JPH07501941A - オンコスタチンmおよび白血病阻害因子の受容体 - Google Patents
オンコスタチンmおよび白血病阻害因子の受容体Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
オンコスタチンMおよび白血病阻害因子の受容体発明の背景
(例えば、ホルモン、薬、サイトカイン、または生化学的な)特異的な分子に結
合する受容体がいろいろな細胞種で同定されてきた。受容体は細胞表面に見いだ
される、または可溶性の受容体の場合は、血清中に遊離される。受容体の生理的
な役割を調べるため、および可能な治療上の役割を探すため、多くの受容体を単
離、同定することに努力が向けられてきた。患者に投与した可溶な受容体が、特
別な標的分子に結合することで、標的分子による障害を緩和できる可能性がある
。
ある受容体は、複合体という形で結合した2つの独立したポリペプチド鎖からな
っていることがわかってきた。このような2本鎖受容体は、鎖1本のみの場合よ
りも強い親和性で標的分子と結合することが多い。
白血病阻害因子(L I F)は、成人および胎児のいろいろな体系の調節にお
L)て中心的な役割を果たすポリペプチドホルモンである。LIFは様々な細胞
種に作用し、多くの生物学的活性を持つ。生物学的活性の多様性は、肝細胞刺激
因子■(バウマン(Baumann)およびウオング(long)、J、I+u
+uno1.143+1163[1989]) ;コリン作用性神経分化因子(
ヤマモリ(Yamamori)ら、5cience 246:1412[199
0]):メラノーマ由来リボプロティンリパーゼ阻害剤(モリ(Mori)ら、
BiocheIIl、 Biophys、Res、comi、160:1085
[1989]) ; DA細胞に対するヒトインターロイキン(モレアラ(Mo
reau)ら、Nature 336:690[19g8]) :分化因子(ト
ミダ(Tomida)ら、J。
Biol、Chea+、259:1097g[1984]) ;分化阻害因子(
アベ(Abe)らJ、 Biol、 CheIn、 264@;89
41[1989]) :分化阻害活性(スミス(Smith)およびクープぐ−
(Hooper)、Devel、 Bi。
1.121:1[1987]) :および分化遅延因子(クープ−7ン(Koo
pman)およびコ・ソトン(Cotton)、Exp、Ce11. Res、
154:233[1984])を含むLIFのいろいろな別名に反映されてい
る。
白血病阻害因子受容体(L I F−R)のクローニングはギアリング(Gea
rLng)らによりEMBo 1.IQ:2839(1991)で報告されてい
た。この組み換え一末鎖LIF−RポリペプチドはLIFと結合するが、ある普
通の細胞でみられる当然起こっているLIF受容体よりも親和性が低い。このク
ローニングされた一末鎖LIF−Rよりも高い親和性でLIFと結合する受容体
がある種の応用には理想的であろう。
オンコスタチンMは、ある腫瘍由来細胞および普通の細胞ラインの生育を調節す
る分泌性の一末鎖ポリペプチドサイトカインである。オンコスタチンMは、白血
球細胞によって活性化される。多くの細胞種がオンコスタチンMタンパク質と結
合することがわかってきている。例えばリンスレイ(Linsley)ら、J、
Biol、 Chell。
、 264 :4282(1989)参照。しかしオンコスタチンMの単離およ
び同定は報告されていない。
発明の概要
本発明は、オンコスタチンMおよび白血病阻害因子(LIF)の双方と結合する
性質を持つ受容体を供給する。受容体は白血病阻害因子受容体(L I F−R
)と(好ましくは共有結合的に)結合するgp130からなる。gp130ポリ
ペプチドは、架橋剤またはポリペプチドリンカ−を介してのような、何か適当な
方法で、LIF−Rと共有結合的に結合しているであろう。本発明の1つの態様
において、この受容体は、組み換えDNA技術によって作製された融合タンパク
質である。オンコスタチンMまたはLIFによる障害は、治療上有効な量の本発
明の受容体をこのような障害に被っている患者に投与することによって、処置で
きる。
図面の簡単な説明
図1はLIF結合アッセイの結果を示したグラフである。実施例1に示したよう
に、gp130またはL I F−Rをコードするベクターをトランスフェクト
した宿主細胞の、LIFに結合する能力をアッセイした。
図2はオンコスタチン間結合アッセイの結果を示したグラフである。実施例2に
示したように、gpiaoまたはLIF−Rをコードするベクターをトランスフ
ェクトした宿主細胞の、オンコスタチンMに結合する能力をアッセイした。
図3は、実施例2に示したように、gpiaoをコードする発現ベクターをトラ
ンスフェクトした宿主細胞に対する、オンコスタチンMの結合親和性が低いこと
を示したものである。
図4は、抗体由来のFcポリペプチドがgp130断片をL I F−Rとつな
げるために用いられているという、本発明の受容体を図解したものである。
図5は、cDNAおよび染色体クローンの塩基配列を比較することによって決定
した全長LIF−RのDNA配列およびコードされるアミノ酸配列を示したもの
である。シグナルペプチダーゼによる切断部位は垂直の矢印で示した。膜貫通領
域は太い下線で示した。潜在的なN−結合糖鎖付加部位はアスタリスクで示した
。ヘマトポイエチンファミリー受容体に関連した重要な残基は箱で示した。水平
の矢印はLIF−Rの3° コード部位として染色体配列が用いられた部位を示
している。なぜなら塩基配列決定に用いられたcDNAクローンはこの部位でA
ヌクレオチドのストレッチで終わっていたためである。
図6はヒビ(I(ibi)らによってCe1l 63:1149(1990)で
報告されたクローニングされたgp130cDNAのDNAおよび予想されるア
ミノ酸配列を示したものである。予想されるシグナル配列は下線で示した。太い
下線は予想される膜貫通領域を示す。一連のアスタリスクは可能なN糖鎖付加部
位を示す。
図7は、実施例7に示したように、LIFおよびオンコスタチンMが結合すると
いう点で、可溶なgp130/Fc融合タンパク質と可溶なLIF−R/Fcと
の相互作用を証明するスキャーチャード解析(Scatchard analy
sis)を示す。
発明の詳細な説明
本発明は白血病阻害因子受容体(L I F−R)と共有結合的に結合している
、gpiaoからなる受容体を供給する。本発明のもう1つの態様として、この
受容体は、LIF−Rと非共有結合的に複合体を形成するgpiaoからなる。
この受容体はオンコスタチンMと結合可能で、白血病阻害因子(L I F−R
)とも結合する。このようにこの受容体は、オンコスタチンMまたはL I F
−Rによる障害を処置するのに有用である。
gl)130は架橋剤またはポリペプチドリンカ−を介するような、何か適当な
方法でL I F−Rと共有結合的に結合しているであろう。gpiaoとLI
F−Rタンパク質は、結果としてできた受容体がオンコスタチンMおよびLIF
と結合する活性を阻害しないような形で、共有結合的に結合している。本発明の
1つの態様として、受容体は組み換えDNA技術で作製された融合タンパク質で
ある。
gpiaoとL I F−Rとの非共有結合は、受容体のオンコスタチンおよび
LIFとの結合能を妨げることのないような形で、可能であろう。一つの方法と
しては、第一の化合物がL I F−Rと結合し、非共有結合により第一の化合
物と結合した第二の化合物がgpiaoと結合する。このような化合物の例はビ
オチンとアビジンがある。受容体はこのように非共有結合的にビオチンがアビジ
ンと相互作用することによって形成される。本発明の1つの態様として、L I
F−Rおよびgpiaoは組み換えポリペプチドであり、各々組み換え細胞か
ら精製され、非共有結合的に結合して、受容体を形成している。宿主細胞は、L
I F−Rおよびgpiaoの両方が組み換え宿主細胞によって産生されるよ
うな2つの異なる発現ベクターで形質転換しであるであろう。このような形質転
換された宿主細胞によって産生されたL I F−Rおよびgpiao (以下
に示したように、これらの一方または両方は可溶性の断片)は会合して、非共有
結合的な相互作用で複合体を形成するであろう。
”白血病阻害因子受容体” (L I F−R)は、単球マクロファージおよび
巨核球を含むいろいろな造血細胞の表面、および、遺骨細胞(osteobla
sts)、胎盤栄養芽層(placental trophoblasts)、
肝臓柔組織細胞(11ver parenchymal eel Is)を含む
非造血細胞に存在するタンパク質(サイトカイン受容体)である。L I F−
Rは白血病阻害因子(L I F−R)分子と結合することができ、1.IFに
よって産生されるシグナルを細胞に伝える役割を果たしている。何の種別の記載
もないときは、LIF−Rは一般に、それだけに限られるわけではないが、ヒト
、ネズミ、ウシLIF−Rを含むは乳類L I F−Rのことをいう。
ヒトおよびネズミの白血病阻害因子受容体(LIF−R)(どちらも一本位のポ
リペプチドであるが)のクローニングは、参考文献で本明細書中に取り入れられ
ているEliBOJ、 10:2839(1991)において、ギアリング(G
earing)らによって報告されている。ヒトLIF−RcDNAクローンの
DNA配列およびそれにコードされるアミノ酸配列はSEQ ID NO:5お
よびSEQ ID N。
:6に示されている。このクローニングされたヒトcDNAは、(N末端からC
末端にかけて)44アミノ酸のシグナル配列(アミノ酸−44から−1まで)、
細胞外部位全体、膜貫通領域(最初のアミノ酸はSEQ ID NO:5の79
0番目のアミノ酸)および細胞内ドメインの一部を含むヒトL I F−RのN
端断片をコードする。断片のC端は、上述のギアリングらで記載されているよう
に、ポリA1およびベクターの作製に利用されたリンカ−によってコードされる
アミノ酸を含んでいる。本明細書中で使われている”膜貫通領域”という言葉は
タンパク質の細胞外ドメインと細胞内ドメインの間に位置する、一連の疎水性ア
ミノ酸を指す。上に記載したクローニングされたヒトLIF−RcDNAを含む
プラスミドベクターはpHLIFR−65と呼ばれ、大腸菌宿主細胞内において
、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに1990年12月11日(
ATCC受託番号第68491号)に寄託しである。全長ヒトL I F−Rの
DNAおよびアミノ酸配列(cDNAと染色体クローンとを比較して決定された
)は上述のギアリングによって報告され、本明細書中、図5で示されている。
クローニングされたcDNA(SEQ ID NO:6)でコードされるLIF
−RはL I F−Rの細胞外領域全長(LrF結合活性を担っていると信じら
れているドメイン)を含み、LIFと結合するが、ある普通の細胞でみられるL
IF受容体に天然に起こっているものより親和性が低い。さらにオンコスタチン
Mは、ある細胞型天然に起こっている高親和性LIF受容体との結合を、LIF
と競合している(ギアリングら、New Biologist、4:61.19
92)が、COS細胞で発現させた上述のクローン化されたL I F−Rとは
結合しない。
クローン化された一末鎖ポリペプチドL I F−Rに対する高親和性の変化す
るサブユニットの存在する可能性を研究するために、宿主細胞をL I F−R
をコードするプラスミドpHLIFR−65およびヒト胎盤cDNAライブラリ
ー(これらも発現ベクターの中に含まれている)からのプールとを同時にトラン
スフェクトした。コトランスフェクトされた(co−transfected)
細胞の、放射ラベルしたオンコスタチンMとの結合能をアッセイした。
陽性cDNAブールをさらに分け、上述の工種を繰り返し、プラスミドpHLI
FR−65をコードするLIF−R共にコトランスフエクトされた場合に、細胞
上のオンコスタチンMに結合する能力を与える、BIOGと名付けられた単一の
cDNAクローンを単離した。コトランスフェクトされた細胞はまた、pHLI
FR−65のみでトランスフェクトされた細胞より高い親和性でLIFに結合す
ることが分かった。BIOGのみでトランスフェクトされた宿主細胞は低い親和
性のオンコスタチン間結合部位を示した。BIOGクローン化cDNAの塩基配
列を決定し、gpiaoとして知られるタンパク質であることが分かった。
Rポリペプチドのみの場合よりも高い親和性でLIFに結合するということが、
今や分かった。gpiaoと組合わされたLIF−RのLIFに対する結合の増
加は下記の実施例1に記載されており、図1に表されている。
LIFは高い親和性でも低い親和性でもオンコスタチン間受容体に結合しないが
、オンコスタチンMがLIF−Rおよびgpiaoからなる本発明の受容体に結
合することが分かった。オンコスタチンMの結合は実施例2に記載されており、
図2に表されている。
gpiaoとして知られているタンパク質を、胎盤組織および骨髄腫細胞系列U
266を含む細胞源より精製した。Ce1l 63:1149 (1990)で
ヒビ(Hibi)らによって報告されているように、さらなる多くの細胞型がg
piao mRNAを発現していることが分かった。gpiaoは高親和性イン
ターロイキン−6結合部位の形成およびIL−6シグナル伝達に関与していると
報告されている(上述のヒビら)。gp130タンパク質全長をコードするcD
NAのクローニングおよび発現は上述のヒビらによって報告されており、それは
、全部が本明細書中に参考として取り入れられている。ヒビらによりて報告され
たgpiaoのDNA配列および予想されるアミノ酸配列はここで図6に示され
ている。gp130アミノ酸配列はヒビらによって報告されたものと異なる。例
えば単一配列中の8番目のロインンンはバリンに置き換えられている(番号は図
6に示しているとおりである)。アミノ酸の置換は遺伝的多形性(polymo
rphism)(タンパク質を産する個体のアレリックな多様性)に帰すること
ができ、22番目のヌクレオチドがGではな(Cであることによる。
ここで用いたように、L I F−Rという用語は、所望されるLIF結合活性
またはシグナル伝達活性を有する天然のL I F−Rタンパク質の変種および
短縮型(truncated form)を含む。同様に、ここで用いるgp1
30という用語は、所望の生物学的活性を保持する天然のgp130タンパク質
の変種および短縮型を含む。gp130の所望の生物学的活性は、オンコスタチ
ンMの結合すること:本発明の受容体にオンコスタチンMに結合する能力を与え
ること:および単一鎖L I F−RポリペプチドのみのL(F結合親和性と比
較して、L[Fに対する本発明の受容体の親和性を高めることからなる。以下に
記載したように、L I F−Rおよびgp130の短縮型、可溶性型、または
融合型が特に含まれる。天然の配列にアミノ酸を加えたり、置換したり、減らし
たりすることにより産せられる変種については以下でもっと詳しく論する。
使用されるL I F−Rポリペプチドの1つの例は、上述のギアリング(Ge
artng)らによって記載されたように、および以下の実施例3に記載しであ
るように、pHLIF−R−65(SEQ ID NO:5)と名付けられたc
DNAクローンによりコードされたものである。または、SEQ ID NO:
5の1から945のアミノ酸からなる断片が用いられる。945番目のアミノ酸
は、クローンpHLIF−R−65によりコードされるポリペプチドの、hLI
F−RcDNAの調製中にmRNAの内部にオリゴ(d T)をつけたため生じ
たと思われるポリ式ヌクレオチド部分の前の、最後のL I F−R特異的なア
ミノ酸である(ギアリングら、EMBOJ、上述の2840頁、欄1参照)。
本発明の受容体で用いられるL I F−Rポリペプチドのその他の例は、タン
パク質の膜貫通領域または細胞質部分のすべてまたは一部を欠いたものからなる
。
従って、適当なL I F−Rポリペプチドは、図5に描かれた全長L I F
−R配列の、1番目からX番目のアミノ酸、または、シグナル配列が望まれない
場合は45番目からX%目のアミノ酸であるものを含む。ここでXは833から
1096の整数を表す。833番目のアミノ酸は細胞外部分の最後のアミノ酸で
ある(即ち膜貫通領域の始まりである)。■・096番目のアミノ酸で終わるポ
リペプチドは全長タンパク質のC端末アミノ酸を欠いている。シグナル配列を含
むことが好ましいかどうかは、以下で論するように、融合タンパク質中でのL
I F−Rの位置、および受容体が組換えDNA技術により作製される場合、意
図された宿主細胞といった因子に依存している。図5のアミノ酸の番号(上述の
ギアリングらより取られた)がSEQ ID NO:5の番号と異なっているこ
とに注意を要する。なぜなら、図5ではシグナル配列の最初のアミノ酸が1番か
ら数えられているが、SEQ ID NO二5では一44番から数えられている
からである。他のポリペプチドはへマトポエチン受容体ファミリーで保存された
配列に関連して選ばれる(即ち図5で示されている囲まれた配列を含むように選
ばれる)。
適当なgp130ポリペプチドの1つの例はBIOGと名付けられたプラスミド
をつくるためにベクターpDc303にクローン化されたcDNAによってコー
ドされたものである。cDNAをつくる時に用いたmRNAの源はヒト胎盤組織
である。E、coli株DH5(!宿主中のプラスミドBIOGは、Ameri
can Type Cu1ture Co11ection、マリーランド州a
−)クビルに1991年11月14日に寄託されており、ATCC受託番号68
827を与えられている。
プラスミドBIOGに含まれるgp130 cDNAのDNA配列およびクロー
ン化されたcDNAがコードするアミノ酸配列はSEQ ID NO:1および
SEQ ID NO:2に表されている。タンパク質は(N末端からC末端の順
番で)22アミノ酸のシグナル配列、完全な細胞外部分(アミノ酸1−597)
、膜貫通領域(アミノ酸598から始まる)、および部分的な細胞質部分(アミ
ノ酸621−686)からなる。この短縮型gp130ポリペプチドはシグナル
配列中の8個のアミノ酸が上で論じたようにバリンではなくロイシンとなってい
る点で、ヒビらのタンパク質の相当する部分と異なっている。
適当なgp130ポリヌクレオチドのもう1つの例はSEQ ID NO:1の
1から496のアミノ酸からなる。SEQ ID NO:1はタンパク質の細胞
外部分で見られる全てのシスティン残基を含み、完全なフィブロネクチン領域を
もつ。gp130ポリペプチドの別の例はSEQ ID NO:1のアミノ酸1
−298または98−298を含むものである。
すべてのまたは1部の膜貫通領域、および/または細胞質領域を欠(他のgp1
30ポリペプチドを用いることもできる。従って、適当なgp130ポリペプチ
ドは、図6の配列の1番目のからX番目のアミノ酸、または、シグナル配列が望
まれない場合は23番目からX番目のアミノ酸であるものを含む。ここでXは6
19から917の整数を表す。膜貫通領域の最初のアミノ酸は図6の620番の
アラニン残基である。アミノ酸917で終わっているポリペプチドは図6に示し
た全長のタンパク質のC端末のアミノ酸を欠いている。図6のアミノ酸の番号付
け(上述のヒビらから取られた)がSEQ ID NO:1およびNo: 2に
示されるものと異なっていることに注意を要する。これはシグナル配列の最初の
アミノ酸が図6ではアミノ酸1番とされているが、SEQ ID NO:1では
一22番となっているからである。ある種の受容体で保存されている領域に相当
するgp130タンパク質の領域は上述のヒビらによって1150頁欄2右上び
1151頁l!l11で論ぜられている。これらの保存された領域を含むように
選択されたその池の短縮型gp130ポリペプチドが用いることもできる。
好ましいL I F−Rおよびgp130ブリペプチドというのは可溶性のもの
である。本発明の1つの態様では、受容体は可溶性gp130に共有結合されて
いる可溶性IjF−Rからなっている。本発明の文脈で用いられるような”可溶
