JPH07501563A - 界面動電法およびクロマトグラフィー法におけるポリアクリルアミドマトリックスのための新規な配合物 - Google Patents
界面動電法およびクロマトグラフィー法におけるポリアクリルアミドマトリックスのための新規な配合物Info
- Publication number
- JPH07501563A JPH07501563A JP5509738A JP50973893A JPH07501563A JP H07501563 A JPH07501563 A JP H07501563A JP 5509738 A JP5509738 A JP 5509738A JP 50973893 A JP50973893 A JP 50973893A JP H07501563 A JPH07501563 A JP H07501563A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- acrylamide
- matrix
- gel
- formula
- polymerization
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
- B01J20/291—Gel sorbents
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/22—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising organic material
- B01J20/26—Synthetic macromolecular compounds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
- C08F20/00—Homopolymers and copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and only one being terminated by only one carboxyl radical or a salt, anhydride, ester, amide, imide or nitrile thereof
- C08F20/02—Monocarboxylic acids having less than ten carbon atoms, Derivatives thereof
- C08F20/52—Amides or imides
- C08F20/54—Amides, e.g. N,N-dimethylacrylamide or N-isopropylacrylamide
- C08F20/58—Amides, e.g. N,N-dimethylacrylamide or N-isopropylacrylamide containing oxygen in addition to the carbonamido oxygen, e.g. N-methylolacrylamide, N-acryloylmorpholine
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
- G01N27/416—Systems
- G01N27/447—Systems using electrophoresis
- G01N27/44704—Details; Accessories
- G01N27/44747—Composition of gel or of carrier mixture
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2220/00—Aspects relating to sorbent materials
- B01J2220/50—Aspects relating to the use of sorbent or filter aid materials
- B01J2220/54—Sorbents specially adapted for analytical or investigative chromatography
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Electrochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)
- Polymerisation Methods In General (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
法およびクロマトグラフィー去におけるポリアクリルアミドマトリックスのため
の 夫な ム勿本発明は、以下のような独自の特徴を有する新規なポリアクリル
アミドマトリックスに関する。すなわち、a)非常に高い耐アルカリ加水分解性
;b)高分子との疎水性相互作用を回避するための高い親木性;C)高めのポロ
シティ−(大きめの分子質量のモノマーの使用による、あるいは重合段階での側
方凝集剤の使用のいずれかによる);
d)I準的な酸化還元の対(過硫酸塩とN、N、N’ 、N’ −テトラメチレ
ンジアミン、TEMED)で重合されたマトリックスに典型的な、酸化性の欠如
という特徴である。
発明の背景
本発明によると、上記の特徴を示すマトリックスが、同じく本発明に属する方法
を使用することにより、独自の分類のN−モノ−もしくはジー置換アクリルアミ
ドモノマーの重合または共重合を経て得られる。同様に本発明に含まれるものは
、上に述べたアクリルアミドのそのようなポリマーまたはコポリマーの混合物に
よって、あるいは、そのようなポリマーおよびコポリマーと、アガロース、デキ
ストランもしくは他の親水性ポリマーとの混合物によって得られるマトリックス
である。
ゾーン電気泳動における分離のためのポリアクリルアミドマトリックスは、Ra
ymondとWeintraubにより、すでに1959年に導入され(Sci
ence、 130.1959.711−712 ) 、 Davis (An
n、 N、 Y。
Acad、 Sci、 121.1964.404−427 ) 、0rnst
ein (Ann、 N、 Y、 Acad。
Sci、 121.1964.321−349 )およびHjerten (J
、 Chromatogr、 11゜1963、66−70 )により、ディス
ク電気泳動における使用についてさらに促進された。電気泳動の支持体としての
それらの普及は、a)紫外線をはじめとする光の透過性;b)帯電基の不在によ
る電気的中性;c)広い間隔のポロシティ−においてゲルを合成する能力のよう
な、いくつかの基本的な特性に由来する。何年もの間、最大の普及を得たモノマ
ーの対は、アクリルアミドと、架橋剤であるN、N’ −メチレンビスアクリル
アミドとを対にしたものであった(P、 G、 Righetti、 J、 B
iochem、 Biophys、 Methods 19.1989゜1−2
0)。しかし、長らく使用されると、そのようなマトリックスのい(つかの欠点
が注意をよぶようになった。もっとも劇的な障害は、アルカリ性pH値でのその
不安定性である。電気泳動を実施した後(タンパク質および核酸のいずれについ
ても大部分の界面動電的分離はアルカリ性pH値で起こる)、ダングリングアミ
ドボンドが部分的に加水分解されてカルボキシル基を生み、このカルボキシル基
はポリマーに共有結合したままとどまり、このようにして、このポリマーがポリ
アクリレートに転換される。この現象が強い電気浸透を生み、同時にマトリック
スが膨潤し、がなりひずむ。実際には、電気泳動を1回実施しただけで、ポリア
クリルアミドマトリックスは再利用できなくなる。このことは、再利用性マトリ
ックスが利用できれば分析時間が大幅に短縮され、世界中でそのようなプロジェ
クトの迅速な進展が可能になるであろうヒトゲノムの配列決定(sequenc
i ng)のような大規模プロジェクトにおいて、その使用を厳しく制限する。
安定なマトリックスはまた、毛管ゾーン電気泳動(CZE)において、部分的に
加水分解されるか、誤動作を起こして、ゲルを毛管から押し出すことができない
場合に、実に有用であろう。
もう一つの一般的な問題は、ポリアクリルアミドによって効率的にふるい分ける
ことができる分子の大きさの範囲が限られることである。このようなポロシティ
−(porosity)の範囲は、数nm(2〜3 nm)から希釈度の高いマ
トリックスにおける約20〜30nmまでの孔の大きさを包含する。このことが
タンパク質分離へのポリアクリルアミドの利用を制限し、これに対してアガロー
スゲルは、今日、核酸断片の分離にほぼ独占的に使用されている。このように、
ポロシティ−の高いポリアクリルアミドマトリックスは、核酸の、長手方向の、
ある間隔における分画をも可能にするであろう。
第三の問題は、標準的な酸化還元の対の触媒、すなわち過硫酸塩とTEMEDと
