CN114231578B - 一种双酶法制备阿洛酮糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种双酶法制备阿洛酮糖的方法,具体以葡萄糖液为底物,加入硫酸镁、硫代硫酸钠、亚硫酸氢钠酶激活剂,调节pH7.3‑7.6,加入固定化双酶(葡萄糖异构酶和D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶)进行异构化反应,异构化温度50‑60℃,80‑100r/min搅拌反应8‑24h,反应液进行过滤分离,滤液经脱色、离交、色谱、浓缩、干燥得阿洛酮糖。本发明以固定化双酶催化底物连续异构生成阿洛酮糖,降低了原料成本,且固定化酶可重复利用,色谱提纯阿洛酮糖后副产物可循环利用,提高了副产物和酶的利用率,是一种高效率阿洛酮糖生成方法。
Description
技术领域
本发明属于阿洛酮糖制备技术领域,具体涉及一种双酶法制备阿洛酮糖的方法。
背景技术
阿洛酮糖又名D-核糖-2-己酮糖,是一种自然界中存在但含量极少的稀有糖类,D-阿洛酮糖为D-果糖C-3位的差向异构体。D-阿洛酮糖相当于蔗糖70%的甜度,却仅提供相当于蔗糖0.3%的热量,具有与蔗糖相近的口感及容积特性,并与蔗糖一样可与食物中的氨基酸或蛋白质发生美拉德反应,是食品中蔗糖的最佳替代品,被称作“低卡路里蔗糖”,因此阿洛酮糖是糖尿病人、肥胖人群、儿童食品的理想甜味剂。
D-阿洛酮糖的制备过程可分为化学制备和生物制备。化学制备法由于纯化产物步骤复杂,化学污染严重以及一些副产物杂多等一系列的原因,在实际中没有取得相应的成果。生物制备法反应单一,纯化步骤简单,是阿洛酮糖制备研究的主要方向。当前可以实现将D-果糖异构化为D-阿洛酮糖,有两种异构化酶,D-阿洛酮糖3-差向异构酶和D-塔格糖3-差向异构酶,前者底物为D-果糖,后者为塔格糖。目前对于这两种酶的研究较多,且很多机构对不同微生物来源的D-阿洛酮糖3-差向异构酶及其性质进行了研究,但对于反应底物的研究较少,且均以D-果糖为主要反应底物制备阿洛酮糖。本发明突破果糖为底物的束缚,以葡萄糖为底物,对阿洛酮糖3-差向异构酶和葡萄糖异构酶进行共同固定化,使葡萄糖连续异构成阿洛酮糖。在反应进行过程中,打破了果糖和阿洛酮糖的反应体系,使3种单糖形成一种新的关联体系,增加阿洛酮糖的转化率。
发明内容
针对现有技术中D-阿洛酮糖转化率低的问题,本发明提供了一种双酶法制备阿洛酮糖的方法,该法以葡萄糖为底物,以固定化双酶葡萄糖异构酶和D-阿洛酮糖3-差向异构酶催化底物连续异构生成阿洛酮糖,降低了原料成本,且固定化酶可重复利用,色谱提纯阿洛酮糖后副产物加入可循环利用,提高了副产物和酶的利用率,是一种高效率阿洛酮糖生成方法。
本发明通过以下技术方案实现:
一种双酶法制备阿洛酮糖的方法,包括以下步骤:
(1)葡萄糖液为底物,加入硫酸镁、硫代硫酸钠、亚硫酸氢钠酶激活剂,调节pH7.3-7.6,加入固定化双酶进行异构化反应,异构化温度50-60℃,80-100r/min搅拌反应8-24h,所述的固定化双酶为葡萄糖异构酶和D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的混合酶;
(2)对步骤(1)中得到的反应液进行过滤分离,滤液经脱色、离交、色谱、浓缩、干燥得阿洛酮糖。
进一步地,所述的固定化双酶的载体为大孔树脂,固定化双酶中葡萄糖异构酶酶活为2800-3000U/g载体,D-阿洛酮糖3-差向异构酶酶活为800-1000U/g载体。
进一步地,所述的葡萄糖液的质量浓度为35~40%,固定化双酶的加入量为底物干物质的10-20%。
进一步地,所述的硫酸镁的加量为1.0~1.5kg/m3料液,硫代硫酸钠的加量为0.5~1.0kg/m3料液,亚硫酸氢钠的加量为0.3-0.8kg/m3。
进一步地,步骤(2)中过滤分离后的固定化酶可重复利用。
进一步地,步骤(2)中色谱分离后的副产物加入葡萄糖后作为步骤(1)中的底物制备阿洛酮糖;所述的副产物为葡萄糖和果糖的混合糖液。
进一步地,步骤(2)中色谱分离后的混合糖液加入葡萄糖的量为混合糖液干物质质量的50~60%。
进一步地,步骤(2)中色谱分离后的副产物用来制备果葡糖浆。
本发明以葡萄糖为原料,减少了常规以果糖为原料时生产成本,免去了果糖或果葡糖浆的生产;所用的异构酶为固定化双酶(葡萄糖异构酶和D-阿洛酮糖3-差向异构酶),异构化效果好且可重复利用,同时,色谱提纯阿洛酮糖后副产物可精制后做果葡糖浆成品,也可按比例加入葡萄糖做反应底物循环利用,提高了副产物和酶的利用率。本发明为激活葡萄糖异构酶作用,添加了硫酸镁硫代硫酸钠、亚硫酸氢钠酶激活剂,三者之间协同作用,促进葡萄糖转变为果糖,而且镁离子除对葡萄糖异构酶有激活作用外,还对D-阿洛酮糖3-差向异构酶有促进催化作用,减少了D-阿洛酮糖3-差向异构酶转化阿洛酮糖时必需金属催化剂的添加。
另外,本发明通过对色谱提纯阿洛酮糖后副产物的重复利用,反应过程形成葡萄糖、果糖和阿洛酮糖连续转化的反应体系,葡萄糖在反应体系中对阿洛酮糖生成有促进作用,而阿洛酮糖对葡萄糖转化果糖有促进作用,连续的异构化打破了果糖为底物时形成的果糖和阿洛酮糖平衡体系,使阿洛酮糖转化率提高。
有益效果
本发明以葡萄糖为底物,固定化双酶(葡萄糖异构酶和D-阿洛酮糖3-差向异构酶)为异构化酶,可重复利用,且色谱分离后的副产物加入葡萄糖后可循环利用,提高了副产物和酶的利用率,阿洛酮糖转化率高,反应成本降低。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明,本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施,给出了详细的实施方式和具体的操作过程,但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
下列实施例和对比例中固定化双酶(葡萄糖异构酶和D-阿洛酮糖3-差向异构酶)的载体为大孔树脂,固定化双酶分别测葡萄糖异构酶酶活为2900U/g载体,D-阿洛酮糖3-差向异构酶酶活为900U/g载体。
实施例1
(1)以质量浓度为38%的葡萄糖液为底物,并向糖液中按体积加入1.3kg/m3硫酸镁、1.0kg/m3硫代硫酸钠、0.5kg/m3亚硫酸氢钠酶激活剂,调节pH7.3-7.6,加入底物干物质15%的固定化双酶进行异构化反应,异构化温度50℃,90/min搅拌反应24h,分别测定反应液中的葡萄糖、果糖和阿洛酮糖的含量;
(2)步骤(1)中的反应液过滤分离,滤液经脱色、离交、色谱、浓缩、干燥得阿洛酮糖;过滤出的固体固定化双酶清洗后保存待用,色谱分离后的副产物回收待用。
实施例2
(1)向质量浓度为35%的葡萄糖液为底物,并向糖液中按体积加入1.0kg/m3硫酸镁、0.5kg/m3硫代硫酸钠、0.5kg/m3亚硫酸氢钠酶激活剂,调节pH7.3-7.6,加入底物干物质10%的固定化双酶进行异构化反应,异构化温度60℃,90r/min搅拌反应18h,分别测定反应液中的葡萄糖、果糖和阿洛酮糖的含量;
(2)步骤(1)中的反应液过滤分离,滤液经脱色、离交、色谱、浓缩、干燥得阿洛酮糖;过滤出的固体固定化双酶清洗后保存待用,色谱分离后的副产物回收待用。
实施例3
(1)向质量浓度为40%的葡萄糖液为底物,并向糖液中按体积加入1.5kg/m3硫酸镁、0.8kg/m3硫代硫酸钠、0.8kg/m3亚硫酸氢钠酶激活剂,调节pH7.3-7.6,加入底物干物质20%的固定化双酶进行异构化反应,异构化温度60℃,90/min搅拌反应18h,分别测定反应液中的葡萄糖、果糖和阿洛酮糖的含量;
(2)步骤(1)中的反应液过滤分离,滤液经脱色、离交、色谱、浓缩、干燥得阿洛酮糖;过滤出的固体固定化双酶清洗后保存待用,色谱分离后的副产物回收待用。