性L I F−R’は、アミノ酸配列において天然のL I F−Rの細胞外領
域のすべてまたは1部に実質的に類似しているポリペプチド、および、ポリペプ
チドを細胞膜上に保持させるような膜貫通領域の欠如のために分泌されて発現さ
れるポリペプチドを指している。用いられる可溶性LIF−RポリペプチドはL
IFに結合する能力を保持しており、またLIFに競合的に結合することによっ
て細胞表面に結合したL I F−Rタンパク質を介するLIFシグナル伝達活
性を阻害する。
可溶性L I F−Rが分泌されうる限り、可溶性L I F−Rはまた、膜貫
通領域の1部または細胞質領域の1部またはその他の配列を含み得る。同様に、
ここで用いられる”可溶性gp130”という用語は、アミノ酸配列において天
然のgp130の細胞外領域のすべてまたは1部に実質的に類似しており、発現
に際し分泌されるが望まれる生物学的活性は保持しているタンパク質を指してい
る。可溶性gp130は、ポリペプチドが分泌される限り膜貫通領域、細胞質領
域、その他の配列の1部を含む。
可溶性L I F−Rおよび可溶性gp130は、所望のタンパク質を発現する
天然の細胞を培養培地から例えば遠心によって分離し、培地中(上清中)の所望
のタンパク質の存在をアッセイすることによって、検出することができる(およ
び、非可溶性膜結合型から区別することができる)。培養培地は以下の実施例に
記載されたものと同様のまたは同一の方法を用いてアッセイされる。培地中にL
IF−Rまたはgp130が存在するということは、タンパク質が細胞から分泌
されており、所望のタンパク質の可溶性型であるを示している。可溶性L I
F−Rおよびgp130はこれらのタンパク質の自然に生じる形である。天然型
可溶性ネズミL I F−Rのクローニングは上述のギアリングらにより報告さ
れている。または、L I F−Rおよびgp130タンパク質の可溶性断片は
組換えDNA技術似よって作製するか、またはそうでなければ以下に記載されて
いるようにして単離することもできる。
LIF−Rおよびgp130の可溶性型の使用は、ある種の応用法にとって有利
になる。組換え宿主細胞からのタンパク質の精製は、可溶性タンパク質が細胞か
ら分泌されるので、容易になった。さらに可溶性タンパク質は一般に静脈投与に
適しており、血流中での治療上の効果(LIFおよびオンコスタチンMへの結合
)を発揮する。
可溶性L I F−Rポリペプチドは、シグナル配列および完全な細胞外領域(
SEQ ID NO:5のアミノ酸−44から789)からなるもの、またはシ
グナル配列を欠くが完全な細胞外領域(SEQ ID NO+5のアミノ酸1か
ら789)をもつものを含む。可溶性gp130ポリペプチドは、シグナル配列
および完全な細胞外領域(SEQ ID NO:1のアミノ酸−22から597
)からなるもの、またはシグナル配列を欠くが完全な細胞外領域(SEQ ID
N0:1のアミノ酸1から597)をもつものを含む。本発明の受容体中のこれ
らの可溶性ポリペプチドの調製および使用は実施例3−5に記載されている。
池の可溶性L I F−Rは膜貫通領域上流で短縮されているが、好ましくは、
ヘマトボエチン受容体ファミリーで保存された残基(図5中で囲って示している
)、即ちSEQ ID NO:6のアミノ酸11〜479をもつタンパク質の部
分を含む。そのような可溶性LIF−RのN端末はアミノ酸1−11 (天然の
シグナル配列が含まれる場合−44)のどれかであり、タンパク質はアミノ酸4
79から789のどれかから選択されたC端末まで伸びている。2つのそのよう
な可溶性タンパク質はSEQ ID NO:6のアミノ酸−44〜702.1〜
702、−44〜775、または1〜755からなる。これらのタンパク質をコ
ードするコンストラクト(construct)は、上記のクローンpHLIF
R−65(ATCC68491)のヒトLIF−RcDNAのエンドヌクレアー
ゼAsp718およびXmnI、またはAsp418およびBsp12861で
切断することを含む技術で調製される。Asp718は挿入されたL T F−
RをコードするcDNAの上流でベクターを切断する。Xmn Iは702番の
Aspのコドンを切断しく平滑末端となる)、Bsp12861SEQ TD
NO:5の775番のValのコドンの3°末端を切断する。所望により、オリ
ゴヌクレオチドをAsp718/Bsp1286T断片の3°末端にライゲイジ
ョンし、LIF−R配列が、例えばアミノ酸789まで、延ばすことができる。
オリゴヌクレオチドをまた、L I F−R断片の3゛末端にライゲイジョンし
、実施例5に記載されるFcポリペプチドの最初の2つのアミノ酸、およびL
I F−R配列の下流に残りのFc配列を結合するのに有用なりg111部位が
加えることもできる。
さらなる可溶性L I F−Rは、SEQ ID NO:6のアミノ酸1−67
8または1−680からなる。上述のギアリングら、EMBOJ、で表されたヒ
トおよびネズELIF−Rアミノ酸配列を(間隙を2つの配列での同一性を最大
にするようにして)並べるとき、ヒトの配列のアミノ酸680はネズミのタンノ
くり質の最後のアミノ酸と並べられ、アミノ酸678は、ネズミの配列の相当す
るアミノ酸と同一のヒトの配列の最後のアミノ酸である。ネズミのタンノくり質
はLIFに結合するので、ネズミのL I F−RはLIF結合に必要なタンノ
くり質の部分をもつ。
可溶性gp130ポリペプチドの追加例はSEQ ID NO:2のアミノ酸−
22〜582からなる。そのようなタンパク質をコードする発現ベクターは実施
例7で作製された。可溶性L I F−Rおよびgpiaoポリペブトはまた、
フィブロネクチンタイプIII (FNII[)領域が欠失しているようなもの
が含まれる。1つからすべてのFNm領域を除くことができ、タンパク質のサイ
ズを減らすのに有利に働いている。そのようなL I F−Rおよびgp130
タンパク質の調製は実施例8に記載されている。
可溶性ポリペプチド含む、短縮型L I F−Rおよびgpiaoは多くの従来
の技術のいずれかによって調製することができる。組換えタンパク質の場合、所
望の断片をコードするDNA断片を発現ベクターにサブクローン化することがで
きる。また、望まれるDNA配列を既知の技術を用いて化学的に合成することも
できる。また、クローン化された全長DNA配列の制限エンドヌクレアーゼ消化
によってDNA断片を作製し、アガロースゲル電気泳動によって単離することも
できる。制限エンドヌクレアーゼ切断部位をもつリンカ−を用いて、所望のDN
A断片を発現ベクターに挿入するか、または最初から存在する切断部位で断片を
消化することもできる。または、タンパク質を、例えばタンパク質分解酵素を用
いて断片化し、逆相HPLCを用いて消化混合物から所望の短縮型ポリペプチド
を単離することもできる。
よ(知られたポリメラーゼ連鎖反応法もまた、所望のタンパク質断片をコードす
るDNA配列を単離するのに用いられる。この技術は以下の実施例3−5に表さ
れている。
もう1つの方法では、(例えばBa131エクソヌクレアーゼを用いる)酵素処
理を用いてDNA断片から末端ヌクレオチドを除き、特定の望まれる末端をもつ
断片を得ることができる。商品化されているリンカ−のうち、Ba131によっ
てつくられた平滑末端にライゲイジョンでき制限エンドヌクレアーゼ切断部位を
有するものがある。または、所望の部位にDNA断片のN末端またはC末端を再
構成したオリゴヌクレオチドが合成することもできる。オリゴヌクレオチドは望
まれるコーディング配列の上流に制限エンドヌクレアーゼ切断部位をもち、開始
コドン(ATG)をコーディング配列のN末端にもつことができる。
g p ]、 30ポリペプチドは共有結合または非共有結合でL I F−R
ポリペプチドに結合している。共有結合は、例えばin vivoでの使用のよ
うなある種の応用法において、非共有結合とは対照的に、共有結合によって一般
的に与えれる安定性の上昇という点で、好まれる。本発明の受容体の作製時には
、共有結合はクロス−リンキング試薬、ポリペプチドリンカ−1または他の適当
な技術により行うことができる。
1つのタンパク質分子をもう1つにクロス−リンクするのに有用な多くの試薬が
知られている。例えばPierce Chemical Company、イリ
ノイ州ロックフォードのへテロ2反応性リンカ−およびホモ2反応性リンカ−が
この目的で利用できる。そのようなリンカ−は、アミノ酸の側鎖上の官能基と反
応する2つの官能基(例えば、エステルおよび/またはマレイミド)をもち、そ
れで1つのポリペプチドをもう1つに結合する。試薬と反応条件は、クロス−リ
ンキングがオンコスタチンMおよびLIFの受容体に対する結合を阻害しないよ
うに選択されるべきである。
本発明で用いることのできる一つの型のポリペプチドリンカ−は、gp130領
域およびL I F−R領域が所望の生物学的活性に必要な2次および3次構造
に適切に折りたたまれるのに十分な距離で分ける。そのリンカ−はまた、gpi
aoおよびL I F−Rの細胞外領域がオンコスタチンMおよびLIFに対す
る結合部位を形成するのに適切な空間配置を取るようにする。適切なポリペプチ
ドリンカ−は(1)柔軟な伸びた構造を取り、(2)gpiaoおよびLIF−
Rの機能領域と相互作用する整った2次構造を取るような性質を示さず、(3)
タン<り質の機能領域との相互作用を促進させるような疎水性または電荷を最小
限しかもたない性質をもつものが好まれる。柔軟なタンパク質領域中の典型的な
表面アミノ酸はGaySAsnおよびSerからなる。実際、Gly、Asnお
よびSetをもつアミノ酸配列の置換はペプチドリンカ−配列の上記の基準を満
たすと思われる。ThrおよびAlaのような他の中性に近いアミノ酸もリンカ
−配列で用いることができる。そのようなポリペプチドリンカ−の例は以下に示
す。
使用可能な別のタイプのポリペプチドリンカ−は抗体のFc領域を含む。Fcポ
リペプチドをL I F−R若しくはI、 I F−R断片のC−末端に接着す
る。別のFcポリペプチドをgpiaoもしくはgp130断片のC−末端に接
着する。
生じた2つのポリペプチド鎖を緩衝溶液中で混合して、その際2つのFcポリペ
プチドの間で(例、抗体分子において鏡開ジスルフィド結合が通常存在する、い
わゆるヒンジ部において)ジスルフィド結合を形成させることができる。2つの
ポリペプチドが宿主細胞で共発現され鏡開ジスルフィド結合が形成されるように
、宿主細胞を両方のポリペプチドをコードするDNAで形質転換するのが望まし
い。
この様にして、L I F−Rは受容体のリンカ一部のジスルフィド結合によっ
てgpiaoに共有結合により連結される。抗体のFc領域を分離する操作はよ
く知られており、パパインでの蛋白質分解消化を含む。または、組み換え細胞も
しくは化学的に合成することにより、Fcポリペプチドを産生ずることもできる
。ヒンジ部におけるジスルフィド結合形成に必要なシスティン残基を含む、抗体
FC領域のN−末端断片も有用である。Fcポリペプチドリンカ−を含む受容体
のある例は、以下の実施例5に例示される。その受容体は図4に描かれている。
ジスルフィド結合の数および位置は図4に示されたものから変わってもよい。
本発明の受容体を調製するのに有用なLIF−R/Fcおよびg p 130/
FCのさらに別の例は、実施例7および8に記載される。有利なことに、宿主細
胞は2つの異なる発現ベクター(一方は可溶性LIF−R/Fcを、他方は可溶
性gl)130/Fcをコードする)でコトランスフエクト(cotransf
ect)される。ヘテロダイマーが細胞内で若しくは分泌の際に形成されると考
えられる。
ジスルフィド結合により連結された2つのLIF−R/Fcポリペプチドもしく
は2つのgl)130/Fcポリペプチドを含むホモダイマーも、本明細書中で
開示されるトランスフェクトされた宿主細胞のいくつかによって生産される。L
IF−R/FCホモダイマーはLIFの結合に有用であり、gl)130/Fc
ホモダイマーはオンコスタチンMを結合することに用途を見出だす。ホモダイマ
ーは、互いに、そしてヘテロダイマーから、サイズの違いによって(例、ゲル電
気泳動によって)分離することができる。ヘテロダイマーも、逐次的な免疫アフ
イニティークロマトグラフィ−(以下に記載)によって精製することができる。
別の態様では、抗体軽鎖(若しくはその断片)の上流にgp130 (若しくは
その断片)を含む第1の融合ポリペプチドが調製される。第2の融合ポリペプチ
ドは、抗体重鎮(若しくは11鎮断片、そのN−末端は少な(ともC,1領域に
渡る)の上流にL T F−Rを含む。gp130−軽鎖融合ポリペプチドとL
IF−R−重鎮融合ポリペプチドの間にジスルフィド結合が形成され、従ってポ
リペプチドを含む本発明の受容体を産生ずる。所望により、第3の融合体(L
I F−R−抗体軽鎖融合ポリペプチド)を調製し、抗体重鎮と融合されたgp
130を含む第4の融合体と(ジスルフィド結合により)組み合わせる。2つの
ジスルフィド結合した分子を組み合わせると、2つのFc領域の間にさらにジス
ルフィド結合が形成される。4つの融合ポリペプチドを含む、生じた本発明の受
容体は構造上、抗体に似ており、2価的なオンコスタチンM/Ll結合部位を示
す。
ポリペプチドリンカ−は、あるポリペプチドを別のポリペプチドに接着させるの
に用いられる慣例的な操作のいずれかによって、gり130およびLIF−Rに
接着することができる。上記のピアース ケミカル カンパニー(Pierce
Chewical Company)から入手可能な架橋剤は、利用可能なも
のの一つである。そのような試薬と反応する側鎖を持つアミノ酸を、ポリペプチ
ドリンカ−中、例えば、その末端に含ませることができる。
gp130およびI、 I F−Rポリペプチドは、細胞ソースから独立に精製
され、それから−緒に架橋してもよい。また、本発明の受容体は組み換えDNA
技術を用いて生産してもよい。gp130およびL I F−Rポリペプチドは
、形質転換された宿主細胞から独立に生産され、精製されてから、以降の共有結
合架橋に用いてもよい。本発明のある態様では、宿主細胞は、gp130および
L I F−Rを別々のポリペプチドとしてコードする外来DNAで形質転換/
トランスフェクトされる。該2つのポリペプチドは、2つの遺伝子の各々に対し
て開始および終止コドンを有す同一の発現ベクターによりコードされてもよいし
、または組み換え細胞を2つの別々の発現ベクターでコトランスフエクトしても
よい。また、別の態様では受容体は組換え細胞中で融合タンパク質として産生さ
れる。
本発明のある態様では、受容体蛋白質は、RI L R1もしくはR,−L−R
1ここでR1はgp130もしくはgp130断片;R2はLIF−Rもしくは
LIF−R断片;およびLはポリペプチドリンカ−を表す:という化学式の組み
換え融合蛋白質である。
本発明の融合蛋白質は、gp130のC端部分を、L I F−RのN端部分に
融合されたリンカ−に融合させたコンストラクトを含み、L I F−RのC端
部分を、gp130のN端部分に融合されたリンカ−に融合させたフンストラク
トも含む。
gp130は、gp130およびL T F−Rの所望の生物学的活性を保持す
る単一の蛋白質を生産するような様式で、L I F−Rに共有結合で架橋され
る。融合蛋白質の構成要素は作られる順に挙げられている(即ち、N端のポリペ
プチドが先ず挙げられ、次にリンカ−1それからC端のポリペプチドが挙げられ
ている)。
融合蛋白質をコードするDNA配列は、gp130およびL I F−Rをコー
ドする別々のDNA断片を適当な発現ベクターに挿入する組み換えDNA技術を
用いて構築される。gp130をコードするDNA断片の3′端をLIF−Rを
コードするDNA断片の5′端に(リンカ−を通じて)mRNAが生物学的に活
性のある一つの融合蛋白質に翻訳されるように配列の読み枠を合わせて連結する
。
または、L I F−RをコードするDNA断片の3′端をgpt3oをコード
するDNA断片の5′端に(リンカ−を通じて)mRNAが生物学的に活性のあ
る一つの融合蛋白質に翻訳されるように配列の読み枠を合わせて連結する。N末
端のシグナル配列をコードするDNA配列をN末端のポリペプチドをコードする
DNA配列に残しておいてもよく、一方、第2の(C末端側の)DNA配列への
読み通しを妨げるような終止コドンは除去される。逆に、翻訳を終わらせるのに
要求される終止コドンは、第2のDNA配列中に残される。シグナル配列をコー
ドするDNAは、C末端のポリペプチドをコードするDNA配列から除かれるの
が望ましい。
適したポリペプチドリンカ−は、好適には20から100アミノ酸の長さ、そし
て最も好適には30から60アミノ酸の長さのアミノ酸の鎖から成る。上述のよ
うに、リンカ−は、グリシン、アスパラギン、セリン、スレオニン、およびアラ
ニンから成るグループから選択されるアミノ酸を含むのが都合がよい。適したポ
リペプチドリンカ−の例には、(Gly4Ser)、、(ここでnは4−12、
好適には8)、および(Gly、5erGly、5er)2が含まれるがこれら
だけに限られるわけではない。
所望のポリペプチドリンカ−をコードするDNA配列を、適当な慣例技術のいず
れかを用いて、gp130をコードするDNA配列およびL I F−Rをコー
ドするDNA配列の間に、且つ同じ読み枠になるように、挿入することができる
。
例えば、リンカ−をコードし適当な制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含む、化
学合成されたオリゴヌクレオチドを、gpi3oをコードする配列およびLIF
−Rをコードする配列の間に連結することができる。
また、化学合成されたDNA配列は、gp130若しくはL I F−Rの一方
の3′末端に相補的な配列(終止コドンは含まない)、次いでリンカ−をコード
する配列、さらに続いてgp130若しくはL I F−Rの他方の5′末端に
相補的な配列を含んでいてもよい。それからオリゴヌクレオチドによる変異導入
を用いて、gp130およびL I F−Rを直接融合させたものを含むベクタ
ーにリンカ−をコードする配列を挿入する。
本発明は、gp130、L I F−Rおよびポリペプチドリンカ−から成る上
記の融合蛋白質をコードする分離されたDNA配列を提供し、該分離されたDN
A配列を含む組み換え発現ベクターも提供する。“発現ベクター“は請求める蛋
白質をコードするDNAを発現するのに使われ、一式の(1)遺伝子発現に調節
的な役割を持つ遺伝子因子(例えばプロモーター、オペレーター、若しくはエン
ハンサー)、請求める蛋白質(この場合、本発明の受容体)をコードし、mRN
Aに転写され蛋白質に翻訳されるDNA配列((1)は(2)に機能的にリンク
(連結)している)、並びに(3)適当な転写および翻訳開始および終結配列か
ら成る転写ユニットを含む、複製可能なりNAコンストラクトに関する。プロモ
ーターおよび他の調節因子の選択は、一般的に、意図する宿主細胞に従って変化
する。
酵母発現系で生産される蛋白質には、酵母宿主細胞により翻訳された蛋白質の細
胞外への分泌を可能にするリーダー配列が含まれるのが望ましい。または、組み
換え蛋白質がリーダー配列も輸送配列(transport 5equence
)もなく発現される場合、それはN末端のメチオニン残基を含んでいてもよい。
この残基は、後に、発現された組み換え蛋白質から切断され、最終産物を提供す
ることができる。
本発現ベクターにおいて、転写もしくは翻訳を制御する調節因子は、哺乳動物、
微生物、ウィルス、若しくは昆虫遺伝子に由来するのが一般的である。宿主中で
複製する能力は、複製起点により付与されるのが普通で、形質転換体の認識を容
易にする選択遺伝子を付加的に取り入れてもよい。レトロウィルスに由来するベ
クターも使用することができる。
様々なりNA領域は、互いに機能的に関連していれば、実行可能に(有効に)(
operably)リンクしているといえる。例えば、シグナルペプチド(分泌
リーダー)をコードするDNAは、ポリペプチドが宿主細胞膜を通して分泌され
る前駆体として発現されるならば、ポリペプチドをコードするDNAと有効にリ
ンクしており:プロモーターは、コード配列の転写を制御するならば、その配列