の触媒の使用に関連する。これは、酸化還元の対であるため、アミノ基(第一級
から第三級まで)を含む多くの物質を酸化させて、N−酸化物を生成することが
ある。過剰の過硫酸塩を陽極に放出した後でもゲルの中に残るこのようなN−酸
化物は、タンパク質、特に−SH残基を酸化させてジスルフィド結合(−5−5
−)にすることがある。
いくつかの初期の特許出願は、上に述べた問題のいくつかを取り上げ、異なるタ
イプのモノマーを提案している。ある例(Kozulic。
B、およびMo5bach、 K、の特許、PCT/EP88100515.1
988年6月10日)には、Trisacryl [N−アクリロイルトリス(
ヒドロメチル)アミノメタン、NATIが、電気泳動のための親水性の大孔ゲル
を製造することが提唱されている。該Trisacrylモノマーは、実際に、
クロマトグラフィー支持媒体に提案されていた(Girot、 P、およびBo
schetti、 E、 、J、 Chromatogr、213.1981゜
389−396 )。以下に示すように、このモノマーは、親水性の強いもので
はあるが、零次の反応速度で崩壊するため、固有の不安定性をこうむるものであ
る。たとえば再利用性マトリックスまたは長期貯蔵マトリックスへのその使用を
、明確に提唱することはできない。もう一つの特許出願(Kozulic、 B
、の欧州特許第88810717.4号、1988年10月19日)には、N−
アクリロイル(またはメタクリロイル)−1−アミノ−1−デオキシ−D−グリ
シドールまたは相当するD−キシリトール誘導体のようなアクリルアミド糖類が
提案されている。良好な親水性と、非置換アクリルアミドよりも大きな分子量を
たしかに有するこの分類のアクリルアミドモノマーもまた、零次の反応速度で崩
壊するため、きわめて不安定であり、したがって、上に述べたポリ(NAT)と
同様、有効な代替品になりつるとは考えられない。もう一つの出願(Shorr
、 R,およびJain、 T、の欧州特許第89107791.9号、198
9年4月28日)には、電気泳動支持媒体として、上述の七ツマ−のいくつかを
はじめとする、広範囲のN−モノ−およびジー置換アクリルアミドモノマーが提
案されている。しかし、5horrおよびJainは、この大きな分類の電位性
モノマーのうち、わずか2種の好ましい混合物を取り出している(そして市販化
している)、次のように述べている(原文どおり)。「ある好ましい実施態様に
おいては、ポリマーは、N、N−ジメチルアクリルアミドとエチレングリコール
メタクリレートとの架橋重合によって形成される。もう一つの好ましい実施態様
においては、ポリマーは、N、N−ジメチルアクリルアミドおよびヒドロキシエ
チルメタクリレートとN、N−ジメチルアクリルアミドとの架橋重合によって形
成される。」これらの処方も最適なものとは考えられない。
以下に示すように、N、N−ジメチルアクリルアミドおよび同様なアルキル置換
アクリルアミドはあまりにも疎水性であり、一方、種々のメタクリレート架橋剤
も同様に加水分解を受けやすく、疎水性である。この結果として、このような処
方を含有する市販の製品(Hydrolink )は、モノマーの可溶化を助け
るために洗剤を含有しなければならない。相当するエマルションはしばしば凝集
する。これらの例は、さきに明瞭に述べた問題、すなわち、高い親水性と、高い
耐加水分解性と、大きめの孔の大きさとを同時に有する新規なマトリックスの設
計が適切に取り上げられたことはな(、解決からはほど遠いことを示す。
発明の記載
本発明は、そのような不都合を解消して、界面動電的分離において大きく優れた
結果を出すことができる新規な配合物を提案する。
このような配合物は、以下の式(I)で示される独自の分類のモノマーの重合ま
たは共重合を経て得られる。
式中、Rは、水素またはCHsを表し;R1およびR2は、独立して、水素また
は式−[(cot)、、−o−(co、)Il−o)N)! (式中、n=2ま
たは3であり、N=1〜5、好ましくは1である)で示される基を表す。
ただし、R1およびR2の一方は水素とは異なる。式(I)の好ましいモノマー
は、N−(2−ヒドロキシエトキシ)エチルアクリルアミド(=N−アクリロイ
ルアミノエトキシエタノール)もしくはN−置換誘導体または相当するメタクリ
ルアミド誘導体である。
これらのモノマーのポリマーおよびコポリマー(たとえばN、N−ジメチルアク
リルアミドとの)は、良好な親水性、きわめて高い耐加水分解性、および従来の
ポリアクリルアミドよりも大きなポロシティ−を示す。そのような特徴は、アガ
ロース/ポリアクリルアミドのような混合床マトリックスにおいても見出すこと
ができる。
後者は、前記のモノマーによって得ることができる。
本発明はまた、酸化還元または好ましくは光触媒作用を介して、しかし側方凝集
剤(たとえばポリエチレングリコール)の存在において、高いMrのタンパク質
および核酸断片を分解することができるポロシティ−の高いマトリックスを製造
するためのゲルを得る(重合または共重合による)ための手法を包含する。後者
の手法において、重合(または共重合)を側方凝集剤の勾配の存在において実施
するならば、一定量のモノマーがゲル中に存在する場合でさえ、ポロシティ−の
勾配を得ることが可能である。また、上記のモノマーを、たとえばリボフラビン
と光によって、しかし好ましくはメチレンブルーによって光重合(または光共重
合)させて(一般的にはトルエンスルフィン酸ナトリウムおよび塩化ジフェニル
ヨードニウムの存在において)、上に述べたように、N−酸化物を含まず、それ
ゆえ、タンパク質を酸化させることのないマトリックスを形成することもできる
。本発明はまた、工業、研究および分析の用途のためのすべての界面動電法に使
用されたり、クロマトグラフィー支持媒体として粒状物質(単独で、またはプラ
スチックもしくはガラスのビーズの表面コーティングとして、あるいはアガロー
スおよび他の親水性ポリマーと組み合わせて)の形態で使用される、長期貯蔵の
ためのゲルスラブを製造するための、上記の式(I>のモノマーの使用を含む。
本発明によるマトリックスの利点を以下に論じ、例示する。
新規な分類のN−モノ−およびジー置換モノマーアクリルアミドに基づくポリア
クリルアミドマトリックス図1の実施例は、従来のアクリルアミドの加水分解速
度を、従来のN−モノ−およびジー置換アクリルアミドおよび本発明による新規
な分類のモノマーと比較して示す。0.INのNaOHに溶解した遊離モノマー
を、表示の時間、70℃で装置し、中和し、ついでマンデル酸を内標準として使
用する毛管ゾーン電気泳動によって分析した。BeckmanシステムGold
によって、ピーク積分を得た。
Kozulicによって報告された親水性の高いモノマー(アクリルアミド糖類
)ならびにKozulicとMo5bachによって報告された親水性の高いモ
ノマー(NATもしくはTrisacryl )のすべてが、どのように零次の
崩壊速度を示し、そのような分子固有の不安定性を示唆するかを理解することが
できる。従来のタイプの種々のN−モノ−およびジー置換アクリルアミドはすべ
て、アクリルアミドの一次崩壊速度と形状でそれほど違わない一次崩壊速度を示
す。対照的に、本発明に報告されるモノマー[たとえばAAEE、N−(2−ヒ
ドロキシエトキシ)エチルアクリルアミド]は、きわめて高い加水分解安定性の
独自の挙動を明らかに示す。
モノマーを、溶液中に遊離させるのではなく、ポリマーマトリックスに係合させ
ると、安定性における相違はさらに強められる。図2において再び、従来のN−
置換アクリルアミドの安定性を、ここではポリマー網状質で比較している。この
実験では、すべてのポリアクリルアミドを球体として合成しく乳化重合により)
、ついでそれを0.INのNaOH中、70℃で、図2に表示した時間、加水分
解した。ポリマーの加水分解の程度の評価は、前端分析により、アミド結合が加
水分解したときに得られる遊離カルボキシルの滴定によって実施した。従来のポ
リアクリルアミドにおいて、わずか2時間の(M置で少な(とも30%のモノマ
ーがいかに加水分解されたかがわかる。逆に、ポリ(AAEE)においては、同
じ期間において加水分解の証拠はなく、従来のN−置換アクリルアミドから作ら
れた他のすべてのマトリックスは、異なった程度に加水分解する。(この図およ
び他の図の詳述については、後の「解説」の章を参り、りされたい)。
図3の実施例では、等電集束実験における新規な分類のN−置換アクリルアミド
の耐加水分解性を示す。一方はポリ(アクリルアミド)、他の一方はポリ(AA
EE)である2枚のスラブを用意し、0.INのNaOH中に70℃で20分間
温装する(曲線l)が、100mMのトリスホウ酸塩緩衝液(DNA解析に典型
的な緩衝液)中、pH8,5で一夜装置する(曲線2)。過剰のNaOHまたは
トリスホウ酸塩を除去するために蒸留水で洗浄したのち、ゲルを乾燥保存して、
2%のAmpholine中、pH3〜lOで再び膨潤させる。
