤＹＮ■１６００と同じであれば、その装置の品質保証アル ゴリズム次第で、標準化した弱溶解による示差的白血球プロフィールに強い歪み があると警告が鳴らされる。ＧＬＰ　（グツド・ラボラトリ−・プラクティス） およびＣＬＩＡ（臨床実験室改善法）の指針によれば、アラームが鳴れば、個々 の装置について調査および注意が必要である。このジレンマに答えて、ＣＥＬＬ −ＤＹＮ社は、わずかに改良した血液分析器、ＣＥＬＬ−ＤＹＮ■１３００を市 販した。これは「強溶解」に対して効果的に作動することができる。このわずか に安価な装置は、溶解しに（い赤血球に関連する全白血球の計数問題−ＷＢＣ− のみを解決するものである。

しかし、これは、顧客にとっては高価な解決法である。というのは、溶血に耐え る、細胞質を含まない白血球の核の総数を除く全ての白血球に関する情報をたと え犠牲にしても、追加の装置がスペースを占有し、それが完全な保守を必要とす るからである。血液膜調製物で利用できる形態学上の白血球情報と比較しても、 サブ集団について得られる単一ピークの白血球ヒストグラムに関しては、利用で きる示差的または形態学的な情報はない。

特に言及しておきたいことは、利用価値のある「中位の溶解条件」−溶血強度が ＣＥＬＬ−ＤＹＮ■１６００の「弱溶解」とＣＥ　Ｌ　Ｌ　−Ｄ　Ｙ　Ｎ［Ｆ］ １３００の「強溶解」との中間である−をまだ誰も見出すことができないことで ある。そのような溶解条件の選択を試みる場合、完全にむきだしになった核の領 域に、部分的に溶解した好中球が代わりに移動する。これは、弱溶解条件下では 、溶血した小リンパ球の領域である。このため、雑ではあるが有用な有核白血球 の区別−主として細胞質が取り除かれたリンパ球（図１の６６　ｆ　ｌ　（ＬＥ ＥＶ）の周り）、わずかに溶解して損傷を受けた好中級（多かれ少なかれ図１の 顆粒球Ｇの部分）、ならびにＬおよびＮ細胞残余の間にあって、同一であること が証明され、目に見えるように好塩基球残余および好酸球残余によって包囲され た（これらの細胞は、血液中のかなりの濃度がここに存在する）、中位に損傷を 受けたた単球への区別−があやふやなものになる。

現在は、２世代のＣＥＬＬ−ＤＹＮ■３０００装置が存在する。第一世代のＣＥ ＬＬ−ＤＹＮ■３０００．１は、容易に第二世代のＣＥ　Ｌ　Ｌ　−Ｄ　Ｙ　Ｎ ■３０００．２に変換することができる。この第二世代のＣＥＬＬ−ＤＹＮ■３ ０００．２は本発明を利用している。本発明は、第一世代装置の白血球に関する ４次元の光学的情報の他に時間の次元を加えている。溶解しにくい赤血球の問題 （ＣＥＬＬ−ＤＹＮ■３０００で白血球の計数を不正確にし、従って許容できな いものにしていた）を克服するために、第一世代のＣＥＩ、Ｌ−ＤＹＮ■３００ ０゜１は、強溶解を利用するＣ　Ｅ　Ｌ　Ｌ−Ｄ　Ｙ　Ｎ■１３００もしくは１ ４００またはＣＥＬＬ−ＤＹＮ■１６００とセットで販売されていた。本発明を 利用する第二世代のＣＥＬＬ−ＤＹＮ■３０００．２は、等級の低い随伴装置は もはや必要としない。

■ 実際、ＣＥＬＬ−ＤＹＮ　３０００．１とＣＥＬＬ−ＤＹＮ■３０００．２との 相違を表す本発明では、その最も簡単な構成にもかかわらず、遥かに複雑なＣＥ ＬＬ−ＤＹＮ■３０００Ａシステムを無用のものとした。そのＣＥＬＬ−ＤＹＮ ■３０００Ａシステムは、ＣＥＬＬ−ＤＹＮ■３００．０．１より大きくなるこ となく単一装置内でＣＥＬＬ−ＤＹＮ■３０００．１とＣＥＬｒ、−ＤＹＮ■１ ３００と組み合オ）せたものとして開発された。ＣＥＬＬ−ＤＹＮ■３０００． ２で表される装置の成功は、費用効果がはるかに大きい。

本発明は、溶血性の強い物質および条件の使用に伴う白血球溶解を相殺するため の白血球数の厳密な補正に対し対策を構じているため、溶血性の強い物質および 条件の使用を可能とし、もって完全な溶血を保証するものである。本発明方法は 、白血球集団が、適切に選択した溶血性の強い物質または条件の存在下では、比 較的安定でゆっくりした、計算可能な崩壊速度で溶解するという実験的に得られ た知見を十分利用している。それらの白血球崩壊パターンは、白血球の計数器に 包含される比較的短時間のうちに記録することができ、得られる崩壊速度を使用 すると、白血球サンプル処理サイクルの開始時に白血球溶解プロセスが始まる前 のサンプル溶液に最初に存在した白血球集団の濃度を正確に推定することができ る。

細胞の計数速度をモニターすることはよく知られているものの、この目的のため に使用されたことはない。それは、細胞計数器の検出ゾーンの完全性または計数 プロセス中に変換器を通過する細胞含有サンプル溶液の流量の安定性を評価する ために使用することが多い。また、分析中の細胞が検出ゾーンを通過するとき、 それらが互いに付着しないことを保証する手段としても知られている。計数速度 のモニタリングは、１９６０年代以来、植物理学分野に対して製造されたほとん どのマルチチャンネル分析器にＭＣ３（マルチカウントスケーリング）機能が存 在したので、血球計数器の初期の開発段階では上記の目的のために使用された。

これらの装置を初期の血球計数器と結合した場合、細胞計数サイクル中の計数速 度のモニタリングは単純な自動操作であった　（ｙｏｎ　Ｂｅｂ＋ｓｎｓ、　Ｗ 、　Ｅ、■ｄ　Ｌ■ｄ！＋、Ｐ＋ｏｃ。

＾ｎ＋Ｉ＋ｔｌｉ■　Ｓｏｅ、Ｍｅｄ、　Ｒｅ＋ｅｚ＋ｃｈ、Ｙｅｔ、　２．　 ｐ、　３８０．　１９７０）。　さらに、出力は容易にプロッターに結合するこ とができた。集団の定量的挙動を得るために経時的な速度情報を使用することば なかった。

全面サンプルに存在する細胞を同定・分類・計数する別の従来技術は、別々の多 数のサンプル容器（マｏｌｉｓｓ）を有し、その各々で細胞アリコートを異なる 高度に特異的な溶解条件に付す別々のマルチチャンネル分析を利用するものであ る。この技術を利用する自動計測では、全血サンプルが複数のアリコートに分け られる。次いで、これらのアリコートは別々に、そのアリゴー１−内の問題の１ 種の細胞集団を除く全細胞成分が溶解するように選択された異なる溶解条件にか けられる。これらの個々のサンプルは次いで、各々のチャンネルで、各々の変換 器を使用して平行して処理され、生存する非溶解細胞集団に対する計数情報が得 られる。この方法は、その装置でマルチ技法を行う必要があり、ハードウェアお よび試薬が複雑になるという欠点を有する。製造・維持・品質管理費の上昇は一 般に、計測および試薬系の複雑さと関連する。さらに、生存する細胞集団の純度 は決して保証されない。

このマルチチャンネル法を行う装置の−っはＴｏａのＥ８０００■分析器である 。この装置は細胞分析用に４個のチャンネルを使用する。血小板、好酸球および 好塩基球は、別々のチャンネルで計数される。リンパ球、好中球および単球は（ 分散した血小板、好酸球および好塩基球と共に）、直流および交流電気インピー ダンスによる視覚化原理を利用する第四チャンネルで大雑把に分類し、計測され る。赤血球は、示差的溶解せず血小板とともに血小板チャンネルで処理される。

ヘモグロビンは、最大限の全溶血後に別のチャンネルで処理される。

Ｔｅｃｈｎ！ｃｏｎのＨ１血液分析器は、種々に調製した血液サンプルを処理す るためにたった２個の細胞変換器およびヘモグロビン計を使用するものであるが 、細胞アリコートはこれらの変換器で連続的に処理され、また１０種以上の異な る試薬を使用しなければならないため、少なくともＴｏ　ａ／Ｓｙｓｍｅｘ　Ｅ ８０００■と同じくらいに複雑である。

ＣＥＬＬ−ＤＹＮ■３０００．ＩＡもまた、そのような複雑な装置であるが、そ の改良型であるＣＥＬＬ−ＤＹＮ■３０００．２では、重要な新しい細胞分類情 報を得ることができる。

本発明は、従来のマルチチャンネル型の分類・計数法よりもかなり有益である。

本発明は、より単純な装置の使用が可能であり、全ての有核白血球サブ集団の有 効な多次元分類および計数に、たった１個のチャンネルとたった１種の溶血試薬 およびプロセスしか要しない。下記に述べるＣＥＬＬ−ＤＹＮ■３０００．２は 、全部でたった２個の変換器およびたった３種の簡単な試薬を使用して血小板、 赤血球、ヘモグロビンおよび全白血球サブ集団の処理を行う。

発明の要約 本発明方法は、その完全性を失っている不安定な希釈細胞集団の存在を、日常的 に形式的に認識することができる。また、本発明は、分類とともに、これらの細 胞集団の実際の計数およびより厳密な特徴付けが可能である。本発明方法によれ ば、細胞懸濁物の条件の調整後に、特定の細胞集団生存速度の信号が送られ、モ ニターされる。懸濁した全細胞集団は、短い時間（サンプル分析サイクルの細胞 計数期）に検査または追跡され、その間に細胞計数パルスが得られる。細胞は、 それらが実質的に無傷（場合によっては生存を意味する）のときに占める領域ま たは、ゴースト、むき出しの核もしくは死細胞として分解された状態のいずれか で検査される。任意の所与の単一細胞のこれらの状態間の変移は突然であり、飛 躍的である。なぜならば、２個の状態間の細胞の変移を感知する条件を整えるこ とは極めて困難であるからである。また、細胞は、両方の状態において独立して 、しかし同時にモニターすることができる。モニターされるいずれか、または全 ての細胞集団の変移速度（無傷の状態から分解した状態への変移速度）により、 有用な信号を出すことが可能であり、感度のよい同定および特徴付は情報が提供 され、正確な計数データが与えられる。

本発明方法の好ましい実施態様では、信号が送られ、モニターされる細胞集団の 反応は、無傷の細胞集団の崩壊速度または分解した、もしくはゴーストになった 細胞残余の発生速度のいずれかである。この反応情報を使用すると、細胞集団の 主要な細胞質破壊溶解がいつ生じたか、もしくは生じたかどうか、またはまだ生 じているかどうかを実証することができる。ついで、この情報を使用すると、あ る異常な細胞集団を同定し、分類し、特徴付けを行うことができる。確認される 細胞集団変移速度も、細胞懸濁物の処理・測定中に生じる細胞集団分解の程度を 正確に調べることにより、特定の細胞集団を正確に計数するのに役立つ。この分 解は、細胞集団の実際の計数前に装置内で始まる連続的な溶解プロセスにより生 じる。

本発明の特に好ましい実施態様は、全血サンプルおよび白血球の計数に適用され る。費用効果的な、溶血性の強い条件を使用して完全な溶血を保証し、それによ って白血球の計数に対して妨害となる赤血球の悪影響を排除する。この強い溶血 条件から生じる白血球溶解は、溶解に耐える細胞の数を経時的に調べてモニター することにより、同定・特徴付け・定量がなされる。

白血球溶解という事実を単に使用することにより、溶解感受性白血球の存在を見 知することができ、それによると、白血球計数の他の方法のほとんどでは、白血 球の全体および一部の正確な数を過少評価する傾向にある。白血球溶解の速度を 使用すると、意図しない白血球溶解により生じる分解した白血球の数が調整され る。

特に好ましい方法は、２個の前進方向および２個の直交する光散乱次元を利用し て有核白血球を検出・分類・計数することにより、有核白血球の５種類のサブ集 団を区別することができる流動血球測定装置において有利に行われる。効率的に 全溶血を行い、時間の次元を新しく使用すると、この同じ分析通路により、溶解 により生き残る哺乳類の核のない血小板を評価することもできる。

図１は、等張的に希釈した全血に対して、流体力学に焦点を置いた研究用血球分 析器により１９７３年に得られた一次元のインピーダンスデータのｌｏｇ−１ｏ ｇプロットである。Ｔに血小板、Ｅ−赤血球、Ｌ−リンパ球または小単核細胞、 Ｇ＝顆粒球または多形核細胞、およびＭ−単球または大単核球細胞。

図２は、図４の２個の別々に記録した細胞集団図に含まれる同じ情報の積分ｌｏ ｇ−１ｏｇ図である。

図３は、図５にも示すように溶解前および溶解後の赤血球の混合集団を生じさせ るために低張的に希釈した全血に対して１９７６年に得られた一次元のインピー ダンスデータのｌｏｇ＝１０ｇプロットである。

■ 図４は、ＣＥＬＬ−ＤＹＮ　３０００．ＣＥＬＬ−ＤＹＮ■１６００およびＣＥ ＬＬ−ＤＹＮ■１３００で使用される　ｔｏｎ８ｓｈ＋ｅｎ＋プレートインピー ダンス変換器により、希釈した全血に対して同時に得た血小板および赤血球集団 のデータの２（ＩＩの一次元（ヒストグラム）図を示す。この変換器は、前方焦 点ではなく、受動後方焦点のみを使用しているので、フィールド誤差によりゆが められた赤血球（ＥＦ　’）が生じる。これらの血小板および赤血球は分析前に は溶解されない。

図５は、図４で使用したインピーダンス変換器で同時に得られた遷移的な溶解後 および溶解前の赤血球集団データの２個の一次元図である。図５Ａは、溶解後の 赤血球ゴーストおよび本質的に影響を受けていない血小板を示す。図５Ｂは、溶 解前の球状赤血球を示す。これらのパターンは、全血を低張性食塩水中で希釈す ることにより到達した温和な溶血条件下で血液を分析して得たものである。

図６Ａおよび６Ｂは、正常なヒトの全血サンプルの有核白血球に対する一組の四 次元ＣＥ　Ｌ　Ｌ　−Ｄ　Ｙ　Ｎ■３０００．２データを表す同じ対の２次元投 影図を示す。図６Ｂは、これらの２次元投影図上に、有核白血球の無傷の５個の サブ集団が五次元で追跡される四次元領域を示そうと試みた図である。Ｌ＝リン パ球、Ｍ＝単球、Ｎｅ＝好中球、Ｅｏ＝好酸球、Ｂａ＝好塩基球、Ｒ＝残余、お よびＴ＝大きい血小板凝集体および、全白血球数またはＷＢＣの「閾値外」であ るｃｈ７ｂｏｍｉｃ目などの構造からの人工パルス。

図７は、ＣＥＬＬ−ＤＹＮ■３０００装置の光学変換器の感知ゾーンおよびフロ ーセル領域を図式的に示す断面図である。

図８は、ＣＥＬＬ−ＤＹＮ■３０００装置系の光学ベンチを図式的に示したもの である。

図９は、溶解耐性赤血球および溶解感受性白血球を含まない患者から採った全血 サンプルに対するＣＥＬＬ−ＤＹＮ■３０００．１により認められた白血球細胞 数対時間のアナログプロットである。ストリップチャートレコーダーの記録は、 本発明方法による計数速度モニターを示す。その図は、型にはまった計数期のみ を使用する１個の細胞分析サイクルおよび強制による再計数を使用する２個の細 胞分析サイクルを示す。

図１０は、慢性リンパ性白血病患者から採った単一の全血サンプルに対するＣＥ ＬＬ−ＤＹＮ■３０００．１により認められた白血球細胞数対時間の２個のアナ ログプロットである。第二分析での解像では、３分の１が回収された目に見える 細胞であり、３分の２が消滅した目に見えない細胞であった。

図１１は、ＣＥＬＬ−ＤＹＮ■３・０００．２に対して行ったサンプル処理サイ クルの計数期に対する計数対時間のｌｏｇのデジタルプロットを示す。図１１Ａ は、溶解しにくい新生児赤血球の４個の異なるサンプルを示す。

図１１Ｂは、種々の治療段階にある慢性リンパ性白血病患者から採った５個の血 液サンプルに対する計数対時間を示す。２個の計数期のみは、ＣＥ　Ｌ　Ｌ　− Ｄ　Ｙ　Ｎ■３０００操作の強制再計数モードに拡張した。

図１１０は、異常ヘモグロビン症の二人の成人患者に対する計数対時間を示す。

なお、縦軸は、解像度をより高くしである。

本明細書および請求の範囲にわたって多くの用語を使用するが、本発明の内容で は独自の意味またはわずかに異なる意味を有する可能性がある。従って、これら の用語をここで定義する。

全体にわたって使用する「細胞集団」は、同じ細胞型のクローン的に均一な集団 を意味する。血小板は、壊れやすいリンパ球およびモノクローン的に同一である とみなしうるリンパ球の集団（Ｔ細胞のサブセットなど）と同じように、前記定 義の意味において均一である。赤血球も、たとえ骨髄を離れてからの時間が１２ ０日間にわたり、従ってその時間に基づく相違があるとしても、クローン的には 均一である。

本発明の説明において、赤血球以外の血球集団は全て、白血球集団の広義のサブ 集団とする。なぜならば、血小板、リンパ球、単球、好中球、好酸球および好塩 基球は、細胞質構造がかなり類似しているからである。例えば、血液を遠心分離 すると、これらの細胞は全て、赤血球の上の白いバッフイーコート層に蓄積する （米国特許第３．９１４．９８５号参照）。同様に、図１のこれらの集団は全て 、図１の全赤血球を容易に破壊する低張性の類似溶解に対して耐性を示す傾向が ある。赤血球とは対照的な、全白血球のそのような表面的類似性にもかかわらず 、本発明の中心となる主義は、各々の均一細胞集団が各々独自の反応パターンを 有するということである。従って、たとえこの簡素化した命名法を使用しても、 基本は、これらの白血球サブ集団細胞系の各々が自律性の明確な集団として挙動 すると言うことである。白血球サブ集団が共有する特徴は、全体としてのそれら を、数の上で優勢な赤血球集団から区別する点にすぎない。

「サンプル溶液」は、液体のサンプルを意味する。この用語は、無傷の細胞また は溶解により生じた細胞の残骸を特定の方法で溶液に懸濁したり、血液または尿 などの生理学的サンプルを請求の範囲の方法を実施する前に希釈または前処理し なければならないことを意味するものではない。従って、サンプル溶液は、未希 釈体液（例えば、全血、***など）および希釈、保存、処理等を施した液体サン プルの両方をカバーするものである。また、種々の懸濁物および細胞培養（植物 細胞の懸濁物など）も含む。特定のサンプル溶液条件を必要とする方法の場合は 、本明細書の中でその条件を明確に説明する。

「動的溶解　（Ｋｉｎｅｔｉｃ　１Ｂｉｓ）Ｊは、本明細書では、ある細胞集団 の反応現象を特徴付けるために使用し、この場合、大部分の細胞溶解が、その集 団を含む種々の細胞群の中で、進行的速度で起こる。「動的溶解または崩壊」は 、細胞数の情報を得る間、計数速度が安定して一定であると伝統的に仮定されて いる同定領域において、無傷の細胞の消失または細胞の残骸の出現が経時的に連 続することを伝えるものである。

「サンプルの単位体積当たりの細胞数」は、本発明方法に従って得られる計数デ ータの種類を示すために使用する。計数手段は典型的には、検出器の観測場の信 号検知部を通過する細胞事象の検出可能な数の計数を行うことを充分理解すべき である。

この生データ情報はやがて分割され、単位時間当たり、分析される体積当たりの 細胞事象の計数を与える。通常利用される計数手段は、−細胞ずつ検出器の中を 流れるように、元のサンプル溶液の実質的な希釈を必要とすることが多いため、 生の計数情報は元のサンプル溶液の単位体積当たりに戻して相関させ、計数情報 を臨床的に価値のあるものする。従って、実際の計数データは、元のサンプル溶 液の単位体積当たりの細胞数を得るために、希釈度または試薬添加を考慮して処 理する。すなわち、本発明の範囲は、細胞を計数し、細胞を同定する方法を包含 し、その方法は、無傷の細胞に関する通常の安定な定量的情報に基づいた計数デ ータを利用するものである。

「細胞溶解」は、細胞を保持している条件がその細胞溶解閾値を超えるときに生 じる。その閾値は、細胞のマクロ環境およびミクロ環境の物理化学的関数である 。その結果、細胞溶解は、細胞を、細胞溶解閾値を超える細胞を生じる物理化学 的条件を特徴とする溶液または環境に故意にさらすと生じる。装置の細胞分析サ イクルの計数期に細胞集団の構成員が細胞溶解を受ける程度および細胞溶解が生 じる速度は、ある細胞型の存在の同定、ある細胞型における異常の存在、および 進行性の動的溶解を受けていることが認められる分析される細胞集団内での初期 の細胞数の正確な計数に対して有用な情報を提供する。

細胞溶解を招く純粋に物理化学的な条件が多く知られている。

溶液のイオン強度、ｐｌｌおよびコロイド侵透圧（ｏｓｍｏｌｉｃ　＊ｎｄｏａ ｃｏｌｉｃ　ｐ＋ｅｓ＋ｗ＋ｅ）が細胞保護を高めたり、細胞溶解を引き起こす 条件をつくり出すことは公知である。さらに、温度は、細胞溶解速度に対して強 い影響を有する。本明細書では、この細胞溶解の原因となる物理化学的条件に関 する伝統的理解を拡張して、自動計数装置に存在して不注意に細胞溶解を引き起 こす可能性のある溶液処理条件も含める。これらの条件には、装置の流体部分に 存在する一様に激しい混合または一定の撹乱またはせん断応力が含まれる（例え ば、米国特許第３．８７１，７７０号に記載）。さらに、特定の細胞型に対して 細胞溶解性を示す、細胞膜に損傷を与えたり細胞膜を変形したりする公知の溶解 剤がある（例えば、米国特許第４．９６２，０３８号、欧州特許出願第４４４． ２４１号）。

他の試薬および条件は、当業者には周知である。

細胞集団反応、細胞溶解および細胞計数は、本明細書では、従来の装置のこの問 題における一次的、すなわち細胞の直接的可視化の概念と明瞭に関係する。この 「細胞の直接的可視化」は、特定の信号（ｉｎｌｅ＋＋ｏｇｔ＋１ｏｎｌ　に対 する細胞集団の反応の間接的検出と対比することができる。この二次的な細胞検 出は、本発明を、関連する従来技術と明確に区別するものである。さらに、特定 の細胞懸濁物に対しである細胞計数法を選択する場合、間接的検出の細胞計数事 象は、直接測定可能な信号を生じる特定の条件下で生じる。例えば、電気インピ ーダンスによる細胞の測定では、所定の細胞懸濁物条件および電気信号条件を使 用して、細胞懸濁物中の特定の細胞の存在を示す測定可能な信号を得る。「観察 窓」は先に観察された反応に基づいて選択され、計数事象は通常、この窓内に導 かれる。

溶解性溶液条件および有効な電気信号を誘発する条件に対する細胞集団反応は、 以前は意図に反するもので（現在は制御し得る）、現在は、その溶液条件または 信号条件を変えることにより系統的に変えることができる。細胞の溶解反応が生 じると、細胞の残骸またはゴーストにより生じる潜在的な信号が初期の観察窓か ら移動する可能性があり、その結果、モニターされる集団が全く見えなくなり、 従って初期の観察窓には存在しなくなる。実際、無傷の細胞集団の反応は、溶解 を受けると一つの場所から消えるが、得られる細胞残骸、残余またはゴーストの 反応が全く離れた場所に現れる可能性がある。この方法では、課した条件に反応 した細胞集団の消失または崩壊の「視覚化」または測定の他に、他の観察窓にお ける細胞残余の出現を「視覚化」または測定することもできる。すなわち、所与 の領域でモニターした「崩壊」速度は、実際には正である可能性すらある。その ような正の崩壊速度を説明するある機構では、細胞残余の局所的な増加および離 れた所での無傷の細胞の数の減少を含む。別の機構では、細胞内の主要な変化（ 顆粒または内部ゾル膜成分のエネルギー変換ゲル膜への析出など）を含むととも に、以前には検出できなかった細胞が突然、可視細胞に変移することも含む。

本発明では、この相対的可視性における飛躍的変化の概念を、赤血球破壊テスト 中に動的溶解を受ける赤血球集団に関しての、容易に得られる一次元インピーダ ンスデータによって説明する。

提示された種々の考えを伝えるために、図１〜３ならびに図４および５の内容を 以下で詳しく説明する。図１〜３の両対数データは、流体力学に焦点を置いた研 究用血球分析器により１９７０年代に得られ、Ｃｌ１ｎｉｃｚｌ　Ｒｅ＋ｓＩ＋ ｅｈ、１９７４．２２　ｐｔｇｅ１２３＾に記載されている。図４および５のデ ータは、ＣＥＬＬ−ＤＹＮ■９００〜ＣＥ　Ｌ　Ｌ　−Ｄ　Ｙ　Ｎ■３０００の ＣＥＬＬ−ＤＹＮ■装置系で使用されている、赤血球／血小板インピーダンス変 換器の１種により得たものである。これらのインピーダンス変換器は、流体力学 上の前方焦点（ｔｒａｉｌ　Ｉｏｃｓ＋＋１ａｌ）を使用しておらず、臨床デー タの表示は線形である。しかし、他の点では、基本となる可視化現象は、１９７ ０年代の研究装置ならびに１９８０年代および１９９０年代の臨床用ＣＥＬＬ− ＤＹＮ■装置で特に差はない。　図１は、希釈された抗凝固全血におけるインピ ーダンス感知により可視化される全血球を示す。

図１の文字は、血小板（Ｔ）、赤血球（Ｅ）、リンパ球（Ｌ）、顆粒球（Ｇ：好 中球、好酸球および好塩基球）および単球（Ｍ）の頻度分布を表す。

慣例により、既知容積の球状ラテックス粒子を使用して、ＥＤＴＡで取り巻いた 血小板のインピーダンスの大きさのヒストグラムを検定する（図１および４Ａ） 。これらの粒子はまた、比較的硬い球状白血球のインピーダンスの大きさのヒス トグラムを検量化するためにも使用する（図１．Ｌ、ＧおよびＭ）。

こうして、これらの細胞のＬｘｌｅｔ　Ｅｑｔｉ■１ｅａｌ　ＥＩｅｃｌ＋ｉｔ 　Ｖｏ１ｗｍｅＩｌｔｏｌｉｌｅ＋ｓ　（Ｌ　Ｅ　Ｅ　Ｖ　ｆ　］　）において 横軸の検量が得られる（ｔｏｎ　ＢｅｈｒＩ１１＋、１９７５　Ｍｅｄｉｌｅ＋ ＩｎＩｎ１Ｊｉｃ＋ｏｌｂ＋ｏｍｂｏｃ７＋ｏｐｅｎ目Ｂｌｏｏｄ　４５＋１９ ９１．これらのＬＥＥＶ検量プロフィルは、図１の濃い影の部分である。

そのようなラテックス球は、赤血球のインピーダンスの大きさのヒストグラムを 大雑把に検量するためにも使用される。しかし、赤血球は非回転楕円形に、変形 しており、とりわけ先に挙げた物理化学的変数に対する赤血球の容積反応の影響 が大きいため、この大雑把なラテックス検定を臨床レベルに高めるには、複雑な 形状因子を使用しなければならない。この形状因子補正は、暗黙のうちに、形状 因子、収縮または膨潤因子および電場誤差項を含む。しかし、この形状因子は通 常、明確にコンビコータ計算されるわけではない。そのかわり、血液分析器では 、ＥＥＥＶ　ｆｌ、すなわち赤血球等価電気容積ｆ１（Ｅ＋！ｌｂ＋ｏｃ７１ｅ Ｅｑｍｉマ１１＋ｎｌ　Ｅｌｅｃｔ「ｉｃ　Ｖｏｌｕｍｅ　Ｉｅｗｌｏｌｉｌｅ ＋＋ｌ　で直接検量される。この正確な目盛りの確立については、下記のＣＥ　 Ｌ　ｉ−−、Ｄ　Ｙ　Ｎ■３０００装置系の血小板および赤血球集団パラメータ という見出しの箇所で説明する。

多くの血液分析器では、ＥＥＥＶ　ｆｌがＬＥＥＶ　ｆｌと約１．５倍異なる（ ｗｏｎ　Ｂｅｂ＋ｅｎ＋　１９７５前出）。このことは、図４Ｂおよび図１に見 られる血小板がＥＥＥＶ単位ならば、その大きさが容積にして１．５倍大きくな ることを意味する。この変化は、図４Ａおよび４Ｂのデータの両対数表示である 図２において明らかである。

図１の薄く影をつけた赤血球曲線は、下方の横軸が一般的な球容積を表し、上方 の横軸が一般的な球の直径を表すように、実際は、その元のパルス位置から１． ５倍だけ右に移動させた。

その結果、赤血球はＥＥＥＶで表わされている。

十分な有核白血球（すなわち、ＬＳＧおよびＭ）を得て、図１の２．５００個／ μｍのリンパ球および３．１００個／μｌの顆粒球の実際の分布を図示するため に、本発明者らは、６１０万個の赤血球および１８７．０００個の血小板を処理 しなければならなかった。この処理は、４６分を要した。

上記で強調したように、市販の血液分析器は「スピードの必要性」のため、図１ の両対数曲線のピークを大体の中心とする各々の窓で赤血球、血小板および有核 白血球を個々に処理する傾向にある。例えば、赤血球は図２および４Ｂに示すよ うに見ることができる。すでに述べたように、図２は実際は生のデータではなく 、図４Ａ（血小板；図２の濃い方の曲線）および図４Ｂ（赤血球；図２の薄い方 の曲線で、図４Ｂの数の上で少ない血小板も示す。）の生データを両対数表示し たものである。

図４はまた、臨床用ＣＥＬＬ−ＤＹＮ■３０００．１インピーダンス変換器にお いて得られた細胞データに対する２個の容積ヒストグラムを示す。図４Ａは血小 板を示し、図４Ｂは赤血球を示し、それらは、ルーチン計数サイクル中に計数し た。両方の図で垂直の点線は種々の細胞集団の計数境界（即ち観察に便利な窓） を表す。図４の２個のヒストグラムを対比すると、赤血球ヒストグラム（４Ｂ） の垂直の点線以下の領域は、少数の血小板を示す。血小板ヒストグラム（４Ａ） は、赤血球ヒストグラム（４Ｂ）の左側領域に示されるのと同じ血小板集団に関 する情報を報告するものである。しかし、図４Ａのデータは、かなり小さい観察 窓を表す。検量単位（すなわち、ＬＥＥＶ対ＥＥＥＶ）の相違の他に、図４の２ 個のヒストグラムは、それらの横軸の及び幅が大きく異なる。赤血球ヒストグラ ムの広い窓と対比して、血小板のヒストグラムの窓は約５倍狭い。

赤血球ピークの右側の肩（図２および４ＡのＥ、）は、装置に起因するもので、 フィールド誤差関数として知られる（マ０Ｏｔｌｓｈ＋ｅｎｓ　＋ｎｄ　Ｅｄｓ ｏｎｄ＋ｏｌＩ；　］、　ｌＩｉ＋１ｏｃｈｅａ、　ＣＣ７１ｏｃｈｅ　２４２ ４７−２５６１９７６１゜焦点の合っていないインピーダンス系に見られるこの 赤血球に生じた肩は、図１の希釈した全血に存在するリンパ球、顆粒球および単 球がたとえ高濃度であったとしても、これらの白血球をかなりおおい隠すであろ う。明らかに、図１の優位を占める赤血球集団が簡単に溶解される（その結果、 完全に消失して見えなくなる）ならば、両対数の図に示した数少ない血小板およ び実際にまれな有核白血球が、便利で費用効果的な迅速分析処理を受けやすくな る。

残留赤血球ゴーストが検知できない程度の全溶血を可能にする溶血剤（サポニン など）がある。しかし、直接的な細胞可視化および間接的な細胞検出という考え を発展させるためには、低張性溶液による血液希釈を使用して赤血球の観察でき る反応を変えることが好ましい。こうすると、赤血球の体積が膨張し、循環して いる元の両凹型の赤血球円板と同じ膜表面積を有する溶解前の球になる。低張性 がより強くなると、赤血球は突然、「消失する」か、図４Ｂのもとの窓において 電気的に「不可視」になるようにみえる。細胞の可視性が飛躍的に変化するのは 、膜が電流および赤血球細胞質を含むヘモグロビン分子の溶液に対して突然多孔 性になるからである。溶解前の赤血球は、突然、溶解後の赤血球ゴーストになる 。そのとき、電流は、実質的に細胞の周りよりも細胞の中を流れる。しかし、図 ５Ａおよび３に示すように、赤血球のゴーストまたは基質構造は信号を出す。

とはいっても、その電気的大きさは、伝統的な臨床上の赤血球の体積および計数 情報を得るために使用する標準的な観察条件下では、赤血球からの信号より何倍 も小さい。計数プロセス中、赤血球ゴーストの信号は、図５Ａおよび３に示すよ うに、血小板サイズの領域に現れる可能性がある。

溶解前の赤血球のヒストグラム（図５Ｂ）は、０〜３８４の範囲のｒｇａｔｅｄ 　ｏｕｔＪｆｌ（ＬＥＥＶ）のデータを示す。血小板の小さい集団は、図５Ｂの 垂直の点線の左側にあって、観察領域のｒｇａｔｅｄ　ｏｕｔＪである。図５Ａ では、この「血小板領域」が観察領域であり、高増幅、従って高分解能で目盛ら れている。この場合、赤血球ゴーストが優勢であることがわかる。図３のグラフ は、予期される血小板領域における細胞集団の性質の組み合わせを示す。図５Ａ の比例的縦座標では、血小板集団はほとんど無視される。図３の対数の縦座標で はそれが明らかである。しかし、本明細書で使用されるように、血小板は図５八 では明らかに目に見える。それらは変換器および回路によって認められ、示され た。他方、図５Ａの赤血球ゴーストは、図５Ｂでは不可視であった。細胞は位置 的に飛躍的な移動または変移を受けた。この優位を占める赤血球ゴーストの集団 は、赤血球に対する低張性条件の、じ解効果のために古典的な血小板領域に現れ 始めた。

実際、図１および３で使用したものと同じ装置により、赤血球の飛躍的な移動に もかかわらず、図３の細胞構造全体を同時に計数することができる。そのような 観察条件下では、本発明で開示する崩壊速度が０とかなり異なるときはいつも、 観察される異種集団全体の細胞の平均の大きさが連続的に減少することは当業者 には明らかである。飛躍的な溶解細胞分解の広いダイナミックレンジにわたって 特定の平均パルスの大きさをモニターすることは、間接的または二次的な細胞の 可視性変化の別の形に過ぎない。

この可視性の概念を、ここでは、規範的な一次元の環境から多次元の空間に拡張 する。

図６Ａは、全血サンプルの有核白血球の同じ四次元データを表す２個の異なる２ 次元投影を図示したものである。これらのデータは、ＣＥＬＬ−ＤＹＮ■３００ ０．２から得たものである。図６Ｂは、これらの同じ投影を、５つの領域の大雑 把な二次元表示を行うために書き入れた線と共に図示するものであり、無傷の有 核白血球のサブ集団は、それらの領域で、その装置の計数期の間、四次元空間的 に追跡される。領域りにはリンパ球が存在する。領域Ｎは好中球を含む。単球は 領域Ｍに存在する。

領域Ｅｏは好酸球を含む。好塩基球は領域Ｂａに存在する。大きい血小板は凝集 し、ｃｂ７１ｏｍｉＣ＋ｓは領域Ｔに現れる可能性があるが、溶解により生存す る血球構造の全体には含まれない。

領域Ｒは、このサンプルに対して無視できるデータが得られる場所として図６Ｂ ｌに表示される。これらの分析条件下では、有核白血球はこの領域で視覚化され ない。本発明で開示する方法によれば、白血球残余、ゴーストまたは核が通常は 認められない領域（例えば、領域Ｒなど）に出現することを使用して、課した条 件に対する特定の細胞集団の反応を測定することができる。一定の領域における 細胞残余、細胞ゴーストまたは細胞核の出現速度は、処理時間０、すなわち測定 可能な反応を得るための条件を課す前にサンプルに最初に存在する細胞の数を同 定・特徴付け・分類・計数するために使用することができるパラメータである。

本発明は、その最も広い概念において、他の細胞集団から独立した１個の細胞集 団における細胞または同じサンプル溶液に存在する不活性なモニター粒子を同定 ・計数する方法を提供する。本発明は、種々の細胞集団の生存特徴をモニターす ることにより、ある細胞集団内の細胞を同定・特徴付け・分類・計数することが できる。次いで、これらの特徴を使用することにより、測定可能な反応を引き出 すための条件をサンプルに課す前のサンプル溶液に元々存在する細胞集団に関す る定量および定性的情報を引き出すことができる。モニターされる細胞の生存反 応は、図５Ｂに示すような無傷の細胞の直接的な消失または図５Ａに示すような 細胞の構造、残骸、ゴーストもしくは残余の出現（すなわち、無傷の細胞の間接 的な消失）のいずれかであると考えられる。

本発明方法は、赤血球の壊れやすさの測定および特徴付けに有利に適用すること ができる。細胞溶解過程中、経時的に赤血球数をモニターすると、問題の赤血球 集団に関する定量および定性的情報が得られ、それは、診断およびそれに続く病 気の治療に有用であると考えられる。

本発明方法を使用して赤血球の壊れやすさを評価し、特徴付けることは、多段希 釈を使用して同じ結果を達成する従来の方法とはかなり異なる。例えば、米国特 許第４．０４０，７４２号および同第３．６０６，５３９号を参照。本発明方法 によれば、そのような測定を単一の浸透圧（ｌｏｎｉｃｉｌｌ）で行うことが可 能である。

本発明の別の実施態様では、サンプル溶液に存在する第一細胞集団があり、その 第一集団はいつでも作ることができて、特定の溶解剤の添加またはサンプル溶液 の物理化学条件を変えることによりその細胞型の細胞溶解閾値をかなり超えた場 合は全細胞溶解を迅速に示す。細胞溶解後は従って、この第一細胞集団は、この 型の無傷の細胞の領域での細胞の計数機構に対して確実に目に見えなくなる。同 じサンプル溶液に存在し、第一細胞集団よりも複雑であるか異なる細胞質構造を 有する第二細胞集団は、これらの条件下では、同様の非常に急速な全細胞溶解は 示さないが、進行性でゆっくりした（動的）溶解を示す。例えば、赤血球以外（ および同様の構造を有する細胞液胞以外）のほとんどの型の細胞は、広範囲にわ たる水和により膨張する傾向があり、余分の内在化した細胞膜が次第に外在化す る可能性があるため、これらのいわゆる「最小法　（ｍｉｎｉｓｗ＊　ｃ！ｔｅ ｓ）Ｊよりも溶解する傾向が小さい。この第二細胞集団が関係する時間枠におい てともかく溶解を示すという事実およびこの第二細胞集団の溶解が起こる割合は 共に、無傷の第二細胞集団細胞、細胞ゴーストまたはその両方を計数することに よりモニターされる。計数は、第一細胞集団の完全細胞溶解を生じるサンプル溶 液の物理化学的調整後に始まる最小限の少なくとも２回の異なる時間的間隔にお いて行う。

次いで、第二細胞集団の反応または崩壊速度をモニターして得られた情報番使用 して、第二細胞集団中の崩壊細胞の存在を特徴付け、影響を受けた細胞集団をさ らに特定して同定する。

この情報はまた、第一細胞集団を溶解するためのサンプル溶液の物理化学的調整 が起こった時点と分析サイクルの実際の計数期の始まりとの間に生じた不注意に よる第二細胞集団の溶解に対して補正することにより、第二細胞集団に最初に存 在する単位体積当たりの無傷の細胞数を正確に推定するために使用される。この 第二細胞集団の不注意による特定の溶解に対する一時的な補正により、第二細胞 集団の計数の正確性がかなり改善される。このことは、単に第二細胞集団の計数 情報の臨床上の価値を高めるだけではなく、第二細胞集団に関する、可能性の大 きいどんな重要な計数も実際に可能にすると考えられる。

別のＳ様では、本発明を、関連する進行性の飛躍的動的溶解を共に示す少なくと も２種類の集団を含むサンプル溶液に適用する。各集団の各細胞は、可視性にお いて突然大きな変化を受けるが、集団全体がほとんど即座に溶解するわけではな い。溶解は、サンプル溶液に残存する物理化学的条件の調整に応答して、異なる 溶解または崩壊速度で生じる。崩壊速度および／または細胞残余の発生速度をい わゆる多区分または集団特異的にモニターすると、すぐに適用される有用な情報 が得られる。

飛躍的集団が細胞である場合、この方法は、サンプル溶液の簡単な希釈により１ 種以北の細胞集団に好ましい細胞溶解条件を作ることができるので適用可能であ る。この方法はまた、自動計数システムに残存するサンプル処理条件により不意 に動的１曜的細胞溶解が生じる場合にも適用できる。この方法はまた、溶解剤を サンプル溶液に添加して１種以上の集団の進行性動的溶解を開始させる状況にお いても適用できる。各々の細胞集団の進行性動的溶解は、溶解開始後の種々の時 間間隔において全てのデータを得ることによりモニターする。溶解により生存す る細胞が細胞集団に特異的な数で発生すると、集団に特異的な崩壊パターンを利 用して特定の細胞集団のある性質を定量することができる。これらのパターンの 範囲は、崩壊速度０（または無視できるほど小さい）から非常に大きく、臨床的 にかなり重要な速度にまで及ぶ。そのような速度およびパターンは、ある疾患に 対しては特徴的ですらある。さらに、特定の細胞集団の計数のモニターデータを 使用すると、正しく分類し、サンプル溶液を調整して細胞溶解を開始する前のサ ンプル溶液に最初に存在した各細胞集団の細胞の数を正確に推定することができ る。

本発明方法は、骨髄、全血、血漿、脳を髄液、関節液、***および臓器細胞懸濁 物などの生理学的流体の示差的細胞分析に有利に適用することができる。また、 培地に懸濁した植物細胞培養、有核植物細胞構造との懸濁物における植物液胞お よび海洋中の有機体の濃縮物などの他の異種細胞懸濁物にも適用できる。本発明 は、溶解細胞集団の減少および数分以内の即時測定を用いるシステムにおいて有 用である。溶解により生存する腫瘍細胞のその後の成長形態において示差的細胞 集団反応を誘発するために溶解後に数時間のインキュベーションまたは培養を行 う方法は含むものではない。また、本発明は、存在するバクテリアを続いて培養 するために血球を微生物学的に溶解する方法を含むものではない。

赤血球−白血球系 好ましい態様では、本発明は、全血サンプルに存在する白血球サブ集団の分類、 特徴付けおよび計数に有利に適用できる。

上述したように、赤血球−白血球系はかなり研究されており、特に全溶血を使用 して白血球を処理する方法は周知である。

また、どの溶血性希釈剤も幾分かは白血球溶解性であり、特に溶血条件が強い場 合はそうである。そして結局は、一定の白血球集団の細胞が、あるとき、それら の特定の溶血閾値を超える。細胞計数システムが、予想される無傷の白血球の存 在を記録するために組み立てられる場合、均一な白血球サブ集団内の各崩壊細胞 は、その計数システムの通常の領域で見ることができない結果、失われる。これ らの白血球細胞は、溶解感度に関して示差的挙動または相違する成熟を示すので 、あるとき、それらの溶血閾値に達する。サブ集団の膜には、その集団を代表す る典型的または中位の細胞よりかなり感度が高いものもある。

他は感度がかなり小さい。これらの白血球集団の重要な特徴は、それらが溶解の 処理を受けると、どの特定集団も、延長された時間にわたって測定可能な無傷の 細胞の消失または細胞残骸の発生を連続して示し、この連続した崩壊または発生 プロセスを、用いた特定の細胞溶解条件下で、この特定の集団に対して特徴付け る重要な特定の速度情報として提示するために使用できることである。この特定 の速度情報は、最初に存在した無傷の細胞集団を正確に計数し、分類するために 使用することができる。

また、この特定の速度情報は、病気の分類、従って患者の治療および患者の継続 管理において臨床上重要である細胞集団の、先に測定できなかった性質を特徴付 けるために有用となる。

例えば、多くの壊れやすい細胞を有するサブ集団の細胞を含むと言われるサンプ ルでは、壊れやすい細胞とともにその細胞集団全体を含む種々のコホート（ｅｏ ｈｏ目Ｓ）のこの連続した動的示差挙動が保存される。言い換えると、そのサブ 集団全体は、顕微鏡下で認識される明らかに壊れやすい細胞だけでなく、変化し た特定の挙動パターンを有する。これらの壊れやすい細胞は氷山の一角のようで ある。氷山は、「常に目に触れる以上のもの」がある。同様に、感受性のあるサ ブ集団の不規則性または認識される不均一性に対して均一性も存在する。

この均一性ものは、長年、本発明者の一人が研究してきた血球集団均一性と類似 する（例えば、Ｈｏｍｅｇｔｉｅａｕｔ　１１ｅｌｅ＋ｏｌｅ＋＋ｅｉ１７ａｔ 　Ｐｌｓｌｅｌｅｌ　Ｐｏｐｗｌｓｌ＋ｏｇｓ、Ｗ、ε、ｗｏｗ　Ｂｅｋｒｅ■ １Ｐｒｏｃ、　＾１ｃ。

Ｓｏｃ、　Ｍｅｄ　Ｒｅｓ　２３３９．　１９７０）　、しかし、本発明ではそ れを、信頼性のある細胞計数の困難なプロセス中の、生か死か、−か八かの動的 飛躍現象として初めて利用するものである。影響を受りるサブ集団細胞クローン はどのコホートも、溶解耐性もしくは影響を受けない細胞クローンまたは典型的 な白血球由来の対応するコホートよりも溶解に対する感受性が大きい。これは、 クローナル集団の単一の均一崩壊速度パラメータの物理的解釈である。従って、 これらの全血サンプルの完全溶血が行われ得る一方で、分析器によって白血球数 が得られる信号の発生期中に壊れやすい白血球サブ集団が進行性の動的溶解を受 ける可能性がある。（暖かい赤道の水での氷山の消失に要する時間は、目に見え る頂上の大きさに単に比例する。この消失時間は、最初の頂」二を溶融するのに 要する時間よりはるかに長い。）分類可能な均一集団の進行性溶解の間の２個以 上の時点で集団細胞の計数データを取ると、集団の崩壊または細胞残骸の発生の 数学的表示が得られる。

一方では、この数式化またはパラメータ表示を使用して、溶解が始まる前のサン プルに最初に存在するサブ集団全体の数を正確に推定することができる。これは 、崩壊速度（または発生速度）を分析プロセスの時間０に外挿することにより行 う。この時間０は、溶血を開始するためにサンプル溶液に溶血剤を添加した瞬間 、またはそのサンプル溶液の物理化学的条件の調整を行った瞬間として定義し、 知られている。他方では、このパラメータ表示により、細胞分類および病気の診 断の両方において有用な新規情報が得られる。

本発明を表す、細胞のサブ集団またはクローンが均一に挙動することは、一般的 な生物学的原理の認めるところではなく、むしろ、信頼できる細胞計数に関する 実験室での日常的研究の際に、飛躍的な時間的に相違する生存溶解の関係におい て利用されるものである。

本発明によれば、細胞の溶解または崩壊速度は、細胞の純粋または不均一な懸濁 物に含まれる個々の細胞（氷山の頂上または雪片）よりもむしろ細胞の集団全体 （氷山全体）に起因するものであり、それに対して計算される。これは、同一の 均一なりローナル集団内の細胞同士の構造的類似性が高いために可能である。無 数の研究から、この構造的類似性は、そのような集団の細胞同士の飛躍的溶解反 応が実験的に測定された機能的類似轢に反映されると結論づけられる。本発明方 法に従って分析される、少数の壊れやすい細胞を示す細胞集団（例えば、慢性リ ンパ性白血病患者のリンパ球集団）を含むサンプルは、「悪性の」血液皮膜に認 められる少数の壊れやすい細胞ではなく、細胞集団全体が、変化した挙動パター ンを示す。本発明者らは、血液サンプルのどのサブ集団のどの細胞も、ｉｎ　ｖ ｉｔｒ。

血液保存中に同様に影響を受けて悪性血液皮膜を生じるが、保存血液サンプル内 の種々の血球サブ集団が損傷を受ける速度には相違があることを知っている。ま た、新しい血液サンプルにおいて、血液皮膜に少数の「ストレスにより誘発され る」壊れやすい細胞を示すクローナル細胞集団のどの細胞も、血液皮膜調製物の せん断応力下で壊れやすい細胞を示さない、影響を受＋ｊない白血球集団（例え ば好塩基球または好酸球）の対応する細胞に比べて溶解に対する感受性が大きい ことを知っている。

もちろん、白血球分化の初期段階では、クローン異常もある。

従って、全血球の幹細胞レベルでの突然変異は、ちょうど、不十分な抗凝固法お よび不利な血液保存条件が多くのサブ集団に同時に影響を及ぼすように、いくつ かの血球集団の溶解特性に同時に影響を及ぼすことができる。

本発明は、多くの異なる細胞系および多くの異なる細胞検出系に有利に適用され る。本発明は、細胞を希釈する公知の細胞分類法のほとんどを使用して行うこと ができる。この方法はまた、均一で特異的なりローン細胞の崩壊または発生速度 の測定および使用にに依存しているため、新しく開発される細胞分類法にも将来 適用できる。これらの速度を得る操作は、細胞型および細胞計数法に依存しない 。本発明は、細胞集団を同定、特徴付け、分類および計数するための細胞の大き さの測定値として電気インピーダンスを使用するもの（例えば、Ｃｏｗｌｌｅ＋ 　Ｓ　ＰＩａｓ　ＩＶ　Ｂｌｏｏｄ　Ｃｅ１ｌ＾ｎｅｔｈｅｒおよびＣＥＬＬ− ＤＹＮｏ１６００　Ｂｌｏｏｄ　Ｃｅ１１＾ｎ＊ｌｙ＋＋＋のインピーダンスお よび光学変換器モジュール）などの自動細胞計数装置において行うことができる 。

例えば、本発明は、細胞集団の分類・計数を行うために選択的蛍光染色法または 標識および光散乱または吸収現象などの光学的流動血球測定法を用いる装置にお いて行うことができる（５ｉｏｓｅｔＢ、　３；　６Ｂ−７４，１９９２；　Ｂ ｅｃｌｏｎ−Ｄｉｃｋｉｏｓｏ＠ＦＡＣ３ＣＩＩＩｓｎｄ　ｒＡｃｓｏ＋Ｉ　＋ ７ｓｌｅｍｌｅｄ　Ｕｌ＋ｏｌｌ　Ｃｈ、Ｌ−０１Ｎ■３０ｎおよび４０００シ リーズの装置）。この装置の列挙は、本発明方法による細胞の同定、特徴付け、 分類および計数のために使用できる方法を例示するためのものであって、これら に限定されるものではない。光学、電気抵抗、電気容量、超音波および他の多く の細胞を感知するための原理は、同時または逐次的に全てを結合させて、流体の 各要素の、信号を発生する細胞または細胞様構造の有無（出現または消失）につ いて質疑応答することができる。これらの構造は、無傷の細胞、凝縮細胞、種々 の分解段階にある死細飽、溶解プロセス開始後に放出される細胞成分、有核細胞 残骸、核を含まない細胞残余または古典的な細胞ゴーストおよび、特に植物の場 合は細胞の液胞が考えられる。それらは、粒状の、妨害する構造または関与する 構造であってもよく、それらは、別の観察窓に見えたり、見えなくなったりする 。

記載したこれらの計数システムは、本発明の詳細な説明するための便利な手段と して役立つに過ぎない。ある方法によれば、少なくとも２個の集団を含むサンプ ル溶液を計数装置にかける。

次いで、ある試薬を添加して一方（第二）の細胞集団の完全細胞溶解を誘発し、 別の（第一）細胞集団の細胞の同定、分類および計数を行う。第一細胞集団の崩 壊パターンの測定では、通常、溶解誘導試薬をサンプル溶液に添加する時を、細 胞処理サイクルの時間０として措定すると都合がよい。ある公知の計数装置では 、希釈し、溶解したサンプル溶液を、本質的には一細胞ずつ検出部に流し、第一 細胞集団の細胞の細胞型および細胞数に関連した信号を測定する。

しかし、溶解誘導試薬を最初にサンプル溶液に添加した後、即座に、希釈し、溶 解したサンプルが信号検出部を流れ始めるわけではない。理想的には、第二細胞 集団の溶解を完全にすべきであるが、希釈し、溶解したサンプル溶液が検出部を 流れ始めるまでに第一細胞集団の崩壊がいくらか不注意に始まってもよい。伝統 的に、正確に知りたいことは、第一細胞集団（白血球）の数値による細胞濃度で ある。このために、目に見える各々の細胞集団の挙動を経時的に観察し、計算す る。第二集団の無傷の細胞および目に見える可能性のある残骸は、第一細胞集団 の数値による推定濃度の正確さを保証するために必要な情報以上に発見的な情報 を提供する可能性がある。

一定流量条件を血球計数器または分析器に設けると、信号検出器が目に見える細 胞構造によって生じる信号を捕獲する。これらの信号は経過処理時間信号を含み 、検出部を通過する各々の細胞構造（または結果としての細胞群）を独自に同定 する。

この信号発生および検出期は、計数器開始後のある時間にわたって継続する。検 出部を連続して定常流量で流れる希釈サンプルの信号発生・検出期の間、サンプ ルの単位体積当たりの計数データが、２回以上の間隔を置いた計数期中に視野内 にある全細胞構造に関して集められる。特定の時間間隔の間、自動装置は発生し た全信号を使用して、検出部を流れる目に見える全細胞様構造物に関する計数情 報を保存し、提供する。これらは、別々の体積の希釈サンプルに存在する第一ま たは第二細胞集団のいずれかに属する。サンプル分析サイクル（図９および１０ ）の計数期のＡ部分の間、各細胞集団の生の計数データを使用すると、単位平均 時間Ａ当たり、単位体積当たりの細胞数が得られる。次に、計数期の後の平均時 間Ｂに検出部を通過する希釈サンプルの第二の別の体積の分析に基づいて、単位 体積当たりの細胞数がその装置から得られる（図９および１０）。この計数操作 は、サンプル溶液が検出部を通過するにつれて、計数期の間、短い時間間隔で繰 り返してもよい（図１１）。サンプル希釈度および他の試薬の添加に関する生デ ータに対して調整をする。

次いで、平均時間ＡおよびＢ（および所望により、その後の時間）に得られた細 胞計数値を使用して、観察データの点を通る曲線を作り、その曲線を細胞分析サ イクルの時間０に延ばすことにより細胞崩壊速度を計算する。細胞崩壊速度を得 るには、確かに、平均時間ＡおよびＢでの計数より多くのデータポイントを使用 することが考えられる。２個の点および単一の崩壊細胞集団は、有用な曲線あて はめ法の最少条件を表したに過ぎない。速度関数は、サンプル溶液に最初に存在 する細胞集団の正確な計数値を得るために、サンプル分析サイクルの時間０に外 挿される。所望の細胞の不注意による溶解または妨害する細胞の不完全な溶解の ために崩壊速度が重要（正または負）であるときはいつも、試薬添加により不正 確になる細胞計数値をこの外挿により補正する。この補正は、無傷の細胞に対し ては意味のある（０でない）負の崩壊速度を利用することができ、分解した細胞 、細胞ゴーストまたは残余などの細胞構造の出現に対しては、意味のある（０で ない）正の発生速度を利用することができる。関与する最初の細胞に対する崩壊 速度の概念は、これらの変移速度−出現および消失−の両方を含むものである。

細胞の型および数の指標として種々・の細胞感知原理（光散乱データなど）を使 用する従来の流動血球測定装置には、改良して検出部を通過する各細胞のデータ のリストに時間要素を加えることができることがわかった。次いで、この「時間 タグ（ｔｉｍｅ　ｔａｇ）Ｊを使用して、細胞処理サイクルの時間０に不安定集 団に存在する細胞の数の計算を可能にする細胞崩壌速度を計算する。

しかし、そのようなデジタルデータ処理は本発明の実施に必須ではない。図９お よび１０に示すように、作動している標準流動血球測定器の適切な細胞溶解モー ド下では、適切に調製したサンプルに関する連続的な２個の計数により、本発明 の実施に必要な最小の情報が得られる。以前、図１０の第一分析によって示され る「不安定な」計数条件は、ぜひとも避けなければならなかったが、これは不可 能であることが多かった。現在は、そのような非常に恒常的な不安定性を、図１ ０の第二分析で示すように系統的に利用することができる。

全血サンプルに存在する白血球細胞集団の同定、特徴付け、分類および計数に関 して、本発明の好ましい態様を記載する。

この細胞系はかなり研究されており、本発明は、既存の血球計算システムに重要 な強化を与えるものである。これらの強化は、計数データの正確さを改善するこ とによりこれらのシステムの能力を伸ばすものである。本発明はさらに、細胞崩 壊および／または細胞崩壊速度の利用に基づいて、ある異常な細胞型または条件 の同定を可能にする。

非常に高価な方法に頼ることなく、赤血球の存在下で白血球集団を計数するため には、第一に、図１で優位を占める多数の赤血球を溶解することが必要である。

これは、比較的単純で、費用効果のある検出原理を利用してあまり多くない白血 球集団の可視化を可能にするために行う。しかし、赤血球をより溶解耐性にする 条件が存在する。上記ですでに述べたように、赤血球は、ヒト胎児、ヒト新生児 、ヒト以外のある種の哺乳類、ヘモグロビン障害患者および高血漿蛋白濃度の患 者から採った血液サンプル中では溶解がさらに困難である。赤血球の溶解耐性は 、未溶解赤血球がセンサーを浸す傾向にあるため、不十分な溶血は不十分な白血 球計数情報をもたらす傾向にあるというジレンマを生じる。他方、完全な溶血を 行うためにより強い溶血剤を使用しても、不注意な白血球溶解により、白血球計 数の正確さには逆効果となる。

本発明の一態様によれば、たとえ以前はこれらの溶解しにくい赤血球のためにか なり困難であった、列挙した状況においても、完全溶血のために強い溶血剤を使 用する。強い溶血条件による白血球集団に対する悪影響は、計算される白血球崩 壊速度またはパターンの使用により補正する。これは、個々の白血球集団基準に 関して外挿することにより、細胞分析サイクルの時間０での白血球計数値が正確 に推定される（図１０）。

別の態様によれば、本発明方法を使用して、全血サンプルに存在するいわゆる壊 れやすいリンパ球の存在を検出する（正確に計数する）。リンパ球は、慢性リン パ性白血病、感染性単核球症および他の２．３の障害に苦しむ患者では、溶解に 敏感であることが知られている。この溶解感受性は、赤血球の細胞溶解閾値を超 えるのに必要な条件下でかなりの数のリンパ球が溶解することを含む。これは、 このクローナルな溶解感受性を完全に妨害するという無益な試みにおいて、細胞 を歪めて固定し、安定化させるための苦心して作った高価なシステムを使用する ときでさえ生じる。

この態様の実施においては、溶解耐性の赤血球を克服するための強い溶血剤はや はり使用するが、リンパ球数は経時的に密接にモニターする。リンパ球の計数は 、溶血剤を添加した後、サンプルを検出部に流しながら、選択した時間間隔で行 う。これらのリンパ球計数値は次いで、時間の関数として解析し、サンプル溶液 に存在するリンパ球の数において測定可能な分解がａるかどうかを調べる。次い で、崩壊速度の少なくとも１個の閾値を溶解感受性リンパ球の存在の指標として 確立する。この情報は、切り取って、サンプルを採取した患者の病状の診断の助 けとするため使用することができる。そのようなスクリーニング情報は極めて価 値があると考えられる。また、その情報は、疾病の治療の有効性をモニターする ためにも使用することができる。既知疾病を新たに可能となるサブカテゴリーの 間で区別するために使用することすらできる。

この態様では、所望により、異なる時間間隔から得たりｃｕｒｖｅ　ｆ’ｉｔｔ ｉｎｇ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）によりリンパ球崩壊速度を得ることができる。

これは、計数速度パターンを崩壊速度情報によって時°間０に外挿することによ り正確なリンパ球数の推定を可能にする。次いで、サンプル溶液に最初に存在す る全リンパ球集団の正確な推定も可能である。

また、完全な溶血は、濾過した海水および蒸留水を、はぼ等張性の海水１体積に 対して極めて低張性の蒸留水が４体積を超える割合で混合することにより得るこ ともできる。その結果得られる溶血性が強くて非常に低張性の希釈剤は、低コス トで世界的に利用可能であることから、白血球集団を確実に計数するのに有利で ある。しかし、この理想の溶血剤は、そのかわりに白血球溶解性も有するので、 今日まで全く受入れられなかった。

この白血球溶解活性は、現在ではモニターすることができ、最終の白血球数の最 終合計および小計において説明することかで本発明の好ましい態様では、Ａｂｂ ｏｔｔ　ＣＥＬＬ−ＤＹＮ■３０００が、通常は循環しない別の細胞型の認識フ ラッグを出すことにより通常の５個の白血球サブ集団の区別を行う（ＮＣＣＬＳ 　Ｈ２Ｏ−Ａ）。本明細書に開示した第５番目の時間的次元を追加する前は、Ｃ ＥＬＬ−ＤＹＮ■３０００の白血球示差データが、染色されていない白血球の４ 次元光散乱特性のみに基づくものだった。これ以前の方法は、本出願人による同 時継続中の米国特許出願束０７／３５２，１０６号（１９８９年５月１５日出願 ；発明の名称：流動血球測定の溶解剤および５種類の白血球の示差計数を可能に する方法）に記載されている。この特許出願の関連部分は、参考として本明細書 に組み入れる。

ＣＥＬＬ−ＤＹＮ　３０００では、サンプル処理が１５０〜３５０μｌの全血の 吸引（サンプリングモードに依存する）で始まる。吸引は、開管または閉管のサ ンプラーにより行われ、使用する装置の型に応じて手動または自動サンプル供給 を使用する。吸引されたサンプルはせん断バルブに入り、正確な３個のアリコー トが取り出される。３２μｌのアリコートの血液は溶血剤で２５０倍に希釈され 、全白血球数（ＷＢＣ）の測定および白血球の区別のために光学変換器に送られ る。１２μｍのアリコートの血液はヘモグロビン試薬で２５０倍に希釈され、ヘ モグロビン計として公知の分光光度計であるヘモグロビン変換器に送られる。０ ．８μｍのアリコートの血液は、はぼ正常緊張状態（ｎｏｒｍｏｔｏｎｉｃ）の 血液希釈剤で１２．５００倍に希釈され、血小板および赤血球のパルスデータの 発生のためにインピーダンス変換器に送られる。

ＷＢＣおよび白血球分析 ＣＥＬＬ−ＤＹＮ■３０００は、光学変換器を使用して白血球の光散乱特性を測 定するものである。変換器の流動セル１０を図７に図示する。赤血球が名目上は 溶解している血液の懸濁物が低速でサンプルノズル１２から噴出される。ノズル では、該懸濁物が、移動速度の速い層流の被覆流１４と接触する。流体力学焦点 法（ｆｏｃｕｓｓｉｎｇ）として知られる方法では、サンプル流が中央コア１６ まで細くなる。溶融シリカ流動セルでは、このコアの直径が２５〜３０μｍであ る。通常は、この装置により、一定時間にレーザービーム＃の感知領域に存在す るのは単一の白血球のみである。従って、同麟共在の問題は最小になる。もし、 赤血球が効率的に溶解されていなかったならば、典型的には、妨害する１００以 上の赤血球がこの感知ゾーンに存在したであろう。さらに、流動チャンネル１８ は物理的口径が大きい（２５０μｍ２）ので、恐らく詰まることはない。

それにもかかわらず、インピーダンス変換器で使用されるもつと小さい口径の分 解能を得ることができる。

図８は、ＣＥ　Ｌ　Ｌ　−Ｄ　Ｙ　Ｎ■３０００光学ベンチの図を示す。

本出願人の米国特許第５，０１７，４９７号（「粒子の弁別器および方法」）の 明細書を参考として本明細書に組み入れる。

光源２０は、偏光した５ｍＷのヘリウム−ネオンレーザ−であり、波長は６３２ ．８ｎｍである。レーザーヘッドは、偏光面が垂直になる方向に向いている。レ ーザービームの向きおよび焦点は、前方表面鏡２２、円柱レンズ２４、別の前方 表面鏡２６、垂直レンズ２８およびレンズ３０により決定される。この方向決定 により、サンプル流の中央コア３２の領域におけるビームの強さは、必ず、ｒｏ ｎｅ　ｏｖｅｒ　ｅｓｑｕａｒｅｄＪ直径が約７０μｍのガウス分布になる。水 平面では、エネルギープロフィルが、平らな上部の幅が約８０μｍである「シル クハツト」状を示す。この配列により、サンプルコアが正常な位置かられずかに 逸れたとしても、信頼できるデータが装置から得られるようになっている。

焦点に集ままたレーザービームが溶解により生存する白血球に当たると、全ての 方向に光が散乱する。光の波長は細胞の大きさに比べて小さいので、この散乱現 象はＭ　ｉ　ｅ理論およＭｉｌｌｅｒマトリックスにより説明される。散乱光の 一部は４個の光検出器により集められる。２個のシリコン光ダイオード３４およ び３６は、レーザービームの軸に関して約１〜３度および約３〜１０度の半分の 角度で散乱する光を測定する。これらの光ダイオード３４および３６は、各々「 ０度」および「１０度」の検出器と言う。直接のレーザー光は遮蔽バー３８によ ってブロックされる。これらの小さい角度での光散乱は、細胞の大きさに支配さ れる複雑な作用であり、細胞構造または細胞の複雑さがい（らか寄与している。

レーザービームの軸に対して９０度で散乱する光は、２個の先乗算器（ＰＭＴ） ４０および４２を使用して集められる。光ダイオードでない先乗算器は、大きい 角度で散乱する光が比較的少ないので、９０度のチャンネルで使用される。衝突 する偏光が単一表面から反射するだけであるならば、その最初の偏光垂直平面は 保持される。しかし、例えば多くの顆粒または異方性構造によって、１個のセル 内で何回も反射されると、散乱光は偏光角を変えることができる。この現象をＣ ＥＬＬ−ＤＹＮ■３０００で利用するために、一方のＰＭＴ４２の前に水平偏光 器４１を設ける。この偏光器は、垂直に偏光された光が先乗算器に当たるのを防 ぐ。従って、「９０度の偏光の偏りをなくすＪＰＭＴ４２によって検出される光 は、細胞構造（通常は白血球）との相互作用により「脱偏光コされた光である。

第二の先乗算器４０（ｒ９０度全Ｃ９０ｄｅｇｒｅｅｔｏｔａｌ）ＪＰＴＭとい う）は、４５度に置いたカバーガラス４３に対して反射された散乱光を受け入れ る。この直交する光の大部分は、まだ垂直に偏光されている。従って、このセン サー４０は、直交方向に散乱した完全部の良好なモニターとなる。

直交散乱チャンネルは、対物レンズ４４および散乱ストップ４６により完全なも のになる。角度の小さい散乱チャンネルは穴のあいた鏡４８も含む。

４個の光センサーから得られるデータを使用して、四次元の散乱図（図６）を作 ることができる。これは、三次元の「固体」表現を空間で回転させることができ るその装置のコンピュータグラフィックを使用して見ることができ、第４の次元 は、その第４の次元で異なるパルスの大きさを表す画素に対する種々の色の選択 により表現される。証拠として紙面にのこすために、四次元の散乱図は、二次元 の散乱プロットまたは投影の対を使用者が６個選択して、また、−次元のヒスト グラム投影を使用者が多数選択して確かめることができる。四次元の散乱図の２ 個の二次元表現を図６Ａおよび図６Ｂに二重に示す。−次元ヒストグラムは、図 ４および５に示すフォーマットと類似する。

白血球の計数および白血球のサブ集団への分類（またはＷＢ　Ｃ）に使用される 溶解剤は、白血球を急速かつ完全に溶解するように調製するのが最良である。Ｃ ＢＬＬ−ＤＹＮ■３０００は、芳香族オキシエタノール、有機緩衝液（ｐ　Ｈが ８．５またはその付近であり、ｐＨ緩衝能を付与し、溶解剤の電導性を増加させ る働きがある。）および非イオン性洗剤成分の水溶液から成る溶解剤を使用する ことができる。使用される芳香族オキシエタノールは、好ましくは、２−フェノ キシエタノールである。有機緩衝液は、トリス／ＨＣＩ、ホウ酸、グリシル／グ リシンおよびビシン（Ｂ　ｒ　ＣＥＮＥ）から成る群から選択される。非イオン 性洗剤は、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１１４およびポリオ キシエチレンまたはサツカライド誘導洗剤から成る群から選択される。本発明が 導入される前の好ましい溶解剤は、本質的に２０〜８０ｍＭの濃度の２＝フエノ キンエタノール、トリス／ＨＣＩ緩衝液およびＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００で構成 されていた。

本発明を利用するための特に好ましい態様では、溶解剤が、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ− １００の水溶液、２−フェノキシエタノールおよびトリス／　Ｉ−Ｉ　ＣＩ緩衝 液を含む。全血を過剰（典型的には５０倍）のこの溶解剤と混合する。赤血球の 飛躍的動的溶解は、浸透圧性の衝撃、非イオン性洗剤の作用および約８．５のｐ 　１１の組み合わせにより極めて急速に起こる。溶解剤の最適組成物は以下の通 りである。

２−フェノキシエタノール（２５℃で液体）　７５０ｍ１トリス／ＨＣＩ緩衝液 、ｐＨ８，５（５００ｍＭトリス）ＩＭのＨＣＩでｐＨ８，５に滴定　１５００ ｍ１０．５％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉ　ｔｏｎ　Ｘ−１００水溶液００ｍ１ 脱イオン水　１００Ｉになる量 最適の組成物において、２−フェノキシエタノールは約４１ｍＭの濃度で存在す るが、有用な濃度範囲は２０〜８０ｍＭである。トリス緩衝液のｐ　Ｈは、その 性能に重要な影響がないならばｐＨ８，１まで下げることができる。その緩衝液 のｐＨが９．０以上に大きくなると、試薬は溶血性がより大きくなり、より急速 な飛躍的動的溶血が生じる。痕跡量（約５％ｖ　／　ｖまでのＴｒｉｔｏｎ　Ｘ −１００）または同様の非イオン性洗剤があると、典型的には溶解しにくいとみ なされている検体における溶血が完全なものになるが、この存在は、飛躍的動的 溶血の促進もする。本発明以前は、これが、壊れやすい白血球を有する血液サン プルおよび溶解感受性細胞を有する血液サンプルにおけるジレンマであった。血 液は４〜６時間以上、１ｎｖｉｔｒｏ保存するからである。

トリス／ＨＣＩの代わりに他の有機緩衝液を使用してもよい。

これらのうち、ｐＨが８．５またはその付近のものは、ホウ酸、グリシルグリシ ンおよびビシン（ＣｒｌＢｉｏｃｂｅｍ製）があり、これらを溶解剤に使用して もよい。Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１１４１４溶解剤の非イオン性洗剤成分として使用 できる。他の親水性洗剤は、ポリオキシエチレンまたはサブカライドヘッド基を 有するものから選択することができる。

白血球の５種類の示差は、時間および光散乱に基づいてのみめられる。細胞化学 染色は必要ないので、ＣＥＬＬ−ＤＹＮ＠３０００．２は、費用効果の非常に高 い、迅速なＣＢＣをＷＢＣ示差とともに提供する。スルーブツト（ｔｈｒｏｕｇ ｌｐｕｔ）は、サンプルの処理法に応じて、１時間につき約１００の血液サンプ ルである。各白血球の散乱特性によって得られるデータは、先に説明した４個の 光検出器から得られる。

図９は、ＣＥＬＬ−ＤＹＮ■３０００．１と連結したストリップチャートレコー ダで記録した計数速度を示す。そのデータは、３つの異なる全血サンプルを表す 。それらのサンプルの全赤血球は、サンプル分析サイクルの計数期の開始までに 急速な溶解による崩壊が完了している。白血球サブ集団はどれも、不注意による 重要な崩壊を示さない。なぜならば、サンプル分析サイクルの型にはまった典型 的な計数期の間、溶解生存細胞数の経時的減少が実質的にないからである。この 計数速度の安定性を強調するために、図９のサンプル２および３に対するサンプ ル分析サイクルの間、分析器を強制的に再計数モードにした。

この再計数能は、１慮は、サンプルのＷＢＣ濃度が非常に低いときの自動発生に 対して備えである拡張計数モードである。１５秒の日常的再計数時間の間、縦軸 上で相対頻度として、また全血数として示される白血球数において明らかな崩壊 はない。

ストリップチャート計数速度で明らかな少数の異常は、ポアソン型の確率的ラン ダムさに基づいて予想される。

図１０は、慢性リンパ性白血病であることがわかっている患者による対照的なス トリップチャート結果を示す。図９および１０に示すデータは、溶血性希釈剤（ 上述）を使用して得た。

その希釈剤は、最も溶解耐性のある赤血球さえも充分に溶解することができるよ うに選択した。図１０は、各サンプル分析サイクル中の日常的計数および強制に よる再計数を示す。さらに、２個の該分析サイクルをそのサンプルに対して行う 。再分析中の一致するパターンから明らかな白血球数の減少は、不均一または混 合した白血球集団内に少なくとも一種類の溶解感受性を有するサブ集団が存在す ることを示す。壊れやすい均一なリンパ球集団は、溶解過程にある。図１０の第 二追跡に加えた点線は、白血球の崩壊パターンまたは白血球の計数速度のサンプ ル分析サイクル時間０への外挿を表す。２個の外挿により、最初の白血球数が３ ０２，０００および３０１．ｏｏｏ細胞／μｍ全血となった。これらの数字は、 骨の折れる手動法により正しいことが確認された。

図６．９および１０を利用すると、この全血サンプル中の壊れやすいリンパ球の 存在を特に同定するために、本発明方法をどのように使用することができるかを 示すことができる。

図９および１０のモニタリングは、図６Ａに見られる全データに対して行う。装 置が正確に作動しているならば、この白血球領域での計数の減少が、サンプル中 に溶解感受性を有する細胞が存在することを示す。というのは、この希釈剤の場 合、メカニズムは知られていないが、モニターされる全領域の外側に存在する必 要がある目に見えない細胞から細胞構造が出現することにより、この全領域の計 数速度が増加できるようにこの四次元の全白血球領域が選択されているからであ る。言い換えると、特定の分析条件では、リンパ球の崩壊を、生息の細胞構造発 生または粒子発生により遮蔽することができない。

次に、ソフトウェアのアルゴリズムにより、図６Ｂ１の二次元図で領域Ｒとして 投影されるサブ領域に四次元パルスを送ることによって、このサンプルの計数速 度パターンを調べることができる。〔図６のサンプルは、図１０の特定のサンプ ルを表すものではない。図６Ｂの領域表示はかなり動的であり、詳細にはサンプ ルごとに異なることを理解しなければならない。〕領域Ｒは、溶解しに（い赤血 球が崩壊パルスパターンの理由となる場合、崩壊パルス速度が予想される領域で ある。〔あるいは、動的に位置するＬ／Ｒ閾値は、本発明によれば、経時的に移 動する。〕領域Ｒはまた、ある無傷の白血球（例えば前骨髄性白血病由来のもの ）が例外的に分解し、核の残りがこの領域に運ばれるとき、計数速度の増加が生 じる領域でもある。その場合、図６Ｂの領域Ｒの上のモニターされる全領域に、 少なくともこの大きさの計数減少が現れる。

そのような領域Ｒに特異的な計数の増加が、相互領域Ｍの減少によって説明され る場合は、「不安定な細胞領域で、前単球性白血病と一致する。」という解釈を 示唆することができる。

図１０の特定の場合は、領域Ｒにおける無視できるほど小さいが安定な計数速度 の増加も減少もなかった。全白血球計数領域における減少全体は、リンパ球領域 しての同様の買疑応答（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ）により説明された。その 結果、壊れやすい、または溶解感受性を有するリンパ球の集団が見出され、ウィ ルス性感染および白血病が考慮されなければならない。全血１μｍにつき２９９ ．０００という補正された非常に高いリンパ球数のために、装置のインタープリ ティプレポートは、「リンパ球集団は非常に壊れやすく、本発明の分析条件下（ 正常値二〇）での標準化された崩壊速度は＋＋＋である。」とともに、数値によ る正しいアウトプットを補充することができる。報告された全血１μｌにつきリ ンパ球２９９，０００という計数は、この１ｎｖｉｔｒｏ崩壊現象に対して補正 されている。この血液情報は、慢性リンパ性白血病の診断と一致する。

ＣＥＬＬ−ＤＹＮ■３０００．２を使用する本発明のこの好ましい白血球の態様 によれば、溶血により生存する細胞構造全体が、サンプル処理サイクルの計数期 中にモニターされる計数速度である。各々５００ミリ秒の間隔に対して生き残る 細胞数が、光散乱法によって得られる。

図１１は、この方法でＣＥＬＬ−ＤＹＮ■３０００．２により生じる崩壊速度デ ータの型を示す。図１１人は、いわゆる溶解しにくい赤血球を有する４個の新生 児血液サンプルに対して得られた全白血球計数速度を表す。計数減少全体は、図 ６の領域ＲおよびＬにおける崩壊によって説明された。今、この問題を切り取る と、ＣＥＬＬ−ＤＹＮ■３０００．３により、図９および１０のサンプル分析サ イクルの開始後４５秒間待った後、計数量を開始することが可能である。これら の分析条件下では、新生児の赤血球は図６の領域りをもはや侵食することはなく 、全白血球サブ集団は一般に、安定した計数速度を与え、そのような新鮮な血液 サンプルに関する計数を補正する。

図１１Ｂは、種々の治療段階にある慢性リンパ性白血病の５人の患者から採った 血液サンプルに対して得られた崩壊パターンを示す。これらの患者の一人は、標 準化したリンパ球の壊れやすさが＋＋＋＋であり、これは図１０に見られるもの に匹敵する。中央の二つは壊れやすさが＋＋であり、残りの二つは壊れやすさが 十である。その壊れやすさが統計的に無視できるものではないという事実は、図 １１０と同様に説明される。その図において、縦軸の目盛りは、かなり高い解像 度が示されるようにつけである。図１１人および１１Ｂでは、水平線の低い方か ら高い方まで、数が１０倍増加している。図１１０では、その増加がほんの１， ５倍である。図１１０の２個のプロットをより解像度の低い方眼上に表すと、そ れらは実際、図１１ＢのＣＬ　Ｌプロットの４個のように、はとんど水平線にな るであろう。

図１１０に示した患者は、図１１人の患者と同様、溶解しにくい赤血球を有する 。しかし、前者は成人であり、そのメカニズムは、新生児の生理的に異なるヘモ グロビンＡとそれらの細胞の形状の相違との組み合わせというよりも、異常ヘモ グロビン症である。図１１０の場合、崩壊は、図６８１の領域Ｒにおける崩壊速 度によって完全に説明された。その結果、ＷＢＣは、ＣＥ　Ｌ　Ｌ　−Ｄ　Ｙ　 Ｎ■３０００．１では、これらのサンプルに対して誤ってはいなかった。他方、 ＣＥＬＬ−ＤＹＮ■３０００．２　（および３０００．２Ａ）に本発明を導入す ると、これら二人の患者のヘモグロビンにおける先天的な異常を、全く予期せず にうまく遮ることができた。血液学レボ＝１・のこの費用効果のある注釈は、臨 床上、多くの場合に非常に有用である。それは、図２および５に関する部分で述 べた実験的方法の溶血性白血球分析への組入れを表す。この新規で有効な赤血球 の壊れやすさによる方法は、溶血性試薬を適切に選択することによりさらに最適 化を行うための重要な可能性を有する。

ＣＥＬＬ−ＤＹＮ■３０００．１または２は、白血球を流動セルに一度通して処 理する。ＣＥＬＬ−ＤＹＮ■３０００Ａと■ いう名称のＣＥＬＬ−ＤＹＮ　３０００の改良型も、本発明方法を利用すること ができる。ＣＥＬＬ−ＤＹＮ■３０００Ａは、白血球の処理に２個のチャンネル を使用する。ＣＥＬＬ−ＤＹＮ■３０００の光学チャンネルとＣＥＬＬ−ＤＹＮ ■１３００のインピーダンスチャンネルである。インピーダンスチャンネルは、 粒子が小さい孔を通過するとき、その粒子によって作られる電気抵抗の変化を測 定するよく知られている方法を使用する。同様の方法は、本出願人による米国特 許第４．７１０．０２１号、第４．７４５，０７１地号および第５．０４５，４ ７４号に記載されている。

ＣＥＬＬ−ＤＹＮ■３０００Ａにおいて、インピーダンスチャンネルは、溶解し た全血を処理して、温和であるが特定の方法で細胞質が［正常緊張状態によりむ き出しに（ｓｔｒｉｐｐｅｅｌ　ｎａｒｍｏｔｏｎｉｃａｌｌｙ）Ｊされた無傷 の細胞由来の白血球の核を計数することにより全白血球数を得る。こうして、光 学チャンネルにより外挿された白血球数を、インピ−ダンスチャンネルにより完 全に独立して異なるように最適化された白血球数によって確認することができる 。正常緊張状態かられずかに高張性のインピーダンスチャンネルで計数した核は 、進行性の白血球溶解に対して感受性がないので、確認が可能である。ＣＢＬＬ −ＤＹＮ■３０００．２Ａでの二チャンネル法は、光学チャンネルからとインピ ーダンスチャンネルからとの生の計数速度間に観察できる相違があるので、壊れ やすい白血球集団の存在をオペレータが確認することができる。

本発明のこの段階での利用で強調すべきことは、崩壊補正した光学ＷＢＣ（ＷＯ Ｃと称する）および厳密な、必要であれば崩壊補正した核インピーダンスＷＢＣ （ＷＩＣと称する）の間に重要な不一致がないことである。しかし、両方の方法 によるデータの利用可能性は、ただ濾過し、部分的に希釈し、た海水を利用して 全血分析を行うことができる極めて簡単な装置であっても、新しい有効な補正さ れたＷＯＣの確立を促進する。

ＣＥＬＬ−ＤＹＮ■３０００ＡのｗｏｃおよびＷＩＣチャンネルにおいて溶血方 法が別々に調整できることも、新しく可能になった「相対的溶解感受性」崩壊速 度パラメータの確立を可能にする。

ヘモグロビン変換器 ＣＥＬＬ−ＤＹＮ■３０００および３０００Ａの装置は、ヘモグロビンを、第四 アンモニウム塩と関連したヘム−シアニド錯体として測定する。

１２μＩの血液アリコートを溶血性ヘモグロビン試薬で２５０倍に希釈し、ヘモ グロビン分光光度計に移す。ヘモグロビン試薬は、第四アンモニウム塩／ＫＣＮ 溶液と希釈剤との混合物である。希釈剤のｐＨは７．４±０．０５であり、浸透 圧は３４０±３ｍ０５ｍである。その組成物は、ＮａＣｌ。

７．９ｇ／Ｉ　；ＫＣｌ、０．４ｇ／Ｉ　；Ｎａ２ＨＯ４゜０．２ｇ／Ｉ　；Ｎ ａ２ＨＰＯ４，１，９ｇ／Ｉ　；Ｎａｚ　ＥＤＴＡ、０．３ｇ／ｌ　；ＮａＦ、 ０．４ｇ／Ｉ　；　２−７ヱ／キシエタノール、３ｍｌ／Ｉおよび１１とするた めの水である。ヘモグロビン分析の最良型では、第四アンモニウム塩溶液が臭化 テトラデシルトリメチルアンモニウム９０ｇ／ｌとシアン化カリウム０．７５ｇ ／ｌとをＩＩの脱イオン水に混合したものから成る。この第四アンモニウム塩溶 液２１を１０１の希釈剤と混合する。最後に、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１１４を０． ２５ｍ１／１の濃度で添加する。

この試薬の場合、赤血球がヘモグロビンを急速に放出し、ヘモグロビンはシアニ ドおよび第四アンモニウムと反応して安定な錯体を形成する。この錯体はヘモグ ロビン変換器を通過し、光路長１ｃｍの流動セル中で５４０ｎｍで吸光度を測定 することにより測定される。この測定値は、試薬を含まないブランクに対する同 様の測定に対して評価される。ヘモグロビン結果は、全血中での濃度により報告 される。使用者は、ｇ／ｄｌＳｇ／ｌまたはミリモル／１のいずれかの単位を選 択することができる。

血小板および赤血球集団パラメータ ０．８μｌの血液アリコートをヘモグロビン測定器の項で述べた希釈剤で１２， ５００倍に希釈し、血小板および赤血球パルス発生用のインピーダンス変換器に 移す。

インピーダンス感知ゾーンを通過する粒子により発生する各パルスを増幅し、内 部参照電圧と比較する。それにより、血小板および赤血球を赤血球／血小板チャ ンネルに分ける。パルス数が細胞数の指標であり、パルスの振幅は、細胞容積に 関係する。パルス振幅の周波数分布により、図４Ａおよび４Ｂに示す容積ヒスト グラムが得られる。

図４Ａのヒストグラムを使用すると、次の血小板パラメータ：ＰＬＴ　（血小板 数）、ＭＰｖ（平均血小板容積）、ＰＤＷ（「血小板分布幅」というより対数正 規分布の幾何標準偏差を１０倍したもの）およびＰＣＴ（血小板クリット）が血 小板集団に対する種々の警報とともに誘導される。

図４Ｂのヒストグラムを使用すると、次の赤血球パラメータ：ＲＢＣ（ｒ赤血球 数Ｊ　）　、ＭＣＶ　（平均血球容積）　、ＲＤＷ（「赤血球分布幅」というよ り分布の変動係数）およびＨＣＴ（ヘマトクリット）ならびに赤血球集団の種々 のインタープリティブ分析が誘導される。さらに、下記パラメータ＋ＭＣＨ（平 均の血球ヘモグロビン含量）およびＭＣＨＣ（平均の血球　′ヘモグロビン濃度 ）ならびに種々のインタープリティブ分析がヘモグロビン値（ＨＧＢ）とともに コンピュータで計算される。

データを得る間に変換器を通過する希釈血液の容積は、完全な細胞数を得るため に知っておかなければならない。

血小板／赤血球チャンネルの場合、これは、米国特許第４．７１０，０２１号に 記載の計量管を使用して行う。各サンプルの分析サイクルの細胞パルスおよび細 胞数獲得期の間は、細胞がインピーダンスの孔を通って引き出され、液体が計量 管を通って引き出される。試薬のメニスカスが光学検出器を通過するとき、パル ス獲得期がスタートして、血小板および赤血球の計数が同時に行われる。実際、 図４Ａおよび４Ｂの異なる２個の「観察窓」のパルスは、２個の異なる電気回路 で処理され、全てのデータは、いわゆるリストモードにデジタル値として記憶さ れる。このパルス獲得は、メニスカスが第二光学検出器を通過するときに停止す る。厳密に１００μｌまたは２００μｍの希釈血液が、装置に対して選択したマ ノメータに依存するこの間隔の間にインピーダンス変換器を通過する。計数時間 を使用すると、オリフィスで破片を検出することができる。というのは、そのよ うな物質は孔の有効な直径を小さクシ、従って計数時間を増加させるからである 。また、この破片は、サイジングデータに悪影響を及ぼす可能性がある。

〔本発明は、図１０および１１に詳述した光学データだけでなく、図１〜５で示 した血小板および赤血球のインピーダンスデータ全部に適用可能である。〕 ＣＥ　Ｌ　Ｌ−Ｄ　Ｙ　Ｎ■３０００により、赤血球のサイズ分布から平均細胞 容積（ＭＣＶ）が導かれる。その結果は、前述したＥＥＥＶ　ｆｌで直接報告さ れる。ヘマトクリット結果は、全血の単位体積当たりのパーセント充填赤血球ま たは充填赤血球の比率（１／Ｉ）として報告される。

ＥＥＥＶ　ｆｌの目盛りは、電気的に得られるヘマトクリットが参照のミクロへ マドクリットまたは遠心により得られる充填細胞容積（ＰＣＶ）と必ず一致する ようにすると、どの赤血球希釈剤およびインピーダンス分析器に対しても確立さ れる。

典型的な抗凝血化した新鮮なヒト血液サンプルの場合、そのような平均的な一致 は、赤血球計数および電子ＭＣＶから計算されるヘマトクリット（ＨＣＴ）がＰ Ｃｖと一致するように検量しである赤血球パルスを目盛ることにより達成される 。

ＨＣＴ＝　（ＲＢＣ数　Ｘ　ＭＣＶ）／１０＝ＰＣＶ赤血球分布幅（ＲＤＷ）は 、赤血球の容積分布からめられる。それは、簡単には、注意深く抽出したヒスト グラムピークのＣ，Ｖ、（％）である（Ｃ，ｖ、＝　（ＳＤ／平均）×１００〕 。このパラメータは、赤血球の同種細胞溶解（ｉｓｏｃｙｔｏｓｉｓ）およびキ ロ細胞溶解（ｋｉｌｏｃｙｔｏｓｉＳ）の指標である。ＲＤＷは、血液のよごれ （ｂｌｏｏｄ　ｓｍｅａｒ）で見られる不同赤血球溶解（ａｎｉｓｏｃｙｔｏｓ ｊｓ）（赤血球のサイズの変化）の程度および変形赤血球溶解（ｐｏｉｋｉｌｏ ｃｙｔｏｓｉｓ）（赤血球の形の変化）の程度の両方により変わる。上記パラメ ータは全て臨床的に育用な結果である。

これらの結果は、各サンプル処理または測定サイクルの完了時にモニター上に表 示される。使用者は、このディスプレイおよび印刷物に現れる結果の順序および 様式に対して自由に調節できる。溶解により生存する白血球から得られる四次元 光散乱データからの抜粋は、二次元散乱図として（図６に示すように）、および ／または選択可能なヒストグラムとして（本明細書では図示しないが、図４に示 すものと同様）、表示することができる。絶対的な白血球数は、子側／μｌ全血 の単位またはＳｌ単位などの他の単位で表示することができる。赤血球データは 、ＥＥＥＶ　ｆｌで区分した横軸を有する容積頻度分布ヒストグラムとして表示 される（図４Ｂに例示）。絶対的な赤血球数は、１００万個／μｌ全血の単位ま たはＳｌ単位などの他の単位で表示される。血小板データは、ＬＥＥＶ　ｆｌで 区分した横軸を有する容積頻度分布ヒストグラムとして表示される（図４Ａに例 示）。絶対的な血小板数は、子側／μｌ全血の単位またはＳｒ単位などの他の単 位で報告される。

コントロールおよびデータ処理特性 ＣＥＬＬ−ＤＹＮ■３０００の操作は、系の状態をモニターし、データを記憶し 、ＱＣプログラムを実行し、異常データに対してフラッグを出し、診断上のチェ ックを行う３個のマイクロプロセッサにより制御される。データ端局のコンピー タを使用して細胞崩壊速度が計算され、これは、細胞集団の全生存特性の質疑応 答に使用される。不注意による白血球溶解に対して白血球集団数を補正するため に必要な白血球崩壊速度は、該速度１個のみである。

ＣＥ　Ｌ　Ｌ　−Ｄ　Ｙ　Ｎ■３０００は、各測定サイクル後に、使用者が選択 可能な多数組の数値的・グラフ的データを自動的に表示する。検体の測定は、実 行モードの選択により行われる。検体は、次のように同定することができる。患 者、低コントロール、正常コントロール、高コントロール、反復、選択したサン プルの型など。オペレータの識別、日付、時刻などは、キーボードによって入力 できる。表示されたデータは、グラフィックプリンターによってＺに折り畳んだ 用紙（８，５＠Ｘｌｌ”）に印刷することができる（その画面に対して単一のレ ポート）。

あるいは、マルチコピーチケットレポートも同じプリンターで印刷できる。

コンピュータのハードディスクに対して選択したサイズに応じて、電流２．００ ０〜１０，０００サイクルに対するデジタル合計データは、自動的に記憶される 。このデータは、要求に応じて呼び出したり、印刷することができる。各データ ファイルはグラフィックデータを含み、下記情報を含むことができる。

シーケンス番号、検体の型、検体の識別番号（使用する場合）、日付、時刻、オ ペレータの識別およびオペレータが上記したものから選択した全パラメータに対 する数値的グラフィックデータ。さらに、数値的データは、装置のモニターパラ メータ、および本発明のパラメータをモニターする細胞集団崩壊速度を含むこと ができる。

使用者は、準備モードにより数値的データの範囲をセットすることができる。こ れらの範囲外のデータは、使用者が選択可能な目立つ色調でビデオスクリーン上 に表示され、レポートには肉太体で印刷される。赤血球および血小板に対して動 的にモニターされたデータまたは溶解により生存する有核白血球に対する四次元 の散乱図のデータがある基準を満たさない場合、影響をうける各領域は、完全に 印字された警報メツセージによりフラッグが出される。

本発明を説明するために、代表的な態様および詳細を示したが、請求の範囲で規 定する本発明の範囲から逸脱しない限り、種々の変形および修正を行うことがで きる。

等価球直径（μｍ） 図工 等価球直径（μｍ） ｏ、１１１０　１０Ｃ）　１０００ 容積（ｆＬ） 図２ 等偏球直径（μｍ） ０．１　１　１０　１００　１０００ 容積（ｆＬ） 図３ ＣＥＬＬ−ＤＹＮ　３０ＧＧ血小板 ラテックス球の等価電気容積、ｆＬ　（ＬＥＥＶ、ｒＬ）図４Ａ ＣＥＬＬ−ＤＹＮ　３０００赤血球 赤面球の等価電気容積、ｆＬ　（ＥＥＥＶ、ｆＬ）図７ ｒ−−−−−コ １、零’、　’　−６／　’４１４Ｍ傭辱　。

図１０ 計数期の時間（秒） 図１２Ａ− フロントベージの続き （７２）発明者　グレイシアー、ジョンアメリカ合衆国、フロツク、ペンブロウ ク・パインズ、サウス・ウェスト・ワンハンドレッドアンドサーティーンス・ア ベニュー・５１１ （７２）発明者　ロシエ、ジョン・ダブリュアメリカ合衆国、カリフォルニア・ ９５０３７、モーガン・ヒル、バイア・コーフイノ・（７２）発明者　ディレク ター、ブルース・エイアメリカ合衆国、カリフォルニア・９５９５１、サンタ・ クララ、キーリー・ブールバード・９３８・シー

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. １．エーテル結合を主鎖中に有する高分子量ポリマーの解重合方法において、 （ａ）複数のエーテル結合を主鎖中に有し、少なくとも約５，０００の分子量を 有するポリマーと液体の水との水性混合物を作り、そして（ｂ）この混合物を約 ２００℃ないし、水の約臨界温度の範囲内の温度でシステムの自然発生圧力下で このポリマーを低分子量化合物に解重合するために十分な時間加熱することから なる高分子ポリマーの解重合方法。
2. ２．前記の重合体が式 Ｒ′（ＯＲ）ｎＯＲ′′ 〔ここで前記重合体は少なくとも約５０００の分子量を持ち、式中Ｒ，Ｒ′およ びＲ′′は同一であっても異っていてもよく、それぞれ置換されていてもよい脂 肪族または芳香族の炭化水素基からなる群から選ばれるが、Ｒ，Ｒ′およびＲ′ ′の少なくとも１個は置換フェニル基であり、そしてｎは少なくとも約１００の 整数である。〕で表わされる請求の範囲１の方法。
3. ３．前記の水性混合物が、重合体１重量部当り約１〜１０重量部の水を含有する 請求の範囲１の方法。
4. ４．前記の混合物を行２００℃ないし約３５０℃の温度で加熱する請求の範囲１ の方法。
5. ５．前記の水性混合物が、重合体１重量部当り約２〜５重量部の水を含有する請 求の範囲１の方法。
6. ６．前記の液体の水が約７．０のｐＨを持つ請求の範囲１の方法。
7. ７．前記の液体の水が約７ないし約３．５のＰＨを持つ請求の範囲１の方法。
8. ８．前記の重合体がポリエチレングリコールである請求の範囲２の方法。