JPH0739B2 - 改良されたグルコース異性化方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、グルコース（デキストロース）をフルクトー
ス（レブロース）に変換する酵素を用いた方法に関す
る。

ほとんどの食品用グレードのグルコースは、トウモロコ
シデンプン、即ち市販のコーン・シロツプの酵素加水分
解物として提供される。グルコースは、一般にシヨ糖の
60〜80％の甘味を有するとされており、このためそれに
相当する低価格で販売されている。グルコース・イソメ
ラーゼ活性を有する酵素、好ましくは、ジエチルアミノ
エチル−セルロース、多孔質ガラスまたはキチンのごと
き不活性担体に固定化された酵素を用いてグルコースを
フルクトース（これは、シヨ糖よりも甘味が強い）に異
性化することは、かなり古くから公知である。グルコー
ス・イソメラーゼを用いたグルコースのフルクトースへ
の酵素変換の詳しい記載は、ハミルトンら（Hamilton,e
t al.“Glucose Isomerase:a Case Study of Enzyme−C
atalyzed Process Technology",Immobilized Enzymes i
n Food and Microbial Processes）、オルソンら（Olso
n et al.,Plenum Press、New York,（1974）,pp.94−10
6,112,115−137）、アントリムら（Antrim,et al.,“Gl
ucose Isomerase Production of High−Fructose Syrup
s",Applied Biochemistry and Bioengineering,Vol.2,A
cademic Press（1979））、チエンら（Chen,et al.,“G
lucose Isomerase（a Review）",Process Biochem.,（1
980）,pp.30−35）、チエンら（Chen,et al.“Glucose
Isomerase（a Review）",Process Biochem.,（1980）,p
p.36−41）およびタカサキ（“Fructose Production by
Glucose Isomerase",Chem.Abstracts,Vol.81,（197
4）,Abs.No.76474a）の報文に見られる。さらに、グル
コースの異性化に関する多数の特許があり、代表として
米国特許第3,616,221号、再発行特許第28,885号（原出
願第3,623,953号）、第3,694,314号、第3,708,397号、
第3,715,276号，第3,788,945号、第3,826,714号、第3,8
43,442号、第3,909,354号、第3,960,663号、第4,144,12
7号および第4,308,349号が挙げられる。

グルコース・イソメラーゼを用いるグルコースシロップ
の異性化によつて達成されるフルクトースのレベルは異
性化反応の平衡によつて制限される。65℃において、純
デキストロースを出発基質とした場合、フルクトース約
51重量％（以下、単に％という）にて該反応の平衡が成
立する。精製デキストロース溶液を基質（非単糖類約６
％以下含有）として用い、酵素反応器中に適当な時間置
いた場合、約48〜52％のフルクトースシロツプが従来方
法にて得ることのできる最高の濃度である。より高含量
のフルクトースシロツプを得るには、分別システムを用
いなければならず、最終製品に多大のコストを付加す
る。しかしながら、より高温において、平衡は、より有
利となる。例えば、約90〜140℃の温度で操作しうるグ
ルコース・イソメラーゼ法を用いることができれば、直
接53〜60％のフルクトースを含有する高フルクトース・
コーン・シロツプ（HFCS）が得られ、分別および再循環
の必要がなくなる。しかしながら、公知のグルコース・
イソメラーゼ系は活性の急激な減少を伴なう熱変性を受
けるという傾向があるため、異性化の平衡をよりフルク
トースに有利にしようとする高温操作の試みは全く失敗
に終つていた。

さらに、フルクトースは、非常に不安定な糖であつて、
グルコースをフルクトース53〜60％に変換するのに必要
な高温にまでその溶液を加熱すると、容易に多数の好ま
しくない副生成物に分解する。プシコース、マンノー
ス、タガノース、フルクトース・ジ無水物、有機酸、着
色生成物および着色前駆物質が、フルクトース溶液を強
く加熱した場合に生じる最も一般的な副生成物である。

ここに、本発明者らは、驚くべきことに、後記する一定
のpH臨界点および酵素反応器中の滞留時間内にてグルコ
ース異性化操作を行なうことにより、約100℃〜約110℃
の異性化温度が効果的に用い得、高品質のHFCSシロツプ
が許容される副生成物の存在下に、約53〜約60重量％の
フルクトース含有量にて直接得られ、これによつて、前
記範囲のフルクトース濃度を有するHFCSシロツプを得る
公知のグルコース異性化方法に必要な高価で操作の複雑
な分別および再循環を省くことができることを見出し
た。

本発明によれば、約40〜約65重量％の炭水化物を含むグ
ルコース含有供給液をグルコース・イソメラーゼと温度
約100℃〜約110℃、pH約５〜約6.5にて、プシコースお
よび／または他の非フルクトース、非グルコース糖の何
ら実質的な形成なしに前記液体中の全炭水化物含有量に
基づき少なくともフルクトース約53〜約60重量％の最終
濃度を得られるに充分な約２〜約30分間の接触時間接触
させることからなる方法によりグルコースがフルクトー
ス−グルコースシロツプに異性化される。

前記の方法は、特別なグルコース・イソメラーゼの使用
によるものではないが、100℃以上にて本明細書にて規
定する充分な程度に異性化を達成する時間、不活性化に
耐えるに充分な安定性を有するグルコース・イソメラー
ゼを用いて行なうことができるものである。しかしなが
ら、特に熱安定性に注意のはらわれたグルコース・イソ
メラーゼ、例えば、米国特許第3,826,714号に開示のバ
チルス・ステアロサーモフイルス（Bacillus stearothe
rmophilus）により産生されるグルコース・イソメラー
ゼ、および米国特許第4,308,349号に開示のアンプラリ
エラ（Ampullariella）属の微生物により産生されるグ
ルコース・イソメラーゼを使用することも本発明の範囲
内である。さらに、熱安定性グルコース・イソメラーゼ
は、欧州特許出願第41,213号に記載のバチルス・リケニ
ホルミス（Bucillus licheniformis）並びに日本特許公
報74−30588号（C.A.81;76474a）に記載のサーモアクチ
ノマイセス（Thermoactinomyces）、サーモポリスポラ
（Thermopolyspora）、サーモモノスポラ（Thermomonos
pora）、およびシユードノカルデア（Pseudonocardia）
属の高温性微生物を用いて得ることができ、これらの文
献が参照できる。