と有効にリンクしており;または、リポソーム結合部位は、コード配列が翻訳さ
れるように配置されていれば、その配列と有効にリンクしている。一般的に、“
有効にリンクしている(operably 1ink)″ことは、連続して接し
ている、そして分泌リーダーの場合は連続して且つ読み枠があっていることを意
味する。
形質転換された宿主細胞は、組み換えDNA技術を用いて外来DNAで形質転換
された若しくはトランスフェクトされた細胞である。本発明の文脈では、外来D
NAには、本発明の受容体をコードする配列が含まれる。宿主細胞は、外来DN
Aをクローン化もしくは増幅するために形質転換することもできるし、または、
受容体蛋白質の生産のために発現ベクターで形質転換することもできる。受容体
発現に関して適した宿主細胞には、適当なプロモーターでの制御の下にある原核
細胞、酵母もしくは高等真核細胞が含まれる。原核生物には、グラム陽性もしく
はグラム陽性微生物、例えば、大腸菌もしくは桿菌(bac i I 1 i)
が含まれる。原核発現ベクターは、一般的に、1つ若しくは複数の表現型による
選択可能なマーカー、例えば、抗生物質耐性を付与する蛋白質をコードする遺伝
子もしくは栄養要求性を補う遺伝子、および宿主内での増幅を保証する、宿主に
より認識される復製起点を含む。形質転換に適した原核生物の宿主の例としては
、大腸菌(E、coli)、枯草菌(Bacjllus 5ubti1iis)
、ネズミチフス菌(Salmonella typhi+aurium)並びに
プソイドモナス(Pseudomonas)属、ストレプトミセス(Strep
tomyces)属およびスタフィロコッカス(Staphylococcus
)属の中の様々な種が含まれるが、その他のものも選択により使ってもよい。高
等真核細胞には、哺乳動物を起源とする確立された細胞系列が含まれる。無細胞
翻訳系も、本発明のDNAコンストラクトに由来するRNAを用いて融合蛋白質
を生産するのに使うことができよう。
細菌、真菌、酵母および哺乳動物細胞の宿主に用いられる適当なりローニングお
よび発現ベクターは、バラエル(Pouveis)ら、(Cloning Ve
ctors:A LaboratoryManual、Elsevier 、
=、−ヨーク、1985) (これに関連する開示は本明細書に参考事項として
取り入れられている)によって記載されている。
細菌利用に関する有用な発現ベクターは、よく知られたクローニングベクターp
BR322(ATCC3701,7)の遺伝子因子を含む市販のプラスミドに由
来する、選択可能なマーカーおよび細菌の複製起点から構成することができる。
このような市販のベクターは、例えば、pKK223−3 (ファルマシア フ
ァイン ケミカル(PharIIlacia Fine Chemicals)
、ウプサラ、スウェーデン)およびpGEMl (プロメガ バイオチック(P
romega Biotec)、マジソン、ウィスコンシン州、USA)が含ま
れる。これらのpBR322を“骨格とした(backbone)”断片は適当
なプロモーターおよび発現される構造配列と組み合わせられる。大腸菌は典型的
には、ある大腸菌種に由来するプラスミドであるpBR322(ポリバー(Bo
livar)ら、Gene 2:95.1977)の誘導体を用いて形質転換す
る。pBR322は、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性遺伝子を含み、
これにより形質転換された細胞を同定するための簡単な手段が提供される。
微生物の組み換え発現ベクターに広く用いられるプロモーターは、β−ラクタマ
ーゼ(ベニンリナーゼ)とラクトースプロモーター系(チャン(Chang)ら
、Nature 275:615.1978;およびゴーデル(Goeddel
)ら、Nature 281:544.1979)、トリプトファン(trp)
プロモーター系(ゴーデルら、Nucl、^cids、 Res、 8:405
7.1980:およびEPA第36,776号)並びにtacプロモーター(マ
ニアティス(Maniatis)、Mo1ecular Cloning:^L
aboratory Manual、Co1d Spring Harbor
kaborat
ory、 p、 412.1982)が含まれる。特に有用な細菌発現系は、λ
フアージPt、プロモーターおよびCl857ts温度誘導性レプレッサーを用
いる。λPLプロモーターの誘導体を取り込んだ、アメリカンタイプカルチャー
コレクションから入手可能なプラスミドベクターは、大腸菌株JMB9に居るp
HUB2 (ATCC37092)および大腸菌RR1に居るpPLc28 (
ATCC53082)を含む。
組み換え受容体蛋白質は、好適にはパン酵母(S、 cerevisiae)な
どのサツカロミセス種からの酵母宿主でも発現させてもよい。ピキア(Pich
ia)もしくはフリユベロミセス(Kluyveromyces)などの池の属
の酵母も使うことができる。酵母ベクターは一般的には2μm酵母プラスミドか
らの複製起点もしくは自立複製配列(AR3) 、プロモーター、受容体融合蛋
白質をコードするDNA、ポリアデニル化および転写終結のための配列、並びに
選択遺伝子を含むであろう。望ましくは、酵母ベクターは、酵母と大腸菌の両方
の形質転換を可能にする複製起点および選択可能なマーカー、例えば大腸菌のア
ンピシリン耐性遺伝子およびパン酵母trpl遺伝子(トリプトファンなしで増
殖する能力を欠く酵母の変異株に対する選択マーカーを提供する)、並びに下流
の構造遺伝子の転写を誘導するための高度に発現される酵母遺伝子に由来するプ
ロモーターを含むであろう。それから、酵母宿主細胞のゲノムにおけるt rp
l欠損の存在は、トリプトファンの非存在下での増殖によって形質転換を検出す
るための効果的な環境を提供する。
酵母ベクターの適したプロモーター配列には、メタロチオネイン、3−ホスホグ
リセリン酸キナーゼ(ヒッツエマン(HitzeIIlan)ら、J、 Bio
l、 Chew、 255 :2073.1980)または、エノラーゼ、グリ
セルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デ
カルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−6−リン酸イソメラ
ーゼ、3−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン
酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼなどの他
の解糖系酵素(ヘス(Hess)ら、J、^dv、Enzyme Reg。
7:149.1968;およびホランド(Holland)ら、Biochem
、 17+4900.1978)のプロモーターが含まれる。酵母発現に使われ
る適したベクターおよびプロモーターは、R。
ヒッツェマンら、EPA第73,657号にさらに記載されている。
好適な酵母ベクターは、大腸菌における選択および復製のためのpBR322か
らのDNA配列(Amp’遺伝子および複製起点)、並びにグルコース抑制可能
なADH2プロモーターおよびαファクター分泌リーダーを含む酵母DNA配列
を用いて組み立てることができる。ADH2プロモーターはラッセル(Russ
ell)ら(J、Biol、Chew、 258:2674.1982)および
バイアー(Beier)ら(Nature 300ニア24.1982)により
記載されている。酵母αファクターリーダー(異種蛋白質を分泌するように仕向
ける)を、プロモーターと発現される構造遺伝子の間に挿入することができる。
例えば、カージャン(Kurjan)ら、Ce1l 30:922.1982;
およびビック−(Bi tter)ら、Proc、 Natl、^cad、 S
ci、 USA 81 :5330.1984を参照していただきたい。
リーダー配列を改変して、その3′端付近に、リーダー配列の外来遺伝子への融
合を容易にする有用な制限部位を1つ若しくは複数含ませることもできる。
適した酵母形質転換プロトコールは当業者に知られている。代表的な技術はヒン
ネン(Hinn6n)ら、Proc、 Natl、^cad、 Scj、 IJ
S^75:1929.(197g) (0,67% 酵母窒素源ベース、0.5
% カサアミノ酸、2% グルコース、10μg/mlアデニンおよび20μg
/ml ウラシルから成る選択培地でTrp”形質転換体を選択する)により記
載されている。
ADH2プロモーターを含むベクターにより形質転換された宿主株を、発現のた
めに、80μg/ml アデニンおよび80μg/m+ ウラシルを加えた、1
% 酵母エキストラクト、2% ペプトンおよび1% グルコースから成る富栄
養培地中で増殖させることができる。ADH2プロモーターの脱抑制は、培地の
グルコースを使い果たすと起こる。酵母粗上清を濾過により回収し、さらに精製
するまで4°Cに保つ。
種々の哺乳動物もしくは昆虫細胞培養系を用いて組み換え蛋白質を発現させるこ
とができる。昆虫細胞での異種蛋白質の生産のためのバキュロウィルス系は、ル
ッコフ(Luckow)とサマーズ(Summers)、 Bio/Techn
ology 6:47 (1988)によるレビューがある。適した哺乳動物宿
主細胞系列の例としては、サル腎臓細胞のCO5−7細胞(グルラマン(Glu
zmanXCell 23:175.1981)により記載)、並びに、例えば
L細胞、C127,3T3、チャイニーズ ハムスター卵巣(CHO) 、He
LaおよびBHK細胞系列を含む、適当なベクターを発現する能力を持つ他の細
胞系列が含まれる。哺乳動物発現ベクターは、複製起点、発現される遺伝子に繋
げられたプロモーターおよびエンハンサ−1並びに他の5′若しくは3−に隣接
する非転写配列などの非転写因子、並びに、必須なリポソーム結合部位、ポリア
デニル化部位、スプライス供与および受容部位、並びに転写終結配列などの5′
若しくは3′非非翻訳列を含むこともできる。
形質転換を椎動物細胞で使われる発現ベクター中の転写および翻訳制御配列は、
ウィルスソースにより提供されることができる。例えば、広く使われているプロ
モーターおよびエンハンサ−は、ポリオーマ、アデノウィルス2、シミアンウィ
ルス40 (SV40)およびヒト サイトメガロウィルスに由来する。SV4
0ウィルスゲノムに由来するDNA配列、例えば、SV40オリジン、初期およ
び後期プロモーター、エンハンサ−、スプライスおよびポリアデニル化部位は、
異種DNA配列の発現1°こ要求されるその他の遺伝子因子を提供するのに用い
られる。
初期および後期プロモーターは、共にSV40ウィルス複製起点も含む断片とし
てウィルスから容易に得られるので、特に有用である(フィアーズ(Fiers
)ら、Nature 273:113.1978 )、ウィルス複製起点に含ま
れるHindIII部位からBg11部位までの約250bpの配列が含まれる
限り、より小さな若しくは大きなSV40断片も利用され得る。代表的なベクタ
ーは、オカヤマ(Okayama)とバーブ(BergXMol、 Ce11.
Biol、 3:280.1983)により開示されたようにして構築される
。
C127マウス乳上皮細胞における、哺乳動物受容体cDNAの安定かつ高レベ
ルな発現に有用な系は、実質的にコスマン(Cosman)ら(Mat、 Im
munol、 23:935.1986)により記載されたようにして構築され
る。
本発明の受容体を融合蛋白質として発現するのに特に望ましいベクターは、以下
の実施例で記載される。先の考察は、勿論、gp130の断片および/もしくは
L I F−Rの断片を含む組み換え融合蛋白質の生産に適用可能である。適し
た断片は上述の通りであり、そのような断片をコードするDNA配列を上記の発
現ベクターに挿入することができる。
本発明は、該受容体をコードするDNA配列を含む発現ベクターで形質転換され
た宿主細胞を、発現を促す条件下で培養することを含む、本発明の組み換え受容
体を調製するプロセスを提供する。それから受容体は、培養培地もしくは細胞抽
出物から精製される。
例えば、組み換え蛋白質を培養培地に分泌する系からの上清を、先ず、市販の蛋
白質濃縮フィルター、例えば、アミコン(A■1con)もしくはミリポアベリ
コン(Millipore Pe1licon)限外濾過ユニットを用いて濃縮
することができる。濃縮工程に続き、濃縮液を適当な精製マトリクスに適用する
ことができる。例えば、適した親和性マトリクスは、LIFもしくは03Mを含
んでいてもよい。LIF親和性マトリクスは11組み換えヒトLIFを、製造元
の勧めに従って、ブロムシアン活性化セファロース(ファルマシア社)もしくは
ヒドラジド アフィゲル(バイオラド社)に結合させることによって調製するこ
とができる。適した支持体に結合した抗体を用いた逐次的免疫精製が望ましい。
L I F−Hに特異的な抗体に結合する蛋白質を回収し、不溶性支持体上のg
p130特異的な抗体と接触させる。
このようにして両方の抗体に免疫反応する蛋白質を同定し分離することができる
。
または、陰イオン交換樹脂、例えば、突き出たジエチルアミノエチル(DEAE
)基を持つマトリクスもしくは基質を使うことができる。マトリクスは、アクリ
ルアミド、アガロース、デキストラン、セルロースもしくはタンパク質精製に広
く使われている他のタイプであってもよい。または、陽イオン交換工程を使うこ
とができる。適した陽イオン交換体には、スルホプロピルもしくはカルボキシメ
チル基を含む種々の不溶性マトリクスが含まれる。スルホプロピル基が望ましい
。
疎水性の逆相高速液体クロマトグラフィー(RP−HPLC)媒体、例えば突き
出たメチル基もしくは他の脂肪族基を持つシリカゲルを使った、1回もしくは複
数回のRP−HPLC工程を用いて融合蛋白質構成物をさらに精製することがで
きる。
先のいくつかの若しくは全ての精製工種は、様々に組み合わせて使つて、本質的
に均一な組み換え蛋白質を提供することができる。組み換え細胞培養は、それぞ
れの種類の起源、例えば細胞、細胞滲出物もしくは体液において本来見出だされ
るような、通常gpi3o若しくはL I F−Rに結合し得る混入蛋白質を含
まない融合蛋白質の生産を可能にする。
前記の精製操作は、本発明の非組み換え受容体を精製するのにも使うことのでき
るものである。ホモダイマー(gp130−リンカー−gp130およびLIF
−R−リンカー−L I F−R)を生じ得る架橋操作を用いた場合、そのよう
なホモダイマーからめるヘテロダイマーを分離する精製操作が使われる。そのよ
うな操作の例は、上述の逐次的免疫精製である。
細菌培養で生産される組み換え蛋白質は、細胞ベレットからの最初の抽出、1つ
若しくは複数の濃縮操作、脱塩、水性イオン交換もしくはサイズでふるい分ける
クロマトグラフィ一工程によって分離されるのが普通である。最終的に、高速液
体クロマトグラフィー(HPLC)を用いて最終精製工程を行ってもよい。組み
換え融合蛋白質の発現に使われる微生物細胞は、凍結−融解サイクル、音波処理
、機械的破壊もしくは細胞溶解剤の使用を含む、慣例的な方法のいずれかによっ
て破壊することができる。
融合蛋白質を分泌蛋白質として発現する酵母の発酵は、精製を大いに簡略化する
。大規模発酵から得られる分泌組み換え蛋白質は、アーダル(Urdal)ら(
J、 Chromatog、 296:171.1984)により開示された、
調製HPLCカラム上での組み換え蛋白質の精製に2つの逐次的な逆相HPLC
を要する方法と類似の方法によって精製することができる。
本発明はまた、生理学的に許容可能な担体もしくは希釈剤を伴う本発明の受容体
蛋白質を含む薬剤組成物も提供する。そのような担体もしくは希釈剤は、使われ
る薬量および濃度において受容者に毒とならないであろう。そのような組成物は
、例えば、緩衝溶液中に受容体蛋白質を含み、該溶液にはアスコルビン酸などの
抗酸化剤、低分子量(約10残基未満)のポリペプチド、蛋白質、アミノ酸、グ
ルコース、ショ糖もしくはデキストリンを含む炭水化物、EDTAなどのキレー
ト剤、グルタチオン並びに他の安定剤および助剤が添加されてもよい。本発明の
受容体は、静脈注射、点滴、インブラントからの持続的な放出などの、徴候に適
した様式で適当な方法のいずれかによって投与することができる。
gp130およびL I F−RのDNAおよび/もしくはアミノ酸配列は、S
EQ ID NO:1およびSEQ [)NO:5に提示されたものから変化し
てもよい。既知の遺伝子暗号の縮重(degeneracy)により、同じアミ
ノ酸配列をコードするヌクレオチド配列にかなりの変動が可能である。SEQ[
DNO:1若しくはSEo 10 NO:5のネイティブなりNA配列にある程
度厳しい条件下(50℃、2XSSC)でハイブリダイズできるDNA配列で、
生物学的に活性のあるgp130若しくはL I F−Rポリペプチドをコード
するものも、本発明の文脈においては、それぞれ、gp130若しくはLIF−
RをコードするDNA配列と考えられる。さらに、L I F−Rもしくはgp
130をコードするヌクレオチド配列中のある変異は、最終的な蛋白質産物には
発現されないであろう。例えば、主に転写されたmRNAの2次構造ループを避
けて発現を昂進するためにヌクレオチド置換を行うこともできる(EPA第75
,444A号、本明細書中に参考文献として入れられている)。選択された宿主
により容易に翻訳されるコドン、例えば大腸菌での発現に関して大腸菌に好まれ
るよ(知られたコドンを提供するために、ヌクレオチド配列の他の変更も可能で
ある。
天然のgp130若しくはL I F−Rのアミノ酸配列を、1つ若しくは複数
のアミノ酸を置換、欠失、添加、もしくは挿入によって変えることで、gp13
0若しくはL I F−R変異体を産生ずることができる。天然のgp130お
よびLfF−R蛋白質のめる生物学的活性を有す変異体を本発明の受容体に用い
ることができる。変異蛋白質の生物学的活性を分析することのできるアッセイを
後述の実施例に記す。
天然のアミノ酸配列に対する変更は、多くの既知の技術のいずれかによって達成
できる。例えば、天然の配列の断片に連結できるような制限酵素部位が隣接した
変異配列を含むオリゴヌクレオチドを合成することにより、特定の遺伝子座位に
変異を導入することができる。連結反応後、得られた再構築された配列は、所望
のアミノ酸挿入、置換、もしくは欠失を持つ類似体をコードする。
または、オリゴヌクレオチドによる部位特異的変異導入操作を用いて、要求され
る置換、欠失、若しくは挿入に従って変更された特定のコドンを持つ変更遺伝子
を提供することができる。上に挙げた変更を作製する代表的な方法は、ワルダ−
(Walder)ら(Gene 42:133.1986);バウアー(Bau
er)ら(Gene 37:73.1985);フレイブ(Claig)(Bi
oTechniques、 1985年1月、 12−19) ニスミス(S+
l1ith)ら(Genetic@Eng
ineering:Pr1nciples and Methods、 Ple
num Press、 1981) ;米国特許第4,51W゜
584号および米国特許第4,737,462号(本明細書中に参考文献として
入れられている)によって開示されている。
L I F−Rおよびgp130と生物学的に等価な変異体は、例えば、生物学
的活性に必要ない種々のアミノ酸残基の置換または末端もしくは内部のアミノ酸
の欠失を作ることによって構築することができる。本発明のある態様では、変異
アミノ酸配列は、天然の配列に少なくとも80%、好適には90%同一である。
百分率による類似性は、例えば、GAPコンピュータープログラム、バージョン
6゜0(ウィスコンンン大学遺伝子コンピューターグループ(Universi
ty of Wisconsin Genetics Computer Gr
oup; U’WG CG)より入手可能)を用いて配列情報を比較することに
よって決定できる。GAPプログラムは、スミスとウォーターマン(Adv、^
pp1. Math、 2:4g2.1981)により改良された、ニードルv
ン(Needleman)とブンシュ(lfunsch) (J、 Mo1.
