JP2875552B2 - 非特異吸着排除の抗体測定方法及び測定試薬 - Google Patents
非特異吸着排除の抗体測定方法及び測定試薬Info
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Description
定試薬に関し、詳しくは固相と血清検体を接触せしめて
検体中の抗体を測定する方法および測定試薬において、
該接触に伴って起こる非特異吸着を排除して検出感度を
向上させた測定方法及び測定試薬に関する。
体の非特異な吸着によって測定結果に誤差がもたらされ
ることはしばしば経験されるところであり、例えば、下
記文献1)〜4)がある。
982)241−248 (イー.ジェー.シリトー:ジェー.オブ ビロロジカ
ル メソッド,4,(1982)241−248) 2) 沢田高志等:臨床と研究,62巻1号(1985)311−
318頁 3) 沢田高志等:臨床と研究,63巻11号(1986)3818
−3822頁 4) 特公昭64−54356号公報 即ち、1)によれば長期保存した血清検体において、
また2),3)によれば加熱非働化した血清検体におい
て、それぞれ検体中に変性あるいは凝集したIgG(変性
抗体と呼ぶ)が生成し、これが固相に非特異な吸着をし
て測定結果に誤差がもたらされることが記載されてい
る。1)ではカオリン添加の前処理により、また2),
3)では性能のよいカップ洗浄機を使用したり、カット
オフ値を適正に設定することによりそれぞれ変性抗体の
非特異吸着による測定誤差を排除することができると述
べられている。一方4)によれば測定のために加えられ
る標識された抗体(標識抗体と呼ぶ)が固相に非特異な
吸着をして測定結果に誤差がもたらされることが記載さ
れており、pH8.0〜9.5の緩衝液中で固相に標識抗体を反
応させることにより標識抗体の非特異吸着による測定誤
差を抑制することができると述べられている。
特異吸着と標識抗体の非特異吸着とは共に固相に対する
抗体の吸着である点では同様のものとみられるが、実際
の測定操作の中では全く別の現象として処理される必要
がある。即ち、変性抗体と標識抗体とは物質として別異
であるほかに、前者の非特異吸着は固相法による測定に
おいて固相に検体血清が添加された時点での反応(第一
反応と呼ばれる)で起こり、後者の非特異吸着は第一反
応が完全に停止され引き続いて標識抗体が添加された時
点での反応(第二反応と呼ばる)で起こる。従って前者
の非特異吸着に対する排除処理は後者の非特異吸着に対
する抑制処理、例えば文献4)記載の技術とは別個の技
術であり、かつそれから容易に推考される技術でもな
い。変性抗体の非特異吸着の排除処理については文献
1)〜3)記載の技術があるが、これらよりもさらに簡
便かつ正確な技術が求められる。本発明はこれを課題と
してなされた。
結果、固相に血清検体を添加するにあたり、該添加をpH
9〜10の条件下で行うことにより、変性抗体の固相への
非特異吸着を排除することができることを見出し、本発
明を完成した。
抗体を測定する測定方法において、該添加をpH9〜10の
条件下で行うことを特徴とする測定方法を提供するもの
であり、更に本発明は、固相に血清検体を添加して検体
中の抗体を測定する測定試薬において、該添加の条件の
ためにpH9〜10の緩衝液が必須の構成成分となることを
特徴とする測定試薬をも提供するものである。
るものではない。即ち、本発明は血清検体、特にヒト血
清検体に含まれる変性抗体の非特異吸着を問題としてと
りあげ、それに対する解決手段を提供するものであるか
ら、測定抗体自体はいかなる抗体であってもよい。
り、あるいは血液であってもよい。
のカップあるいはガラスビーズ等を用いればよい。固相
表面は常法により抗原をコートしておく。
疫学的測定法を利用するものであり、例えば酵素免疫測
定法、放射免疫測定法、受身凝集法等を利用することが
できる。これらの方法における通常の手順自体はすでに
一般に公知であり、本発明に利用される。従って、例え
ば酵素免疫測定法を利用する場合について本発明測定方
法を説明すれば以下のごとくである。
素標識抗体、基質であり、他に緩衝液、希釈液、停止
液、標準抗体等が使用される。まず固相を抗原でコート
し、ここに検体血清をそのまま又は正常ウサギ血清で希
釈して添加し、よく洗浄後酵素標識抗体を添加し、よく
洗浄後基質を添加し、反応を停止後基質の分解量を測定
する。ここで、本発明の特徴は検体血清を添加するとき
にpH9〜10の条件下でこれが行われる点にある。該条件
のために酸またはアルカリを加えてpHを調整すればよい
が、通常は緩衝液の添加によってなされる。
み用意される試薬であるが、pH9〜10の緩衝液は必須の
成分であり、他にいくつかの使用成分を任意に選択して
加え、組み合わせてセットしたものでもよい。緩衝液の
種類はpH9〜10に緩衝能を持つものであればいずれであ
ってもよく、例えばリン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、