等電集束の後、陽極と陰極との間でゲルスライスを切断する(5mm間隔で)こ
とにより、pH勾配を測定する。ポリ(AAEE)においては、pt+勾配は、
予想どおりの間隔(pH3〜10)で普通に延び、一方、ポリ(アクリルアミド
)においては、pH勾配は、非常に穏やかな加水分解条件、たとえばゾーン電気
泳動に一般的な緩衝液の存在において一夜装置する条件でも、完全に酸性化した
ことがわかる。この最後の現象は、pH勾配を強(酸性化し、実質的な電気浸透
流を生み出す、マトリックス中の多数のヒドロキシル基の存在を明確に示すもの
である(P、 G、 Righetti、 J、 Biochem、 Biop
hys。
Methods 19.1989.1−20) 、固定化されたpH勾配を含む
ゲルにおいても、同様な結果が得られる。
発明者らの見出した新規な分類のN−置換モノマーの親水性を実証するために、
水溶液をn−オクタツール中で分配処理に付した。
平衡に達した後、毛管ゾーン電気泳動(CZE)によって水相を分析し、このよ
うにして、二つの相におけるモル比を決定した。図4は、アクリルアミド、その
従来のN−置換誘導体、および本発明の新規なモノマーそれぞれの分配係数を示
す。Trisacrylおよびアクリルアミド糖類一般はきわめて親水性である
(同時にきわめて加水分解を受けやすい)が、他のすべての従来のN−置換アク
リルアミドは、明らかにアクリルアミドよりも疎水性であることがわかる。
ここに報告する新規なモノマー(AAEEによって例証されるようなもの)は、
加水分解処理に対して独自の耐性を示しながらも、著しく低い分配係数(P=0
.13) 、ひいてはアクリルアミドに比べてより顕著な親水性を示すことにお
いて、他に類を見ないものである(図X〜3を参照)。親水性ゲルを得るための
最大P値はP=0.4である。このような値を越えると、ポリマー、たとえばポ
リ(DMA)は、タンパク質との間で疎水性相互作用を示す。
P=0.8を越えると、ポリマーはもはやプロトン性溶媒の中で再び膨潤するこ
とはできない。
このようなアルカリによる加水分解に耐えるマトリックスはまた、CZHにおい
て電気浸透流(EEO)を除去するために、毛管の内壁〔普通は石英ガラス(f
used 5ilica)のもの〕を被覆するのに極めて有用である。EEOの
抑制は、毛管壁土に固着した電荷によってpH勾配がただちに破壊される等電集
束法において基本的であり、また、タンパク質およびペプチドの分離の場合にも
、通常、それらが負の電荷を帯びた毛管壁に強力に吸着されるために基本的であ
る。毛管を被覆するのに用いられる標準的な方法の一つは、Hjertenによ
って提案されている(J、 Chromatogr、 347.1985゜19
1−198 ) 、毛管を二官能性試薬(たとえばBind 5L1ane、3
−メタクリルオキシプロピルトリメトキシシラン)で処理し、ついで、架橋剤の
非存在において、ポリアクリルアミドの゛ひも゛ (string)で被覆する
。このように、長い線状の°ひも°が形成され、これらのひもが壁に共有結合し
、EEOフラックスを消滅させる。しかし、このような被覆はアルカリ性条件に
きわめて敏感である。等電集束法に毛管を使用するならば、EEOフラックスは
、たった5回の実施の後に早くもはっきりと表れる。しかし、同様にして事前に
処理した毛管を綿状のポリ(AAEE)鎖で被覆するならば、50回実施した後
でもEEOフラックスは認められない。石英ガラス壁と二官能性試薬(Bind
5Llane ) (−31−0−3i−タイプのもの)との間の結合もまた
、被覆の不安定性に寄与する。代替方法は、Cobbらの方法(に、 A、 C
obb、 V、 DolnikおよびM、 Novotny、Anal、 Ch
em、 62.1990.2478−2483 )を使用することである。この
方法は、グリニヤール試薬を利用して、該石英壁と二官能性試薬との間に直接的
な一3t−Cミ結合を生じさせる。この代替方法を使用することにより、そして
直鎖状ポリ(アクリルアミド)で壁を被覆することにより、被覆の安定性は5回
から10回に増すだけである。しかし、直鎖状のポリ(AAEE)と組み合わせ
てCobbの方法を使用すると、100回もの実施の後でもEEOフラックスは
表れない(表I)。
EEO”フラックスに対する毛管被覆のタイプの影響架橋剤のタイプ ポリマー
鎖のタイプ 電気泳動の回数−5i−0−3t−ポリ(アクリル1ミド) 5−
5i−0−5i−ポ1バN−(2−ヒドロキシエトキシ)エチル−アクリル1ミ
ド) 〉50
−5i−Cミ ポリアクリルアミド) 1O−5i−Cミ ポリ(N−(2−七
ドロNジェトキシ)エチル−アクリル1ミド) >100
”EEO:電気浸透フラックス
ポリ(AAEE)でできたマトリックスは、化学的に架橋したポリマーおよび未
架橋のポリマーの両方として、被覆だけでなく。
CZEにおける充填ポリマーとしても使用することができる。他に類を見ない用
途は、粘稠な溶液としての、すなわち、液状で直鎖状の未架橋ポリマーとしての
、 ゛からみ合いしきい値°を越える濃度でのそれらの用途である。このような
充填材は、普通CZE中の電気回路を混乱させる、高電界中でのポリマーの網状
構造のひずみや気泡の形成が起こらないため、CZEに非常に有用である。図5
は、10%の粘稠な(未架橋)ポリ(AAEE)溶液中で、大きさが125塩基
対(bp)から22,226bpまでの範囲のDNA断片を分離する例を示す。
このエレクトロフェログラムは、5.1および4.9kbpの断片が一つの領域
にともに移行するところの、欄準アガロースゲル中でも達成することができない
分離である、混合物に含まれる13個の断片すべての完全な分解を示す。
また、本発明においては、望ましくない毒性の遊離アクリルアミドモノマーを除
去するための方法を提案する。゛化学的°または°物理的°ゲルのいずれかを重
合させると、10〜15%もの未反応モノマーが液相中に残る。このようなモノ
マーは、タンパク質と反応し、それらの残基(たとえば、−3H基、末端−NH
,、Lysの5−アミノ基、Hisのイミダゾール部分)を改質することがある
。さらに、これらは、核酸の検出に典型的な波長である260nmで強い吸収を
示す。開いたゲルスラブの中では、洗浄によってこれらを除去してもよいけれど
も(完全に除去することができる保証はないが)、密閉系の中(たとえば毛管充
填中)においては、簡単な拡散法は存在しない。このような場合(また、アクリ
ルアミドの完全な除去が必要な場合、たとえば等電膜法および予備的な電気泳動
法の場合)、マトリックス(または粘稠な溶液)中でスルフィドリル化合物を電
気泳動的に駆動しく弱アルカリ性のpH値、たとえばpH8,5〜9で)、−5
H基がアクリルアミドの二重結合に完全に付加されるまで、そのようなスルフィ
ドリル化合物を反応させることからなる化学掃去法が見出された。そして、この
ようにして形成された付加物を、電気泳動的に駆動して、分離カラムの外に追い
出すことができる。このような掃去法の例を図6に示す。
アクリルアミド−Cys付加物の後方の境界線が毛管から出現するにつれて、バ
ックグラウンド吸光度が急激にゼロに落ち込むことがわかる。システィン、チオ
グリコール酸および他のスルフィドリル化合物を用いても、同一の結果が得られ
る。この掃去法はまた、電界の非存在において、たとえば、容器から取り出すこ
とができるすべてのゲルマトリックスに適用することもできる。
側方凝集(laterally aggregated)ポリアクリルアミドマ
トリックス
ポリアクリルアミドのポロシティ−を増すための周知の方法は、%T(−官能性
および二官能性のモノマーの総量)を一定に維持しながら、高い%C(=架橋剤
)を利用することからなる。高い%C(〉50%)では、ポリアクリルアミドマ
トリックスがきわめて高いポロシティ−(500nmまでの孔径)をもつように
なることが実証されており[A、 Bianchi Bosisio、 C,L
oeherlein 、 R,S。
5nyderおよびP、 G、 Righetti、 J、 Chromato
gr、 189 (1980)31?−3303、これが、このようなマトリッ
クスを、大きなMrのDNA断片とウィルス粒子との分画にとって興味深いもの
にする。
残念ながら、このようなマトリックスは、高い%Cでは疎水性になり、重力場で
崩壊し、水をしみ出させるため、界面動電法には用いられない。発明者らは、こ
こに、ポリアクリルアミドマトリックスに高いポロシティ−を与えるための新規
な方法を記載する。この方法は、発生状態の鎖を側方に凝集させる特別な薬剤を
、重合するモノマー混合物に添加することからなる。このような薬剤は一般に、
特定の濃度でモノマー混合物に添加されると、分子鎖を凝集させて、普通のポリ
アクリルアミドゲルの直径(約0.5%mと思われる)よりもずっと大きな直径
の繊維を有するゲル網を形成させる親水性のポリマー(たとえば、ポリエチレン
グリコール、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシメチルセルロース)である。必