Biol、 48 :443.1970)のアライメント法を利用している。
簡単に述べると、GAPプログラムは、似ているとアラインされた記号(即ち、
ヌクレオチド若しくはアミノ酸)の数を、2つの配列のうち短いほうの記号の総
数で割った数として類似性を定義している。GAPプログラムに好適なデフォル
トパラメーターは、(1)ヌクレオチドに関して単一要素からなる比較マトリク
ス(同一であれば1の値を、同一でなければ0の値を含む)、およびシュワルツ
(Schwartz)とデイホフ(Dayhoff)編、At1as of P
rotein 5equence and 5tructu窒■B
National Biomedtcal Re5earch Foundat
ion、 pp、 353−358.1979により記載さ黷■A
グリブスコフ(Gribskov)およびバーゲス(Burgess)、 Nu
cl、^cids、 Res、 14:6745.1986の加重比較マトリク
ス; (2)各ギャップに関する3、0のペナルティおよび各ギャップにおける
各記号に関する0、10の付加的なペナルティ:並びに(3)末端ギャップに関
する0のペナルティを含む。
一般的に、置換は保存的になされるべきである;即ち、最も好適なアミノ酸は、
置き換えられる残基と似た物理化学的特性をもつものである。保存的置換の例と
しては、Ile、Va 1SLeu、もしくはAlaを互いに置換するなどの、
ある脂肪族残基を別のものに置換する、または、LysとArg;GluとAs
p:若しくはGinとAsn間などの、ある極性残基を別のものに置換すること
が含まれる。池のそのような保存的置換は、例えば、同様の疎水特性を持つ領域
全体を置換することがよ(知られている。さらに、ヒト、ネズミおよび他の哺乳
動物のLIF−Rの間で特定のアミノ酸の相違は、L I F−Rの本質的な生
物学的特性を変えることなくできる、さらに別の置換を示唆する。
再生の際に不要な若しくは誤った分子内ジスルフィド結合が形成されるのを防ぐ
ために、システィン残基を欠失もしくは他のアミノ酸に置き換えることができる
。隣接した二塩基性アミノ酸残基を改変して、KEX2プロテアーゼ活性のある
酵母系での発現を高めることもできる。
EP第212.914Mは、蛋白質におけるKEX2プロテアーゼによるプロセ
ッノング部位を不活化する部位特異的変異導入の利用を開示している。KEX2
ブロテアーゼブロッセシング部位は、残基の欠失、付加もしくは置換によりAr
g−ArgSArg−LysおよびLys−Argの組を変えることで不活化さ
れる。Lys−Lysの組はKEX2切断をかなり受けにくく、Arg−Lys
若しくはLys−ArgからLys−Lysへの変換は、保存的で且っKEX2
部位を不活化する好適なアプローチを表す。
親水性アミノ酸を、gp130およびL I F−Rの膜貫通領域および/若し
くは細胞内ドメイン中の疎水性アミノ酸と置換して、蛋白質の水溶性を高めるこ
ともできる。天然の配列へのアミノ酸の付加は、クローニングもしくは発現ベク
ターの構築に用いられるリンカ−に存在する読み枠の合ったコドンの翻訳による
。
pHI LI F−R−65にコードされるLIF−Rは、ギアリングら、上記
に記載されたように、C末端にそのようなリンカ−にコードされたアミノ酸を含
む。
本発明には、関連のある天然のパターンの糖鎖付加を受けた若しくは受けない蛋
白質も含まれる。融合蛋白質をコードするDNAの大腸菌などの細菌における発
現は、糖鎖を付加されていない分子を提供する。不活化されたN−グリコジル化
部位を持つ機能的な変異類似体を、オリゴヌクレオチド合成および連結反応によ
り、若しくは部位特異的変異導入技術によって産生ずることができる。これらの
類似蛋白質は、酵母発現系において均一な炭水化物の少ない形で、高い収率で生
産することができる。真核蛋白質のN−グリコジル化部位は、アミノ酸トリブレ
ットAsn−Al’−Z (AlはPro以外のアミノ酸、ZはSetもしくは
Thr)という特徴がある。この配列において、アスパラギンは炭水化物の共有
接着のための側鎖アミノ基を提供する。そのような部位を、Asn若しくはZの
代わりに別のアミノ酸に置換する、Asn若しくはZを欠失させる、またはA1
とZの間にZでないアミノ酸を、もしくはAsnI!:A1の間にAsn以外の
アミノ酸を挿入することによって除くことができる。蛋白質中のN−グリコジル
化部位を不活化する既知の操作には、米国特許第5.071,972号およびE
P第276.846号に記載されているものが含まれる。
本発明の受容対蛋白質の変異体には、生物学的活性を保持した、1次的な蛋白質
の種々の構造形態も含まれる。例えば、イオン化し得るアミノ基およびカルボキ
シル基の存在によって、受容体蛋白質は、酸性塩もしくは塩基性塩の形をとるこ
とも、中性の形をとることもできる。個々のアミノ酸残基は、酸化もしくは還元
によっても改変できる。
1次アミノ酸構造も、グリコジル基、脂質、リン酸塩、アセチル基などの他の化
学的モ1′エティーとの共有結合若しくは凝集による複合体を形成することによ
って改変できる。共有結合による誘導体は、特定の官能基をアミノ酸側鎖または
N−若しくはC−末端に結合させることによって調製される。本発明の範囲に入
る受容体蛋白質の他の誘導体は、N−若しくはC−末端融合体として組み換え培
養で合成するなどして、受容体蛋白質の他の蛋白質若しくはポリペプチドとの共
有結合若しくは凝集による複合体を含む。例えば、繋げられるポリペプチドは、
蛋白質のN−末端部にあるシグナル(若しべはリーダー)ポリペプチド(翻訳と
同時に若しくは翻訳後に、合成の場から細胞膜もしくは細胞壁の内側もしくは外
側の機能する場への蛋白質の運搬を指示する:例えば、酵母a−ファクターのリ
ーダー)であってもよい。ペプチドはまた、融合蛋白質の精製若しくは同定を容
易にするために付加されてもよい(例、ポリHis)。融合蛋白質のアミノ酸配
列は、ペプチドAsp−Tyr−Lys−Asp−Asp−Asp−Asp−L
ys (DYKDDDDK)に繋げられることもできる(ホップ(Hopp)ら
、13i0/TechnoLogy 6・1204.198111)。後者の配
列は抗原性が高く、特異的なモノクローナル抗体により可逆的に結合されるエピ
トープを提供し、発現された組み換え蛋白質の迅速なアッセイおよび容易な精製
を可能にする。この配列はまた、ウシ粘膜エンテロキナーゼによってAsp−L
ysの組の直後の残基で特異的に切断される。
このペプチドを頭に付けた受容体蛋白質は、大腸菌での細胞内分解に耐性でもあ
り得る。
本発明の受容体は、主としてオンコスタチン間結合試薬として有用であり、in
vivo投与してオンコスタチンMの生物学的活性を(情報伝達を含めて)阻
害することができる。本発明の受容体はLIF結合試薬としての用途も持つ。
オンコスタチンMもしくはL I Fにより媒介される疾患は、そのような疾患
に苦しむヒトもしくは哺乳動物患者に、治療上有効量の本発明の受容体を投与す
ることによって治療することができる。生物学的に活性のあるオンコスタチンM
若しくはLIFが(直接若しくは間接的に)疾患を起こし、または悪化させてい
る場合、その疾壱はオンコスタチンMもしくはLIFにより媒介されていると言
われる。可溶性受容体蛋白質はLIFおよびオンコスタチンMに競合的に結合す
るよう用いることができ、それによりL I FおよびオンコスタチンMの細胞
表面の受容体への結合を阻害することができる。
実施例2で論じるように、gp130とL I F−Rの両方を含む本発明の状
態に比べて親和性が低いものの、gp130は今やオンコスタチンMに結合する
ことが見出だされている。gp130は、オンコスタチンMにより媒介される病
状の治療に投与することができる(もっとも、本発明のgp130/LIF−R
受容体の方がそのような目的には望ましいが)。
オンコスタチンMは、造血を刺激し、上皮細胞増殖を刺激し、プラスミン活性を
増加させ(それによって繊維素溶解が誘導される)、血管形成を阻害し、そして
上皮細胞上の主要組織適合抗原複合体の発現を抑制することが報告されている。
PCT出願wo 9109057および欧州特許出願第422,186号を参照
していただきたい。オンコスタチンMのこれらの若しくは池の生物学的効果が望
ましくない場合、本発明の受容体を投与してオンコスタチンMを結合させること
ができる。
オンコスタチンMは、ブラウン(Brown)ら、J、 Immunol、 1
47:2175 (1991) lこより報告されたように、サイトカイン イ
ンターロイキン6 (IL−6)の生産を刺激すると考えられる。それ故、オン
コスタチンMは、IL−6の存在に関連した疾患を間接的に媒介する。!L−6
はAIDSに関連したカボシ肉腫の病原に関与していると報告されている(デウ
ィット(debit)ら、J、 Inter、 Med、 [England]
229:539[1991] )。従って、本発明の受容体によるオンコスタチ
ンMの結合は、カポン肉腫の治療に有用であろう。または、それほど望ましくは
ないが、gp130はカポシ肉腫の治療に投与することができる。
LIFにより媒介される疾患には、骨およびカルシウム代謝の疾患またはLI濾
過剰発現に伴う肝細胞、ニューロン、もしくは白血球を冒す疾患以外に、アテロ
ーム性動脈硬化および肥満などのリボ蛋白質代謝欠損がある。LIFにょる胚幹
細胞および造血幹細胞の調節も本受容体により操作することができる。可溶型の
受容体も、LTFによる増殖刺激に応答した白血病細胞を治療するのに用いるこ
とができる。LrFはまた、癌もしくはAIDS患者におけるカヘキシー(Ca
chexja)の誘導にも働くことができる。その受容体もしくはそれに対する
抗体は、異常なL I F−Rの存在を特徴とする疾病を検出する診断試薬とし
ても有用であるだろう。
オンコスタチンMおよびLIFは異なる蛋白質だが、ある構造特性および生物学
的特性を共有している。オンコスタチンMおよびLIFにより共有される生物学
的活性の阻害がめられている場合、本発明の受容体は特殊な生物学的活性を示す
これらの蛋白質の両方に結合するという利益を提供する。これらの蛋白質の一方
にしかジスルフィド結合しない受容体は、他方の蛋白質を活性のあるままにして
おき、疾患を媒介させ続けるであろう。
受容体蛋白質もしくはその誘導体は、受容体をベースとした免疫アッセイにおけ
る試薬、オンコスタチンMもしくはLIFのアッセイにおける試薬、またはオン
コスタチンMもしくはLIFのアフィニティー精製のための結合試薬としても利
用できる。本発明の受容体は、ポリクローナル若しくはモノクローナル抗体の産
生に関する慣例的な操作において免疫原として使うことができる。そのような抗
体は、受容体の精製のための免疫アフィニティーカラムに、または診断もしくは
研究上のアッセイの構成要素として使用することができる。誘導体は、例えば、
システィンおよびリジン残基と反応するN−マレイミドベンゾイルスクシニミド
エステルなどの架橋剤を用いて、付加的なポリペプチドを攻撃することによって
も得ることができる。受容体蛋白質は、反応性の側鎖基を通じて、ブロムシアン
活性化、ビスオキシラン活性化、カルボニルジイミダゾール活性化もしくはトシ
ル活性化アガロース構造などの種々の不溶性基質に共有結合により繋げられ、ま
たは吸着によりポリオレフィンの表面に(グルタルアルデヒド架橋を用いて若し
くは用いないで)繋げられることができる。
以下の実施例は本発明のある態様を例示するために提供される、本発明の範囲を
制限するよう解釈されるべきではない。
黒臭珂
実施例I
Llの結合を検出するためのアッセイ
本質的にホップ(Hopp)等、Bio/Techno Iogy6 :120
4 (1988)が述べているように、組換え体ヒトLIFを酵母で発現させ、
均質になるまで精製した。精製したタンパク質を商業的に入手可能なエンザイモ
ビーズ放射性ヨウ素化試薬(BioRad)を用いて放射性標識した。この操作
において、0.2Mリン酸ナトリウム(pH7,2)50μm中のLIF 10
μgにエンザイモビーズ試薬50μlと、領 05Mリン酸ナトリウム(pH7
,0)20μl中のヨウ化ナトリウム2mciと2.5%β−D−グルコース1
0μmとを配合する。25℃における10分間後に、アジ化ナトリウム(50m
Mを20μl)とメタ亜硫酸水素ナトリウム(5mg/mlを10μl)とを加
え、25℃においてインキュベーションを5分間続ける。この反応混合物をウシ
血清アルブミ:/ (BSA)2.5%(w/ v )と、アジ化ナトリウム0
.2%(W/V)と、20mMへベスpH7,4(結合培地)とを含むローズウ
ェル パーク メモリアル インスチチx −t・(Rosevell Par
k Memorial In5titute) (RPM I ) 1640培
地中にて平衡させたセファデックス(Sephadex)(登録商標)G−25
(シグマ(Sigma))の2mlml土量上ゲル濾過によって分画する。”I
−L[Fの最終プールを結合培地中3 x 10−’Mの作用ストック溶液まで
希釈して、受容体結合活性の検出されうる損失なく、4℃において1力月まで貯
蔵する。比活性はルーチンに6〜8X10”cpm/ミリモルLIFの範囲内で
ある。
放射性標識LIFは特定のタンパク質又は細胞がLIFと結合するかどうかを決
定するための幾つかの通常の分析方法のいずれにも使用可能である。このような
アッセイの例は、細胞表面にLIF結合タンパク質を発現する、細胞への放射性
標識LIFの結合を検出するアッセイである。放射性標識LIFは細胞培養培地
中のLIF結合タンパク質(例えば、組換え体細胞によって分泌されるLIF結
合タンパク質)の存在の分析にも使用可能である。細胞抽出物(例えば、組換え
体細胞から)中のタンパク質も放射性標識LIFとの結合能に関して分析する二
とができる。
1つの分析方法では、LIFとの結合能に関して検査すべきタンパク質をコード
する発現系によりて形質転換及び/又はトランスフェクションした細胞を2X1
05細胞/孔の密度で6孔皿(ファルコン(Falcon))又は単孔チャンノ
く−ド(ahambered)スライド(LabTek)に接種する。皿とスラ
イドの両方をヒトフィブロネクチン(PBS中10ug/ml)1mlで30分
間前処理した後1こ、PBSによって1回洗浄する。48〜72時間後に、下記
オートラジオグラフィ一方法を用いて放射性標識LIFの結合によって、L4F
結合タンノくり質の発現番二関して細胞を分析する。トランスフェクションした
細胞を結合培地(ウシ血清アルブミ:/ (BSA)25mg/ml、アジ化ナ
トリウム2mg/mlと、20mMへペスpH7,2と、脱脂ドライミルク(N
FDM)50mg/m+とを含むRPM11640培地)によって1回洗浄し、
1.25xlO−”Mの1251 1゜IFを含む、結合培地+NFDM 1m
lと共に4℃において2時間インキュベートする0インキユベーシヨン後に、チ
ャンノく一トスライド中の細胞を結合緩衝液+NFDMによって3回洗浄し、次
にPBS (pH7,3)T、こよって2回洗浄して、非結合”J−LIFを除
去する。細胞をPBS (pH7,3)中の10%グルタルアルデヒド中で室温
において30分間インキュベートすること1こよって固定し、PBS中で2回洗
浄し、風乾させる。スライドをコダ・ツク(Kodak) NTB−2写真乳剤
(水中で5倍に希釈)中に浸漬し、遮光ボツクスに入れて4℃において12時間
〜7日間暗所で暴露させる。スライドを次基こコダックD19現像液(40g/
水500m1)中で約5分間現像し、水中ですすぎ洗0シ、Agfa G433
C固定液中で固定する。スライドを個別に25〜40x倍率の顕微鏡によって検
査し、LIFと結合する陽性細胞を明色背景6二対するオートラジオグラフィー
銀粒子の存在によって確認する。
6孔プレート中の細胞を結合41衝液+NFDMによって1回洗浄し、次善二P
BS (pH7,3)によって3回洗浄して、非結合”1−LIFを除去する。
細胞を次にトリプシン処理して、それらをプレートから除去し、結合1251
LIFをガンマカウンター(gamma counter)で計数する。
陽性の結果を得たトランスフェクトント(transfectant)プール中
の細胞をtjzブールに分け、LIF結合タンパク質を発現する単一のクローン
が単離されるまで、検査プロセスを繰り返す(必要に応じてプールをさらに分割
する)。200倍以上に過剰な非標識LIFの存在下では、I!5t−LIFの
非特異的結合(non−specific binding)が測定されること
がある。対照として、L I F−Rコード配列を有さないベクターによってト
ランスフェクトした同じ宿主細胞を分析して、この宿主細胞中にバックグラウン
ド内因性LIF受容体が存在するか否か調べるべきである。
他の分析方法では、細胞から培養培地中に放出される、溶解性LIF結合タンパ
ク質を確認する。培養ブロス(broth)から遠心分離によって細胞を回収す
る。
上澄み液(培養培地)を10倍に濃縮し、1μlアリコートをニトロセルロース
フィルター上にスポットし、風乾させる。3%脱脂ドライミルクを含む上記結合
培地(BMNFDM)中で4℃において一晩インキユベートすることによって付
加的な結合部位をブロックする。フィルターを200nM非標識LIFの存在下
又は不存在下のInM”’!−LIF含有BMN含有8中NFDにおいて2時間
インキュベートし、次にPBS中で洗浄する(3x5分間)。フィルターを室温
において写真フィルムに48時間暴露させる。
下記方法によって実施するLIF結合分析1回の結果を図1に示す。以下に述べ
るようにL I F−R又はgp130をコードするベクターによってトランス
フェクトした宿主細胞をLIF結合能に関して分析した。宿主細胞はグルラマン
(Glutzman)、Ce I l 23 二175 (1981)が述べて
いるサル腎臓細胞ライン(CO5−7と呼ばれる)であった。別々のトランスフ
ェクションにおいて、C08−7細胞を下記ベクター組合せによってトランスフ
ェクトした。種々な型のトランスフェクト(trB15fected)細胞(及
び非トランスフェクト対照細胞)を以下に示すようにA−Fと名付け、各トラン
スフェクト細胞又は対照細胞型のLIF結合分析データを表す曲線も図1におい
てA−Fと表示する。
(A)B10c (実施例3に述べるgp130コードベクター)とpHLIF
R−65(実施例3に述べるLIF−Rコードベクター)(B)pHLfFR−
65と対照ベクターCAV (LIF−R又はgp130をコードしない対照ベ
クター:gp130コードベクターとLIF−Rコードベフターの両方によって