ホウ酸緩衝液等を使用することができる。緩衝液の濃度
は通常は0.05〜0.1M程度であるが、ケースに応じて決定
すればよい。また緩衝液を該緩衝液の成分固体の形で提
供し、同時に水を加えて溶解し所定の緩衝液とすること
は可能であり、これは実質的に本発明に含まれる。
細胞白血病ウィルス抗体(HTLV−I抗体)の測定に応用
したところ非常に良い結果を得ることができた。
あるいは加熱非働化した検体血清中の変性抗体の非特異
吸着が排除される。従って本発明の作用は該排除による
検出感度の向上にある。
本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
10μg/mlの濃度に調整し、マイクロタイターウェルに10
0μずつ分注し、4℃下に一晩放置する。ウェルを蒸
溜水で洗浄し、各ウェルに0.1Mホウ酸緩衝液でpH9.5に
調整した正常ウサギ血清を第1反応用溶液として100μ
ずつ加える。ここに検体血清20μずつ加え、37℃に
て60分間インキュベート(incubate)する(第1反
応)。ウェル内を0.01%ツイーン(Tween)20を含む生
理食塩水にて洗浄後、各ウェルにアルカリフォスファタ
ーゼ標識抗ヒトグロブリン抗体を100μずつ加え、37
℃にて60分間インキュベートする(第2反応)。ウェル
内を0.01%ツイーン20を含む生理食塩水にて洗浄後、各
ウェルに基質液(4mg/mlのp−ニトロフェニルフォスフ
ェート)を100μずつ加え、37℃にて30分間インキュ
ベートする(第3反応)。各ウェルに1N NaOH液を100μ
ずつ加えて反応を停止した後、反応液につき波長405n
mにおける吸光値を測定する。カットオフ値はOD 405nm
における吸光値で0.08とし、これ以上の吸光値を示した
時HTLV−I抗体陽性、これ未満の吸光値を示した時HTLV
−I抗体陰性と判定した。
30分間加熱非働化することにより、非特異的反応を呈す
る様になった検体(非働化非特異検体1,2)と、HTLV−
I抗体陽性コントロールとして、HTLV−Iキャリアーの
血清を用いた。
HTLV−Iに対する免疫学的反応性における陽否を判定し
た。ただし、実施例1記載における第1反応用溶液とし
て各々pH調整した下記(a)〜(c)を使用した。
7.5に各々緩衝化した正常ウサギ血清) (b) 0.05Mトリス塩酸緩衝化第1反応用溶液(pH8.
0,8.5に各々緩衝化した正常ウサギ血清) (c) 0.1Mホウ酸緩衝化第1反応用溶液(pH9.0,9.5,
10.0に各々緩衝化した正常ウサギ血清) ハ)結果 結果を図1に示す。
反応用溶液のpHが5.6〜8.5の時カットオフ値以上の吸光
値を示して陽性(偽陽性)と判定されたが、pH9.0〜10.
0の時にはカットオフ値以下の吸光値を示しており、陰
性と判定された。陽性コントロールは、各pHの第1反応
用溶液を用いてもカットオフ値以上の吸光値を示してお
り、陰性化することはなかった。これらの結果は、第1
反応用溶液のpHを9.0〜10.0に上昇させることにより、
非特異的な反応のみがより有効に除去されることを示す
ものである。
溶液としてホウ酸緩衝化第1反応用溶液を用いたが、グ
リシン水酸化ナトリウム緩衝化第1反応用溶液、ベロナ
ール塩酸緩衝化第1反応用溶液、炭酸重炭酸緩衝化第1
反応用溶液を用いた時も同様の結果を得た。
抗体陽性コントロールとして、HTLV−Iキャリアーの血
清を用いた。
HTLV−Iに対する免疫学的反応性における陽否を判定し
た。ただし、実施例1記載における第1反応用溶液とし
て実験例1記載におけるpH8.0とpH9.5の第1反応用溶液
を使用した。
用いた時には、4検体(4.4%)がカットオフ値以上の
吸光値を示し陽性(偽陽性)と判定されたが、pH9.5の
第1反応用溶液を用いた時には全てカットオフ値以下の
吸光値を示し、非特異的な反応により偽陽性と判定され
る例はなかった。また陽性コントロールの吸光値はpH9.
5の第1反応用溶液を用いた時にpH8.0の第1反応用溶液
を用いた時よりもやや低い吸光値を示したが、大差はな
かった。
pHを9.5に上昇させた第1反応用溶液を用いることによ
り、非特異反応を有効に除去できることを示すものであ
る。
結果を示すグラフである。
Claims (3)
- 【請求項1】固相に血清検体を添加して検体中の抗体を
測定する測定方法において、該添加をpH9〜10の条件下
で行い、検体中に変性あるいは凝集したIgG(変性抗
体)の非特異吸着を排除することを特徴とする測定方
法。 - 【請求項2】抗体が成人T細胞白血病ウィルス抗体(HT
LV−I抗体)である請求項1記載の測定方法。 - 【請求項3】固相に血清検体を添加して検体中の抗体を
測定する測定試薬において、該添加の条件のためにpH9
〜10の緩衝液が必須の構成成分となることを特徴とする
変性抗体の非特異吸着を排除した測定試薬。
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