本発明にもとづいてフルクトースに異性化されるグルコ
ースは、公知のこの糖のいかなる原料からも得ることが
できる。経済的理由から、該グルコースは、通常公知の
方法により酸および／または酵素、好ましくは酵素を用
いるセルロースまたはデンプンの加水分解により得られ
る。この方法により得られたグルコース含有液体は、典
型的には少量の多糖類、糖オリゴマー等を、用いた炭水
化物源および使用した加水分解法に従つて含有する。ト
ウモロコシ、マイロー、小麦、ライ麦などの穀類、並び
にバレイシヨ、ヤム、ニンジン、キヤツサバ（マニオツ
ク）などのデンプンを含む根および塊茎は、本発明のグ
ルコース出発物質に変換されるデンプンの優れた供給源
である。米国内においては、比較的低コストと入手の容
易性からトウモロコシデンプンがことに好ましい。食品
用グレードのグルコースの製造には、酵素によるデンプ
ン加水分解法の使用が好ましいので、本発明において
は、この方法を用いるのが好ましい。酵素加水分解法
は、米国特許第4,017,363号、第3,912,590号、第3,922,
196号、第3,922,197〜3,922,201号および第4,284,722号
に記載されており、これらが参照できる。

本発明によつて製造されたフルクトースは、グルコース
より得られるので、異性化に用いるデンプン加水分解物
はいずれもグルコース含量を最大限度高くするのが有利
である。酵素法によるグルコースの製造が好ましい。最
も好ましいのは、グルコアミラーゼのような酵素と、英
国特許出願GB2097405A号に記載のごとき分岐分解酵素
（debranching enzyme）の組合せを用いる方法である。
液化デンプンを同時にグルコースとフルクトースに変換
することのできる酵素の組合せは、特に好ましく、例え
ば米国特許第4,111,750号に記載のグルコアミラーゼ、
プルラナーゼおよびグルコース・イソメラーゼの組合せ
が挙げられる。この方法により乾物換算でフルクトース
48％とグルコース50％を含有する異性化加水分解法を提
供することが可能であり、これは本発明にもとづく次の
フルクトース53〜60％への変換に非常に適している。デ
ンプン加水分解物より多糖類を除去し、グルコース99％
を越えるフラクシヨンを得る膜による方法を用いること
も可能であり、これは本発明方法に理想的な出発物質で
ある。もちろん、デンプン加水分解物からの結晶化によ
り得られるグルコース溶液も、本発明方法の好ましい原
料物質に含まれる。

出発物質として用いられるグルコースおよび／またはグ
ルコース／フルクトース溶液は、その製造のいずれかの
段階で精製して、グルコース・イソメラーゼに対する非
炭水化物不純物のいかなる悪影響も回避し、本発明にお
ける高温異性化中の着色を最小限に制限することが好ま
しい。しかしながら、米国特許第4,376,824号に概説さ
れた製造原理に従えば、非精製デンプン加水分解物も適
当である。

所望により、本発明方法の出発基質として、グルコース
のみを含有する溶液を用いる代りに、グルコースの一部
がすでにフルクトースに異性化したグルコース溶液を用
いることもできる。例えば、52％までのフルクトースを
含む異性化グルコースの溶液は、本発明の方法に従つて
処理することができ、フルクトースの濃度を52％以上の
より望ましいレベルに、好ましくは55〜56％以上の水準
にレベルさせることができる。

炭水化物に基いて50％以下のフルクトースを含むグルコ
ースの溶液は従来の方法により製造されうる。

高温異性化中の過度の着色を防止する助剤として、重亜
硫酸塩生成物質を、米国特許第3,623,953号（再発行特
許第28,885号）の教示に従つてグルコース／フルクトー
ス供給溶液へ添加してもよい。不活性化を引き起しうる
いかなる酵素の酸化をも最小限とするため、高温異性化
反応中にグルコース・イソメラーゼと接触しうる全ての
溶液から酵素を排除するのが好ましい。

ここで用いられるグルコース・イソメラーゼは、公知の
いかなるグルコース・イソメラーゼ産生微生物からも単
離しえ、このような微生物としては、ストレプトマイセ
ス・フラボリレンス（Streptomyces flavouirens）、ス
トレプトマイセス・アクロモゲネス（Streptomyces ach
romogenes）、ストレプトマイセス・エチナタス（Strep
tomyces echinatus）、ストレプトマイセス・アルブス
（Streptomyces albus）、ストレプトマイセス・ウエド
モレンシス（Streptomyces wedmorensis）、ストレプト
マイセス・フアエオクロモゲネス（Streptomyces phaeo
chromogenes）、ストレプトマイセス・ボビリアエ（Str
eptomyces bobiliae）、ストレプトマイセス・オリボク
ロモゲネス（Streptomyces olibochromogenes）、スト
レプトマイセス・ベネズエラ（Streptomyces venezuela
e）、エアロバクター・アエロゲネス（Aerobactor aero
genes）、アエロバクター・クロアカエ（Aerobactor cl
oacae）、バチルス・コアグランス（Bacillus coagulan
s）、バチルス・メガテリウム（Bacillus megateriu
m）、バチルス・フルクトスス（Bacillus fructosu
s）、アセトバクター・オキシダンス（Acetobactor oxy
dans）、アセトバクター・サブオキシダンス（Acetobac
tor suboxydans）、アセトバクター・ロセウス（Acetob
actor roceus）、アセトバクター・メラノゲヌス（Acet
obactor melanogenus）、ラクトバチルス・フエルメン
チ（Lactobacillus fermenti）、ラクトバチルス・ブレ
ビス（Lactobacillus breuis）、ラクトバチルス・ガボ
ニ（Lactobacillus gavonii）、ラクトバチルス・リコ
ペルシシ（Lactobacillus lycopersici）、ラクトバチ
ルス・マンニトポエウス（Lactobacillus mannitopoeu
s）、ラクトバチルス・ペントアセチクス（Lactobacill
us pentoaceticus）、シウドモナス・ヒドロフイリア
（Pseudomonas hydrophilia）、ブレビバクテリウム・
ペンタアミノアシジクム（Brevibacterium pentaaminoa
cidicum）、エシエリヒア・インテルメデア（Escherich
ia intermedia）、ロイコノストツク・メセンテロイデ
ス（Leuconostoc mesenteroides）、およびパラコロバ
クトルム・アエロゲノイデス（Paracolobactrum aeroge
noides）、が挙げられる。ストレプトマイセス・エス・
ピイ（Streptomyces sp.）ATCC21,175は、本発明方法に
用いられるグルコース・イソメラーゼの優れた供給源で
ある。前記のごとく、本発明で用いられる比較的高い異
性化温度において安定性を有するグルコース・イソメラ
ーゼを用いるのが有利であつて、例えば、バチルス・ス
テアロサーモフイルス（Bacillus stearothermophilu
s）、特に米国特許第3,826,714号に開示のバチルス・ス
テアロサーモフイルスATCC21365、NRRLB−3680、NRRL B
−3681およびNRRL B−3682からなる群より選ばれた菌株
によつて産生されるグルコース・イソメラーゼ、アンプ
ラリエラ（Ampullariella）属の微生物、例えばアンプ
ラリエラ・ジギタタ（Ampullariella digitata）、アン
プラリエラ・ロバタ（Ampullariella lobata）、アンプ
ラリエラ・カンパヌラタ（Ampullariella campanulat
a）、およびアンプラリエラ・レギユラリス（Ampullari
ella regularis）により産生されるグルコース・イソメ
ラーゼ（米国特許第4,308,349号）、バチルス・リケニ
ホルミス（Bacillus licheniformis）により産生される
グルコースイソメラーゼ（欧州特許出願第41213号）お
よび日本特許公報74−30588号に記載されれる属の高温
性菌により産生されるグルコース・イソメラーゼなどが
挙げられる。