同時にトランスフェクトしたC OS −7細胞の結果とより正確に結果を比較
するためのプラス2ド希釈に関する対照)(C)BIOGとpHL IFR−6
5; トランスフェクト細胞を12J (、IFとのインキュベーション前に非
放射性標識オンコスタチンMと共にインキュベートした。
(D)pHLIFR−65とCAV: t−ラ:zスフxクトI[I胞を12s
I−LIFとのインキュベーション前に非放射性標識オンコスタチンMと共にイ
ンキュベートした。
(E)非トランスフェクトCOS−7細胞(対照)(F)BIOGとCAV
本質的にダウェル(Dower)等、J、Immuno+、1.32ニア51
(1984)及びパーク(Park)等、J、Biol、Chem、261:4
177 (1986)が述べているように、フタレート油分離方法によって分析
を実施した。簡単に説明すると、トランスフエクシヨンから2日間後に、非酵素
式細胞解離緩衝液(シグマ)中での37℃における30〜60分間のインキュベ
ーションによりC08−7宿主細胞を10cm組織培養プレートから分離させた
。次に、細胞を上記結合培地によって洗浄し、結合培地中に5xlO’細胞/m
lで再懸濁させた。
細胞の50μmアリコートを”’I−LIFの連続希釈物と共に、総量150μ
m中で(200倍以上に過剰な非標識LIFの存在下又は不存在下で)、室温に
おいて撹拌しながら1時間インキュベートした。非標mL I FはLIFの非
特異的バックグラウンド結合の算出を可能にした。各インキュベーション混合物
の2通りのアリフート(60μm)を次に、ビス(S−エチルヘギンル)フタレ
ート1部に対してジブチルフタレート15部を含むフタ1ノート油混合物を含む
ポリエチレン遠心管に移した。
エノペンドルフ マイクロフコージ(Eppendorf microfuge
)中での15. 00Qxgにおける5分間の遠心によって、細胞を非結合’2
31−LIFがら分離した。遠心管をカプトして、非結合l2J−LIFを含む
上澄み液から細胞ベレット(結合12J−LIFを含む)を分離した。画部分に
おける放射能をガンマカウンターで測定した。2種類の60μmアリコートから
の細胞結合放射能と細胞1F結合放射能との測定値を次に計算して平均化した。
結果は生物学的データの標準スキャッチャード変換(Scatchard tr
ansfor艶ati。
n)として図1に示す。データは結合”1f−LIF分子数/細胞:遊離IHi
l。
IF分子の比(y軸)対結合”’I−LIF分子数/細胞(X軸)として報告す
る。解離定数(K、)を図1に、LIF結合部位数/細胞と共に示す。飽和量の
放射性tlIll識L[Fが提供されたので、結合した放射性標識LIF分子数
/細胞はLIF結合部位数/細胞に等しいと考えられる。
図1の曲線Aが示すように、gp130コ−ドベク9− (BIOG)とLIF
−Rコードベクター(pHL IFR−65)とによって同時トランスフェクト
した(co−transfected) COS −7細胞は高アフィニティL
IF結合を実証した(K−= 9 x i O−”M)。これらと同じ同時トラ
ンスフェクトCO3−7細胞を1251−LIFとのインキュベーション前に非
放射性標識オンコスタチンMと共にブレインキュベートすると(曲線C)、LI
Fの結合は非常に減少した(Ko=4゜2xlO−’M)。従って、オンコスタ
チンMはこれらのトランスフェクト細胞の結合部位に関してLIFと競合する。
単一ポリペプチド鎖LIF−Rをコードするベクター(pHLI FR−65)
と対照ベクターCAVとによってトランスフェクトしたCO3−7細胞はLIF
と結合した、但しgp130とL I F−Rとを産生ずる細胞よりも低いアフ
ィニティテあツタ(曲線B:に一=2.4xlO−’M)、CO3−7細胞は内
因性の高アフィニチイのサルLIF受容体を示す(曲線E:Ko=約3X10−
’!M)。
pHL I FR−65(単一ポリペプチド鎖L I F−Rをコードする)に
よるトランスフェクションは、サルのLIF受容体(KO=3.3X10−11
M;曲線B。
部位1)と同様に、付加的な低アフィニティLIF受容体(K、=2.4xlO
−9M、曲線B1部位2)の表示を生ずる。
pHLIFR−65とCAVとによってトランスフェクトしたC08−7細胞を
”5I−IjFとのインキュベーション前に非放射性標識オンコスタチンMと共
にブレインキュベートすると(曲線D) 、pHLIFR−65によって発現さ
れるL I F−Hに対するLIFの結合は、オンコスタチンMと共にブレイン
キュベートしない同じトランスフェクト細胞に比べて、本質的に変化がない。従
って、オンコスタチンMは単一ポリペプチド鎖LIF−Rへの結合に関してIj
Fと競合しない。しかし、CO5−7細胞上の内因性サル高アフィニティL I
F−Rに対するLIF結合は競合した。
gp130コードベクターとCAV対照ベクターとによって同時トランスフェク
トしたCO3−7(曲線F)は、非トラスフェクトCO3−7細胞への結合量を
越える量てはLIFに結合しなかった(曲線E)。
実施例2
オンコスタチンMの結合を検出する分析オンコスタチンMはこのタンパク質が天
然に検出される細胞から、又はオンコスタチンMをコードする発現ベクターによ
って形質転換した細胞から精製することができる。オンコスタチンMの供給源の
1つは、ツアーリング(Zarling)等。
PNAS USA 83・9739 (1986)が述べているように、ホルボ
ールエステル処理U937細胞である。組換え体オンコスタチンMの精製は、リ
ンスレイ(Linsley)等、J、Biol、Chem、264+4282〜
4289(1989)(この全体が参考文献としてここに含まれる)が述べてい
る。
好ましくは、オンコスタチンMを適当な発現ベクターによって形質転換した酵母
細胞中で産生する。シグナル配列(例えば、酵母α因子リーダー配列)をコード
するDNA配列は、オンコスタチンMをコードするDNA配列のN末端に融合し
て、宿主細胞からのこのタンパク質の分泌を促進することができる。タンパク質
は、最初に製造されたときには、ホップ等、Bio/Technology6・
1204 (1988)が述べているように、N−末端確認リーダー(例えば、
Asp−Tyr−Lys−Asp4−Lysのような“フラグ配列)を含むこと
もできる。このフラグ配列は非常に抗原的であり、特定のモノクローナル抗体に
よって可逆的に結合されるエピトープを提供し、発現された組換え体タンパク質
の容易な精製を可能にする。この配列はまた、Asp−Lysベアリングの直後
の残基においてラン粘膜エンテロキナーゼによって特異的に開裂される。
処理された最終的オンコスタチン間生成物にはシグナル配列もフラグ配列も検出
されない。
オンコスタチンMは、例えば実施例1においてLIFの放射性標識するために用
いられた放射性ヨウ素化方法のような、適当な通常の方法で放射性標識すること
ができる。オンコスタチンMの放射性標識は、前記リンスレイら(ltnsle
y et al、)に記載されている。
得られた放射性標識オンコスタチンMを実施例1に述べた分析方法において、オ
ンコスタチンMと結合するタンパク質及び細胞を検出するために、放射性標識L
IFの代わりに用いることができる。細胞への125I−オンコスタチンMの結
合の分析もリンスレイ等の上記文献に述べられている。
オンコスタチン間結合分析の1回の結果を図2に示す。gp130又はLIF−
RをコードするベクターによってトランスフェクトしたCO3−7細胞を、オン
コスタチンMとの結合能に関して分析した。別々のトランスフェクションにおい
て、CO3−7細胞を下記ベクター組合せによってトランスフェクトした。種々
な型のトランスフェクト細胞(及び非トランスフェクト対照細胞)を以下に示す
ようにA−Eと名付け、各細胞型のオンコスタチン間結合分析データを表す対応
曲線も図2においてA−Eと標識する。
(A)BIOG (実施例3に述べるgp130コードベクター)とpHLIF
R−65(実施例3に述べるL I F−Rコードベクター)(B)BIOGと
pHLIFR−65: l−ランスフエクト細胞を125■−オンコスタチンM
とのインキュベーション前に非放射性標識LIFと共にインキュベートした。
(C)pHLIFR−65とCAV: (LIF−R又はg+)130をコード
しない対照ベクター+gp130コード化ベクターとL I F−Rコード化ベ
クターの両方によって同時にトランスフェクトしたCO3−7細胞の結果とより
正確に結果を比較するためのプラスミド希釈に関する対照)(D)非トランスフ
ェクトCO5−7細胞(対照)(E)BIOGとCAV
実施例1に述べたフタレート油分離方法によって分析を実施した(但し、LIF
の代わりにオンコスタチンMを使用)。結果は生物学的データの標準スキャッチ
ャード変換として図2に示す。データは結合125■−オンコスタチンM分子数
/細胞:遊離+251−オンコスタヂンM分子の比(y軸)対結合125■−オ
ンコスタチンM分子数/細胞(X輪)として報告する。解離定数(K、o)を図
2に、オンコスタチン間結合部位数/細胞と共に示す。飽和量の放射性標識オン
コスタチンMが提供されたので、結合した放射性標識オンコスタチン間分子数/
細胞はオンコスタチン間結合部位数/細胞に等しいと考えられる。
図2の曲1mAが示すように、gp130コード化ベクター(BIOG)とLI
F’ −Rコード化ベクター(pHLIFR−65)とによって同時トランスフ
ェクトしたCO3−7細胞は高アフィニティでのオンコスタチン〜1との結合可
能性を実証した(Ko= 2. 4 x 10−’°M)。
単一ポリペプチド鎖L I F−Rをコードするベクター(pHLIFR−65
)と対照ベクターCAVとによって同時トランスフェクトしたCO3−7細胞(
曲線C)は、非トランスフェクトCO5−7細胞による結合量(曲線D)を越え
る有意な量ではオンコスタチンMを結合しなかった。
pHLIFR−65とBIOGとによって同時トランスフェクトし、l!II■
−オンコスタチンMとのインキュベーション前に非放射性標識Llと共にブレイ
ンキュベートしたCO3−7細胞(曲線B)は、非トランスフェクトCO3−7
細胞による結合量を越える測定可能な量ではオンコスタチンMを結合しなかった
。
従って、LIFは組換え体細胞の結合部位に関してオンコスタチンMと競合する
。
この分析(この結果は図2に示す)の実験条件は、低アフィニテイオンコスタチ
ンM受容体の正確な検出のために適当ではなかった。従って、別の実験(フタレ
ート油分離方法)を実施して、BIOGのみ(CAV対照ベクターなしに)でト
ランスフェクトしたCO5−7細胞によるオンコスタチン間結合を非トランスフ
ェクトCO3−7細胞によるオンコスタチン間結合と比較した。対照として分析
した非トランスフェクトCO5−7細胞は高アフィニテイオンコスタチンM受容
体数が少ないことを実証した(KO= 3. 6 x 10−”M)。BIOG
でトランスフェクトした細胞はオンコスタチンMの付加的な低アフィニティ結合
を示した(Ko=7.7xlO−’M)。このオンコスクチンM結合分析の結果
は生物学的データの標準スキャッチャード変換として図3に示す。データは結合
+25■−オンコスタチン間分子数/細胞:遊離125!−オンコスタチン間分
子の比(y軸)対結合+237−オンコスタチンM’y)子数/細胞(X軸)と
して報告する。対照細胞に比べてgpiao産生細胞によるオンコスタチン間結
合の差異がより容易に目視できるように、図3のスケールは図1及び2とは異な
る。
このようにオンコスタチンMによって仲介される障害はgp130又はそのフラ
グメン]・を投与することによって治療することができる。しかし、オンコスタ
チンMに対するgp130のみのアフィニティに比べてこのような受容体のアフ
ィニティが大きいことを考慮すると、このような状態の治療にgpi3oとLI
F−Rの両方を含む受容体を用いることが好ましい。gp130は診断分析及び
研究分析にオンコスタチン間結合試薬として用いることもできる。
実施例3
L I F−Rリンカー−gp130と名付けた組換え体融合タンパク質の製造
本発明の組換え体受容体タンパク質を下記方法で製造する。この受容体はポリペ
プチドリンカ−を介してgp130フラグメントに結合した、N末端のI、IF
−Rフラグメントを含む。ポリペプチドリンカ−は式(G1y4Ser)sを有
する。リンカ−配列の一部、すなわち配列Ser (GIy、5et)、GIy
をコードするオリゴヌクレオチドをオリゴヌクレオチド合成の通常の公知方法に
よって合成する。二本鎖オリゴヌクレオチドのDNAとコードアミノ酸配列は次
の通りである:
SEQ ID No、7
S@r Gly Gly GLy Gly Ser GLy Gly Gly
Gly S@t Gly GLy Gly Gly SerBspMX工 Xb
aI
ベクター構成中に以下に述べるように、リンカ−の残りの部分を加える。このオ
リゴヌクレオチド及び以下で考察するオリゴヌクレオチドは、例えばバイオサー
チ社(Bioseach、 Inc、 ) (カリホルニア州サンラフアニル)
又はアプライド バイオシステム(^pplied BiosysteIll)
から入手可能であるような自動化DNA合成装置によって合成することができる
。
リンカ−をコードするオリゴヌクレオチドを、リンカ−をコードする配列のいず
れかの側に、この配列と同じ読み取りフレーム(reading frame)
において、LIF−Rとgp130とをコードする配列を挿入するために用いる
ことができる、多重の制限エンドヌクレアーゼ開裂部位を好ましく含むベクター
中に、クローン化する。このようなベクターの1種はpBLUEscRIPT
SK(登録商標)と名付けられ、ストブタジーン クローニング システム(S
tratagene CloningSystems) (カリホルニア州う
ホヤ)から入手可能である。このプラスミドベクターは大腸m (E、co l
i)において複製可能であり、独特の21制限部位を含むポリリンカーセグメ
ントを含む。このプラスミドは制限酵素BamHIとXbalによって消化され
、リンカ−をコードするオリゴヌクレオチドを通常の方法を用いてこのベクター
にライゲートすることができる。挿入されたオリゴヌクレオチド配列を含む組換
え体ベクターは、制限エンドヌクレアーゼ分析と、ゲル電気泳動によるサイジン
グ(sizing)とによって確認される。L I F−RをコードするDNA
配列をpBLUESCR[’T SK(登録商標)中にリンカ−コードオリゴヌ
クレオチドの上流に挿入し、gp130コードDNA配列をリンカ−配列の下流
に挿入する。LIF−Rとgp130の可溶性フラグメントをコードするcDN
A分子を単離して、周知のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)方法を用いて増幅す
ることができる。PCR方法に用いるために下記オリゴヌクレオチドを合成した
:
SEQ ID NO:8(オリゴヌクレオチドNo、1)SEQ ID NO:
9(オリゴヌクレオチドNo、2)3’ CATACATACACCACTGT
TTCCTTTTAAGACCTCCTCCACCTAGGTACG 5’am
HI
SEQ ID NO:10(オリゴヌクレオチドNo、3)SEQ ID NO
:11(オリゴヌクレオチドNo、4)3° C^^^CGAGTTCCTCT
TTAACTTATCCGCCGGCGTACG 3’オリゴヌクレオチド1と
2をPCR反応に用いて、L I F−Rの可溶性フラグメントを単離する。こ
の反応に用いた鋳型(t emp I a t e)は、ギアーリング等の上記
文献に述べられたようにクローン化したヒトLIF−RcDNAである。cDN
AクローンのDNAとコード化アミノ酸はSEQ ID NO:5に示す。この
ヒトLIF−RcDNAクローンを含む、このクローン化ベクターを大腸菌宿主
細胞に含めて、1990年12月11日に名称pHLIFR−65でアメリカン
タイプ カルチャー コレクション(American Type Cu1t
ure Co11ection)(米国、メリーランド州、ロックヴイル)に寄
託した(ATCC受は入れ番号68491)。この寄託はブタペスト条約の条件
下で実施された。5゛プライマーはオリゴヌクレオチドN091であり、LIF
−Rのシグナル配列の最初の8アミノ酸をコードするDNA配列を含み、Sal
制限エンドヌクレアーゼ開裂部位を導入する上流配列をも含む。オリゴヌクレオ
チドN011はSEQ ID NO:5のヌクレオチド179〜202に相補的
である(−)鎖にアニーリングすることができる。3゛プライマーはオリゴヌク
レオチドNo、2であり、SEQ ID NO:5のヌクレオチド2651〜2
677に相補的である配列を含む(すなわち、L I F−Rの細胞外ドメイン
の最後の9アミノ酸をコードするアンチ−センス(ant i−sense)ヌ
クレオチドを含む)。L I F−Rコード化配列の直接下流で、オリゴヌクレ
オチドNO12は(Gly)4scrをコードする配列を含み、BamHI制限
エンドヌクレアーゼ開裂部位をも導入する。
従って、オリゴヌクレオチドNo、lと2を用いるPCR反応は、全シグナル配
列と全細胞外ドメインを含むが、トランスメンブラン領域と細胞外ドメインとを
欠いたL I F−RフラグメントをコードするDNA配列を単離し、増幅する
。
このLIF−Rフラグメントの3′末端に結合した(Gly)+Ser配列は最
終構造のポリペプチドリンカ−の一部である。
適当なPCR方法を用・いることができる。このような方法の1つはサルキ(S
arki)等、5cience239:487 (1988)に述べられている
。他の方法はRecombinant DNA Methodology、ウー
(llu)等編集、アカデミツク プレス社(^cadeeic Press、
Inc、 )、サンジエゴ(1989)。
189〜196頁に述べられている。−役に、PCR反応は、適当な緩衝化溶液
中で5°と3゛ ヌクレオチドを鋳型DNA及び4種の1オキシヌクレオシドト
リホスフエートの各々と一緒にすることを含む。この溶液を加熱しく例えば、9
5〜100℃)、二本鎖DNA鋳型を変性させ、次に冷却してから、DNAポリ
メラーゼ酵素を添加する。所望のDNAフラグメントを増幅するために反応を多
数サイクル実施する。
適当なI) CR方法の例を以下に述べる。全ての温度は摂氏度である。下記P
CR試薬を15m1エツペンドルフ マイクロフユージ管に加える: l0XP
CR緩衝液(500mM KCl、100mM Tris−HCl、pH8,3