实施例4
实施例1步骤(2)中过滤出的固定化双酶用清水洗涤3次,回收重复使用。
使用回收后的固定化双酶,其余步骤与实施例1相同。
实施例5
以实施例1步骤(2)中色谱分离阿洛酮糖后副产物糖液(含葡萄糖和果糖),加入糖液干物质55%的葡萄糖干物质作为底物,其余步骤和方法同实施例1。
对比例1
将实施例1中的酶激活剂替换为“向糖液中按体积加入1.0kg/m3氯化钴、1.3kg/m3硫酸镁、0.5kg/m3硫代硫酸钠、0.5kg/m3亚硫酸氢钠酶激活剂”,其余步骤和方法同实施例1,反应结束后对反应液成分进行分析,对阿洛酮糖的转化率没有影响。
对比例2
将实施例1中的酶激活剂替换为“向糖液中按体积加入2.0kg/m3硫酸镁”,其余步骤和方法同实施例1。
对比例3
以实施例1步骤(2)中色谱分离阿洛酮糖后副产物糖液(含葡萄糖和果糖)、加入糖液干物质25%的葡萄糖干物质作为底物,其余步骤和方法同实施例1。
对实施例1~5和对比例1~3中反应液中的葡萄糖、果糖和阿洛酮糖的含量,结果如下表1所示:
表1葡萄糖、果糖和阿洛酮糖的含量分析
葡萄糖 | 果糖 | 阿洛酮糖 | |
实施例1 | 35.91% | 37.24% | 27.85% |
实施例2 | 36.56% | 36.54% | 26.90% |
实施例3 | 36.51% | 38.09% | 26.40% |
实施例4 | 38.60% | 35.89% | 25.51% |
实施例5 | 36.88% | 37.46% | 25.66% |
对比例1 | 36.41% | 36.81% | 26.78% |
对比例2 | 40.01% | 38.28% | 21.71% |
对比例3 | 40.70% | 40.24% | 19.06% |
。
Claims (6)
1.一种双酶法制备阿洛酮糖的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)葡萄糖液为底物,加入硫酸镁、硫代硫酸钠、亚硫酸氢钠酶激活剂,调节pH7.3-7.6,加入固定化双酶进行异构化反应,异构化温度50-60℃,80-100r/min搅拌反应8-24h,所述的固定化双酶为葡萄糖异构酶和D-阿洛酮糖3-差向异构酶的混合酶;
(2)对步骤(1)中得到的反应液进行过滤分离,滤液经脱色、离交、色谱、浓缩、干燥得阿洛酮糖;
所述的固定化双酶的载体为大孔树脂,固定化双酶中葡萄糖异构酶酶活为2800-3000U/g载体,D-阿洛酮糖3-差向异构酶酶活为800-1000U/g载体;
所述的硫酸镁的加量为1.0~1.5kg/ m3料液,硫代硫酸钠的加量为0.5~1.0kg/ m3料液,亚硫酸氢钠的加量为0.3-0.8kg/m3。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的葡萄糖液的质量浓度为35~40%,固定化双酶的加入量为底物干物质的10-20%。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(2)中过滤分离后的固定化酶可重复利用。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(2)中色谱分离后的副产物加入葡萄糖后作为步骤(1)中的底物制备阿洛酮糖;所述的副产物为葡萄糖和果糖的混合糖液。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,步骤(2)中色谱分离后的混合糖液加入葡萄糖的量为混合糖液干物质质量的50~60%。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(2)中色谱分离后的副产物用来制备果葡糖浆。
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