前記の微生物に加えて、本発明は、その変異種および変
種、並びに中温性および高温性微生物を含む他の微生物
へ変異グルコース・イソメラーゼ遺伝子を導入すること
によつてそれらから由来した遺伝的形質変換微生物を用
いることも包含する。かかる使用のために選択される変
異グルコース・イソメラーゼ遺伝子は、高温下、ことに
90℃以上、好ましくは約140℃まで安定なグルコース・
イソメラーゼを提供するものである。このような遺伝子
は照射または化学的手段などのような微生物の変異に用
いられる通常の技術により作ることができる。別法とし
て、例えば、ある種のストレプトマイセス属の菌株によ
り産生されるような隠やかな温度で安定性を有するグル
コース・イソメラーゼを産生する単離されたグルコース
・イソメラーゼ遺伝子をin vitroにて変異させることも
できる。適当な変異遺伝子の選択は、変異した遺伝子を
親または他の生物に再導入し、該生物の増殖および複製
を行ない、得られたグルコース・イソメラーゼの熱安定
性をテストすることにより行なわれる。組換えDNA技術
も、本発明に用いるのに適した改良された熱安定性を有
するグルコース・イソメラーゼを得るために用いること
ができる。アルゴスら（Argos,et al.Biochemistry18
（25）:5698−5703（1979））は、中温性生物由来の酵
素中のグリシル、セリル、バリルおよびリジルのある種
のアラニル置換体が高温性生物由来の対応する酵素中に
見い出されることを指摘している。ペルツ（Perutz,Sci
ence,201,1187−91（1978））は、高温性細菌の酵素の
大きな安定性は、タンパク質表面の付加塩架橋によるこ
とが大きいことを示している。ツーバー（Zuber,“Bioc
hemistry of Thermophily",Friedman,S.M.ed.,pp.267−
285、Academic Press,N.Y.,1978）は、さらに熱安定酵
素の構造についての情報を与えている。すなわち、グル
コース・イソメラーゼのアミノ酸鎖および三次元（第三
級）構造が判明すれば、イソメラーゼ遺伝子中の部位特
別性変異により安定性を向上させ、より安定な構造を与
えるアミノ酸の量が増加するよう設計された酵素を得る
ことが可能となる。グルコースイソメラーゼのDNA鎖が
決定された後、新しい鎖を作るために遺伝子シンセサイ
ザーを用いることができ、これによつて、このような人
工遺伝子により作られたグルコース・イソメラーゼの熱
安定性を増加させることができる。このように設計され
た酵素は、本発明の実施にことに有用である。

グルコース・イソメラーゼは、典型的にはこれらのまた
は他の微生物により、細胞内で産生されるので、グルコ
ース・イソメラーゼ源は、単に微生物体を採取すること
により得ることができる。グルコース・イソメラーゼ
は、公知技術、例えば音波破壊によつて微生物体より分
離することができ、公知の通常の設計の酵素反応器中に
て用いることができる。ここで用いられるグルコース・
イソメラーゼは、その由来にかかわらず、公知の通常の
方法に従がつて不活性物質に固定化されるのが好まし
い。酵素の固定に用いられる材料および方法は、よく知
られており、数多くの報文がある。例えば、ワング（Wa
ng,et al.Fermentation ＆ Enzyme Technology,John Wi
ley ＆ Sons,Inc,New York（1979）,pp.318−338）およ
びキルク−オスマー（Kirk−Othmer,Encyclopedia of C
hemical Technology,3rd Ed.,John Wiley ＆ Sons,In
c.,New York（1980）vol.9pp.148−172）が挙げられ、
それらが参照される。少量のコバルトカチオンおよび／
または亜硫酸の水溶性塩、例えば亜硫酸ナトリウム、重
亜硫酸ナトリウム、亜硫酸マグネシウムおよび／または
重亜硫酸マグネシウムの存在は、米国再発行特許第28,8
85号に教示されるごとく、本発明の方法の実施中グルコ
ース・イソメラーゼの変性を減少、阻止することができ
る。

グルコース含有供給液体中の炭水化物の濃度は、好まし
い結果を得るためには、約40〜約65重量％の範囲である
必要がある。

また、異性化は、約５〜約6.5の範囲のpHで行なわれる
ことが必要である。前記pH範囲より著しく低いかまたは
高い範囲での異性化操作は、多量の望ましくない副生成
物、例えば、プシコース、有機酸、着色生成物、着色前
駆体、フルクトース・ジ無水物などの形成につながる。