(25℃)、25mM MgCl2及び1mg/mlゼラチン)(バーキンーエ
ルマーノークス(Perkin−Elmer Cetus)、コネチカソト州、
ノルウオーク)10μm;3dNTPを含む2mM溶液(2mM dATP、2
mM dCTP、2mM dGTP及び2mM dTTP)10μl ;Taq
DNAポリメラーゼ(パーキンーエルマーノークス)2.5単位(標準5000
単位/ml溶液0,5μI):鋳型DNA50ng:オリゴヌクレオチドブライ
マ−1と2の各々の20μM溶液5μl:及び100μmの最終量にするための
水74.5Iz’l。次に、最終混合物にパラフィン油100μlを重層する。
PCRをDNAサーマルサイクラ−(thermal cycler) (エリ
コンブ(Ericomp)、カリホルニア州、サンジエゴ)を用いて、最初に鋳
型を94°において90秒間変性させ、55°において75秒間再アニーリング
し、72°において150秒間cDNAを伸長させる(extend)ことによ
って実施する。PCRをステップ プログラム(94@、25秒間変性、55°
、45秒間アニーリングニア2°、150秒間伸長)を用いて、さらに20サイ
クルの増幅のために実施し、次に72°において5分間伸長させる。
サンプルをパラフィン油から取り出し、DNAをフェノールクロロホルム抽出に
よって抽出し、カラムクロマトグラフィーによってG−50(ベーリンガー(B
ehringer)、マンハイム)上に展開させる。抽出DNAの10μlアリ
コートを1%シーケム(Seakea+) (登録商標)アガロース(FMCバ
イオプロダクツ(阻0Products)、メイン州、ロックランド)上での電
気泳動によって分離させ、臭化エチジウムによって染色して、DNAフラグメン
トサイズが予想生成物に一致することを確認する。
PCR増幅cDNA生成物を次に5allとBamHI制限酵素によって標準方
法を用いて消化させる。次に、Sa I I/BamHI制限フラグメントを例
えば1,2%ジ−プラーク(Seaplaque) (登録商標)低ゲル化温度
(LGT)アガロース上でのゲル電気泳動によって分離し、所望のフラグメント
を表す帯を単離する。このフラグメントを所望の融合タンパク質をコードするベ
クター中に下記のように挿入する。
ヒトgp130cDNAを含むプラスミドベクターを大腸菌株DH5α宿主細胞
に含めて、1.991年11月14日に名称BIOG/pDc303 (DH5
α)でアメリカン タイプ カルチャー コレクション(米国、メリーランド州
、ロックヴイル)に寄託した(ATCC受は入れ番号68827)。この寄託は
ブタペスト条約の条件下で実施された。このクローン化cDNAのDNAとコー
ド化アミノ酸配列とをSEQ ID NO:1に示す。
オリゴヌクレオチド3と4をポリメラーゼ連鎖反応方法に用いて、5et(Gl
y)4Serをコードし、その後にSEQ ID NO:1のアミノ酸1〜59
7(成熟gp130タンパク質の全細胞外ドメイン)が続<DNAフラグメント
を増幅させ、単離させる。5′プライマー、オリゴヌクレオチドNo、3はSE
Q TD NO:1のヌクレオチド310〜336を含む、これらのヌクレオチ
ドは成熟gp130タンパク質の最初の9アミノ酸をコードする。このヌクレオ
チド配列はSEQ ID NO:1のヌクレオチド310〜336に相補的であ
る(−)鎖にアニーリングすることができる。オリゴヌクレオチドNO63はg
pt3o配列の直接上流(及び同じ読み取り範囲内)において5et(Gly)
、Ser配列をもコードし、さらにBspMII制限エンドヌクレアーゼ開裂部
位をSer (Gly)4 Serコード配列の5゛末端近くに位置付ける。
3°プライマー、オリゴヌクレオチドNo、4は、SEQ ID NO:lのヌ
クレオチド2080〜2100に相補的である配列を含む、すなわち、gp13
0細胞外ドメインの最後の7アミノ酸をコードするアンチ−センス ヌクレオチ
ドを含む。オリゴヌクレオチドNo、4はgp130配列の直後に終止コドンを
位置付け、Notl制限部位をも下流に挿入する。PCRによるgp130フラ
グメントの増幅後に、PCR反応生成物をBsqMIIとNotlによって消化
させ、所望のフラグメントを単離する。
上記1jF−R,Ser (Gly*5er)sGIyリンカ−1及びgp13
0フードフラグメントを下記のように一本鎖DNA配列に組み立てる。5er(
Gly、5er)sGIyリンカ−をpBLUEscRIPT SK(登録商標
)ベクターからBamHIとBspMTIによる消化によって切断する。このリ
ンカ−フラグメントを次にL I F−Rフラグメントの3′末端に結合させる
(BamHTによって、GIy、Ser配列後のその3°末端において開裂)。
この結合は通常の条件下で実施する。リンカ−フラグメントの3°末端をgp1
30フラグメントのBspMII開裂5°末端に結合させる。得られるDNAフ
ラグメントは、(5゛から3°にかけて)LIF−Rのシグナル配列と細胞外ド
メインとそれに結合する(GIy4Ser)sポリペプチドリンカ−とそれに結
合するgp130細胞外ドメインの成熟コード配列を含む本発明の受容体をコー
ドする。
このDNAフラグメントは適当なりローコンブ及び/又は表現ベクター中に挿入
することができる。例えば、pBLUEscRIPT SK(登録商標)ベクタ
ーを5alIとNotIによって消化させ、これに結合(ligated)DN
A7ラグメントを挿入する。次に、大腸菌細胞をこの組換えベクターを用いて通
常の方法によって形質転換させる。
代替え方法では、Ser (Gly4Ser)sGlyリンカ−配列を含むpB
LtTEscRIPT SK(登録商標)ベクターを5allとBam)(Iに
よって消化させ、これに上記L I F−Rコードフラグメントを挿入する。得
られるベクターを次にBspMIIとNot[によって消化させ、これにgp1
30コード化フラグメントを挿入して、本発明の受容体をコードするDNA配列
を形成する。
クローン化受容体をコードするDNAフラグメントを通常の方法を用いて、切断
して、適当な発現ベクター(所望の宿主細胞の種類に応じて選択される)中に挿
入することができる。組換え体表現ベクターによって形質転換した宿主細胞を培
養して、受容体タンパク質を製造する。本発明の組換え受容体融合タンパク質の
製造には、哺乳動物宿主細胞が一般に好ましい。
受容体コード化構造を5allとNotT消化によって切断し、哺乳動物宿主細
胞への使用に適したベクター中に挿入することができる。適当なベクターの1種
はpDc406と名付けられる。このベクターの5alI部位に挿入されたCD
NA分子はHIV及びアデノウィルスに由来する制御要素を用いて転写及び翻訳
する。pDc406はSV40、エプスタイン−バール(Epstein−Ba
rr)ウィルス及びpBR322に由来する複製起点を含む。インターロイキン
−1受容体CDNAをクローン化したpDc406はアメリカン タイプ カル
チャー コレクション(米国、メリーランド州、ロツクヴイル)に、受は入れ番
号CRL10478で、寄託されている。インターロイキン−1受容体cDNA
をこのベクターから通常の方法によって切断し、上記で製造した本発明の受容体
コードDNAと置換することができる。pcD406はダワー([)□wer)
等、J、Immunol。
142:4314 (1989)が述べているHAV−EOの誘導体である。p
CD406はHAV−EOとは、HAV−EO中のアデノウィルス2の三分節系
リーダー配列中に存在するイントロンが欠失することで異なる。
受容体融合タンパク質を表現するための適当な哺乳動物細胞の例には、両方とも
サル腎臓に由来するcv−1細胞(ATCCCCL70)とCO3−7細胞(A
TCCCRL1651)がある、他ノサルWt臓細胞ライ:/CV−1/EBN
A(ATCCCRL10478)はエプスタイン−バール ウィルス核抗原−1
(EBNA−1)をコードする遺伝子とCMV制御配列を含むベクターとによる
CV−1細胞ラインのトランスフェクションによって導出された。マクマハン(
McMahan)等、EMBOJ、10:2821 (1991)を参照のこと
。EBNA−1遺伝子はEBV複製起点を含む、例えばHAV−EO又はpDC
406のような、表現ベクターのエビソーマル複製を可能にする。
本発明のこの受容体は実施例3の受容体とは、L I F−Rポリペプチド(実
施例3の受容体では5′ポリペプチドである)がこの場合には3″ポリペプチド
であることで異なる。融合タンパク質の製造に用いるために下記オリゴヌクレオ
チドを合成した:
SEQ ID NO:12
5 ’ GATATGTCGACAAGATGTTGACGTTGCAGACT
TGG 3 ’(オリゴヌクレオチドNo、5)
SEQ ID NO:13
3° CAAACGAGTTCCTCTTTAACTTCCTCCTCCACC
TAGGTACG 5゜(オリゴヌクレオチドNo、6)
SEQ ID NO:14
5 ’ CGCGTCCGGAGGAGGTGGTAGCCAGAAA^^GG
GGGCTCCTCATG 3’(オリゴヌクレオチドNo、7)
SEQ ID NO+15
オリゴヌクレオチド5と6をポリメラーゼ連鎖反応方法に用いて、gp130の
フラグメントを単離する。5′プライマー(オリゴヌクレオチドNo、5)は、
SEQ ID NO:1のヌクレオチド244〜264 (gp130シグナル
配列の最初の7アミノ酸をコードする配列)を含む。オリゴヌクレオチドN09
5は上流5ai1部位を導入する配列をも含む。このヌクレオチド配列は5EQ
H) NO:1のヌクレオチド244〜264に相補的である(−)鎖にアニー
リングすることができる。3°プライマー(オリゴヌクレオチドNo、6)は、
SEQ ID NO:1のヌクレオチド2080〜2100に相補的である配列
を含む、すなわち、gp130細胞外ドメインの最後の7アミノ酸をコードする
アンチ−センス ヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドNo、6はcr74
Set配列をgp130配列に対して(及び同調して)直ぐ3′にコードし、下
流BamH1部位をも挿入する。
PCR反応を実施例3に述べたように、但しオリゴヌクレオチド5と6をgp1
30cDNA鋳型上で用いて、実施する。5゛ シグナル配列と全細胞外ドメイ
ンを含むが、トランスメンブラン領域と細胞質ドメインとを含まないgp130
フラグメントをコードするDNA配列をPCR反応によって単離する。Gly4
Ser配列をgp130断片の3゛末端に融合する。PCR反応生成物を5at
IとBamHIとによって消化させ、所望のフラグメントを単離する。
L I F−Rフラグメントを単離し、オリゴヌクレオチド7と8を用いるPC
R反応によって増幅する。5°プライマー(オリゴヌクレオチドNo、7)は成
熟L I F−Rタンパク質の最初の7アミノ酸をコードするSEQ ID N
O:5のヌクレオチド311〜331を含む。このヌクレオチド配列はSEQ
IDN0=5のヌクレオチド311〜331に相補的である(−)鎖にアニーリ
ングすることができる。オリゴヌクレオチドNO37はL I F−R配列の5
゛末端に融合したGly<Setをもコードし、上流BspM11部位を挿入す
る。3゜プライマー(オリゴヌクレオチドNo、8)はSEQ ID NO:5
のヌクレオチド2651〜2677 (Ll−R細胞外ドメインの最後の9アミ
ノ酸をコードする)に相補的である。オリゴヌクレオチドNo、8はまたL I
F−R配列の3゛末端に終止コドンを加え、NotI部位を下流に挿入する。
PCR反応生成物をBspMIIとNotIとによって消化させ、所望のフラグ
メントを単離する。
上記で製造したgp130フラグメントのBamHI部位を実施例3で述べたリ
ンカ−フラグメントの5゛末端のBamHI部位に結合させることによって、所
望の受容体タンパク質をコードするDNA配列を製造する。同様に、リンカ−を
コードするフラグメントのC末端を上記で製造したL I F−Rコード化フラ
グメントの相補的部位に対してBspM11部位に結合させる。得られるDNA
フラグメントを実施例3に述べた方法を用いて、表現ベクターにクローン化する
。
単離DNAフラグメントによってコードされる受容体は(N末端からC末端まで
の)シグナル配列と、LIF−Rの細胞外ドメインの成熟コード化配列に結合す
る(Gl y4se r)sポリペプチドリンカ−に結合したgp130の細胞
外ドメインとを含む。
実施例5
Fcポリペプチドリンカ−によりgp−130に結合したLIF−Rを含むレセ
プター融合蛋白
以下の方法に従って製造したレセプターを図4に表した。該レセプター融合蛋白
の製造に使用するために以下のオリゴヌクレオチド類を合成した:SEQ ID
NO:16
3− CATACATACACCACTGTTTCCTTTT^^GACTCG
GGTCTAGATACG 5− (オリゴヌクレオチドno、 9)
SEQ ID NO:17
3− CAAACGAGTTCCTCTTTAACTTCTCGGGTCTAG
ATACG 5− (オリゴヌクレオチドno、 10)LIF−1?をコード
するDNA配列を単離し、オリゴヌクレオチド1及び9を用いたPCI?反応に
より増幅させる。オリゴヌクレオチドno、1(5−プライマー)は上流に5a
lI部位を挿入するもので、実施例3に述べられている。3′プライマーはSE
Q ID NO:5のヌクレオチド2651から2677に相補的な配列を含み
、すなわちLIF−Hの細胞外ドメインの最後の9アミノ酸をコードするアンチ
センスヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドno、9である。オリゴヌクレオ
チドno、9は同様に下流にBgLII部位を挿入する。該PCR反応生成物を
5alI及びBglIIで切断し、LIF−Rをコードする望ましいDNA配列
を通常の方法を用いたゲル電気泳動により単離する。LIF−R配列中に内部B
glII部位が存在するために、BglII切断は部分的切断をもたらす条件下
で行う必要がある。
gp 130をコードするDNA断片を単離し、オリゴヌクレオチド5及び10
を用いたPCR反応により増幅させる。5−プライマー(オリゴヌクレオチドn
o、5)は上流に5alI部位を挿入するもので、先の実施例4に述べられてい
る。3′プライマーはSEQ rD NO:1のヌクレオチド2080から21
00に相補的な配列を含み、すなわちgp 130の細胞外ドメインの最後の7
アミノ酸をコードするアンチセンスヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドno
、 10である。オリゴヌクレオチドno、 10は同様に下流にBglII部
位を挿入する。該PCR反応生成物を5alI及びBglIIで切断し、gp
130をコードする望ましいDNA断片を通常の方法を用いたゲル電気泳動によ
り単離する。
ヒトIgG1抗体のFc領域に由来する一末鎖ポリペプチドをコードするcDN
Aを上記のpBLUEscRIPT SK (登録商Iりベクター中にクローニ
ングして、hIgGIFcと呼ばれる組み換えベクターを製造した。唯一のBg
l、II部位が、挿入されたFcコード配列の5−末端の近くに位置する。5p
eI部位は停止コドンのすぐ下流にある。クローニングされたFc cDNAの
開^配列及びコードされているアミノ酸配列をSEQ IDN0:3及びSEQ
ID NO+44m示す。
該cDN^によりコードされるFcポリペプチドはN末端ヒンジ領域から天然の
C末端までに渡り、すなわち本質的に抗体Fc領域の全長である。Fc断片類、
例えばC末端が切り取られたものも、使用できる。該断片は複数のシスティン残
基(少な(ともヒンジ反応に係るシスティン残基)を含む必要がある。Fcポリ
ペプチドが由来する抗体は、それから製造される融合蛋白で治療される患者と同
じ種のものであることが好ましい。
プラスミドhIgGIFcをBglII及び5alIで切断し、上記のように製
造されたBglII/5alI LIF−R断片を通常の手法により該ベクター
中に結合させる。Fcコード配列はLIF−R配列の下流であってLIF−R配
列と同じ読み取り枠内に位置する。別の反応でgp 130の上記の5alI/
BglII断片を同様に同じベクター中に挿入する。望ましいDIJ^インサー
トを含むプラスミドベクターを、通常の手法を用いた制限酵素切断分析により同
定する。
LIF−R−Fc融合ポリペプチドをコードするクローニングされたDNAセグ
メントは、5ail及びNotIで切断することによりpBLUEscRIPT
SK (登録商標)ベクターから切り出してもよい。同様に、gp 130−
Fc融合ポリペプチドをコードするDNAセグメントは、5alI/Notlで
切断することにより切り出してもよい。切り出された各DNAセグメントを、望
ましい宿主細胞のタイプに応じて適当な発現ベクター中に挿入する。適当な発現
ベクターのひとつに、実施例3に述べたように哺乳動物宿主細胞中に形質転換す
ることができるプラスミドpDc406がある。
本発明の一態様では、LIF−R−Fc融合体をコードする発現ベクター及びg
p 130−Fc融合体をコードする第二の発現ベクターを望ましい宿主細胞中
に共トランスフェクトさせる。それにより二個の別個の組み換えポリペプチドが
宿主細胞中に作られる。第一のポリペプチドはgp 130断片のC末端に枠内
融合されたFcポリペプチドを含む。第二のポリペプチドはしIF−R断片のC
末端に枠内融合されたFcポリペプチドを含む。二個のFc領域間に形成される
ジスルフィド結合は二個の別個の融合ポリペプチドを本発明のレセプター蛋白中
に共有結合させる。
或いは、LIF−R−Fcポリペプチド及びgp 130−Fcポリペプチドを
(同じ宿主細胞中に共トランスフェクトさせるのとは対照的に)宿主細胞中に別
々に形質転換してもよい。これらの二個のポリペプチドを宿主細胞から精製した
後に適当なバッファー溶液中で合わせて、それにより銀白ジスルフィド結合が二
個のFc領域間に形成される。
該レセプター蛋白はいくつかある通常の蛋白精製法のいずれを用いて精製しても
よい。抗体Fc領域はプロティンA及びプロティンGに結合するため、不溶性担
体物質に結合させたプロティンA又はプロティンGを用いたアフィニティークロ
マトグラフィーを精製工程に用いてもよい。ひとつの方法として、該レセプター
を含む1リツトルの培養上清を固体相プロティンGカラムに通し、その後カラム
をリン酸緩衛化食塩水(PBS)でよく洗浄する。吸着したFc含有融合蛋白を