然的に、これはポロシティ−の増大を伴う。架橋度の高いゲルとは対照的に、側
方に凝集したゲルは、水和水をしみ出させず、崩壊する傾向を示さない。一般に
、このようなゲルは、異なる量の、通常は0.5〜10%の側方凝集剤の存在に
おいて重合される。重合を、一定量のそのような薬剤の存在においてではなく、
その勾配の存在において実施するならば(たとえば、10.000Daの平均分
子量をもつポリエチレングリコール、PEG)、広範囲の分子の大きさにわたっ
て最適な分離を可能にするポロシティ−勾配をゲルに得ることが可能である。こ
のような側方凝集ゲルは、大きさにおいて数百〜数千の塩基対(bp)にまで及
ぶDNA断片の分離に利用されてきた。これらの実験は、従来のポリアクリルア
ミド(4%T)およびアガロースゲル(1,2%)の両方と並行的に実施された
ものである。分解能は、対数(bp) (横軸)を移動距離に対してプロットす
ることにより、片対数グラフで表す。回帰線の傾きが、いかなるゲルのタイプに
おける分画にも有用な範囲を示す。図7の実施例においては、従来のポリアクリ
ルアミドゲルにおいて有用な分画範囲は約50〜約1,0OObpに及び、一方
、1.2%アガロースは、約500〜約10,0OObpのM、の範囲を包含す
ることがわかる。2本の線は、準平行な傾きを有し、分子の大きさの尺度の約1
オーダの距離をおいて位置する。同じポリアクリルアミドゲルは、側方凝集剤の
存在下において重合すると、他の2本の線の間を斜めに横切り、200〜4.0
OObpの範囲の分子の大きさを最適なやり方で包含する。このように、そのよ
うな側方凝集ゲルが。
ポリアクリルアミドとアガロースとの間の°暗い°領域、すなわち、ポリアクリ
ルアミドがあまりにもふるいにかけすぎ、アガロースのポロシティ−が高すぎる
ところのM、値の範囲を包含しうることがわかる。側方凝集ゲルは、標準条件の
もとで重合された同等なゲルに比べて、一般に2オーダだけ高いポロシティ−を
有する。
たとえば、従来の6%T、4%Cのゲルは、約5〜6nmの平均孔径を有する。
逆に、lO%PEG−10にの存在で重合された同じゲルは、走査型電子顕微鏡
で見ると、約500nmの平均ポロシティ−を示す。このようなポロシティ−の
高いゲルは、最小限のふるい分けを必要とする技術、たとえば等電集束法および
固定化されたpi(勾配における支持体のマトリックスとして有用であるだけで
な(、たとえば膜装置に基づく電気泳動法またはクロマトグラフィー法における
膜としても有用である。最近、このような方法の一つである、多室型電解槽中で
の等電膜によるタンパク質の等電集束法(固定化po勾配の概念に基づ()が記
載された(Righetti、 P。
Go、Wenisch、 E、およびFaupel、 M、、J、 (:hro
matogr、 475.1989゜293−309 )。この機器の速度制限
要因の一つは、室から室へのタンパク質の移行を相当に遅らせる膜の多孔度(p
orosity)である。これらの膜が°側方凝集°ゲルでできたものであった
とき、タンパク質の移行は約1オーダだけ増大した。
ポリアクリルアミドマトリックスの光重合最近、標準的な酸化還元の対(過硫酸
塩とTEMED)で重合されたマトリックスにおいては、アミノ基(第一級〜第
三級)を含むすべての緩衝液(たとえば等電集束法のための担体両性電解質緩衝
液、P、 G、 Righetti%l5oelectric Focusin
g: Theory。
Methodology and Applications、Elsevie
r、Amsterdam、1983または固定化pH勾配のためのImmobi
line緩衝液、P、 G、 Righetti、Immobilized p
HGradients: Theory and Methodology、
Elsevier。
Am’sterdam、 1990 )が、N−酸化物の生成とともに酸化され
るということが実証された[P、 G、 Righetti、 M、 Chia
ri 、 E、 Ca5aleおよびC,Chiesa 、 Applied
Theor、 Electr、 1 (1989) 115−121;G、Co
55u、M、G、Pirastru、M、5atta、M、Chiari 、C
,ChiesaおよびP、 G、 Righetti、 J、 Chromat
ogr、 475 (1989) 283−2921゜電気泳動による移行の前
に過剰の過硫酸塩を陽極に放出するときでさえ、このようにして生成されたN−
酸化物はゲルの中に残り、電気泳動の実施の間にタンパク質の−SH基を酸化さ
せて、人工生成物を生成することができる。化学重合に代わる方法は、たとえば
リボフラビン(またはりボフラビンー5゛−ホスフェート)と光の存在における
光重合である。この方法は、過去に広範囲にわたって研究されてきたが、その低
い収率(モノマーのポリマーマトリックスへの転換率〈60%、それに対して、
過硫酸塩重合における転換率〉90%)のために放棄されたものである(P、
G、 Righetti、C,Ge1fiおよびA、 Bianchi−Bos
isio、 Electrophoresis 2.1981゜291−295
)。本発明においては、〉98%の転換率(過硫酸塩を用いる場合をも越える
)を可能にする最適な光重合条件が初めて記載される。このような条件は、
a)大きめの出力(>100W)およびよりきわたった紫外線スペクトル(UV
−A)をもつ光源を利用しく過去に記載された標準的な条件は、16Wのネオン
電球を用いるものであった);および/または
b)特に低いワット数の電球で実施するときに、光重合温度を〉50℃に高める
ことを含む。
本発明に記載された新たな条件は、光重合を、現在まで利用されてきた酸化還元
化学よりも有効な方法にする。光重合には、もう一つの大きな利点、つまり、重
合処理の間の酸化力の完全な欠如という利点が加えられている。図8は、このよ
うな現象の一例を示す。
第三級アミン(pに7.0のImmobilineの類似物、アクリル二重結合
をもたない)を、過硫酸塩/TEMEDの対、またはりボフラピンと光のいずれ
かにより、標準条件(いずれの場合も50℃で1時間)のもとで温度した。反応
後、CZEによって第三級アミンを分析した。図8Aに示すように、pK7.o
の化合物のピークは、第二のピークを生み出す(NMR分析により、N−酸化物
に帰属する)。このN−酸化物種は、光重合された生成物のエレクトロフェログ
ラムにはまったく見られない。リボフラビンでの光重合に加えて、発明者らは、
トルエンスルフィン酸ナトリウムおよび塩化ジフェニルヨードニウム(通常はそ
れぞれ1mMおよび50KM)の存在において、メチレンブルー(たとえば50
KM)を用いる光重合からなる、もっとも効率的なシステムをここに報告する。
このシステムは、リボフラビン重合と同じ利点(すなわち、酸化力の欠如)を有
し、それに加えて、過硫酸塩重合の場合よりも優れた粘弾性をもつゲルを生成す
る(図9を参照)。
本発明による新規なマトリックスの製造に関するいくつかの非制限的な例を、以
下に報告する。
実施例1
N−(2−ヒドロキシエトキシ)エチル−アクリルアミドの合成
次のようにして、上記のモノマーを得た。CHx C1−120mLに、アミノ
エトキシエタノール20mL(0,278mol)およびトリエチルアミン27
.6mL (0,198mol)を加えた。この溶液を塩化アクリロイル16m
l (0,198mol)で滴下処理しく約0℃で)、室温で約2時間攪拌を続
けた。沈殿した塩をろ過したのち、NaC1の存在下に、有機相をpH5,5の
リン酸塩緩衝液で洗浄した(2回、それぞれ100m1)。NatSO4上で乾
燥させたのち、有機溶媒の最後の残留物を回転エバポレータで蒸発させた。この
生成物を、溶離剤としてのCHCl3/CH,0H(7:3、その後9:1)中
、TLCによって分析した。収量:約8g、この生成物をシリカカラム上で精製
し、まずCH,CI□/CH,OH(95: 5) で、次にcHi C1,/
CH,0H(9:1)で溶離させた。
この同じ方法により、N−(2−ヒドロキシエトキシ)エチルメタクリルアミド
およびN、N−ジ(2−ヒドロキシエトキシ)エチルアクリルアミドを得た。
実施例2
トリス酢酸エステル緩衝液40mM、酢酸ナトリウム20mMおよびEDTA2
mM中、pH8,4で、N−(2−ヒドロキシエトキシ)エチルアクリルアミド
クリルアミドもしくはDHEBAまたはビスアクリロイルピペラジンもしくは同
様な化合物のような架橋剤4%を使用)を調製した。この溶液を水流ポンプで1
u分間脱ガスし、ついでTEMED(ゲル化溶液1mlあたり1μl)を加えた
。この溶液を二つのアリコートに分け、一方をPEG−10に中で0、2%にし
、もう一方をPEG−1 0に中で2%にした。各溶液10mLっづを2室型勾
配ミキサに移し、ゲル化溶液1mLあたり10mLの4%過硫酸アンモニウムを
加えた(攪拌しながら)。2個の弁を開放し、電気泳動カセットを、一定のモノ