グルコース・イソメラーゼの活性に対する至適pHは、高
温で著しく下がることがわかつた。すなわち、ストレプ
トマイセス・ラビンゲノサス（Streptomyces rubingeno
sus）由来のグルコース・イソメラーゼでは、至適活性
は、25℃においてpH8.6〜9.2、75℃でpH6.9〜7.5、125
℃でpH5.6〜6.2である。このように、異性化温度の上昇
に従がい、異性化pHを下げることにより、酵素活性を最
大に保持し、さらに副生成物の形成を回避することがで
きる。

本発明方法では、接触時間は、反応混合物中に存在する
全炭水化物に基いて少なくともフルクトース53〜56％の
最終濃度が得られるに必要な時間に規定される。グルコ
ース含有供給液は、実質上グルコース単独（すなわちフ
ルクトースは少量またはなし）からなつていてもよく、
また約52％までの範囲のフルクトースを有するグルコー
スからなつていてもよいので、その反応時間は、供給液
の性質にもとづき異なる。したがつて、１秒程度の短時
間から数時間までの接触時間が有効であり、通常の接触
時間は、約２〜約30分間である。

グルコース・イソメラーゼとグルコース含有液との好ま
しい接触時間は、異性化反応の行なわれるpHにより広い
範囲で変わる。該pH範囲の下限においては、グルコース
およびフルクトースが好ましくない分解を生じてプシユ
ースおよび他の望ましくない分解生成物が生成すること
なく、長い接触時間が許されうる。pH範囲の上限におい
ては、プシコースおよび着色の生成を回避するために短
かい接触時間であることが必要である。実際上は、グル
コース含有シロツプが最終反応温度付近に置かれる合計
時間が、有効接触時間として計算されるが、これは糖分
解反応が非酵素的であつて、該液体がグルコース・イソ
メラーゼと接触しているかどうかにかかわらず起こるこ
とにもとづく。したがつて、90℃以上で異性化を行なう
には、グルコース溶液を所望の異性化温度に上昇させる
に必要な時間を最少限とし（例えば、イソメラーゼとの
接触直前または接触中に該液体をスチームと混合するこ
とにより）、一旦所望のフルクトースレベルが達成され
れば速やかに液体をいずれの活性イソメラーゼからも分
離し、ついで該液体をできるだけ速やかに90℃以下、好
ましくは70℃以下に冷却することが重要である。可溶性
の形態のグルコース・イソメラーゼを用いる場合は、不
活性化（例えば、イソメラーゼを不活性化する範囲にpH
を低下させることにより）を行なつた後、冷却操作を行
ない、高温異性化工程中に形成されたフルクトースがグ
ルコースに再変換するのを完全に回避することが必要で
ある。これは、当然ながら異性化反応が可逆であること
による。

達成することのできるグルコースのフルクトースの変換
の最大度合は、グルコースとフルクトースの間の熱力学
的平衡によつて律され、これは、さらに、異性化を行な
う温度に依存する。グルコースとフルクトースの混合物
の平衡に関する非常に注意深い分析から、つぎの関係が
確立された。

Ｆ＝100K/（Ｋ＋１） （１） 式中、Ｆはグルコースとフルクトースの全重量に基く平
衡時のフルクトースの％、Ｔは異性化を行なう温度
（℃）、Ｋはグルコース−フルクトース平衡定数を意味
する。

反応器中におけるグルコース含有シロツプとイソメラー
ゼの間の実際の接触時間は、固定化された形のイソメラ
ーゼを入れた反応器を用いる場合、一般に、つぎの式を
参照して算出される。

式中、ｔは実際の接触時間、Ｃはグルコースおよびフル
クトースの濃度、Ｖは充填床中の遊離液体の容量（床の
容量−固定化酵素によつて占められた容量）、Feは異性
化温度における平衡時のグルコース／フルクトース混合
物中のフルクトースのフラクシヨン、Foは充填床への入
口におけるフルクトースのフラクシヨン（グルコース＋
フルクトースに基く）、Ｆは充填床に存在する液体中の
フルクトースのフラクシヨン（グルコース＋フルクトー
スに基く）、ｋはその異性化条件における異性化の反応
速度定数、Ａは充填床におけるイソメラーゼの活性を意
味する。

後記参考例に従つて調製した固定化イソメラーゼについ
てのｋ値は、各々、90〜140℃の温度で約0.07〜約5ghr
^-1IGIU^-1の範囲にある。この関係は単位容量当りの活性
の高い充填床を用いることによる高温における接触時間
を最少にするための要求を示している。後記の参考例の
方法に従つて形成された充填床は2000IGIU/mlまで含む
ことができ、これは、段階反応器を別々の温度で用い、
第一段の反応器への供給物を、第二段の反応器における
高温での異性化の前に低温で異性化させる場合、高温反
応器中で１分以内にフルクトース含量平衡の99.5％を達
成できることとなる。段階反応器システムを利用する場
合、約40〜約65重量％の炭水化物を含有するグルコース
含有供給液を約20℃〜約80℃、pH約6.0〜約9.0で、約0.
5〜約２時間の接触時間でグルコース・イソメラーゼと
接触させて該液中で全炭水化物に基いて約52重量％まで
のフルクトースレベルを達成させ、該異性化液の温度を
約100℃〜約110℃に上昇させ、該異性化液のpHを約５〜
約6.5の範囲に調整し、このフルクトース含有液をさら
に約２〜約30分間グルコース・イソメラーゼと接触させ
て変換レベルを当初のグルコース含有供給液中に存在し
たグルコースの約53〜約60重量％に増加させることから
なる酵素的にグルコースをフルクトースに変換する方法
を用いることが好ましく、これにより、プシコースまた
は他の非フルクトース、非グルコース糖の生成は実質的
に起らない。したがつて、高効力の充填床の使用は非常
に短い有効接触時間の採用を可能にし、これは、さら
に、本発明に必要な高温において起るフルクトースの分
解を最少にすることができる。

グルコース・イソメラーゼ固定化技法の選択において
は、小さな、実質的に非圧縮性の多孔質触媒粒子が得ら
れることのできる方法が好ましく、これにより、異性化
速度拡散効果の阻害が最少になる。別法として、酵素と
基質の良好な接触を促進させ、拡散の制限を最少にする
ための手段として該グルコース溶液を高温異性化の間に
強制的に通過させる膜の孔内に該イソメラーゼを固定す
ることもできる。固定化に用いる担体は、基質溶液のグ
ルコース／フルクトース成分の望ましくない汚染または
分解をさけるために全く不溶性、不活性であることが好
ましい。