5軸誠グリシンバツフアー、pH3で溶出し、’l M Trisバッファー、
pH9でpH7にする。
さらに、免疫アフィニティーカラム、例えばLIF又は03Mが結合したアフィ
ニティーカラムを含む精製を行ってもよい。
実施例6
レセプターに対するモノクローナル抗体の製造精製された本発明のレセプター蛋
白、又は高濃度の該レセプターを発現するトランスフェクトされたCO8細胞の
調製品を、例えば米国特許第4.411.993号に開示されている通常の手法
を用いて、該レセプターに対するモノクローナル抗体を生成するのに使用する。
マウスを免疫するために、レセプター免疫原をフロイント完全アジュバント中に
乳化し、to−tooμgの範囲の量でBa1b/cマウスに皮下注射する。1
0ないし12日後に、免疫されている動物をフロイント不完全アジュノくシト中
に乳化した免疫原をさらに追加投与し、その後工ないし2週間毎の免疫スケジュ
ールで定期的に追加投与する。血清サンプルは眼窩後採血又は足先端切除により
定期的に採取し、トントープロットアッセイ(抗体サンドイッチ)又はEL■S
^(酵素結合型免疫吸着剤アッセイ)によって試験する。他のアッセイ方法でも
よい。適当な抗体力価が検出された後、陽性の動物に食塩水に溶解した抗原を静
注する。3ないし4日後、動物を屠殺して牌臓細胞を採収し、ネズミ骨髄腫細胞
株NSIに融合させる。この方法により生成されたハイブリドーマ細胞株を、非
融合細胞、骨髄腫ハイブリッド、及び牌臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害するた
めにHAT選択培地(ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン)中でマ
ルチ微量滴定プレート中に接種する。
このように生成されたハイブリドーマのクローンを、例えば、エングバルら(E
ngvall etal、 )、 Immunochea+、 8巻、871頁
、1971年及び米国特許第4.704. (104号に開示されている手法の
適用により、該レセプター蛋白との反応性についてELIS^によりスクリーニ
ングすることができる。陽性のクローンをその後同系Ba1b/cマウスの腹膜
腔内に注射し、高濃度(1mg/mlより高い濃度)の抗レセプター・モノクロ
ーナル抗体を含む腹水を作らせる。できたモノクローナル抗体は硫酸アンモニウ
ム沈澱、並びにそれに続くゲル排除クロマトグラフィー及び/又はスタフィロコ
ッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)のプロテ
ィンAに抗体を結合させることに基づくアフィニティークロマトグラフィーによ
り精製することができる。
実施例7
ヘテロダイマー型レセプター
抗体のFc領域に由来するポリペプチドに融合したヒトLIF−R細胞外ドメイ
ンの断片をコードする発現ベクターを以下のように作成した。Fcポリペプチド
に融合したヒトgp 130細胞外ドメインの断片をコードする第二の発現ベク
ターも作成した。
実施例3に述べたように発現ベクターpDc303中にヒトLIP−RcDNA
を含むプラスミドpHLIF−R−65(^TCC68491)を制限酵素As
p7Lg及びXmnIで切断した。^5p7L8は該ベクターをLIF−RcD
N^DNA−トの上流で開裂させる。XmnIは縁膜領域の上流でSEQ rD
NO:5のアミノ酸No、702(^sp)に対するコドン中で開裂させて平
滑末端化させる。望ましい^5p718/XmnI断片(長さが約 2,444
bp)をアガロースゲル電気泳動により分離し、エルチップ(Elutip)
カラムを用いた通常の方法により精製した。
pBLUEscRIPT SK (登録商標)ベクター中にヒトIgG1抗体の
Fc領域に由来する一末鎖ポリペプチドをコードするcDNAを含む、hIgG
IFcと呼ばれる組み換えベクターは実施例5に述べた。クローニングされたF
c cDNAのDNA配列及びコードされるアミノ酸配列をSEQ ID No
・3及びSEQ ID NO:4に示す。いくつかの制限部位を含むポリリンカ
ー領域は該Fc cDNAに直ぐ上流に位置する。
プラスミドhIgGIFcを、該Fc配列の上流のポリリンカー中で開裂させる
^5p718及び5tuIで切断した。上記のように製造した^5p718/X
mnI LIF−R断片を開裂したhIgGIFcベクター中に通常の手法によ
り結合させた。3tuI及びXmnIは両方とも平滑末端を作り、それらの末端
はライゲートしてつながり合う。できた組み換えベクターにおいて、Fcコード
配列はLIF−R配列の下流であってLIF−R配列と同じ読み取り枠内に位置
する。コードされたLIF−R/Fc融合蛋白はSEQ ID NO:5(LI
F−R)の−44から702のアミノ酸を含み、これらのアミノ酸にプラスミド
hIgGIFcのポリリンカーセグメントによりフードされるペプチドリンカ−
を構成する6アミノ酸が続き、さらにそれにSEQ ID NO:3(Fc)の
1−232アミノ酸が続く。イー・コリ(E、 coli)細胞をライゲイジョ
ン(ligation)混合物で形質転換させ、標準的方法によりそれからプラ
スミドを単離した。望ましいDN^インサートを含むプラスミドベクターを制限
酵素切断分析法により同定した。
LIF−R/Fc融合ポリペプチドをコードするクローニングされたDNAセグ
メントを組み換えベクターから^5p718及びNotIでの切断により切り出
した。NotI酵素は該Fc cDN^DNA−トの直ぐ下流のポリリンカー領
域で該ベクターを開裂させる。切り出されたDNAセグメント(3,2kb)を
望ましい宿主細胞のタイプに応じて適当な発現ベクター中に挿入する。適当な発
現ベクターのひとつに、PCT出願W090105183に述べられている哺乳
動物発現ベクターであるpcAV/NOTがある。
pCAV/NOTを、両方ともマルチクローニング部位を開裂させる、Asp7
18及びNotIにより開裂させた。LIF−R/Fcをコードする上記のよう
に製造された^sp71g/NotIDN^断片を該ベクター中に結合させた。
可溶性gl)130/Fc融合蛋白をコードする発現ベクターを以下のように作
成した。
ヒトgp130 cDNA (実施例3に記載)を含む組み換えベクターBIO
G/pDc303 (ATCCG3827)をEcoRlで切断し、できた5゛
突出をT4 DNAポリメラーゼを用いて平滑末端化した。EcoRlに対する
認識部位はSEQ ID NO+1のヌクレオチド2056−2061を含む。
EcoRlで切断したベクターをそのL gl)130 cDN^DNA−トの
上流で該ベクターを開裂させるXhoIで開裂させた。
Fcポリペプチドをコードする上記のcDNAを含むプラスミドhIgGIFc
を、挿入されたFc cDNAの上流及び下流でそれぞれ開裂させる5tul(
平滑末端化酵素)及びNotlで切断した。上記のように単離された(EcoR
l)/XhoI gp130断片を、このFcを含む断片及びXhoI/Not
lで切断したベクターSF CAV/NOTに結合させた。哺乳動物発現ベクタ
ーSF CAV/NOTはNotI部位を含むことを除いて本質的1:sF C
AV(ATCC68922)ト同等テある。SF CAV/NOTは、バクテリ
アにおいて機能する“隠れた′プロモーターを含むアデノウィルス−2三分割リ
ーダー(TPL)のセグメントが削除されていることを除けば、PCT出願w0
90105183に記載されているpcAV/NOTとも本質的に同等である。
該”隠れた”プロモーターからの蛋白発現は、バクテリア細胞において望ましい
組み換えプラスミドを製造及び単離するには不利であろう。
E、 cal i細胞をライゲーション混合物で形質転換し、通常の方法により
それからプラスミドを単離して、望ましい組み換えプラスミドを制限分析によっ
て同定した。望ましい組み換えベクターによってコードされるgp130/Fc
融合蛋白は(N末端からC末端へ) SEQ ID NO:2(gp130)(
7)7 ミ/酸−22かう582を含み、これらのアミノ酸にプラスミドhIg
GIFcのポリリンカーセグメントによりコードされるペプチドリンカ−を構成
する7アミノ酸が続き、さらにそれにSEQ ID NO:4(Fc)の1−2
32アミノ酸が続く。
CO5−7細胞(ATCCCRL 1651)を、上記のように製造したLIF
−R/Fcをコードする組み換え発現ベクター或いはgl)130/Fcをコー
ドする発現ベクターのいずれか、又は両方の発現ベクターでトランスフェクトし
た。該細胞を培養して可溶性融合蛋白を発現させた。発現された蛋白を、培養液
上清をプロティンGセファロースビーズ(ファルマシアより入手)と共に4℃で
一晩インキユベートした後、遠心によってビーズをベレット化させることにより
回収した。ビーズに結合させた蛋白による+tq〜ラベル化ヒト・オンコスタチ
ンM及びl 26I−ラベル化ヒトLIFの結合を分析した。
結合アフィニティーを標準スカチャード分析変法により決定した。結合アッセイ
方法は、蛋白が可溶性であって、トランスフェクトした細胞の表面にあるのでは
なくプロティンGセファロースビーズに結合していることを除けば、モスレイら
(Mosley et al、 、Ce1l 59巻、335頁、1989年)
に述べられているものと同様であった。簡単に言うと、96穴の微量滴定プレー
ト中で”I−LIF又は+ 23I−オンコスタチンMのlO段階のl:2希釈
系列それぞれを、2.5%ウシ血清アルブミン、0゜2%(V/V) アジ化ナ
トリウム及び20111M Hepes、 pH7,4,を含むRPMI 16
40中に再懸濁させた(ビーズに結合した)発現蛋白を含むサンプルと共に、4
℃で2時間、攪拌しながらインキュベートした。コールドの標準競合ウェルも二
個ずつインキュベートした。子ウシ血清の入った遠心管を、ダウアーら(Dow
er et at、 、 J、 Imaunol、 132巻、751頁、 1
984年)及びパークら(Park et al、、 J、 8io1. Ch
eIl、、 261巻、4177頁、 1986年)、並びに上記の実施例1に
述べられている分離方法におけるフタル酸オイル混合液の入った管の代わりに使
用した。各インキュベージジン混合液の一定量を該遠心管に移した。遠心後、遠
心管を切断して、放射能活性を測定し標準スカチャ・−ド分析で処理した。
図7は、gp130/Fcベクター単独でトランスフェクトした細胞により作ら
れたgl:1130/FcホモダイマーによるI 25■−オンコスタチン間結
合のスカチャード分析(左上)及び、共トランスフェクトした細胞により発現さ
れた蛋白による+25I−オンコスタチンMの結合スカチャード分析(左下)を
表す。LIF−R/Fcベクター単独でトランスフェクトした細胞により作られ
たLIF−R/Fcホモダイマーによる1 131−LIF結合のスカチャード
分析(右上)及び、共トランスフェクトした細胞により発現された蛋白によるl
”5I−LIF結合のスカチャード分析(右下)を同様に図7に表す。g9L
30/Fcホモダイマーに比べて共トランスフェクトした細胞から回収された蛋
白による方がオンコスタチンMの結合が高アフィニティー側にシフトしているの
が図7から明らかである。同様に、図7のデータからLIF−R/Fcホモダイ
マーに比べて共トランスフェクトした細胞から回収された蛋白による方がLIF
の結合が高アフィニティー側にシフトしていることが示されている。結合の高ア
フィニティー側へのノットは、LIF−R/Fc及びgl1130/Fcを含む
ヘテロダイマーの存在を示しており、さらにLIF−R及びgp130部分がオ
ンコスタチンM及びLIFの結合において共同作用、即ち相互作用していること
を示して°いる。対照からLIF−RホモダイマーによるオンコスタチンMの結
合が無いこと、及びgp130ホモダイマーによるLTF結合が無いことが示さ
れている。
実施例8
FNIII ドメインを欠< LIF−R及びgp130ポリペプチドを含むレ
セプターフィブロネクチンHI型(FNIII) ドメインを欠く可溶性LIF
−R及びgp1301白をコードするDNA配列を単離し、Fcコード配列に融
合させた。FNIII ドメインの欠失には、LIF−R/FC及びgl)13
0/Fc融合蛋白のサイズを減少させるという利点がある。SEQ ID NO
:6のIJF−R蛋白は細胞外ドメインにIII型フィブロネクチン様のモジュ
ールを3回反復して含んでいる。FNIiIモジュールを含む3ドメインはSE
Q IDN0:6の、それぞれ、アミノ酸487 (Thr)から584(^s
n)、585 (Asp)から679 (Ala)、及び680 (Pro)か
ら789 (Set)を含む。gp130も同様に、SEQ IDN0:2の、
それぞれ、アミノ酸300 (Tyr)から399 (Phe)、400 (G
in)から496(Pro)、及び497 (Pro)から597 (Glu)
を含む3個のFNIII ドメインを含む。1個ないし3111全てのFNII
I ドメインをgp130又はLIF−Rから除去して該蛋白のサイズを減少さ
せてもよい。
LIF−R/Fcをコードする実施例7で製造した発現ベクターを制限酵素Ec
o 0109I(Dra IIのイソシゾマー)で切断し、できた突出部を74
DNAポリメラーゼを用いて通常の方法により充填することにより、ヒトLI
F−RのFNIIIドメインを除去した。Eco O109Iに対する認識部位
は、SEQ ID NO:5(IJF−R)のヌクレオチド1789−1.79
5に渡っており、LIF−Rの第−FNIIIドメインのアミノ酸8−9に対す
るコドン中で開裂する。開裂したベクターをその後BstXl及びEcoR5で
切断した。
BstXlに対する認識部位は、SEQ ID NO:5のヌクレオチド104
8−1059に渡っており、(平滑末端を作る)EcoR5は該Fc配列の上流
のポリリンカー中で開裂させる。
(IJF−!?の5′末端、該ベクター、全Fc配列、及び該ポリリンカ一部分
を含む)BstX1/EcoR5断片及び、BstX1/(Eco O109I
) LIF−R断片を単離し、つなぎ合わせた。E、coli細胞をライゲーシ
ョン混合物で形質転換し、それよりプラスミドを単離して、望ましい組み換えプ
ラスミドを制限分析によって同定した。できた構造物は(N末端からC末端へ)
SEQ ID NO:5(LIF−R)のアミノ酸−44から494、該ポリ
リンカーセグメントによってコードされる4アミノ酸スペーサーペプチド−Hl
s−^rg−Tyr−Val−、及びSEQ TD NO:3 (Fc)のアミ
ノ酸1−232を含む融合蛋白をコードする。該LIF−Rポリペプチド部分は
第−FNIIIドメインの最初の8アミノ酸を含むが、第−FNIIIドメイン
の残りの部分並びに第二及び第三FNIIIドメインの全てを欠いている。
gp130のFNIIIドメインを、実施例7で製造したgp130/Fcをコ
ードする組み換え発現ベクターをBstXlで切断した後に74 DNAポリメ
ラーゼを用いて通常の方法により突出部を平滑末端化することにより除去した。
BstXlに対する認識部位は、SEQ ID NO:1(gp130) ノヌ
クL/オチド1231−12421.1mmラッテり、gt1130 (7)第
−FNIIIドメインのアミノ酸10−11に対するコドン中で開裂する。開裂
したベクターをその後、該Fc配列の上流のポリリンカー中で開裂させて平滑末
端を作るEcoR5で切断した。(FNIIIドメインを欠< ) ’gp13
0の5′末端を含む(BstXl)/EcoR5断片、該ベクター配列、該Fc
配列、及び該ポリリンカ一部分をつなぎ合わせた。E、coli細胞をライゲー
ション混合物で形質転換し、それよりプラスミドを単離して、望ましい組み換え
プラスミドを制限分析によって同定した。該構造物によりコードされる融合蛋白
は、(N末端からC末端へ) SEQ ID NO:2(gp130)のアミノ
酸−22から308、該ポリリンカーセグメントによってコードされる4アミノ
酸スペーサーペプチド−^sn−^rg−Tyr−Val−、及びSEQ II
I NOO20(Fc)のアミノ酸1−232を含む。該gl)130ポリペプ
チド部分は、第−FNIIIドメインの最初の9アミノ酸を含むが、第−FNI
IIドメインの残りの部分並びに第二及び第三FNIIIドメインの全てを欠い
ている。
FNIII ドメインは、本発明のレセプターのgp130成分、LIF−R成
分、又はその両方から欠失させてもよい。本発明の一態様において、実施例7で
製造した可溶性LIF−R/Fcをコードする哺乳動物発現ベクター及び、上記
のように製造したFNIIIドメインを欠く可溶性g+)130/Fc蛋白をコ
ードする哺乳動物発現ベクターによリCO3’?細胞を共トランスフェクトした
。発現された蛋白の5O3−PAGEによる分析から、2個のホモダイマーと考
えられる分子量のものを含むバンドと共に、ヘテロダイマーと考えられる分子量
のバンドが明らかにされた。実施例7に述べた方法により行ったスカチャード分
析から、共トランスフェクトした細胞により発現された蛋白に対しての方が、対
応するホモダイマーに比べてLIF及びオンコスタチンMの結合が高アフィニテ
ィー側にシフトしていることが示されてた。この結果は、LIF−R/Fc及び
gt1130/Fcを含むヘテロダイマーの存在を示しており、さらにLIP−
1?及びgpL30部分がオンコスタチンM及びLIFの結合において共同作用
、即ち相互作用していることを示している。
配列表の簡単な説明
SEQ ID NO:1及びSEQ ID NO:2は、gp130のN末端断
片をコードするクローニングされたcDNAにおけるDNA配列及びコードされ
るアミノ酸配列を示す。
SEQ ID NO:3及びSEQ ID NO:4は、IgG1抗体のFc領
域に対応するポリペプチドをコードするクローニングされたcDNAにおけるD
NA配列及びコードされるアミノ酸配列を示す。
SEQ ID NO:5及びSEQ ID NO:6は、LIF−RのN末端断
片をコードするクローニングされたcDNAにおけるDNA配列及びコードされ
るアミノ酸配列を示す。
SEQ ID NOニアは、本発明のいずれかのレセプターを作成するのに用い
られるポリペプチドリンカ−をコードする化学合成されたDNA分子のコーディ
ング鎖のDNA配列を示す。
SEQ ID NO:8−3EQ ro NO:17は、本発明のいずれかのレ
セプターを作成するポリメラーゼ連鎖反応に用いられる種々の一重鎖オリゴヌク
レオチドブライマーのI)HA配列を示す。
」烈!