マー濃度で、直線的勾配(0.2〜2%のPEG−10K)20mLで満たした
。室温で1時間重合した後、図5の解説に記載のようにして.DNA断片の電気
泳動分離を実施した。同様にして、しかしPEG−10にの非存在において、ポ
リアクリルアミド対照物を重合した。N− (2−ヒドロキシエトキシ)エチル
アクリルアミドまたはアクリルアミド−N,N−ジェトキシエタノールを使用す
ると、同様な結果が得られた。この種のマトリックス(一定のポロシティ−また
は可変性のポロシティ−のいずれでも)は、洗浄し、乾燥させ、所望の添加物(
たとえば簡易的な溶剤、8M尿素、イオン系、非イオン系または両イオン系の洗
剤、担体両性電解質などまたはそれらの混合物)で再び膨潤させた後に利用する
ことができる。
実施例3
実施例2と同様に、しカルPEG−10にの非存在において実施した。発明者ら
の新規な分類のN−モノおよびジ−置換アクリルアミドによって得られるマトリ
ックスは、PEG−10にの存在にょる大きめの孔をもたなくても、きわめて耐
アルカリ加水分解性であり、長期間の貯蔵に対して優れていることが見出された
。
実施例4
本発明に記載されたモノマーは、実施例2のように(PEG−10にの存在また
は非存在のいずれにおいても)、反応促進剤としてのTEMEDo、4ul/1
mLと、ゲル化溶液1mLあたり2、32 X 10−’mMo1の最終濃度の
りボフラビン(もしくはりボフラビンー5′−ホスフェート)とを加えることに
より、光重合させることができた。光重合は、室温で105WのUV−A灯から
10cm離れたところで、あるいは、70℃で16Wのネオン灯の正面で、1時
間続けて実施した。あるいはまた、光重合は、メチレンブルー50μM、トルエ
ンスルフィン酸ナトリウム1mMおよび塩化ジフェニルヨードニウム50μMの
存在において実施した。また、この場合、ゲルをただちに使用することもできる
し、洗浄し、乾燥させ、実施例2に記載されたような所望の添加物の存在におい
て、再び膨潤させることによる将来の使用に備えて貯蔵することもできる。
解説
図1
種々のアクリルアミドモノマーの加水分解速度。0.INのNaOH中、70℃
で表示の時間、加水分解を実施した。量は、各時点でトリブリケートを取り出し
、中和し、CZE機器(Beckman P/ACE )に注入することによっ
て評価した。条件:100mMのホウ酸塩−NaOH緩衝液、r+H9,o、1
5kV、86μA、25℃。長さ50cm、内径75μmの被覆のない石英ガラ
ス毛管。BeckmanシステムGoldを用いるピーク積分(内部標準として
マンデル酸を使用した)。略号:Acrニアクリルアミド、DMA:N、N−ジ
メチルアクリルアミド、ACMニアクリロイルモルホリン、dd−Trisニジ
デオキシトリスアクリル、Tris−Asトリスアクリル。トリス−A(および
他すべてのタイプのアクリルアミド糖類も同様)は零次の崩壊速度を示し、一方
、他の大部分のモノ−およびジー置換モノマー(未置換アクリルアミドを含む)
は−次反応速度を示すことに注意されたい。比較すると、崩壊速度は、ここに提
案する新規な分類のN−置換モノマ−1たとえばAAEE (アクリルアミド−
N−エトキシエタノール)については、それほど顕著ではなかった。
図2
ポリマーゲルへのモノマーの崩壊速度。種々のモノマーをビーズ状に重合しく乳
化重合による)、0.INのNaOH中、70℃で表示の時間加水分解に付し、
加水分解生成物について分析した。前端分析により、アミド結合の加水分解によ
って生成した遊離アクリル酸残渣を滴定することによって、ビーズにおける加水
分解を評価した。本発明において提案された新規なモノマー、たとえばアクリル
アミド−N−エトキシエタノールのきわめて高い安定性に注目されたい。
図3
種々のマトリックスの加水分解の検証。ポリアクリルアミド(FAA)およびポ
リアクリルアミド−N−エトキシエタノール(AAEE)ゲルを、3ind−3
ilaneで被覆したガラス上に流延し、0.1MのNaOH中、70℃で20
分間加水分解に付した(曲線1)。何度も洗浄し、乾燥させたのち、ゲルを2%
のpH3〜10の担体両性電解質の中で再び膨潤させ、等電集束に付した(15
00V、4℃で2時間)。電極の距離に沿ってゲルをスライスし、lomMNa
clの300μL中で平衡化したのち、pHを測定した。ポリ(AAEE)マト
リックスのきわめて高い安定性に比較して、FAAゲル中のpH勾配の扁平化し
た顕著な酸性化(アクリル酸のpK値であるpH4,7に変曲点がある)に注目
されたい。ポリアクリルアミドゲルはまた、100mMのトリスホウ酸塩緩衝液
中、pH8,5で一夜装置しただけで、実に安定であるように見える(曲線2)
。
図4
7種のアクリルアミドポリマーの疎水性の尺度。これは、室温で水/n−オクタ
ノール中で分配を行い、二つの相の濃度をCZEによって定量することによって
得た。条件ニホウ酸塩−NaOH緩衝1M 100mM、 pH9、0,15k
V、86uA、25℃。長さ50cm、内径75μmの石英ガラス毛管。Bec
kmanシステムGoldを用いるピーク積分(内部標準としてpK9.3のI
mmobilineを使用した)。
略号:TrisA:)リスアクリル、AEE ニアクリルアミド−N−エトキシ
エタノール、Acrニアクリルアミド、MMA :モノメチルアクリルアミド、
DMA:N、N−ジメチルアクリルアミド、A CM ニアクリロイルモルホリ
ンシトリスアクリル。
図5
直鎖状ポリ(AAEE)の粘稠な溶液におけるDNA制限断片の分離。AAEE
の10%溶液を、架橋剤の非存在下に、毛管中で重合した。未反応モノマーを除
去したのち(図6を参照)、毛管をトリスホウ酸塩緩衝液(pH8. 5) 1
0 0mMおよびEDTA2mM中で、電気泳動的に平衡化した。DNA制限
断片0.25μg/mLの溶液を、電気泳動(4 0 0 0 V、7μA、3
秒)によって毛管に導入し、Waters Quanta 4000i器に入れ
て100gm (内径)の石英ガラス毛管の中で、500V (8.8μA)で
分離させた(258nunでの検出)。断片は(左から右に):125、564
、831、947、1375、1584、1904、2027、3530、42
68、4973、5148および22226塩基対(bp)である。
図6
スルフィドリル化合物による遊離した未反応アクリルアミドの掃去。ゲル(また
は粘稠な溶液)を重合させたのち、システィン100mMを含むトリスホウ酸塩
緩衝液(pH9.0)200mMを、毛管中、電気泳動的に10時間、3kVで
陽極に向かって駆動する。
この処理ののち、陽極容器の溶液をトリスホウ酸塩(pH9,0)200mMで
置き換え、電気泳動を4時間、5kVで続けることにより、Cys−アクリルア
ミド付加物を追い出す。50分後、反応生成物の鋭い後方の境界が出現し、吸光
度(mA、254 nm)がゼロに落ちることに注目されたい、この時点で、毛
管が新たな緩衝液で満たされると、電流(μA)は安定化する傾向を見せる。分
析の前に、毛管を所望の作業緩衝液(たとえばDNA分析の場合、トリスホウ酸
塩(pH8,5)100a+M)中で電気泳動的に平衡化する。
図7
側方凝集ゲル(4%T)、標準的なポリアクリルアミドゲル(4%T)およびア
ガロースゲル(1,2%)におけるDNA断片(二重鎖)の電気泳動の比較。2
種の異なるポリアクリルアミドゲル中、50Vで3時間、また、アガロースゲル
中、60Vで1時間30分、一連のDNA断片(123〜6000bp)を移行
させる(総試料装填量:DNA1.67μg)。ゲルはすべて以下の寸法を有し
ていた。7x7cm、厚さ1.2mm0試料装填ウエルから各領域の中心までの
移行距離(臭化エチジウム染色によって発現した)を断片の分子量(bp)の対
数に対してプロットしている。移行緩衝液ニドリス酢酸塩40mM、酢酸ナトリ
ウム20mMおよびEDTA2mM、pH8,4゜側方凝集ゲルは、2室勾配ミ
キサから、凝集剤の直線的な勾配(PEG−10に0.2〜5%)の存在におい
て、一定のモノマー濃度(4%T、4%C)の溶液を溶離させることによって得
た。
図8
化学重合中のN−酸化物の形成。pK7.0のImmobiline (モルホ
リノプロピルアセトアミド)の類似物のlOaMの溶液を、過硫酸塩1.2%と
TEMEDlmMの存在下、またはりボフラビン(2mM)と光(105Wのt
JV−A灯)の存在下のいずれかにおいて温室(50℃で1時間)する、温室の
後、生成物を、リン酸塩緩衝液50mM中、pH7,0で、毛管ゾーン電気泳動
(Waters Quanta4000)によって分析する(15kV、86μ
A 、254nmで検出)。
上の区画:過硫酸塩渦電、下の区画:リボフラビン部属。下の区画には、上のエ
レクトロフェログラムにはっきりと見えるN−酸化物のピークが存在しないこと
に注目されたい。メチレンブルー重合によっても同じ結果(酸化力の不在)が得
られる。
図9
メチレンブルー重合(上)、過硫酸塩(中)および側方凝集剤の存在下における