しかし、商業的実施において、フルクトース含有シロツ
プは純グルコースから製造されるものではない。むし
ろ、デンプン加水分解物（前記の文献中で製造されてい
るような）をグルコース源として用いており、これらは
常に、デンプンの不完全な加水分解や、グルコースの戻
りに由来する非グルコースおよび非フルクトース糖類
（以下、多糖類という）を含有している。典型的には、
これらは、デンプン加水分解に由来する糖類の全乾燥重
量の３〜８％を構成する。したがつて、異性化を行なう
温度を算出する場合に、グルコース液中に含有されるい
ずれの多糖類ならびに、達成すべき総乾物換算のフルク
トース含量、グルコース液とイソメラーゼの有効接触時
間の間のプシコースおよび他の非グルコース、非フルク
トース生成物の形成のような他の因子を考慮することが
必要である。異性化温度の算出についての関係を以下に
示す。

式中、Ｔは異性化温度（℃）、Ｆは温度Ｔにおける平衡
フルクトース含量（全グルコース＋フルクトースに基く
％）、Ｍは異性化生成物中に要求される乾物換算のフル
クトース％、Ｃは有効異性化接触時間の間に形成された
プシコース＋他の分解生成物％、Ｑは異性化反応の間に
達成された平衡の％、Ｐはグルコース液の多糖類含量％
を意味する。

典型的には、１％以下、好ましくは、0.5％以下のプシ
コースおよび他の分解生成物が形成され、99.5％の平衡
が達成される。したがつて、55.5％フルクトース（乾物
換算）のシロツプを調製するには、以下に示す多糖類含
量のグルコース液にはつぎのような異性化温度が必要で
ある。

許容される商品は、平均的に、乾物換算で55.5％のフル
クトースを含有する。これは、このフルクトース・レベ
ルで、高フルクトース・コーン・シロツプ（HFCS）が乾
物換算重量でシヨ糖と等しい甘味を呈することになるか
らである。さらに、55.5％フルクトース含量のHFCSは多
くの食品、ことに、炭酸飲料において、シヨ糖の全部ま
たは一部と置き換えて同等に使用される商品として確固
たる地位を得ている。米国におけるこのタイプのHFCSの
消費は1982年で29億ポンドが期待され、1983年では40億
ポンドとなることが予想される。HFCSの配送、貯蔵、計
量および食品への処方における固有の複雑さから、異な
つた供給源からの製品が同等に、かつ、同時に使用でき
るようにするために、１つのHFCS製造業者の製品を他の
業者のものと一様にするための普遍的な要求が存在す
る。したがつて、乾物換算で55〜56％のフルクトース・
レベルはHFCS製造に併なう技術における目標レベルとし
て特に重要な意味がある。

本発明の方法は、少なくとも53％、好ましくは、少なく
とも54％、もつとも好ましくは、少なくとも55％のフル
クトース・レベルを与える。

この方法の生成物は、着色が許容しうる程度であるとい
う特徴も有し、精製の費用も最小限となるので当然非常
に望ましい。通常、着色は、約55（CIRF X100）以下、
好ましくは、20以下、もつとも好ましくは10以下であ
る。

前記のグルコース濃度、pHおよび接触時間の要件に従つ
て、公知のグルコース異性化法を適宜採用し、約100〜
約110℃で操作し、本発明の高グルコース−フルクトー
ス・シロツプを得ることができる。

つぎに、実施例にもとづき、本発明をさらに詳しく説明
する。

参考例１ 本参考例は、乾物換算でフルクトース55.5％を含有する
組成物を得る高温下の直接グルコース異性化を示すもの
であり、ここでは二段階異性化システムを用いる。

可溶性グルコースイソメラーゼを米国特許第3,788,945
号の記載と同様な方法により製造する。

ストレプトマイセス・ルビゲノサス（Streptomyces rub
igenosus）ATCC21175由来のストレプトマイセス・ルビ
ゲノサス菌を好気性液体発酵によりつぎの組成の培地で
培養する。

％ デキストロース 9.0 コーン・ステイープ・リカー（固形分） 1.6 リン酸ジアンモニウム 0.08 硫酸マグネシウム 0.06 発泡防止剤（Pluronic PL−61） 0.003 この培地を121℃で45分間滅菌、冷却後、pH6.8〜7.0に
調整する。前記のストレプトマイセス・ルビゲノサス変
種株を用いて製造した種発酵物かならる接種物を14％
（V/V）でこれに接種する。発酵を無菌状態下に30℃に
て約60時間0.65vvmでエアレーシヨンして行なう。スト
レプトマイセス・ルビゲノサスATCC21175も接種および
イソメラーゼの産生に用いられ、この場合はつぎの組成
の培地が用いられる。

％ デキストロース 0.24 コーン・ステープ・リカー（固形分） 1.5 ソルビトール 1.6 CoCl₂ 0.02 リン酸ジアンモニウム 0.56 キシロース 1.0 グルコース・イソメラーゼは、0.35％マクアツト（Maqu
at）MC1412（メイソン・ケミカル社製（Mason Chemical
Co.））および10ppm鶏卵リゾチームを添加して、５時
間40℃、pH6.3〜6.6にて撹拌することによりストレプト
マイセス・ルビゲノサスより抽出される。ついで、混合
物を過し、粗製の未精製グルコース・イソメラーゼ溶
液を得る。

粗製イソメラーゼは、DEAE−セルロース（米国特許第3,
823,133号により製造）に吸着させ、過し、該吸着生
成物を0.1M NaCl溶液で洗滌し、不純物を除去した後、
0.45M NaCl溶液と接触させることにより脱着させて精製
される。全ての溶液のpHは、精製工程中7.5に維持され
る。このようにして得られた部分精製イソメラーゼ溶液
は、３倍容量の95％エタノールと０℃にて混合され、イ
ソメラーゼを沈澱させる。パーライト過助剤を加え、
過して固形物を回収し、風乾し、2500IGIU/gを含む可
溶性イソメラーゼ調製物を得る。該イソメラーゼ調製物
の比活性は、40IGIU/mg蛋白である。

