JPH07503622A - 多価の一本鎖抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 多価の一本鎖抗体 本発明は一本鎖の多価抗体に関する。

抗体は、身体が外来物であると判断する特定の抗原又は物質に応答して免疫系に より誘発されるイムノグロブリンの群に属するタンパク質である。５クラスのヒ ト抗体があり、各クラスは同一の基本構造を有している。抗体の基本構造は四量 体、又はその複合体であり、軽鎖と重鎮とよりそれぞれが構成される二つの同一 のへテロダイマーより成る。軽鎖は一本の可変（Ｖ）　ドメインと一本の定常（ Ｃ）　ドメインとより成り、他方、重鎮は一本の可変性ドメインと、３本以上の 定常ドメインとより成る。軽鎖及び重鎮の両者に由来する、それぞれＶＬ及びｖ Ｈと称される可変ドメインは、イムノグロブリンの特異性を決定し、他方、定常 （Ｃ）　ドメインは様々なエフェクター機能をもたらす。

アミノ酸配列データーは、それぞれの可変ドメインが、４つの比較的保存された フレームワーク領域（ＰＲ）によりフランクされている３つの相補性決定領域（ ＣＤＲ）を含んで成ることを示唆する。このＰＲは可変領域ドメインの構造保全 性を維持するものと考えられている。このＣＤＲは個々の抗体の結合特異性にと って重要であり、且つ抗体の結合の多様性の原因であると推定されている。

抗体の基本構造は２本のへテロダイマーを含むため、抗体は多価分子である。例 えば、　■ｇＧクラスは２つの同一の抗原結合部位を有しており、他方、三量体 １ｇＭクラスはｌＯの同一の結合部位を有している。

同一の遺伝系列及び結合特異性を有するモノクローナル抗体は診断及び治療剤の 両方として有用とされている。モノクローナル抗体は、確立された手順に従い、 マウスのリンパ球と適当なマウスミエローマ細胞系との融合により作られたハイ ブリドーマにより日常的に産出される。しかしながら、ヒトにおけるインビボ治 療及び診断にとってのネズミ抗体の投与は、ヒト免疫系により誘発されるヒト抗 −マウス抗体応答に基づき制約されている。

キメラ抗体であって、−の種に由来する抗体の結合又は可変領域が別の種に由来 する抗体の定常領域と組合されたものが組換ＤＮＡ方参照のこと。これらは腫瘍 関連抗原に対するキメラ抗体を開示している。典型的には、ネズミ抗体の可変領 域はヒト抗体の定常領域に連結されている。かかるキメラ抗体はその組成におい て大部分がヒトであるため、それらはネズミ抗体よりも免疫原性が実質的に低し ）ものと予測される。

キメラ抗体は、抗原結合にとって必須でないが、その薬理動力学に影響を及ぼす タンパク質構造全体のうちの主要部分を構成するＰｃ領域を保有し続けている。

免疫療法又は免疫診断における抗体の利用のため、標的組織に迅速に集中し、且 つ結合する抗体様分子を得ること、及び未結合の物質が身体から迅速に排除され ることが所望される。一般に、小さめの抗体フラグメントは高めの毛管浸透性を 有しており、そして完全抗体よりも身体からより早く排除される。

抗原と相互作用するのは軽鎖及び重鎮の可変領域であるため、一本のＶＬと一本 のｖＨとにより一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖｓ）が作られており、これは ６つのＣＤＲを含み、それらはペプチドリンカ−（米国特許第４．９４６．７７ ８号）により連結されたＶＬ−Ｌ−Ｖ□ポリペプチドを成しており、ここでＬは ペプチドリンカ−を表している。ＶＬとｖＨドメインが配向ＶＨ−Ｌ−ＶＬであ る５ｃＦｖが米国特許第５．１３２．４０５号に開示されている。

完全抗体にとっての最少限の２つの結合部位と比べて５ｃＦｖは一つのそれを存 するため、５ｃＦｖは２以上の結合部位を含む抗体に比べて低い活性を存してい る。

従って、このポリペプチドの活性を高めるため、且つその抗原認識特性を維持又 は高めるため、複数の結合部位を有する５ｃＦｖの構築体を獲得することが有利 であろう。加えて、標的組織上の別々のエピトープの認識を可能とする、別の免 疫エフェクター機能の抗体ベース漸増を可能とする、又は治療もしくは診断成分 の抗体捕獲を可能とする二価特異的である多価５ｃＦｖを獲得することが有利で あろう。

それぞれ第一ペプチドリンカ−により共有結合している一本のＶ、ｌと一本のＶ 、ドメインとを存する一本鎖抗体フラグメントは、第二ペプチドリンカ−によっ て共有結合されて、完全抗体の結合親和力を維持している多価−重鎖抗体を形成 できうることが発見された。

−態様において、本発明は抗原に対する親和性を有する多価−重鎖抗体であり、 ここでこの多価−重鎖抗体は２本以上の軽鎖可変ドメインと２本以上の重鎮可変 ドメインとを含んで成り、ここで各可変ドメインは少なくとももう一つの別の可 変ドメインに連結されている。

別の態様において、本発明は２本以上の一本鎖抗体フラグメントを含んで成る多 価−重鎖抗体であり、各フラグメントは抗原に対する親和性を有しており、ここ でそれらのフラグメントは第一ペプチドリンカーにより共有結合しており、そし て各フラグメントは：（ａ）軽鎖可変ドメインを含んで成る第一ポリペプチド； （ｂ）重鎮可変ドメインを含んで成る第二ポリペプチド；及び（Ｃ）この第一と 第二のポリペプチドを機能的な結合性成分へと連結せしめる第二ペプチドリンカ ー： を含んで成る。

別の態様において、本発明は、多価−重鎖抗体をコードするＤＮＡ配列を提供し 、ここでこの多価の一本鎖抗体は２本以上の一本鎖抗体フラグメントを含んで成 り、各フラグメントは抗原に対する親和性を有しており、ここでこれらのフラグ メントは第一ペプチドリンカーにより共有結合しており、そして各フラグメント は：（ａ）軽鎖可変ドメインを含んで成る第一ボリベブチド：（ｂ）重鎖可変ド メインを含んで成る第二ポリペプチド；及び（Ｃ）この第一と第二のポリペプチ ドを機能的な結合性成分へと連結せしめる第二ペプチドリンカ−； を含んで成る。

この多価−重鎖抗体は、完全抗体の特異性及び活性を有するが、サイズにおいて もっと小さく、より迅速な毛管透過を可能とする抗体フラグメントの構築を可能 とする。多価−重鎖抗体は、結合部位が２種類の抗原決定基でありうる多価−重 鎖抗体の構築も可能とするであろう。

図面の簡単な説明 図１ｉｆｔ、Ｖ、−Ｌ−Ｖ、−Ｌ−ＶＬ−Ｌ−Ｖ、　（ＬＨＬＨ）とＶＬ−Ｌ− Ｖ、−Ｌ−Ｖ、−Ｌ−ＶＬ　（ＬＨＨＬ）の形態を有する共有結合型−重鎖抗体 及び非共有結合型Ｆｖ一本鎖本体抗体ｖ２）を示す。

図２はＣＣ４９ＶＬのヌクレオチド配列を示す。

図３はＣＣ４９ＶＬのアミノ酸配列を示す。

図４はＣＣ４９Ｖ、のヌクレオチド配列を示す。

図５はＣＣ４９ＶＮのアミノ酸配列を示す。

図６はｐ４９ＬＨＬＨにおけるＣＣ４９−重鎖抗体ＬＨＬＨのヌクレオチド配列 及びアミノ酸配列を示す。

図７はｐ４９ＬＨＨＬにおけるＣＣ４９−重鎖抗体Ｌｌ（ｌ（Ｌのヌクレオチド 配列及びアミノ酸配列を示す。

図８はプラスミドｐｓＬ３０１Ｔ及びｐｓＬ３０１ＨＴ（７）構築を示す。　− 図９はプラスミドｐ４９ＬＨＨＬの構築を示す。

図１Ｏはプラスミドｐ４９ＬＨＬＨの構築を示す。

図１１はＣＣ４９［ｇＧ、　ＣＣ４９ｓｃＦｖ２及びＣＣ４９ｓｃＦｖを用いた 、競合因子としてビオチニル化ＣＣＣＣ４９ｌを用いる競合アッセイの結果を示 す。

本明細書で挙げた全ての文献の教示全体を引用することで本明細書に組入れる。

核酸、アミノ酸、ペプチド、保護基、活性基等を略すとき、それらはＩＵＰＡＣ ＩＵＢ　（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ　ｏｎ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｎｏｍｅｎｃ ｌａｔｕｒｅ）又は関連分野の実際に従って略している。

本明細書で用いる［−重鎖抗体フラグメントＪ　（ｓｃＦｖ）又は「抗体フラグ メント」なる語は、ＶＬ　Ｌ　ＶＭにより表わされる、ペプチドリンカ−（Ｌ） によりＶＨドメインに連結されたｖＬ　ドメインを含むポリペプチドを意味する 。ＶＬとＶＨドメインとの順序は逆であってよく、Ｖ、−Ｌ−ＶＬとして表わさ れるポリペプチドが獲得できつる。「ドメイン」は、独立の機能、例えば抗原結 合又は抗原認識を及ぼすタンパク質のセグメントである。

「多価−重鎖抗体」はペプチドリンカ−により共有結合した２以上の一本鎖抗体 フラグメントを意味する。この抗体フラグメントは連結されて、 Ｖ、−Ｌ−Ｖ、−Ｌ−Ｖ、−Ｌ−Ｖ、　；　ＶＬ−Ｌ−Ｖ、−Ｌ−Ｖ、−Ｌ−Ｖ Ｌ；　ＶＭ−Ｌ−Ｖ、−Ｌ−Ｖ、−Ｌ−Ｖ、　；又は 九−ｔ、−ｖＬ−ｔ、−ｖＬ−ｖ、 のｖＬとｖＨドメインの順序を有する二価の一本鎖抗体を形成してよい。

三価以上の一本鎖の多価抗体は、追加のペプチド間リンカ−によって二価の一本 鎖抗体に連結されたｌ又は数本の抗体フラグメントを有する。好適な態様におい ては、ｖＬとｖＨドメインの数は等しい。

本発明は、 Ｖ、−Ｌ−Ｖ、−Ｌ−ＶＬ−Ｌ−Ｖ、又＋；！ＶＬ−Ｌ−ＶＬ−Ｌ−Ｖ、−Ｌ− Ｖ。

で表示されうる多価の一本鎖抗体も提供する。

ＶＬ−Ｌ−Ｖ、−Ｌ−ＶＬ−Ｌ−Ｖ、　（ＬＨＬＨ）及びＶｔ、−Ｌ−Ｖ、−Ｌ −Ｖｘ−Ｌ−Ｖ、、（ＬＨＨＬ）　ノ形態を有する共有結合型−重鎖抗体を図１ に示す。非共有結合型Ｆｖ一本鎖本体抗体ｖ２）も図１に示している。

本発明において利用するための一本鎖抗体フラグメントは任意の抗体の軽鎖及び ／又は重鎮可変ドメインに由来しうる。好ましくは、その軽鎖と重鎮可変ドメイ ンは同一の抗原に特異的である。連結されて多価の一本鎖抗体を構成している個 々の抗体フラグメントは、同一の抗原に対して特異的でありうるか、又は別々の 抗原に対して特異的でありうる。