過硫酸塩(下)の場合の曲線における弾性率(E、 N/cm’ )の重合時間
への依存性。最後の場合、2%ポリエチレングリコール10.0OODaの存在
下においてゲルを化学的に重合した。光重合の場合、より遅い速度で平坦部分に
達しているが、最高の弾性特性が示されていることに注目されたい。
ド嵌φ謀栄
ド 昼子余謀
−〜
中隔$拐
Slr’lV 2−0$ X
フロントページの続き
(51) Int、 C1,’ 識別記号 庁内整理番号GOIN 30/88
J 8310−2J(81)指定国 EP(AT、BE、CH,DE。
DK、ES、FR,GB、GR,IE、IT、LU、h丁C,NL、 SE)、
CA(BF、BJ、CF、CG、CI、 CM、 GA、 GN、 ML、 M
R,SN、 TD、 TG)、 AU、 BB、 BG、 BR,CA、 C3
,FI、 HU。
JP、 KP、 KR,LK、 MG、 MN、 MW、 No、 PL、RO
,RU、SD、US
I
Claims (18)
- 1.式(I): ▲数式、化学式、表等があります▼(I)(式中、Rは、水素またはCH2を表 し、R1およびR2は、独立して、水素または式−[(CH2)n−O−(CH 2)n−O]nH(式中、n=2または3であり、N=1〜5、好ましくは1で ある)で示される基を表すが、ただし、R1およびR2の一方は水素とは異なる )を有するモノマーの(共)重合によって、あるいは、同モノマーと他の(メタ )アクリルアミドとの共重合によって得られる、界面動電法またはクロマトグラ フィー法に使用するための、ポリ−(N−置換)アクリルアミドマトリックス。
- 2.N−(2−ヒドロキシエトキシ)エチル(メタ)アクリルアミドまたはN、 N−ジ(2−ヒドロキシエトキシ)エチル(メタ)アクリルアミドの重合によっ て、あるいは、該モノマーとN、N−ジメチル(メタ)アクリルアミドとの共重 合によって得られる請求の範囲第1項記載のマトリックス。
- 3.毛管ゾーン電気泳動を含むすべての界面動電的分離法のための、請求の範囲 第1項または第2項記載のマトリックスの使用。
- 4.−Si−O−Si−結合を形成する二官能性試薬を使用するか、直接的な− Si−C≡結合を形成する二官能性試薬を使用するかのいずれかによって毛管ゾ ーン電気泳動の毛管の内壁を被覆するための、あるいは、毛管を充填するための 、いずれも架橋したマトリックスまたは未架橋の粘稠な溶液としての、式(I) で示されるモノマーの使用。
- 5.毛管ゾーン電気泳動を用いるか、ゲルスラブもしくはシリンダーを用いるか のいずれかによる、核酸配列決定およびDNA断片分析を含むすべての界面動電 法における、また、ドデシル硫酸ナトリウム電気泳動によってタンパク質分子の 大きさを測定するための、および固定化pH勾配を含むすべての集束技術のため の、請求の範囲第1項または第2項記載のマトリックスの使用。
- 6.側方鎖凝集をもたらす親水性ポリマーの存在における(共)重合によって得 られる請求の範囲第1項または第2項記載のマトリックス。
- 7.一定濃度または変動する濃度の側方凝集剤でゲルを(共)重合させることを 特徴とする請求の範囲第6項記載のマトリックス。
- 8.側方鎖凝集剤としてポリエチレングリコールおよびポリビニルビロリドンの 群の親水性ポリマーを使用することを特徴とする請求の範囲第6項または第7項 記載のマトリックス。
- 9.従来の等電集束法および固定化pH勾配を包含する、高ポロシティー支持体 上でのすべてのタイプの電気泳動のための、請求の範囲第6項〜第8項のいずれ か一項に記載のマトリックスの使用。
- 10.クロマトグラフィーまたはろ過の目的の膜としての、請求の範囲第6項〜 第8項のいずれか一項に記載のマトリックスの、単独での、あるいは他の膜の上 に被覆されての使用。
- 11.タンパク質を精製するための、該タンパク質調製物から発熱因子、核酸断 片およびウイルス粒子を除去するのための多室電解槽における、一般に耐引裂き 性の支持体に被覆された等電緩衝膜としての、請求の範囲第6項〜第8項のいず れか一項に記載のマトリックスの使用。
- 12.式(I)で示されるモノマーの光(共)重合によって得られる請求の範囲 第1項または第2項記載のマトリックス。
- 13.リポフラビンの存在において、ワット数>50−WのUV−A灯を用いて 、および/または>50℃の温度で、光(共)重合を実施することを特徴とする 請求の範囲第12項記載のマトリックス。
- 14.メチレンブルーならびにトルエンスルフィン酸ナトリウムおよび塩化ジフ ェニルヨードニウムの存在において光共重合を実施することを特徴とする請求の 範囲第12項記載のマトリックス。
- 15.すべての界面動電法(可溶性両性緩衝液の存在における、または固定化p H勾配を用いての等電集束法を包含する)のための長期貯蔵のためのゲルスラブ であって、溶剤で含浸された状態で貯蔵されるか、洗浄および乾燥ののち、使用 の際に再び膨潤させるためのゲルスラブを調製するための、請求の範囲第1項記 載の式(1)で示されるアクリルアミドの使用。
- 16.クロマトゲラフィーピースを製造するための、請求の範囲第1項記載の式 (I)で示されるアクリルアミドの、単独で、またはプラスチックもしくはガラ スのビースヘの被覆としての、あるいはアガロースもしくは他の親水性ポリマー と混合されての使用。
- 17.該マトリックスが、未反応アクリルアミドの二重結合に付加され、それを 破壊することができる1種以上の化学的掃去剤で処理されていることを特徴とす る‘化学的′または‘物理的′ゲルとしての請求の範囲第1項または第2項記載 のマトリックス。
- 18.請求の範囲第1項記載の式(I)で示される(メタ)アクリルアミド。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
IT91A003271 | 1991-12-06 | ||
ITMI913271A IT1252628B (it) | 1991-12-06 | 1991-12-06 | Formulazioni per matrici poliacrilamidiche in metodiche elettrocinetiche |
PCT/EP1992/001772 WO1993011174A1 (en) | 1991-12-06 | 1992-08-05 | New formulations for polyacrylamide matrices in electrokinetic and chromatographic methodologies |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH07501563A true JPH07501563A (ja) | 1995-02-16 |
JP3313712B2 JP3313712B2 (ja) | 2002-08-12 |
Family
ID=11361272
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP50973893A Expired - Fee Related JP3313712B2 (ja) | 1991-12-06 | 1992-08-05 | 界面動電法およびクロマトグラフィー法におけるポリアクリルアミドマトリックスのための新規な配合物 |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5470916A (ja) |
EP (1) | EP0615525B1 (ja) |
JP (1) | JP3313712B2 (ja) |
AU (1) | AU2396192A (ja) |
CA (1) | CA2125136C (ja) |
DE (2) | DE615525T1 (ja) |
IT (1) | IT1252628B (ja) |
WO (1) | WO1993011174A1 (ja) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2007524090A (ja) * | 2004-01-28 | 2007-08-23 | メトラー−トレド アクチェンゲゼルシャフト | ポリマー電解質、電気化学的測定用の半電池、およびこれらの使用 |
JP2015013980A (ja) * | 2013-06-05 | 2015-01-22 | 株式会社リコー | インク |
WO2017110817A1 (ja) * | 2015-12-25 | 2017-06-29 | 信和化工株式会社 | クロマトグラフィー用分離剤、クロマトグラフィーカラム、及びクロマトグラフィーによる分離方法 |
Families Citing this family (29)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5627022A (en) * | 1994-11-01 | 1997-05-06 | Visible Genetics Inc. | Microgels for use in medical diagnosis and holders useful in fabricating same |