(i)配列の特性
(A)配列の長さ: 2369塩基対
(B)配列の型: 核酸
(C)鎖の数: 一本線
(D)トポロジー: 直鎖状
(u)配列の種類: cDNA to mRNA(m)ハイボセティカル:N。
(fv)アンチセンス= N。
(v)フラグメント型: N末端フラグメント(@)起源:
(F)組織の種類: human placenta(vi) I!接の起源:
(B)クローン名: B10G/pDc3o3(ft)配列の特徴:
(A)NAME/KEY: CD5
(B)存在位置二 244.、.2369(it)配列の特徴:
(A)NAME/KEY: 成熟タンパク質(B)存在位置: 310.、.2
369(ix)配列の特徴:
(A)NAME/KEY: シグナルタンパク質(B)存在位置: 244.、
.309(XI)配列: 配列番号:1
GCCACA AAA C1′G ACA GTA 入AT CTCACA k
AT GAT CGCTAT CTA GCA ACc 1S40
^11τhr Lys Lau Thr Val Asn Leu Thr A
sn Asp Arg Tyr Lau AlaτhzCTA A(J GTA
ACA 入^T CTT GTT GGCAAA TCJ CAT GCA
GCT CTT TTA 八Cτ P鴫88
L4u Thr Val Arg Asn Lau Val Gly Lys
Sat Asp Ala Ala Val Leu 丁hxATCCCT GC
CTGT GACτττ C入八 GCT kcT CACCCT GTA λ
TGG八TCへτ 入λ入 1536エl@ Pro ALa Cys 入sp
Ph@ Gin 八la ThK Hlm PffiOVal Mat As
p Lsu Ly■
GC入 TTCCCCλ大入 GAT へへ〇 入TG CTr 丁COG↑G
G入A TGCACT ACT CCλ ^GG 1511S
Aim Pha Pro Lyコ 入sp Asn Met Leu Trp
Val Glu Trp ThI Thr Pro AzgGAA TCT C
TA 入AG 入AA TAT ATA CTT GAG TGG 丁GT G
TG TTA TCA GAT 入AA@1632
Glu 5er Val Lys Lys 丁yz Hlm Lau Glu
Trp Cys Val Leu 5er Asp LysGCA CCC丁G
T ATCACA GACTGG CAA CへAG入A GAT GGT A
CCG丁GCAτ CGC16110八la Pro Cys Ile ThI
Asp 丁rp Gin Gin Glu Asp Gly Thr Val
His ArgCCT GTT TGCTTA GCA TTCc’rx T
TG All:A ACT CTT CTG GGA GTG CTG TTb
2160
Pro Val Cya Lau Ala th@L@u Lau Thr T
hI Lau heu Gly Val rxu PheTGCTTT 入AT
kAG CGA GACCTA ATT kkk PIAA CACATCT
GG CCT AAT GTT 22O11
Cys Phe Asn Lys Arg Asp Leu X1@ Lys
Lys His Ile 丁rp Pro Asn Va1620 625 G
30
CCA GNT CCT TCA MG AGT CAT )ITT GCCC
AG TGOTCA CCT CACACT CCT 22T6
Pzo Asp Pr口 Ser Lys 5er HLs 工1@ Ala
Gin Trp Sir Pro Hls 丁hr Pz。
CCA AGG CACMT TTT AAT TCA AAA GAT CA
A ATG TAT TCA GAT GGC入Aτ 23O4
Pzo 八rg His Aan Ph@ 入sn Ser Lys Asp
Gln Met Tyr Sar Asp Gly ^5nTTCACT GA
T GTA AGT GTT GTG GAA ATA GAA GCA AA
T GACAAA AAG CCT 2R52
Phe Thr Asp Val 5er Van Val Glu Ile
Glu Ala 入3n 入5p Lya Lya Pr。
670 675 6日0
(i)配列の特性
(A)配列の長さ: 708アミノ酸残基(B)配列の型: アミノ酸
(D)トポロジー: 直鎖状
(ム)配列の種類: タンパク質
(Xi)配列: 配列番号:2
Mat Lauτhr Lau Gin Thrτtp Leu Val Gi
n Aia Leu Phe Il@Phe LauThr Thr Glu
Ser Thr Gly Glu Leu Leu ASP Pro Cys
Guy Tyr Xle 5erPro Glu SII: Pro Val
Val Gin Lau HLs S七λsn Ph@τhr Ala VaL
CysVal Leu Lys Glu Lys Cys Met Asp
Tyr Phe I(is Val 八sn Ala Asn Ty■
rye Val Trp Lys Thr Asn HLs Phe Thr
Ile Pro Lys Glu Gin Tyr ThI45 .50 55
!le Ile 入sn Arg Tht Ala Sex 5ar Val
Thr Pha ThI Asp XLe ALa 5erLeu入sn 工i
@Gin Leu T?+r Cys Asn Lie Leu Th、w P
he Gly Gin Leu GLuGin Asn Val Tyr Gl
y rle ThI: Xis Ile Ser Gly Leu Pzo P
ro GLu Ly■
Pro Lysλs* Leu Set Cya Xis Val Asn G
lu Gly Lys Lys Met^rq Cysllo 115 120
Glu Trp Asp Gly Gly Arg GLu Thr HiS
Leu Glu Thz x!n f’he Thr La■
Lys Ssr Glu Trp Ala Thr HLs Lys Ph@A
la Asp Cys Z、ys Ala Lys 八tgAsp Thr P
ro Thr Set Cys Thi Val Asp Tyr Ser T
hr Val 丁yr Pha Va1Asn Ile Glu Val Tr
p vaL Glu Ala Glu Asn Ala Lau Guy Ly
s Va1τhiS@i Asp His X1* Aan Phe Asp
Pro VaL Tyr Lya Val L+y3 f’ro Asn P煤
B
Pro )lis Asn Leu Ser Val XL@Asn Ser
Glu Glu Leu Set Ser ILe Lau2(Is 210
215
Lys Leu Thr Trpτ?++e Asn Pro 5er XLe
Lys Ser Val rla Ile Leu Ly■
?yt Asn Xls Gin Tyr Argτhr Lys A!IP
Ala S@r Thr Trp See Gin HePro Pzo Gl
u Asp 丁hr ALa Ssr The Arg Ser Sex Ph
e ThI Val Gin MpLeu Lys Pro Ph@ Thi
G工U Tyr Val Phe Atg ZLe Aeg Cys にat
Lys GLu2’0 275 280
Asp GLy Lys Gly Tyr Trp Ser Asp 丁rp
Sex Glu Glu Ala Ser GLy XL@Thr Tyr G
Lu Asp Arg Pro Set Lys Ala Pro Ser P
he Trp Tyr Lys XLeAspProSerH1sThzGin
GlyTytAtgThrValGinL@uVa工τzpLysThr Le
q Pro Pzo Phe Glu 八la Aan Gly Lys rl
e Leu Asp Tyr Glu Va1τhr Leu Tht Arg
Trp Lys Ser His Leu Gin Asn Tyr Thr
Val Asn Alaτhr Lys Leu Thr Val Asn
Leu Thr Asn Asp Arg Tyr Leu Ala Thz
LeuThr Val Atg Asn Leu Val Gly Lys S
ex Asp Ala Ala VaL Leu Thr X1s31i0 3
85 390
pro Ala Cys Asp Phe Gin Ala Thr HLs
Pro Val Met Asp Leu Lys AlaSet VaL L
ys Lys Tyc 工is Leu Glu Trp Cys VaLIa
u Set Asp Lys 八18Pro Cys Ile Tht Asp
Trp Gin Gin Glu Asp Gly Thr vax HAs
入zg でhcTyt Leu kKq Gly Asn !、eu Aha
GLu Sex Lys Cys τyrL・U 工1・ 丁hr Va工τ
hr f’ro Van 丁yr 入is Asp Gly PI:a GLy
S@r Pr:o Glu Sar 工Le L+ys@^1轟
475 411+1 4115 490〒y1 Leu Lys GLn Al
a flro Pro S酊LYS GlyPt6τhr Val Arg T
hr Lys495 500 5Q5
Lys VaL GLy Lys 入sn Glu 入1a Val Lau
Glu Trp ksp Gin Lau Pro Va1Asp VaI G
in Asn Gly Pha Zl@ Aig Asn Tyr Thc Z
le Phe τyf Arg Th【11a Ile Gly AsnGlu
Thr^la Val Asn Val Asp Ser Sei )Iis
τht Glu540 545 5SQ
Tyr Th【 Leu Ser See Lau ThE Sat 入sp
The tau Tyt Met vaL 八xq Met^11 ^11 T
yc Thr Asp Glu Gly Gly Lys Asp GLy P
to Glu Pha Thaw PhE
575 5B0 5@5
Thr Thr Pr:o Lys Pha 入La Gin Gly GLu
工i@ GLu 入λ畠 工1@ Vlll Van P秩B
Val cys t、eu^1a Pha Lau Leu Thr Thf
Lau Lau GLy Vai Lsu f’he Cyr
Phe^sn Lys Arg^sp Leu エエs Lys Lys Hl
s rl@Trp Pro Asn Val Px。
Asp 1lro 5er Lys Sst HLs rle Ala Gin
Trp Set Pr6 HLs Thr Pro P(O
1i3S 640 645 650
^tq Hi、s Asn Ph@Asn Sar Lys Asp Gin
Met Tyr Ssr 八sp GIy Asn Pheτhr: 八sp
Val Ser Val val Glu ti@ GLu Aha Asn
)+sp Lys Lys Pro P■■
670 、 675 680
(2)配列番号:3
(i)配列の特性
(A)配列の長さ; 705塩基対
(B)配列の型: 核酸
(C)鎖の数−一本舗
(D)トポロジー: 直鎖状
(ii)配列の種類: cDNA to mRNA(Uハイボセティカル二 N
O
(汁)アンチセンス= NO
(報)il!接の起源:
(B’)クローン名: hIgGIFc(f)配列の特徴:
(A)NAME/KEY: CD5
C8>存在位置: 1.、.699
(xi)配列: 配列番号:3
(2)配列番号:4
(D配列の特性
(A)配列の長さ: 232アミノ酸残基(B)配列の型: アミノ酸
(D)トポロジー: 直鎖状
(■)配列の種類: タンパク質
(尤)配列: 配列番号=4
Glu Pro Arg S@t Cys^sp Lys ThtHLs〒hr
Cys Pro Pro Cys prロA工1L 5 10 15
(2)配列番号=5
(1)配列の特性
(A)配列の長さ: 3182塩基対
(B)配列の型: 核酸
(C)鎖の数−一本線
(D)トポロジー: 直鎮状
(ii)配列の種類: cDNA to mRNA(出)ハイポセティカル:N
0
(tv)アンチセンス: No
(W)フラグメント型: N末端フラグメント(@)起源:
CF)組織の種類: human placenta(n)直接の起源:
(B)クローン名: pHLIFR−65(ix)配列の特W!、:
(A)NAME/KEY: 成熟タンパク質(B)存在位IE: 31.1.、
.3182(it)配列の特徴:
(A)NAME/KEY: CD5
(B)存在位置: 179.、.3182(iX)配列の特徴:
(A)NAME/KEY: シグナルタンパク質(B)存在位置: 179.、
.310(江)配列の特徴:
(A)NAME/KEY: 成熟タンパク質(B)存在位置: 311.、.3
182CAGAAAGGGA GCC丁CTGCGA CTCAττC^τCG
CCCTCCAGG ACTGACτGCA TTGCA(AG P711
(2)配列番号=6
(f)配列の特性
(A)配列の長さ: 1001アミノ酸残基(B)配列の型: アミノ酸
(D)トポロジー: 直鎖状
(il)配列の種類: タンパク質
(xl)配列・ 配列番号=6
Thf L4* 八sn Gly rays Asp Thr Lsu His
HLs Trp Ser Trp Al轟 5er 入3■
150 Ass 16O
Net i’rcl Leu GLu Cys Ala El@ +41s P
ha Val Glu His Arg Cys Tyr H1e
165 170 1フ5 180
Asp Asn Lau Hls Pha Sir Gly Lsu Glu
Glu Trp Sar 入5p Trp 5er Pに0Val Lys A
sn Ila 5er 丁rp Xka Pro Asp Set Gin T
he Lys Val Phs Pr。
200 205 21G
Gin Asp Lys val X1e Leu VaL GLy Ser
入sp 工1* Tht 1Fhe Cys Cys Vak
S@r Gin Glu Lys Val Lau Ser Ala XAu
Ile Gly +4is Thr Asn Cys PrB
L4u ILe His Lau Asp Gly Glu Asn Val
入1a Ile Lys rle Arg Agn Il・S@t Val 5
ar Ala Ser Ser Gly Thf Asn VaI VaL P
he Thr 丁hr Glu 八3p八snZ工@ Phe Gly Thr
Val 1Le Pha 八la Gly Tyr Pro Pro Asp
The PzOGin Gin Lau Agn Cys Glu Thr
HLs 八sp Leu Lys GLu ILe ZLe Cys 5eeT
rp Asn Pro Gly Arg Val Thr 八La Leu V
al Gly pro Arg ALa Thr 5sr310 1に5 32
G
Tyz Tht Lau Val GLu Sat ph@Set Gly L
ys Tyr valAla Lau LyB ktqGly Arg Sar
Gin Set Thr ILe Lau Val 入3n 11e Thf
Glu Lys Val 丁yr375 3!10 385
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Lys A5p ff1s 入sn Ser Thr Al■
Val Lys L舒u Ser Trp )lis Leu Pta GLy
Asn Phe ALa Lys XLe 八sn t’■■
Lau Cys Glu ILe Glu Ila Lys Ly3 Ser
八sn 5er Val Gin Glu Gin 八【9425 430 Q
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Ser Ser 丁yr Leu Val 八λδ Ll撃■
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65
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S@t All’l 1−y5 !、ys Glr+−14Pg
鴫7o4フ5480
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iy Pro Asp でhr 丁xp Arg Glu4115 490 4
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11− τ7f テrp Lya Pro Leu Pr。
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Lu GLu The Gin Sat Leu Se+: Glu Xle
Pro Asp Pro Gin H1■
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AsnAspAspL自uLysIleGluGinValValGlyMet
GlyLys Gly rle Leu Leu Thrτrp )lis T
yr^sp Pro Agn Met Thr Cys ksp600 GO5
610
丁yr Val Zle Lys Trp Cys Asn Se+: Sar
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Thr GLu 丁hr Val 工is Glu 5exksp GLu !
’h@ 八r:q Pro Gly Lle Arg Tyr Asn Phe
Phe Leu Tyt: Gly bys
645 650 G55 660
Atg Asn Gin Gly Tyr Gin Lau Leu Arg
SeffMat Xie Gly Tyt rle Glu665 670 6
フ5
Qlu Lau 入1a Pro Ile Val ALa Pto Asn
Pha Thf Val Glu Asp 丁hr5・にAlll Asp S
et XLa Leu Val Lysτrp Glu Asp Ila Pt
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Gly Tye Leu Phe Tyr Phe Gly Lys Gly
Glu ArgAsp Thr Ser Lys Maj Aeq Val
Lau Glu See Gly 入r:q See 入sp ILe Lソr
フ25 730 735 740
Val Lys Asn Ile 丁hr Asp Els Sar Gin
Lys Thf Leu Azg XLe 八la AsnL@u Gin G
Ly Lys Thr Sar Tye 1(is Leu Val Lau
八xq 入L& TVτ 丁hz )IrP
760 765 77G
Gly Guy Val Gly Pro Glu Lys Ser Mac
丁yr Val Van Thr Lys Glu Asn775 フ110
7115
Ser Val Gly Leu Ule Ile 八La He Lau I
Le 1ito VaL へ1晶 Val 八la VatXl@ Vat G
ly Val Val Thf Ssr 工1a Lau Cys Tye A
rg Lys Azg Glu 丁rp8051!10 815 B20
(2)配列番号ニア
(i)配列の特性
(A)配列の長さ: 100塩基対
(B)配列の型: 核酸
(C)鎖の数−−末鎖
(D)トポロジー・ 直鎖状
(ii)配列の種類: cDNA
(:d)配列: 配列番号ニア
GへτCAGGTGG AGGAGGττCT GGAGGTGGAG GTT
CCGGλAτ 100(2)配列番号:8
(i)配列の特性
(A)配列の長さ= 36塩基対
(B)配列の型: 核酸
(C)鎖の数二 −重鎖
(D)トポロジー: 直鎖状
(■)配列の種類: cDNA
(xi)配列: 配列番号二8
G^TATGTCGA CGATGATGGA TATTTACGTA TGT
TTG(2)配列番号:9
(i)配列の特性
(A)配列の長さ: 48塩基対
(B)配列の型: 核酸
(C)鎖の数二 −重鎖
(D)トポロジー; 直鎖状
(if)配列の種類: cDNA
(xi)配列: 配列番号:9
36 GCATGGATCCACCTCCTCCk G八人ででττCCT τ
τGτC八CCAへ 入T入C八TAC(2)配列番号:12
(1)配列の特性
(A)配列の長さ: 35塩基対
(B)配列の型; 核酸
(C)鎖の数: −重鎖
(D)トポロジー: 直鎖状
(if)配列の種類: cDNA
(d)配列: 配列番号:12
LaTA?CXCGA CAAGkTGTTG ACGTTGCAGA CTT
GG 35(2)配列番号:13
(D配列の特性
(A)配列の長さ: 41塩基対
(B)配列の型: 核酸
(C)鎖の数: −重鎖
(D)トポロジー: 直鎮状
(ii)配列の種類: cDNA
(xl)配列: 配列番号:13
GC八へGGATCC八CCTCCτCCT T(入ATTTC丁CCTTGA
GCkAA C41(2)配列番号:14
(i)配列の特性
(Δ)配列の長さ= 44塩基刻
CB)配列の型: 核酸
(C)鎖の数二 −重鎖
(D)トポロジー: 直鎖状
(if)配列の種類: cDNA
(xol)配列: 配列番号=14
CGCGTCCGGA GGAGGTGGTA GCCAGAAAAA GGG
GGCTCCT CATG ”(2)配列番号=15
(i)配列の特性
(A)配列の長さ: 43塩基対
CB)配列の型: 核酸
(C)鎖の数: −重鎖
(D)トポロジー・ 直鎖状
(ii)配列の種類: cDNA
(xi)配列: 配列番号=15
GC八へGCGGCCGCτ八入へ入Aττ TTCCτ丁TGTCACCAC
λτACA TAC43(2)配列番号=16
(i)配列の特性
(A)配列の長さ二 45塩基対
(B)配列の型: 核酸
(C)鏑の数: −末鎖
(D)トポロジー: 直鎖状
(■)配列の種gi: cDNA
(xt)配列: 配列番号;16
GCATAGA丁CT GGGCTCAG入A τ↑τTCCTTTG TCA
CCACATA CATAC(2)配列番号:17
(i)配列の特性
(A)配列の長さ−38塩基対
(B)配列の型: 核酸
(C)鎖の数: −末鎖
(D)トポロジー: 直鎖状
(if)配列の種類: cDNA
(対)配列: 配列番号;17
浄書(内容に変更なし)
FIGURE4
…1w−−P+1Ffv−−炉一虐fツー管帽慴−−雫r−断−−n−−−−−
門?−1書114’#anml+1+−1+++mml1+T+l+1++l+
Inl+t+修−++kl+lr+に+1+allIns++?神kHP+に+
1++
丑、 E:iヨ===ミE::ミ:=巨!百讐二百:; :! il :; 巨
!星=二:工真ミfi、 :、 :I11雇/ダ薯
りuOり/」
手続補正書
Claims (20)
- 1.オンコスタチンM及び白血病抑制因子に結合することができるレセプターで あって、LIF−Rに共有結合しているgp130を含むレセプター。
- 2.請求項1記載のレセプターであって、当該レセプターが可溶性LIF−Rポ リペプチドに共有結合している可溶性gp130ポリペプチドを含むレセプター 。
- 3.請求項1記載のレセプターであって、当該レセプターがポリペプチドリンカ ーによってLIF−Rに共有結合しているgp130を含むレセプター。
- 4.請求項3記載のレセプターであって、当該レセプターが以下の式R1−L− R2又はR2−L−R1 (式中、R1はgp130を表し;R2はLIF−Rを表し;Lはポリペプチド リンカーを表す)の組み換え融合蛋白であるレセプター。
- 5.請求項4記載のレセプターであって、該ポリペプチドリンカーがグリシン、 アスパラギン、セリン、スレオニン、及びアラニンから成る群から選択される2 0ないし100アミノ酸を含むレセプター。
- 6.請求項5記載のレセプターであって、該ポリペプチドリンカーが、式中nが 4−12を示す(Gly4−Ser−Gly5−Ser)2及び(Gly4−S er)■から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むレセプター。
- 7.請求項4記載のレセプターをコードする単離されたDNA。
- 8.請求項7記載のDNA配列を含む組み換え発現ベクター。
- 9.請求項8記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
- 10.請求項3記載のレセプターであって、gp130のC末端に結合した抗体 Fc領域ポリペプチドを含む第一の融合ポリペプチド及びLIF−RのC末端に 結合した抗体Fc領域ポリペプチドを含む第二の融合ポリペプチドを含み、当該 第一の融合ポリペプチドが当該第二の融合ポリペプチドに該Fc領域ポリペプチ ド間のジスルフィド結合により結合しているレセプター。
- 11.請求項1、4、又は10に記載のレセプターであって、a)SEQ ID NO:1のヌクレオチド244−2369を含む第一のDNA配列、SEQ ID NO:1のヌクレオチド310−2369を含む第二のDNA配列、及び 緩和にストリンジェントな条件下で当該第二のDNA配列にハイブリダイズする 第三のDNA配列から成る群から選択される単離DNAによって、当該gp13 0がコードされ;且つb)SEQ ID NO:5のヌクレオチド179−31 82を含む第一のDNA配列、SEQ ID NO:5のヌクレオチド311− 3182を含む第二のDNA配列、及び緩和にストリンジェントな条件下で当該 第二のDNA配列にハイブリダイズする第三のDNA配列から成る群から選択さ れる単離DNAによって、当該LIF−Rがコードされるレセプター。
- 12.請求項10記載のレセプターであって、当該gp130が可溶性gp13 0ポリペプチドであり、当該LIF−Rが可溶性LIF−Rポリペプチドである レセプター。
- 13.可溶性gp130ポリペプチドのC末端に結合した抗体Fc領域ポリペプ チドを含む融合蛋白。
- 14.請求項13記載の融合蛋白をコードする単離されているDNA配列。
- 15.可溶性LIF−RポリペプチドのC末端に結合した抗体Fc領域ポリペプ チドを含む融合蛋白。
- 16.請求項15記載の融合蛋白をコードする単離されているDNA配列。
- 17.Fc領域ポリペプチド間のジスルフィド結合により結合している、請求項 15記載の二個の融合蛋白を含むホモダイマー型レセプター。
- 18.請求項4記載のレセプターを製造する方法であって、当該融合蛋白をコー ドするDNA配列を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞を当該融合蛋白 の発現を促進させる条件下で培養すること、及び当該融合蛋白を回収することを 含む方法。
- 19.請求項10記載のレセプターを製造する方法であって、当該第一の融合ポ リペプチドをコードする第一の発現ベクター及び当該第二の融合ポリペプチドを コードする第二の発現ベクターで共トランスフェクトした宿主細胞を当該第一及 び第二融合ポリペプチドの発現を促進する条件下で培養すること、及び当該レセ プターを回収することを含む方法。
- 20.オンコスタチンM又はLIFが介在する疾患を治療するための、請求項1 、4、10、又は12に記載のレセプター及び適当な希釈剤又は担体を含む、医 薬用組成物。
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JP2021531002A (ja) * | 2018-07-20 | 2021-11-18 | ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー | 可溶性ポリペプチド、および白血病抑制因子の活性を阻害するためのその使用方法 |
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