一本鎖の多価抗体についてのＤＮＡ配列を含むベクターを作るため、これらの領 域をエンコードする遺伝子の起源が必要とされる。適当なりＮＡ配列は公共の起 源から入手するか、又は当業界に公知の標準の手順によって獲得できつる。例え ば、Ｔｈｅ　Ｕ、Ｓ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆＨｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕ ｍａｎ　５ｅｒｖｉｃｅｓにより公開されたＫａｂａ　ｔらの５ｅｑｕｅｎｃｅ ｓｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅ ｓｔ第４版（１９９１）は、今日まで述べられているほとんどの抗体可変領域の 配列を開示している。

遺伝子配列が未知のとき、ベクターの中にクローンするＤＮＡの起源として、逆 転写酵素仲介合成によりｔｎＲＮＡから獲得したｃＤＮＡ配列を利用することが 一般に可能である。抗体に関して、ｍＲＮＡの起源は広範囲にわたるハイブリド ーマから獲得できつる。例えば、カタログＡＴＣＣＣｅ１ｌ　Ｌｉｎｅｓ　ａｎ ｄ　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ、　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　 Ｃｏ１１ｅｃ−ｔｉｏｎ、　２０３０９　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ、　Ｒ ｏｃｋｖｉｌｌｅ　Ｍｄ、、　ＵＳＡ　（１９９０）を参照のこと。その中に挙 げられている幅広い様々な抗原と反応性のモノクローナル抗体を分泌するハイブ リドーマがそのＣｏ１１ｅｃｔｉｏｎより入手でき、そして本発明において利用 できる。これらの細胞系及びその他の類似の種類が、可変ドメインをコードする ｍＲＮＡの起源として、又はモノクローナル抗体自体のアミノ酸配列を決定する ために抗体タンパク質を獲得するように利用できううる。

抗体の可変領域は、適当なを推動物、通常は家畜動物とそして最も好都合にはマ ウスを免疫することにより得られもする。その免疫原は課題の抗原であるか、又 はハブテンであるとき、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）の如きの 抗原に対するこのハブテンの抗原性抱合体であろう。免疫化は宿主哺乳動物への 通常は２〜３週間置きの免疫原の１又は数回の繰り返し注射によって好適に実施 されうる。通常、最後の負荷の３日後、牌臓を取り出し、そしてｍＲＮＡが当業 界に公知の標準手順により簡単に獲得できつるようにハイブリドーマを供するた めの細胞融合に利用する単独細胞へと解離する。

課題の抗体が獲得でき、そしてそのアミノ酸配列だけを知り得たら、その配列を 逆転写することが可能である。

本発明において有用なＶＬ及びＶ８ドメインは好ましくは、１９９０年３月３日 に公開されたＰＣＴ出願ＷＯ９０１０４４１０及び１９８９年１月２６日に公開 されたＰＣＴ出願Ｗ０８９１００６９２に開示されている、腫瘍関連糖タンパク 質７２抗原に対する一連のＣｃ抗体の一つから獲得できる。

より好ましイノは、ＰＣＴ公開ＷＯ９０１０４４１０及びＷＯ８９１００６９２ １ｍおいてＣＣ４９と表示されているモノクローナル抗体に由来するｖＬ及びｖ Ｈドメインである。ＣＣ４９のｖＬをコードするヌクレオチド配列（ＳＥＱ　１ ０　ＮＯ：　１　）は図１に示すものと実質的に同じである。ＣＣ４９のＶＬの アミノ酸配列（ＳＥＱ　ｒＤ　Ｎｏ　：　２　）は図２に示すものと実質的に同 じである。ＣＣ４９のＶＨをコードするヌクレオチド配列（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ ：３）は図３に示すものと実質的に同じである。ＣＣ４９のｖＨをコードするア ミノ酸配列（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　４　）は図４に示すものと実質的に同じで ある。

本発明の抗体フラグメント及び多価の一本鎖抗体を形成するため、適当なペプチ ドリンカ−を得ることが必要である。■工とＶ、ドメインを連結するための適当 なリンカ−は、Ｖ□とｖＬ　ドメインが、−重鎖ポリペプチドであって完全抗体 のもとの構造に非常に類似する三次元構造を存し、従ってその抗体フラグメント が由来している完全抗体の結合特異性を保持しているポリペプチド鎖へと折りた たまれることを可能にするものである。５ｃＦｖを連結するための適当なリンカ −は、各イムノグロブリンフラグメントのｖＨ及びＶＬ　ドメインが三次元構造 であって、その各フラグメントが、そのイムノグロブリンフラグメントが由来し ている完全抗体の結合特異性を保持するような三次構造を有するように、２以上 の５ｃＰｖを連結することの可能なものである。所望の特性を有するリンカ−は 、その開示内容を引用することで本明細書に組入れる米国特許第４．９４６．７ ７８号に開示の方法により獲得できつる。この第４．９４６．７７８号に記載の 方法により作られたポリペプチド配列より、ポリペプチドをコードする遺伝子配 列が獲得できうる。

好ましくは、Ｖ□とｖＬ　ドメインを連結して５ｃＦｖを形成せしめるペプチド リンカ−と、２以上の５ｃＰｖを連結して多価の一本鎖抗体を形成せしめるペプ チドリンカ−とは実質的に同じアミノ酸配列を存する。

そのリンカ−ペプチドは抗体フラグメントに対して、その個々の抗体フラグメン トへのこのリンカ−の結合がその抗原認識部位の結合能力を妨害しないように付 加されていることも必要である。

好適なリンカ−は、ＰａｎｔｏｌｉａｎｏらのＢｉｏｃｈｅｍ、、　３０．１０ １１７−１０１２５（１９９１）に開示されている２０５Ｃと称されているヘリ カルリンカ−を基礎とするが、その最初と最後のアミノ酸は、一端にあるＸｈｏ 　Ｉ部位と、他端にある旧ｎｄＩ［Ｉ部位により指定されるコドンを理由に変え られている。

好適なリンカ−のアミノ酸配列（ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ：　５　）は下記の通りで ある。

Ｌｅｕ−３ｅｒ−Ａ　ｌ　ａ−Ａｓ　ｐ−Ａｓ　ｐ−Ａ　Ｉａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ −Ａｓ　ｐ−Ａ　１ａ−Ａ　１ａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｓ　吹|Ａｓ　ｐ− Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ− Ｌｅｕ　。

このリンカ−は一般に１０〜５０のアミノ酸残基である。好ましくは、このリン カ−はｌＯ〜３０のアミノ酸残基である。より好ましくは、このリンカ−は１２ 〜３０のアミノ酸残基である。最も好ましくは、このリンカ−は１５〜２５のア ミノ酸残基である。

本発明の分子の製造のための発現媒体にはプラスミド又はその他のベクターか含 まれる。一般に、かかるベクターは宿主細胞と適合性な種に由来するレプリコン とコントロール配列とを含む。このベクターは通常レプリコン部位、及び形質転 換細胞の中での表現壓選別を供することのできる特定の遺伝子を保有している。

例えば、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）はｐＢＲ３２２を用いて容易に形質転換される （　Ｂｏｌｉｖａｒら、Ｇｅｎｅ、２．　９５−（１９７７）又はＳａｍｂｒｏ ｏｋら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、第 ２版（１９８９）　）。

真核細胞にとって適当なプラスミドも利用できつる。Ｓ、セレビシェ（Ｓ、　ｃ ｅｒｅｖｉｓｉａｅ）又は一般のパン酵母が真核微生物の中で最も一般的に利用 されているが、数多くのその他の株、例えばビシアバストリス（Ｐｉｃｈｉａ　 ｐａｓｔｏｒｉｓ）が作用である。多細胞生物、例えばＡＴＣＣより入手できる ５Ｐ２１０又はチャイニーズハムスター卵巣に由来する細胞の培養物も宿主とし て利用できつる。哺乳動物細胞にとって適当な典型的なベクタープラスミドはｐ ｓＶ２ｎｅｏ及びｐｓＶ２ｇｐｔ（ＡＴＣＣ）　；　ｐｓｖｔ、及びＩ）ＫＳＶ −１０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＢＰＶ　−１／ｐＭＬ２ｄ　（Ｉｎｔｅｒ− ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ、）である。

本発明のポリペプチドについての遺伝子を発現するための原核及び真核ウィルス 発現ベクターの利用も考慮される。

この発現ベクター及びこの−木組の多価抗体をコードするインサートは、その挿 入連結部において適合性制限部位を存し、且つその制限部位が挿入の領域にとっ て固有であることが好ましい。ベクター及びインサートの両者とも制限エンドヌ クレアーゼにより処理し、次いで任意の様々な方法、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら 、前掲に記載の方法によりリゲートする。

本発明の一本鎖の多価抗体の製造にとって好適なベクターの遺伝子構築体は、構 成的に活性な転写プロモーター、新生−重鎖ポリペプチドの合成／細胞の外への 分泌を誘導するシグナルペプチドをエンコードする領域を含むものである。好ま しくは、その発現速度は、不溶性物質としてそのポリペプチドが蓄積することを 避けるために輸送、折りたたみ及び集成過程とつり合う。レプリコン及びコント ロール配列に加えて、−重鎖ポリペプチドの最適な合成にとって追加の要素が必 要とされうる。これらの要素にはスプライスシグナル、並びに転写プロモーター 、エンハンサ−１及び終止シグナルが含まれる。更に、追加の遺伝子及びその生 成物が集成及び折りたたみを助長するために必要とされつる（シャベロン）。

市販されているベクターはベクターにとって上記の基準を満たすように簡単に改 変されつる。かかる改変は入手できる書物及び本明細書における教示により、当 業者によって容易に実施される。

更に、このクローニングベクターは選択マーカー、例えば薬剤耐性マーカー、又 は宿主細胞による選別できる特徴の発現を引き起こすその他のマーカーを含むこ とが好ましい。「宿主細胞」とは、組換ＤＮＡ技術を用いて構築されたベクター により組換的に形質転換されつる細胞である。薬剤耐性又はその他の選択マーカ ーは形質転換の選別をある程度助長することを意図する。更に、選択マーカー、 例えば薬剤耐性マーカーの存在は、夾雑微生物が培養培地の中で繁殖するこを防 ぐうえで利用されうる。この態様において、かかる純粋な形質転換細胞の培養物 は生存のために誘発された表現梨を必要とする条件のもとて細胞を培養すること により得られるであろう。

本発明の回収及び精製は当業界に公知の標準技術を利用して達成されつる。例え ば、もしそれらが培養培地の中に分泌されるなら、この−木組の多価抗体は限外 濾過により濃縮されうる。そのポリペプチドか宿主細胞のペリプラズマ空間へと 輸送されるなら、精製はその細胞に浸透圧ショックを与え、次いで限外濾過、抗 原アフィニティークロマトグラフィー又はイオン交換クロマトグラフィーを用い るカラムクロマトグラフィー及びゲル濾過を実行することにより達成されつる。

不溶性であり、且つ屈折体（ｒｅｆｒａｃｔｉｌｅ　ｂｏｄｉｅｓ）、通称封入 体として存在しているポリペプチドは、細胞の溶解、封入体を単離するための遠 心と洗浄の繰り返し、例えばグアニジン−ＨＣｌによる可溶化、及び再度の折り たたみ、それに続く生物活性分子の精製によって精製できうる。

一本鎖の多価抗体の活性は当業界に公知の標準アッセイ、例えば競合アッセイ、 酵素結合免疫収着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）及びラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ） により測定できつる。

本発明の多価の一本鎖抗体は診断及び治療における利用に固有の利点を供する。

この多価の一本鎖抗体の利用は、大きめのフラグメント又は抗体分子全体の利用 に勝る数多くの利点を供する。それらはその標的組織により迅速に到達し、そし て身体からより迅速に排除される。

診断及び／又は治療用途のため、この多価の一本鎖抗体はｌ又は複数の抗体フラ グメントが標的組織に対して特異的であるように、及び／又は複数の抗体フラグ メントが診断もしくは治療因子に対して特異的であるように構築されつる。

本発明は更に、癌の如きの障害の診断及び／又は治療において有用な特に好都合 な薬理組成物も考慮しており、ここでこの標的抗原はしばしば細胞の表層上で発 現される。診断及び／又は治療用途のため、この多価の一本鎖抗体は適当なイメ ージ又は治療剤に当業界に公知の方法によって抱合されつる。本発明の薬理組成 物は当業界に公知の方法、例えば常用の混合、溶解又は凍結乾燥工程によって調 製される。

本発明を、その単なる例示を意図する下記の実施例の考慮により更に明らかにす る。

略語 ＢＣＩＰ　５−フロモー４−クロロ−３−インドイルホスフェートｂｐ　塩基対 Ｂ１５−Ｔｒｉｓプロパン　〔ｌ、３−ビス〔トリス（ヒドロキシメチル）−メ チルアミノコプロパン） ＢＳＡ　牛血清アルブミン ＣＤＲ相補性決定領域 ＥＬＩＳＡ　酵素結合免疫収着アッセイＦｖ２　非共存一本ＩＦｖダイマー ＩＥＦ　等電点電気泳動 Ｋｂｐ　キロ塩基対 しＢ　Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地Ｍａｂ　モノクローナル抗体 ＭＥＳ　２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸ＭＷ　分子量 ＮＢＴ　ニトロブルーテトラゾリウムクロリドオリゴ　オリゴヌクレオチド ＰＡＧ　ポリアクリルアミドゲル ＰＡＧＥ　ポリアクリルアミドゲル電気泳動ＰＢＳ　リン酸緩衝食塩水 ＰＣＲポリメラーゼ連鎖反応 ｐＳＣＦＶ　５ＣＦＶをコードするＤＮＡ配列を含むプラスミドＲＩＧＳ　ラジ オイムノガイド外科 ＲＩＴ　ラジオイムノ治療 ５ｃＦｖ　一本ＭＦｖイムノグロブリンフラグメントモノマーｓｃＦνＳ　共有 結合した一本鎖Ｆｖイムノグロブリンフラグメントダイマー ＳＤＳ　ドデシル硫酸ナトリウム ＴＢＳ　ｌ−リス緩衝食塩水 トリス　（トリス〔ヒドロキシメチルコアミノメタン）ＴＴＢＳ　ツイーン２０ 洗浄液 ■Ｈイムノグロブリン重鎮可変ドメイン■Ｌ　イムノグロブリン軽鎖可変ドメイ ンモノクローナル抗体；　ＡＴＣＣＮｏ、　ＨＢ９４５９として寄託。

ＣＣ４９ＦＡＢ　：重鎖のＮ−末端領域に連結している完全軽鎖より成るＣＣ４ ９の抗原結合性領域。

ＣＣ４９ｓｃＦｖ　：ペプチドリンカ−により連結されているＣＣ４９抗体の二 本の可変ドメインより成る一本鎖抗体フラグメント。

ＣＣ４９Ｆｖ２　：ダイマーを構成するように非共有結合している２つのＣＣ４ ９ｓｃＦＶｏ　Ｆｖの後ろの数字は、表示の分子のモノマーサブユニットの数を 意味する。例えばＣＣ４９Ｆｖ６は六量体の多量体を意味する。

ＣＣ４９ｓｃＦｖ２　：　３　ツのリンカ−により連結されている、２本のＣＣ ４９ＶＬドメインと２本のｖＨドメインとより成る共有結合型−木繊抗体フラグ メント。ＶＬ（Ｌ）とＶｏ（Ｈ）　ドメインとを連結し合わせるのに６つの可能 な順序の組合せがある：　ＬＨＬＨ，ＬＨＨＬ、　ＬＬＨＨ，ＨＬＬＨ，ＨＬＨ Ｌ及びＨＨＬＬ。

の可変軽鎖とＣＣ４９可変重鎖とより成る５ｃＦｖについてのコード配列をれを 生成するためのコード配列を含むプラスミド。

分子クローニングのための手順は、その開示内容を引用することで本明細書に組 入れる。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ｃｏｌ ｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ第２版（１９ ８９）及びＡｕ５ｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ １ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　５ｏｎｓ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９９２）に記載の手順である。

ここで用いた水は全て脱イオン蒸留水とした。

オリゴヌクレオチドの合成及び精製 オリゴヌクレオチド（オリゴ）は全て、標準のβ−シアノエチルホスホラミジッ ト及び合成カラムを用い、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅ ｒ　Ｃ１ｔｙ、　ＣＡ）由来のＭｏｄｅｌ　３８０Ａ又はＭｏｄｅｌ　３９１　 ＤＮＡ合成装置のいづれかで合成した。その生成物上の保護基は、濃水酸化アン モニウムの中で５５°Ｃで６〜１５時間加熱することにより除去した。水酸アン モニウムはエバポレーションを介して除去し、そしてその粗混合物を３０〜４０ μｌの滅菌水の中に再懸濁させた。ポリアクリルアミド−尿素ゲル上での電気泳 動の後、オリゴを短波紫外（ＵＶ）光を用いて可視化させた。ＤＮＡバンドをゲ ルから切り出し、そして１ｍｌの１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ、　ｐＨ７，４， ５００ｍＭのＮａＣ１，５ｍＭのＥＤＴＡの中で６５°Ｃで２時間かけて溶離さ せた。最終精製は、ＤＮＡを５ｅｐ−Ｐａｃ（商標）Ｃ−１８カラム（Ｍｉｌｌ ｉｐｏｒｅ、　Ｂｅｄｆｏｒｄ、　ＭＡ）に適用し、そして結合したオリゴを６ ０％のメタノールで溶離させることによって行った。その溶液の体積を約５０ｍ １に下げ、そしてＤＮＡ濃度を２６００ｍ　（ＯＤｚｓ。）での光学密度を測定 することにより決定した。

制限酵素消化 制限酵素消化は全て、Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒｉｅｓ　（Ｇａｉｔｈｅ−ｒｓｂｕｒｇ、　ＭＤ）、　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎ ｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ、（Ｂｅｖｅｒｌｙ、　ＭＡ）又はＢｏｅｈ−ｒｉ ｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　（ＢＭ、　［ｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、　ＩＮ） の酵素及び緩衝液を用い、その製造者の推奨する手順に従って実施した。消化さ せた生成物をポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により分離させた。

そのゲルをエチジウムプロミドで染色し、そのＤＮＡバンドを短波ＵＶ光により 識別化させ、次いでそのＤＮＡバンドを切り出した。そのゲルスライスを、５ｍ Ｍのトリス、２．５ｍＭの酢酸、１ｍＭのＥＤＴＡ、　ｐＨ８，０を含む透析チ ューブ（Ｕｎｉｏｎ　Ｃａｒｂｉｄｅ　Ｃｏｒｐ、、　Ｃｈｉｃａｇｏ）の中に 入れ、そしてＭａｘ　Ｓｕｂｍａｒｉｎｅｔ気泳動装置（Ｈｏｅｆｅｒ　５ｃｉ ｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ。

ＣＡ）を用いて溶離させた。サンプル容量を５ｐｅｅｄ　Ｖａｃ濃縮器（Ｓａｖ ａｎｔＩｎｓｔｒｃｕｎｅｎｔｓ、　Ｉｎｃ、、　ＮＹ）で下げた。ＤＮＡをエ タノール沈殿させ、そして滅菌水の中で再溶解させた。

酵素結合免疫収着アッセイ（ＥＬ４ＳＡ）Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｃａｎ、　Ｒｅｓ 、、　４６．　８５０−８５７　（１９８６）に実質的に記載の通りに調製した ＴＡＧ　−７２抗原を、ポリビニルクロリド９６穴マイクロタイタープレート（ Ｄｙｎａｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、、　Ｃｈａｎｔｉｌ ｌｙ。

ＶＡ）のウェルの上に一夜乾燥させることで吸着させた。そのプレートをＰＢＳ 中の１％のＢＳＡで３１″Ｃで１時間ブロックし、次いで２００μｌのＰＢＳ、 　０．０５％のツイーン５０で３回洗った。２５μｌの試験抗体及び２５μｍの ビオチニル化ＣＣ４９（１／２０．０００希釈率のＩｍｇ／ｍｌの溶液）をウェ ルに加え、そしてそのプレートを３１”Ｃで３０分インキュベートした。プレー トに結合したＴＡＧ−７２、ビオチニル化ＣＣ４９、ストレプトアビジンアルカ リホスファターゼの相対量、及び発色時間は、余計な抗体又はビオチニル化ＣＣ ４９がないように、しかも５ｃＦｖによる競合を検出するのに十分なシグナルが 得られるように実験的に決定した。陽性コントロールは５μｇ／ｍｌのＣＣ４９ 及び１０Ｍｇ／ｍｌのＣＣ４９Ｆａｂとした。陰性コントロールはＰＢＳ中の１ ％のＢＳＡ及び／又は濃ＬＢとした。未結合のタンパク質を洗い流した。アルカ リホスファターゼの抱合された１：１０００の希釈率のストレプトアビジン５０ μｍ　（ＳｏｕｔｈｅｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｇｙ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ、　 Ｉｎｃ、、　Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、　ＡＬ）を加え、そしてそのプレートを３ １°Ｃで３０分インキュベートした。そのプレートを更に３回洗った。５０μＩ のバラ−ニトロフェニル−ホスフェート溶液（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ　＆　Ｐｅ ｒｒｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、、　Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ 、　ＭＤ）を加え、そして発色反応を最低２０分行わせた。５ｃＦｖ２結合の相 対量をマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ　Ｃｏ ｒｐｏｒａｔｉｏｎ。

Ｍａｎｌｏ　Ｐａｒｋ、　ＣＡ）を用い４０４−４５０　ｎｍでの光学密度スキ ャニングにより測定した。５ｃＦｖ２の結合は、発色の同時低下を伴うビオチニ ル化ＣＣ４９の結合の低下をもたらした。

ＳＯ３−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロッティングＳＤＳ　−ＰＡＧＥ分析のため のサンプル（２０μｌ）を、非還元用サンプル調製バッフｙ　−３ｅｐｒａｓｏ ｌ　Ｉ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　５ｅｐａｒａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＩＳ Ｓ）。

Ｎａｔｉｃｋ、　ＭＡ）の中で５分間煮沸することにより調製し、そして１０− ２０％勾配のポリアクリルアミドＤａｉｉｃｈｉ　Ｍｉｎｉｇｅｌにその製造者 の仕様書（ＩＳＳ）に従って載せた。

電気泳動は、Ｍｉｎｉ　２−ゲル装置ｔ（Ｉｓｓ）を用い、ゲル当り５５ｍＡで 、一定の電流で約７５分行った。ゲルをクマジーブリリアントブルーＲ−２５０ （Ｂｉｏ−Ｒａｄ、　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　ＣＡ）の中で少なくとも１時間染色 し、次いで脱色した。分子量標準品は予め染められており（Ｍｉｄ　Ｒａｎｇｅ ｋｉｔ、　Ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｅｄ　Ｂｉｏｔｅｃｈ、　Ｎｅｗｔｏｎ　Ｃｅｎ ｔｅｒ、　ＭＡ）、そして下記のタンパク質を含んでいた：ホスホリラーゼｂ１ グルタメートデヒドロゲナーゼ、オバルブミン、ラクテートデヒドロゲナーゼ、 炭酸アンヒドラーゼ、Ｂ−ラクトグロブリン及びチトクロームＣ０対応の分子量 はそれぞれ９５．０００．５５．０００．４３．０００．３６．０００．２９． ０００．１８．４００及び１２．４００である。

ウェスタン分析を行うとき、デュブリケートのゲルも泳動した。

電気泳動後、ゲルの一方を陽極バッファー＃１（０，３Ｍのトリス−ＨＣｌ、　 ｐＨ１０，４）の中で１５−２０分平衡にした。Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ　ＰＶ ＤＦ　（ポリビニリデンジクロリン）膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、　Ｂｅｄｆｏｒ ｄ、　ＭＡ）をメタノールで２分処理し、そして水の中に２分浸した。その膜を 次に陽極バッファー＃ｌの中で３分平衡にした。Ｍｉ　１１１ｂｌｏｔ　−ＳＤ Ｅ装置（Ｍｉｌｌｉ−ｐｏｒｅ）を、ゲルの中のタンパク質をこの膜に転写する ために用いた。

−滴の陽極バッファー＃ｌを陽極電極面の中央に載せた。Ｗｈａｔｍａｎ３ＭＭ 濾紙のシートを陽極バッファー＃１の中に浸し、そしてその電極面の上に滑らか に置いた。陽極バッファー＃２（２５ｍＭのトリス、ｐＨ１０，４）の中に浸し た別の濾紙を一枚目の上に載せた。次に濡れたＰＶＤＦ膜を加え、平衡ゲルをそ の上に載せ、そして最後に陰極バッフｙ　（４０ｍＭのグリシン中の２５ｍＭの トリスＨＣＩ、　ｐＨ９，４）の中に浸した濾紙のシートを加えることによって サンドイッチを作った。転写は２５０ｍＭの定常電流（初期電圧は８〜２０ボル トに範囲した）を用いて３０分て達せられた。

プロットした後、その膜を水の中で簡単にすすぎ、そして２０ｍ１のブロッキン グ溶液（トリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）中の１％の牛血清アルブミン（ＢＳＡ）＜ Ｓｉｇｍａ、　Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ））を有する皿の中に入れた。ＴＢＳ はＰｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、　ＩＬ）より、予備 秤量粉末として購入し、５００ｍ１の水を加えたとき、その混合物は２５ｄのト リス、０．１５Ｍの塩化ナトリウム溶液、ｐＨ７，６を供する。これらの膜を最 少限１時間、周囲温度でブロックし、そして２０ｍ１づつの０．５％のツイーン ２０洗浄液（ＴＴＢＢ）を用いて５分間３回洗った。ＴＴＢＢを調製するには、 ０、５ｍｌのツイーン２０（Ｓｉｇｍａ）をＴＢＳのリッター当り混合した。使 用したプローブ抗体は２０ｍ１のビオチニル化ＦＡＩＤ　１４溶液とした（１０ Ｍｇ／２０ｍ１の抗体バッファ−）。抗体バッファーはｌｏｏｍｌのＴＴＢＳ当 りＩｇのＢＳＡを加えることにより作った。周囲温度で３０〜６０分プローブし た後、その膜を上記の通りＴＴＢＳで３回洗った。

次に、その膜を周囲温度において３０〜６０分、抗体バッファーの中でｌ：５０ ０希釈率のアルカリホスファターゼの抱合されたストレプトアビジン（Ｓｏｕｔ ｈｅｒｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ、　Ｂｉｒｍｉ ｎｇｈａｍ。

ＡＬ）　２０ｍ１とインキュベートした。洗浄工程を上記の通り、この後繰り返 した。発色反応の前に、膜を炭酸アルカリバッファー（２０ｍｌ）の中で２分洗 った。このバッファーは０．１Ｍの炭酸水素ナトリウム、１ｍＭのＭｇＣＩｚ・ Ｈ２Ｏ，ｐＨ９，８とした。アルカリホスファターゼにとつての基質を作るため 、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）クロリド（５０ｍｇ、　Ｓｉｇｍａ） を７０％のジメチルホルムアミドの中に溶かした。５−ブロモ−４−クロロ−３ −インドイルホスフェート（ＢＣＩＰ０２５ｍｇ。

Ｓｉｇｍａ）を別に１００％のジメチルホルムアミドの中に溶かした。５−ブロ モ−４−クロロ−３−インドイルホスフェート（ＢＣＩＰ）（２５ｍｇ。

Ｓｉｇｍａ）を別に１００％のジメチルホルムアミドの中に溶かした。これらの 溶液も、Ｐｒｏｍｅｇａよりウェスタン発色剤として市販されている。

発色のため、それぞれ１２０μｌを上記のアルカリ溶液に加え、そして１５分間 反応させ、次いで発色膜からそれらを水で洗い流した。

ビオチニル化ＦＡＩＤ　１４ ＦＡＩＤ　１４は、ＣＣ４９に対して特異的な、ＡＴＣＣＮｏ、ＣＲＬ１０２５ ６として寄託されているネズミの抗−イディオタイプ抗体（ＩｇＧ２ａ、　Ｋア イソタイプ）である。ＦＡＩＤ　１４をＮｙｇｅｎｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａアフ ィニティーカラム（Ｙｏｎｋｅｒｓ、　ＮＹ）を用いて精製した。製造者のプロ トコールに従ったが、ただし溶離バッファーとして０．１Ｍのクエン酸ナトリウ ム、ｐｉ（３，０を用いた。画分を１．０Ｍのトリス−１（ＣＩ　ｐＨ９，０を 用いてｐ）Ｉ〜７に中和した。ビオチニル化反応は下記の通りに設定した。ＰＡ ＩＤ　１４（１ｍｇ、水の中で１００μｍ）を１００μｍの０．１ＭのＮａ２Ｃ Ｏｉ、　ｐＨ９，６と混合した。ビオチニル−ｅ−アミノ−カプロン酸Ｎ−ヒド ロキシスクシニミドエステル（Ｂｉｏｔｉｎ−Ｘ　−ＮＨＳＸＣａｌｂｉｏｃｈ ｅｍ、　ＬａＪｏｌｌａ。

ＣＡ）　（２，５ｍｇ）を０．５ｍｌのジメチルスルホキシドの中に溶かした。

Ｂｉｏｔｉｎ　−Ｘ−ＮＨ３溶液（２０μｍ）をＦＡＩＤ　１４溶液に加え、そ して２２°Ｃで４時間反応させた。過剰のビオチン及び不純物を、Ｐｈａｒｍａ ｃｉａＳｕｐｅｒｏｓｅ　１２　ＨＲＩＯ／３０カラム（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ 、　ＮＪ）を用いてゲル濾過により除去した。０．８μｌ／ｍｉｎの流速で、ビ オチニル化ＦＡ［Ｄ　１４は１６．８ｍ１ｎのピークで出現した。このピークを 構成する画分をプールし、モして４°Ｃで保存し、そしてＣＣ４９ＶＬ及びＶ、 ＣＤＲにより決定されるＣＣ４９イデイオタイプを検出するのに用いた。

等電点電気泳動（ＩＥＦ） 等電点（ｐｌ）は、ＤＮＡ５ＴＡＲ（Ｍａｄｉｓｏｎ、　Ｗｌ）を介して入手で きるＰＲＯＴＥ　ＩＮ−Ｔ　ＩＴＲＡＴＥという名のコンピュータープログラム を用いて推定した。入力しである配列によるアミノ酸組成に基づき、ｐｌに加え てＭＷ値が得られた。Ｃｙｓ残基は電荷に寄与するため、Ｃｙｓについての計数 は０に調整し、なぜならそれらは全てジスルフィド結合に関与するからである。

実験的にｐｌを、ＩｓｏｇｅｌアガロースＩＥＦプレート、ｐｌ域３〜１０（Ｆ ＭＣＢｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、　Ｒｏｃｋｌａｎｄ、　ＭＥ）を用いて決定した 。Ｂｉｏｒａｄ　Ｂｉｏ−ｐｈｏｒｅ−ｓｉｓ水平電気泳動セルを、　ＩＥＦを 行うのに用い、両者の製造者の仕様書に従った。電気泳動条件は、５００ボルト （限界）　、　２０ｍＡの電流及びＩＯＷの定常電力とした。等電点泳動は９０ ｍ１ｎで完了した。ＩＥＦ標準品はＢｉｏｒａｄより購入した。そのキットはフ ィコシアニン、β−ラクトグロブリンＢ１牛炭酸アンヒドラーゼ、ヒト炭酸アン ヒドラーゼ、馬ミオグロビンヒトヘモグロビンＡ及びＣ，３レンチルレクチン及 びチトクロームＣを含み、それとのｐｌ値は４：６５．５，１０．６．００゜６ ．５０．７，００．７．１０及び７．５０．７．８０．８．００並びに８．２０ 及び９．６０である。

ゲルを、ＦＭＣにより供給された仕様書に従って染色及び脱色した。

ＣＣ４９抗体種の定量 ＩｇＧ、　５ｃＦｖ２の種および単量体５ｃＦｖを含む精製ＣＣ４９抗体はすべ て、適合している１、　０ｃｍ光路長の石英製キュベツト（Ｈｅｌｌｍａ社）お よびＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　ＵＶ／ＶＬＳ分光光度計５５２Ａ型を用いて、 タンパク質希釈液の２８０ｍｍ波長光の吸光度を測定して定量した。モル吸光係 数（Ｅ、）は、各抗体について、下記式を用いて測定した。

Ｅ、　＝（Ｔｒｐ数）　Ｘ５．５００　＋ＣＴｙｒ数”）　Ｘｌ、３４０　＋（ （ＣＶＳ）２数）Ｘ１５０十（Ｐｈｅ数）ＸＩＯ これらの値は、Ｄ、Ｂ、Ｗａｔｌａｕｆｅｒ、　Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｐｒ ｏｔｅｉｎ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ。

１７巻、３７５〜３７８頁に記載されている情報に基づいている。

高性能液体クロマトグラフィー ＣＣ４９ｓｃＦｖ２を精製するために行った高性能液体クロマトグラフィーには すべて、全体にチタンまたはテフロン製配管を用いたＬＫＢ）（ＰＬＣシステム を使用した。このシステムは、２１５０型）ＩＰＬＣポンプ、２１５２型制御器 、２７６ｎｍの吸光度に設定されたＵＶ　Ｃ０ＲＤ　ＳＩＩ　２２３８型検出装 置および２２１１型５ｕｐｅｒＲａｃ　ｆｒａｃｔｉｏｎ　ｃｏｌｌｅｃｔｏｒ で構成されている。

サブユニットのＰＣＲによる製造 ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）はすべて、　１５０ピコグラム（ｐｇ）のプラ スミド標的（ｐｓｃＦＶｔＪＨＭ）　；　ｔｏｏピコモルのプライマー；１μｍ のＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−Ｃｅｔｕｓ社（米国、コネティカット州、ノーウ オーク所在のＰＥＣ社）のＡｍｐｌｉ−Ｔａｇポリメラーゼ、１６μＬの１０ｍ Ｍ　ｄＮＴＰおよびｌＯμＬのＩＯＸ緩衝液（両者ともにＰＥＣキットに提供さ れている）：ならびに合計容積を１００μＬにするのに充分な水で構成された反 応混合物で行った。ＰＣＲ反応はメーカーが記載しているのとほとんど同様にし て行った。これらの反応は、ＰＥＣ９６００型サーモサイクラ−（ｔｈｅｒｍｏ ｃｙｃｌｅｒ）を用いて３０サイクル行ったが、そのｌサイクルは、９４℃で２ ０〜４５秒間のＤＮＡの変性；５２〜６０°Ｃで０．５〜１．５分間のアニーリ ングおよび７２℃で０．５〜２．０分間の伸長で構成されている。オリゴヌクレ オチドのプライマーは、Ａｐｐｌｉｅｄ　ＢｉＢ１０５ｙＳｔｅ社（米国・カリ フォルニア州、ホスター・シティ所在）の３８０Ａ型もしくは３９１型ＤＮＡ合 成器で合成し次いで上記のようにして精製した。

リゲーション １１００ｎのベクターＤＮＡおよび対応する１：ｌ化学量論的当量のインサート ＤＮＡを用いるリゲーション反応を、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社（米国。

カリフォルニア州、う・ホーヤ所在）の７４　ＤＮＡリガーゼキットを用い、該 メーカーの指示にしたがって行った。リゲーション反応物（全容積２０μＬ）は 最初１８°Ｃでインキュベートし、次いで一夜４℃まで徐々に冷却した。

形質転換は、１００μＬのＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社の大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　 ＡＧＩ　：１ンビテント細胞（米国、カリフォルニア州、う・ホーヤ所在のＳｔ ｒａ−ｔａｇｅｎｅ社）を用い、メーカーの指示によって行った。上記リゲーシ ョン反応物由来のＤＮＡ（１〜５μＬ）を使用した。形質転換ステップの後、細 胞は、混合を続けながらルリアブロス（ＬＢ）中で３７℃で１時間再生させ、続 イテ、ｐｓｃＦＶＵＨＭ、　ｐ４９ＬＨＬＨもしく　ｌ；！　ｐ４９ＬＨ）ＩＬ ニ用いる２０℃ｇ／ｍＬのクロラムフェニコール含有（ＣＡＭ２０）ルリア寒天 上にプレートし、またはプラスミドＩ］５Ｌ３０１を含有するクローンもしくは ｐｓＬ３０１由来のその後の構築物に用いる１００μｇ／ｍＬアンピシリン（Ａ ＭＰｌｏｏ）ルリア寒天プレート（ＬＢ−ＡＭＰｌｏｏ）上にプレートした。

大腸菌クローンのスクリーニング 細菌プラスミドは、Ｐｒｏｍｅｇａ社（米国、ウィスコンシン州、マディラン所 在）のＭａｇｉｃミニ−ブレツブプラスミド製造キットを用いて、淘太圧（ｓｅ ｌｅｃｔｉｏｎ　ｐｒｅｓｓｕｒｅ）を維持するため適切な薬剤を含有するＬＢ ツブス培養物から単離した。このキットはメーカーの取扱い説明書にしたがって 使用した。

プラスミドの構築 ｐ４９ＬＨＬｌ（およびｐ４９ＬＨＨＬと命名された２種のプラスミドを、多価 の一本鎖抗体を製造するために構築した。ｐ４９ＬＨＬＨを含有する宿主細胞は 、ＶＬ−Ｌ−Ｖ□−Ｌ−ＶＬ−Ｌ−Ｖ−で表すことができるポリペプチドを産生 じた。ここでｖＬとＶＨはＣＣ４９抗体の軽鎖と重鎖の可変領域であり、および リンカ−（Ｌ）は、下記ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ　＋　５の配列を有する２５個のア ミノ酸のリンカ−である。

Ｌｅｕ−Ｓｅｔ−Ａ　１ａ−Ａｓ　ｐ−Ａｓ　ｐ−Ａ　Ｉａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ− Ａｓ　ｐ−Ａ　１ａ−Ａ　Ｉａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｓ　ｐ|Ａｓ　ｐ− Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ− Ｌｅｕｐ４９ＬＨＨＬを含有する宿主細胞は、ＶＬ−Ｌ−Ｖ、−Ｌ−Ｖ、−Ｌ− ＶＬ　テ考すコトができるポリペプチドを産生じた。こ−でＶＬとＶＨはＣＣ４ ９抗体の軽鎖と重鎖の可変領域であり、およびＬは上記アミノ酸配列を有するペ プチドリンカ−である。

ＣＣ４９ＶＬ−Ｌ−Ｖｓ−Ｌ−ＶＬ−Ｌ−Ｖ、（ｐ４９ＬＨＬＨ）ノヌクレオチ ド配列（ＳＥｏ　１０　ＮＯ：６）とアミノ酸配列（ＳＥＱ　１０　ＮＯ：　７ 　’）を図６に示す。ＣＣ４９ＶＬ−Ｌ−Ｖ、−Ｌ−Ｖ、−Ｌ−ＶＬ（ｐ４９Ｌ ｌ（ＨＬ）（７）　：（り１ｚ　オチド配列（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　８　）お よびアミノ酸配列（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　９　）を図７に示す。

ｐｓＬ３０＋ＨＴの構築 ｐｓＬ３０１ＨＴの構築を図８に示す。バシラス・リヘニフォルミス（Ｂａｃｉ ｌｌｕｓ　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のベニシリナーゼＰ　（ｐｅｎＰ）タ ーミネータ−の配列を、Ｎｈｅ　ＩおよびＢａｍ１（Ｉで４５分間消化すること によって、ｐｓｃｐｖ　［ＪＩ（Ｍと命名されたプラスミドから取出し、電気泳 動を行った後４．５％ポリアクリルアミドゲルから切取り、電気溶出させ、エタ ノールで沈澱させ、次に、同様に製造されたベクター：　ｐｓＬ３０１　（米国 、カリフォルニア州、サンディエゴ所在のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中の同じ部 位に連結した。ｐｓｃＦＶ　ｔＪｌ（Ｍの製造手順は、１９９２年８月２１日付 は出願の米国特許願第０７／９３５．６９５号に記載されている。なおこの出願 の開示事項は本願に援用するものである。一般に、ｐｓｃＦＶ　ＵＨＭは、ｐｅ ｎＰプロモーターのヌクレオチド配列；固有Ｎｃｏ　Ｉ制限部位；　ＣＣ４９Ｖ Ｌ領域；　ＨｉｎｄｌＩ［制限部位：２５個のアミノ酸のリンカ−；固有Ｘｈｏ 　Ｉ制限部位；　ＣＣ４９Ｖ、領域；　ＮｈｅＩ’制限部位；　ｐｅｎＰターミ ネータ−；およびＢａｍｔ（Ｉ制限部位を含有している（図８参照）。このｐｅ ｎＰプロモーターとｐｅｎＰターミネータ−は、Ｍｅｚｅｓら、　Ｊ、Ｂｉｏｌ 、Ｃｈｅｍ、、　２５８巻、１１２１１−１１２１８頁、１９８３年に記載され ている。

上記のリゲーション反応物の一部（３μＬ）を、ＬＢ−ＡＭＰ１００寒天プレー ト上にプレートし次いで一夜増殖させたコンピテント大腸菌ＡＧＩ細胞を形質転 換するのに用いた。ｐｅｎＰターミネータ−、インサートを含有するポテンシャ ルクローンを、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社（米国、メリーランド州、ガイサーズバー グ所在）のＴ７　Ｑｕｉｃｋｐｒｉｍｅ　”Ｐ　ＤＮＡ標識キットと、Ｂｕｌｕ ｗｅｌｓら、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、１７巻、　４５ ２頁、１９８９年に記載されているマイクロ波によるコロニー溶解法をともに用 いてスクリーニングした。プローブは、ｐｅｎＰ　−Ｎｈｅ　Ｉ　−ＢａｍＨＩ ターミネータ−フラグメント自体であるが、Ｑｕｉｃｋｐｒｉｍｅキットによっ て提供された指示によって製造し使用した。陽性プローブであり、かつＢａｍＨ ＩおよびＮｈｅ　Ｉによる消化物由来の２０７個の塩基対挿入断片（図６に示す １９５８〜２１６５の塩基対（ｂｐ））を含有するクローンをｐｓＬ３０１Ｔと 命名し、次いでＣＣ４９ＶＨに対するヌクレオチド配列を含有するｐｓＬ３０ｔ ＨＴを構築するのに選択した。　Ｎｈｅ　Ｉ　−ＢａｍＨＩ　ｐｅｎＰターミネ ータ−をｐｓＬ３０１中に配置した理由は、そのＮｈｅ　ＩとＢａｍ）Ｉ　Ｉの 部位の間のポリリンカー領域中に存在するＥｃｏ４７Ｉ［制限エンドヌクレアー ゼ部位を除くためであった。このことは、Ｅｃｏ４７１１［部位が、構造体中に 各連続Ｖ領域を配置するのにユニークである必要があるｖＬとｖＨの領域を続い て構築するため設計された。各Ｖ領域がＥｃｏ４７Ｉ［［−ＮｈｅＩ部位に付加 されると、Ｅｃｏ４７Ｉ［Ｉは各場合に破壊されて、ユニーク挿入断片に入って くる次のＥｃｏ４７Ｉ［［部位を形成した。

■Ｈ配列は、ＰＣＲ増幅の標的としてｐｓｃｐｖ　ＯＨＭを用い、オリゴの５　 ’　５ＣＰＩと３′オリゴ５ＣＰ５によってＰＣＲで作製した。５ＣＰＩに対す るＤＮＡ配列（ＳＥＱ　［ＯＮＯ：　１０）と５ＣＰ５に対するＤＮＡ配列（Ｓ ＥＱ　１０　ＮＯ：　１１）は次のとおりである。

５ＣＰ５　：　５’　−ＴＡＡＡ　ＧＣＴ　ＡＧＣＡＣＣＡ　ＡＧＣＧＣＴ　Ｔ ＡＧ　ＴＧＡ　ＧＧＡ　ＧＡＣＧＧＴ　ＧＡＣＴｕＡ　ＧＧs−３’ 下線をつけた部分はエンドヌクレアーゼ制限部位を示す。

増幅されたＶ、ＤＮＡを、４％のＰＡＧＳ電気溶出、エタノールによる沈澱およ び２０μＬ水への溶解によって精製した。そのｖＨ配列をＸｈｏ　ＩとＮｈｅ　 Ｉの制限酵素で消化し、同じ制限酵素で消化され続いて精製された１）ＳＬ３０ １Ｔベクターに対するインサートとして用いた。

標準のリゲーション反応を行い、次いで一部分（４μＬ）を用いてコンピテント 大腸菌ＡＧＩ細胞を形質転換させた。形質転換された細胞を、ＬＢ　ＡＭＰ１０ ０寒天プレート上にプレートした。ＣＣ４９Ｖ、インサートを含有していること を示す候補的クローンをＮｈｅ　ＩおよびＸｈｏＩ消化スクリーンから取出した 。

Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　（ＵＳＢ）社（米国、 オハイオ州クリーブランド所在）の５ｅｑｕｅｎｃｅ　Ｋｉｔ、および配列決定 用プライマーｐｓＬ３０１ｓＥＱＢ　（ｐｓＬ３０１ベクター中、Ｘｈｏ　Ｉ部 位から５７ｂｐ上流においてアニールした２１ｂｐの配列決定プライマー）とＣ Ｃ４９ＶＨＰを用いて、ＤＮＡの配列決定を行って、ＣＣ４９Ｖ、の配列を確認 し、Ｉ）ＳＬ３０１ＨＴ中に正しいＣＣ４９ＶＨ配列を存するクローンを明らか にした。このプラスミドはＩ）Ｓｌ２Ｏ３−ＨＨＬＴおよびｐｓＬ３０１−　Ｈ ＬＨＴの両者を構築するときの出発点で使用した。使用した配列決定用のオリゴ をこ＼に示す。

ｐｓＬ３０１３ＥＱＢ（ＳＥＱ　１０　ＮＯ：　１２）およびＣＣＣ４９Ｖ　（ ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　１３）のオリゴヌクレオチド配列は次のとおりである。

ｐｓＬ３０１ｓＥＱＢ　：　５’　−ＹＣＧ　ＴＣＣＧＡＴ　ＴＡＧ　ＧＣＡ　 ＡＧＣＴＴＡ−３’ＣＣ４９ＶＨＰ　：　５’　−ＧＡＴ　ＧＡＴ　ＴＴＴ　Ａ ＡＡ　ＴＡＣＡＡＴ　ＧＡＧ−３’実施例１　ｐ４９ＬＨ１（Ｌの構築 ｐｓＬ３０１ＨＴ　（５ｔｔ　ｇ　）を出発物質として用い、これをＥｃｏ４７ ｎ［およびＮｈｅ　Ｉで消化し、大きい方のベクターフラグメントを精製した。

ＣＣ４９Ｖ、挿入フラグメントは、５′オリゴとして５ＣＰＧＣを用いかつ３′ オリゴとして５ＣＰ５を用い、ＰＣＲによって製造した。５ＣＰ６Ｂのヌクレオ チド配列（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　１４）は下記のとおりである。

５ＣＰ６Ｂ　：　５’　−Ｔ航１■（９）Ａ　ＧＡＴ　ＧＡＣ厖ＭＧ黒ＧＡＣ隠 ＧＣＴＡＡＡ黒ＧＡＣＧＡＴＧＣＣＡＡＡ　ＭＧ　ＧＡＴ　ＧＡＣＧＣＣＭＧ　 ＡＡＡ　ＧＡＴ　ＣＴｒ　ＧＡＧ　ＧＴＴ　ＣＡＧ　ＴＴＧ　ＣＡＧ　ＣＡＧＴ ＣＴ−Ｇ’ またオリゴ５ＣＰＧＢはリンカ−のコーディング領域の一部（ＳＥＱ　ＩＤＮ０ 　：　１４（７）ｂｐ　８〜７６）を含有しテイル。ｐＳＣＦＶ　ＯＨＭ中（７ ）　ＣＣ４９ＶＨ標的でアニールするよう設計された該オリゴの部分は、ＳＥＱ 　ＩＤ　Ｎｏ　：　１４中のｂｐ７７〜９０由来のものである。

下線をつけた配列はＦｓｐＩ部位に相当する。得られたＰＣＲインサートを精製 し、ＦｓｐＩとＮｈｅ　Ｉで消化し次いでｐｓＬ３０１ＨＴ　Ｅｃｏ４７１１［ −Ｎｈｅ　Ｉベクターとのリゲーション反応に用いた（図７）。コンピテント大 腸菌ＡＧＩ細胞を、このリゲーション反応物（３μＬ）で形質転換を行うのに用 い、ＬＢ−ＡＭＰ１００寒天プレート上にプレートした。

ｐＳＬ３０１）ＩＨＴ生成物を示す正しい大きさのＸｈｏ　Ｉ　−Ｎｈｅ　Ｉイ ンサートを有する２個のクローンの配列をオリゴ５ＱＰＩを用いて決定し、正し い配列（図７のヌクレオチド１１２４〜１５４３）を有する単クローンをその後 の構築に用いるのに選んだ。５ＱＰＩのヌクレオチド配列（ＳＥＱ　ＩＤＮｏ　 ：　１６）は下記のとおりである。

５ＱＰＩ　：　５’　−ＴＧ　ＡＣＴ　ＴＴＡ　ＴＧＴ　ＡＡＧ　ＡＴＧ　ＡＴ Ｇ　Ｔ−３’最終のリンカ−ＶＬサブユニット（ｂ１１１５４４〜１９６３、図 ７）は、５′オリゴの５ＣＰ７ｂと３′オリゴの５ＣＰ８ａを用いかつＰＣＲの 標的としてｐＳＣＦＶ　ＵＨＭを用いて製造した。５ＣＰ７ｂ１７）　ヌクレオ チド配列（ＳＥＱ　ＩＤＮ０　：　１７）は下記のとおりである。

５ＣＰ７ｂ　：　５’　−ＴＭＡ　Ｅ　ＧＣＡ　ＧＡＴ　ＧＡＣＧＣＡ　ＭＧ　 ＡＡＡ　ＧＡＣＧＣＡ　ＧＣＴ　ＭＡ　ＡＡＡ　ＧＡＣＧＡs ＧＣＣＡＭ　ＡＡＧ　ＧＡＴ　ＧＡＣＧＣＣＡＡＧ　ＡＡＡ　ＧＡＴ　ＣＴＴ　 ＧＡＣＡＴｒ　ＧＴＧ　ＡＴＧ　ＴＣＡ　ＣＡＧ　ＴＣＴ工 下線をつけたヌクレオチドはＦｓｐ　Ｉ部位である。５ＣＰ８ａのヌクレオチド 配列（ＳＥｏ　１０　ＮＯ：　１８）は下記のとおりである。

５ＣＰ８ａ　：　５’　−ＴＡＡＡ　ＧＣＴ　ＡＧＣＴＴＴ　ＴＴＡ　ＣＴＴ　 ＡＡＧ　ＣＡＣＣＡＧ　ＣＴＴ　ＧＧＴ　ＣＣＣ−３’下線をつけた最初の一組 はＮｈｅ　Ｉ部位に相当し、もう一つの組はＡｆ１１１部位に相当する。５ＣＰ ７０のヌクレオチド８〜７６はリンカ−をコードしく図７のヌクレオチド５４４ 〜１６１２）　、一方ＶＬにアニールするヌクレオチド７７〜９９は図７の１６ １３〜１６３５に相当する。プライマー　５ＣＰ８ａは、その５′末端の短かい テール、Ｎｈｅ　Ｉ制限部位、終止コドン、ＡｆｌＴｌ制限部位およびＶ、の最 後の２１個の塩基を含有している。Ｆｓｐ　ＩとＮｈｅ　Ｉによる消化の後、こ の得られた４２０ｂｐのインサートを精製して精製ｐｓＬ３０ＨＨＴベクターの Ｎｈｅ　ＩとＥｃｏ４７１１［の部位に連結し、候補的なりローンをＮｈｅ　Ｉ とＸｈｏ　Ｉでスクリーニングし、正しい大きさのインサートが確認されかっ４ ９ＬＦＲ２（−）と５ＱＰＩで配列が決定されて、ｐｓＬ３０１ＨｔＩＬＴ中に 新たに挿入された配列が確認された。そのヌクレオチド配列（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ Ｏ：　１９）は下記のとおりである。

４９ＬＦＲ２（−）　：　５’　−ＣＴＧ　ＣＴＧ　ＧＴＡ　ＣＣＡ　ＧＧＣＣ ＡＡ　Ｇ−３’プラスミド１１ＳＬ３０１Ｈ１（ＬＴをＸｈｏ　ＩおよびＮｈｅ 　Ｉで消化し、精製し、得られた１Ｉ７９ｂｐＶＨ−リンカー−Ｖ、−リンカー −ＶＬ上セグメントｐｓｃＦＶ　ＵＨＭＩ：連結しテｐ４９ＬＨＨＬを製造した 。なおコノｐｓｃＦＶ　ＯＨＭは同じ制限酵素て切断されその大きい方のフラグ メントを精製したものである。そのリゲーション反応生成物（４μｍ部分）を用 いてコンピテント大腸菌ＡＧＩ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を形質転換し、 しＢＣＡＭ２０寒天プレートにプレートした。正しい制限酵素地図を有するプラ スミドを含有する単クローンを、ｐ４９ＬＨＨＬを含有させるために選択した。

ｐ４９ＬＨＨＬは、ＣＣ４９多価−重鎖抗体５ｃＦｖ２　：　ＶＬ−Ｌ−ＶＨ− Ｌ−Ｖ、−Ｌ−ＶＬまたはＣＣ４９ｓｃＰｖ２　（ＬＨＨＬ）のｐｅｎＰプロモ ーターとヌクレオチド配列を含有している。

実施例２　：　９４９ＬＨＬＨの構築 ｐ４９ＬＨＬＨの構築を図１１に図式的に示す。リンカ−ＶＬのサブユニットを ５′オリゴの５ＣＰ７ｂと３′オリゴの５ＣＰ９で製造した。

５ＣＰ９　：　５’　−ＴＡＡ　ＡＧＣＴＡＧ　ＣＡＣＣＡＡ　ＧＣＧ　ＣＴＴ 　ＡＧＴ　ＴＴＣＡＧＣＡＣＣＡＧＣＴＴＧ　ＧＴＣＣＣＡ　Ｇ−３’５ＣＰ７ ｂオリゴ（ヌクレオチド８〜７６）は図６のリンカ−をコードしくヌクレオチド １１２４〜１１９２に相当する）および図６のＶＬのヌクレオチド１１９３〜１ ２１５＋１ｍ相当する、ＰＣＲｉ：：対す６１）ＳＣＦＶ　０８Ｍ標的（ヌクレ オチド７７〜９９）にアニールした。

５ＣＰ９は、Ｎｈｅ　Ｉ部位（第一の下線をつけたヌクレオチド）とＥｃｏ４７ Ｉ［部位（第二の下線を付けたヌクレオチド）を有し、これらの部位は次のＶ領 域を受けるための１）ＳＬ３０１ＨＬＴを作るのに必要な制限部位である。５Ｃ Ｐ９のヌクレオチド１８〜２３は図６のヌクレオチド１５３２〜１５３７　（リ ンカ−の最初の２個のアミノ酸をコードしている）に相当し、一方ヌクレオチド ２４〜４６は、ＰＣＲにおける５ＣＰ９のアニーリング領域である図６に示すヌ クレオチド１５０８〜１５３１に相当する。

プラスミドｐｓＬ３０１ＨＴをＥｃｏ４７１１［とＮｈｅ　Ｉで消化し、そして その大きい方のベクターフラグメントは精製して、予めＦｓｐＩとＮｈｅ　Ｉで 処理され精製された、ＰＣＲからのリンカー−ＣＣ４９ＶＬ　ＤＮＡインサート と連結させる。その連結混合物（３μＬ）を用いて大腸菌ＡＧＩコンピテント細 胞を形質転換し、次いで正しいＸｈｏ　Ｉ　−Ｎｈｅ　Ｉの大きさのフラグメン トを有する一つのコロニーの配列をオリゴＰＥＮＰＴＳＥＱ２を用いて決定した 。そのヌクレオチド配列（ＳＥＱ　ｒＤ　ＮＯ：　２１）は下記のとおりである 。

５’　−ＴＴＧ　ＡＴＣＡＣＣＡＡＧ　ＴＧＡ　ＣＴＴ　ＴＡＴ　Ｇ−３’配列 決定の結果は、得られたｐｓＬ３０１ＨＴクローン中にＰＣＨの誤まりと欠失が あるということを示した。図６にみられるヌクレオチド１５３３〜１５３７に相 当する５個の塩基の欠失がみとめられ、そしてＴであるべきはずのヌクレオチド １５３１はＤＮＡ配列のデータから確認したところ実際にはＧであった。得られ た配列は、５′・・・ＧＡＡＧＣＧＣＴＴ・・・であった。

こ−で下線をつけた配列は偶然にＥｃｏ４７１１［部位を形成した。図６のＡＧ ＣＯＣＴの配列はヌクレオチド１５３０．１５３１．１５３２．１５３８．１５ ３９および１５４０に相当する。この誤まりは次のステップで修正され、オリゴ ５ＣＰ６Ｃの末端に５塩基の欠失を組込むことにによってｐｓＬ３０１　ＨＬＨ Ｔを製造した。

５ＣＰ６Ｃ：　５’　−ＴＡＡＧＣＧＣＴＧＡＴＧＡＴＧＣＴＡＡＧＡＡＧＧＡ ＣＧＣＣＧＣＡＡＡＡＡＡＧＧＡＣＧＡＣＧＣＡＡＡＡＡＡＡＧＡＴＧＡＴＧＣ ＡＡＡＡＡＡＧＧＡＴＣＴＧＧＡＧＧＴＴＣＡＧＴＴＧＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＡ Ｃ−３’５ＣＰ６Ｃ中の下線をつけた配列はＥｃｏ４７Ｉ［部位に相当する。Ｐ ＣＨにおいて、５ＣＰ６Ｃは５′オリゴとして用いられ一方５ＣＰＩＯは３′オ リゴとして用いられて、リンカ−ＣＣ４９Ｖ、セグメントが生成する。

５ＣＰＩＯのヌクレオチド配列（ＳＥＱ　ＩＤＮ０　：　２３）は下記のとおり である。

５ＣＰＩＯ：　５’　−ＴＴＧ　ＴＧＣＴＡＧ　ＣＴＴ　ＴＴＴ　ＡＴＧ　ＡＧ Ｇ　ＡＧＡ　ＣＧＧ　ＴＧＡＣＴＧ　ＡＧＧ　ＴＴ−３’ ５ＣＰＩＯ中の下線をつけた配列は図６のヌクレオチド１９５８〜１９６３に見 られるＮｈｅ　Ｉ部位に相当する。この場合、ＰＣＲインサートはＮｈｅＩだけ で消化され次いで精製される。ベクター（１）ＳＬ３０１ＨＬＴ）はＥｃｏ４７ １１１部位（先に形成されている）およびＮｈｅ　Ｉ部位で消化され次いで精製 された。そのインサートとベクターは連結され、その一部分（３μＬ）を使って コンピテント　イー・コリＡＧＩ細胞を形質転換した。

この形質転換細胞をＬＢ−ＡＭＰ１００プレート上にプレートし次いで候補的ク ローンをＸｈｏ　ＩとＮｈｅ　Ｉでスクリーニングした。正しい大きさのＤＮＡ を有する３個のクローンを得た。これらのクローンのうちの２個は、オリゴ４９ ＶＬＣＤＲ３（＋）および５ＱＰＩを用いて配列を決定した。

ソノヌクレオチド配列（４９ＶＬＣＤＲ３（＋）　（７）　ＤＷＱ　１０　Ｎｏ 　：　２４）　ｌ；！下記のとおりである。

４９ＶＬＣＤＲ３（＋）　：　５’　−ＣＡＧ　ＣＡＧ　ＴＡＴ　ＴＡＴ　ＡＧ ＣＴＡＴ−３’正しい配列を有する一つのクローンが得られ、そして図６のヌク レオチド１５３３〜１９６３からの配列が確認され、正しいｐｓＬ３０１ＨＬＨ Ｌクローンを示した。

大腸菌中で発現させるのに用いる最終的なプラスミドｐ４９Ｌｌ（ＬＨを製造す るために、ｐｓＬ３０１）ＩＬＨＴ　（５ｕ　ｇ　）をＮｈｅ　ＩとＸｈｏ　Ｉ で消化し、次いて■。−Ｌ−ＶＬ−Ｌ−Ｖ、配列を含有する小さい方のインサー トを精製した。コノ断片を、ｐｓｃＦＶ　ＬＩＨＭ（５ｕ　ｇ　）をＸｈｏ　Ｉ とＮｈｅ　Ｉ　テ消化して得た大きい方のベクターフラグメントの精製物と連結 した。上記連結混合物の一部（４μＬ）を使ってコンピテント大腸菌ＡＧＩ細胞 を形質転換した。得られた形質転換混合物をＬＢ　−ＣＡＭ２０プレート上にプ レートし、次いでｐ４９ＬｔｌＬＨに対する代表的なりローンを、正しい制限酵 素地図（図１Ｏ参照）およびＴＡＧ−７２に対する生物活性に基づＣＣ４９の共 有結合した一本鎖二量体（ｓｃＦｖ２）の精製を行うために、大腸菌のペリプラ ズマ細胞質の画分を、１１４９ＬＨＬＨと９４９ＬＨＨＬの両者の１．ＯＬの一 夜培養物から調製した。要約すると、培養物を２５０ｍＬづつの４部分に分割し 、５ｏｒｖａｌｌ　ＧＳ　−３ロータで１０分間５０００ｒｌ１ｍで遠心分離し た。ペレット化した細胞を洗浄し、３０ｍＭ　ＮａＣ１を含有する１０ｍＭ　ト リス−ＨＣｌ　ｐＨ７，３からなる１００ｍＬ中に再懸濁させた。細胞を再びペ レット化し、合計１００ｍＬの３０ｍＭ　トリス−ＨＣｌ　ｐＨ３で洗浄し、そ して一つのチューブにプールした。このチューブに、４０ｗ／ｖ％のスクロース を含有する３０ｍＭ　’ｒ−リスー〇Ｃ１，ｐＨ７，３（１００ｍＬ）および１ ゜ｍＭ　ＥＤＴＡ　ｐＨ７，５（２，０ｍＬ）を添加した。得られた混合物を、 時々振盪しながら、室温に１０分間保持した。高張性細胞（ｈｙｐｅｒｔｏｎｉ ｃ　ｃｅｌｌ）を前記のようにしてペレット化した。次のステップでショックを 与えて、該ペレットを２０ｍＬの水冷０．５ｍＭ　ＭｇＣ１ｔ中に速やかに懸濁 させ、次いで時々振盪しながら氷上に１０分間保持した。その細胞を前記のよう にしてペレット化し、大腸菌の周辺細胞質の画分を含有する上澄み液を、０．２ μｍのＮａｌｇｅ社（米国、ニューヨーク州、ロチェスター所在）の濾過装置で 濾過することによってさらに清澄にし、次いでＡｍｌｃｏｎ社（米国、マサチュ ーセッツ州、ダンバース所在）のＣｅｎｔｒｉｐｒｐ　３０およびＣｅｎｔｒｉ ｃｏｎ　３０で１．０ｍＬより小さい容積まで濃縮した。

ｐ４９Ｌｌ（ＬＨまたはｐ４９ＬＨＨＬのクローン由来の濃縮周辺細胞質のショ ケート（ｓｈｏｃｋａｔｅ）を、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社（米国、ニューシャーシ ー州。

ビス力タウエイ所在）の５ｕｐｅｒｄｅｘ　７５　）ＩＲ１０／３０　ＨＰＬＣ カラム（予めＰＢＳで平衡化させたもの）に注入した。競合ＥＬＩＳＡ法で測定 する場合、問題の生成物は０．５ｍｌ／分の流量で２１〜２４分間放出させた。

活性画分をプールし、先に述べたようにして濃縮し、次に、システム５００　Ｍ ｉｃｒｏｄｉａｌｙｚｅｒ　Ｕｎｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａ１社）を 用い、緩衝液を３〜４回変えなから８０００ＭＷカットオフ膜を使用して、２０ ｍＭ　トリス−ＨＣｌ　ｐＨ７，６に対して一夜透析を行った。その試料をＰｈ ａｒｍａｃｉａ社のＭｏｎｏ　Ｑ　ＨＲ５／　５アニオン交換ＨＰＬＣカラムに 注射した。緩衝液入として２０ｍＭ　）リス−ＨＣｌ　Ｉ）８７．６を用い、緩 衝液Ｂとして２０Ｍトリス−ＨＣｌ　ｐｆ（７，６＋０．５Ｍ　ＮａＣ１を用い る勾配プログラムを、１．５ｍｌ／ｍｉｎの流量で使用した。問題の生成物は、 競合ＥＬＩＳＡ法で測定する場合、各々３〜４分間カラムから放出させた。この 時点の画分の、二つのＳＯＳ　−ＰＡＧＥゲルによる分析で、一方のゲルはクー マシープリリアントブルーＲ２５０で染色し、他方のゲルはウェスタン分析（プ ローブ抗体としてビオチニル化ＰＡＩＤ　１４を使用）に移されたが、５ｃＦｖ ２（ＬＨＬＨまたはＬＨＨＬ）の種の計算分子量の単一バンドが、５８．２３９ ダルトンの位置に出現した。活性画分は各場合濃縮し、５０ｍＭ　ＭＥＳ　Ｉ） ８５．８に対して一夜透析し、次いでＰｈａｒｍａｃｉａ社のＭｏｎｏ　Ｓ　Ｈ Ｒ５／　５カチオン交換カラムに注射した。この精製ステップからの問題の二つ の画分の５と６は、５ＤＳ−ＰＡＧ法およびＥＬＩＳＡ法で測定する場合、勾配 液の使用が開始される直前に溶出された。したがってこれらの画分は実際にはカ ラムに結合していなかったわけである。次いで画分５と６はさらに精製するため にプールした。

Ｍｏｎｏ　Ｑカラムを活性Ｍｏｎｏ　Ｓ画分について再度使用したが使用した緩 衝液は２０ｍＭ　）リス−ＩＣＩ　ｐＨ８，０であり、流量は０．８ｍＬ／分に 低下させた。生成物はカラムとの結合なしで放出されたが、Ｍｏｎｏ　Ｓに残っ ている不純物かわずかにあり、したがって分離は５〜６分間かかった。この処理 を行った後、生成物は均質であり以後の特性決定のために貯蔵した。

等電点電気泳動 構築物の等電点（ｐｌ）はＤＮＡ５ＴＡＲ社（米国、ウィスコンシン州。

マディラン所在）のコンピュータプログラムＰｒｏｔｅｉｎ−ｔｉｔｒａｔｅを 使用して予測した。アミノ酸組成、ＭＷおよびｐｌ値に基づいて計算した。

試験では、ｐｌは、ＦＭＣＢｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ社（米国、メーン州、ロック ランド所在）のＩｓｏｇｅｌ　ＩＥＦプレートｐＨ範囲３〜ＩＯを使用して測定 した。上記ＩＥＦを操作するために、Ｂｉｏｒａｄ社（米国、カリフォルニア州 、リッチモンド所在）の電気泳動装置を、上記両メーカーの指示にしたがって使 用した。その電気泳動の条件は、２０ｍＡで５００Ｖ　（限定）および一定電力 のＩＯＷであった。等電点電気泳動は９０分間で完了した。Ｂｉｏｒａｄ社の［ ＥＦ標準品は、フィコシアニン、βラクトグロブリンＢ、ウシカルボニックアン ヒドラーゼ、ヒトカルボニックアンヒドラーゼ、ウマミオグロブリン、ヒトヘモ グロビンＡとＣ１３種のヒラマメレクチンおよびシトクロムＣが含有され、ｐｔ 値はそれぞれ４．６５．５．１０．６．００．６．５０．７．００．７．５０． ７．８．８．００．８．２０および９．６であった。ゲルはＦＭＣの指示にした がって染色し脱色した。

ＤＮＡ５ＴＡＲプログラムによって両方の５ＣＦＶ２の種のｐｌ値として８．１ の値が予測された。純品の生成物に対し単一の均一なバンドがゲル上に、両者の ｐＩ値の６．９の位置にみとめられた。

ＩｇＧ、　５ｃＦｖ２　（ＬＨＬＨおよびＬＨＨＬ）のような精製ＣＣ４９抗体 は、２８０ｎｍ波長光の吸光度を分光光学的に測定することによって定量した。

モル吸光係数値ＥＭは各々、先に引用したＷｅｔｌａｗｆｃｒの式を用いて測定 した。

そのアミノ酸組成に基づイテ、ＣＣ４９［ｇＧ、　ＣＣ４９ｓｃＦｖ２ＬＨＬＨ ，ＣＣ４９ｓｃＦｖ２ＬＨＨＬおよびＣＣ４９ＳＣＦＶのＥ　’■（２８０ｎｍ ）値はそれぞれ１．４９゜１．６５．　１．６５および１．７１であった。

実施例４ ＣＣ４９ｓｃＦｖ２の種のＬＨＬＨとＬＨＨＬの相対活性を、　ＩｇＧおよびＣ ０ＯＨ末端にＦＬＡＧペプチドを有する単量体５ｃＦｖ型と比較した。

パーセント競合（ｐｅｒｃｅｎｔ　ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ）を下記式によって ＥＬＩＳＡのデータからめた。

“ゼロ競合（ｚｅｒｏ　ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ）”値は、１％ＢＳＡをビオチ ニル化ＣＣ４９（３×１０〜１４モル）とｌ：ｌ比率で混合して測定し、一方１ ００％競合値はビオチニル化ＣＣＣＣ４９ｒと混合しりＣＣ４９１ＣＣ４９ｌ　 ５　ｔｔ　ｇ／ｍＬ試料に基づいた値である。これらのデータは図１１に示す。

試料の吸光度値は４０５ｎｍ〜４５０ｎｍで測定した。３回の読取り値の平均値 を使用した。最初に試料（２５μＬ）を、ＴＡＧ−７２でコートしたマイクロリ ットルプレートに、　１．０ＸＩＯ，１０モルの結合部位／ｍＬで塗布した。

ビオチニル化ＣＣ４９（４μｇ／μｍ　１　：２０，０００に希釈、２５μｌ使 用）で試料を１／２濃度に希釈した。連続希釈法（１：２）を行った。

両方の形態の５ｃＦｖ２はＩｇＧにほり等しい（図１１参照）。別の試験で、Ｃ Ｃ４９ｓｃＦｖ単量体をＦａｂフラグメントと比較した。両者は一価であるか、 これらはＴＡＧ−７２に対する結合アフィニティーが等しいことを示した。これ らの結果は、共存結合の二量体の両者の形態は、二つの充分に機能的な抗原結合 部位をもっていることを示している。これは、単量体の種に比べて全１ｇＧにつ いてみられるのと同じ結合力の増大である。

またこれらのデータは、５ｃＦｖ２分子が、そのＣＣ４９ＩｇＧの親と同様に、 免疫治療用途の候補であり、毛細血管透過性の増大および一層迅速な生体分布薬 物動態の利点を有することを示している。この利点によって、既存の［ｇＧ分子 に比べて、本発明の化合物は多数回注射することができ、かつ癌治療に用いる免 疫治療法において腫瘍：組織比を高くすることができる。

本発明の他の実施態様は、本明細書を検討するかまたは本願に開示されている発 明を実施することから、当該技術分野の当業者にとって明らかになるであろう。

本明細書と実施例は例示だけを目的とするもので、本発明の真の適用範囲と思想 は以下の特許請求の範囲によって示される。

以上 浄書（内容に変更ない ＦＩＧＵＲＥ　１ ＦＩＧ、２ ＧＡＣＡＴＴ　ＧＴＧ　ＡＴＧ　ＴＣＡ　ＣＡＧ　ＴＣ’ｒ　ＣＣＡ　ＴＣＣ’ ｌ”ｃｃ　ＣＴＡ　ＣＣＴ　ＧＴＧ　’ｒｃＡＧＴＴ　ＧＧＣＧＡＧ　ＡＡＧ　 ＧＴＴ　ＡＣ’ｒ　ＴＴＧ　ＡＧＣＴＧＣＡＡＧ　ＴＣＣＡＧ’ｒ　ＣＡＧ　Ａ ＧＣＣＴＴ　ＴＴＡ　ＴＡＴ　ＡＧ’Ｊ’　ＣＧＴ　ＡＡＴ　ＣＡＡ　ＡＡＧ　 ＡＡＣＴＡＣＴＴＧ　ＧＣＣＴＧＧ　ＴＡＣＣＡＧ　ＣＡＧ　ＡＭ　ＣＣＡ　Ｇ ＧＧ　ＣＡＧ　’！’ＣＴ　ＣＣＴ　ＡＡＡ　ＣＴＧ　ＣＴＧ　ＡＴＴ　ＴＡＣ ＴＧＧにＣＡ　ＴＣＣＧＣ’ｒ　ＡＧＧ　ＧＡＡ　ＴＣＴ　ＧＧＧ　ＧＴＣＣＣ Ｔ　ＧＡＴ　ＣＧＣＴＴＣＡＣＡ　ＧＧＣＡＧＴ　ＧＧＡ　ＴＣ’ｆ’　ＧＧＧ 　ＡＣＡ　ＧＡＴ　ＴＴＣＡＣＴ　ＣＴＣＴＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＴ　ＧＴＧＡ ＡＧ　ＡＣＴ　ＧＭ　ＧＡＣＣＴＧ　ＧＣＡ　ＧＴ’ｒ　ＴＡＴ　ＴＡＣ’ｆ’ ＧＴ　ＣＡＧ　ＣＡＧ　ＴＡＴ　’ＦＡＴＡＧＣＴＡ’ｒ　ＣＣＣＣＴＣＡＣＧ 　ＴＴＣＧＧ’ｒ　ＧＣ’ｌ’　ＧＧＧ　ＡＣＣＡＡＧ　ＣＴＧ　ＧＴＧ　ＣＴ ＧＡｓｐ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ｍｅヒ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｓｅｔ 　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　ＭａｌＧｌｙ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　 Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　 Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｉ、ｅｕＦＩＧ、４ ＧＡＧ　ＧＴＴ　ＣＡＧ　Ｔ’ｒ’Ｇ　ＣＡＧ　ＣＡＧ　ＴＣ’！’　ＧＡＣＧ Ｃ’ｒ　ｃＡＧ　ＴＴＧ　ＧＴＧ　〜ｕ　ｃｃ’ｒＧＧＧ　ＧＣＴ　ＴＣＡ　Ｇ ＴＧ　ＭＧ　ＡＴＴ　ＴＣＣＴＧＣＭＧ　ＧＣＴ　Ｔ’ＣＴ　ＧＧＣＴＡＣＡＣ ＣＴｆ’ＣＡＣＴ　ＯＡＣＣＡ’ｒ　ＧＣＡ　ＡＴＴ　ＣＡＣＴＧＧ　ＧＴＧ　 ＡＪＩＡ　ＣＡＧ　ＡＡＣＣＣ’ｌ’　ＧＭＣＡＧ　ＧＧＣＣＴＧ　ＧＡＡ　Ｔ ＧＧ　ＡＴＴ　ＧＧＡ　ＴＡτｍ　’ｒｃｒ　ｃｃｃ　弱ＡＡＡＴ　ＧＡＴＧＡ Ｔ　ＴＴＴ　ＡＡＡ　ＴＡＣＡＡＴ　ＧＡＧ　ＡＧＧ　ＴＴＣＡＡＧ　ＧＧＣＡ ＡＧ　ＧＣＣＡＣＡ　ＣＴＧＡＣＴ　ＧＣＡ　ＧＡＣＡＡＡ　ＴＣＣＴＣＣＡＧ ＣＡＣＴ　ＧＣＣＴＡＣＧＴＧ　ＣＡＧ　ＣＴＣＡＡＣＡＧＣＣＴＧ　八Ｃ＾　 丁ＣＴ　ＧＡＧ　ＧＡ’ｌ’　ＴＣＴ　ＧＣＡ　ＧＴＧ　ＴＡＴ　ＴＴＣＴＧＴ 　ＡＣＡ　ＡＣＡＴＣＣＣＴＧ　ｋＡＴ　ＡＴＧ　ＧＣＣＴＡＣＴＧＧ　ＧＧＴ 　ＣＡＡ　ＧＣＡ　ＡＣＣＴＣＡ　ＧＴＣＡｃｅＧＴＣＴＣＣＴＣＡ ＦＩＧ、５ Ｃ１ｕ　Ｖａｌ　（：１ｎ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ａｌａ 　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｖａｔ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ＾１ａ　Ｓ＠【Ｖａｔ　Ｌ ｙｓ　Ｘ１ｅ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ＾ｌａ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ〒ｙ【テｈｒ　 Ｐｈｅ　Ｔｈｅ＾ｓｐ　ｆｉｌｓ＾ｌａ　Ｉｌｅ　Ｈｌｓ　Ｔｒｐ　Ｖａｔ　Ｌ ｙｓ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｇｌｎ　Ｇｌｙ　Ｉ、ｅｕＧｌｕ　Ｔ ｒｐ　ｌｉｅ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｈｅｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ａ ｓｐ　Ａｓｐ　ｔｈｅ　Ｌｙｓ　ＴｙｒＡｓｎ　（、ｌｕ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ｌ 、ｙｓ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ＾ｌａ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ａｌａ＾ｓｐ　Ｌｙ ｓ　ＨｅｒＳｅｒ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ 　Ａｓｎ　Ｈｅｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　１ｉａｒ　（：１ｕ　ＡｓｐＳｅｒ＾ｌａ 　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　ＰｈｅＣｙｓ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　 Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　ＴｒｐＧｌｙ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｖ ａｌ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　５ｅｒ１　ジ　〜　ＯＱ）＋、ＯＩｔ　Ｎ　Ｏ ａ）■じ　々お　繋　巴　毘　−１ 目　ヨ　ジ　ｒ　コ　ｈ　託　朋　Ｂ５　ｇコ基ロｕｈ＜　）４Ｌｌ　１鴫　α ＜　ｏｈ　ｂｕトｕＩ＋Ｉａ　＜）４　＞＜　、−＋＜　ｔ、ｕ　ｓ。

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Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. １．２以上の一本鎖抗体フラグメントを含んで成り、各フラグメントが抗原に対 する親和性を存しており、ここでそのフラグメントは第一のペプチドリンカーに より共有結合されており、そして各フラグメントは： （ａ）軽鎖可変ドメインを含んで成る第一ポリペプチド；（ｂ）重鎖可変ドメイ ンを含んで成る第二ポリペプチド；及び（ｃ）この第一と第二のポリペプチドを 機花的な結合性成分へと連結せしめる第二のペプチドリンカー；を含んで成る、 多価の一本鎖抗体。
2. ２．この第一のペプチドリンカーが下記のアミノ酸配列【配列があります】 を有する、請求項１記載の多価の一本鎖抗体。
3. ３．この軽鎖可変領域が、図３に示すものと実質的に同じアミノ酸配列を有して おり、そしてこの重鎖可変領域が、図５に示すものと実質的に同じアミノ酸配列 を有している、請求項１記載の多価の一本鎖抗体。
4. ４．この第一と第二のペプチドリンカーが実質的に同じアミノ酸配列を有する、 請求項１記載の多価の一本鎖抗体。
5. ５．多価の一本鎖抗体をコードするＤＮＡ配列であって、この多価の一本鎖抗体 が２以上の一本鎖抗体フラグメントを含んで成り、各フラグメントが抗原に対す る親和性を有しており、ここでそれらのフラグメントは第一のペプチドリンカー により共有結合されており、そして各フラグメントは； （ａ）軽鎖可変ドメインを含んで成る第一ポリペプチド；（ｂ）重鎖可変ドメイ ンを含んで成る第二ポリペプチド；及び（ｃ）この第一と第二のポリペプチドを 機能的な結合性成分へと連結せしめる第二のペプチドリンカー；を含んで成る、 ＤＮＡ配列。
6. ６．この第一のポリペプチドをコードする配列が図２のそれと実質的に同じであ り、そして第二のポリペプチドをコードする配列が図３のそれと実質的に同じで ある、請求項５記載のＤＮＡ配列。