US5932285A (en) * | 1995-02-17 | 1999-08-03 | Medlogic Global Corporation | Encapsulated materials |
US5785832A (en) * | 1995-07-26 | 1998-07-28 | Chiari; Marcella | Covalently cross-linked, mixed-bed agarose-polyacrylamide matrices for electrophoresis and chromatography |
IT1276957B1 (it) * | 1995-10-18 | 1997-11-03 | Pier Giorgio Righetti | Acrilamido derivati e formulazioni per matrici poliacrilamidiche in metodiche elettrocinetiche e cromatografiche |
US5840877A (en) * | 1996-09-05 | 1998-11-24 | Guest Elchrom Scientific | Electrophoresis gels of enhanced selectivity |
US6800278B1 (en) | 1996-10-28 | 2004-10-05 | Ballard Medical Products, Inc. | Inherently antimicrobial quaternary amine hydrogel wound dressings |
US6511803B1 (en) * | 1997-10-10 | 2003-01-28 | President And Fellows Of Harvard College | Replica amplification of nucleic acid arrays |
EP1051390A1 (en) * | 1998-01-30 | 2000-11-15 | Molecular Dynamics, Inc. | Compounds for molecular separations |
US6464850B1 (en) | 1998-07-31 | 2002-10-15 | Biowhittaker Molecular Applications, Inc. | Method for producing hydrophilic monomers and uses thereof |
US6117293A (en) * | 1998-07-31 | 2000-09-12 | Biowhittaker Molecular Applications, Inc. | Method for producing hydrophilic monomers and uses thereof |
US6410668B1 (en) | 1999-08-21 | 2002-06-25 | Marcella Chiari | Robust polymer coating |
US6410643B1 (en) | 2000-03-09 | 2002-06-25 | Surmodics, Inc. | Solid phase synthesis method and reagent |
DE10033583A1 (de) * | 2000-07-11 | 2002-01-24 | Bayer Ag | Superparamagnetische Perlpolymerisate |
SE0003358D0 (sv) * | 2000-09-19 | 2000-09-19 | Amersham Pharm Biotech Ab | Charged carrier material and its use |
AUPR522501A0 (en) * | 2001-05-25 | 2001-06-14 | Proteome Systems Ltd | Increased solubilisation of hydrophobic proteins |
WO2004036204A2 (en) | 2002-10-13 | 2004-04-29 | Picosep A/S | A two-dimensional microfluid biomolecule separation system |
US20040140215A1 (en) * | 2003-01-17 | 2004-07-22 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Pre-cast electrophoresis slab gels with extended storage life |
EP1680665A4 (en) * | 2003-09-19 | 2010-06-16 | Life Technologies Corp | COMPOSITE COMPOSITIONS FOR ELECTROPHORESIS |
WO2005089911A1 (en) * | 2004-03-17 | 2005-09-29 | Ciphergen Biosystems, Inc. | Materials, methods, and systems for separating and identifying proteins from mixtures |
WO2007018589A2 (en) * | 2005-07-28 | 2007-02-15 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Separation of proteins based on isoelectric point using solid-phase buffers |
US20070048249A1 (en) | 2005-08-24 | 2007-03-01 | Purdue Research Foundation | Hydrophilized bactericidal polymers |
GB0708921D0 (en) * | 2007-05-09 | 2007-06-20 | 3Lfants Ltd | Photo-initated, non aqueos, temperature independant gels, and method of preparation thereof |
CN103508913B (zh) * | 2012-06-27 | 2015-05-13 | 中国石油化工股份有限公司 | 单体和三元无规共聚物及其制备方法和三元无规共聚物的应用 |
CN105492904B (zh) * | 2013-07-08 | 2017-10-24 | 国立大学法人京都工艺纤维大学 | 分离剂 |
US11619608B2 (en) | 2017-05-22 | 2023-04-04 | Life Technologies Corporation | Compositions, methods, kits and devices for molecular analysis |
CN117191921A (zh) | 2017-05-22 | 2023-12-08 | 因特根克斯股份有限公司 | 用于分子分析的组合物、方法、试剂盒和装置 |
EP3629731A1 (en) | 2017-05-27 | 2020-04-08 | Poly Group LLC | Dispersible antimicrobial complex and coatings therefrom |
US20180362678A1 (en) | 2017-06-16 | 2018-12-20 | Poly Group LLC | Polymeric antimicrobial surfactant |
CN109633045A (zh) * | 2018-12-20 | 2019-04-16 | 广州广电计量检测股份有限公司 | 一种液相色谱串联质谱同时测定水产品中6种色素残留量的方法 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS50147844A (ja) * | 1974-05-17 | 1975-11-27 | ||
JPS62159933A (ja) * | 1986-01-09 | 1987-07-15 | Nec Corp | フレ−ム同期検出回路 |
JPS62243426A (ja) * | 1986-04-16 | 1987-10-23 | Canon Inc | デ−タ伝送システム |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3037056A (en) * | 1959-03-30 | 1962-05-29 | California Research Corp | Amido polyglycols |