米国特許第3,788,945号によつて製造した固定化イソメ
ラーゼを１″径のガラスカラムに充填して低温（70℃）
イソメラーゼ反応器を調製し、20000IGIUの活性を有す
る5cm高の床を得る。充填床の上部空間には温度計と、
できるかぎり無効な容積を最小限とするためのガラスビ
ーズを詰める。該カラムに入口と出口を設け、サーモス
タツトからの水を循環させるジヤケツトを取付ける。

同様に、前記精製イソメラーゼをDEAE−セルロースに吸
着させることにより得た固定化イソメラーゼを用いて、
高温（93℃）反応器を得る。充填床は、97,000IGIUを含
有し、高さ15cmである。

可溶性イソメラーゼ調製剤の活性は、ロイドら（Lloyd
et al.Cereal Chemistry,49,No.5,pp.544−543（197
2））に記載の方法により決定される。1IGIUは、該方法
で測定した場合、グルコース２モル／、MgSO₄0.02モ
ル／およびCoCl₂0.001モル／を含む溶液中、pH6.85
（0.2Mマレイン酸ナトリウム）、温度60℃にて１分間当
りグルコース１マイクロモルをフルクトースに変換する
イソメラーゼの量である。

グルコース含有溶液は、結晶グルコース（クリントース
Ａ顆粒（Clintose A granulation,Clinton Corn Proces
sing Co.）を脱ミネラル水に溶解して調製し、乾物換算
で48％を含む溶液とする。活性化剤および安定性剤とし
て、グルコース溶液に25mMメタ重亜硫酸ナトリウム、5m
M硫酸マグネシウムおよび0.1mM塩化コバルトを溶解す
る。該溶液を水酸化ナトリウムによりpH6.8に調整す
る。

最初の低温異性化は、70℃にてポンプにより前記グルコ
ース溶液を低温反応器に3.7ml/分で通すことにより行な
われる。反応器より流出する最初の溶液2500mlを廃棄
し、その後反応器より流出する液を集め、第二の高温異
性化に用いる。高温異性化においては、70℃の異性化に
より得られた溶液を、反応器温度を93℃に保ちつつ、ポ
ンプにより5ml/分で前記のごとく調製した高温反応器に
通す。高温反応器における溶液と固定化酵素との接触時
間は、約12分間である。該溶液が93℃にて反応器内に存
在する全時間は、約18分間である。該溶液は、高温反応
器より出ると直ちに氷冷され、pH4.0に調整される。最
初の１時間の高温反応器よりの流出液は、廃棄する。

70℃および93℃の反応器より得られた異性化グルコース
溶液の炭水化物組成および色を分析し、その結果を未異
性化グルコース溶液について同様に分析を行なった結果
と比較して第１表に示す。

該結果は、乾物換算でプシコースを0.5％以下に保持し
ながら、フルクトース55.5％が得られることを示す。着
色の増加は、５（CIRF×100）以下である。

炭水化物含有量および色はthe Standard Analytical Me
thods of Member Companies of the Corn Refiners Ass
ociation（Corn Refiners Association,Inc.,1001Conne
cticut Avenue,Washington,D.C.,20036）のＥ−61およ
びＦ−14法により各々測定した。Ｆ−14法により得られ
た着色値は100倍し、（CIRF×100）として記載した。

参考例２ 本参考例は、主として精製トウモロコシデンプン加水分
解物からなるグルコース含有溶液からのフルクトース5
5.2％を有するフルクトース含有生成物の製造を示すも
のである。

該加水分解物は、トウモロコシデンプンより、米国特許
第3,644,126号（液化）および米国特許第3,280,006号
（糖化）に記載の方法に従つて製造される。糖化液は、
米国特許第3,834,940号に従つて精製し、全乾物含量50
％で乾物換算でグルコース95.3％を含む生成物を得る。
充分量の結晶グルコースを加え、乾物換算で全グルコー
ス含量97.1％とする。これにより以下の組成の溶液を得
る。

全乾物（％） 42.4 グルコース（％乾物換算） 97.1 フルクトース（％乾物換算） 0.1 多糖類（％乾物換算） 2.8 プシコース（％乾物換算） 0.0 NaHSO₃（mM） 50.0 MgSO₄（mM） 5.0 CoCl₂（mM） 0.1 pH 6.8 高さ16.5cmの床中147500IGIUを含む高温反応器を参考例
１と同様にして作る。温度を97.4℃に制御する。前記溶
液をポンプにより2.2ml/分で充填床に通す。反応器から
の初期流出液50mlを廃棄し、その後カラムより出た流出
液を採取し、分析する。得られた結果を未異性化グルコ
ース溶液の組成と比較してつぎの第２表に示す。

この結果は、プシコースの生成がわずか0.2％において
フルクトース55％以上が得られることを示している。本
参考例において生ずる比較的高い着色は、ほとんどのフ
ルクトースが低温（70℃）で生成される参考例１の二段
プロセスに対して、全体の異性化が高温（97.4℃）で行
なわれることに起因しており、二段反応器の使用により
回避されうる。しかしながら、生じた着色は13（CIRF×
100）以下である。

参考例３ 本参考例は、精製トウモロコシデンプン加水分解物に結
晶グルコースを加えてなるグルコース含有溶液より乾物
換算でフルクトース55.3％を含有するフルクトース含有
生成物を製造する方法を示すもので、ここでは、第二段
に市販の固定化グルコース・イソメラーゼを用いた二段
階異性化システムを用いる。

第一段反応器用の可溶性グルコースイソメラーゼを参考
例１に記載された方法によつて調製し、精製する。この
調製物の比活性は40.9IGIU/mg蛋白である。この酵素の
全量25000IGIUをホワツトマンDE−23 DEAE−セルロー
ス10g上に吸着させて固定化する。この固定化酵素は、
参考例１と同様にして直径１″のジヤケツト付ガラスカ
ラムにおける70℃反応器を製造するのに用いる。床の高
さは13cmである。

該反応器用の基質は基本的には参考例２と同様にして調
製され、以下の組成を有する。

全乾物（％） 50.2 グルコース（％乾物換算） 97.6 フルクトース（％乾物換算） 0.0 多糖類（％乾物換算） 2.4 プシコース 0.0 NaHSO₃（mM） 50.0 MgSO₄（mM） 5.0 CoCl₂（mM） 0.1 pH 6.8 低温異性化は、前記基質を3.2ml/分の流速でポンプを使
つて該低温反応器に通すことにより70℃で行なう。反応
器からの初期流出液1000mlを廃棄する。その後流出した
流出液を第二の高温異性化で使用するために集める。

高温反応器を製造するのに使われる酵素は、エンザイム
・デイベロープメント・コーポレイシヨン（Enzyme Dev
elopment Corportion）から得られるイソメラーゼであ
る。該酵素は、Maxazyme GI immob.,batch K−12467を
まず乳鉢と乳棒で摩砕し、粒子径を小さくし、ついで、
該摩砕酵素を20メツシユの標準篩に通し、60メツシユの
篩によつて残る部分を基質に懸濁し、真空下で60℃にて
60分間脱気する。該脱気スラリーを用いてジヤケツト付
ガラスカラム中、1.5×39cmの床を製造する。この充填
床は5200IGIUを含んでいる。

第一段の70℃異性化より製造された基質をpH6.5に調整
し、希釈して乾物含量42.6％とする。ついで、該基質を
6ml/分の流速で60℃にて30分間ポンプを使つて該カラム
に通す。該カラムの内部温度を、床直上に位置させ、無
効容積をできるだけ少なくするための0.5cmガラスビー
ズで取り囲んだ温度計でモニターする。ついで、該カラ
ムの温度を、98.7℃のサーモスタツト付浴からの水をジ
ヤケツトを通して循環させて速やかに上昇させる。該カ
ラムの温度が97℃に達したとき、基質流速を2.0ml/分に
減ずる。この基質流速で、固定化酵素と基質の接触時間
は約22分であり、また該溶液が97℃の反応器内に滞在す
る全時間は約35分である。

該カラムからの流出液を50〜58％のフルクトースを読み
取るための目盛をつけた記録式旋光計によつてモニター
する。該流出液のフルクトース含量が所望のレベルに達
した時、該流出液を集め、氷浴中で速やかに冷却する。
1Mクエン酸を加えてpH4.0に調整する。見かけ上のフル
クトースレベルが55％以下に下がるまで流出液を集め
る。

70℃および97℃反応器から得られる異性化溶液の炭水化
物組成および色を分析し、その結果を未異性化基質液に
ついて行なつた同様の分析結果と比較して以下の第３表
に示す。

この結果は、乾物換算で0.4％以下のプシコースを維持
してフルクトースレベル55.5％がが達成されたことを示
している。

参考例４ 本参考例は、フルクトース55.8％を含有する組成物を得
るための高温下におけるグルコースの直接異性化を示す
もので、ここではアースロバクター・エス・ピー（Arth
robacter sp.）によつて産生されるイソメラーゼの固定
化物を用いて第二段階異性化を行なう。

アースロバクター・シトレウス（Arthrobacter citreu
s）菌株を以下の組成を有する培地上で好気的液体発酵
にて増殖させる。

キシロース 1.5％ ブレイン・ハート・インフユージヨン培地（BHI）4.2％ 酵母エキス 0.1％ 塩化ナトリウム 0.2％ カゼインアミノ酸 0.5％ 硫酸マグネシウム 0.024％ pH 6.9〜7.2 発酵は無菌条件下30℃にて44時間行なう。菌体を遠心分
離によつて採集し、0.85％の塩化ナトリウムで洗滌し、
再び遠心分離する。10260IGIUの全イソメラーゼ活性を
有する菌体塊76gが得られる。鶏卵リゾチーム900mgおよ
び界面活性剤BTC−835（Onyx Chemical社製）250mgd.b.
を含有する水250ml中に該菌体塊を懸濁させ、pH7.0に調
整し、45℃にて16時間培養して菌体塊45gよりグルコー
ス・イソメラーゼを抽出する。ついで、該懸濁液を遠心
分離し、上澄液を分離する。不溶性物質を0.1％トリト
ンＸ−100（Triton X−100）（Sigma Chemical社製）、
pH7.0中に懸濁させ、45℃にて８時間培養する。この懸
濁液を遠心分離し、上澄液を最初の遠心分離で得られた
上澄液を合す。

合した該抽出液を、YM−30メンブランを用いたAmicon40
1スタード・セル（Amicon401stirred cell,Amicon Corp
oration）で限外過して濃縮、精製する。滞留物を５
倍容の0.2mM CoCl₂,1mM MgSO₄溶液（pH7.0）で２回透析
過する。限外過後の最終滞留物は合計で3115IGIUを
含有する。この酵素は、米国特許第3788945号に従いDEA
E−セルロースへ吸着させる固定化イソメラーゼの調製
に用いられる。全量4.0gのホワツトマンDE−23を該溶液
に加え、pHを7.0に調整し、該懸濁液を室温にて60分間
撹拌する。その結果得られる不溶性酵素を取し、水洗
する。水洗した固定化酵素の一部を基質中に懸濁させ、
60℃にて60分間脱気し、高温反応器における1.5×13cm
床を製造するのに用いる。

該反応器用の基質は、基本的には参考例１と同様にして
第一段の70℃異性化によつて調製する。この基質は以下
の組成を示す。

全乾物（％） 42.6 グルコース（％乾物換算） 46.9 フルクトース（％乾物換算） 52.3 多糖類（％乾物換算） 0.8 プシコース 0.0 NaHSO₃（mM） 50.0 MgSO₄（mM） 5.0 CoCl₂（mM） 0.1 pH 6.7 基質を6ml/分の流速で60℃にて30分間ポンプを使つて反
応器に通す。ついで、該カラムの温度を速やかに97.8℃
に上昇させ、流速を2ml/分に減じ、流出液を前の参考例
と同様にしてモニターする。流出液を氷浴中で集め、1M
クエン酸でpH4.0に調整する。

97.8℃反応器からの流出液、第一段の70℃異性化によつ
て得られる基質および70℃反応器用の基質として用いら
れる原デキストロース溶液の炭水化物組成および色につ
いて分析する。結果を以下の第４表に示す。

該結果は、プシコースを0.2％以下、色を６以下（CIRF
×100）に維持してフルクトースレベル55.8％が達成さ
れたことを示す。

実施例１ 本実施例は、フルクトース55.8％を含むフルクトース含
有生成物を製造するため、第二段反応器を100℃以上で
用いる二段異性化システムの使用を示すものである。

第二段反応器用の基質は参考例３と全く同様にして第一
段反応器によつて調製し、pH6.6に調整する。

第二段反応器用の固定化イソメラーゼはMaxazymae GI i
mmob.で、参考例３と同様にして摩砕し、篩にかける。
この酵素を基質に懸濁させ、60℃で脱気し、高温反応器
における1.5×40.5cm床を調製するのに用いる。全イソ
メラーゼ活性は5820IGIUである。基質を6ml/分の流速で
合計90分間、温度を60℃に維持してポンプを使つて反応
器に通す。ついで、カラムの温度を102℃に上昇させ、
基質の流速を3ml/分に減ずる。この条件下、基質と酵素
床との接触時間は約16分であり、また102℃での全滞留
時間は約24分である。

カラムからの溶出液を集め、参考例３および参考例４と
同様に分析する。その結果を以下の第５表に示す。

この結果は、わずか0.2％のプシコース含量のフルクト
ース55.5％含有生成物が得られたことを示している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭52−5706（ＪＰ，Ａ) 特開 昭49−92243（ＪＰ，Ａ) 特公 昭55−12238（ＪＰ，Ｂ１) 特表 昭56−501630（ＪＰ，Ａ)

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】約40〜約65重量％の炭水化物を含むグルコ
   ース含有供給液をグルコース・イソメラーゼと、温度約
   100℃〜約110℃、pH約５〜約6.5にて、プシコースおよ
   び／または他の非フルクトース、非グルコース糖の何ら
   実質的な形成なしに、該液中のフルクトースの最終濃度
   が全炭水化物含量に基いて少なくとも約53〜約60重量％
   となるに充分な約２〜約30分間の接触時間接触させるこ
   とを特徴とするグルコースのフルクトースへの異性化方
   法。
2. 【請求項２】グルコース含有液が、トウモロコシデンプ
   ンの加水分解により得られる特許請求の範囲第（１）項
   記載の方法。
3. 【請求項３】グルコース含有供給液が、トウモロコシデ
   ンプン加水分解物を異性化して、全炭水化物含量に基い
   てフルクトース含量52％までとしたものである特許請求
   の範囲第（１）項記載の方法。
4. 【請求項４】グルコース・イソメラーゼが、ストレプト
   マイセス（Streptomyces）種、その変異種、変種および
   遺伝子改変種からなる群より選ばれた微生物から得られ
   る特許請求の範囲第（１）〜（３）項のいずれか１項記
   載の方法。
5. 【請求項５】グルコース・イソメラーゼが、ストレプト
   マイセス・エス・ピイ（Streptomyces sp.）ATCC2117
   5、その変異種、変種および遺伝子改変種からなる群よ
   り選ばれた微生物から得られる特許請求の範囲第（１）
   〜（４）項のいずれか１項記載の方法。
6. 【請求項６】グルコース・イソメラーゼが、変異グルコ
   ース・イソメラーゼ遺伝子を導入した微生物より得られ
   るものであって、該変異遺伝子が熱安定性の高いグルコ
   ース・イソメラーゼを提供するものである特許請求の範
   囲第（１）〜（５）項のいずれか１項記載の方法。
7. 【請求項７】グルコース・イソメラーゼが、熱安定性グ
   ルコース・イソメラーゼである特許請求の範囲第（１）
   〜（６）項のいずれか１項記載の方法。
8. 【請求項８】熱安定性グルコース・イソメラーゼが、バ
   チルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothe
   rmophilus）由来である特許請求の範囲第（７）項記載
   の方法。
9. 【請求項９】熱安定性グルコース・イソメラーゼが、バ
   チルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）由
   来である特許請求の範囲第（７）項記載の方法。
10. 【請求項１０】熱安定性グルコース・イソメラーゼが、
    サーモアクチノマイセス（Thermoactinomyces）、サー
    モポリスポラ（Thermopolyspora）、サーモモノスポラ
    （Thermomonospora）またはシウドノカルデア（Pseudon
    ocardia）属の高温性微生物由来である特許請求の範囲
    第（７）項記載の方法。
11. 【請求項１１】熱安定性グルコース・イソメラーゼが、
    アンプラリエラ（Ampullariella）属の微生物由来であ
    る特許請求の範囲第（７）項記載の方法。
12. 【請求項１２】酸素変性防止量の亜硫酸の水溶性塩が、
    異性化基材中に存在する特許請求の範囲第（１）〜（1
    1）項のいずれか１項記載の方法。
13. 【請求項１３】グルコース・イソメラーゼを固定化形態
    で用いる特許請求の範囲第（１）〜（12）項のいずれか
    １項記載の方法。
14. 【請求項１４】グルコース・イソメラーゼが、ジエチル
    アミノエチルセルロースに固定化されている特許請求の
    範囲第（13）項記載の方法。
15. 【請求項１５】生成フルクトース−グルコース異性化混
    合液を約80℃以下の温度に冷却する特許請求の範囲第
    （１）〜（14）項のいずれか１項記載の方法。
16. 【請求項１６】生成フルクトース−グルコース異性化混
    合液を温度約20℃〜約80℃に冷却する特許請求の範囲第
    （１）〜（15）項のいずれか１項記載の方法。
17. 【請求項１７】第一工程として、約40〜約65重量％の炭
    水化物を含むグルコース含有供給液をグルコース・イソ
    メラーゼと、温度約20℃〜約80℃、pH約６〜９、接触時
    間約0.5〜約２時間で接触を行ない前記溶液中の全炭水
    化物に基いて約52重量％までのフルクトースレベルを達
    成し、第二工程として、異性化基材の温度を約100℃〜
    約110℃に昇温させ、約５〜約6.5の範囲にpHを調整し、
    ついで、該フルクトース含有溶液をフルクトースレベル
    を約53〜約60重量％に増加させるに充分な約２〜約30分
    間の接触時間、さらにグルコース・イソメラーゼと接触
    させることを特徴とするグルコースのフルクトースへの
    異性化方法。
18. 【請求項１８】生成フルクトース−グルコース異性化混
    合液を約80℃以下の温度に冷却する特許請求の範囲第
    （17）項記載の方法。
19. 【請求項１９】生成フルクトース−グルコース異性化混
    合液を温度約20℃〜約80℃に冷却する特許請求の範囲第
    （17）項または（18）項記載の方法。