US3776956A (en) * | 1970-04-25 | 1973-12-04 | Lion Fat Oil Co Ltd | Resinous composition |
JPS6147741A (ja) * | 1984-08-13 | 1986-03-08 | Nippon Synthetic Chem Ind Co Ltd:The | 硬化性樹脂組成物 |
US5055517A (en) * | 1988-04-29 | 1991-10-08 | At Biochem | Electrophoretic media |
ATE121384T1 (de) * | 1988-10-19 | 1995-05-15 | Guest Elchrom Scient Ag | Hydrophile monomere, polymere davon und ihre verwendungen. |
-
1991
- 1991-12-06 IT ITMI913271A patent/IT1252628B/it active IP Right Grant
-
1992
- 1992-08-05 AU AU23961/92A patent/AU2396192A/en not_active Abandoned
- 1992-08-05 WO PCT/EP1992/001772 patent/WO1993011174A1/en active IP Right Grant
- 1992-08-05 EP EP92916513A patent/EP0615525B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-08-05 JP JP50973893A patent/JP3313712B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1992-08-05 CA CA002125136A patent/CA2125136C/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-08-05 DE DE0615525T patent/DE615525T1/de active Pending
- 1992-08-05 US US08/244,608 patent/US5470916A/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-08-05 DE DE69225494T patent/DE69225494T2/de not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS50147844A (ja) * | 1974-05-17 | 1975-11-27 | ||
JPS62159933A (ja) * | 1986-01-09 | 1987-07-15 | Nec Corp | フレ−ム同期検出回路 |
JPS62243426A (ja) * | 1986-04-16 | 1987-10-23 | Canon Inc | デ−タ伝送システム |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2007524090A (ja) * | 2004-01-28 | 2007-08-23 | メトラー−トレド アクチェンゲゼルシャフト | ポリマー電解質、電気化学的測定用の半電池、およびこれらの使用 |
JP2015013980A (ja) * | 2013-06-05 | 2015-01-22 | 株式会社リコー | インク |
US10280319B2 (en) | 2013-06-05 | 2019-05-07 | Ricoh Company, Ltd. | Ink, ink cartridge, ink jet recording device, ink jet ink printed matter, compound, and composition |
WO2017110817A1 (ja) * | 2015-12-25 | 2017-06-29 | 信和化工株式会社 | クロマトグラフィー用分離剤、クロマトグラフィーカラム、及びクロマトグラフィーによる分離方法 |
JPWO2017110817A1 (ja) * | 2015-12-25 | 2018-09-20 | 信和化工株式会社 | クロマトグラフィー用分離剤、クロマトグラフィーカラム、及びクロマトグラフィーによる分離方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU2396192A (en) | 1993-06-28 |
EP0615525A1 (en) | 1994-09-21 |
JP3313712B2 (ja) | 2002-08-12 |
CA2125136C (en) | 2003-12-30 |
DE69225494D1 (de) | 1998-06-18 |
ITMI913271A0 (it) | 1991-12-06 |
EP0615525B1 (en) | 1998-05-13 |
US5470916A (en) | 1995-11-28 |
CA2125136A1 (en) | 1993-06-10 |
IT1252628B (it) | 1995-06-19 |
DE69225494T2 (de) | 1999-02-04 |
WO1993011174A1 (en) | 1993-06-10 |
ITMI913271A1 (it) | 1993-06-06 |
DE615525T1 (de) | 1995-06-14 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JPH07501563A (ja) | 界面動電法およびクロマトグラフィー法におけるポリアクリルアミドマトリックスのための新規な配合物 | |
Chiari et al. | Towards new formulations for polyacrylamide matrices: N‐acryloylaminoethoxyethanol, a novel monomer combining high hydrophilicity with extreme hydrolytic stability | |
Nishi et al. | Optical resolution of drugs by capillary electrophoretic techniques | |
Takács | Electrophoresis of proteins in polyacrylamide slab gels | |
US4857163A (en) | High resolution electrophoretic gel and method for separating serum proteins | |
CA2060314C (en) | Low electroendosmosis agarose | |
WO1999038840A1 (en) | Compounds for molecular separations | |
JP2654681B2 (ja) | ポリマー、および電気泳動のためのゲルとしてのその使用方法 | |
WO2000007002A1 (en) | Method for producing hydrophilic monomers and uses thereof | |
DE69605569T2 (de) | Neue polyacrylamid matrizen für elektrophorese und chromatographie | |
JPH07500126A (ja) | ポリアクリルアミドゲルマトリックス | |
JP2003004702A (ja) | 高分解能電気泳動用ゲルの製造方法 | |
JPH05133947A (ja) | 液体クロマトグラフイー用担体およびそれを用いた液体クロマトグラフイー法 | |
JPH01302153A (ja) | 電気泳動用ゲルの製造方法 | |
JP2010503869A (ja) | 分子の電気濾過のための組成物およびデバイス | |
JPH10501629A (ja) | モノマー:架橋剤の高い比を有する架橋ポリアクリルアミドゲル | |
KR980009329A (ko) | 폴리아크릴아미드 전기영동 겔의 제조방법 | |
JPS63228053A (ja) | 電気泳動用媒体 | |
JPS6370157A (ja) | 電気泳動用媒体 | |
JPS62272146A (ja) | 電気泳動用媒体 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |